Apresentação do PowerPoint

Contaminação
Bacteriana na
Fermentação Etanólica
Profª. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis
1. INTRODUÇÃO
O planeta Terra com seus estimados
4,8 bilhões de anos passou por
diferentes etapas desde a sua
formação até tornar-se um ambiente
que favorecesse a condição de vida
como entendemos hoje.
Destas etapas, a primeira delas foi o
resfriamento da superfície e a condensação da
água. Durante este período as condições
energéticas provavelmente eram muito severas:
intensa radiação atômica;
radiação solar e
energia vulcânica ativa.
Soma-se a isto as descargas elétricas da
atmosfera. Neste ambiente altamente energético
e atmosfera tóxica foram sendo formadas muitas
moléculas
orgânicas
simples
e
outras
fotossensíveis
que
foram
interagindo
e
complexando-se, formando na água um ambiente
rico em nutrientes.
Com a formação das moléculas de ácidos graxos
com sua polaridade hidrofílica e hidrofóbica
formaram-se as micelas. Provavelmente, destas
micelas
surgiram
as
primeiras
reações
bioquímicas e os primeiros mecanismos biológicos
de replicação, que denominamos de metabolismo.
Partindo pois destas micelas, as primeiras formas
metabólicas que surgiram foram os metabolismos
fermentativos anaeróbios, pois são muito mais
simples que o metabolismo respiratório aeróbio.
Esta forma é mais eficiente no aproveitamento
da energia química acumulada nas moléculas.
Deste período de cerca de 3,5 bilhões de anos já
se evidenciaram alguns organismos simples
capazes de captar a energia solar e produzir
oxigênio (O2). A produção de O2 pelos
microrganismos fotossintetizantes introduziu
uma das mais importantes modificações da
superfície
terrestre,
transformando-a
de
redutora para oxidante.
A produção de O2 propiciou
também a formação da
camada de ozônio, impedindo
pois que a radiação ultravioleta atingisse a Terra.
Isto liberou a vida dos
esconderijos das rochas e da
profundidade oceânica.
Neste período teve origem a
biodiversidade.
Supõe-se que os seres vivos tenham sua origem
em um ancestral comum que se diversificou em
três domínios:
ARCHAEA
arqueobactérias
BACTERIA
bactérias verdadeiras
ANCESTRAL
COMUM
EUKARYA
Animais, plantas, algas,
protozoários, fungos,
leveduras
Esta divisão da Biologia não surgiu por acaso, mas
sim por muitos estudos de todos os organismos
para que pudessem ser entendidos em sua
ecologia, fisiologia, genoma, constituição química,
e outros atributos.
Portanto, quando se faz referência aos
organismos de cada domínio deve-se sempre
considerá-los especiais em cada segmento e
entender a diversidade biológica em cada domínio.
Os organismos dos 3 domínios são encontrados
predominantemente no solo. As Arqueobactérias,
bactérias e eucariotos são encontrados dispersos
nos ambientes mais estranhos e suportando
ambientes estressantes com alta biodiversidade.
Tais organismos estão presentes também nos
diferentes sítios onde está inserido o complexo
ambiente de uma indústria sucro-alcooleira.
Considerando-se a origem
dos
microrganismos
na
indústria, parece e inúmeras
pesquisas comprovam que a
terra ainda é a maior fonte
de seus contaminantes.
2. CONTAMINANTES NA INDÚSTRIA
Uma vez que o solo é o grande reservatório
biológico de microrganismos, a contaminação que
atinge a indústria em sua maior parte tem nele
sua origem.
A contaminação chega até a indústria mediante a
terra aderida às raízes, caule, folhas, água,
partículas carregadas pelas correntes aéreas,
etc.
SHEATA (1960) e TILBURY (1975) mostraram
em seus trabalhos que na cana pode-se encontrar
de 104 a 108 unidades formadoras de colônias
(UFC).
Dentre os gêneros de bactérias encontradas
destacam-se:
¾ Aerobacter
¾ Bacillus
¾ Escherichia
¾ Micrococcus
¾ Flavobacterium
¾ Corynebacterium
¾ Pseudomonas
¾ Enterobacter
¾ Erwinia
¾ Lactobacillus
¾ Leuconostoc
Escherichia
coli
Pseudomonas
aeruginosa
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus
ssp
Corynebacterium
diphtheriae
Aerobacter
aerogenes
Leuconostoc
mesenteroides
Enterobacter
Bacillus
Flavobacterium
Erwinia
Micrococcus
Também foram detectadas leveduras dos
gêneros Candida, Saccharomyces, Torula e Pichia;
além dos fungos filamentosos.
Candida
Candida
parapsilosis
Pichia
pastoris
Saccharomyces
cerevisiae
Torula
Fungo filamentoso
LIMA et al. (1974) constataram que as espécies
de microrganismos encontradas na indústria são
as mesmas daquelas presentes no solo da lavoura
de cana.
A cana ao ser queimada e cortada entra em
contato com o solo e através de corte os
microrganismos invadem os tecidos do vegetal.
Tem aí a origem de muitos contaminantes
encontrados na indústria (QUIMATEC, 1991).
Microrganismos que chegam à indústria vão
encontrar
condições
ideais
ao
seu
desenvolvimento. O caldo de cana constitui um
ótimo meio de cultura que estimula o
desenvolvimento microbiano considerando-se a
sua composição de sais minerais e carboidratos,
atividade de água, pH e temperatura
favoráveis.
Além disso fatores como:
ƒ variações nas formas de colheita terrenas,
ƒ diferentes variedades de cana,
ƒ condições climáticas muito oscilantes,
ƒ pragas e doenças,
ƒ tipo de transporte,
ƒ armazenamento,
ƒ tempo decorrido entre o corte da cana e o seu
processamento na usina,
ƒ estado da matéria-prima ao dar entrada na
usina (limpa, suja, molhada, seca, queimada, nova,
velha, deteriorada, com raízes, perfuradas por
insetos)
Contribuem significativamente no número de
microrganismos
presentes
na
cana
e
conseqüentemente no caldo (GALLO; CÃNHOS,
1991).
Durante a colheita, transporte e armazenamento,
alguns desses microrganismos tendem a penetrar
nos colmos através de lesões e se multiplicam
agravando o problema.
Por outro lado, durante a lavagem da cana há
duas possibilidades:
¾ remoção parcial dos contaminantes se a
qualidade da água e os cuidados operacionais
forem adequados;
¾ aumento drástico dos contaminantes quando os
cuidados não são assumidos corretamente.
Com controle adequado de matéria-prima, da água
de lavagem e do processo de extração, pode-se
obter um caldo misto com pH ao redor de 5.5
(BAYMA, 1973) e com números de contaminantes
inferiores a 107 UFC/mL (COPERSUCAR, 1983).
Quando o pH da água encontra-se entre 10,0 e
11,0 em circuitos fechados, possui contagens de
bactérias mais baixas.
SERRA et al. (1979) efetuaram contagens
microbianas em águas de lavagem de cana em duas
usinas que operavam com diferentes circuitos. Os
autores concluíram que na usina que não
recirculava a água as contagens eram de 10 a 20
vezes menores.
LOBO et al. (1987) avaliaram o número de
bactérias da água de lavagem de duas usinas e
uma destilaria. Os autores verificaram que os
valores obtidos de 104 e 105 UFC/mL não
influenciavam nas contagens que eram efetuadas
posteriormente nos caldos dos primeiros ternos
de cada unidade analisada.
Na indústria o preparo da cana para a extração do
caldo mediante a ação dos picadores e
desfibradores constitui um ponto importante para
a exposição do caldo à ação microbiana.
Microrganismos aí encontrados por BEVAN,
BOND (1971) mostraram que são ótimos
metabolizadores de sacarose, glicose e frutose
(Leuconostoc, Actinomycetos, Brevibacterium,
fungos e leveduras).
Dentre os pesquisadores TILBURY (1977)
destaca-se pela preocupação com as perdas do
processo. Dentre as perdas, o autor verificou que:
‰ 13% ocorrem pela inversão química,
‰ 25% pela inversão enzimática das enzimas
extracelulares invertase,
‰ 63% em conseqüência da atividade microbiana.
As perdas de sacarose na moenda podem atingir,
segundo TILBURY (1977), 1kg de sacarose por
tonelada de cana. Outros autores, ORTH in
MOROZ (1969), tinham registrado perdas de
3,07% dos caldos em moendas lavadas e sem
lavar. O caldo bruto, segundo LIMA et al. (1977),
pode apresentar de 104 leveduras e 108
bactérias/mL.
AMORIM, OLIVEIRA (1982) em seu trabalho
verificaram que a diminuição da produção de
etanol pode ser causada por diferentes motivos:
• consumo de açúcar pelo contaminante;
• consumo do álcool produzido;
• liberação de substâncias tóxicas;
• excesso de ácidos;
• biocidas
infecções;
empregados
no
controle
das
• perda do fermento nas centrífugas ou fundos
de dorna;
• floculação do fermento, etc.
Deve-se considerar que em uma unidade
industrial todos estes fatores podem acontecer
simultaneamente.
Ainda segundo os autores, durante uma safra
pode acontecer perdas nas destilarias por
formação de ácido. Se ocorrer, por exemplo, 5 a
6 g de acidez por litro de vinho, haverá
diminuição do rendimento alcoólico em 60%.
GUERRA e ANGELIS (1998) verificaram durante
o acompanhamento da incidência de floculação do
fermento a presença de bactérias indutoras da
floculação.
A pesquisa pôde diferenciar quatro biotipos de
bactérias que possuíam sensibilidades diferentes
aos biocidas e antibióticos empregados na
indústria estudada. Este fato permite verificar a
dificuldade de solucionar o problema.
3. POR QUE CULTIVAR BACTÉRIAS?
A preocupação dos pesquisadores com a
contaminação
microbiana
dos
processos
industriais está voltada especialmente no que se
refere à bebidas alcoólicas fermentadas.
Deve-se
considerar
que
a
entrada
de
microrganismos em uma indústria constitui uma
população mista proveniente do solo, água, etc.
Nesta situação considera-se uma comunidade de
espécies em competição. Mudanças nas condições
externas podem favorecer o crescimento de uma
ou poucas espécies particulares.
Isto pode resultar no estabelecimento de uma
população predominante às custas de outras
espécies. Diante da diversidade das espécies
microbianas no interior de uma indústria sucroalcooleira, deve-se aplicar técnicas adequadas
para
sua
detecção.
Eventualmente
há
necessidade de se aplicar a técnica de
enriquecimento onde se suprime determinada
condição, favorecendo assim o desenvolvimento
de outras espécies, que embora presentes não se
desenvolvem por falta das condições que não
lhes propiciam o crescimento.
Muitas tentativas têm sido feitas para promover
um levantamento real dos microrganismos,
predominantemente
bactérias
e
mais
recentemente as leveduras.
Após a implantação do PRO-ÁLCOOL no Brasil
como fonte alternativa de combustível , houve
maior preocupação com os contaminantes da
fermentação etanólica e com as conseqüentes
perdas no processo.
Os
inconvenientes
provocados
pelos
contaminantes formadores de gomas foram as
primeiras características para as quais voltou-se
a atenção dos pesquisadores.
A microbiologia dos caldos destinados à
produção de açúcar e posteriormente à do
álcool pode ser considerado o ponto inicial para
a elucidação da formação dos compostos
mucilaginosos nos caldos de cana.
Quanto à detecção dos microrganismos nas
usinas, a literatura mostra que muitos países
adaptaram e desenvolveram métodos para a área
do açúcar. Entretanto, a metodologia visa
sempre o controle da qualidade bacteriológica do
produto final.
Dentro do setor de produção de álcool o
conhecimento de métodos de avaliação de
contaminantes na fermentação alcoólica é muito
restrito e não existe uma metodologia
padronizada.
Dentre as possibilidades existe a recomendação
da contagem microscópica, esta, no entanto deixa
a
desejar
porquanto
muitas
bactérias
confundem-se com partículas do próprio caldo. As
contagens das bactérias no microscópio ainda não
avalia aquelas que estão mortas das vivas.
Contudo para avaliar leveduras vivas e mortas a
contagem microscópica constitui uma ferramenta
importante.
A microscopia pode ainda associar-se com alguns
tipos de coloração, o que evidenciará o material
além de poder diferenciar sua morfologia como no
caso das bactérias Gram-positivas das Gramnegativas.
Este conhecimento poderá ser útil no controle dos
contaminantes ao se procurar aplicar antibióticos
ou biocidas.
A vantagem da contagem microscópica é a sua
rapidez, por outro lado, apresenta como
desvantagem a possibilidade de se poder contar
partículas que estejam em valores superiores a
10.000 por mL.
Entretanto, a contagem em placas pode avaliar
até um por mL, mais precisamente 30/mL.
Embora
com
restrições,
a
contagem
microscópica tem mostrado correlações
positivas entre os valores de acidez e o
número de bactérias.
Por outro lado, a contagem nas placas contendo
meio sólido embora seja um método indireto de
avaliação, indica com segurança a quantidade de
microrganismos vivos presentes na amostra
mesmo quando estão em baixo número.
O uso deste método em fermentação alcoólica
só foi possível com a descoberta de antibiótico
que pudesse inibir o crescimento de levedura e
desta forma quantificar as bactérias.
A aplicação de actidiona (cicloheximida) em 1951
por GRAY permitiu o desenvolvimento de
técnicas de avaliação bacteriana em cervejarias
Dentre os meios recomendados para avaliação de
bactérias pode-se destacar o “Plate Count Agar”
(PCA) e Man, Rogosa e Sharpe (MRS). Há também
indicações de suplementação do PCA com extrato
de levedura para contagem total de bactérias.
ROSALES,
FURLETTI,
ANGELIS
(1987)
propuseram o emprego de meios de cultivo para
dinamizar o levantamento dos principais
problemas microbiológicos da indústria sucroalcooleira.
Estes meios permitem verificar de 18 a 24 horas
as bactérias produtoras de goma. O meio de
oxidação do etanol exige um período maior,
aproximadamente 30 horas.
Quando se propõe um levantamento microbiano
na indústria sucro-alcooleira, parte-se em geral
de um meio complexo onde há a possibilidade de
crescer muitas espécies que normalmente não
interagem em meios seletivos onde alguns grupos
seriam favorecidos.
Contudo, hoje entendemos que existem grandes
problemas microbiológicos na fermentação
etanólica:
™ gerado por bactérias:
- produtoras da inversão e posterior
polimerização na formação da goma.
- produtoras
açúcar.
de
ácido
empregando
o
- consumidoras de etanol produzindo ácido
acético.
™ gerado por leveduras selvagens:
- células que consomem açúcar vorazmente
e das quais sabemos pouco.
Da população altamente diversificada da
indústria, importante é conhecer o que estaria
viável em cada etapa do processo.
Para tanto elegem-se meios de avaliação total
dos contaminantes, que denominamos meios
seletivos, para quantificar:
¾ bactérias totais;
¾ bactérias produtoras de gomas;
¾ bactérias produtoras de ácidos;
¾ bactérias consumidoras de etanol
4. UTILIDADES DO ACOMPANHAMENTO
MICROBIOLÓGICO
Independente do método aplicado o importante é
estarem em sintonia: laboratório, processo e área
agrícola.
No controle do processo industrial da fermentação e
na produção de açúcar podemos correlacionar:
¾ Água de lavagem – acompanhar a água de lavagem
da cana mantendo o pH entre 10 e 11.
¾Moenda – efetuar sempre que possível amostragens
compostas; existem equipamentos específicos para
coletas das amostras: caldo primário, caldo misto e
caldo decantado.
Microrganismos =
População bacteriana do caldo 1º terno
População bacteriana do caldo misto
• Se a População do caldo misto é X e
a População do caldo decantado é Y
X-Y = W
e
W/X = Z , então
Z x 100 = % redução
Desta forma é possível avaliar a eficiência do
tratamento do caldo.
4.3 – FERMENTAÇÃO
A contaminação bacteriana deve sempre ser
o mínimo possível.
O índice de contaminação (IC) de bactérias
por mL pode ser correlacionado com diferentes
parâmetros do processo:
CV = número de células vivas de leveduras /mL
VC = viabilidade celular da levedura
RF = rendimento da fermentação
A = acidez
NB = número de bactérias (avalia-se somente
os bacilos ao microscópio)
IC =
CV
NB
IC =
VC
NB
IC =
RF
NB
IC =
A
NB
Estas correlações se bem reproduzidas
poderão nortear as ações a serem assumidas em
qualquer parte do processo.
Pode-se calcular também as taxas
multiplicação do fermento na dorna (TMF).
de
População que entra na dorna no início
da fermentação (DIF)
X 100
TMF =
População na dorna no final da
fermentação (DFF)
Pode-se
construir
correlacionando-se com
o
fermentação.
um
gráfico
rendimento da
Outro parâmetro a ser considerado é a
recirculação das bactérias (RC).
RC =
População das bactérias do leite
População de bactérias na dorna no final da
fermentação
5 – JUSTIFICATIVA PARA EFETUAR O
CONTROLE
9A fermentação etanólica processa-se no Brasil em
condições não estéreis e as contaminações no
processo causam prejuízos no rendimento final.
9As causas principais são relativas ao consumo de
açúcar, produção de toxinas, mucilagens (gomas) que
provocam entupimentos nas tubulações e floculação
no fermento.
9A presença de bactérias está ligada à qualidade da
matéria-prima e é influenciada pelo solo, variedade,
tipo de corte, armazenagem, transporte, associado
ainda à água de lavagem e da diluição do mosto.
9Considera-se uma dorna contaminada aquela
onde o número de bactérias atinge níveis que
prejudiquem a produção de etanol.
9As bactérias presentes no mosto ou nas dornas
causam fermentações secundárias tais como:
acética, láctica, dextrânica, butírica, levânica.
9Todas as fermentações secundárias utilizam
direta ou indiretamente o açúcar para produzirem
o produto final.
5.1 – FERMENTAÇÃO ACÉTICA
As bactérias acéticas produzem a oxidação do
etanol à ácido acético. Possuem tolerância
relativamente alta à ácidos.
São bactérias Gram (-), bastonetes curtos,
aeróbios, desenvolvem-se entre 15 a 45ºC, sendo
que a temperatura mais favorável é de 15 a 34ºC.
O gênero mais freqüente é Acetobacter e as
espécies: A. acetii, A. pasteurianum, A. acetosum,
A. sub-oxydans.
5.2 – FERMENTAÇÃO LÁCTICA
Possuem a habilidade de inibir o crescimento de
outras bactérias. São bactérias Gram (+),
anaeróbias ou microaerófilas. Desenvolvem-se em
temperaturas elevadas até 45ºC. Podem ser
homofermentativas ou heterofermentativas.
Os
principais
Streptococcus.
gêneros:
Lactobacillus
As espécies mais freqüentes são:
L. fermentum, L. plantarum L. bulgaricus,
L. delbruckei, L. casei, S. lactis, S. thermophilus.
Glicose
Glicose
homofermentação
heterofermentação
2 ácido láctico
Ácido lático +
CO2+álcool etílico
e
5.3 – FERMENTAÇÃO DEXTRÂNICA
O principal agente é a bactéria Leuconostoc
mesenteroides. São bactérias cocos Gram (+),
vivem isoladas, em pares ou cadeias.
Do metabolismo da sacarose forma-se uma massa
gelatinosa transparente em polímeros de dextrana,
conhecida como canjica. Temperatura ótima de
desenvolvimento 36ºC é heterofermentativa.
n C12H22O11
Leuconostoc
mesenteroides
(C6H10O6)n + n C6 H12 O6
dextrana
frutose
5.4 – FERMENTAÇÃO DO LEVÂNIO
As principais bactérias são do gênero Bacillus
(Gram
(+)),
Aerobacter
(Gram
(-))
e
Streptococcus (cocos Gram (+)). São do
metabolismo da sacarose, polimerizam a frutose e
liberam a glicose.
n C12H22O11
(C6H10O5)n + n C6 H12 O6
levânio
glicose
5.5 – Fermentação Butírica
Geralmente está associada ou ocorre depois da
fermentação láctica. São bactérias cilíndricas,
ovais ou em forma de losangos ou de raquetes.
São esporuladas, crescem bem a temperaturas de
40ºC e em mostos pouco ácidos. Metabolicamente
geram ác. butírico, acético, fórmico, CO2, álcoois,
etc.
Segundo ROSALES (1989), 222 linhagens isoladas
do processo de fermentação etanólica foram
identificadas:
BACTÉRIAS ISOLADAS
222 CULTURAS
Gram (-)
Gram (+)
24,32%
75,68%
Bastonetes
Cocos
76,78%
23,21%
ƒ Acetobacter – 29,63%
ƒ Xantobacter – 14,81%
ƒ Pseudomonas – 5,55%
ƒ Acinetobacter – 27,77%
ƒ Enterobacter – 27,77%
Bastonetes
Cocos
76,78%
23,21%
ƒ Lactobacillus – 77,52%
ƒ Bacillus – 16,28%
ƒ Sporolactobacillus sp –
6,2%
ƒ Leuconostoc -
82,05%
ƒ Micrococos – 10,25%
ƒ Staphylococcus – 7,69%
ƒ L. fermentum - 29%
Lactobacillus
ƒ L. brevis – 33%
ƒ L. canfusus – 20%
ƒ L. plantarum – 7%
ƒ outros – 11%
Bacillus
ƒ B. coagulans – 14,28%
ƒ B. subtilis – 47,62%
ƒ B. megaterium 28,57%
ƒ B. firmus – 9,50%
Sporolactobacillus sp
LITERATURA RECOMENDADA
‰ Microrganismos
da
fermentação
etanólica
e
possibilidade de utilização
da vinhaça.Seminário.
UNIMEP. UNESP-IB.RC.ed. Buckman Lab. Ltda, 1987
(vários autores)
‰ ROSALES, S,V,R. Contaminantes bacterianas da
fermentação etanólica: isolamento em meios diferenciais,
identificação e avaliação de desinfetantes. Rio Claro.
UNESP. Instituto de Biociências. Tese de doutorado. Área
de Ciências Biológicas. 1989.
‰ GUERRA, E,J. Isolamento de bactérias da fermentação
etanólica que induzem a floculação em Saccharomyces
cerevisiae e sua sensibilidade a agentes microbianos. Rio
Claro. UNESP. 1995. Dissertação de Mestrado em Ciências
Biológicas. Área de Microbiologia Aplicada
‰ GUERRA, E,J.; ANGELIS,D,F. Floculação da levedura
induzida por bactérias na fermentação etanólica. I
Método de detecção preventiva e estudos para o
controle. STAB.
‰ YOKOIA,F.;OLIVA-NETO,P. Características da
floculação de leveduras por Lactobacillus fermetum.
Revista de Microbiologia. São Paulo, v.22, n.1, p.12-16.
1991.
‰LIMA,U.A.;GOLDONI,J,S.;CEREDA,M,P.;SOUZA,L,Ocor
rência de microrganismos em caldo bruto, caldo misto e
água de embebição de uma usina de açúcar de cana. Brasil
açucareiro. V.83, p.337-343.1974.