identificação dos genotipos gep de rotavírus suíno - EAIC

IDENTIFICAÇÃO DOS GENOTIPOS G E P DE ROTAVÍRUS SUÍNO
GRUPO A POR MULTIPLEX RT-PCR
Livia Bodnar (CNPq-Balcão), Brigida Kussumoto de Alcantara (PIBIC/CNPqUEL), Bruna Letícia Domingues Molinari (Fundação Araucária-UEL),
Fernanda Abdulack Lopes (Fundação Araucária-UEL), Patricia Filippsen
(CNPq/Balcão), Rafael Cascales (PIBIC/CNPq-UEL), Elis Lorenzetti (Pósgraduação-Mestrado-UEL), Thaís Neris da Silva Medeiros (Colaborador),
Amauri Alcindo Alfieri (Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências
Agrárias/Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) –
Londrina – PR
Palavras-chave: suíno, diarréia, rotavírus grupo A, Multiplex RT-PCR,
genotipos.
Resumo
Os genotipos G (VP7) e P (VP4) de rotavírus grupo A de origem suína foram
determinados pela técnica de Multiplex RT-PCR. Foram avalidadas 74
amostras de fezes de leitões lactentes, com ou sem quadro clínico de
diarréia. Todas as amostras foram previamente identificadas como positivas
para rotavírus grupo A por meio da técnica de eletroforese em gel de
poliacrilamida (EGPA). A genotipagem completa através da identificação dos
genotipos P e G foi realizada em 58,1% das amostras. O genotipo G4P[6]
(Gottfried-like) ocorreu como infecção singular em 10,8% da amostragem. A
frequência de infecções mistas foi de 17,6% e as infecções com
características de recombinação gênica (singular e mista) ocorreu em 29,7%
das amostras.
Introdução
A diarréia neonatal em suínos é caracterizada como uma síndrome
multifatorial e multietiológica. Fatores nutricionais e fisiológicos, manejo,
alterações ambientais, imunidade do hospedeiro e agentes infecciosos
podem estar envolvidos tanto na presença quanto na intensidade da diarréia
em leitões.
O rotavírus (RV) é o principal agente etiológico das
gastroenterites virais em suínos lactentes e recém-desmamados,
ocasionando grandes perdas econômicas (JANKE; MOREHOUSE;
SOLORZANO, 1988). O Rotavírus pertence à família Reoviridae, tem
aproximadamente 85nm de diâmetro e seu genoma é constituído por 11
segmentos de RNA fita dupla. O RV não é envelopado e seu capsídeo é
formado por três camadas protéicas concêntricas (capsídeos externo,
intermediário e interno).
De acordo com a proteína estrutural VP6, o RV pode ser classificado
Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009
em sete sorogrupos (A-G) sendo o sorogrupo A o mais freqüentemente
detectado em animais jovens de várias espécies, incluindo leitões. Por meio
da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), torna-se
possível observar o perfil de migração dos 11 segmentos genômicos do
dsRNA, possibilitando a classificação do RV em sete grupos (A-G),
chamados de eletroferogrupos (HERRING et al., 1982).
O RV eletroferogrupo A pode ser classificado em sorotipos e/ou
genotipos G e P, de acordo com a especificidade antigênica das proteínas
estruturais VP7 e VP4, localizadas no capsídeo externo. O RV possui um
sistema binário para sua classificação, de acordo com os G tipos da proteína
VP7 (glicoproteína) e P tipos da proteína VP4 (protease sensível)
(KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001).
Utilizando métodos sorológicos ou moleculares são descritos
atualmente pelo menos 18 G tipos e 27 P tipos em estirpes de RV,
demonstrando a ampla diversidade antigênica do rotavírus sorogrupo A
(RVgpA). Os G tipos mais comumente detectados em suínos tem sido G3,
G4, G5 e G11 associados com os P tipos P[6] e P[7] (RÁCZ et al., 2000) que
são considerados os P tipos mais comuns nessa espécie animal. Os
genotipos mais comuns em suínos são o G5P[7] e G4P[6].
A técnica de Multiplex RT-PCR (GOUVEA; SANTOS; TIMENETSKY,
1994) é o método molecular mais utilizado para realizar a genotipagem do
RVgpA. A técnica possibilita a identificação dos genotipos mais freqüentes
de estirpes virais que ocasionam episódios de diarréia. A genotipagem tem
importância na epidemiologia da rotavirose e na adoção de medidas
profiláticas para o controle dos quadros de diarréia neonatal.
O objetivo do trabalho foi identificar os G e P tipos de RV suíno grupo
A em amostras de fezes de leitões, utilizando a técnica de Multiplex RTPCR.
Material e Métodos
Amostras
As 74 amostras de fezes de leitões lactentes de uma a quatro semanas de
idade, com ou sem quadro clínico de diarréia, foram selecionadas da
coleção do Laboratório de Virologia Animal/DMVP/CCA/UEL. As amostras
foram previamente triadas como positivas para RVgpA pela técnica de
EGPA.
Extração do RNA viral
A extração do ácido nucléico foi realizada de acordo com a técnica descrita
por Alfieri et al. (2006). O RNA foi eluído em 50μL de água tratada DPEC e
mantido à -20ºC até seu uso.
RT-PCR (Transcrição reversa - Reação em Cadeia pela Polimerase)
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Foram utilizados 5μL do RNA eluído para a realização da técnica RT-PCR
com primers consensuais, de acordo com as descrições de Alfieri et al.
(2006). A amplificação dos produtos do gene VP4 (P) resulta em um
fragmento com 876pb (GENTSCH et al.,1992), e do gene VP7 (G) resulta
em um fragmento de 1062pb (GOUVEA et al., 1990). Em todas as reações
foram utilizadas uma amostra de água ultrapura autoclavada como controle
negativo.
Multiplex RT-PCR
Para a identificação dos G e P tipos, foram utilizados 5μL do produto da RTPCR e um “pool” de primers tipo específicos, sendo para o genotipo G:
SBeg9, G1, G2, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10 e G11 e para o genotipo P:
4con2, P1, P4, P5, P6, P7, P8, P9 e P11 (ALFIERI et al., 2006).
Análise dos produtos
Os produtos amplificados na RT-PCR e na Multiplex RT-PCR foram
avaliados por eletroforese em gel de agarose 2% com brometo de etídeo
(0,5 µg/mL), em tampão TBE pH 8,4 (89 mM Tris; 89 mM ácido bórico;
EDTA 2 mM) sob voltagem constante (90v) e visualizados sob luz
ultravioleta.
Resultados e Discussão
Nas 74 amostras avaliadas foi possível detectar as bandas consensuais de
G e P, o que ratifica o resultado do EGPA indicando a presença do RVgpA.
A genotipagem de G e P tipos foi obtida em apenas 58,1% das
amostras. Alfieri et al. (2006) obteve 100% de genotipagem em 50 amostras
de suínos. Do total de amostras genotipadas, em 10,8% foi possível detectar
somente um G e um P tipo, G4P[6] que é considerada a associação mais
freqüente na espécie suína (RÁCZ et al., 2000).
Em 47,3% das amostras genotipadas foi observada a presença de
mais de um G ou P tipos, indicando a presença de RV diferentes em fezes
de um mesmo animal. A infecção mista possibilita a troca de segmentos
genômicos entre os RV, o que pode resultar em recombinação e o
aparecimento de G e P tipo não identificados até o momento. Isso justifica a
falha dos primers para G e P tipo usuais não anelarem na sequência
desejada e assim resultar em 41,9% de amostras onde só foi possível
detectar o G ou P tipos.
Associações de G ou P tipos, singulares ou múltiplas, de diferentes
espécies animais como G7P[6] (bovino e suíno, respectivamente) ou G5P[6]
(estirpes diferentes de RV) foram detectadas em 29,7% das amostras, sendo
que esses genotipos virais podem apresentar potencial zoonótico (ALFIERI
et al., 2006).
Conclusões
Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009
Por meio da Multiplex RT-PCR utilizando primers específicos foi possível
detectar diferentes P e G tipos em amostras de rotavírus suíno sorogrupo A,
sendo que a estirpe mais encontrada neste estudo foi a G4P[6] além de
infecções mistas e recombinações.
Referências
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