Anais do IV Simpósio do Programa de Pós

Transcrição

Anais do IV Simpósio
do Programa de PósGraduação em
Biologia Molecular da
Universidade de
Brasília
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Índice
APRESENTAÇÃO ............................................................................ 2
PALAVRA DA COMISSÃO ORGANIZADORA DO SIMPÓSIO .............. 3
INFORMAÇÕES IMPORTANTES ........................................................ 4
COMISSÃO ORGANIZADORA ........................................................... 5
CRONOGRAMA ............................................................................... 6
PALESTRAS .................................................................................. 10
APRESENTAÇÕES ORAIS 1 ............................................................ 24
APRESENTAÇÕES ORAIS 2 ............................................................ 29
RESUMOS..................................................................................... 32
ALUNOS DO PROGRAMA PPG-BIOMOL REALIZANDO DOUTORADO
SANDUÍCHE NO EXTERIOR ......................................................... 129
PROGRAMAÇÃO: APRESENTAÇÕES DE PAINÉIS
DIA: 19/11/2014 ....................................................................... 135
DIA: 20/11/2014 ....................................................................... 140
APOIO ....................................................................................... 146
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SEJAM BEM VINDOS AO IV SIMPÓSIO DO PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM BIOLOGIA M OLECULAR DA UNB!
O programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular (PPG BioMol) teve inicio
em 1973, com a criação do curso de mestrado em Biologia Molecular, composto por
orientadores do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, um
grupo recém chegado à então jovem Universidade, que trazia uma abordagem
científica voltada às bases Moleculares e Celulares dos processos biológicos.
Com o crescimento do corpo docente e a criação do curso de Doutorado em
1992, novas áreas foram adicionadas, destacando-se Genética Molecular de Plantas
e Controle Biológico. As principais áreas de pesquisa do programa de Pós-Graduação
hoje incluem: Biologia Molecular, Bioquímica, Microbiologia Molecular, Estrutura de
Proteínas, Modelagem e Simulação de Biomoléculas, Biologia Estrutural, Virologia
Molecular, Genômica, Proteômica e Bioinformática.
Desde a sua implantação, o Curso de Mestrado/Doutorado em Biologia
Molecular já formou mais de 560 alunos (202 de doutorado e 358 de mestrado), com
aproximadamente 70 alunos de doutorado e 30 de mestrado desenvolvendo as suas
teses e dissertaçoes em 2014.
Realizado anualmente no Instituto de Biologia da Universidade de Brasília, o
Simpósio PPG-BioMol é um evento organizado por alunos do Programa de PósGraduação em Biologia Molecular em conjunto com docentes. Acreditamos que seja
uma ótima oportunidade para aproximar e apreciar as diversas pesquisas acadêmicas
desenvolvidas na Universidade de Brasília e região.
_______________________________
Prof. Robert Neil Gerard Miller, Ph.D.
Coordenador do PPG-BioMol-UnB
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PALAVRA DA COMISSÃO ORGANIZADORA DO SIMPÓSIO
O nosso simpósio teve início em 2011 e chegou à sua quarta edição no ano
2014. O evento está sendo realizado anualmente graças ao empenho dos alunos
envolvidos na organização. A novidade deste ano foi a publicação dos trabalhos em
Anais disponível na página da PPG-BioMol.
Para este evento, preocupamos-nos em buscar assuntos e temas atuais,
diretamente relacionados às atividades de pesquisa que os alunos vêm
desenvolvendo para a sua formação. A lista de convidados foi grande e o cronograma
foi organizado da melhor maneira possível a fim de atender a disponibilidade dos
palestrantes.
Agradecemos a todos que contribuíram para a realização do IV Simpósio do
Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular da UnB. Agradecimento em
especial à comissão avaliadora pelo esforço em selecionar os melhores trabalhos,
não é uma tarefa fácil; aos professores do programa pela orientação, apoio e
incentivo, à secretária Ana Tiberti pelas orientações e sugestões, ao coordenador do
curso, prof. Robert N. G. Miller, pelo apoio inesgotável, à BD Biosciences pelo
patrocínio do material, à CAPES pelo apoio financeiro e ao Instituto de Biologia, pelo
espaço utilizado.
Mais do que uma obrigação, a oportunidade de organizar um evento como este
faz parte da nossa formação como pesquisadores e foi muito gratificante.
Venha fazer parte da próxima comissão organizadora!!! Sugestões para
melhorarmos o nosso simpósio são bem vindas, por meio do endereço eletrônico
[email protected]
Da esquerda para a direita: Valquíria Lacerda, Débora Torres, Robert Miller, Fabrício Morgado, Thiago Oliveira,
Polynne Almeida, Henrique Veras, Samuel Mandacaru.
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Informações Importantes
 Alunos selecionados para apresentação oral também devem apresentar seus
painéis, pois os seus tutores irão ao seu encontro.
 Haverá premiação para os três melhores painéis. A avaliação será feita por
uma comissão avaliadora que estará presente nas seções de painéis.
 O encontro com os tutores será no mesmo dia da avaliação dos painéis. Fique
atento ao dia da sua apresentação!
 A entrega das premiações ocorrerá no dia 21/11 durante a seção de
premiações e encerramento.
 Os certificados serão enviados posteriormente via endereço eletrônico.
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Comissão Organizadora
Ana Hilda Tiberti
Samuel Coelho Mandacaru
Débora Torres A. Figueiredo
Thiago Rodrigues de Oliveira
Fabricio da Silva Morgado
Valquíria Alice Michalczechen Lacerda
Henrique César T. Veras
Ildinete Silva Pereira
Pollyne Borborema A. Almeida
Marcelo de Macedo Brígido
Robert Neil Gerard Miller
Comissão Avaliadora*
Claudio Afonso Pinho Lopes
Marciano Regis Rubini
Diana Mendoza Gomez
Marcus de Melo Teixeira
Galina Gulis
Rafael Trindade Burtet
Gláucia Emy Okida Midorikawa
Rosana Blawid
Juliana Davis Oliveira
Simone Nardin
Kelly Barreto Rodrigues
Túlio César
Leonora Rios de Souza Moreira
Viviane Reis
Leandro Ambrósio Cantos
* Todos são integrantes de pós-doutorado do PPG-BioMol
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Cronograma
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19/11 – Quarta-feira
Local
Balcão de
08:00 – 09:00h
Credenciamento
9:00- 9:30
Abertura
09:30 – 10:30h
Fenótipos complexos: explicar ou predizer? Evoluindo da
inferência de genes individuais para a predição genômica total
em Eucalyptus
Dário Grattapaglia (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia)
10:30 – 11:15h
11:15 – 12:00h
12:00 – 12:30h
12:30 – 14:00h
14:00 – 14:40h
14:40 – 15:20h
15:20 – 16:00h
Stress tolerance in peanuts: a genomic approach using wild
Arachis
Ana Cristina Miranda Brasileiro (Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia)
Estratégia genômica para o entendimento da produção de
celulases pelo fungo Trichoderma reesei
Roberto do Nascimento Silva (USP)
entrada
Auditório 1
Discussão
ALMOÇO
Da descoberta de novos vírus à caracterização funcional de
genes virais
Fernando Lucas de Melo (IB-UnB)
Metagenômica funcional da microbiota em solos tropicais
Tsai Siu Mui (USP)
O Microbioma Intestinal Humano: estrutura, funções e
modificações
Christian Hoffman (USP/UnB)
16:00 – 16:30h
Mesa Redonda – Análise genômica e microbiologia ambiental
16:30 – 18:00h
Coffee Break + Sessão de Painéis
Auditório 1
Térreo do
prédio azul
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20/11 – Quinta-feira
08:30 – 10:30
11:00 – 12:00 h
12:00 – 14:00h
14:00 – 15:00h
15:00 – 16:30h
Local
Mini curso 1: Preparação de amostras para NGS
Daniel Paiva Agustino (Visiting PhD student at Karl Kuchler GroupÁustria)
Auditório 1
Mini curso 2: Espectrometria de massa Top-down no estudo de
complexos proteicos nativos
Luis Henrique Ferreira do Vale (UnB)
Auditório 4
Mini curso 3: Biologia Sintética e Nanotecnologia
Cintia Marques Coelho e Luciano Paulino da Silva (EMBRAPA
Recursos Genéticos e Biotecnologia)
Sequence and pattern based characterization of insect viromes
via small RNA metagenomics
João Trindade Marques (UFMG)
Auditório 3
Auditório 1
ALMOÇO
Ferramentas de bioinformática aplicados a analise de dados
“omics”
Gabriel da Rocha Fernandes (UCB)
Apresentação oral (Alunos selecionados)
Mayara Simonelly Santos - Entrega de Azul de Metileno mediada
por Nanofolha de Óxido de Grafeno para Terapias Fotodinâmica e
Fototérmica Combinadas no Tratamento de Carcinoma Mamário
Humano In Vitro e In Vivo
Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of
a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach
Auditório 1
Caio Silva Souza - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor
Domains
Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli
engenheirada metabolicamente aumentam a produção de
proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra
sintética
16:30 – 18:00h
Coffee Break + Sessão de Painéis
Térreo
do
prédio azul
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21/11 – Sexta-feira
Local
08:30 – 9:10
Role of conformational equilibrium in molecular recognition:
regulation of catalysis, defensins and virus assembly
Fábio Ceneviva Lacerda Almeida (UFRJ)
Auditório 1
09:10 – 9:50
Intracellular trafficking mediated by actin-based molecular motors:
The myosin V family
Mário Tyago Murakami (LNBio)
Auditório 1
09:50 – 10:30
10:30 – 11:30
12:00 – 14:00
14:00 – 15:30
15:00 – 16:30
16:30 – 17:00
A espectrometria de massas como ferramenta de biologia estrutural
Fábio Cesar Gozzo (Unicamp)
Mesa redonda: Atualidades/tendências e integração de dados de
diferentes técnicas no estudo da biologia estrutural.
Fábio Ceneviva Lacerda Almeida (UFRJ), Mário Tyago Murakami
(CNPEM), Fábio Cesar Gozzo (Unicamp), Marcelo Valle de Sousa (UnB),
João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa (IB-UnB), Aline Lima de
Oliveira (IQ- UnB).
Auditório 1
Auditório 1
ALMOÇO
Apresentação oral (Alunos selecionados)
Elias Ferreira Sabiá Júnior - Detecção e Caracterização de Proteínas
Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a
Células de Câncer Humano.
Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of
gram-negative bacteria in lipid antigen presentation through CD1
molecule.
Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of
a medical interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua
(Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription terminator
factor possibly acquired from the host.
Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de
RNA fita dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga:
avaliação na planta e no inseto alvo.
RECOBIO: Rede Centro-Oeste de formação e pesquisa em BIOlogia
computacional
Werner Treptow (UnB)
Homenagem – prêmio CAPES
Mecanismo de ativação de canais iônicos dependentes de voltagem,
Kv e Nav, e a interação com anestésicos gerais
Cristiano Guimarães Pinheiro (UnB)
Auditório 1
Auditório 1
17:00 – 17:30
Premiação – Apresentação oral e painéis.
Auditório 1
18:00
Fechamento e Premiação
Auditório 1
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Palestras
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P01- Fenótipos complexos: explicar ou predizer? Evoluindo da inferência de
genes individuais para a predição genômica total em Eucalyptus
Dario Grattapaglia
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB Final W5 Norte 70770-970, e Programa de
Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, 70790-160,
Brasília, DF.
[email protected]
A perspectiva de explicar a arquitetura genética de fenótipos complexos e com isso
acelerar a seleção direcional no melhoramento de plantas tem sido uma justificativa
comum de projetos genômicos e de biologia molecular. Pensou-se que seria possível
descobrir, "visualizar" e entender a função de alelos e genótipos aos locos
controladores de características quantitativas (QTLs) ou até mesmo, para os mais
otimistas (ou incautos) diretamente dos "genes" (conceito cada vez mais elusivo
nestes últimos anos post-ENCODE). Isto envolvia a suposição implícita de que seria
possível explicar a função e os efeitos de todos ou pelo menos a maioria dos genes
envolvidos no controle da variação quantitativa durante o desenvolvimento da planta,
em cada população e ambiente. No entanto, apesar dos avanços realizados com o
mapeamento de QTLs, genética de associação (GA) e genética reversa a inferência
destes efeitos tem se revelado muito mais incerta do que se pensou inicialmente. A
incapacidade de se chegar a uma explicação causal precisa dos efeitos e interações
de genes individuais, tem causado uma mudança de paradigma nas perspectivas de
incorporar a genômica na prática do melhoramento de fenótipos complexos. Estamos
migrando da tentativa de descobrir genes ou regiões genômicas individuais e voltando
a lidar com o agregado do genoma, assim como a genética quantitativa classicamente
faz, porém utilizando a genotipagem ou sequenciamento denso de todo o genoma.
Isto permite evoluir do modelo infinitesimal para a estimação da contribuição de cada
um dos segmentos cromossômicos para a variação observada. Isto por sua vez torna
possível predizer fenótipos futuros de um indivíduo com base em modelos construídos
com dados genômicos e fenotípicos passados, em uma abordagem denominada
Seleção Genômica (SG). Esta tecnologia já é realidade no melhoramento de animais
domésticos e vem sendo rapidamente incorporada no melhoramento de plantas. Com
base em uma série de experimentos realizados e o desenvolvimento de uma
plataforma de alto desempenho de genotipagem de SNPs estamos iniciando a
implementação operacional da SG no melhoramento intensivo de eucalipto no Brasil.
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P02- Stress tolerance in peanuts: a genomic approach using wild Arachis
Brasileiro, ACM1; Ana CG Araujo1; Guimarães, LA1; Williams, CCV1; Vidigal, BS1; Silva, M1; Martins,
ACQ1; Silva, AK1; Nicolini, T1; Bonfim, O1; Togawa, RC1; Saraiva, MAP1; Fonseca, LN1; Bertioli, D2;
Leal-Bertioli, SCM1; Guimarães, PM1
1Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, CP 02372, CEP 70.770-
900, Brasília, DF, Brazil
2Universidade
de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas,
Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP 70.910-900, Brasília, DF, Brazil
[email protected];
Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is morphologically diverse but has a narrow
genetic base due to its origin. The understanding of its genetic processes has been
hindered so far by the non-availability of a fully sequenced genome and limited
genomic resources. Due to the higher genetic diversity and adaptation to a range of
environments throughout the evolution course, peanut wild relatives (Arachis spp.)
constitute a rich source of alleles for resistance to abiotic and biotic stresses. In
particular, A. duranensis and A. stenosperma harbor high adaptability to limited water
environments and root-knot nematode resistance, respectively. In order to identify
genes in these wild Arachis species that are differentially expressed in response to
drought stress and to nematode (Meloidogyne arenaria) challenge we conducted
comprehensive transcriptome analyses using sequencing data obtained with Sanger,
454 and Illumina HI-SEQ technologies. In silico analysis revealed that several genes
were significantly modulated (up- or down-regulated) in stressed or control conditions.
Differentially expressed candidate genes related to abiotic and biotic stresses were
further selected for validation through qRT-PCR. Among these, expansin, aquaporin,
dehydrin, chaperone, nitrilase, transcription factors, resistance protein MG13,
resveratrol synthase coding genes revealed high levels of differential expression in
stressed plants, validating the relationship of these genes with drought responses or
nematode resistance. The identification of candidate genes for resistance to abiotic
and biotic stresses can provide additional resources for peanut breeding and
transgenic approaches.
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P03-Estratégia genômica para o entendimento da produção de celulases pelo
fungo Trichoderma reesei
Roberto N. Silva
Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Dept. Bioquímica e Imunologia
[email protected]
O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) produz um grande
número de celulases e hemicelulases que podem ser usadas na degradação de
componentes da biomassa com aplicação na produção de bicombustível. A
transcrição da maioria dos componentes do complexo de celulases é induzida não
apenas por celulose, mas também por uma variedade de dissacarídeos incluindo
lactose, celobiose e soforose e antagonizado por glicose. Entretanto, nem a natureza
do indutor nem as vias de sinalização celular são totalmente conhecidas. Nesse
estudo investigamos a expressão gênica diferencial de T. reesei crescido em celulose,
soforose e glicose. Nossos dados revelaram novos componentes na degradação da
celulose, tais como proteínas acessórias com funções não catalíticas,
transportadores, fatores de transcrição, e CAZymes, que respondem especificamente
resposta quer a celulose ou soforose. Além disso, foi possível a identificação de novos
transportadores de açúcares e fatores de transcrição associados exclusivamente a
degradação da biomassa vegetal. Com os dados obtidos, será construído um modelo
relacionado ao papel desses transportadores e fatores de transcrição no metabolismo
de diferentes fontes carbono, possibilitando uma melhor compreensão do
comportamento das enzimas celulolíticas produzidas por T. reesei e contribuindo para
a aplicação desse fungo na indústria de bioetanol.
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P04- Da descoberta de novos vírus à caracterização funcional de genes virais
Melo, FL1,, Ardisson-Araujo, DMP1, Ribeiro, BM1, Ribeiro, S2, Nagata, T1, Resende, RO1, Souza, M2
1Universidade
2EMBRAPA
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, CP 02372, CEP 70.770-
900, Brasília, DF, Brazil
[email protected]
A descrição da biodiversidade viral tem despertado a atenção da comunidade
cientifica em todo o mundo e estudos metagenômicos virais de diferentes organismos
e amostras ambientais de diferentes regiões do planeta sugerem que grande parte da
biodiversidade viral ainda permanece desconhecida e deverá ser caracterizada no
futuro. O conhecimento da composição e dinâmica de comunidades virais tem
implicações importantes em diversas áreas visto que: (i) os vírus têm sido envolvidos
em diferentes processos biológicos/ecológicos (ciclagem de nutrientes, indução de
resistência ao frio em plantas, etc.), (ii) apresentam um enorme potencial
biotecnológico (controle biológico, vetores de expressão heteróloga de proteínas em
animais e plantas, vetores de silenciamento gênico em plantas, etc.) e (iii) são
responsáveis pela maioria das doenças emergentes em animais e plantas. A
importância desses estudos cresce na medida em que a pressão antrópica nos
ecossistemas aumenta, pois a dinâmica acentuada de desmatamento e de alteração
no uso do solo pode favorecer a emergência de patógenos virais de importância para
saúde publica e sanidade animal/vegetal, e acelerar a perda da biodiversidade e de
serviços ambientais importantes. Neste contexto, serão apresentados resultados
preliminares da Rede Centro-Oeste de Pesquisa em Biodiversidade Viral referentes
à descoberta de novos vírus em diferentes espécies de insetos, plantas e amostras
ambientais. Além disso, resultados de estudos genômicos e funcionais de
representantes da família Baculoviridae serão apresentados.
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P05- Metagenômica funcional da microbiota em solos tropicais
S.M. Tsai, A.A. Navarrete, L.W. Mendes, F.S. Cannavan, C.D. Borges.
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade
de São Paulo, Av. Centenário-303, Piracicaba-SP, CEP.13.416-000.
[email protected]
Uma suposição frequentemente feita é que a perda da biodiversidade está
acontecendo mais rapidamente em regiões tropicais devido à expansão das
atividades agrícolas. O processo de conversão de terra e intensificação da agricultura
é uma das mais importantes causas de perda de biodiversidade, com efeitos
negativos, tanto sobre o ambiente, assim como na sustentabilidade da produção
agrícola. A consequente redução da diversidade da comunidade do solo pode causar
uma perda de função, reduzindo a capacidade dos ecossistemas para suportar os
períodos de estresse, levando a efeitos indesejáveis. Os cientistas começaram a
quantificar as relações causais entre (i) a composição, diversidade e abundância de
organismos do solo, (ii) a fertilidade do solo e produção sustentável de culturas
associadas, e, (iii) os efeitos ambientais, incluindo as emissões de gases de efeito
estufa e sequestro de carbono do solo. Consequentemente, as ações que visam
diretamente a conservação de componentes da diversidade microbiológica trarão
benefícios ambientais em escala do ecossistema, da paisagem assim como em níveis
globais. Nosso objetivo é integrar dados físicos, químicos e microbiológicos do solo,
assim como de bioinformática, em um esforço para detectar, quantificar e
correlacionar os processos microbianos envolvidos nos processos biogeoquímicos
dos ciclos do C e N em solos sob cultivo da soja e cana. Usando estimadores de
diversidade, sequenciamento de DNA em larga escala e inferência estatística,
avaliou-se as diversidades avaliadas em filos de Bacteria e Archaea, assim como
quantificar genes funcionais associados à produção de gases de efeito estufa nos
solos. Os dados revelaram que mudanças no uso da terra alteram claramente a
estrutura das comunidades e abundância de domínios de Bacteria e Archaea em
solos, destacando alguns grupos envolvidos no funcionamento do ecossistema e
manutenção de processos biogeoquímicos. Assim, variações temporais e espaciais
na estrutura da comunidade microbiana e de genes funcionais associados ao
consumo/emissão de GHG podem ser utilizadas como dados adicionais no
monitoramento da microbiota em solo ou na rizosfera das culturas de plantas
[FAPESP, CNPq, CAPES].
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P06- O Microbioma Itestinal Humano: estrutura, funções e modificações.
Hoffmann, C.1,2
1Universidade
de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Dep de Nutrição Eperimental, Av.
Prof. Lineu Prestes, 580 Bloco 14, Cidade Universitária, CEP 05508-000, São Paulo, SP, Brazil
2Universidade
[email protected]
O organismo humano, composto de cerca de 10 trilhões de células, abriga entre 10 e
100 vezes mais células microbianas no seu interior e superfície. O genoma
combinado dessa comunidade microbiana, composta de Bactérias, Arqueas, Fungos
e Bacteriófagos, supera o tamanho do genoma humano em pelo menos duas ordens
de magnitude. Quando consideramos essas informações, é difícil descartar o fato de
que esses microrganismos devam ser intimamente relacionados ao funcionamento
correto do corpo humano, e em nenhuma parte do mesmo isso é mais evidente do
que no sistema gastrointestinal. Aqui estão abrigados inúmeros grupos de
microrganismos, compondo uma diversidade que é sem precedentes. Somente em
grupos bacterianos estima-se que estejam presentes mais de 1.800 gêneros e entre
15.000 e 36.000 espécies, das quais a maioria é desconhecida e até hoje não
cultivável. Exemplos de funções da microbiota intestinal, e de sua relação mutualistica
com o oganismo humano, incluem a fermentação de carbohidratos não digeríveis,
síntese de certas vitaminas essenciais, degradação de oxalatos, desenvolvimento do
sistema imune e a estimulação da angiogênese intestinal. Alterações nessa relação
podem levar a um estado patogênico, seja pela introdução de um organismo estranho
ao sistema, pela desregulação da comunidade microbioma autóctone, ou por efeitos
oriundos do hospedeiro humano (por exemplo, processos inflamatórios). Exemplos
da disrupção entre o microbioma e o organismo humano que induzem estados
patológicos incluem a obesidade, o diabetes, a arteriosclerose e diversas doenças
inflamatórias intestinais. Entre os fatores humanos que influenciam a microbiota estão
a idade, o genótipo, e a dieta humana, sendo a dieta o fator de acesso mais fácil
quanto a à sua utilização em intervenções terapêuticas. A estrutura do microbioma
intestinal é uma característica de cada individuo, e o microbioma é adaptado a hábitos
alimentares de longo prazo de cada individuo, com pouca influência de intervenções
alimentar de curta duração. Se mudanças a longo prazo nos hábitos alimentares
poderão mudá-lo ou não ainda é uma questão aberta, e o quão essa interação
dieta/microbioma afeta quadros clínicos ainda requer um conhecimento mais
profundo da composição e da dinâmica presente na microbiota.
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M01- Mini curso: Preparação de amostras para NGS
Daniel Paiva Agustino
Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas,
[email protected]
In the dawn of Next Generation Sequencing (NGS) technologies, they have become
essential tools for most Biology laboratories interested in genomic, epigenomic and
transcriptomic approaches. They allow samples to be sequenced, producing massive
amounts of data in the scale of hours or days. Everyday new uses for these
technologies arise, thus creating new specific protocols for more specific approaches.
In this Minicourse, the context of NGS technologies in biological research will be
studied, focusing in RNAseq methodologies. The RNAseq pipeline of sample
preparation from bench to sequencer will be analyzed. This includes the comparison
of RNA extraction protocols, RNA quality control methodologies, library preparation
techniques and experimental design for RNAseq experiments.
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M02- Mini curso: Espectrometria de massa top-down no estudo de complexos
proteicos nativos
Luis Henrique Ferreira do Vale
[email protected]
Proteômica é definida como o estudo em larga escala do conjunto de proteínas
contidas em uma amostra biológica, sejam células, tecidos ou fluídos biológicos. A
velocidade, a especificidade e a sensibilidade atual, em particular, da espectrometria
de massas, a tem tornado especialmente atraente para uso em estratégias que
requeiram rápidas identificações e caracterizações proteicas. Atualmente, existem
duas abordagens gerais para a análise proteômica: “bottom-up” e “top-down”.Os
processos “bottom-up” tem sido a abordagem da pesquisa proteômica mais utilizada
nas últimas duas décadas. Basicamente, nesta abordagem, as proteínas são
digeridas com proteases e os correspondentes peptídeos são analisados em
espectrômetro de massas. Proteômica “top-down” envolve medições em alta
resolução e acurácia de massa moleculares de proteínas intactas e a fragmentação
direta de íons dessas proteínas na fase gasosa de espectrômetros de massa de alto
desempenho. A abordagem “top-down” permite caracterizações acuradas de
interações proteína-proteína, de interações proteína-ligante, de modificações
proteicas pós-traducionais, de proteoformas, com a possibilidade real de elucidação
completa de sequências de aminoácidos em muitos casos. Por sua vez, a
espectrometria de massas (MS) é uma ferramenta de química analítica que determina
razões massa/carga (m/z) de átomos e compostos químicos ionizadas em fase
gasosa. Para tanto, um espectrômetro de massas deve ser composto basicamente
de quatro partes principais: uma fonte ionizante, um analisador de massas, um
detector e um sistema de aquisição de dados. Seguindo estas abordagens, o
minicurso tem como objetivo principal uma introdução `as duas técnicas princiapis de
proteômica levando em conta as teorias de espectrometria de massas que são
fundamentais para o desenvolvimento destas.
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M03- Mini curso: Biologia sintética e Nanotecnologia
Biologia sintética
Cíntia Marques Coelho
Professora no Departamento de Genética e Morfologia da Universidade de Brasília (UnB) e
pesquisadora colaboradora no Laboratório de Biologia Sintética da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia (Cenargen).
[email protected]
A biologia sintética é uma área emergente que abrange diferentes campos de
conhecimento da ciência e pode ser amplamente descrita como um desenho e
construção de processos biológicos não existentes em um organismo específico ou
re-desenho daqueles já existentes. Esse mini curso terá como objetivo a
apresentação e discussão de vantagens e desvantagens de ferramentas de edição
de genoma que são utilizadas na biologia sintética. Zinc finger nucelases (ZFNs),
transcription activator like effector nucleases (TALENS) e "clustered regulatory
interspaced short palindromic repeats" (CRISPRs) tem sido as tecnologias usadas
para edição de genoma. As três baseiam-se no sistema de reparo NEHJ (nonhomologous end-joing), induzido após a quebra da dupla fita da molécula de DNA
para produção de mutações do tipo inlserção e/ou deleção (indel). Se após a quebra
da dupla fita de DNA ocorrer o reparo através de recombinação homóloga genes de
interesse podem ser inseridos nesses locais. ZFNs e TALENs são proteínas
recombinantes que possuem um domínio de ligação ao DNA alvo e um domínio de
clivagem proveniente da enzima de restrição FokI. Já o CRISPR constitui um loci que
contêm várias repetições diretas curtas, e fornecem imunidade adquirida para
bactérias e archaea. Sistemas CRISPR são baseados em crRNA e tracrRNA para
silenciamento específico de seqüência do genoma alvo. Existem três tipos de
sistemas de CRISPR/Cas e o sistema de tipo II foi utilizado para o desenvolvimento
da ferramenta de edição do genoma, onde Cas9 é utilizada como uma endonuclease
de DNA-RNA que cliva DNA, guiada sobre crRNA-tracrRNA de reconhecimento do
alvo.
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Nanotecnologia
Luciano Paulino da Silva
Pesquisador no Laboratório de Espectrometria de Massa da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia (Cenargen) e professor nos Programas de Pós-graduação em Nanociência e
Nanobiotecnologia e de Biologia Animal na Universidade de Brasília (UnB).
[email protected]
A nanotecnologia é uma área do conhecimento que integra várias ciências como a
física, a química, a biologia e a ciência dos materiais. Os sistemas nanoestruturados,
devido ao seu tamanho em nanoescala (em geral com pelo menos uma das
dimensões entre 1 a 100 nm) apresentam propriedades novas ou aprimoradas
baseadas nas suas características especificas (tamanho, forma, carga de superfície,
composição, entre outras) quando comparadas a estruturas de dimensões maiores
provenientes do mesmo material. Duas abordagens principais são utilizadas para
síntese de nanossistemas as quais são conhecidas em nanociência e nanotecnologia
como top-down (de cima para baixo) e bottom-up (de baixo para cima). A estratégia
top-down consiste na desconstrução de material macroestruturado, geralmente por
técnicas de nanolitografia ou por moagem de alta energia, até a obtenção do produto
final nanoestruturado. Essa abordagem é comumente utilizada para produção em
escala, mas são observadas dificuldades para obtenção de uma homogeneidade nas
características do produto final. A outra abordagem, bottom-up, segue o caminho
oposto no qual a nucleação de crescimento ocorre a partir de átomos e/ou moléculas
individuais para a formação das nanoestruturas. Essa abordagem permite controlar
diversos parâmetros, como a distribuição de tamanho e forma das nanoestruturas,
sendo a mais utilizada atualmente. Diversos avanços vêm sendo demonstrados nos
últimos anos por meio da aplicação de estratégias para produção de nanossistemas,
sobretudo por rotas sustentáveis as quais serão discutidas nesse mini curso.
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P07- Sequence and pattern based characterization of insect viromes via small
RNA metagenomics
Aguiar, ERGR1, Olmo, RP1, Vianna, FF1, Paro, S2, Lobo, FP3, Drumond, BP4, Gontijo, NF5, Sant’Ana,
MRV5, Moreira, LA6, Meignin, C2, Imler, JL2, Marques, JT1
1-Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil
2- UPR9022 Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire,
Strasbourg, France
3- EMBRAPA-Campinas, Brazil
4- Department of Parasitology, Microbiology and Immunology, Universidade Federal de Juiz de Fora,
Minas Gerais, Brazil
5-Departament of Parasitology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
Belo Horizonte, Minas Gerais , Brazil.
6- Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil.
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
Arthropod-borne viruses (arboviruses), such as dengue virus (DENV), infect millions
of people annually and have great impact on public health. Incidence of arboviral
diseases has been steadily rising and, at the same time, discovery of new arboviruses
has stagnated since the mid-60s. Most arboviruses lack specific and effective
treatment or vaccines. Surveillance strategies to monitor and discover new
arboviruses are important to help design public health policies. Here we developed
and applied a broad metagenomics strategy for the identification of the virome in three
different dipteran insects. We deep sequenced small RNA libraries from wild vector
insects, Aedes aegypti mosquitoes and Lutzomyia longipalpis sand flies, and the
laboratory model organism Drosophila melanogaster. We found two mosquito viruses
that includes a new virus most similar to the Luteoviridae family and a new strain of
Phasi Charoen virus previously identified as a Bunyavirus present in mosquitoes from
21
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Thailand. We also identified three new viruses in sand flies, two of which show
similarity to members of the Reoviridae family and one with the Nodaviruses. In fruit
flies, we found two new viruses that were most similar to Reoviridae and Caliciviridae
families. Apart from the new strain of PhasiCharoen virus, all other six viruses likely
represent new species. Viral contigs obtained from our metagenomic approach were
confirmed by RT-PCR and sequencing. In some cases, SNPs between contigs and
PCR products but all of them represented polymorphisms present in small RNA reads
suggesting they represent the genetic diversity naturally found in the viral population.
Small RNA size and density profiles for all viral contigs were characteristic for each
virus and could indicate differences in infection strategies such as tissue tropism and
RNAi pathway inhibition. Although most viruses we identified were at very high
prevalence in insect populations, one of the reoviruses was at very low prevalence in
the sand fly population. Nevertheless, our approach was still sensitive enough to
detect this virus. Following our initial strategy based on sequence similarity we also
applied a pattern-based approach to identify viral sequences. We searched for contigs
presenting small RNA profiles consistent with other viruses and were able to detected
additional contigs that likely represent other segments from the two reoviruses in sand
flies. These contigs have small RNA profiles and expression that perfectly mimic the
other reovirus sequences we identified. Importantly, they do not show significant
similarity to any sequence in genbank. We also validated the strength of our approach
by applying it to other previously published small RNA datasets. In every library
analyzed from adult mosquitoes or Drosophila and mosquito cell lines, we were able
to identify viruses that had not been detected before. Utilizing our pattern-based
approach, we detected a contig with virus-consistent small RNA profile that is
completely uncharacterized. Together, our results show the power of our approach to
reliably identify and characterize new viruses in insects without any prior information.
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P08- Ferramentas de bioinformática aplicadas às análises de dados “OMICS”
Fernandes, GR.
Universidade Católica de Brasília – UCB - Campus Avançado Asa Norte - SGAN 916 Módulo B Avenida
W5 - CEP: 70790-160 - Brasília/DF
[email protected]
Em uma era pós-genômicas, quando a geração de dados guia as pesquisas
científicas, é cada vez mais importante o uso e desenvolvimento de ferramentas
capazes de extrair o máximo de informação dos dados produzidos. Dados genômicos,
transcritômicos e metagenômicos podem ser utilizados para diversas finalidades
desde que sejam acoplados a um fluxo de trabalho com ferramentas que deem ao
pesquisador a resposta para uma pergunta objetiva. A chamada "data driven science",
ao contrário do que sugere, exige planejamento para que os experimentos sejam
desenhados de modo que possam responder a uma determinada pergunta biológica.
No presente trabalho, serão apresentadas alternativas e aplicações de dados de NGS
para estudos de associação, anotação de genomas, análises de expressão de genes,
assim como as condições que devem ser consideradas para a geração desses dados.
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Apresentações orais
P09 - Mayara Simonelly Santos - Entrega de Azul de Metileno mediada por Nanofolha
de Óxido de Grafeno para Terapias Fotodinâmica e Fototérmica Combinadas no
Tratamento de Carcinoma Mamário Humano In Vitro e In Vivo.
P10- Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of a novel
bacterial protease selected in a metagenomic approach
P11- Caio Silva Souza - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains.
P12- Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli engenheirada
metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de
aranha e origina fibra sintética.
O conteúdo destas apresentações encontra-se na seção de resumos.
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P13- Role of conformational equilibrium in molecular recognition: regulation of
catalysis, defensins and virus assembly
Fabio C. L. Almeida
Biomolecular NMR Laboratory, National Center of Nuclear Magnetic Resonance, Institute of Medical
Biochemistry and Nucleus for Structural Biology and Bioimaging, Federal University of Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, Brazil.
[email protected]
Proteins are dynamic entities able to move in a wide range of timescales that goes
from picoseconds to seconds. Motions that occur in microseconds to seconds define
biologically relevant events that are frequently involved in binding, allostery and
catalysis. We measured relaxation parameter, relaxation dispersion experiments and
molecular dynamic simulation in order to correlate conformational equilibrium with
membrane interface recognition. We probed the dynamics of plant defensins from
sweet peas (Psd1) and sugar cane (SD5) and correlated to their ability to specifically
bind a glucosylceramide at the target membrane. In spite of the great similarity in
folding, their binding site is remarkably different, and highly dependent on the
dynamics. Using CPMG relaxation dispersion methods we characterized the structural
property of the excited state conformation of sugar cane defensin 5 and observed that
for Cys-stabilized folding conformational equilibrium is mainly regulated by polar
contacts, enabling this kind of folding to successfully insert hydrophobic residues
facing that protein surface. These finding are essential to understand evolution of cysstabilized folding, which includes several protein families. We will also show how
Dengue virus capsid protein (DENVC) recognizes lipid droplets (LD) inside the cells.
LDs recognition is essential for virus assembly. The understanding of the participation
of the intrinsically disordered N-terminal region and its dynamics helped us to develop
an inhibiting peptide.
ACKNOLEDGEMENTS: FAPERJ, CAPES, CNPq, INBEB-CNPq, Program Science
Without Borders-CNPq
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P14- Intracellular trafficking mediated by actin-based molecular motors: The
myosin V family
Mario T. Murakami
Laboratório Nacional de Biociências (LNBio) - Centro Nacional de Pesquisas em Energia e Materiais
(CNPEM).
[email protected]
Unconventional myosins are actin-based molecular motors ubiquitous in eukaryotic
cells, which participate in a multitude of intracellular processes including cell division,
cell movement, intracellular transport and signal transduction. Mutations or defects in
myosin genes are related to a variety of human diseases such as Griscelli syndrome
that is characterized by hypopigmentation and neurological disorders and some types
of cancer promoting proliferation, invasion and motility. The goal of this research line
is shed light on the sophisticated molecular mechanisms involved in the signaling,
regulation and selectivity of these essential molecular motors for eukaryotes. In this
presentation, our recent findings regarding the functional differentiation and
overlapping in the Myosin V family will be discussed.
Acknowledgements: FAPESP, CNPq and CAPES.
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P15- A espectrometria de massas como ferramenta de biologia estrutural
Fabio Cesar Gozzo
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. Instituto de Química - Unicamp
Cidade Universitária 13083970 - Campinas, SP – Brasil
[email protected]
Nos últimos anos, a espectrometria de massas (MS) tem avançado no campo de suas
aplicações e uma das áreas de grande desenvolvimento é a aplicação da técnica no
estudo das estruturas e interações de proteínas e complexos proteína-proteína. Para
se obter informações estruturais, três técnicas baseadas em MS tem se destacado:
mobilidade iônica, troca H/D e ligação cruzada (cross-linking). Através do uso
combinado dessas três técnicas, pode-se obter um conjunto complementar de
informações estruturais de proteínas e complexos, em especial para aquelas que não
são passíveis de serem analisadas por métodos de alta resolução. Essas informações
estruturais compreendem dados sobre a dinâmica das proteínas, a determinação de
parceiros de interação, mapeamento das regiões de interação proteína-proteína, além
de fornecer dados para guiar a modelagem molecular de proteínas. Neste seminário
essas técnicas serão apresentadas assim como aplicações recentes em sistemas
biológicos de interesse.
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P16- Atualidades/tendências e integração de dados de diferentes técnicas no
estudo da biologia estrutural
Fabio C. L. Almeida (UFRJ)
Mario T. Murakami (CNPEM)
Fabio Cesar Gozzo (Unicamp)
Marcelo Valle de Sousa (UnB)
João Alexandre R. G Barbosa (IB-UnB)
Aline Lima de Oliveira (IQ- UnB)
Proteínas são polipeptídeos compostos de aminoácidos e estão envolvidos na maior
parte dos processos biológicos. Nos últimos 50 anos, o estudo de estruturas a nível
molecular revolucionou a visão da biologia. A análise da estrutura tridimensional de
proteínas, complexos proteicos bem como suas redes de interações são
fundamentais, uma vez que quase todos os processos biológicos envolvem uma
regulamentada cooperação entre várias subunidades de proteínas em termos de
tempo e espaço. Igualmente importante estão as interações de proteínas com outras
biomoléculas, tais como DNA, cofatores e moléculas mensageiras, que também
contribuem para a complexidade da regulação. Identificação, caracterização
estrutural e funcional dos componentes envolvidos nestes mecanismos e como eles
interagem para desempenhar suas funções biológicas é a chave para a compreensão
dos processos biológicos a nível molecular. Há várias abordagens experimentais para
se investigar estes aspectos da biologia estrutural. Nesta mesa redonda, será
abordado os principais avanços, perspectivas e integração de informações entre a
espectrometria de massas, cristalografia e ressonância magnética nuclear na biologia
estrutural.
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Apresentações orais
P17- Elias Ferreira Sabiá Júnior - Detecção e Caracterização de Proteínas
Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Câncer
Humano.
P18- Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of gramnegative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule.
P19 - Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of a medical
interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals
a new transcription terminator factor possibly acquired from the host.
P20- Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita
dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no
inseto alvo.
O conteúdo destas apresentações encontra-se na seção de resumos
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P21- RECOBIO: MidWest Network to education and research on computational
biology
Brígido, M1, Treptow, W 1, Montera, L2, Pereira, M3
1Universidade
2Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul, Faculdade de Computação, CEP 79070-900, Campo
Grande, MS, Brazil
3Universidade
Federal de Goiás, Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, CEP 74001-970, Goiânia, GO, Brazil
[email protected]
A Rede Centro-Oeste de Formação e Pesquisa em Biologia Computacional foi criada
visando ao desenvolvimento de projetos de pesquisa e à formação de recursos
humanos em Biologia Computacional, bem como a nucleação de equipes acadêmicas
das grandes áreas Ciências Biológicas, Exatas e da Terra. É composta atualmente
por sete Programas de Pós-graduação das Universidades Federais de Goiás, Mato
Grosso do Sul e Brasília e suas áreas temáticas e linhas de pesquisa da Rede
abrangem: (a) análise computacional de dados de alto desempenho, (b) biologia
estrutural computacional e (c) biologia de sistemas. Buscando atingir os objetivos
propostos, estão previstas ações das seguintes categorias: (i) integração de grandes
áreas; (ii) formação de recursos humanos; e (iii) atividades de extensão. Nessa
palestra serão apresentadas as bases desse projeto, suas realizações e perspectivas.
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P22- Mecanismo de ativação de canais iônicos dependentes de voltagem, Kv e
Nav, e a interação com anestésicos gerais*
Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro, Sonia Maria de Freitas, Werner Treptow.
Homenagem à Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro.
* Prêmio CAPES de Tese - Edição 2014, teses defendidas em 2013.
[email protected]
O papel fundamental dos canais catiônicos dependentes de voltagem (VGCC) nos
mais diversos organismos baseia-se no seu complexo mecanismo de ativação, i.e a
transição entre dois estado fisiológicos funcionais desses canais: ativado/aberto (AT)
e desativado/fechado (RT). Logo após a publicação da primeira estrutura
cristalográfica do canal de mamífero Kv1.2 na conformação AT, alguns modelos do
estado RT tem sido propostos na literatura para este canal. Para todos esses
modelos, análises estruturais tem sugerido um consenso com os dados
experimentais, destacando portanto a natureza inequívoca dessas estruturas RT.
Tomados em conjunto, os estudos estruturais sobre o Kv1.2 são até agora o único
conjunto de dados disponível, no nível das interações atômicas, para o entendimento
sobre o mecanismo de ativação da superfamília VGCC. Recentemente, a estrutura
cristalográfica de um canal de sódio de procarioto, dependente de voltagem (NavAb),
foi resolvida numa conformação interpretada como estado pré-ativado do canal.
Como um possível ancestral da superfamília dos canais de sódio e cálcio
dependentes de voltagem de vertebrados, o surgimento da estrutura atomística do
NavAb nos proporciona a primeira, e até então a única, estrutura de alta resolução
para estender nossa compreensão sobre outros membros da superfamília VGCC.
Dessa forma, de modo a contribuir com o referido tema, consideramos as estruturas
AT e RT do Kv1.2, equilibradas na membrana, como guias estruturais em uma série
de simulações de dinâmica molecular no intuito de investigar o processo de ativação
do canal NavAb. Além de identificar a estrutura cristalográfica do NavAb como um
estado intermediário dentro do caminho de ativação, nosso trabalho permitiu
determinar conformações relacionadas aos estados fisiológicos funcionais
estruturalmente relacionados às estruturas AT e RT. De maneira geral, os resultados
suportam a ideia de um mecanismo de ativação altamente conservado ao longo de
toda a superfamília de VGCC.
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Resumos
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R00-Entrega de Azul de Metileno mediada por Nanofolha de Óxido de Grafeno
para Terapias Fotodinâmica e Fototérmica Combinadas no Tratamento de
Carcinoma Mamário Humano in vitro e in vivo
Mayara Simonelly Costa dos Santos; Leonardo Giordano Paterno; Paulo Eduardo Narcizo De Souza;
Ricardo Bentes De Azevedo; Sônia Nair Báo.
Microscopia Eletrônica
As terapias fotodinâmica (TFD) e fototérmica (TFT) destacam-se como alternativas
terapêuticas aos métodos convencionais para o tratamento de carcinoma mamário. A
TFD envolve: agente fotossensibilizante (FS), luz de comprimento de onda específico
e oxigênio. O produto dessa reação são espécies reativas de oxigênio capazes de
induzir efeitos tóxicos a células e tecidos-alvo. Na TFT, um agente fototérmico
absorve luz, a qual induz o aumento da temperatura localmente, causando dano
celular, desnaturação das proteínas, DNA e coagulação do tecido. O FS azul de
metileno (AM) possui forte absorção de luz de comprimento de 660 nm e alta
eficiência fotodinâmica. O grafeno, composto derivado do grafite, tem sido proposto
com um bom material para a associação e entrega de drogas. Além de possuir alta
eficiência fototérmica, absorção em 808 nm. A associação do grafeno ao AM
possibilitaria o uso de um dispositivo de efeito sinérgico, aonde o agente
fotossensibilizante e fototérmico estão em uma única nanoestrutura para o tratamento
de carcinomas. As nanofolhas de óxido de grafeno e azul de metileno (NanoGO-AM)
foram produzidas a partir de reação de carboxilação de óxido de grafeno, sonicação
e adsorção do tensoativo Pluronic F127 e do fotossensibilizante AM. As nanofolhas
apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 110 nm, índice de polidispersão de
0,3 e potencial zeta de -46,2 mV. A ultraestrutura das nanofolhas, em característico
formato de folhas, pode ser observada em microscopia eletrônica de transmissão.
Foram construídos dispositivos de LED (660 nm, AM) e laser (808 nm, NanoGO) para
irradiação do fármaco. Após a irradiação do NanoGO-AM com o LED 660 nm, podese observar produção de espécies reativas de oxigênio em espectrofotômetro.
Durante a irradiação de NanoGO-AM com o laser 808 nm (densidade de energia 2
W/cm2) por 3 minutos, houve a variação de temperatura da amostra de 28 °C para
53 °C. Mostrando assim, o potencial da NanoGO-AM em produzir dano celular
irreversível.
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R01-Síntese racional de análogos de toxinas escorpiônicas com ação em canais
KV1.3 visando uma abordagem terapêutica contra a esclerose múltipla
Solange Cristina Rego Fernandes; Carlos Bloch Jr.; Elisabeth Schwartz.
[email protected]
Laboratório De Toxinologia
Canais Kv1.3, membros da família de canais de K+ voltagem-dependentes, são
expressos predominantemente em linfócitos T humanos, e têm sido amplamente
utilizados como alvos farmacológicos em terapias imunossupressoras, principalmente
no tratamento da Esclerose Múltipla (EM). O bloqueio in vitro e in vivo desses canais
tem demonstrado um papel crucial na patogenicidade da doença, levando à melhoria
da encefaliomielite autoimune experimental (EAE) em ratos. Bloqueadores peptídicos
têm mostrado alta potência e especificidade para os canais Kv1.3 e, até o momento,
os mais potentes e seletivos foram isolados da peçonha de escorpiões. Neste campo,
o desenho racional de peptídeos tem grande valor: por meio de mutações e alterações
pontuais, a potência e seletividade dos peptídeos podem ser grandemente
influenciadas. Os peptídeos serão sintetizados em sintetizador automático pela
estratégia Fmoc/t-butila em suporte sólido utilizando as resinas de Wang apropriadas;
purificados por RP-HPLC e analisados por espectrometria de massa MALDI-TOF. A
atividade bloqueadora será testada em diferentes linhagens celulares expressando
canais de potássio por meio de patch-clamp. Para o modelo da EAE, a fase de
sensibilização será realizada in vitro pela apresentação de auto-antígenos às células
T, seguida pela fase in vivo, onde linfócitos autorreativos serão transferidos a fim de
causar a doença. Serão realizados ensaios de prevenção e tratamento. O peptídeo
Tc32, isolado a partir da peçonha do escorpião amazônico Tityus obscurus, foi
escolhido como modelo no presente estudo por ser um potente bloqueador de canais
Kv1.3 (Kd de 10 nM). Foram sintetizados quatro peptídeos, um com sequência
primária idêntica à Tc32 e outros três análogos variando quanto à ausência das
regiões N- e C-terminais. A massa teórica experimental foi confirmada e,
posteriormente, o processo de oxidação foi realizado com a finalidade de fechar as
pontes dissulfeto. A partir da obtenção e purificação dos peptídeos em sua
conformação ativa, serão realizados experimentos eletrofisiológicos para registros
dos canais Kv1.3 em patch-clamp, além de outros canais da família Kv1. Os peptídeos
bloqueadores de Kv1.3 mais potentes e específicos serão testados in vivo utilizando
o modelo da encefalomielite autoimune experimental para esclerose múltipla.
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R02-Engenharia metabólica de soja e edição de genoma de genes associados a
ácidos graxos
Débora Torres Alves Figueiredo, Cíntia Coelho, Marly Coelho, André Melro Murad, Nicolau Cunha,
Giovanni Vianna, Elíbio Rech.
[email protected]
Laboratório De Biologia Sintética Embrapa
O biodiesel vem se destacando como uma importante fonte de energia renovável e
sustentável. Dentre as matérias-primas utilizadas para a produção do biodiesel, a soja
(Glycine max) se destaca pelo alto teor e qualidade do óleo de suas sementes,
domínio do sistema de produção em larga escala e custo reduzido quando comparado
a qualquer outro óleo. Sementes de soja apresentam um perfil de ácidos graxos
composto principalmente de 13% de ácido palmítico (16:0), 4% de ácido esteárico
(18:0), oléico 18% ácido (18:1), ácido linoléico 55% (18:2) e 10% de ácido linolênico
(18:3). Devido a essa alta proporção de poliinsaturados ácidos graxos, o óleo de soja
é oxidativamente instável e oxidado, fato que pode comprometer o desempenho do
motor e utilização como opção viável de biocombustível. Para maximizar as
características de um bom biodiesel, tem-se sugerido o desenvolvimento de um óleo
rico em ácido oléico e com baixo teor de ácidos graxos saturados. Os genes FAD21A e FAD2-1B são importantes na conversão do óleo monoinsaturado (oléico) em
óleo poliinsaturado (linoléico). Transcription activator-like effector nucleases
(TALENs) foram desenhados a fim de se obter mutações tipo nula em dois genes
importantes da via metabólica de ácidos graxos e gerar linhagens com maior teor de
ácido oléico. Neste trabalho através de cromatografia gasosa, foram obtidas três
linhagens independentes com o conteúdo de ácido oleico aumentado, variando 3166%.
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R03-Genome sequence and analysis of a medical interest baculovirus isolated
from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription
terminator factor possibly acquired from the host
Clara Wandenkolck Silva Aragão; Fernando Lucas Melo; Daniel Ardisson Araújo; Miguel Andrade;
Bergmann Morais Ribeiro.
[email protected]
Virologia
Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) is a poisonous larvae of medical
importance due to the severity of accidents occurred in Brazil caused by the contact
of these larvae with the human skin. The possibility of controlling these populations is
being evaluated by using pathogens such as a nucleopolyhedrovirus isolated from L.
obliqua. In this work, we have sequenced the genome of the baculovirus LoobMNPV
and analyzed its genomic composition and evolutionary history. The genome is
120.022 bp long, comprising 135 putative ORFs. Furthermore, in an evolutionary
context, based on analysis that include the core gene from 93 sequenced baculovirus
, LoobMNPV fell into a basal position related to the Alphabaculovirus group I
(lepidopteran-infective NPV). Interestingly, one ORF showed significant identity (evalue equals to 3e10-11) to a eukaryotic transcription terminator factor (TTF2) from
the lepidoptera Danaus plexippus (GenBank: EHJ68439.1). On the other hand, when
restricting this search only to baculoviruses, this ORF also demonstrated identity (evalue of 1e10-6) to the Global Transactivator (GTA) gene from Antheraea pernyi
nucleopolyhedrovirus (Genbank:YP_611073.1). Phylogenetic analysis were
performed with the TTF2 gene from various organisms, as well as with the GTA from
baculovirus. These results indicated two hypothesis: (i) this gene may have been
independently acquired from the host through horizontal transfer, acting as an inhibitor
of the host´s transcriptional machinery in order to benefit viral translation; (ii) or it is a
divergent variation of the GTA gene that has undergone positive selection.
36
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R04-Análise estrutural da proteína PPARγ in silico e por difração de raios x
Jônatas Cunha Barbosa Lima; Erika Sampaio, Kelly Grace Magalhães, Luiz Romeiro; João Alexandre
Ribeiro Gonçalves Barbosa.
[email protected]
Laboratório De Biofísica Estrutural
Os receptores PPAR são importantes em tecidos como o adiposo e muscular por
estarem relacionados ao metabolismo glicose e lipídeos, dessa forma, sua alteração
está relacionada a doenças. Os PPAR heterodimerizam com a RXR para se associar
ao DNA, e possuem alguns domínios como o de ligação ao ligante (LBD). Os
receptores distribuem-se em subtipos: α, β/δ e γ, que possui as isoformas γ1 e γ2,
onde cada um possui funções específicas sendo encontrados em diferentes tecidos.
O PPARγ tem sido alvo de moléculas contra diabete, com ação anti-inflamatória, entre
outros. Algumas dessas podem interagir de modo full agonist, levando a respostas
mais fortes, e em consequência também mais efeitos colaterais, e partial agonist, com
respostas mais brandas. Neste trabalho usa-se o AutoDock Vina para analisar a
afinidade de interação dos ligantes com o PPARγ através de dois métodos de docking:
com a proteína rígida e com alguns resíduos de aminoácidos flexíveis. Até o
momento, os resultados mostram que nenhum ligante interagiu como full agonist, nos
dois tipos de docking executados todos se ligam em posições características de
partial agonist. No docking rígido, os ligantes LDT28, LDT29, LDT30 e LDT208
ocuparam duas posições durante a interação, mas o LDT13 ocupou somente uma
dessas. Um dos posicionamentos se encontrava mais no interior da proteína e
apresentou, em geral, maiores afinidades, o que era esperado, pois o ligante é
semelhante a um ácido graxo, sendo mais termodinamicamente favorável se
posicionar onde poderia realizar o maior número de interações hidrofóbicas. O LDT13
não foi encontrado no interior, mas, apresentou afinidades semelhantes aos lá
localizados, o que pode indicar maior afinidade. Serão realizados experimentos para
expressão e purificação da região LBD do PPARγ, com o objetivo de conseguir cristais
da interação deste com ligantes selecionados por estes resultados de docking e
ensaios celulares in vitro.
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R05-Caracterização
físico-química
e
molecular
da
enzima
bifuncional
Fosfatase/Fitase produzida por Trichoderma harzianum ALL42
Amanda Araújo Souza, Viviane Castelo Branco Reis, Marcelo Henrique Soller Ramada, Vanessa
Oliveira Leitão, Fernando Araripe G. Torres, Raphaela De Castro Georg, Cirano José Ulhôa, Sonia
Maria De Freitas.
[email protected]
As fosfatases ácidas (ACP) são enzimas produzidas por plantas e microrganismos
que hidrolisam ligações monoéster, liberando fósforo (Pi). Fitases são fosfatases que
degradam ácido fítico em mio-inositol e Pi. Estas enzimas apresentam aplicações
biotecnológicas como, enriquecimento de ração para animais, aumento de Pi no solo
e biorremediação; tratamento de efluentes contaminados com organofosfato. Neste
trabalho uma fosfatase ácida/fitase de T. harzianum ALL 42 foi purificada e
caracterizada fisicoquimicamente. Análises moleculares, clonagem do gene e
identificação da região codante desta proteína foram realizados. A proteína foi
purificada por exclusão molecular (Superdex-200) e sequenciada por espectrometria
de massa (MALDI-TOF/TOF). Os sete peptídeos obtidos foram comparados com
sequências do “GenBank”. O nível de expressão RT-PCR, tamanho da ORF,
presença de íntrons e análise de cDNA por PCR semi-quantitativa foram realizados.
O gene e cDNA da enzima foi clonado em PCR Blunt, replicado em Escherichia coli
(XL 10-Gold) e sequenciados pelo método de Sanger. A produção enzimática foi
de11,33 ± 0,10 U/mg e massa molecularde 95 KDa, com 30% de glicosídeo. A enzima
apresentou capacidade de degradar fenil fosfato de sódio, D-glicose-1-fosfato e ácido
fítico, em pH de 3 a 6, temperatura ótima 60oC, Km 0.027 µM e Vmáx 5.02 µM.min1. Em solução, a ACP apresentou-se monodispersa, compatível com a forma
monomérica. Os peptídeos obtidos no sequenciamento são similares a fitase de T.
harzianum, histidina fitase ácida de Trichoderma pleuroticola e uma proteína de
Trichoderma virens. A enzima foi parcialmente inibida por Pi e altamente inibida por
tungstato de sódio. Os ensaios qPCR revelaram alto nívelde expressão em meio
contendo apenas glicose. Fragmentos de 2.200pb, 1.843pb e de 1.570pb foram
amplificados, correspondendo ao gene completo, DNA genômico e cDna da ACP,
respectivamente. Análise das sequências mostrou que o DNA genômico da ACP
apresenta íntrons. A sequência do gene e da ORF estão sendo analisadas, e o DNA
plasmidial preparado para expressão heteróloga em Pichia pastoris. Após a
expressão dessa enzima, a análise estrutural e ensaios de cristalização serão
realizados.
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R06-Estudo da Capacidade Evolutiva de Tospovirus via Rearranjo Genético e
Sua Implicação na Epidemiologia Viral
Mariana Martins Severo de Almeida; Melo, Fernando Lucas; Martinez, Reina Teresa; Renato De
Oliveira Resende.
[email protected]
Virologia Vegetal
Viruses in the genus Tospovirus (family Bunyaviridae) are plant pathogens transmitted
by insects known as thrips, with a trisegmented single-stranded ambisense RNA (S,
M and L) genome and the ability to replicate in vector too. The diversity of the genus
comprises 8 recognized species with a variable host range and geographic
distribution. Tospovirus are widespread in the Americas, where Tomato chlorotic spot
virus (TCSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Groundnut ringspot virus (GRSV),
Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV),
Impatiens necrotic spot virus (INSV), Iris yellow spot virus (IYSV), Alstroemeria
necrotic streak virus (ANSV), Melon severe mosaic virus (MeSMV) and Bean necrotic
mosaic virus (BeNMV) have been reported. TCSV was first noticed in Brazil in the
early 1990's, with GRSV. Nowadays, GRSV is present in both new world and the old
world, whereas TCSV is find only in the Americas. A phylodinamic study was
conducted to infer the TCSV spread. Thirty-three sequences corresponding to RNA S
with coding (N protein) and no-coding regions were downloaded from GenBank. The
alignment was carried out using MUSCLE software. The phylogenetic and
phylodinamic relationships were inferred by BEAST package using Bayesian
Evolutionary Analysis. According to the sampling year, the spatial phylogenetic
reconstruction and the dynamic evolution were determined by SPREAD program.
Probably, TCSV has two different origins in South America, one in Brazil (S45325) and
the other in Argentina (U49709, U49707), in 1996. Brazilian lineage spread to the
country to North America and Caribe. Once in Caribe, it was introduced back in North
America. The first introduced in North America most likely in 1994, led to the first
reassortant intra-species isolates. This new isolate has the S and L RNAs from GRSV
and the M RNA from TCSV. The isolates originated from the second introduction in
the North America around the year 2006 are so close related to Caribbean isolates, at
least 97% identical. Comparing the first report of TCSV in Brazil with the last
(JQ034525) sampled in 2009, the nucleotide sequence accumulated modifications
resulting in 93% identity each other. That isolate is more related to Argentine lineage
sharing 99% identity, with a clearly well supported phylogenetic reconstruction. There
is not an updated information about the strain that are present nowadays in Brazil.
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R07-Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de FvFc em células de
mamíferos
Juan Fernando Riasco; Marcelo Macedo Brigido; Andréa Queiroz Maranhão
[email protected]
Laboratorio De Imunologia Molecular
Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas, produzidas pelas
células B, que fazem parte do sistema imunitário, com a capacidade de reconhecer
as moléculas específicas (antigénios). Os anticorpos monoclonais são ferramentas
essenciais na clínica e biotecnologia e provaram ser úteis no diagnóstico e tratamento
de doenças infecciosas, imunológicas e neoplásicas, bem como no estudo das
interações patógeno-hospedeiro e de marcação. Os anticorpos hoje disponíveis no
mercado apresentam parte de suas seuqencias de origem murina, o que pode levar
a respostas imunológicas adversas. Nesse sentido, obter sequências mais próximas
a de anticospos humanos pode minimizar os efeitos colaterais de sua utilização
terapêutica. Esse projeto tem como objetivo a produção de novas versões
humanizadas para anticorpos monoclonais que reconhecem o antígeno linfocitário
CD20 a partir da sequencia murina obtida do anticorpo comercialmente disponível
rituximabe. Utilizando-se a técnica de seleção de bibliotecas apresentadas na
superfície de em fagos (phage display), a seleção será feita a partir da sensibilização
de placas de microtitulação com a porção extracelular do antígeno CD20, O DNA
plasmidial dos ciclos zero e quatro serão extraídos e submetidos ao sequenciamento
de alto desempenho em plataforma 454 da Roche. Os dados gerados serão
disponibilizados em formato FASTAQ, As sequêencias geradas serão filtradas para
termos apenas aquelas com alto grau de qualidade A partir daí serão propostas
sequêencias para serem testadas nas etapas subsequentes do projeto na forma de
scFv, Os genes de scFvs selecionados serão redesenhados e sintetizados
quimicamente, buscando-se a otimização de códons para a expressão heteróloga em
células CHO e a sua posterior conversão na forma de FvFc, A atividade biológica será
testada in vitro por imunoensaio enzimático (ELISA). Além disso. Será testada a
capacidade de ligação das novas proteínas na superfície de células humanas de
linfoma por citometria de Fluxo. A fim de minimizar os efeitos adversos de antirituximab usando humanizado anti-CD20 tem sido proposto para avaliar a acção
molecular deste anticorpo no fundo genético das células, este estudo tem por
objectivo contendo Ac domínios humanos variáveis e menos imunogênica, que mais
tarde serão testados para a atividade biológica.
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R08-Cultivo e caracterização de membros do domínio Archaea a partir de
sedimentos lacustres do Cerrado
Deborah Vasconcellos Ambrósio; Kruger, Ricardo Henrique; Kyaw, Cynthia Maria.
[email protected]
Microbiologia
O avanço das técnicas de Biologia Molecular mostrou uma nova maneira de estudar
os organismos, em especial os procariotos. A classificação dos três domínios,
proposta por Woese e colaboradores em 1990, revelou a importância do domínio
Archaea e desde então vários trabalhos têm sido realizados a fim de melhor entender
este grupo. Os primeiros trabalhos descreviam o domínio Archaea como organismos
que viviam somente em ambientes extremos, hoje se sabe que as archaeas possuem
uma ampla diversidade e distribuição no nosso planeta, sendo importantes para
vários processos ecológicos incluindo a ciclagem do Carbono e Nitrogênio. A maior
parte do conhecimento deste domínio, incluindo a sua diversidade no bioma Cerrado,
está descrita apenas por métodos independentes de cultivo devido a grande
dificuldade de obtenção de culturas em laboratório. Tendo em vista um melhor
entendimento sobre o metabolismo e funções desses organismos, este trabalho
propõe o cultivo em laboratório e posterior caracterização de archaeas mesófilas do
Cerrado a partir de sedimentos de um córrego da reserva ecológica do IBGE
localizada em Brasília, DF. Os microrganismos foram cultivados em meios sólido e
líquido, confeccionados a partir da mistura de água e sedimentos deste córrego. A
mistura foi adicionada de cloreto de amônio, para favorecer o crescimento de
oxidantes de amônia, e de agentes antimicrobianos adequados. As amostras foram
incubadas em estufa a 28ºC e analisadas semanalmente quanto ao crescimento,
sendo realizados repiques quando necessário. As colônias obtidas em meio sólido
tiveram seu DNA extraído e submetidos a ensaios de PCR com iniciadores
específicos para o gene que codifica o rRNA 16S de Archaea e Bacteria e o gene
amoA de Archaea. Os amplicons foram sequenciados e o resultado revelou um cocultivo entre archaeas oxidantes de amônia pertencentes ao filo Thaumarchaeota e
bactérias de 4 gêneros diferentes, pertencentes as famílias Brucellaceae e
Burkholderiaceae. Análises morfológicas estão sendo realizadas a fim de se
caracterizar as archaeas obtidas neste co-cultivo. Ainda não foi possível analisar as
culturas em meio líquido devido à dificuldade de se estabelecer um crescimento
destes organismos neste modelo de cultivo.
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R09-Estudo da interação da cadeia variável pesada de imunoglobulina
associada a cadeia VpreB com ssDNA
Ronny Petterson dos Santos Araujo; Marcelo De Macedo Brígido
[email protected]
Laboratório De Imunologia Molecular
Os anticorpos são moléculas proteicas do sistema imune humoral dos vertebrados
imprescindíveis para a defesa do organismo. As regiões determinantes
complementariedade (CDRs) dos anticorpos são fundamentais na determinação da
interação com o antígeno. Os anticorpos ligantes ao DNA são ferramentas
importantes no estudo do desenvolvimento de linfócitos B e de algumas doenças
autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico. Em estudos anteriores de nosso
grupo, uma análise de sequências da cadeia variável pesada (VH) de anticorpos em
banco de dados indicou que um grupo específico da cadeia variada pesada, VH10,
apresenta uma característica intrínseca de ligação ao DNA. Na direção contrária, a
família VH4 não apresenta nenhuma sequência com afinidade a ácidos nucléicos, por
esse motivo essa família vem sendo utilizada como controle nas pesquisas do grupo.
Comparações das sequências primárias de VH10 e VH4 mostram diferenças
significativas na região da CDR H2, além disso, essa região se mostrou fundamental
para ligação ao DNA em modelos de BV04-01. Pretende-se, portanto, construir quatro
scFvs com as cadeias pesadas VH4 e VH10 com modificações nas CDR H2,
conjugada com a cadeia leve característica de células B em desenvolvimento (SLC)
e testar a afinidade dessas moléculas ao DNA fita simples (ssDNA). Essas moléculas
serão sintetizadas por expressão heteróloga em bactérias. Para mensurar a afinidade
das moléculas ao ssDNA serão realizados experimentos de ressonância plasmônica
no equipamento Biacore (GE) e ELISA. Esse conhecimento deve propiciar insights
sobre as forças que regem essa interação, além de informações sobre os processos
de desenvolvimento de células B e o surgimento de algumas doenças autoimunes.
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R10-Análise molecular/evolutiva do processo de envelopamento múltiplo em
baculovírus
Miguel de Souza Andrade; Fernando Lucas Melo; Daniel Ardisson-Araújo; Bergmann Morais Ribeiro
[email protected]
Laboratório Do Baculovírus
Baculoviridae é uma família de vírus de DNA fita dupla (80 a 180 kpb), que infectam
insetos da ordem Diptera, Hymenoptera e Lepidoptera e são classificados em 4
gêneros: Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Gamabaculovirus e Deltabaculovirus.
Baculovírus apresentam duas formas infectivas distintas: os vírions derivados de
oclusão (ODV, do inglês ‘occluded derived virus’) e os vírions brotados (BV, do inglês
‘budded virus’). Os primeiros são responsáveis pela infecção inicial no intestino do
inseto, enquanto que os BVs são responsáveis pela transmissão de célula a célula
(infecção sistêmica). Os baculovírus do gênero Alphabaculovírus podem possuir
ODVs com apenas um capsídeo por envelope, chamados de single
nucleopolyhedrovirus (SNPV) ou ODVs com vários capsídeos por envelope, multiple
nucleopolyhedrovirus (MNPV). Duas hipóteses podem explicar uma possível
vantagem dos vírus MNPVs: (i) a presença de mais de um capsídeo por envelope
pode proporcionar a recuperação de genomas danificados ou defectivos por meio de
recombinação; (ii) a entrada de mais de um capsídeo na célula intestinal
simultaneamente pode favorecer um espalhamento mais rápido da infecção. Neste
trabalho, a partir da análise dos genomas de baculovirus sequenciados, nós
propusemos a hipótese de que o gene ac134 (94k) é provavelmente, o responsável
pelo fenótipo MNPV. Construímos um baculovírus recombinante que expressa a 94k
fusionada a um peptídeo marcador (HA) para citolocalização da proteína e, também
outro recombinante com o gene ac134 deletado, com o objetivo modificar o fenótipo
para SNPV. Além disso, construímos um vetor de expressão do gene ac134, que foi
transfectado em células infectadas com um vírus SNPV com o intuito de alterar o
fenótipo deste para MNPV. Atualmente, amostras de células infectadas com ambos
os vírus estão sendo processadas para observação em microscópio eletrônico de
transmissão para confirmação da hipótese proposta.
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R11-Análise e comparação de duas β-glicosidases no sinergismo de enzimas
celulolíticas microbianas na degradação da fração de celulose de bagaço de
cana de açúcar
Amanda Gregorim Fernandes, Gregorim Amanda Fernandes; Lorena Cardoso Cintra; Paula Fabrícia
Fonseca De Faria; José Márcio Poças.
[email protected]
Lignocelulose é o principal componente estrutural da parede celular de plantas. Ela é
composta por três principais componentes: celulose, hemicelulose e lignina. As
celulases constituem um complexo de enzimas envolvidas na conversão da celulose
a glicose. O custo elevado dessas enzimas é um obstáculo para que o processo de
produção de bioetanol se torne economicamente viável. Para a conversão de celulose
a glicose três enzimas são requeridas: endoglucanases (EGs), celobiohidrolases
(CBHs) e β-glicosidases (BGLs). Uma das enzimas produzidas pelo fungo Humicola
grisea var. thermoidea, a BGL4, além de ser termoestável, possui alta atividade para
celobiose e não é reprimida por seu produto no meio reacional, a glicose. A linhagem
9A02S1 de Penicillium echinulatum produz altos níveis de β-glicosidases com
potencial uso na transformação da celulose a glicose. Este trabalho tem como objetivo
produzir, expressar e purificar as enzimas recombinantes HgBGL4 e PeBGL1 na
levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para o isolamento do gene HgBGL4 foi
realizado uma indução da produção de celulases pelo fungo em diferentes fontes de
carbono. A partir da indução foram coletados micélios para uma posterior extração de
RNA totais e amplificação do cDNA por RT-PCR com primers específicos utilizando
farelo de trigo a 2% (FT 2%) como indutor, e em seguida, clonado em vetores de
expressão de P. pastoris. Enquanto isso, o cDNA PeBGL1 foi sintetizado
quimicamente de acordo com os dados obtidos na biblioteca em situação de indução
de celulases desse fungo e posteriormente clonado em vetor de expressão de P.
pastoris. Os vetores produzidos foram transformados nas linhagens GS115 e
SMD1168 de P. pastoris. Análises dos melhores transformantes produtores das
enzimas recombinantes estão sendo avaliados. Após análises das características
bioquímicas iremos propor a viabilidade de comporem misturas enzimáticas para
hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar.
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R12-Study of the Lignocellulosic Potential in the Fungus Aspergillus terreus
Grown on Agro-industrial residues.
Camila Louly Corrêa; Edivaldo Ximenes; Eliane Noronha; Robert Miller
[email protected]
Microbiologia
Increased demands in global energy consumption, together with concerns over
environmental pollution are driving the development of new energy sources to meet
future energy demands. Aspergillus terreus is a filamentous fungus producing
enzymes with a wide range of technological applications in textile, food and biofuel
industries. This study aims to characterize lignocellulolytic enzyme production in A.
terreus grown on culture media containing agro-industrial residue (sugarcane
bagasse, soy and cotton) and analyse differential gene expression in response to
growth on these carbon sources. Enzymatic production in A. terreus grown at 280C in
minimal liquid medium supplemented with yeast extract was evaluated for each carbon
source (1% concentration) over a nine day period. Enzyme assays for xylanase,
endoglucanase, mannanase, pectinase and FPase were conducted according to the
DNS method. Whilst xylanase enzyme activity reached a plateau at 48 hours for all
three carbon sources, xylanase production was more significant for the media
containing sugarcane bagasse and soybean hulls, reaching 1.0 (IU ml-1). The
production of pectinase and FPase was more prominent in the medium containing
soybean hulls, reaching 0.5 and 2.0 (IU ml-1), respectively. Isolation of total RNA from
A. terreus was performed according to the method of Brasileiro & Carneiro, 1998.
cDNA library preparation in ongoing for fungal mRNA from A. terreus cultured under
three carbon sources using the kit RNA TruSeq Sample preparation v2 Kit (Illumina,
Inc.) according to manufacturer's instructions. Characterization of the transcriptome of
this fungus offers promise for gene discovery applicable in second generation biofuel
development.
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R13-Interações Tospovírus-Planta: Caracterização estrutural de proteínas de
tospovírus e identificação de interações entre proteínas virais e celulares
Rayane Nunes Lima; Faheem, Muhammad; Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves ; Melo,
Fernando Lucas; Resende, Renato De Oliveira.
[email protected]
Virologia Vegetal
Uma infecção viral eficiente requer interações entre proteínas virais e proteínas do
hospedeiro. Essas interações proteína-proteína alteram a rotina da célula para
promover todos os eventos do ciclo infectivo de um vírus. As proteínas virais são
multifuncionais e também interagem entre si formando oligômeros, como no caso de
algumas proteínas dos tospovírus. Tospovirus (ssRNA, trissegmentado) é o único
gênero da família de arbovírus animais, Bunyaviridae, que infectam vegetais, e é o
segundo grupo de vírus mais importante para a agronomia mundial, causando
prejuízos econômicos em hortaliças, grãos e plantas ornamentais. Ao contrário dos
vírus animais da família Bunyaviridae e de outros vírus vegetais, pouco ainda se sabe
a respeito das interações entre as proteínas dos tospovírus com seus vetores e seus
hospedeiros, e a ausência de um sistema de genética reversa para tospovírus é um
fator limitante para o avanço de estudos relacionados ao processo infectivo desses
vírus. Portanto, é importante o estudo de suas estruturas, seus domínios funcionais e
suas interações com as proteínas das plantas hospedeiras, para elucidar os
mecanismos envolvidos na infecção viral e os mecanismos de interação planta-vírus.
Não existe nenhuma informação estrutural dessas proteínas para nenhuma espécie
desse gênero. Com esse propósito, o presente projeto visou elucidar as estruturas
tridimensionais por modelagem teórica e analisar os possíveis domínios funcionais da
proteína NP de GRSV, uma proteína estrutural que forma oligômeros que circundam
o RNA para compor o ribonucleocapsídeo (RNP). O alinhamento das sequências de
aminoácidos das NPs de GRSV e de La Crosse virus (LACV), um Orthobunyavirus,
mostrou que elas possuem uma identidade de aproximadamente 17%, fornecendo
evidências para a montagem da estrutura tridimensional e análises dos domínios
funcionais da NP de GRSV a partir da NP de LACV. A partir do modelo tridimensional
da NP de LACV, foi possível construir um modelo tridimensional para NP de GRSV
pela técnica de modelagem estrutural por homologia. A NP de GRSV possui quatorze
alfa-hélices e uma folha beta. O braço N-terminal é composto pelos aminoácidos 1 a
32 e o braço C-terminal é composto pelos aminoácidos 224 a 258. Os outros
aminoácidos (33-223) estão enovelados formando uma estrutura globular com uma
cavidade formada por aminoácidos hidrofóbicos e positivos que interagem com o
RNA. Os resíduos de aminoácidos F23, Q61, T92, R94, R95, Y184, K192, são
candidatos para o domínio de interação com o RNA. Esses estudos resultarão em
conhecimentos sobre as funções biológicas da NP e suas implicações para a infecção
resultando em progressos para as estratégias aplicadas de controle, atualmente
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limitadas pela escassez de conhecimento científico detalhado sobre as interações
tospovírus-planta e tospovírus-inseto.
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R14-A model for the interaction between cadherin-like receptor BT-R1 and three
Cry1a family toxins from Bacillus thuringiensis
Diogo Martins de Sá; Maria Fátima Grossi De Sá
[email protected]
Limpp Embrapa
Cry1Ab is widely described as toxic to M. sexta larvae and extensive substitution of
loop residues in domain II suggests that this region is responsible for binding to
receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac demonstrate 82 to 90% amino acid identity to
one another and the interaction with cadherin-like receptor has been described as an
important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I. We used homology
modeling, protein docking and molecular dynamics to simulate the interaction between
Manduca sexta's cadherin-like receptor BT-R1 and Bacillus thurigiensis' Cry1Ab toxin.
For molecular modeling, we used LOMETS and Phyre servers, as well as MODELLER
9.10 program. Docking was performed using ClusPRO Metaserver and molecular
dynamics was carried out using Gromacs 4.6.3. Analyses using LigPlus program
server permitted us to find conserved amino acids and regions, in both BT-R1 and
Cry1A family toxins, responsible for receptor-ligand binding. Two models were
obtained and seven binding regions have been identified for both Cry1Ab and BT-R1
in each model, with slight diferences. We were able to infer the most important
residues participating in hydrogen bonds during receptor-ligand interaction. To further
investigate the importance of each binding region and validate our model, we
synthesized peptides corresponding to each of these regions. Preliminary result for
one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region
previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. Most interestingly,
binding occurs with over 300-fold less peptide concentration in pH 9.0 than in pH 7.0.
The physiological pH in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that
at least one of our models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if
both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Principal
compounds analysis of our model may preview major conformational changes after
binding and permit infer why alpha-helix 1 is cleaved. Overall, these models allowed
the observation of the toxin's behavior when binding to receptor. Moreover, they help
clarify the participation of Ca+ ions and alpha-helix 1 in the interaction between
Cadherin and Cry toxins, as well as infer the function and importance of some amino
acids present in the binding site and their role in alpha-helix 1 cleavage.
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R15-Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita dupla para uso no
silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no inseto alvo
Rayssa Almeida Garcia; Leonardo Lima Pepino De Macedo, Danila Cabral Do Nascimento; Maria
Fátima Grossi De Sá.
[email protected]
Interação Molecular Planta Praga
A cotonicultura é uma das principais commodities agrícolas, sendo, o Brasil, o quinto
maior produtor mundial de algodão. Entre as diferentes pragas da cultura do algodão,
o bicudo-do-algodoeiro é o inseto-praga mais destrutivo, sendo de hábito endofítico,
o que dificulta seu controle pelo uso de agrotóxicos. Através da biotecnologia, um dos
métodos alternativos de controle de insetos é o silenciamento gênico por meio do
RNA interferente. Contudo, em insetos-praga, o mecanismo de RNAi não é muito
esclarecido e a liberação do RNA dupla fita no inseto não é eficaz, em decorrência da
clivagem do dsRNA alvo na planta e a ação de nucleases no intestino do inseto. Uma
vez expresso na planta, o ideal seria que o inseto assimilasse o dsRNA alvo na forma
não clivada e que este fosse processado somente nas células do inseto. Visando
avaliar a estabilidade das moléculas de dsRNA em insetos, foram propostos
desenhos de dsRNA com estruturas secundárias, baseadas na arquitetura de
viróides, para estudar a estabilidade do RNA e foram selecionadas três nucleases
intestinais do bicudo para serem validadas. A molécula de dsRNA foi tratada com
homogenato intestinal do inseto adulto para analisar sua degradação pela ação de
nucleases intestinais do inseto. A expressão das nucleases foi analisada em
diferentes partes do intestino da larva e do inseto adulto, além da carapaça. As
nucleases foram silenciadas nos bicudos adultos, por microinjeção, e sua expressão
foi analisada após 48 e 148 horas. A expressão das nucleases diminuiu,
consideravelmente, após 48 e 148 horas do silenciamento gênico e o dsRNA tratado
com homogenato intestinal de insetos silenciados com 48 horas demonstrou alta
redução na degradação do RNA. Entre as moléculas de dsRNA estabilizado com
arquitetura de viróide, uma foi localizada no cloroplasto e outra no núcleo de plantas
de Arabidopsis thaliana. Os dados aqui gerados contribuem para o conhecimento do
mecanismo de RNAi em insetos e demonstram que as moléculas de dsRNA
estudadas em plantas de A. thaliana foram estáveis e com potencial de serem
aplicadas no controle de insetos-praga, pela tecnologia do RNAi.
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R16-Investigação da Interação do Sevoflurano com o Canal Iônico Kv1.2
Juliana Mayumi Hosoume; Caio Silva Souza; Manuel Covarrubias; Werner Treptow
[email protected]
Lbtc - Laboratório De Biologia Teórica E Computacional
Os canais iônicos apresentam papel central nas características elétricas celulares.
Essas proteínas de membrana são responsáveis pela geração e propagação de
potenciais de ação em neurônios. Diversos estudos mostram a suscetibilidade dos
canais iônicos das famílias Kv e Nav à modulação por anestésicos gerais. A fim de
investigar os detalhes moleculares dos mecanismos de analgesia, é estudada a
intricada interação entre moléculas anestésicas e canais iônicos dependentes de
voltagem. Para tanto, foram utilizados docking e cálculos de energia livre baseados
em dinâmica molecular para investigar sítios putativos de ligação do sevoflurano, em
específico. O ligante foi confrontado a um conjunto de estruturas do Kv1.2 e Kv1.2G329T equilibrados em membrana, tanto na conformação aberta, quanto na fechada.
A partir do complexo anestésico-canal, foram realizados cálculos de energia livre para
obtenção das afinidades sítios específicas do ligante. Dos resultados obtidos pelo
Vina, notou-se a ligação de sevoflurano a quatro diferentes regiões do canal,
denominadas sítios 1-4. Os sítios 1, 2 e 3 estão localizados na região
transmembrânica do canal no linker S4-S5 e na região de interface S5-S6 de
subunidades adjacentes, enquanto o sítio 4 é encontrado na face extracelular do
canal, próximo ao filtro de seletividade. Em especial, o sítio 2 é situado ao lado do
aminoácido mutado G329T. Pelo método do LIE, foram obtidas energias de interação
do sevoflurano com cada um dos sítios. Em especial o sítio 4 apresenta energias
favoráveis e, por meio da manutenção do estado ativo, é considerado como sítio
putativo responsável pelos efeitos de potenciação no Kv1.2. Em contraste, os dados
sugerem o sítio 3 como sítio putativo relacionado à potenciação aumentada no canal
mutado, via estabilização da conformação aberta. Por conseguinte, os presentes
dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína, favorecendo
futuros estudos experimentais relacionados a este assunto.
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R17-Caracterização
lipopeptídeos
antimicrobianos
produzidos
por
Paenibacillus sp.
Rosiane Andrade da Costa; Ricardo Henrique Kruger; Beatriz Simas Magalhães; Cristine Chaves
Barreto.
[email protected]
Bactérias do gênero Paenibacillus têm sido isoladas nos mais diversos ambientes e
são citadas por sua capacidade de produzir compostos antimicrobianos de amplo
espectro. Trabalhos relatam esses compostos como sendo lipopeptídeos de variadas
massas moleculares, estáveis e de baixa toxicidade, sendo promissores como novos
antibióticos. Uma cepa de Paenibacillus foi isolada do solo do cerrado e experimentos
preliminares demonstraram atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi
identificar as moléculas responsáveis pela atividade antimicrobiana e avaliar seu
potencial. A bactéria foi cultivada em caldo nutriente a 37 °C e 200 rpm por 40 horas.
As células foram removidas e o sobrenadante foi extraído três vezes com butanol. A
fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi liofilizada e em seguida
ressuspendida em água MilliQ e purificada em HPLC. As frações purificadas foram
então coletadas e a atividade antimicrobiana avaliada por ensaio de difusão em
placas. As frações ativas foram então analisadas por MALDI-TOF/MS e sua
concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada contra Escherichia coli pelo
método de microdiluição. As frações ativas correspondem às massas 1087 e 1101
m/z. Essas massas são consistentes com lipopeptídeos antimicrobianos da família
das Pelgipeptinas previamente descritos em P. elgii. Essas frações foram então
fragmentadas por MS/MS, obtendo-se a seguinte sequência de aminoácidos: Dab1X2-Dab3-Phe4-Leu/Ile5-Dab6-Val7-Leu/Ile8-Ser9 ligado ao ácido graxo C7H12O2,
onde X representa Val para o lipopeptideo 1087 m/z e Leu/Ile para o 1101. Ou seja,
as duas frações apresentam praticamente mesma sequência, diferindo apenas pela
substituição de Val por Leu/Ile na posição 2 da sequência. Ambos os lipopeptídeos
exibiram MIC contra E. coli igual a 29 μM. Paenibacillus sp. produz pelo menos dois
lipopeptídeos pertencentes à família das Pelgipeptinas. A diferença nas estruturas
desses dois lipopeptídeos não é crucial para a atividade antimicrobiana uma vez que
ambos apresentaram o mesmo MIC. Mais estudos devem ser conduzidos a fim de
avaliar o potencial antimicrobiano dessas moléculas contra outros patógenos.
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R19- Selection profiles in the recent evolutionary history of baculoviruses.
Jhon Eric Alves Fernandes; Miguel De Sousa Andrade; Bergmann Morais Ribeiro; Fernando Lucas
Melo
[email protected]
Laboratório De Baculovírus
The major evolutionary forces underlying the evolution of virus from the family
Baculoviridae are both horizontal gene transfer and gene duplication. Such events
expose affected genes to new selective pressures that can drive the construction of
novel niches by viruses. However, in the case of intraspecific contexts, those events
are rarer and mutational change might be the force that drives the virus evolution.
Thus, a genome-wide analysis of selection patterns in different isolates of the same
virus species may reveal how baculoviruses respond to new environments at
nucleotide level, and also, the potential role of mutations on short-term evolution. To
achieve this information, we obtained sequences from viruses with more than four
isolates completely sequenced and extracted ORFs those are present in all the
isolates with at least three substitution. For the trimmed sequences obtained, we
calculated the dN/dS ratio by using the CODEML program within the PAML package
under six different models of codon evolution and performed likelihood ratio tests for
pairs of nested models in order to choose which best fit to the data. Although this
assumption is unrealistic, most of genes from all viruses, except BmNPV, fit well in the
model of one category of dN/dS for the entire gene. The estimations under this model
show differences between virus with a single nucleocapsid per virion (SNPV) and with
multiple nucleocapsids per virion (MNPV). The results agree with the hypothesis that
SNPV are under a more severe selective pressure, since there is just one copy of the
genome per infection, whereas the MNPV carries many copies and thus, new
mutations in MNPV genomes have a nearly neutral nature because of the mutational
compensation. Moreover, selection analysis reveals that mta-1 and pp-31 in SeMNPV
and orf-55 and orf-63 in BmNPV are under positive selection.
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R20-Avaliação do papel de microRNAs regulatórios na resposta imune inata à
infecção por Paracoccidioides brasiliensis
Marco Antônio de Oliveira; Lorena Da Silveira Derengowski; Daniel Paiva Agustinho; Ildinete Silva
Pereira.
[email protected]
Biologia Molecular
Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos
envolvidos sofrem uma ampla reprogramação genética, o que vem mostrando ser
crucial para o estabelecimento da patogenia. Dentre os inúmeros genes com
expressão alterada no hospedeiro encontram-se aqueles que codificam microRNAs
(miRNAs), um grupo de pequenas moléculas de RNA regulatórios atuantes nos mais
diversos processos celulares, incluindo a regulação de respostas inflamatórias.
Embora vários trabalhos venham mostrando a importância de miRNAs na resposta
imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do
papel desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar
o papel de miRNAs na resposta imune inata de hospedeiros murinos suscetíveis e
resistentes à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da
Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de maior prevalência
na América Latina. Os ensaios de infecção foram realizados utilizando-se macrófagos
peritoneais murinos das linhagens A/J e B10.a, resistentes e suscetíveis à PCM,
respetivamente, e leveduras do isolado Pb18 de P. brasiliensis. Células hospedeiras
foram cultivadas por 6 horas em presença ou ausência de leveduras na proporção 2:1
(macrófagos:leveduras). Após esse período de interação o sobrenadante das culturas
foi coletado para dosagem de citocinas por meio de ELISA e o RNA dos macrófagos
foi extraido para avaliação das variações nos níveis de transcritos de cinco miRNAs 125b, 132, 146a, 155 e 455 - por RT-qPCR. Os níveis de pri-miR 155 e pre-miR 155,
moléculas precursoras desse miRNA maduro, também foram avaliados com o
objetivo de analisar o efeito da infecção sobre diferentes etapas no processo de
biogênese do miRNA. Todos os miRNAs avaliados mostraram um aumento no
acúmulo de transcritos em resposta à infecção fúngica por P. brasiliensis, nas duas
linhagens de camundongo utilizadas. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, a
participação de miRNAs na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata à
P. brasiliensis. Dando continuidade aos estudos serão avaliados os níveis de mRNAs
alvos dos miRNAs selecionados, assim como a realização de ensaios com inibidores
de miRNAs para avaliação de seu papel funcional na resposta imune inata à
paracoccidiodomicose.
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R21-Biologia de sistemas para estudo comparativo de leveduras fermentadoras
de xilose
Henrique César Teixeira Veras; Gabriel Da R Fernandes; João Ricardo M. Almeida; Nádia Skorupa
Parachin.
[email protected]
Laboratório De Genética E Biotecnologia - Lgb (Embrapa Agroenergia)
O etanol resultante da biomassa lignocelulósica é uma das opções para obtenção de
energia renovável. As leveduras que são utilizadas na indústria do bioetanol, têm
diferentes capacidades metabólicas para converter açúcares derivados da biomassa.
A Saccharomyces cerevisiae, principal levedura utilizada em bioprocessos, apresenta
preferência por açúcares hexoses, principalmente glicose. Assim, é especialmente
desejado a identificação e/ou modificação de leveduras que realizem fermentação de
xilose, a pentose mais abundante presente na biomassa lignocelulósica, segunda
maior fonte de carboidrato do planeta. Logo, a fermentação de xilose tem importância
tanto para aumentar a produção de etanol, como para diminuir os resíduos da
agricultura. Desta forma, a detecção de diferentes características fisiológicas e
moleculares relacionados ao metabolismo deste açúcar em diferentes leveduras é de
grande relevância. Portanto, nosso objetivo é avaliar a capacidade de fermentação
realizadas por diferentes leveduras utilizando xilose como fonte de carbono. As
leveduras Scheffersomyces stipitis; Spathaspora passalidarum; Spathaspora
arborariae e Candida tenuis foram cultivadas em meio mínimo 2.5X, suplementado
com xilose 40g/L e mantidas sob condições de aerobiose e microaerobiose. Os
cultivos foram iniciados com OD600 de 0,5. As culturas foram mantidas em agitação
(180 rpm) e temperatura (28° C) constantes, em intervalos regulares foram coletados
amostras para monitoramento do crescimento e quantificação por HPLC do substrato
consumido e formação de produtos. Além disso, durante a fase exponencial de
crescimento das leveduras, foram coletadas amostras para extração de RNA para
posterior sequenciamento e avaliação das atividades enzimáticas. Paralelamente, as
vias metabólicas das leveduras foram montadas com o auxilio da base de dados
KEGG e visualizadas através da ferramenta IPATH. Comparando com os cultivos
aeróbicos que apresentaram OD final entre 15 - 20, os bioprocessos em condições
microaeróbicas apresentaram OD de 3 a 4 vezes menores. Os resultados observados
com menor taxa de crescimento, apresentaram maior formação de etanol e foram
vistos principalmente nas leveduras S. stipitis e S. passalidarum. A montagem das
vias metabólicas demonstrou que a levedura S. stipitis apresenta enzimas distintas.
Isto pode explicar a maior adaptabilidade dessa levedura nos bioprocessos
fermentativos de xilose. No entanto, a S. passalidarum apresentou as maiores taxas
de formação de etanol. Deste modo, nossas perspectivas são de que com a
integração dos dados fisiológicos, de sequenciamento, de atividades enzimáticas e
compostos metabólicos quantificados possamos construir modelos matemáticos de
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fluxos metabólicos visando a identificação de novos alvos moleculares que aumente
eficiência no consumo de xilose e formação de etanol.
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R22-Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV) genome reveals
acquisition of a peculiar nucleotide metabolism fused gene that changed a
recombinant prototypic baculovirus in vitro infection
Daniel Mendes Pereira Ardisson de Araújo; Fernando Lucas Melo; Rollie J. Clem; Daniel Sosa-Gómez;
Bergmann Morais Ribeiro
[email protected]
Laboratório De Baculovírus
Viruses can improve their fitness by acquiring new genes mostly large dsDNA viruses
whose mutational changes are less usual. In this work, we accessed and described
the genome of the baculovirus Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus
(PeluSNPV) and we characterized a nucleotide metabolism fused gene (NMG) that
was found to be acquired independently by distantly related baculoviruses. The gene
was able to accelerate Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
(AcMNPV) in vitro infection and augment yields of occlusion bodies. PeluSNPV is a
novel Group II alphabaculovirus with a genome of 132,924 bp long and a G+C content
of 44.1 %. We found 145 putative ORFs coding for polypeptide with at least 50 amino
acid residues. Only 18 genes were found to be unique. PeluSNPV is closely related to
ClbiNPV, another sphingid-infecting alphabaculovirus. We performed phylogenetic
analysis and molecular characterization of the independently acquired NMG, pelu112.
The amino-terminal is related to the Orf138 of Lymantria dispar multiple
nucleopolyhedrovirus and the carboxy-terminal to a dUTPase (dut gene). Both
enzymes have separately-encoded homologs in a few other baculovirus species.
Therefore, the fact that these viruses acquired the same fused NMG implies it might
improve virus fitness. The fused gene is present only in PeluSNPV (pelu112), Orgyia
pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (op031) and Erinnyis ello
granulovirus (ErelGV) (erel005). When erel005 and pelu112 genes were cloned into
an NGM-lacking baculovirus AcMNPV, the recombinants produced genomic DNA,
virus progeny, and two virus genes (IE-1 and GP64) earlier during in vitro infection and
the yields of OB were increased when compared to the virus control. ErelGV-derived
gene was found to be predominantly cytoplasmic while PeluSNPV-derived gene
localized to the nuclear ring zone. These results suggested that decreased dUTP
levels and dTTP production may be beneficial for AcMNPV genome replication and
gene expression in cultured cells. Moreover, genome sequencing of new baculovirus
species and gene content studies can lead to the understanding of both evolutionary
history and strategies to improve baculoviruses as agents for pest management and
protein expression.
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R23- Construção e Expressão de Anticorpos que reconhecem o antígeno CD20
humano.
Tarcila Zuleica Zaparolli Lopes; Marcelo De Macedo Brígido; Galina Gulis; Andréa Queiroz
Maranhão.
[email protected]
Imunologia Molecular
O trabalho proposto contribui com o projeto “ANTI-CD20 - DESENVOLVIMENTO DE
TECNOLOGIA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA O ANTÍGENO
LINFOCITÁRIO HUMANO CD20”, financiado pelo BNDES e executado em parceria
com a empresa: Laboratório Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda.
Nesse trabalho objetiva-se o desenho e a construção de anticorpos humanizados
recombinantes específicos para antígeno humano CD20, produzindo-os na forma de
fragmentos FvFc (scFv fusionado aos domínios CH2CH3 de IgG1 humana) e testando
a sua capacidade de realizar os mesmos mecanismos efetores do anticorpo
monoclonal quimérico Rituximabe (MabThera, Rituxan). Resultados: Primeiramente
realizamos o desenho gênico de versões humanizadas dos domínios variáveis leve e
pesado do Rituximabe, propondo-se a sequência dos genes a serem sintetizados
quimicamente no vetor pBSK. Foram selecionadas três versões scFvs e transferidas
para o vetor de expressão em células de mamíferos pCOmiresdelta600: versão A (Vk
A27VH1-46), versão O (V am4/ humanVH1-46) e, versão L (V kL1/ humanVH1-46).
Após a finalização das etapas de clonagens, células de ovário de hamster chinês
versão K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. As
células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da
população mista de clones de células CHO-K1 produtores dos FvFcs recombinantes.
Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio
de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de
afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação, as frações
coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos
por meio de SDS- PAGE e Wersten-Blot. Perspectivas: Determinar a capacidade de
ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo, e avaliar as
funções biológicas dos FvFcs recombinantes: ADCC, CDC e apoptose.
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R24-Inativação do Filtro de Seletividade de um Canal de Potássio
Letícia Stock Vieira; Werner Treptow
[email protected]
Laboratório De Biologia Teórica E Computacional
Canais iônicos (CIs) são proteínas transmembrânicas (TM) que delimitam poros
hidratados, conectando meios intra e extracelulares. Fundamentais a uma variedade
de fenômenos biológicos, CIs permitem o fluxo de íons segundo um gradiente
eletroquímico e são capazes de regular a condução via mecanismos chamados
gating. Um dos mecanismos de regulação da condução relaciona-se à flexibilidade
do filtro de seletividade (segmento que discrimina íons atravessando o CI). Tal
mecanismo é denominado inativação lenta (IL). A IL regula a excitabilidade celular,
propriedades de disparo bem como adaptação dos potenciais de ação. Como
resultado, defeitos nesse controle implicam em doenças relacionadas à excitabilidade
celular. Apesar de a existência de um mecanismo de gating no FS ser corroborada
por diversos estudos experimentais de mutagênese e eletrofisiologia, aspectos
estruturais atômicos desse mecanismo ainda são pouco caracterizados. Assim, no
contexto do projeto aprovado pelo PPG em Biologia Molecular, este trabalho objetiva
caracterizar o mecanismo de gating via IL em CIs. Para os fins estabelecidos,
simulações de dinâmica molecular e métodos avançados de amostragem (umbrella
sampling) são empregados. Transições moleculares envolvendo torções no FS são
responsáveis pelo mecanismo de controle da condução IL. Com base em estudos de
simulações longas, amostrando diversas conformações do FS, propõe-se aqui um
potencial estado inativado para o CI humano seletivo a K, Kv1.2. O estado inativo é
estável nas escalas de tempo até então amostradas. Ainda, validação da estrutura
proposta é feita via cálculos de energia livre relativos à passagem do íon K pelo CI
inativado. De fato, tal estrutura se mostra impermeável. Estudos estão em andamento
para K serão estendidos a CIs de Na e Ca. Ainda, conhecimento estrutural atômico
da IL de CIs possibilita uma melhor compreensão de disfunções relacionadas ao mau
funcionamento desse mecanismo.
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R25-The role of type VI secretion system of gram-negative bacteria in lipid
antigen presentation through CD1 molecule
Raquel das Neves Almeida; Rafael Corrêa ; Thaís Amanda Pinho-Silva ; Dalila Juliana Silva Ribeiro;
Wanderley Dias Da Silveira; Tatiana Amabile De Campos; Kelly Grace Magalhães.
[email protected]
Laboratório De Imunologia E Inflamação
Type VI secretion systems (T6SS) are multi-component machines encoded within
genomes of most gram-negative bacteria and are considered as potential virulence
factors. The T6SS is composed of proteins such as Icmf, Hcp and Clvp, which can
mediate transport of effector molecules from the bacteria to the host and can enable
survival of the pathogen. Therefore, the acknowledgment of this system is important
to understand better host pathogen interactions. Moreover recognition and antigen
presentation is an important factor in host immunity. The CD1 molecule is involved in
the antigen presentation beyond MHC and its discovery provides a new perspective
on microbial immunity by showing how T cells can recognize lipid antigens from
pathogens as well as self-lipids. Here we have evaluated the modulation of CD1
expression during the infection caused by Escherichia coli 362 and the role of type VI
secretion systems in this process by using E. coli knockouts strains for T6SS proteins:
Icmf, Hcp and ClpV. In order to verify if the T6SS is involved in lipid antigen
presentation through CD1 molecules, human monocytes as wells as murine
macrophages were infected with different E. coli strains and CD1 expression were
analyzed. The infections were performed with E. coli wild type (362) and knockout
strains for the proteins that comprise the T6SS (Icmf-/-, Hcp-/- and ClpV-/-). We
analyzed the expression CD1 group I and II by Flow Cytometry. Our data showed that
E. coli wild type inhibit the expression of CD1 molecules in both cell types, and
consequently the presentation of lipid antigen. In contrast, the knockouts strains Icmf/-, Hcp-/- and Clvp-/- triggered an up regulation of CD1a and CD1d expression
isoforms. Taken together our data demonstrated that T6SS can be used by gramnegative bacteria as a mechanism to evade host immune response by reducing the
expression of lipid antigen presentation through CD1 molecules and consequently the
lymphocyte TCD8+ activation, which can play an important role in pathogen survival.
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R26-Estrutura do complexo entre o peptídeo PTRY e tripsina
João Paulo Campos Fernandes; Sônia Maria De Freitas; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa.
[email protected]
Biofísica Molecular Estrutura
Serino proteases foram classificados em muitas famílias diferentes entre eles
pertence a classe de inibidores Bowman-Birk inibidor (BBIs).Os inibidores da família
BBI têm sido descritos como agentes supressores de carcinogênese em diversos
órgãos e tecidos. Neste estudo foi utilizado o inibidor família dos BBIs extraído de
Vigna unguiculata (black-eyed pea trypsin\chymotrypsin inhibitor - BTCI),para estudos
estruturais.O BTCI apresenta dois loops reativos que interagem com tripsina e
quimotripsina simultaneamente sendo os resíduos Lys26 e Phe53, responsável pela
interação com tripsina e quimotripsina,respectivamente. As estruturas cristalográficas
do presente inibidor com tripsina no complexo binário e ternário com tripsina e
quimotripsina ambos foram cristalizadas e suas estruturas resolvidos e depositada no
banco de dados de proteínas (PDB - 2G81 e 3RU4). De acordo com a estrutura
resolvida do laço formado pela ponte de ponte dissulfeto Cys24 a Cys32 nos resíduos
da sequencia do BTCI, aqui denominado PTRY pode ser claramente identificada
como a região responsável pela ligação de alta afinidade e a consequente inibição da
tripsina. No presente estudo, utilizamos o peptídeo PTRY sintético em ensaios de
cristalização em complexo com a tripsina bovina. Os ensaios de cristalização foram
realizados usando o método de difusão de vapor em gota sentada. Os conjuntos de
dados de difração de raios-x foram coletados na linha de luz MX2 do Laboratório
Nacional de Luz Síncrotron (Campinas, Brasil), em λ = 1,2 Å.O conjunto de dados de
difração foi escalona e integrado usando iMosflm. A estrutura do complexo do PTRY
em complexo foi resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura
cristalográfica de tripsina (PDB 4I8H) como modelo de busca. O refinamento da
estrutura foi realizado utilizando o programa de software suíte CCP4, PHENIX E
COOT. O processamento de dados mostrou uma grupo espacial primitivo P 21 21 21.
Os valores da célula unitária foram A = 60,39 B = 63,97 C = 69,63. α,β,γ = 90º.A
estrutura final foi resolvida a uma resolução de 1,37 Å.
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R27-Desenvolvimento de estratégias baseadas em RNA interferente para
resistência ampla a begomovírus em tomateiro (Solanum lycopersicum)
Lídia Nascimento Queiroz; Francisco José Lima Aragão
[email protected]
Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical
A cultura do tomate está sujeita a ação de diversos patógenos que afetam a
produtividade, sendo que as viroses, especialmente as begomoviroses, são as mais
prevalentes na tomaticultura nacional. Os métodos de controle destas viroses
envolvem múltiplas aplicações de inseticidas, com o objetivo de eliminar o vetor da
doença, a mosca branca. No entanto, esta abordagem de controle possui um custo
elevado, além de ser pouco eficiente e poder colocar em risco a saúde tanto de quem
manipula os agrotóxicos quanto de quem consome o tomate. As técnicas baseadas
na resistência derivada do patógeno têm demonstrado ser uma alternativa eficiente
para o controle de viroses em plantas, podendo resultar no silenciamento de um gene
importante para o estabelecimento da infecção. O silenciamento gênico pós
transcricional (PTGS), desencadeado por moléculas de RNA interferente (RNAi),
pode ser induzido por uma construção quimérica contendo fragmento do gene alvo
que se deseja silenciar. Neste trabalho objetivamos obter plantas transgênicas de
tomate apresentando resistência simultânea a várias espécies de begomovírus por
RNAi. Para isso foram construídos cassetes de interferência com sequências
conservadas quiméricas do gene rep oriundas de diversas espécies de begomovírus.
A proteína REP é essencial para o processo de replicação viral. Estas construções
estão sendo validadas em Nicotiana benthamiana, paralelamente ao processo de
transformação de tomate cultivar IPA - 6. Os explantes alvo escolhidos para a
transformação via Agrobacterium tumefaciens foram cotilédones e hipocótilos
provenientes de plântulas de 10 dias germinadas in vitro. Os cassetes contêm o gene
marcador de seleção pat, que confere tolerância ao herbicida glufosinato de amônio.
A partir da curva de seleção para tolerância ao herbicida foi estabelecida a
concentração de 2mg/L para seleção não destrutiva dos genótipos transformados. Até
o momento foram obtidas duas plantas putativamente positivas apresentando
regeneração parcial in vitro.
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R28-Desenvolvimento de clone infeccioso de Norovírus Humano
Layssa Miranda de Oliveira; Tatsuya Nagata
[email protected]
Fiocruz (IOC)
Virologia Humana
Os Norovirus humano (HuNoV) têm sido reportados como os principais causadores
dos surtos de gastroenterites de origem viral no mundo. As pesquisas com HuNoV se
inserem em um cenário mundial caracterizado por limitações no cultivo desses vírus
em cultura de célula e oculta informações essenciais para a elucidação da biologia
molecular e estratégias de replicação. As incansáveis tentativas de crescimento em
cultura celular têm demonstrado infecção e formação de partículas virais que falham
durante a passagem para novas células. Nesse sentido esse trabalho propõem
construir um clone infeccioso contendo o genoma inteiro do HuNoV em plasmídeo
flanqueado com promotor e terminador eucariótico. O isolado HuNoV GII.4 subtipo
2006b foi cedido pela Fundação Osvaldo Cruz (Dr. Tulio M. Fumian, IOC/FIOCRUZ).
Para essa finalidade foram amplificados separadamente com primers específicos as
regiões do terminal 5' e do 3'por RT-PCR com a transcriptase reversa Superscript III
(Invitrogen) e Phusion High fidelity DNA polimerase (NEB). Os fragmentos de DNA
purificados foram clonados em pCR4 TOPO (Invitrogen). O genoma completo foi
clonado no pcDNA 3.1 (5Kb) utilizando a estratégia do GIBSON ASSEMBLY
CLONING (NEB). A transformação com essa construção foi realizada em células de
Escherichia coli cepa Stbl4 (Invitrogen) e o seqüenciamento do cDNA foi
encaminhado para o Macrogen Inc (Coréia do Sul). Para as próximas etapas serão
realizados os ensaios de transfecção, bem como as padronizações em células Caco2 para a confirmação da infectividade do clone.
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R29-The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains
Caio Silva Souza; Cristiano Amaral; Werner Treptow.
[email protected]
A central paradigm in the subject of cellular excitability is whether or not a dynamic
membrane voltage field contributes to the operation of voltage sensing proteins. This
issue has challenged an entire generation of scientists because static and dynamic
contributions of the field can not be discriminated from electrophysiology
measurements. The dilemma imposes that structure-based calculations are required
to solve the issue. Here, the dynamic field contribution to the VS energetics was
analyzed via electrostatic calculations applied to a number of atomistic structures
made available recently. We find that the field is largely static along with the molecular
motions of the domain and more importantly, it is minimally modified across VS
variants. This implies that sensor domains transfer approximately the same amount of
gating charges when moving the electrically charged S4 helix between fixed
microscopic configurations. This is a remarkable result meaning that the observed
operational diversity of distinct VS domains, including the extension, rate and voltagedependence of the S4 motion, as dictated by the free-energy landscape theory, must
be rationalized in terms of dominant variations of its chemical free energy (detailed
atom-atom interactions of the domain) rather than modifications of the membrane
voltage field.
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R30- Prospecção e caracterização de genes envolvidos na resistência de
Arachis stenosperma ao Meloidogyne arenaria
Andressa da Cunha Quintana Martins, Larissa Arrais Guimarães; Ana Cristina Meneses Mendes
Gomes; Regina Maria Dechechi Gomes Carneiro; Ana Cláudia Guerra De Araújo; Ana Cristina Miranda
Brasileiro; Patrícia Messenberg Guimarães; Robert Neil Gerard Miller.
[email protected]
O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma cultura alimentar importante, que apesar
da grande variabilidade morfológica apresentada entre as suas diferentes cultivares
(AABB), apresenta estreita base genética e alta suscetibilidade ao ataque de
fitopatógenos. Por outro lado, seus parentes silvestres diploides apresentam maior
variabilidade genética, sendo uma potencial fonte de alelos de resistência a doenças
e à adaptação a diversos ambientes. Os nematoides das galhas Meloidogyne arenaria
raça 1 está dentre as pragas e doenças que acometem e prejudicam a produtividade
do amendoim. Em A. stenosperma (V10309) foi observado uma reação de
hipersensibilidade (HR) quando o estágio juvenil 2 (J2) de M. arenaria tentou induzir
o sítio de alimentação (Proite et al., 2008). Sabe-se que poucos genes dominantes
estão envolvidos na HR. E o estudo da expressão gênica tem auxiliado o
entendimento dos processos biológicos envolvidos na defesa de plantas, na
caracterização de resistências e na identificação de genes que possam estar
envolvidos nesses mecanismos de defesa. A tecnologia de microdissecção a laser
(LCM - Laser capture microdissection) tem sido utilizada em estudos comparativos de
expressão gênica em nível celular, enquanto que sequenciamento massal do
transcritoma da interação planta-patógeno, seguido de validação da expressão
gênica por qPCR (PCR quantitativo), tem possibilitado a identificação e seleção de
novos genes candidatos, os quais serão alvos de estudos posteriores sobre a sua
função biológica. Além disso, a produção de plantas transgênicas compostas
utilizando Agrobacterium rhizogenes possibilitará a validação da função biológica
destes genes, assim como a elucidação das vias metabólicas envolvidas na
resistência ao ataque do patógeno. O objetivo deste projeto é identificar, caracterizar
e validar in vitro (qPCR) e in planta genes de A. stenosperma envolvidos na
resistência a M. arenaria. Para tal, será realizado a LCM de células adjacentes à HR
e o sequenciamento do transcritoma desta interação, análise bioinformática dos
dados, validação de genes candidatos selecionados in vitro e in planta. Estes genes
poderão ser utilizados diretamente para transformação de amendoim e de outras
leguminosas, ou serem utilizados como marcadores moleculares em programas de
melhoramento genético.
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R31-Caracterização de Anticorpos Humanos Anti- Peçonha de Serpentes do
Gênero Bothrops
Thompson França Tomatieli; Andrea Maranhão
[email protected]
Laboratório De Biologia Molecular
Os acidentes ofídicos têm importância médica em virtude da grande frequência e
gravidade. Anualmente, ao cerca de 2,5 milhões de pessoas no mundo são vítimas
de picadas de serpentes, das quais 100.000 chegam a perder a vida. Atualmente o
principal tratamento em acidentes ofídicos ainda é a soroterapia com antiveneno
poliespecífico. A engenharia genética apresenta uma alternativa promissora para
criação de novos antivenenos e outros biofármacos. O presente trabalho tem como
principais objetivos: Análises das sequencias dos fragmentos de anticorpos a serem
produzidos; montagem dos mapas de restrição; envio das sequências para síntese
das sequencias propostas; clonagens das sequências dos fragmentos dos anticorpos,
murino, humanizado e humano, em vetores de expressão heteróloga de células de
mamíferos; Expressão dos Fab´s murino, humanizado e humano em uma linhagem
de células de ovário de hâmister chinês (CHO-K1); Purificação dos Fab´s secretados
no sobrenadante de cultura em colunas de purificação específicas e análise da
atividade ligante desses fragmentos de anticorpos humanizados à PLA2 de Bothrops
atrox. Até o presente momento foram montados dois dos três vetores de expressão
propostos (Murino e Humanizado) e confirmadas as clonagens por digestão e perfil
de restrição e por PCR, o terceiro vetor (Humano) ainda encontra-se na fase de
confirmação da clonagem. Dos dois primeiros encontram-se na etapa de expressão,
produção e purificação em células de mamíferos.
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R32-Estudo das teias tróficas do predador Hippodamia convergens (Coleoptera:
Coccinellidae) pela análise metagenômica do DNA mitocondrial presente no
conteúdo gastrointestinal
Renata Velôzo Timbó; Paulo Roberto Queiroz; S. S. Carmen Pires; Edison R. Sujii;, Marcelo M.
Brígido; Alfried P. Vogler; Débora P. Paula.
[email protected]
O objetivo geral desse trabalho consiste na identificação de presas de agentes de
controle biológico para comparação de suas teias tróficas em fazendas em diferentes
estágios de manejo agroecológico no Distrito Federal. Desenvolvemos um
experimento-piloto para avaliar o potencial de utilizarmos a ferramenta molecular
metagenômica para identificação de espécies pela analise do DNA mitocondrial até
então ainda não aplicada a esse tipo de estudo ecológico, sendo o coccinelídeo
Hippodamia convergens
o
primeiro predador a ter o DNA do conteúdo
gastrointestinal sequenciado, dada a sua abundancia nas áreas. As amostragens
ocorreram quinzenalmente entre 10-12/2012 (captura manual entre 9 e 12:00 h) e os
espécimens foram imediatamente preservados em etanol 100% e, 4h após a
captura, armazenados a -20 C. Fez-se a dissecção do trato gastrointestinal de seis
espécimens (de mesma data e local) e a extração do DNA total para construção da
biblioteca TruSeq (1ug de DNA) e sequenciamento em Illumina MiSeq (inserto 600
pb, paired-end, 250 bases forward e reverse, 1 lane, cobertura 20 X). Foram obtidas
1.443.651 reads (Phred20), as quais fez-se o alinhamento (BLASTn, cut-off: e-value
e-100<, identidade 90% em fragmento de 240-250 b) com o banco de dados contendo
386 mitogenômas da ordem Insecta (GenBank), 7 mitogenômas parciais e genes COI
e CtyB de 20 potenciais presas (incluindo predadores intraguilda e H. convergens)
do agroecossistema em estudo. Pode-se verificar que 7% do material genético
detectado foi mtDNA da ordem Insecta, do qual 98,8% correspondeu ao mtDNA do
próprio predador e 1,2% de 10 espécies pertencentes a quatro ordens (Hemiptera:
Aphis sp., Orius sp., Thrips sp., Euschistus sp.; Lepidoptera: Spodoptera sp.,
Helicoverpa sp.; Coleoptera: Coleomegilla sp., Hippodamia sp., Harmonia sp. e
Hymenoptera), incluindo predadores intraguilda. Comprovou-se que a metagenômica
do mtDNA é uma ferramenta molecular promissora para estudos de Ecologia de
Insetos.
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R33-Avaliação dos efeitos imunomodulatório e antiinflamatório de anticorpos
monoclonais anti-CD3 e anti-IL1β produzidos por Lactococcus lactis em modelo
de diabetes autoimune
Maria Jose Chiabai; Marcelo Brígido; Anderson Miyoshi; Anamélia Bocca; Andrea Queiroz Maranhao
[email protected]
Imunologia Molecular - Lab 1
Os anticorpos monoclonais (mAbs) têm se mostrado uma solução tecnológica
importante na terapêutica de muitas doenças autoimunes, por meio da geração de
anticorpos humanos e humanizados. Anticorpos anti-CD3 parenterais são
administrados em humanos desde 1985, quando um anticorpo monoclonal anti-CD3
de camundongo (OKT3) foi aprovado para o tratamento da rejeição aguda de
transplante, porém seu uso foi limitado pela resposta antiglobulina e pelo seu
potencial de mitogenicidade, que levava à síndrome de liberação de citocinas. Logo,
rotas alternativas de administração devem ser investigadas. Assim, o objetivo do
projeto é a produção in loco de anticorpos monoclonais com propriedades
imunorregulatórias e antiinflamatórias na mucosa intestinal utilizando como veículo
cepas de Lactoccus lactis transformantes que poderá ser uma rota terapêutica
alternativa de baixo custo com a capacidade de modular o sistema imune ao induzir
tolerância de antígenos e controlar processos autoimunes e inflamatórios. Serão
sintetizados os genes de fragmentos de dois anticorpos (anti-CD3 e anti-IL1β) com
papel imunorregulatório e antiinflamatório, e posterior clonagem destes genes em dois
sistemas de expressão utilizando um vetor de expressão eucariótico - pValac - e um
vetor de expressão heteróloga - pXIES - em L. lactis. A seguir, será administrado L.
lactis em camundongos NOD, os quais simulam um modelo de diabetes autoimune
e, por fim, serão analisados os efeitos destes dois anticorpos por meio de exames
histopatológicos de pâncreas, do perfil da produção de citocinas e da glicemia.
Espera-se, por meio de um veículo que utiliza uma bactéria láctica, encontrar uma
nova via de administração de anticorpos que serão dados oralmente com ação in loco
e que seja clinicamente aplicável para uso crônico por não induzir efeitos colaterais
graves, como a síndrome de liberação de citocinas e resposta anti-globulina.
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R34-Desenvolvimento de sistema para a triagem de grande desempenho de
compostos com atividade antibacteriana a partir de bibliotecas metagenômicas
Samuel Dias Araújo Júnior; Ricardo Henrique Kruger.
[email protected]
Biologia Celular - Enzimologia
Um dos principais obstáculos em ecologia microbiana é a incapacidade de cultivar a
maior parte da diversidade microbiana presente nos ecossistemas sob as atuais
condições de laboratório. Desta forma, a abordagem metagenômica é uma opção que
permiti o acesso direto aos genomas complexos desses ecossistemas para a
expressão heteróloga de genes e exploração funcional de microrganismos ainda não
cultiváveis. Nesse projeto será utilizado um novo vetor com características especiais,
pBSBAC1 (construído durante o mestrado), para a construção de bibliotecas
metagenômicas utilizando um método diferenciado para extração de DNA total, com
capacidade mais representativa de cobertura da riqueza e abundância da amostra
ambiental em relação a outros métodos convencionais e/ou comerciais. Em
experimentos anteriores, o vetor pBSBAC1 apresentou índices de expressão de
genes metagenômicos superiores quando comparados a outros vetores
convencionalmente utilizados em estudos semelhantes. Para realizar a triagem
funcional de clones com atividade antibacteriana das bibliotecas metagenômicas que
serão construídas será utilizado e validado um novo método, desenvolvido também
durante o mestrado, denominado Cell-Density-Dependent Expression• (CEDDEX).
De acordo com os estudos já realizados, o método CEDDEX é pelo menos 50x mais
sensível que os métodos atualmente empregados para detecção de clones e
compostos com atividade antimicrobiana. Desta forma, a construção de bibliotecas
metagenômicas com a utilização de vetores com características adequadas e
hospedeiros versáteis associados a metodologias mais sensíveis e robustas de
triagem de clones positivos resultará na compreensão e investigação sistemática do
reservatório genético de produtos bioativos microbianos. Essa sistemática,
juntamente com a exploração contínua da diversidade microbiana, terá potencial para
gerar novos compostos químicos e drogas bioativas assim como acelerar a
descoberta de novos genes com atividade antimicrobiana.
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R35-Análise da expressão dos genes bbrizgid1 e bbrizipt9 relacionados à
síntese de fitohormônios em ovários de Brachiaria brizantha
Luciana Gomes Ferreira, André S. Teixeira Irsigler; Júlio Carlyle M. Rodrigues; Lilian H. Florentino;
Ana Cristina M. M. Gomes; Diva M.A. Dusi; Vera Tavares C. Carneiro.
[email protected]
Laboratório De Reprodução Vegetal _ Apomixia
Brachiaria brizantha, forrageira da família Poaceae, com genótipos de reprodução
sexual e assexual, por apomixia, e representa um sistema interessante para o estudo
das vias moleculares envolvidas em ambos os modos de reprodução. Há evidências
de que fitohormônios estejam envolvidos na estruturação de sacos embrionários em
plantas sexuais de outras espécies, mas não há na literatura relato de estudos em
plantas apomíticas. Resultados obtidos por RNA-seq indicaram genes envolvidos na
via de fitohormônios sendo diferencialmente expressos em ovários de B. brizantha
sexual e apomítica, entre eles um gene homólogo a GID1 (Gibberellin Insensitive
Dwarf1) de Arabidopsis, receptor de giberelina, e outro homólogo ao gene IPT9
(isopentenyltransferase), biossíntese de citocinina. O objetivo deste trabalho foi
caracterizar e analisar a expressão de GID1-like e IPT9-like de B. brizantha,
nomeados de BbrizGID1 e BbrizIPT9, respectivamente. Dois acessos foram
analisados, BRA 002747, diplóide (2n=2x=18) sexual e BRA00591, tetraplóide
(2n=4x=36) apomítico facultativo. RT-qPCR foi realizado em ovários nos diferentes
estágios do desenvolvimento de ambos os genes. Para análise por Southern blot foi
usado DNA dos dois genótipos e um fragmento de 300 pb de BbrizGID1 e outro de
982 pb de BbrizIPT9 como sonda. Para observar o padrão de expressão dos genes,
foi realizado hibridização in situ em secções semi-finas de ovários na
megasporogênese. Os resultados obtidos por RT-qPCR validaram os dados do RNAseq, BbrizGID1 apresentou alta expressão nos estádios iniciais do desenvolvimento
do saco embrionário apomítico, e BbrizIPT9 mostrou alta expressão nas plantas
sexuais em todos os estádios. Resultados obtidos por Southern blot sugerem que
BbrizGID1 está presente em duas cópias no genoma dos dois genótipos e BbrizIPT9
em pelo menos três cópias. A hibridização in situ em ovários de BbrizGID1 resultou
em uma forte marcação nas células nucelares, incluindo o meiócito e a célula-mãe do
megásporo (CMM), somente em plantas apomíticas. Já BbrizIPT9 apresentou pouca
marcação na célula arqueospórica e forte hibridização na porção superior do estilete
de plantas apomíticas e nas plantas sexuais apresentou forte marcação nas células
nucelares, incluindo a CMM. Estes resultados sugerem um possível envolvimento dos
genes BbrizGID1 e BbrizIPT9 durante o desenvolvimento reprodutivo de B. brizantha.
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R36-Plantas de tabaco resistentes à Sclerotinia mediada por RNAi
Cristiana Moura Andrade; Francisco José Lima Aragão.
[email protected]
Laboratório De Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical/Embrapa-Cenargen
Os fungos são um grande e importante grupo de microorganismos que tem um
enorme impacto, sendo muitos destes fitopatogênicos causadores de grandes perdas
econômicas para a agricultura. Uma maneira de contornar este problema é a
obtenção de plantas resistentes. A genética dos fungos patogênicos tem sido
estudada de diversas formas e mais recentemente a estratégia de silenciamento
gênico por RNA interferente tem sido empregada com sucesso. A possibilidade de
silenciamento in trans in vivo por plantas e fungos foi demonstrado por Tinoco et al.
(2010). Com o objetivo de gerar o silenciamento de um gene vital para o ciclo de vida
de fungos patogênicos, foram obtidas plantas de fumo transformadas capazes de
transferir os sinais de silenciamento aos fungos. Bioensaios realizados com confronto
de Sclerotinia sp. com plantas transformadas demonstraram que plantas modificadas
para expressar dsRNAs dos genes-alvo apresentaram uma tolerância maior ao
crescimento do fungo. Para comprovar que os sinais de silenciamento estão sendo
produzidos nas plantas e passados ao patógeno, reações de Northern Blot foram
realizadas, identificando estes sinais nas plantas que apresentaram uma maior
tolerância.
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R37-Interfering RNA as a strategy for silencing the rep gene of begomoviruses
infecting tomato (Solanum lycopersicum) in Brazil
Nayhanne Tizzo de Paula; Francisco José Lima Aragão.
[email protected]
Laboratório De Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical
The Begomovirus (Family Geminiviridae) represents an important group of pathogens
that infect a wide range of plant species and cause significant losses in agriculture.
These viruses are transmitted to dicotyledonous plants by whitefly Bemisia tabacci,
whose control by insecticides is difficult and costly, making genetic control a more
promising management. In this study, Nicothiana benthamiana was used as a model
to obtain plants with wide resistance to different begomoviruses infecting tomato in
Brazil, through the use of molecular mechanism of interfering RNA (RNAi). A
chimerical sequence of 1286 nucleotide within the rep gene from four important
Brazilian begomovirus species, Tomato leaf distortion virus (ToLDV), Tomato golden
vein virus (TGVV), Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) and Tomato severe rugose
virus (ToSRV) was used to generate an intron-hairpin construction. Following ligation
of the construct into binary vector pCAMBIA 3300, Agrobacterium tumefaciens cells
(strain EHA-105) were transformed. The bar gene was used as selection marker and
regenerated plants tested for the presence of PAT protein. A total of 20 N. benthamina
plants were selected. Currently, progenies arising therefrom are being challenged with
TGVV and ToSRV and degree of resistance are being evaluated.
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R38-Lysophosphatidylcholine induces IL-1β secretion and lipid droplet
biogenesis in inflammasome-mediated pathway
Rafael Corrêa; Thaís Amanda De Pinho Silva; Raquel Das Neves Almeida; Dalila Juliana Silva Ribeiro;
Patrícia Torres Bozza; Kelly Grace Magalhães.
[email protected]
Imunologia E Inflamação
Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and
has an important role in cell signaling. LPC is a major phospholipids component of
oxidized low density lipoprotein (oxLDL) and is thus directly implicated as a critical
factor in atherogenic activity of oxLDL. Furthermore, LPC is also able to induce the
formation of foam macrophages, which are key cell components for the setting of
atherosclerosis, and leukocyte recruitment to the site of the pathology. Therefore, LPC
plays an important role in atherosclerosis, as well as in acute and chronic
inflammation. One important pro-inflammatory cytokine is the Interleukin-1beta (IL-1β)
which is regulated by inflammasome activation. Our group has previously
demonstrated that LPC is a TLR2 ligand and may be involved in modulation of
inflammatory responses. However, the role of LPC in modulating inflammasome
activation and lipid droplets biogenesis in this process is poorly understood. This study
aimed to investigate if LPC is capable of inducing IL-1β secretion, a key marker of
inflammasome activation, and verify the foam cell formation by analyzing biogenesis
of lipid droplets in this context. Human monocytes were isolated from peripheral
human blood of health donors and bone marrow derived macrophages (BMDM) were
obtained from C57BL/6 mice. Cells were pre-treated or not with inhibitors of (I) ROS
release (NAC), (II) potassium efflux (Glybenclamide), (III) lysosomal damage (CA074), (IV) HMG-CoA reductase (atorvastatin), and (V) blocking TLR2 antibody (AntiTLR2) during one hour and stimulated with different concentrations of LPC. After 24
hours of interaction, the supernatants were collected; IL-1β secretion levels were
analyzed by ELISA, and biogenesis of lipid droplets were analyzed by Flow Cytometry.
1μg of LPC induced significant secretion of IL-1β, which was dependent on potassium
efflux and TLR-2. Moreover, LPC induced lipid droplet biogenesis in a process
dependent on ROS release and lysosomal damage, which mediate the inflammasome
activation. In addition, cell treatment with atorvastatin decreased lipid droplet
biogenesis induced by LPC. Conclusion: Taken together our data suggests that LPC
triggers IL-1β secretion and induces lipid droplet biogenesis in inflammasomemediated pathway.
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R39-Peptídeos antimicrobianos intragênicos de diferentes plantas
Marcelo Henrique Soller Ramada; Guilherme Dotto Brand; Fernando Yano Abrão; Karina Peres
Gramacho; Carlos Bloch Jr.
[email protected]
Laboratório De Espectrometria De Massa
Diversos peptídeos bioativos podem estar inseridos em uma estrutura proteica
(peptídeos intragênicos) e quando liberados podem exercer sua função biológica. Ex.:
encefalina, bradicinina. Alguns peptídeos podem estar presos em uma sequência
proteíca e não terem sítios de liberação. Esses peptídeos intragênicos são de
interesse também na busca por novas moléculas bioativas como uma alternativa para
descoberta de novas drogas e, no caso de peptídeos antimicrobianos, para o controle
de diferentes fitopatógenos, que causam diversas perdas em diferentes culturas de
interesse no Brasil e no mundo. Neste trabalho, nós apresentamos resultados da
busca, síntese e atividade de peptídeos intragênicos antimicrobianos (PIAs)
selecionados do genoma Theobroma cacao e Arabidopsis thaliana. Apresentamos
também, os resultados da interação desses peptídeos com vesículas unilamelares. A
busca por PIAs foi realizada usando as proteínas preditas do genoma de Theobroma
cacao Matina 1.6 e Arabidopsis thaliana usando o software Kamal v1.0, com
parâmetros definidos pelo usuário. Onze peptídeos de T. cacao e dois peptídeos de
A. thaliana foram selecionados para síntese química em fase sólida utilizando a
estratégia Fmoc. Dois peptídeos, DS01 e Ascafina-8 foram sintetizados como
controles positivos. Os peptídeos foram purificados por HPLC de fase reversa. A
pureza, massa molecular e sequência de aminoácidos dos peptídeos foram avaliadas
e confirmadas por MALDI-TOF/TOF. As concentrações inibitórias mínimas dos
peptídeos sintetizados foram realizadas através do método de microdiluição em caldo
de acordo com o CLSI, variando a concentração dos peptídeos entre 256 Î¼M e 0,5
Î¼M contra diversos fungos e bactérias. Termogramas da interação dos peptídeos
com as vesículas unilamelares de DMPC ou 2:1 DMPC/DMPG foram obtidos através
de experimentos de calorimetria diferencial de varredura (DSC). Todos os peptídeos
foram testados contra os seguintes microrganismos: Candida albicans ATCC 90028,
Cryptococcus neoformans ATCC 28957, Fusarium solani, Fusarium oxysporum,
Trichoderma asperellum CNPAF TR356, Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e
Bacillus cereus ATCC 14579. Devido a sua importância na cultura cacaueira, os
peptídeos de cacau foram testados contra os esporos do fungo causadaor da
vassoura-de-bruxa, Moniliophtora perniciosa. Seis dos onze peptídeos de cacau e os
quatro peptídeos de A. thaliana foram capazes de inibir o crescimento de, pelo menos,
um microrganismo. Dos 6 peptídeos ativos de cacau, 5 foram capazes de inibir a
germinação dos basidiósporos de M. perniciosa. As vesículas compostas por 2:1
DMPC/DMPG tiveram alteração em sua transição de fase mesmo com peptídeos que
não apresentaram atividade antimicrobiano, não sendo um modelo adequado para
análise. Já nas vesículas compostas apenas por DMPC, oito dos dez peptídeos que
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apresentaram atividade antimicrobiana apresentaram algum grau de interação com
as mesmas, afetando levemente ou fortemente a transição de fase dessas vesículas.
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R40-Coevolução Molecular em Canais Iônicos e Neurotoxinas
Camila Ferreira Thé Pontes; Werner Treptow
[email protected]
Due to their importance in many cellular processes and specially in signal
transduction, voltage-gated ion channels (VGICs) serve as molecular targets to a
variety of toxins, some of which have an effect on the activation/inactivation kinetics
of the channel, known as gating modifier toxins. The gating modifiers Î±- and βscorpion toxins (Î±- and β-ScTxs) act on voltage-gated sodium channel (Nav)
extracellular sites altering the movement of the voltage sensor through a voltagesensor trapping mechanism. This study is an attempt to elucidate the molecular
mechanisms that determine toxin specificity through the investigation of molecular
coevolution between these toxins and their respective Nav binding sites using
computational methods. Preliminary results concerning the creation of heterogeneous
scorpion toxin sequence alignments and the analysis of the structural patterns present
in each toxin group are shown here. Multiple sequence alignments (MSAs) of Î±- and
β-ScTxs were obtained from UniProtKB using a seed alignment of heterogeneous
sequences to train a hidden Markov model. The obtained MSAs were then analyzed
using algorithms that calculated the entropy, divergence and mutual information for
each position (or pair of positions). The results revealed some positions of interest that
are probably related to toxin-channel interaction. The next step is to find via direct
coupling analysis pairs of interacting residues relevant to toxin selectivity that will be
applied in the generation of atomistic structural models of the complexes receptortoxin, which will be used in Go-type molecular dynamics simulations. It will then be
possible to calculate the binding energies using continuous model simulation, based
on which a model of interaction between toxins and channels will be proposed.
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R41-Development of whitefly resistant transgenic soybean plants via RNAi
Abdulrazak Baba Ibrahim, Ahmadu Bello, Francisco Jose Lima Aragão.
[email protected]
Using RNAi based strategies, we developed eight different lines of transgenic soybean
plants expressing an RNA hairpin capable of silencing A subunit of vacuolar ATPase
gene of Bemisia tabaci. Following the design and construction of a vector using a 576
bp nucleotide sequence from the A subunit of B abaci ATPase gene, the resulting
vector, designated pBtATPase, was used to transform zygotic embryos of Soy bean
(Glycine max) using particle delivery system. Following selection with imazapyr and
regeneration of plants arising therefrom, three distinct putatively transgenic lines
(designated 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 and 11) were successfully acclimatised and grown in the
greenhouse. PCR analysis using primers that anneal to specific regions of the
pBtATPase revealed that these lines have integrated the insert. The expression of this
silencing trait and its expected physiological effect on B abaci will further be evaluated
using additional molecular tools and feeding bioassay.
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R42-Estudo da relação entre o estado de diferenciação celular e a hipótese de
Warburg
José Antonio Fagundes Assumpção; José Raimundo Corrêa
[email protected]
Laboratório De Microscopia Eletrônica
O desenvolvimento do câncer é marcado pela “quebra” da defesa dos mecanismos
adaptativos existentes para a prevenção da transformação celular. Estudos recentes
apontam um modelo de desenvolvimento do câncer baseado em alterações
metabólicas. Uma destas alterações é o chamado Efeito de Warburg, ou glicólise
aeróbica, na qual o tecido utiliza a glicólise - gerando lactato - como fonte primária de
energia. Inicialmente paradoxal, devido à baixa eficiência na geração de ATP, a
glicólise pode ser vista como uma estratégia vantajosa para a adaptação celular,
produzindo inúmeros compostos intermediários de carbono utilizados em reações
anapleróticas para a síntese de ácidos graxos e nucleotídeos e auxiliando a
acidificação celular, por meio do acúmulo de piruvato e formação de lactato
(favorecendo também a invasão tecidual). O efetio de Warburg tem sido
exaustivamente descrito em células de alta capacidade proliferativa, como células
tumorais e embrionárias. Alterações no processo de respiração celular alteram
também padrões de expressão gênica e induzem características tumorigênicas.
Principalmente as chamadas células tronco tumorais (população de células dentro de
um tumor com capacidade para restaurar a colônia tumoral), partilham também outras
similaridades com células embrionárias, provavelmente por possuírem padrões
semelhantes de regulação da expressão gênica. O metabolismo energético alterado
de algumas células cancerígenas poderia ser explicado, então, pela desdiferenciação
“incompleta” de células adultas, que confere certas capacidades compartilhadas com
células embrionárias (mobilidade, invasão tecidual, proteínas de superfície,
receptores) e, ao mesmo tempo, mantem características do tipo celular da qual partiu,
como, por exemplo, o metabolismo energético/mitocondrial. A relação de causa ou
efeito envolvendo o metabolismo energético e o estado de diferenciação celular é
primordial para o melhor entendimento dos processos bioquímicos que regem o
estabelecimento e a progressão tumoral. Com a elucidação deste quadro, torna-se
possível a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento do câncer.
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R43-Aproveitamento de licores resultantes de pré-tratamento Liquid Hot Water
de resíduos agroindustriais como fonte de carbono para produção de enzimas
xilanolíticas por Aspergillus foetidus
Caio de Oliveira Gorgulho Silva; Barbara Neumann; Edivaldo Ximenes Ferreira Filho
[email protected]
Este trabalho propõe o uso de licores ricos em hemicelulose gerados no prétratamento Liquid Hot Water de diferentes biomassas lignocelulósicas como fonte de
carbono para crescimento do fungo filamentoso Aspergillus foetidus e produção de
enzimas xilanolíticas. O pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar será otimizado,
com uso da ferramenta estatística de planejamento experimental, de modo a gerar
licores ricos em hemicelulose que induzam a maior produção de enzimas xilanolíticas
por A. foetidus. Em um primeiro delineamento experimental, em que se variou a
temperatura do pré-tratamento de 170 a 230°C, o tempo de residência de 10 a 60
minutos, e a concentração de biomassa de 1 a 10% (m/m), foi observado que o fungo
não foi capaz de crescer (visivelmente a olho nu) e produzir enzimas na maior parte
dos licores gerados. Moléculas inibitórias ao crescimento microbiano, como furfural e
hidroximetilfurfural (produtos de degradação de pentoses e hexoses,
respectivamente), compostos fenólicos (produtos da modificação e degradação da
lignina) e ácidos fracos (como ácido acético, ácido fórmico e ácido levulínico) já são
documentadas na literatura como compostos gerados durante pré-tratamentos de alta
severidade e podem ser os responsáveis pelos resultados observados acima. Um
segundo delineamento experimental foi então realizado, diminuindo a severidade dos
tratamentos, utilizando os intervalos de 153 a 187°C, 10 a 50 minutos e 1 e 11%. O
fungo foi capaz de crescer e produzir xilanases em todos os licores, exceto no licor
gerado no tratamento mais severo (180°C por 45 minutos). Foi observado que em
licores resultantes de pré-tratamentos menos severos (160°C por 15 minutos), o fungo
secretou xilanases (1,097 UI/mL) já no início do cultivo (2° dia). Já em licores gerados
em tratamentos mais severos (por exemplo, 170°C por 30 minutos ou 160°C por 45
minutos), atividades de xilanase similares foram produzidas, porém em estágios mais
avançados do cultivo (6° dia em diante).
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R44-Análise do sinergismo de enzimas xilanolíticas microbianas na degradação
da fração de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar
Lorena Cardoso Cintra; Cintra, Lorena Cardoso; Oliveira, Izadora Cristina Moreira; Fernandes, Amanda
Gregorim; Jesuíno, Rosália Santos Amorim; Faria, Fabrícia Paula; Ulhoa, Cirano José.
[email protected]
Enzimologia - Ufg
A lignocelulose é o principal componente da biomassa vegetal, sendo constituída por
celulose, hemicelulose e lignina. A xilana constitui o principal componente da
hemicelulose e sua conversão em unidades de xilose requer a ação cooperativa de
um complexo composto por enzimas como: β-xilosidases, endoxilanases, α-Larabinofuranosidases, dentre outras. Genes de α-L-arabinofuranosidase de
Penicilium purpurogenum (PpABF3) e β-xilosidases Humicola grisea var. thermoidea
serão expressos na levedura Pichia pastoris para posterior montagem de um
complexo hemicelulolítico versátil. O cDNA do gene da PpABF3 foi clonado no vetor
de expressão pPICZA. Após a transformação foi realizada a PCR de colônia de
leveduras e os transformantes foram analisados quanto à capacidade de produzir e
secretar a enzima recombinante. O transformante T4 foi o que apresentou a maior
atividade 18 ± 0,4 U/mL, após 72 h de cultivo. A enzima PpABF3 apresentou também
atividade de β-xilosidase sendo, portanto, uma enzima bifuncional. A purificação da
enzima se encontra em andamento. Foi analisado o pico de produção de β-xilosidases
pelo fungo H. grisea cultivado em Farelo de trigo 2%, Bagaço de cana de açúcar 2%.
O melhor resultado foi obtido quando o fungo foi cultivado em meio mínimo contendo
BCA 2% por 216 h de cultivo, apresentando atividade de 3,5 U/mL ± 0,005, seguido
pelo FT 2% em 48 h com 1,1 U/mL ± 0,002. Após a análise do pico de produção de
β-xilosidases de H. grisea, foi possível determinar os pontos para a extração de RNA
total visando à obtenção do cDNA. Foram desenhados primers com base em
sequencias de β-xilosidades depositadas em banco de dados (Genbank) e foram
obtidos dois cDNAs de 984pb e 1617pb. Os cDNAs foram clonados no vetor pGEM®T-Easy (Promega) e utilizados para transformação de células de E. coli
eletrocompetentes. Após o sequenciamento foi possível verificar que se tratam de
duas β-xilosidades. Os cDNAs serão clonados em vetor de expressão para P. pastoris
e, posteriormente, será realizada a transformação. Os próximos passos serão a
produção das enzimas em P. pastoris, purificação e caracterização enzimática.
Posteriormente, as enzimas recombinantes PpABF3 e as β-xilosidades de H. grisea,
e uma endo-xilanase recombinante de H. grisea serão utilizadas em testes de
sinergismo e hidrólise enzimática de BCA.
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R45-Next-generation sequencing applied for identification of viruses in
watermelon (Citrullus lanatus) plants
Mariana Senna Quirino; Melo, F.L Aguiar, R.W. de S.; Orilio, A.F.; Ribeiro, B.M.
[email protected]
Baculovirus
The culture of watermelon (Citrullus lanatus Thunb) belongs to the Cucurbitaceae
family and it is susceptible to several viral pathogens. These viral infections do not
cause obvious symptoms in its host plants and the viral particles frequently occurs in
low concentrations. However, the capacity to analyze asymptomatic viral infections or
coinfection events increased with the appearance of high throughput sequencing.
Thus, this study has been designed to identify viruses which are present in
symptomatic watermelon plants. Watermelon leaves with viral symptoms were
collected from September to December 2013 in three producing regions of Tocantins
state. The plant material was subjected to virus semi-purification using centrifugation
steps through a sucrose cushion. Total RNA was then extracted from this viralenriched fraction using "RNeasy Plant Mini Kit" (Qiagen). Next, the RNAseq library
was prepared and sequenced by Illumina HiSeq 2000 platform. Forty million reads
were generated, and after quality trimming and de novo assembly using CLC
Genomics Workbench software, nearly fifty thousand contigs were obtained. All
contigs were submitted to blastx analyses against the viral RefSeq database. 4,912
contigs produced hits with identity to viral sequences publicly available. To further
confirm these results, we submitted those selected contigs that matched viral
sequences to blastx against the GenBank non-reduntant database (nr database), and
only the plant viruses were selected. We were able to identify viral genomes belonging
to the families Potyviridae, Partitiviridae, and Bunyaviridae. The largest contig (10,371
bp) showed 91% identity with Papaya ringspot virus. One contig of 1,704 bp contig
presented 98% identity with Zucchini yellow mosaic virus. We also found two contigs
of 1,575 and 1,606 bp related to the segments 1 and 2 of Partitiviridae. Interestingly,
these contigs presented an overall identity of 98% suggesting these contigs represent
a new viral species belonging to the Partitiviridae family. Moreover, we found highly
divergent contigs (6,596 and 2,674 bp) related to Bunyaviridae L and S segment,
respectively. Overall, we were able to identify viruses infecting watermelon already
described, as well as both currently circulating in watermelon crops in Brazil, the
complete genome of the novel viral specie Groundnut ringspot virus (GRSV) whose
presence in Brazil was reported recently and a virus from Partitiviridae family.
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R46-Characterization and biotechnological applications of pectinolytic enzymes
secreted by Clonostachys byssicola grown on fruit residues
Helder Andrey Rocha Gomes; Edivaldo Ximenes Ferreira Filho
[email protected]
Laboratório De Enzimologia
Fruit juice production is an important economic activity in Brazil. In 2011, Brazil was
the biggest exporter of orange fruit juice. It was sold 1,5 million tons of ready-to-drink
juice, and 440 thousand tons of concentrated juice. The yield of juice is estimated in
50%, so there is a huge amount of orange waste that, when it is not well disposed,
can produce environmental pollution. Same can be applied to passion fruit juice
production, where juice yield is between 35% and 40%. These residues can be used
as inducers of the secretion of pectinolytic activity by filamentous fungi. Fruit peels and
residues contain significant amounts of pectins, since these polysaccharides play
important role on fruit development and ripening process. Additionally, these residues
are cheap carbon sources, and are abundant, since fruit processing is an important
economic activity in Brazil. Several fungi species are poorly studied for the
characterization and potential of application of lignocellulolytic enzymes. Clonostachys
byssicola is a well known mycoparasitic fungus, and its potential as biocontrol agent
has been evaluated, but the characterization of the enzymes produced by this specie
grown on lignocellulosic residues is still not well studied. In this work, pectinolytic
enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on passion fruit and orange peels
will be purified, characterized and evaluated for biotechnological applications in fruit
juice treatment for reduction of viscosity, as well as for cotton biopurge. So far, crude
extracts of C. byssicola grown on orange peel and passion fruit peel showed pectinase
and pectin lyase activities. These two lignocellulosic substrates were found to be good
inducers for the secretion of pectinolytic activity by the fungal strain. The growth curve
for C. byssicola grown on orange peel has been done, indicating that from the 5th day
on, pectinase levels remain almost constant.
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R47-Identificação de genes cry de Bacillus thuringiensis eficientes no controle
de pragas agrícolas
Fernanda Guimarães Bernardes; Martins, Érica Soares; Queiroz, Paulo Roberto; Gomes, Ana
Cristina Meneses Mendes; Monnerat, Rose Gomes.
[email protected]
Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva normalmente presente em solos
e, entre os seus genes de interesse, estão os genes cry, responsáveis pela
codificação de proteínas tóxicas a diversos insetos-praga da agricultura. Estas toxinas
são produzidas durante a esporulação e apresentam forma de cristais, sendo
altamente específicas para seus insetos-alvo. Existe uma grande variedade de
proteínas Cry. O objetivo do trabalho é selecionar e caracterizar estirpes de B.
thuringiensis da Coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia que sejam tóxicas a pragas agrícolas. Inicialmente as
estirpes serão testadas em bioensaios seletivos contra insetos-praga das Ordens
Lepidoptera e Coleoptera. Aquelas que provocarem mortalidade acima de 50% a um
ou mais insetos, serão submetidas a bioensaios de dose e caracterização molecular
com a identificação de genes cry por PCR (Reação em cadeia da polimerase) e com
análise do perfil proteico. Até o momento, foram testadas cinco estirpes de B.
thuringiensis, sendo que duas provocaram mortalidade acima de 50% no bioensaio
seletivo para Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda. Essas estirpes
apresentaram resultado positivo para o gene cry1, e perfil de proteínas compatível às
proteínas tóxicas a lepidópteras. O próximo passo será realizar o bioensaio de dose
das duas estirpes, aperfeiçoar a caracterização molecular destas na busca da
identificação da presença de outros genes cry e realizar o bioensaio seletivo com
insetos da Ordem Coleoptera. O mesmo procedimento será realizado com diversas
estirpes da coleção.
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R48-Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of
Cryptococcus neoformans
Fabiana Brandão Alves Silva, DERENGOWSKI Lorena; ALBUQUERQUE Patricia; SILA-PEREIRA
Ildinete e NICOLA André; FONSECA, Marcio José Poças.
Cryptococcus neoformans infection is due to expression of various virulence factors
that allow survival under various stress conditions. Inhibitors of histone deacetylases
(HDACi) Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA) have the ability to
affect the profile of chromatin resulting in changes on expression several genes.
Objective: Study the effect of HDACi on expression of virulence phenotypes of
C. neoformans and the interaction of the fungus with animal hosts. Methods:
Different concentrations of the drugs were applied to C. neoformans cultures grown
on several conditions in order to analyze the expression of virulence phenotypes. Cell
cycle was evaluated by flow cytometry. Survival curve were performed infecting
caterpillars of the alternative host Galleria mellonella with C. neoformans cells
pretreated with HDACi. Results and Conclusion: HDAC showed ability interfere on
major virulence phenotypes described for C. neoformans significantly, even in
concentrations subinibitory, such as capsule, melanin, phospholipases and mating
type. Solely urease was not affected at any concentration tested by both HDACi.
NaBut showed more pronounced and permanent effect that TSA, possibly because
TSA is less stable. There is an increase in the population of cells in G2 / M
when treated for NaBut. Inhibitory effects observed in the formation of the capsule
was not maintained after removed of the drug "in vitro". Although HDACi affect
the virulence phenotypes "in vitro", no significant differences were observed in
the time of death of caterpillar of species Galleria mellonella between treatments
versus controls. Perspectives: Following steps of this work will be to evaluate the
synergism of HDACi with other antifungal drugs. We will also construct C. neoformans
HDAC mutants and investigate the role of these genes in the regulation of expression
of virulence factors by RNA-seq and infection in vivo assays.
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R49-Desenvolvimento
de
potenciais
estatísticos
para
simulação
de
enovelamentos proteicos
Diogo César Ferreira, Marx Gomes Van der Linden, Antônio Francisco Pereira de Araújo.
[email protected]
Desde a década de 1970, busca-se compreender os mecanismos subjacentes ao
processo de enovelamento proteico, uma vez que, em geral, as proteínas necessitam
de uma estrutura tridimensional bem definida para exercer seu papel fisiológico.
Nosso grupo tem trabalhado com modelos estatísticos de predição de estrutura
tridimensional, e optou-se por utilizar um algoritmo baseado em Modelo Oculto de
Markov (HMM) para tanto. Além disso, em um trabalho anterior foi proposta uma
equação que descreve a probabilidade de um dado átomo apresentar um certo
enterramento atômico (sua distãncia até o centro geométrico da estrutura). O
presente trabalho visa fazer a transição entre a predição discreta dos enterramentos
(agrupados em camadas) vinda do HMM e a predição contínua com base nesta
equação, a fim de se aproveitar ao máximo a informação obtida pelo algoritmo.
Utilizaram-se dados de cadeias globulares, retiradas do banco de dados PDBSELECT de 2012. Um algoritmo baseado em HMM foi usado para se calcular, para
cada átomo, as probabilidades de sua distribuição em camadas de enterramento.
Ajusta-se então, à cada um destes conjuntos de probabilidades, um conjunto de
parãmetros que leva à função (previamente citada) que melhor descreve tal
distribuição. A qualidade do ajuste é estimada pela divergência de informação entre
as probabilidades calculadas pelo HMM, e as obtidas da função ajustada. A qualidade
final da predição é estimada por uma função de verossimilhança entre os
enterramentos observados e preditos. Com este estudo pretende-se a obtenção de
potenciais para simulações de enovelamento proteico. é possível ainda otimizar os
critérios para o ajuste dos parãmetros da curva para minimizar artefatos decorrentes
do método. Como a qualidade deste método é limitada pela qualidade do método da
predição discreta inicial, põe-se também como perspectiva a possibilidade fazermos
predições contínuas de enterramentos diretamente da sequência primária.
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R50-Escherichia coli engenheirada metabolicamente aumentam a produção de
proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra sintética
Valquíria Alice Michalczechen Lacerda, Vianna, Giovanni Rodrigues; Murad, André Melro; Silva,
Luciano Paulino; Kaplan, David Lee; Rech, Elíbio Leopoldo..
[email protected]
Laboratório De Biologia Sintética
As fibras de teia de aranha são polímeros com propriedades elásticas e de resistência,
simultaneamente. Com os avanços da engenharia genética e da biologia sintética, é
possível elaborar fibras sintéticas a partir de proteínas recombinantes produzidas em
sistemas heterólogos. Esses polímeros apresentam sequências de aminoácidos com
alta repetitividade, sendo um fator limitante para o metabolismo de bactéria. O
presente estudo concentrou-se em melhorar o metabolismo de Escherichia coli
aumentando a disponibilidade de glicil-tRNA (glyVXY) e aminoácido glicina (glyA)
para a produção de proteínas da glândula ampolada maior (MaSp2) da aranha
Parawixia bistriata com 16× e 32× o módulo inicial (54 e 105 kDa), além de
caracterizar as fibras produzidas. Para a alteração metabólica realizou-se quatro
construções utilizando o plasmídeo pACYC184, enquanto as proteínas MaSp2 foram
inseridas no plasmídeo pET19b. As linhagens são derivadas de BL21(DE03) e foram
avaliadas com relação à curva de crescimento (24, n=3), quantidade de material
biológico após a indução e rendimento de proteína alvo. Essas foram confirmadas por
SDS-PAGE, Western blot, espectrometria de massa e caracterizadas por MEV após
liofilização. A elaboração das fibras ocorreu em banho de coagulação com
isopropanol, podendo ou não ser hidratada e esticada posteriormente (tratada), sendo
a morfologia avaliada por MEV e MFA, e a espectroscopia de força e viscoelasticidade
topográficas por MFA. Os resultados foram submetidos ao teste t.utilizando o
programa Assistat 7.7 Beta. Não houve diferença entre as linhagens para a curva de
crescimento, quando induzidas a produzir as proteínas alvo. Quanto à produção de
biomassa o rendimento entre as linhagens foi muito próximo, havendo um aumento
na produção das proteínas de interesse nas linhagens construídas (P<0,05).
Percebeu-se que as fibras apresentam uma topografia não homogênea (MFA) e
houve uma diminuição dos valores em Ra (média aritmética) e Rq (média da raiz
quadrada) para rugosidade e em Rv (vale mais profundo) no grupo tratado, P<0.05.
Além disso, observou-se uma diminuição do diâmetro das fibras para o grupo tratado,
mas todas apresentam morfologia lisa (MEV). As análises por espectroscopia de força
mostraram que houve um aumento da força atrativa entre a superfície da fibra com a
ponteira para o grupo tratado (P<0.01). Sabe-se que após a extrusão, as fibras
sintéticas ainda não terminaram de se formar, e a hidratação e o estiramento são
passos importantes para o produto final. O estudo realizado obteve sucesso com o
rendimento proteico das novas linhagens bacterianas estabelecidas, e os tratamentos
são de extrema importância para a formação de uma fibra com qualidade. Esse
biomaterial tem aplicação em engenharia de tecidos e na indústria de materiais.
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R51-Characterization and comparison between the cellulosome and the crude
extract produced by a new isolate of Clostridium thermocellum
Karen Ofuji Osiro, Camargo, Brenda Rabello; Inoue, Rachel Satomi; Sousa, Marcelo Valle; Murad,
André Melro; Felix, Carlos Roberto; Noronha, Eliane Ferreira.
[email protected]
Enzimologia
The anaerobic bacterium C. thermocellum B8 was isolated from rumen goat and
secretes enzymatic complexes presenting cellulolytic and xylanolytic activities, called
cellulosomes. The present work aimed the purification and characterization of
celulossomes produced by the above mentioned bacterium after growth on liquid
medium containing cellulose as carbon source. The complexes were eluted from the
residual substrate bounded proteins (RSBP) and purified with the aid of a molecular
exclusion chromatographic column (Superdex S-200). The main protein peak was
eluted on the void volume and presented enzymatic activities of cellulases and
xylanases. Through the intensity of dynamic light scattering measurement, two
polydisperse populations (64,34 ± 19,17nm and 481,7 ± 186,9nm) were detected at
this purified sample, being the first peak predominant in number. In addition of tween
0,1% at the cellulosome sample, a third peak of polydisperse population appears
(10,64 ± 2,46 nm) being rife in this condition. As a result of tween 1%, remained only
the peak of 10,64 ± 2,46 nm. Suggesting that the detergent outcomes to the
dissociation of the complexes on the protein units. A total of 24 proteins of the purified
cellulossome were identified by mass spectrometry LC-MS/MS: 4 scaffolding proteins,
1 ABC transporter substrate-binding protein, 19 types of glycoside hydrolase proteins
classified on the families 5, 8, 9, 10 and 48. The cellulosome and the RSBP samples
were characterized in relation of temperature, thermostability, pH and phenols to
evaluate their use on the saccharification of cellulose, sugar cane straw and cotton gin
trash. The optimum temperature has a range from 60°C until 70°C and the optimum
pH is 5, for both samples. It was observed that the cellulosome is less inhibited than
the RSBP during the phenols test in xylanase and CMCase essays. Saccharification
experiment was carried during 10 days at 50°C and 60°C, showing a higher amount
of sugar released in 50°C, for both samples. Sugars obtained during enzymatic
hydrolisis of the substrates were analysed with HPLC technique in first, second and
tenth day of experiment. The maximum of total sugar was in the tenth day, and the
sugar cane straw was the substrate which was detected a higher diversity of released
sugar. However, the higher amount of sugar was found in cellulose for both samples
at 50°C. In summary, this reasearch demonstrated the capacity both the cellulosome
and the RSBP to hydrolize different sources of biomass, being a interest product to
produce the second generation of biofuels.
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R52-Synthesis, purification and characterization of Bioactive Peptides
Mariana Magalhães Nóbrega, Felipe Vinecky, Marcelo Ramada, Guilherme Dotto Brand, Karla
Graziella Moreira, Marcia Renata Mortari, Carlos Bloch Jr.
[email protected]
Bioactive peptides prospection is important for biotechnology field as well as a starting
point in many research areas, such as: new drugs development and production of
genetically modified plants. In general, bioactive peptides have been identified as
candidates for the new drugs development because their intrinsic properties
concerning some potential activities, like high specificity, potency, less toxicity, and
also chemistry and biological diversity. Peptides can present diverse activities such as
antimicrobial, opioids, hypotensive, antithrombotic among others. This study aims to
design sequences of synthetic peptides that may have antimicrobial, opioid and
hypotensive activity. Peptides primary structure prediction was based on previous
work of our group, which focused on prospection and bioactive peptides
characterization. These studies were based on the knowledge available on the
literature about the biological properties of specific protein domains, molecular targets
and drug actions. The peptides were synthesized by solid-phase chemical synthesis
using Fmoc strategy followed by purification on high performance liquid
chromatography. Purity and confirmation of the primary structure were determined by
mass spectrometry, MALDI and ESI. The assay for antimicrobial activity was made in
vitro against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. For
opioid activity, the two synthetic peptides, were tested in mice (6-8 per group)
intraperitoneally, equimolar to morphine (positive control) in order to assess its
possible antinociceptive activity through hot plate and tail flick assays. The
hypotensive activity we try to start, but we had difficult in have collaborators with
spontaneously hypertensive animals. For antimicrobial activity were synthesized four
peptides. It was possible to determine the MIC (minimum inhibitory concentration) for
these microorganisms. Some of MIC values were approximately to one micro molar.
The opioid activity exhibited pharmacological activity in vivo, which may be
denominated opioid receptor agonists, because they promoted antinociception in mice
when exposed to thermal stimulation. Thus, it is interesting continue studying
therapeutic potential of these peptides to contribute with development for new drug
candidates.
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R53-The functional analysis of distinct tospovirus movement proteins (NSm)
reveals different behaviors among the tospovirus species
Mikhail Oliveira Leastro, Ana Peiró, Vicente Pallas, Jesus Angel Sanchez-Navarro, Renato Resende.
[email protected]
Virologia Vegetal
Plant viruses have developed a class of proteins responsible for ensuring viral
infection and dissemination denoted movement proteins (MPs). For tospoviruses, it
was demonstrated that virus movement requires tubules formation driven by its nonstructural movement protein (NSm). Although, it is expected that this mechanism
would be conserved among the 28 tospovirus species reported so far within the genus,
comparison among them reveals significant differences in amino acid sequences of
viral proteins and in their biological features such as host range. Some tospovirus
species present a narrow spectrum of host plants, e.g BeNMV, while others such as
TSWV, TCSV and CSNV display a broad host range infecting plants from a large
number of different botanical families. Due to its main function, the NSm proteins are
often assigned as potential determinants of host specificity and/or adaptation. The aim
of this study was to evaluate the role and the efficiency of four tospovirus MPs on cellto-cell and systemic movements using the heterologous Alfalfa mosaic virus AMV
system, that allows the functional exchangeability of viral movement proteins (MPs)
assigned to the â€œ30K familyâ•. Here, differences in the efficiency in cell-to-cell and
systemic movement were observed based on the average sizes of the infected areas
supported by the distinct tospovirus MPs tested. Also, we observed that all MPs
analyzed were not competent to support the transport of an AMV RNA 3 carrying a CP
mutant (CP206) defective in virus particles, indicating the incapacity of the MPs to
transport other complexes different than virions in the AMV context. It was also
demonstrated that the MPs of the four tospovirus species were similarly efficient to
form tubules. However, C-terminal deletion of the MPs revealed that C-terminus of the
MP of BeNMV was shown not to be essential for virus movement, in contrast to CSNV,
TCSV and TSWV-MPs which required the entire NSm proteins to guarantee the cellto-cell movement. These results confirmed different features and behaviors among the
tospovirus movement proteins. We suggest that the NSm protein plays a role in the
determination of the viral infection spectrum of host plants based on the differences
observed in cell-to-cell and systemic movement patterns among the tospovirus MPs.
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R54-Produção e caracterização de uma endoglucanase da família GH6
proveniente de metagenoma de solo de canavial
Antonielle Vieira Monclaro, Fábio Squina, Thabata M Alves, Thiago A. Gonçalves , Edivaldo Ximenes
Ferreira Filho.
[email protected]
A parede celular é uma rede de fibrilas fortes, composta de celulose, hemicelulose,
pectina, proteínas estruturais e lignina, e sua composição varia entre as espécies de
plantas e entre os tecidos da própria planta. A celulose representa o principal
polissacarídeo presente na biomassa e consiste de um polímero linear não ramificado
de resíduos de D-glicose. Vários organismos podem degradar eficientemente a
parede celular e usar os próprios produtos de degradação para nutrição, porém a
recalcitrãncia à decomposição biológica é um grande limitante para a conversão da
biomassa lignocelulósica em produtos finais valiosos. Uma abordagem interessante
na procura de novos candidatos na degradação da parede celular é através da
metagenômica, análise do genoma das comunidades microbianas complexas
encontradas em determinados habitats. O presente trabalho buscou enzimas
candidatas que possuíssem características bioquímicas interessantes a partir de uma
livraria de metagenoma de solo de cana de açúcar. A amostra de solo de canavial foi
coletada na cidade de São Carlos (SP), foi feita extração e purificação do DNA
metagenômico e um screening funcional para atividade em β-glucana em placas.
Após a identificação do clone positivo para atividade em β-glucana, ela foi
sequenciada e identificada tendo um domínio catalítico de GH6. O clone positivo foi
clonado em pET28a e transformada em DH5alfa. Após confirmação da colônia
transformada, ela foi submetida a miniprep e transformada em ArcticExpress (DE3),
inoculada em meio LB e a enzima expressa foi purificada por cromatografia com
coluna de niquel e gel filtração. Na caracterização bioquímica da enzima, ela obteve
maior atividade em 40 graus, pH 6, apresentou atividade em beta-glucana e liquenana
e massa molecular estimada em 27 kDa. Através de eletroforese capilar seu produto
de hidrólise foi avaliado e confirmou-se que ela é uma endoglucanase da familia GH6.
A análise por dicroísmo circular indicou que sua estrutura secundária é composta
basicamente por alfa-hélice.
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R55-Estudo do efeito da Metilação do DNA e de Histonas na produção de
xilanases por Humicola grisea var. Thermoidea
João Heitor Colombelli Manfrão Netto; Márcio José Poças Fonseca
[email protected]
Regulação Gênica E Mutagênese
Humicola grisea var. thermoidea é um deuteromiceto termofílico com a capacidade
de produzir celulases e xilanases e esta característica faz deste fungo um bom
candidato para utilização na bioconversão de produtos agrícolas. As xilanases são
enzimas com versátil aplicabilidade industrial, tornando atrativo o aumento da
expressão de genes de xilanases em fungos, como Humicola grisea. Neste trabalho
avaliaremos o efeito de moduladores epigenéticos na expressão de genes de
xilanases (celulases também) e na atividade enzimática no fungo Humicola grisea.
106 esporos/mL do fungo serão inoculados por 24 h em 50 mL de meio mínimo de
Pontecorvo (MM). Os micélios crescidos serão então filtrados, lavados com água
destilada estéril e transferidos para novas alíquotas de 50 mL de MM, suplementados
com GLI 1% (p/v) ou bagaço de cana de açúcar explodido a vapor (BCA) 0,1% (p/v)
como únicas fontes de carbono, em presença ou não (controle) das diferentes drogas
moduladoras epigenéticas. As drogas a serem utilizadas serão 5-aza-2’-deoxicitidina,
pargilina e 5´-desoxi-5´metiltioadenosina. A atividade hidrolítica dos sobrenadantes
será determinada por ensaio enzimático utilizando o reagente DNS. RT-qPCR será
utilizada para determinar os níveis dos transcritos de genes de xilanases (alguns de
celulases). Até o presente momento foram realizados apenas os testes com a droga
5-Aza. Nossos primeiros resultados demonstram que a utilização desta droga diminui
a atividade enzimática e os níveis dos transcritos da maioria. Esperamos encerrar os
demais experimentos com as outras drogas moduladoras para assim avaliarmos os
efeitos de mecanismos epigenéticos na regulação de genes de celulase e xilanase.
Nossos primeiros resultados demonstraram que o uso de 5-Aza não aumentou a
expressão dos genes analisados, porém como as outras drogas ainda não foram
testadas, não podemos descartar seu uso como uma possível alternativa para o
aumento da expressão destes genes e uma possível solução para acelerar o
processo de degradação de resíduos agrícolas e transformação destes subprodutos
em produtos com alto valor agregado.
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R56- Engenharia metabólica de Saccharomyces cerevisiae para aproveitamento
de xilose na produção de etanol lignocelulósico
Bárbara Gomes Paes, Lima, Larissa M, Almeida, João R. M, Pepe, Lídia M.
A xilose é o açúcar mais abundante na hemicelulose de várias biomassas. Entretanto
a levedura Saccharomyces cerevisiae é incapaz de fermentar pentoses como a xilose.
Estratégias para desenvolvimento de linhagens recombinantes de S. cerevisiae
capazes de fermentar xilose vem sendo desenvolvidas por expressão de enzimas de
vias catabólicas deste açúcar. Neste trabalho, a xilose isomerase (XI) de Piromyces
sp. foi usada na a construção de linhagens recombinantes de S. cerevisiae e
melhoradas por engenharia evolutiva. Paralelamente, foram identificados e expressos
novos genes codificadores de XI. O gene de Piromyces foi amplificado e clonado em
plasmídeo multicópia sob expressão de promotor forte. Também foi construído outro
plasmídeo multicópia com o gene endógeno de S. cerevisiae para xiluloquinase (XK).
Os plasmídeos foram usados para transformar duas linhagens laboratoriais de S.
cerevisiae. Os transformantes obtidos foram selecionados e submetidos a evolução
adaptativa, que consiste na fermentação continua das linhagens fazendo
transferência sucessiva em meio mínimo seletivo (YNB+Xilose). Paralelamente foram
identificadas por alinhamento em banco de dados, diferentes genes codificadores de
XI. Os genes foram sintetizados e clonados no mesmo vetor escolhido para expressar
a XI-Piromyces. Uma mesma levedura laboratorial foi transformada e clones positivos
isolados. Linhagens recombinantes de S. cerevisiae capazes de consumir xilose
foram obtidas pela expressão da XI de Piromyces juntamente ou não com XK. A
evolução adaptativa permitiu o melhoramento das linhagens, as quais apresentaram
diferença de crescimento até duas vezes maior que as sem condicionamento. Os
novos genes codificadores de XI foram usados na construção de linhagens
recombinantes de S. cerevisiae. Todas as linhagens geradas estão sendo
caracterizadas fisiologicamente considerando taxa de crescimento, produção de
etanol e coprodutos, e consumo de xilose.
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R57-Identificação e caracterização de moléculas microbianas associadas à
biodegradação de polietileno
Julianna Barbosa Peixoto, Ricardo Henrique Krüger.
[email protected]
Enzimologia
O polietileno (PE) é o polímero sintético mais largamente produzido e utilizado, cuja
produção mundial atinge cerca de 140 milhões de toneladas/ano, de modo que
virtualmente todos os produtos modernos apresentam esse polímero em sua
constituição. Essa ubiqüidade é justificada pelo baixo custo, alta versatilidade,
resistência e durabilidade desse plástico, características promissoras para atender à
alta demanda da sociedade. No entanto, esses materiais resistentes e duráveis, ao
serem descartados, levam até 500 anos para se decompor em ambientes naturais.
Essa recalcitrãncia é consequência das características moleculares e estruturais do
PE, um alcano de longa cadeia carbônica e elevadas massa molecular e
hidrofobicidade, além da intensa cristalização de seus segmentos moleculares. Nesse
contexto, os problemas decorrentes da severa poluição e do grande impacto aos
ecossistemas são potencializados pela ineficiência das atuais técnicas de gestão dos
plásticos pós-consumo. Diante desse panorama, a biodegradação emerge como
alternativa sustentável, consistindo na submissão desses polímeros ao metabolismo
microbiano. A fim de explorar o potencial biodegradativo, no presente trabalho foram
isolados mais de 800 microrganismos colonizadores de debris plásticos descartados
em solos do Cerrado a partir de técnicas de cultivo. Com base em uma estratégia
inovadora que visou a selecionar os efetivos biodegradadores de PE, foram
identificadas, dentre os isolados, 9 bactérias com grande potencial para esse
processo, compreendidas entre os gêneros Delftia, Comamonas e
Stenotrophomonas. Esses isolados mostraram-se viáveis mesmo após 3 meses de
cultivo com PE como única fonte de carbono e energia. Análises dos filmes de PE por
FTIR confirmaram a ocorrência de alterações químicas no polímero após o cultivo
com esses isolados. Esses resultados permitiram a seleção de um representante por
gênero, dentre os biodegradadores de PE, para posterior análise de seus genomas,
transcritomas e secretomas, objetivando o estudo do metabolismo de polímeros
sintéticos e a investigação das enzimas envolvidas no processo. Com isso, esperase que esse estudo contribua tanto para a compreensão do processo de
biodegradação, como para o provimento de um manejo sustentável e
economicamente viável aos plásticos pós-consumo.
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R58-Obtenção de proteínas de camada S de Archaea para possíveis aplicações
biotecnológicas
Thiago Rodrigues de Oliveira, Silva, Luciano; Freitas, Sonia; Krüger, Ricardo; Cynthia Maria Kyaw
[email protected]
Laboratório De Microbiologia
O domínio Archaea apresenta características em comum com os domínios Bacteria e
Eukarya e, ao mesmo tempo, apresenta características próprias. A presença de uma
camada proteica de superfície, denominada camada S, é bastante comum neste
domínio. é geralmente composta por uma única proteína e produzida em grandes
quantidades na célula. Além disso, essas proteínas apresentam capacidade de se
auto-organizarem em arranjos cristalinos. O espaço entre as proteínas que formam a
camada S variam de 2,5 a 35 nm. Como camadas S são arranjos monomoleculares
de subunidades idênticas, os poros formados apresentam assim tamanhos e
morfologias idênticos. Mesmo quando separadas, unidades isoladas da camada S
apresentam a capacidade de recristalização em arranjos regulares quando o agente
utilizado na separação é removido. A capacidade dessas proteínas de se autoorganizarem, originando estruturas cristalinas homogêneas, conferem enorme
potencial nanotecnológico às camadas S, de maneira que o objetivo deste estudo é
a obtenção de proteínas de camada S de Archaea para possíveis aplicações
biotecnológicas. Os organismos halófilos, Halobacterium salinarum e Haloferax
volcanii, os quais apresentam apenas camada S na sua parede, foram cultivados em
condições especificas. Iniciadores de PCR foram desenhados para os genes das
proteínas S desses organismos. Foram padronizados protocolos de extração de DNA
dos mesmos para uso como molde em ensaios de PCR feitos com os iniciadores
desenhados. Os fragmentos amplificados foram então clonados em um plasmídeo
vetor e aguardam sequenciamento. Foram feitas análises de microscopia eletrônica
de varredura para a visualização da camada S desses organismos, mas houve
limitações na resolução obtida. Pretende-se isolar o gene da proteína S desses
organismos para se construir fusões gênicas com proteínas de interesse, algo que se
mostrou bastante interessante em outros estudos. Além disso, pretende-se isolar as
proteínas S por protocolos de ultracentrifugação para aplicações biotecnológicas,
como produção de nanopartículas ou construção de membranas de ultrafiltração. Por
fim, pretende-se fazer uma caracterização estrutural dessas proteínas, a fim de se
entender a natureza do seu enovelamento e auto-arranjo.
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R59-Mapeamento de sítios de glicosilação de MRJP1 e sua influência nas
estruturas terciárias e oligoméricas
Samuel Coelho Mandacaru, Rayner Myr Lauterjung Queiroz, Marcelo Valle de Sousa.
[email protected]
Laboratório De Bioquímica E Química De Proteinas
A abelha (Apis mellifera) se mostra um excelente modelo para estudos bioquímicos
de processos neurológicos. MRJPs (Major Real Jelly Proteins) são as principais
glicoproteínas encontradas na geleia real. MRJP1 está envolvida também em vários
processos como a regulação da diferenciação larval em rainha, e aumento do título
do hormônio juvenil e desenvolvimento do ovário. Modificações pós-traducionais são
ubíquas nas células e regulam funções de proteínas, frequentemente, pela
modulação de suas características biofísicas. As diferentes funções desempenhadas
pelos glicanos é determinada pela sua estrutura e a proteína ao qual está ligado. De
acordo com isto, eles podem ter diversas funções como: proporcionar o dobramento
de proteínas; modificar e regular as funções do esqueleto carbônico. Objetivos:
Mapear sítio de glicosilação em MRJP1 e analisar suas influências na formação de
oligômeros e estrutura terciária. Estratégias baseadas em gel como BN-PAGE e 2DE, emissão de fluorescência do triptofano e espectrometria de massas Bottom-up.
Observamos que mesmo deglicosilada, a MRJP1 mantém a estrutura terciária.
Observamos a formação de vários tamanhos de oligômeros de MRJP1 glicosilada. O
mesmo experimento com a proteína deglicosilada não houve a formação dos mesmos
oligômeros quando comparado à proteína glicosilada, mostrando a influência dos
glicanos na estrutura quaternária da MRJP1. Quando analisados por gel 2-DE, foi
observado que a MRJP1 possui 9 diferentes proteoformas. Este mesmo experimento
quando realizado com a proteína deglicosilada, foi observado que as mesmas formas
se mantiveram, sugerindo que os glicanos presentes não são responsáveis pelas
diferentes proteoformas observadas em gel 2-DE. Foram mapeados 2 sítios de
glicosilação em MRJP1.
94
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R60-Genômica aplicada ao cajueiro: tecnologias de genotipagem de alto
desempenho para a caracterização de germoplasma e seleção genômica ampla
Bárbara Muller Salomão de Faria, Orzenil B. Silva-Junior; Mariana Lira; Glaucia S. C. Buso; Zilneide
P. S. Amaral, Dario Grattapaglia.
[email protected]
O cajueiro (Anacardium occidentale) é uma cultura nativa do Brasil em um estágio de
melhoramento genético com plena condição de ser fortemente potencializado pela
aplicação direcionada das novas ferramentas genômicas integradas à fenotipagem
de alto desempenho. A possibilidade de executar seleção ultra-precoce de plantas
elite ainda em estágio de mudas no viveiro com base na análise genômica,
revolucionaria o programa de melhoramento, permitindo reduzir ou mesmo eliminar a
etapa de testes de progênie e partir diretamente para testes clonais. O objetivo do
projeto de doutorado é desenvolver uma plataforma de genotipagem de SNPs de alto
desempenho para aplicações na caracterização genética do banco de germoplasma
do cajueiro e no melhoramento acelerado via seleção genômica. Até o momento,
foram executados dois experimentos de sequenciamento de nova geração (Illumina
HiSeq), de representações de complexidade reduzida do genoma do cajueiro, com o
objetivo de identificar marcadores SNPs. O primeiro experimento envolveu a
descoberta de SNPs através do método RAD sequencing (Floragenex), sequenciando
duas amostras de DNA (sendo uma de um acesso único para gerar um genoma de
pseudo-referência e outra constituída por um pool de 12 indivíduos selecionados para
maximização da diversidade). O segundo utilizou o método Cornell-GbS de
genotipagem por sequenciamento de representações genômicas reduzidas via a
enzima de restrição PstI, sendo genotipados 90 indivíduos (com seis replicatas,
totalizando assim 96 indivíduos sequenciados). Para o RAD sequencing foram
gerados 15,8 milhões de sequências, resultando na identificação de 5.128 SNPs,
sendo 1.403 SNPs de alta qualidade com pelo menos 60 pb de sequência flanqueante
sem SNPs adicionais, efetivamente prontos para a construção de um chip de
genotipagem Infinium (Illumina) ou Axiom (Affymetrix). No método Cornell-GbS foram
geradas 194,6 milhões de sequências, apresentando 11.290 SNPs genotipados,
sendo 3.637 SNPs com qualidade e consistência de declaração de genótipo nas
replicatas. Em conclusão, estes experimentos iniciais são inéditos para o cajueiro e
resultaram na descoberta de mais de 5.000 SNPs de alta qualidade, que permitem
agora o desenvolvimento de um sistema de genotipagem em larga escala para 3.000
genótipos de cajueiro (previsto para 2015).
95
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R61-Initial characterization and crystallization of a novel bacterial protease
selected in a metagenomic approach
Muhammad Faheem, J.F.D., Souto, B.M., Quirino, B.F., Álvares, A.C.M.. , Freitas, S.M. de, Barbosa,
J.A.R.G.
[email protected]
Laboratório De Biofísica
In the past decades sophistication in the sequencing techniques has advanced the
microbial genomic data collection. Metagenomics technique has also played a very
important role in the collection of this significant amount of microbial genomic data.
This huge amount of genomic data has a great importance in terms of discovery of
new microorganisms, evolutionary studies and their role in a specific environment.
One of the current focuses in science is to seek the interpretation and transformation
of the collected genomic data into functional proteomics data. The combination of
structural biology and genomic data is one way to achieve such goal. Structural biology
and X-ray crystallography are now mature fields of science that have evolved a lot in
the 20th century. This has led to more than 100,000 biomacromolecular structures
available online to the scientific community. Here we have aimed to produce a novel
protein crystallographic structure found in a metagenomic approach. This research
utilized a DNA library from a previous study consisting of cloned vectors derived from
metagenomics of microbial population isolated from the gut of Capra aegagrus hircus.
The vectors were sequenced and screened for genes using bioinformatics tools to
define Open reading frames (ORF). Initial sequence analysis led to characterize the
ORF as an uncharacterized novel bacterial cell-wall modifying enzyme. It carries 2
domains, a peptidoglycan binding domain and protease domain with cysteine protease
active site. We have successfully cloned, expressed and purified this gene/protein.
Autoproteolytic activity has been observed for the purified protein, which was inhibited
with protease inhibitors cocktail. Protein has also shown binding towards ampicillin,
which is characteristic of most of the bacterial cell-wall modifying enzymes. This
binding was further evaluated with fluorimetric analysis. Crystallization trial has been
performed for the purified protein and some initial crystals are obtained. In this study
we have successfully expressed, purified and performed a preliminary characterization
of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach. Currently, we are
screening for specific inhibitor for the protease and optimizing protease assays. The
protein crystal refinement experiments are also in progress. Our future aim includes
X-ray crystallographic structure solution of this novel protease with and without
inhibitors and defining its function. Solution of this novel protease may lead to some
novel bacterial cell wall synthesis mechanism.
96
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R62-Bowman-Birk Protease Inhibitor from Vigna unguiculata Seeds Enhances
the Action of Bradykinin Related Peptides
Alice da Cunha Morales Álvares, Luciano Paulino da Silva, Gustavo Pedrino, Elisabeth Schwartz, Sonia
Maria de Freitas.
[email protected]
The hydrolysis of bradykinin (Bk) by different classes of proteases in plasma and
tissues leads to a decrease in its half-life. Here, Bk actions on smooth muscle and in
vivo cardiovascular assays in association with a protease inhibitor, Black eyed-pea
trypsin and chymotrypsin inhibitor (BTCI) and also under the effect of trypsin and
chymotrypsin were evaluated. The structural features of BTCI and its inhibitory activity,
in the presence of Bk-related, were investigated by spectrophotometry, static
fluorescence spectroscopy methods and circular dichroism. The in vitro and in vivo
experiments of Bk-related peptides in the presence or absence of BTCI in vivo were
performed to assess smooth muscle contraction effects and cardiovascular responses
induced by intravenous administration, respectively. BTCI forms complexes with Bk
and analogues at pH 5.0, 7.4 and 9.0. Formation of BTCI-Bk complexes is probably
driven by hydrophobic forces, coupled with slight conformational changes in BTCI. In
vitro assays using guinea pig (Cavia porcellus) ileum showed that Bk retains the ability
to induce smooth muscle contraction in the presence of BTCI. Moreover, no alteration
in the inhibitory activity of BTCI in complex with Bk and analogous was observed.
When the BTCI and BTCI-Bk complexes were tested in vivo, a decrease of vascular
resistance and consequent hypotension and potentiating renal and aortic
vasodilatation induced by Bk and Bk2 infusions was observed. These results indicate
that BTCI-Bk complexes may be a reliable strategy to act as a carrier and protective
approach for Bk-related peptides against plasma serine proteases cleavage, leading
to an increase in their half-life. These findings also indicate that BTCI could remain
stable in some tissues to inhibit chymotrypsin or trypsin-like enzymes that cleave and
inactivate bradykinin in situ. Keywords: Black-eyed pea Trypsin and Chymotrypsin
Inhibitor, Bradykinin, Hypertension.
Supported by UnB, CNPq and CAPES.
97
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R63-Workflow para reconstrução in silico de redes metabólicas de fungos
Waldeyr Mendes Cordeiro da Silva; Maria Emília Machado Telles Walter
[email protected]
Bioinformática
O metabolismo pode ser classificado em primário e secundário. O metabolismo
secundário é abundante em fungos filamentosos que vivem no solo, por influência de
competição ambiental e são geralmente produzidos após um crescimento celular
ativo. Alguns metabólitos são encontrados em fungos relacionados, enquanto outros
são encontrados apenas em uma ou algumas espécies. A reconstrução de redes
metabólicas in silico permite identificar importantes interações bioquímicas, bem
como porporciona uma visão sistêmica dos processos metabólicos do organismo de
interesse. Foram desenvolvidas várias ferramentas e métodos para reconstrução in
silico de redes metabólicas em escala genômica. Os métodos disponíveis de
reconstrução in silico de redes metabólicas são semi-automatizados e a cura das vias
metabólicas preditas é realizada com trabalho manual, baseado na literatura e
experimentos laboratoriais. Objetivo: Propor um método automatizado para
reconstrução in silico de redes metabólicas, com ênfase no metabolismo secundário
de fungos. Estudaremos a expressão gênica de metabolismo secundário em fungos
e os métodos e ferramentas para sua predição, afim de integrá-las ao workflow.
Criaremos um Pathway Genome Database (PGBD) de reações e vias metabólicas de
fungos que inclua metabolismo secundário. Com o workflow definido, reconstruiremos
automaticamente as redes metabólicas dos organismos com base no PGDB criado.
Geraremos a vizualização das redes reconstruídas. Proveremos acesso web às redes
reconstruídas. Esperamos automatizar o processo de reconstrução de redes
metabólicas in silico com acurácia nas predições, tendo como base um PGDB
especializado em fungos, incluindo seu metabolismo secundário. Construiremos
interfaces para manipulação do workflow e para consulta às redes reconstruídas.
Esperamos ainda, tornar o processo colaborativo, para que o PGDB base possa ser
frequentemente atualizado.
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R64-Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por
tecnologia de phage display
Tainá Raiol Alencar, Christiane Nishibe, Andréa Q. Maranhão.
Dentre as tecnologias usadas na produção de anticorpos recombinantes, destaca-se
a expressão de peptídeos em fagos filamentosos (phage display). Tal método permite
produzir bibliotecas de imunoglobulinas específicas para um antígeno de interesse,
cujas sequências podem ser obtidas por sequenciamento de nova geração. No
entanto, a busca por sequências candidatas à produção em larga escala a partir de
dados NGS tem sido um desafio devido ao enorme volume de sequências geradas.
Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo desenvolver um pipeline
computacional para analisar a variabilidade e o enriquecimento de bibliotecas
produzidas por phage display bem como para selecionar in silico sequências
candidatas. O pipeline desenvolvido segue dois critérios de seleção: as sequências
devem ser enriquecidas no round 3 e reconhecidas como domínios variáveis
completos. Todos os scritps foram implementados em linguagem perl. Como estudos
de caso, estão em processo de análise dois conjuntos de dados, gerados pelas
plataformas 454 Roche e Illumina. Em uma análise preliminar dos dados de
sequenciamento 454 Roche, observou-se maior riqueza de sequências no round 0,
tanto para domínios VH quanto para VL. A partir das bibliotecas dos domínios
variáveis, foram selecionadas como sequências candidatas apenas uma sequência
VH e uma sequência VL. O trabalho desenvolvido até o momento permitiu identificar
pontos a serem aperfeiçoados nos scritps do pipeline, tais como o aumento da
sensibilidade do programa de cálculo de sequências únicas, a fim de produzir uma
estimativa mais confiável da riqueza das bibliotecas. No que diz respeito aos dados
Illumina, os quais possuem reads paired-end, será implementado um script de
montagem dos pares R1/R2 para obter uma sequência consenso que possua os
domínios variáveis VH e VL completos. Sendo assim, este trabalho demonstra ser de
grande relevãncia para o grupo de Imunologia Molecular, pois novos experimentos de
phage display poderão ser realizados visando testes biológicos, num conjunto mais
restrito de sequências de imunoglobulinas com expectativas de especificidade pelo
antígeno de interesse.
99
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R65-Papel de antioxidantes endógenos como parte do sistema adaptativo de
um anfíbio para sobrevivência nas secas da Caatinga
Daniel Carneiro Moreira, Marcelo Hermes Lima.
[email protected]
Laboratório De Radicais Livres
Pleurodema diplolistris é um anuro que estiva durante a seca na Caatinga e como
estratégia de sobrevivência enterra-se no solo a profundidades que podem chegar a
um metro. A fisiologia e ecologia da estivação de P. diplolistris é bem conhecida,
entretanto pouco se sabe sobre o papel do sistema de defesa antioxidante e proteínas
de choque térmico na estivação de P. diplolistris. Diferentemente de estudos nos
quais a depressão metabólica é induzida em laboratório este projeto analisará animais
em seus ambientes naturais e todas as variáveis associadas. Desta forma, pretendese entender os mecanismos de regulação de componentes citoprotetores durante a
depressão metabólica em condições naturais. Os objetivos gerais deste projeto são:
identificar ajustes do sistema antioxidante, avaliar o estado redox intracelular e
elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o sistema antioxidante é regulado
em diferentes órgãos do anuro P. diplolistris durante a depressão metabólica na
estivação. São objetivos específicos do projeto: (a) analisar e identificar diferenças
qualitativas e quantitativas dos perfis proteicos; (b) obter sequências parciais de
genes e determinar níveis de RNAm de proteínas do sistema antioxidantes ou
relacionadas a ele (catalase, Se-GPX, GST, GCL, PRXs, Mn-SOD e CuZn-SOD); (c)
determinar a atividade de enzimas antioxidantes e enzimas relacionadas ao sistema
antioxidante (catalase, G6PDH, GPX, Se-GPX, GR, GST, Mn-SOD e CuZn-SOD); (d)
determinar as concentrações dos antioxidantes não-enzimáticos ácido ascórbico,
ácido úrico e glutationa; (e) quantificar e localizar os fatores de transcrição Nrf-2 e
FoxOs; (f) quantificar heat shock proteins (Hsp10, Hsp40, Hsp70 e Hsp110); (g) medir
marcadores de dano oxidativo a diferentes biomoléculas (proteínas carboniladas,
TBARS,
hidroperóxidos
lipídicos,
4-hidroxinonenal
e
8-oxo-7,8-dihidrodesoxiguanosina); (h) relacionar condições ambientais e aspectos fisiológicos das
alterações do sistema antioxidante.
100
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R66-Procurando para um peptídeo sinal para expressar proteínas em diferentes
tipos de células de mamíferos
Carolina Veónica Attallah; Ricardo Kratje; Marina Etcheverrigaray; Marcos Oggero
Laboratorio De Cultivos Celulares. Facultad De Bioquímica Y Ciencias Biológicas. Universidad
Nacional Del Litoral. Ciudad Universitaria. Paraje Â€Œel Pozoâ€• S/N Cc. 242. Santa Fe. Argentina.
[email protected]
A maioria dos bioterapêuticos à base de glicoproteínas é produzida em linhagens
celulares de mamíferos, porque as modificações pós-traducionais devem ser
idênticas ou, pelo menos, semelhantes às obtidas em humanos. Embora as células
de ovário de hamster chinês (CHO) são as mais prevalentes para produzi-los, também
as células de rim embrionário humano (HEK)-293, e mieloma de camundongo (NS0)
estão a ser utilizadas como linhagens celulares de alta produtividade. Por outro lado,
os peptídeos sinal capazes de dirigir eficazmente a secreção de proteínas em
mamíferos, são elementos chave na produção de proteína recombinante. A fim de
estudar a eficácia de diferentes peptídeos sinal para dirigir a secreção da proteína
verde fluorescente (GFP) e uma proteína de fusão scFv-Fc, as linhagens celulares
CHOâ€‘K1, HEK293 e NS0 foram transfectadas de forma transiente e estável. Os
peptídeos sinal derivados da azurocidina humana (AZ), albumina humana (mSA), da
região V MOPC-63-III da cadeiakappa de uma Ig deCricetulus griseus (mIgkC) e da
região VG V-III da cadeiakappa de uma Ig humana (mIgkH), foram avaliados. A
eficácia dos peptídeos sinal foi medida por microscopia de fluorescência e citometria
de fluxo para a GFP, e a eficiência da secreção da proteína de fusão foi analisada por
ELISA indireto específico a partir do sobrenadante de cultura de cada linhagem
celular. Embora a secreção seja um gargalo na expressão da proteína, o peptídeo
sinal mSA é capaz de dirigir a proteína para a via de secreção em diferentes tipos de
células de mamíferos. Neste trabalho, nós designamos este peptídeo sinal como uma
boa sequência para a expressão de proteínas recombinantes, inclusive anticorpos
recombinantes, em diferentes linhagens de células de mamíferos, em ambas as
condições de transfecção transiente e estável.
101
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R67-Validação funcional de neuropeptídeos de Anthonomus grandis via
silenciamento gênico
Ana Gabriela Borges Leite, Roberta Ramos Coelho, José Dijair Antonino de Souza Junior
Alexandra Augusto Pereira Firmino, Maria Fátima Grossi de Sá.
[email protected]
O algodão é uma das principais commodities no Brasil e alvo de uma grande
variedade de insetos praga, que causam perdas significativas à produção. A principal
praga do algodão no Brasil é o Anthonomus grandis (bicudo-do-algodoeiro) e seu
principal método de controle inclui o uso de inseticidas, contribuindo para o aumento
nos custos de produção. Devido a esta demanda, a biotecnologia vem sendo aplicada
ao desenvolvimento de novas ferramentas de controle. Entre as diferentes
abordagens biotecnológicas, a técnica do silenciamento gênico por RNA interferente
vem sendo utilizada como potencial de ser aplicada ao controle desta praga. A atual
disponibilidade do banco de dados do transcritoma de A. grandis é uma fonte de
genes que podem ser validados por esta técnica. Neuropeptídeos são moléculas alvo
em potencial, já que atuam no sistema nervoso dos insetos e são importantes em
processos como metamorfose e metabolismo. Assim, o objetivo do estudo é realizar
a validação funcional de três neuropeptídeos, NP1, NP2 e NP3 no desenvolvimento
de A. grandis via RNA interferente. Os perfis de expressão dos neuropeptídeos
durante o desenvolvimento de A. grandis foram avaliados por RT-qPCR utilizando
cDNAs de ovo, larvas de 1°, 2° e 3° instares, pré-pupa, pupa e adultos machos e
fêmeas. Os fragmentos gênicos de aproximadamente 200pb de cada neuropeptídeo
foram clonados no vetor pCR2.1 TOPO TA em Escherichia coli cepa XL1-Blue para
NP1 e NP2. NP3 foi subclonado no vetor pDONR 221, utilizando a enzima BP clonase,
transferido por recombinação para o vetor pL4440gtwy e utilizada Escherichia
coli cepa OmniMAX2-T1R. As clonagens foram confirmadas através de digestão do
vetor e sequenciamento. O acúmulo de transcritos de NP1, NP2 e NP3 foi maior em
adultos. No momento, está em andamento o estudo do silenciamento destes
neuropeptídeos para validar sua importância no desenvolvimento deste inseto e a
possibilidade do uso para o desenvolvimento de novas ferramentas no controle desta
praga.
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R68-Caracterização dos principais mecanismos fisiopatológicos envolvidos
com a sintomatologia dos acidentes gerados pelo peixe Pimelodus maculatus
e avaliação da atividade proteolítica do extrato proteico de sua peçonha.
Beatriz Elena Sarmiento Certuche, Elisabeth F. Schwartz
[email protected]
Os acidentes gerados pelos animais aquáticos, marinhos e fluviais são muito comuns,
e a maioria deles ocorre de maneira incidental gerando processos dolorosos como
necroses, mutilações, perda de movimento e até mortalidade. A sintomatologia dos
acidentes gerados por peixes marinhos é amplamente conhecida; entretanto, os
estudos de caracterização dos acidentes provocados por peixes de água doce ainda
são poucos. Dentre os acidentes causados por animais aquáticos no Brasil, a maioria
dos casos são causados por bagres marinhos e de água doce.Pimelodus maculatus
é um peixe de água doce muito comum nas bacias brasileiras, responsável pela a
maioria dos acidentes com esses animais, principalmente entre os pescadores, e
cujas características e mecanismos patológicos do veneno são pouco conhecidos. No
presente estudo, foram caracterizados os principais mecanismos fisiopatológicos
associados com a manifestação clínica (dor, inflamação local e edema) dos acidentes
gerados pelo extrato proteico da peçonha do peixe P. maculatus. Os espécimes
usados neste trabalho foram coletados no alto curso do Rio Paraná, no município de
Três Lagoas, Mato Grosso do Sul, sob licença do Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade ICMBio no.34975-2. Os ferrões foram extraídos e
raspados, estimando-se que o extrato proteico bruto de um ferrão de P. maculatus
(EPBF) contém aproximadamente 100 µg de proteína, provavelmente a quantidade
de material proteico envolvido no envenenamento. Durante todas as fases do
experimento os procedimentos foram realizados de acordo com as normas do Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal, e autorizado pelo Comitê de ética em Uso
Animal da Universidade de Brasília sob licença no.(63468/2014). O EPBF gerou um
marcado efeito nociceptivo e edematogênico. As alterações na permeabilidade
vascular foram evidentes caracterizando assim o efeito inflamatório gerado pelo
EPBF. Além disso, o EPBF induziu uma ligeira diminuição na força de contração no
coração in situ em rã, não provocou hemorragia ou alterações nos tempos de
coagulação (tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada), mas induziu
alterações significativas nos níveis de CK e CK-MB em camundongos. A atividade
proteolítica gerada pelo EPBF foi observada sob caseína, elastina e colágeno,
evidenciando a presença de proteases no veneno que favorecem sua difusão no
tecido e, em decorrência favorecendo o envenenamento. Por tanto, neste estudo, se
apresenta a correlação entre os efeitos obtidos experimentalmente e os principais
sintomas observados nos acidentes com o peixe P. maculatus.
103
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R69-Detecção e Caracterização de Proteínas Parasporina em Isolados de
Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Câncer Humano
Elias Ferreira Sabiá Júnior; Érica Soares Martins; José Raimundo; Rose Gomes Monnerat.
[email protected]
Laboratório De Bactérias Entomopatogênicas (Embrapa Cenargen)
A bactéria Gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt) é amplamente conhecida devido
a sua grande importãncia no controle biológico, graças a sua capacidade de produzir
inclusões cristalinas formadas por proteínas inseticidas (Cry e Cyt), ativas contra
algumas espécies de insetos. Recentemente, uma nova atividade, a citotoxicidade
contra células cancerosas humanas foi relatada para cristais sem atividade inseticida.
Essas proteínas citotóxicas, chamadas de Parasporinas, não são hemolíticas e são
estruturalmente diferentes das proteínas Cry e Cyt. Esse trabalho teve como
objetivo identificar genes da família de parasporina através de diferentes marcadores
moleculares, analisar o perfil proteico dessas estirpes e avaliar sua toxicidade para
linhagens de células tumorais.
Foram desenhados iniciadores específicos para
identificação dos genes dos grupos de Parasporina a partir de dados depositados no
GenBank. O perfil proteico foi analisado através de SDS-PAGE, e a toxicidade das
proteínas foram analisadas através de ensaio de MTT.
270 estirpes foram
selecionadas aleatoriamente do banco de bactérias entomopatogênicas da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia. 36 estirpes apresentaram padrões de
amplificação para os genes deparasporina 1 e 3. O perfil proteico sugere que as
proteínas secretadas por algumas estirpes possuíam o tamanho esperado para o
grupo de Parasporina (aproximadamente 81 e 88 kDA). As proteínas das estirpes
testadas não mostraram toxicidade contra as linhagens tumorais DU-145 e HeLa.
Proteínas de duas estirpes mostraram toxicidade a células tumorais de mama MCF7.
Tanto as provas bioquímicas quanto moleculares mostraram a presença de
estirpes de Bt que possuem e expressam o gene deparasporina, o qual se mostraram
tóxicos para linhagens específicas de cãncer. A próxima etapa do trabalho inclui o
sequenciamento do gene das proteínas Parasporina, a purificação, avaliação do tipo
de morte celular induzido por essas toxinas e a possível utilização como marcador
tumoral.
104
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R70-Desenvolvimento de Bioprocesso para a Produção de Álcoois por
Linhagem de Clostridium acetobutylicum Modificada Geneticamente
Myrna Barbosa Gomes, Luiz André Felizardo Schlittler, Fernando Araripe.
[email protected]
Biotecnologia De Levedura
A produção de energia usando recursos naturais renováveis é uma das mais urgentes
tarefas de nosso tempo. Fontes limitadas de combustíveis fósseis, instabilidade no
preço do petróleo e a necessidade de reduzir as emissões de dióxido de carbono na
atmosfera estimulam a necessidade de se explorar novas tecnologias na produção
de combustíveis líquidos usando matéria-prima renovável. Entre os biocombustíveis
produzidos atualmente o butanol (1-butanol, n-butanol), desperta particular interesse,
devido a características energéticas que o tornam um combustível promissor para
motores de combustão. Entretanto, a engenharia metabólica em Clostridium
acetobutylicum para a produção de butanol é particularmente difícil de ser realizada
uma vez que as vias fermentativas são bastante ramificadas e não há conhecimento
detalhado dos seus circuitos regulatórios. O objetivo desse trabalho é desenvolver um
bioprocesso envolvendo modificações genéticas em cepas deC. acetobutylicum para
o aumento da produção industrial de álcoois a partir de sacarose. Escherichia coli K12
foram transformadas com o plasmídeo contendo o gene da metiltransferase. O DNA
metilado foi testado por digestão com Fnu4HI (isoesquisômero de Cac184). AsE. coli
foram testadas quanto à metilação no DNA exógeno e os resultados indicaram que a
cepa mutante é capaz de metilar qualquer material genético. A otimização da
produção de álcoois a partir do caldo de cana será realizada através de modificações
genéticas, de deleção dos genesbuk epta e inserção do genesadh, que resultarão na
alteração das características fisiológicas do micro-organismo, influenciando
significativamente a concentração final dos produtos de interesse. Entre os resultados
esperados estão: o aumento da produção de butanol e etanol, aumento da tolerãncia
aos álcoois pelos clostrídios modificados e a otimização do bioprocesso de produção.
As perspectivas são seleção de linhagem deC. acetobutylicum com maior tolerãncia
a butanol; deleção do gene de interesse da linhagem resultante; construção de vetor
para expressão do gene transformação deC. acetobutylicum; seleção de clones
produtores de álcoois; avaliar a produção de álcoois em escala laboratorial em meio
contendo sacarose.
105
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R71-Desenvolvimento
de
uma
linhagem
industrial
de
Saccharomyces
cerevisiae para fermentação de amido
Daniel Pereira de Paiva, Lidia Maria Pepe de Moraes.
[email protected]
Biotecnologia De Leveduras
O amido é o carboidrato com maior abundância de biomassa depois da celulose e é
a principal forma de armazenamento energético em plantas vasculares, sendo
encontrado em sementes de cereais como cevada, trigo, milho e arroz, e em
tubérculos e raízes como batata, batata-doce, mandioca e sorgo sacarino. A levedura
Saccharomyces cerevisiae, tradicionalmente utilizada para produção de etanol em
escala industrial, é incapaz de metabolizar amido. O desenvolvimento de uma
levedura recombinante capaz de coproduzir glicoamilase e α-amilase, tornando-a
capaz de hidrolisar o amido e utilizar o açúcar obtido para produção de etanol em
apenas uma etapa, tornaria este processo mais economicamente viável. Com a
perspectiva de aplicação comercial da linhagem JP1 amilolítica, modificações
genéticas são necessárias para atender questões de biossegurança exigidas pela
CTNBio. Para isso, o gene STE5, cujo produto pertence à via de sinalização do
ferôrmonio e é essencial para o funcionamento desta, foi deletado; e o gene IME1,
cujo produto é o principal indutor de meiose em leveduras ativando a transcrição dos
genes meióticos iniciais, também será deletado. As linhagens industriais são
geneticamente e fisiologicamente mais adaptadas ao processo estressante de
fermentação, tendendo a dominar o processo. Ademais, é sabido que alguns
promotores de linhagens de laboratório não funcionam da mesma maneira em
linhagens industriais. Para determinar quais promotores serão utilizados para
produção das enzimas, foram construídos 16 plasmídeos usando eGFP como gene
reporter sob controle de oito diferentes promotores amplificados de linhagens
laboratorial (S288c) e industrial (JPU, linhagem JP1 auxotrófica). A força dos
promotores foi comparada em duas linhagens (CEN.PK2 e JPU). Resultados
preliminares demonstraram que os promotores TEF1, HXT7, PGI1 e ADH1 de
diferentes origens possuem diferença significativa quando expressos em JPU.
Portanto selecionamos o promotor PGK1 por não apresentar diferença significativa e
por estar no cassete contendo a glicoamilase; e o cassete ADH1 oriundo de JPU para
construção do cassete contendo a α-amilase por já ter sido demonstrado em trabalhos
anteriores que essa é a combinação mais apropriadas para os genes das enzimas
que serão utilizadas.
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R72-Análise comparativa do genoma e caracterização do gene DNA photolyase
de isolados de Pseudoplusia includens SNPV
Saluana Rocha Craveiro, Zilda Maria Araújo Ribeiro, Peter Ward Inglis, Roberto Goti Togawa, Priscila
Grynberg, Fernando Lucas Melo, Bergmann Morais Ribeiro, Maria Elita Batista de Castro.
[email protected]
Lab. Virologia De Inseto - Embrapa Cenargen
A família Baculoviridae compreende um grupo de vírus artrópodes específico com
DNA fita-dupla circular. A família Baculoviridae é formada pelos gêneros
Alphabaculovirus (NPVs específicos de lepidópteros), Betabaculovirus (GVs
específicos de lepidópteros), Gammabaculovirus (NPVs específicos de
himenópteros) e Deltabaculovirus (NPVs específicos de dípteros). Os
Alphabaculoviruses estão divididos nos Grupos I e II, com base nas suas proteínas
de fusão do envelope viral, proteína F e GP64, respectivamente. A função do gene
p26 não está bem definida, mas acredita-se que a proteína P26 é necessária para a
ótima oclusão dos vírions no poliedro. O gene p26 foi identificado no genoma dos
NPVs até o momento sequenciados e foi utilizada ferramentas de bioinformática a fim
de caracterizar a proteína P26 e elucidar a evolução deste gene na família
Baculoviridae. As cópias do gene p26 encontradas nos baculovírus estão
conservadas na posição adjacente ao gene p10 (P1) em todos os NPVs contendo
uma única cópia, adjacente ao gene iap-2 (P2) em todos os NPVs do Grupo II
contendo a segunda cópia do gene p26 e adjacente ao os genes ptp1 e ptp2 (P3) nos
NPVs do Grupo I com a segunda cópia do gene p26. A árvore filogenética Bayesiana
obtida a partir das cópias da protéina P26 encontradas no genoma dos NPVs mostrou
quatro clados claramente definidas (IA, IB, IIA e IIB) suportando a hipótese da
ocorrência de três eventos independentes de captura do gene p26 pelos baculovírus.
A presença de sítios de clivagem dos peptídeos sinal nas sequências de aminoácidos
da proteína P26 foi analisada e apenas no clado IB foi observada a presença de
peptídeo sinal. Embora a função da proteína P26 não é bem conhecida, o peptídeo
sinal pode provocar diferenças na atividade das proteínas do clado IB indicando sua
possível função distinta das de outras classes de proteínas P26. No entanto, novos
estudos são necessários para uma melhor compreensão da função dessa proteína
nos baculovírus.
107
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R73-Genome sequencing and comparative analysis of the biocontrol agent
Trichoderma harzianum
Andrei Stecca Steindorff, Igor Grigoriev, Eliane Ferreira Noronha.
[email protected]
Biological control is a complex process which requires many processes. The species
f T. harzianum are well known for their biocontrol activity against many plant
pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism used by T. harzianum,
we sequenced the isolate TR274 genome using a combination of 2x100bp and
2x250bp Illumina reads. The assembly was performed using AllPaths-LG with a
maximum coverage of 100x. The assembly generates 2282 contigs with a N50 of
37033. The genome size generated was 40.8 Mb and the GC content was 47.7%, an
expected value when compared with other Trichoderma genomes. The mitochondrial
genome was assembled and generate a contig with 27.7 Kb. The genome annotation
pipeline, using a combination of ab initio and homology methods, modeled 13932
genes (74.6% spliced genes) with a high transcriptome support. To check the genome
reliability, CEGMA analysis was performed showing a 100% coverage. The
phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes
sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma (T. asperellum and T. atroviride),
Longibrachiatum (T. reesei and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum
and T. virens) section division described previously. The comparison between two
Trichoderma harzianum species suggests a high genome similarity, in contrast with
the harzianum complex concept. The secondary metabolites and glycoside hydrolases
contraction and expansion were analysed. The Pachybasium section expanded its
secondary metabolites arsenal compared with the other sections. Glycosyde
hydrolases also expanded in Pachybasium section, as well as the Pectate lyases and
Carbohydrate esterases categories. These results suggests that these proteins
families has an important role on mycoparasitism and plant interaction. Future analysis
will improve the understanding of this complex genus and give some insights about its
lifestyle and the interactions with the environment.
108
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R75-Uso do gene amdS (acetamidase) como uma marca de seleção dominante
e reciclável em Pichia pastoris
Luíza Cesca Piva, Viviane Castelo Branco Reis, Fernando Araripe Gonçalves Torres.
[email protected]
A levedra Pichia pastoris foi estabelecida como sistema de produção de proteínas
heterólogas graças a vantagens como: altas densidades celulares, padrão de
glicosilação semelhante ao de mamíferos e secreção eficiente de proteínas. Para que
diversas modificações sejam introduzidas na levedura, faz-se necessário o uso de
múltiplas marcas de seleção ou de estratégias que permitam a sua reutilização. O
gene amdS de Aspergillus nidulans permite a seleção de leveduras em meio de
cultura contendo acetamida como única fonte de nitrogênio e a contra-seleção em
meio contendo a droga fluoroacetamida. Neste trabalho, o uso da marca amdS será
testado em P. pastoris e, como prova de conceito, serão feitas deleções sequenciais
dos genes ADE2 e URA5, reciclando a marca com o sistema Cre-lox de recombinação
sítio-específica.
A análise do genoma de Pichia pastoris revelou a presença do
gene de uma proteína hipotética da família das amidases. A expressão desse gene
em meio complexo foi demonstrada por experimentos de RT-PCR. Para evitar sua
interferência na seleção baseada no crescimento em acetamida, foi criada a linhagem
LA1 na qual o gene hipotético foi interrompido com a marca de seleçãoSh ble
(resistência à droga zeocina). Paralelamente, a partir do vetor comercial pPIC9
(Invitrogen) foi construído o vetor pPIC9amdS contendo o gene amdS e um gene
repórter (GFP). Tanto a linhagem LA1 quanto X33 foram transformadas com o vetor
pPIC9amdS sendo que a primeira forneceu 100% de clones positivos e a segunda
26% de falsos positivos. Em seguida, o gene ADE2 foi deletado da linhagem LA1,
utilizando um cassete com a marca amdS flanqueada por sequências loxP. A excisão
tanto da marca Sh ble quanto da marca amdS foi feita utilizando um plasmídeo
replicativo contendo a recombinase CreA. A excisão será feita também utilizando a
contra-seleção com fluoroacetamida para selecionar células que excisaram a marca
por recombinação. A seguir será feita a deleção do gene URA5 utilizando a mesma
estratégia. A integração do vetor contendo o geneamdS mostrou que esta nova
marca de seleção é aplicável em P. pastoris, especialmente na linhagem LA1. Essa
nova ferramenta traz alternativas na manipulação genética da levedura, reduzindo
problemas como a expressão de diversos marcadores dominantes.
109
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R76-Detecção de genes de enterotoxinas STX-1 e STX-2 em Escherichia coli
pertencentes ao banco de germoplasma do Laboratório de Microbiologia
Médico Veterinária da Universidade de Brasília
Yara Cavalcante Vieira, Simone Perecmanis, Ana Paula Paiva de Faria, Simone Perecmanis.
[email protected]
Laboratório De Microbiologia Médico Veterinária
Escherichia coli é um importante patógeno para animais sendo que as colibaciloses
suínas são ocasionadas principalmente por cepas enterotoxigênicas e representam
as principais causas de mortes em plantéis suinícolas, englobando doenças como a
colibacilose neonatal, a colibacilose da terceira semana, a diarréia pós-desmame e a
doença do edema. As Verotoxinas ou Toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2) são produzidas
por E. coli Enterohemorrágicas (EHEC) que causam a doença conhecida como colite
hemorrágica, com quadro severo de diarreia sanguinolenta. Neste trabalho foram
estudadas 127 cepas de Escherichia coli pertencentes ao Banco de Germoplasma do
Laboratório de Microbiologia Médica Veterinária da Universidade de Brasília e
isoladas de suínos hígidos escolhidos aleatoriamente em rebanhos do Distrito
Federal, com o objetivo de detectar a presença dos genes codificadores das
enterotoxinas Stx-1 e Stx-2 através da técnica de PCR. Do total de amostras
analisadas, duas (1,6%) apresentaram-se positivas para Stx-2 e nenhuma positiva
para Stx-1, podendo-se verificar a presença de genes codificadores da enterotoxina
Stx-2 em suínos sem sinais clínicos de diarreia, o que demonstra um risco para o
desenvolvimento de doença entérica e consequente disseminação pelo plantel além
de representar riscos ao consumidor humano.
110
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R77-Análise da diversidade de Archaea em solos de Cerrado sensu stricto
submetidos ou não a queimadas bienais
Aline Belmok de Araújo Dias, Thiago Rodrigues De Oliveira, Heloísa Sinatora Miranda, Ricardo
Henrique Krüger, Cynthia Maria Kyaw.
[email protected]
Embora a proposta de classificação dos seres vivos em três Domínios tenha ocorrido
há quase 25 anos, ainda são escassos os estudos sobre Archaea nos diferentes
ambientes naturais do Brasil. O Cerrado é um extenso e importante bioma de nosso
país. No entanto, existem poucos trabalhos que descrevem a diversidade e filogenia
do domínio Archaea nos solos das diferentes fitofisionomias deste bioma. Além disso,
queimadas são eventos ecológicos naturais do Cerrado e não existem estudos sobre
o seu efeito na população de archaeas de solos deste ambiente. Este trabalho tem
como objetivo avaliar e comparar a diversidade de Archaea em solos de cerrado
sensu stricto que não sofrem queimada há aproximadamente 30 anos e solos que
são queimados em regime bienal. Também foram feitas análises para a detecção do
gene que codifica a subunidade A da enzima amônia monooxigenase de Archaea
(amoA), de maneira a avaliar a ocorrência de archaeas oxidantes de amônia nas
condições estudadas, tendo em vista sua importãncia no ciclo biogeoquímico do
nitrogênio.Amostras de solo coletadas na Reserva Ecológica do IBGE foram
submetidas à extração de DNA total, que foi utilizado em ensaios de PCR com
iniciadores específicos para os genes do rRNA 16s e amoA do domínio Archaea. Os
fragmentos amplificados foram clonados e transformados em Escherichia coli. O DNA
plasmidial dos clones recombinantes foi extraído e submetido ao sequenciamento
automático. Foram obtidas oito bibliotecas genômicas para os genes do rRNA 16s e
amoA de Archaea, com 288 e 187 sequências respectivamente. As análises do 16s
mostraram que a grande maioria das sequências pertence ao filo Thaumarcheota e
estão distribuídas entre os grupos I.1b e I.1c deste filo. Apesar da semelhança
encontrada na riqueza de archaeas nos solos em ambas condições, as amostras de
solo queimado bienalmente apresentaram maior abundância de thaumarchaeotas do
grupo I.1b. Pode-se detectar a presença do gene amoA em ambas as condições,
sugerindo a ocorrência da oxidação de amônia tanto em solos queimados
bienalmente quanto no controle. Esses resultados fornecem informações acerca da
diversidade de Archaea em solos de cerradosensu stricto e a detecção de genes
amoA nas amostras indica a provável ocorrência da oxidação de amônia nesses
solos, ressaltando a importãncia das archaeas na ciclagem do nitrogênio em solos.
111
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R78-Desenvolvimento e validação de métodos inovadores para a garantia da
qualidade do biodiesel e de suas misturas ao diesel
Paula Marcela Duque Jaramillo; Léia Fávaro.
[email protected]
Embrapa Agroenergia
Depois da autorização de sua comercialização no país, o biodiesel assume importante
papel na matriz energética nacional, chegando ao final de 2012 com produção anual
de 2.717.483 m3. No entanto, para garantia de sucesso do programa que o instituiu
é fundamental conhecer os problemas técnicos da introdução desse combustível para
que sejam propostas medidas que possam mitigar ou amenizar tais problemas.
Atualmente, o monitoramento da qualidade do biodiesel é feito apenas na usina e nos
postos de combustíveis, quando em mistura com o diesel. Nesse contexto, esse
projeto propõe o desenvolvimento de metodologias inovadoras, com abordagem
química e microbiológica, a partir do monitoramento do combustível em sua cadeia
produtiva. O monitoramento químico será realizado segundo as Resoluções da ANP
e com análises químicas complementares, ou seja, serão desenvolvidas
metodologias com o objetivo de identificar produtos de degradação, contaminantes e
adulterantes do combustível e detectar o estabelecimento de processos corrosivos na
estocagem de interesse das cadeias de produção e comercialização do biodiesel. O
monitoramento microbiológico será realizado por técnicas convencionais baseadas
em cultivo microbiano e, adicionalmente, também por técnicas independentes de
cultivo, tais como sequenciamento de genes ribossômicos e abordagem
metatranscriptômica. Com a comparação de resultados utilizando técnicas
tradicionais e avançadas será possível caracterizar qualitativa e quantitativamente a
população microbiana, além de conhecer a atividade desses micro-organismos no
processo de degradação deste combustível. Conhecendo a população microbiana e
relacionando sua presença ou atividade fisiológica com os produtos de degradação
do biodiesel, serão propostos e validados aditivos multifuncionais que possam inibir
os processos degradativos. Esses aditivos podem vir a ser utilizados por usinas e
distribuidoras de combustíveis, após regulamentação da Agência Nacional de
Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis.
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R79-Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do
influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
Christiane Ribeiro Janner; Viviane Castelo Branco Reis; Sônia Maria De Freitas; Fernando Araripe
Torres.
[email protected]
Sensores fluorescentes têm sido utilizados para o monitoramento de íons e
moléculas, permitindo a resolução temporal e espacial in vivo assim como sua
quantificação. Nanosensores que possuem propriedades de FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer) permitem que mudanças conformacionais em uma
molécula sejam detectadas por fluorimetria.
Dentre os açúcares que poderiam ser
detectados por nanosensores destaca-se a xilose, principal constituinte da
hemicelulose e que não é naturalmente fermentada por Saccharomyces cerevisiae.
Todavia, para tornar o etanol lignocelulósico viável, é necessária a cofermentação de
glicose e xilose. Para tanto, várias modificações genéticas são necessárias, como a
expressão de transportadores de xilose. O objetivo deste trabalho é a construção e a
caracterização de um nanosensor de xilose para avaliar a eficiência de
transportadores deste açúcar em S. cerevisiae.
Primeiramente, foi desenhado
um gene sintético que codifica para o nanosensor. Este é constituído por um domínio
de ligação à xilose flanqueado por dois fluoróforos variantes da GFP (Green
Fluorescent Protein). Uma versão do nanosensor com uma deleção parcial do
domínio de ligação à xilose foi construída por meio de PCR. Os dois genes foram
clonados e expressos com sucesso em Escherichia coli Rosetta. As proteínas foram
purificadas a partir da fração solúvel por meio de cromatografia de afinidade em
coluna de níquel. Seguiram-se ensaios de fluorimetria para verificar a ocorrência do
FRET e a determinação da constante de dissociação (Kd). Também foram realizados
ensaios em diversas temperaturas (25 C a 40 C) para a definição dos parãmetros
termodinãmicos da interação do nanosensor com a xilose. Os
ensaios
demonstraram a ocorrência do FRET para o nanosensor intacto, mas não para o
truncado, sendo necessários mais estudos estruturais para este. Para o nanosensor
intacto, a Kd foi determinada entre 0,031 µM (25 C) e 0,022 µM (40 C). Os parãmetros
termodinãmicos da interação foram: H = 4,118 kcal/mol; deltaS = 20,696 cal/molK;
deltaG = -2,050 kcal/mol; determinando a interação como espontãnea.
Ainda
serão realizados ensaios com outros açúcares para verificar a afinidade do
nanosensor somente por xilose. Além disso, o nanosensor será expresso em S.
cerevisiae para analisar o influxo de xilose in vivo.
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R80- Caracterização do resistoma do solo de Cerrado strictu sensu e potencial
biotecnológico na biorremediação de amostras ambientais contaminadas com
resíduos aromáticos
Débora Farage Knupp dos Santos; Eliane F. Noronha; Georgios J. Pappas; Betania F. Quirino; Paula
Istan; Ricardo Henrique Kruger.
[email protected]
Enzimologia
O estudo da resistência antimicrobiana vem priorizando cepas patogênicas clínicas.
Assim, a diversidade ambiental dos genes de resistência é subestimada, apesar do
conhecimento de que, no meio ambiente, microrganismos ainda não cultiváveis são
maioria. Atualmente a metagenômica vem ao encontro desta necessidade. Na
triagem de 2 bibliotecas metagenômicas de solo de Cerrado stricto sensu, isolou-se
62 clones resistentes dos quais 4 apresentam ORF com funções não relacionadas
à resistência antimicrobiana clássica destacam-se as dioxigenases (DO). Então,
propõe-se testar a ação simultãnea destas enzimas na resistência antimicrobiana e
na degradação de aromáticos. O subclone CRB2(1) foi construído em pET24a, cuja
indução foi otimizada com IPTG e lactose. A proteína foi purificada utilizandobeads
magnéticos com Ni2+. Realizou-se ensaios fenotípicos para testar a resistência e
viabilidade celular em carbenicilina e fenol e ensaios enzimáticos com a enzima
purificada para classificá-la na família de DO. Ainda, realizou-se análises de
bioinformática como a predição de estrutura secundária para identificação do domínio
conservado, alinhamento com enzimas caracterizadas para construção de árvores
filogenéticas e identificação de sítios de ligação ao metal. Os ensaios fenotípicos
provam a dupla função na resistência antimicrobiana e ao fenol. Análises de
sequência indicam presença de domínio bicupina, confirmado pela predição de
estrutura secundária. Tais domínios estão presentes em diversas famílias
enzimáticas, incluindo as DO. Nesta família, todas as gentisato 1,2-dioxigenases
(GDO) são bicupinas. Os alinhamentos com outras GDO mostram os sítios de ligação
ao metal, comum às extradiol-dioxigenases. Essas evidências estimularam a
caracterização de CRB2(1) como uma DO especificamente uma GDO. O ensaio
enzimático com o substrato ácido gentísico revelou atividade pela quebra à
maleilpiruvato, quantificada pela absorbãncia a 330nm. Constatou-se que CRB2(1) é
uma dioxigenase, a primeira DO metagenômica a ter atividade confirmada. Os
próximos passos incluem acessar atividade em outros aromáticos, elucidar o
mecanismo das resistências observadas e caracterizar a enzima quanto à
temperatura e pH ótimos, reação a solventes e metais.
114
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R81-Estratégias para Integração Múltipla de Vetores no Genoma de Pichia
pastoris
Maritza Ocampo Betancur; Viviane Castelo Branco Reis; Fernando Araripe
[email protected]
Uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de P. pastoris como
sistema de expressão envolve o aumento dos níveis de transcrição do gene
heterólogo, o que pode ser obtido aumentando-se o número de cópias do mesmo. O
uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de
integrantes multicópia. Estas marcas consistem em genes com o promotor truncado
o que diminui a taxa de transcrição e somente transformantes contendo alto número
de cópias do vetor podem recuperar a prototrofia em meio seletivo. Ainda, para
aplicações industriais, é importante que o cassete de expressão seja mitoticamente
estável o que pode ser obtido por integração cromossômica do vetor de expressão.
Contudo, como em Pichia a integração se dá por recombinação homóloga, é
necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de
integração múltipla. O foco deste projeto é identificar e comparar sítios repetitivos
para integração no genoma em combinação com o uso da marca auxotrófica defectiva
leu2-d, para aumentar os níveis de expressão de proteínas heterólogas em P.
pastoris. Como alvos para integração múltipla serão avaliados os seguintes loci:
PGK1, 28 S rDNA, 5S rDNA e regiões repetitivas dos cromossomos.
O
alelo
leu2-d foi obtido por PCR a partir do genoma de S. cerevisiae e foi clonado no vetor
pPICK2. O gene repórter GFP foi clonado em seguida sob o controle do promotor
PGK e P. pastoris M12 (Leu2-) foi transformada com o vetor resultante. Este vetor
servirá como plataforma para clonar as diversas sequências repetitivas. Clones
transformantes serão avaliados com relação à produção intracelular de GFP por
citometria de fluxo para identificar clones que hiperexpressam o gene. O número de
cópias integradas será avaliado por PCR em tempo real. Para validar a estratégia
selecionada, será testada a expressão de um biofármaco, o fator de crescimento
epidermal humano (hEGF). Para produzir hEGF intacto é preciso deletar o gene KEX1
na levedura. A deleção na linhagem M12 foi feita usando um cassete de deleção
contendo sequências 5´e 3´ do locus KEX1 flanqueando a marcable (resistência a
zeocina) e contendo sítios loxP para remoção posterior da marca. Após
transformação e identificação de clones kex1 por PCR a marcable foi eliminada
usando-se a recombinase CreA.
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R82-Estratégias de engenharia de leveduras para super produção de L-ácido
lático
Pollyne Borborema Alves de Almeida; Virgilio Hipólito Lemos De Melo; Nadielle Thamires Moreira
Castro; Jéssica Carvalho Bergmann; Lucas Silva Carvalho; Beatriz Simas Magalhães; Nadia Skorupa
Parachin.
[email protected]
Recentemente, a procura por materiais plásticos tem crescido exponencialmente. No
entanto a maior parte dos plásticos produzidos nos dias atuais são originados de
fontes petroquímicas, ou seja, não reciclável. Gerando acúmulo no meio ambiente de
140 milhões de toneladas por ano com expectativa de degradação estimada de um
milhão de anos (1). Biomateriais são produtos naturais sintetizados e catabolizados
por diferentes organismos e que têm encontrado amplas aplicações biotecnológicas.
Os bioplásticos, também conhecidos como plástico-verde, são um tipo especial de
biomaterial feito de matéria-prima de fontes renováveis, como biomassa de milho e
cana-de-açúcar (2), além de serem biodegradáveis, facilitando a reciclagem. L-lactato
(2-hidróxi – ácido - propiônico) é amplamente utilizado em alimentos, produtos
químicos, cosméticos e indústrias farmacêuticas. Além disso, é o monômero do Poli
– ácido lático (PLA), um bioplástico com amplas aplicações que vão desde
embalagens de fibras a espumas (4).Atualmente, a produção de ácido lático é feita
principalmente a partir de amido (6). No entanto, com o aumento da produção de
biodiesel existe uma superprodução de glicerol, principal resíduo produzido durante a
conversão do óleo vegetal em biodiesel. Sendo, o uso de glicerol considerado
vantajoso por agregar valor à cadeia produtora deste biocombustível (7). Diferentes
microrganismos foram geneticamente modificados para produzir ácido lático, mas na
maioria dos casos, o açúcar é utilizado como substrato. Pichia pastoris, uma levedura
metilotrófica, pode atingir uma elevada densidade celular usando glicerol bruto como
fonte de carbono, sobreviver em níveis de pH baixo, embora não seja capaz de
produzir ácido láctico. A engenharia genética pode tornar possível esta produção, a
partir de super-expressão do gene que codifica a enzima Lactato desidrogenase
(LDH) capaz de catalisar a conversão de piruvato em lactato. Neste estudo, pelo
menos quatro genes diferentes que codificam para LDH serão testados para a
produção de ácido L-lático em P. pastoris, de modo a permitir um rendimento elevado
e produtividade de ácido lático a partir de glicerol bruto. Após obtenção das cepas
modificadas geneticamente, serão realizadas fermentações em batelada para
determinar quais as cepas recombinantes resultam em maior rendimento e
produtividade do ácido L-lático.
116
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R83- Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para Tospovírus
baseado em replicação de RNAs defectivos-interferentes (DIs)
André Gustavo Machado Bertran, Anelise Orílio; Massimo Turina; Marina Ciuffo; Ricardo Lenzi; Filipe
Leite, Renato De Oliveira Resende.
Embora sejam vírus relatados desde o fim do século XIX e de causarem doenças de
grande severidade em diversas variedades de plantas cultivadas em larga escala para
fins alimentícios ou ornamentais, não existe ainda para os Tospovirus um clone
infeccioso. Neste trabalho, a partir de moléculas sintéticas idênticas aos RNAs
defectivos interferentes mais prevalentes e persistentes de Tomato spotted wilt virus
(TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) foram produzidos cassetes de expressão
contendo ribozimas ativas in cis no 5' e 3' das moléculas para transcrição in vitro e
transfecção mediada por agrobactéria. Foram produzidas também versões
modificadas dos DI RNAs contendo GFP fusionado ao interno da fase de leitura aberta
(ORF) de modo a manter a fase (in frame) e alterando-a (disrupted frame). A
expressão mediada por agrobactérias foi testada em diferentes ordens (2 e 4 dias pré
e pós tratamento em relação a um tospovírus auxiliar) e com ou sem coinfiltração de
supressores de RNAi (p19 e NSs). Foi possível detectar a expressão do transcrito dos
DIs mas não a sua replicação pelo vírus auxiliar. Para os transcritos in vitro foi possível
realizar detecção por meio de RT-qPCR de RNA dos DIs após 4 dias de inoculação,
um tempo muito longo para um RNA sem CAP 5' e poli-A permanecer em uma folha
sem estar sendo replicado ou ao menos protegido contra degradação pelo
nucleocapsídeo viral. No momento, as construções contendo GFP estão em fase de
conclusão para continuidade dos experimentos incluindo o sistema de culturas
vegetais em protoplastos. Foram realizados também ensaios de indução de
reassortment por meio de forte pressão seletiva para a manutenção de isolado
recombinado partindo de um isolado mutante de TSWV que produz uma proteína NSs
não-funcional e transcritos in vitro de S RNA tipo-selvagem provenientes de outro
isolado de TSWV (BR20).
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R84- Sw-5 gene cluster: understanding tomato resistance and susceptibility to
Tomato spotted wilt virus
Athos Silva de Oliveira, Richard Kormelink, Renato De Oliveira Resende
[email protected]
Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the runner-up of most economically/scientifically
important plant virus since it causes significant losses on vegetable production. Up to
now there are only two natural resistance sources against TSWV. One of them is the
Sw-5b gene, a paralog of the Sw-5 gene cluster which was firstly reported in Solanum
peruvianum and has been introgressed in many commercial cultivars of tomato
(Solanum lycopersicon). The Sw-5 gene cluster codify putative Resistance (R)
proteins, cellular receptors able to identify directly or indirectly the Avirulence (Avr)
determinants from pathogens. In this study, we show that the cell-to-cell movement
protein of TSWV (NSm) is the Avr of the Sw-5b-mediated resistance. In addition, high
accumulation of Sw-5b upon its co-expression with RNA silencing suppressors (RSS)
leads to auto-immunity in Nicotiana benthamiana. These two observations allowed us
to analyze the Sw-5 homologs from resistant and susceptible tomatoes for Avr
recognition and HR activation as uncoupled events. Truncated versions of the Sw-5
homologs were also analyzed, indicating the role of each main domain in such events.
Finally, a single mutation has been found to be associated with loss-of-function in a
Sw-5 homolog from susceptible tomato.
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R85- Produção, purificação e caracterização de xilanases de Aspergillus
foetidus e sua aplicação no aproveitamento de resíduos agroindustriais
Bárbara Calheiros Neumann, Edivaldo Ximenes
[email protected]
A conversão de biomassa em etanol tem um grande potencial econômico a baixos
custos, e consiste na desconstrução da lignocelulose, que pode ser realizada através
de hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática da xilana, presente na parede celular
da planta, é feita por um arsenal de enzimas cujo o principal componente é a xilanase.
Os objetivos desse trabalho são: determinar a atividade de xilanase de Aspergillus
foetidus crescido em meio líquido e sob agitação e na presença de bagaço de canade-açúcar (SCB) como fonte de carbono, purificação e caracterização físico-química
e bioquímica dessa enzima. O fungo foi cultivado em frascos Erlenmeyer contendo
meio de cultura líquido e SCB a 1%, em pH 7,0, durante 7 dias a 28°C sob agitação
de 120 rpm. O Extrato Bruto obtido foi ultra-filtrado com membranas de 30 e 10 kDa.
A determinação da atividade de xilanase (expressa em UI/mL) foi realizada depois de
cada etapa pela adição de 10μl de solução enzimática e 20μl de solução 1% (p/v) de
xilana; a reação foi conduzida a 50ºC, durante 30 min e interrompida pela adição de
60μl de ácido dinitrosalicílico (4, 16) à temperatura de 97ºC durante 10 minutos em
termociclador. A quantidade de açúcar redutor foi medida espectrofotometricamente
a 540nm. O efeito da temperatura foi determinado através de ensaios enzimáticos no
intervalo de 30-80°C, e efeito do pH a 50ºC em valores de pH entre 2,5 e 8,0. A
quantidade de proteínas foi determinada pelo Método de Bradford. As amostras
enzimáticas foram submetidas a procedimentos de purificação por filtração em gel e
troca iônica, com produção de zimogramas. O Extrato Bruto apresentou atividade de
xilanases de 0,87 UI/mL. Após ultrafiltração em membrana de 30 kDa, o ultrafiltrado
teve 0,26 UI/mL. Após ultrafiltração em membrana de 10 kDa, o concentrado (fração
entre 10 e 30 kDa) apresentou atividade de 0,73 UI/mL e concentração de proteínas
de 0,234 mg/mL As maiores atividades de xilanases foram encontradas a 40ºC e em
pH 7,0. Nos testes de termoestabilidade, a amostra reteve 74% da atividade a 40ºC
após 96h. A filtração em gel dessa amostra com resina Sephadex G-50 e tampão
Fosfato de Sódio 50 mM de pH 7,0 e NaCl 0,15 M foi capaz de separar a enzima do
pigmento. Após essa etapa foi feita cromatografia de troca aniônica com coluna
HiTrap DEAE Sepharose FF de 1 mL. Com o total de 34 tubos, foi encontrada
atividade de xilanases nos tubos 1 a 6 e 10 a 12. O perfil encontrado em zimograma
indica 2 xilanases parcialmente purificadas. Em continuidade a esse estudo, esperase obter amostras totalmente purificadas e analisar sua interação com alguns íons.
Em paralelo, serão realizados estudos de pré-tratamento do bagaço de cana em
diversas condições de temperatura, concentração e duração.
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R86- Análise proteômica e genômica funcional de Clostridium thermocellum
(Isolado B8) em diferentes fontes de carbono
Brenda Rabello de Camargo; Karen Ofuji Osiro; André Murad; Jéssica Pinheiro; Eliane Noronha
Ferreira.
[email protected]
Clostridium thermocellum é uma bactéria gram positiva anaeróbica que produz um
complexo enzimático composto de enzimas hidrolíticas e uma proteína estrutural CipA
que sinergicamente degradam desde celulose cristalina e amorfa até estruturas mais
complexas envoltas por lignina. Sua alta eficiência de degradação de materiais
lignocelulósicos devida ao conjunto de classes diferentes de glicosil hidrolases e a
presença de um módulo de ligação à celulose nomeado CBM tem proposto muitos
estudos a respeito de sua modelagem e regulação. Perguntas sobre como essas
enzimas são enviadas, e como o complexo é formado ainda não foram totalmente
elucidados, principalmente o comportamento em fontes de resíduos agroindustriais
encontradas no Brasil. Dessa forma esse presente estudo utiliza uma linhagem de
Clostridium thermocellum isolada de rúmen de caprinos e biomassa de rejeitos da
produção de bioetanol de primeira geração. Dados proteômicos a priori foram
realizados do crescimento da linhagem B8 crescidos nos resíduos palha e bagaço de
cana revelaram a identificação de glicosil hidrolases de atividades celulolíticas endo
e exo e atividades hemicelulolíticas, demonstrando uma xilanase exclusiva em
relação ao crescimento em celulose de fibra longa. As enzimas encontradas em maior
porcentagem relativa à Cip A foram a Cel S ( exoglucanase) seguidas pela Cel J e
Cel K também encontradas em trabalhos anteriores. Proteinas de estresse oxidativo
como por exemplo a peroxirredoxina e proteínas de transporte de membrana e
transporte de açúcar como Proteína de ligação ao soluto extracelular e ABC
transporter foram encontradas associadas ao celulossoma podendo indicar relação
na função ou montagem do complexo. Enzimas de síntese de etanol, acetato e lactato
foram encontradas no sobrenadante demonstrando a utilização da biomassa pela
bactéria chegando a esses produtos de interesse biotecnológico. Posteriormente a
esses dados e tentando chegar á expressão diferencial dessas enzimas e sua
regulação, as culturas da linhagem B8 foram crescidas em meio anaeróbico redutor
em estufa a 60°C para realizar uma curva de crescimento e definir sua fase log para
análise de RNAseq. Os substratos utilizados como fonte de carbono foram: celulose,
palha de cana e bagaço de cana. Após realizacão da curva e visualizacão da fase
exponencial em horas avaliado por OD a 600 nm e baseados em estudos anteriores
foi definido que o tempo definido para coleta de células seria de 37 horas. Para
extração de RNA, foram testados protocolos de extração utilizando RNA
wizard(Ambion), trizol (Invitrogen) e Invisorb (invitrogen). Para realizar a lise da
bactéria foi testado o uso de beads, sonicação e lisozima (10 mg/mL). A extração que
gerou melhores resultados foi com a utilização de beads e lisozima para a lise da
parede bacteriana seguido por extração com Trizol. As amostras foram enviadas para
sequenciamento em plataforma Illumina e os resultados serão analisados e validados
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por PCR em tempo real para os transcritos selecionados de interesse. A parir desses
dados gerados esperamos conseguir relacionar as enzimas de interesse com a
biomassa utilizada, e como essas enzimas e proteínas estão reguladas dentro do
metabolismo.
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R87- Película de amido de milho no controle pós-colheita da antracnose em
frutos tropicais
Bruno Ferreira de Oliveira ; Luiz Eduardo Bassay Blum
[email protected]
Diversas são as causas pelas perdas das frutas, e, dentre elas, principalmente as
doenças. A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum complex. gloeosporioides
(PHOULIVONG et al., 2010; DAMM et al, 2010; SUTTON, 1980) é a principal doença
pós-colheita em frutas tropicais (PERES et al 2002) e vários métodos de controle
são usados, porém, com altos custos de implantação, gasto de energia, ineficiência
de controle e impacto negativo ao ambiente. Por isso, a presente pesquisa tem como
objetivo determinar um método alternativo e eficiente de controle, utilizando uma
película de amido de milho para cobrir as superfícies das frutas manga, mamão e
banana após a colheita. Após análise filogenética do patógeno da antracnose e testes
de patogenicidade em frutos de mamoeiro, mangueira e bananeira, suspensões nas
concentrações de 0,5%, 1%, 1,5% e 2% de amido de milho serão testadas.Com os
conhecimentos obtidos nesta pesquisa, espera-se elucidar este patossistema e
determinar um método promissor de controle da antracnose em pós-colheita dos
frutos.
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R88- Caracterização biológica de um peptídeo inibidor de protease isolado da
peçonha do escorpião Tityus obscurus
Caroline Barbosa Farias Mourão; Maura V. Prates.; Carlos Bloch Jr; Graziella Joanitti; Sônia Freita;
Cristiane Ano Bom; Elisabeth Ferroni Schwartz.
[email protected]
Laboratório De Toxinologia – Ltx
Inibidores de protease (PIs) participam da regulação de diversos processos
metabólicos, apresentando potencial uso na prevenção de patologias humanas, como
câncer e hemorragia. Além disso, em animais peçonhentos, tem-se mostrado PIs que
também bloqueiam canais Kv. A partir da construção da biblioteca de cDNA da
glândula de peçonha e da análise proteômica da peçonha do escorpião Tityus
obscurus (Buthidae) por nosso grupo de pesquisa, obteve-se a sequência primária do
peptídeo denominado ToPI1. Com 33 resíduos de aminoácidos, três pontes dissulfeto
e 3806,8 Da, ToPI1 não apresenta similaridade significativa com nenhuma toxina
descrita até o momento. Os objetivos desse estudo são: obter o peptídeo ToPI1 a
partir da peçonha de T. obscurus e por síntese química; caracterizar sua estrutura e
atividade inibidora de proteases; avaliar sua ação em diferentes subtipos de canais
Kv; e caracterizar sua possível atividade antitumoral. Até o momento, ToPI1 foi obtido
a partir do fracionamento por RP-HPLC da peçonha bruta de T. obscurus e por síntese
química automática em fase sólida. Assim como o peptídeo nativo, ToPI1s (sintético)
apresentou atividade inibidora de tripsina (IC50 de ~110 nM), e não inibiu
quimotripsina. A atividade citotóxica está sendo avaliada por ensaio de viabilidade
celular pelo método MTT. O peptídeo reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa
(IC50 de ~90 µM), sendo a resposta dependente de dose e tempo. A viabilidade
celular da linhagem tumoral B16F10 também foi reduzida, embora doses maiores
precisam ser testadas. A ação do peptídeo nas linhagens equivalentes de células
saudáveis será avaliada em seguida. Posteriormente, ensaios antitumorais in vivo
serão realizados em camundongos, e a ToPI1 será testada em diferentes subtipos de
canais Kv. Adicionalmente, a estrutura secundária da ToPI1s será avaliada por
espectroscopia de Dicroismo Circular em diferentes valores de pH e temperatura. A
análise da estrutura tridimensional por RMN está em andamento.
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R89- Diferentes isotipos IgG de região variável idêntica apresentam distintos
padrões de ligação a Cryptococcus neoformans
Diane Sthefany Lima De Oliveira; Andre Moraes Nicola, Arturo Casadevall; Maria Sueli Soares Felipe.
[email protected]
Biologia Molecular
Acredita-se que sítio de ligação dos anticorpos ao antígeno seja formado por domínios
variáveis. No entanto, evidências sugerem que diferenças relacionadas ao isotipo em
CH podem afetar a especificidade e afinidade do anticorpo, mostrando que não
apenas os domínios VH e VL determinam a ligação ao antígeno. Estudos têm
sugerido que o padrão anular é protetor em modelos animais, enquanto que mAbs
que se ligam de forma puntiforme são pouco protetores ou agravantes de doença.
Para estudar o mecanismo pelo qual o domínio constante altera o paratopo, IgG3
recombinante foi produzido usando domínio variável de mAb 2H1, um IgG1 que se
liga a C. neoformans em padrão anular. Fragmentos codificando VH e VL de 2H1
foram sintetizados e clonados em pFUSE-CHIg-mG3 e pFUSE-CLIg-mk,
respectivamente. Os plasmídeos foram co-transfectados em NSO e IgG3
recombinante foi colhido do sobrenadante. A concentração foi determinada por ELISA
foi de 0.4 mg/ml. A ligação de 2H1-IgG3 foi examinada por microscopia de
fluorescência com deconvolução e mostrou padrão puntiforme. No ensaio de
fagocitose com macrófagos, 2H1-IgG3 promoveu internalização em 15% dos
fagócitos. O anticorpo 2H1-IgG3 mostrou padrão de fluorescência puntiforme,
diferente do padrão anular observado com 2H1 IgG1. Desta forma, temos mostrado
que o resultado único encontrado na literatura é reprodutível. Recombinações entre
sequências CH1 de 2H1IgG3 e CH1 de 2H1IgG1 serão realizadas para identificar
como a estrutura de CH1 interfere com a de domínio variável levando a diminuição
da eficácia imune.
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R90- Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of
Cryptococcus neoformans
Fabiana Brandão Alves Silva; Lorena Derengowski; Patricia Albuquerque ; Ildinete Sila-Pereira; André
Nicola; Marcio José Poças Fonseca
[email protected]
Biologia Molecular
Cryptococcus neoformans infection is due to expression of various virulence factors
that allow survival under various stress conditions. Inhibitors of histone deacetylases
(HDACi) Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA) have the ability to
affect the profile of chromatin resulting in changes on expression several genes.
Objective: Study the effect of HDACi on expression of virulence phenotypes of
C. neoformans and the interaction of the fungus with animal hosts. Methods:
Different concentrations of the drugs were applied to C. neoformans cultures grown
on several conditions in order to analyze the expression of virulence phenotypes. Cell
cycle was evaluated by flow cytometry. Survival curve were performed infecting
caterpillars of the alternative host Galleria mellonella with C. neoformans cells
pretreated with HDACi. Results and Conclusion: HDAC showed ability interfere on
major virulence phenotypes described for C. neoformans significantly, even in
concentrations subinibitory, such as capsule, melanin, phospholipases and mating
type. Solely urease was not affected at any concentration tested by both HDACi.
NaBut showed more pronounced and permanent effect that TSA, possibly because
TSA is less stable. There is an increase in the population of cells in G2 / M
when treated for NaBut. Inhibitory effects observed in the formation of the capsule
was not maintained after removed of the drug "in vitro". Although HDACi affect
the virulence phenotypes "in vitro", no significant differences were observed in
the time of death of caterpillar of species Galleria mellonella between treatments
versus controls. Perspectives: Following steps of this work will be to evaluate the
synergism of HDACi with other antifungal drugs. We will also construct C. neoformans
HDAC mutants and investigate the role of these genes in the regulation of expression
of virulence factors by RNA-seq and infection in vivo assays.
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R91- Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por
tecnologia de phage display
Heidi Muniz Silva; Tainá Raiol Alencar; Christiane Nishibe ; Andréa Q. Maranhão; Marcelo De Macedo
Brígido.
[email protected]
Laboratório De Bioinformática
Dentre as tecnologias usadas na produção de anticorpos recombinantes, destaca-se
a expressão de peptídeos em fagos filamentosos ( phage display). Tal método permite
produzir bibliotecas de imunoglobulinas específicas para um antígeno de interesse,
cujas sequências podem ser obtidas por sequenciamento de nova geração. No
entanto, a busca por sequências candidatas à produção em larga escala a partir de
dados NGS tem sido um desafio devido ao enorme volume de sequências geradas.
Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo desenvolver um pipeline
computacional para analisar a variabilidade e o enriquecimento de bibliotecas
produzidas por phage display bem como para selecionar in silico sequências
candidatas. O pipeline desenvolvido segue dois critérios de seleção: as sequências
devem ser enriquecidas no round 3 e reconhecidas como domínios variáveis
completos. Todos os scritps foram implementados em linguagem perl. Como estudos
de caso, estão em processo de análise dois conjuntos de dados, gerados pelas
plataformas 454 Roche e Illumina. Em uma análise preliminar dos dados de
sequenciamento 454 Roche, observou-se maior riqueza de sequências no round 0,
tanto para domínios VH quanto para VL. A partir das bibliotecas dos domínios
variáveis, foram selecionadas como sequências candidatas apenas uma sequência
VH e uma sequência VL. O trabalho desenvolvido até o momento permitiu identificar
pontos a serem aperfeiçoados nos scritps do pipeline, tais como o aumento da
sensibilidade do programa de cálculo de sequências únicas, a fim de produzir uma
estimativa mais confiável da riqueza das bibliotecas. No que diz respeito aos dados
Illumina, os quais possuem reads paired-end, será implementado um script de
montagem dos pares R1/R2 para obter uma sequência consenso que possua os
domínios variáveis VH e VL completos. Sendo assim, este trabalho demonstra ser de
grande relevãncia para o grupo de Imunologia Molecular, pois novos experimentos de
phage display poderão ser realizados visando testes biológicos, num conjunto mais
restrito de sequências de imunoglobulinas com expectativas de especificidade pelo
antígeno de interesse.
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R93- Expressão heteróloga de rim8 visando a caracterização do gene como alvo
molecular de novas drogas antifúngicas
Lucas Luiz Vieira; Ana Karina Rodrigues Abadio; André Moraes Nicola; Fabiana Freire Mendes
Oliveira; Maria Sueli Soares Felipe.
[email protected]
Laboratório De Biologia Molecular
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma Infecção Fúngica Invasiva (IFI) considerada
problema de saúde pública no Brasil visto que tem elevado o tempo de internação e
gerado o maior índice de mortalidade entre as micoses sistêmicas. O
Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos mais frequentes de IFI e
apresenta diferentes isolados caracterizados, como o P.lutzii. Devido à necessidade
de se obter novos alvos terapêuticos, o gene rim8 foi identificado por genômica
comparativa como uma sequência ortóloga importante no genoma de fungos
patogênicos humanos e ausente no genoma humano. O rim8 codifica uma proteína
envolvida na ativação proteolítica de um fator transcricional em resposta ao pH
alcalino, esta tem sido considerada uma via aparentemente conservada entre os
fungos e envolvida na patogênese e interação patógeno-hospedeiro. O gene rim8 de
P. lutzii foi sintetizado quimicamente com uma cauda de seis histidinas e foi clonado
em vetor pET-21a. A expressão heteróloga do gene foi padronizada usando duas
estirpes de E. coli. A proteína heteróloga RIM8 foi purificada usando cromatografia
por afinidade em coluna de níquel. Os resultados da expressão e purificação foram
analisados em eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS e, em alguns
casos, confirmados por Western blot. Visando a imunocitolocalização, foi realizada a
imunização de camundongos Swiss com a proteína purificada e a presença de
anticorpos anti-RIM8 foi confirmada por ELISA. Resultados: Através da padronização
da expressão do gene rim8, as melhores condições identificadas foram com a
linhagem de E. coli BL21 (ï•¬DE3) e o uso de meio LB com 0,5% de glicose a 37Â°C
por 4 horas e a indução realizada com 0,5 mM de IPTG. Através da análise de
resultados de SDS-PAGE, foi obtida a purificação da proteína heteróloga. Conforme
resultados de ELISA, houve a produção de anticorpos anti-RIM8 pelo camundongo
em títulos de 1:8100. Por imunocitolocalização evidenciou-se o aumento de
fluorescência tanto na superfície quanto no interior celular. Os resultados sugerem
que foi possível expressar o gene heterólogo rim8 e que certo grau de purificação foi
alcançado, tendo em vista as análises de SDS-PAGE e Western blot. A imunização
de camundongos levou a produção de anticorpos anti-RIM8, que puderam ser usados
na imunocitolocalização da proteína em P. lutzii, demonstrando um duplo padrão de
fluorescência. Sendo assim, pode-se inferir que o projeto apresentou contribuição
para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, porém ainda deve passar por
mais etapas de produção e purificação da proteína para ser capaz de realizar a
caracterização estrutural e funcional da proteína heteróloga RIM8.
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R96- Prospecção de transcritos relacionados à olfação em percevejos-praga da
soja
Luciana R. Farias1, Débora P. Paula2, Roberto C. Togawa R.2, Marcos M. C. Costa2, Priscila
Grynberg2, Miguel Borges2, Maria Carolina B. Moraes2, Raul A. Laumann2, Sonia N. Báo1
1Laboratório de Microscopia Eletrônica, Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília
2Embrapa Recursos Genético e Biotecnologia
Em insetos, a olfação é de fundamental importância para sua sobrevivência,
localização de recursos, reprodução e comunicação. Percevejos representam uma
das principais pestes da região neotropical e o desenvolvimento de ferramentas
biotecnológicas que interferem no processo de olfação parece ser uma alternativa
viável ao controle desses insetos. Neste trabalho, foram prospectadas e
caracterizadas, através do transcriptoma das antenas, proteínas relacionadas à
olfação em três espécies de percevejos pragas da soja no Brasil, entre eles:
Euschistus heros, Chinavia ubica e Dichelops melachantus. Entre as proteínas
relacionadas à olfação anotadas nas análises estão as proteínas ligantes de
odorantes (OBPs), proteínas quimiossensoras (CSPs) e receptores de odorantes
(ORs). Contudo, este estudo teve como principal alvo as OBPs, uma vez que essas
proteínas desempenham papel fundamental na comunicação química de insetos. A
partir dos contigs anotados após análise de similaridade no BLASTx, foram
identificadas 64 potenciais OBPs, 38 CSPs e 23 ORs nas três espécies de percevejo
(não foram identificadas ORs em D. melacanthus), das quais foram obtidas quatro
potenciais OBPs com sequência completa em E. heros e C. ubica, e uma em D.
melacanthus. Todas as potenciais OBPs com sequência complete apresentam as
propriedades fisico-químicas preditas para essa classe de proteínas (pequeno
tamanho, pI ácido, domínio PBP/GOBP, seis resíduos de cisteína em posição
conservada, peptídeo sinal na região amino terminal e alfa-hélice como estrutura
secundária predominante. Análises filogenéticas e de similaridade revelaram baixa
similaridade intraespecífica das sequências deduzidas de aminoácidos. Entretanto,
uma alta similaridade interespecífica foi observada entre algumas OBPs de E. heros
e C. ubica. Estes resultados indicam que os insetos com OBPs similares podem
reconhecer o componente do feromônio uma da outra, evitando a competição por
recurso com outras espécies ou melhorando a localização da planta hospedeira ao
utilizar as pistas de outras espécie se a OBP detectar seu ‘perfume’.
Palavras-Chave: RNA-Seq, proteína ligante à odorante, quimiorrecepção.
128
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Alunos do Programa
PPG-BioMol
Realizando
Doutorado Sanduíche
no Exterior
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Genome sequencing and comparative analysis of the biocontrol agent
Trichoderma harzianum
Andrei Stecca Steindorff, Igor Grigoriev, Eliane Ferreira Noronha.
[email protected]
Biological control is a complex process which requires many processes. The species
f T. harzianum are well known for their biocontrol activity against many plant
pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism used by T. harzianum,
we sequenced the isolate TR274 genome using a combination of 2x100bp and
2x250bp Illumina reads. The assembly was performed using AllPaths-LG with a
maximum coverage of 100x. The assembly generates 2282 contigs with a N50 of
37033. The genome size generated was 40.8 Mb and the GC content was 47.7%, an
expected value when compared with other Trichoderma genomes. The mitochondrial
genome was assembled and generate a contig with 27.7 Kb. The genome annotation
pipeline, using a combination of ab initio and homology methods, modeled 13932
genes (74.6% spliced genes) with a high transcriptome support. To check the genome
reliability, CEGMA analysis was performed showing a 100% coverage. The
phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes
sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma (T. asperellum and T. atroviride),
Longibrachiatum (T. reesei and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum
and T. virens) section division described previously. The comparison between two
Trichoderma harzianum species suggests a high genome similarity, in contrast with
the harzianum complex concept. The secondary metabolites and glycoside hydrolases
contraction and expansion were analysed. The Pachybasium section expanded its
secondary metabolites arsenal compared with the other sections. Glycosyde
hydrolases also expanded in Pachybasium section, as well as the Pectate lyases and
Carbohydrate esterases categories. These results suggests that these proteins
families has an important role on mycoparasitism and plant interaction. Future analysis
will improve the understanding of this complex genus and give some insights about its
lifestyle and the interactions with the environment.
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Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para Tospovírus baseado
em replicação de RNAs defectivos-interferentes (DIs)
André Gustavo Machado Bertran, Anelise Orílio; Massimo Turina; Marina Ciuffo; Ricardo Lenzi; Filipe
Leite, Renato De Oliveira Resende.
Embora sejam vírus relatados desde o fim do século XIX e de causarem doenças de
grande severidade em diversas variedades de plantas cultivadas em larga escala para
fins alimentícios ou ornamentais, não existe ainda para os Tospovirus um clone
infeccioso. Neste trabalho, a partir de moléculas sintéticas idênticas aos RNAs
defectivos interferentes mais prevalentes e persistentes de Tomato spotted wilt virus
(TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) foram produzidos cassetes de expressão
contendo ribozimas ativas in cis no 5' e 3' das moléculas para transcrição in vitro e
transfecção mediada por agrobactéria. Foram produzidas também versões
modificadas dos DI RNAs contendo GFP fusionado ao interno da fase de leitura aberta
(ORF) de modo a manter a fase (in frame) e alterando-a (disrupted frame). A
expressão mediada por agrobactérias foi testada em diferentes ordens (2 e 4 dias pré
e pós tratamento em relação a um tospovírus auxiliar) e com ou sem coinfiltração de
supressores de RNAi (p19 e NSs). Foi possível detectar a expressão do transcrito dos
DIs mas não a sua replicação pelo vírus auxiliar. Para os transcritos in vitro foi possível
realizar detecção por meio de RT-qPCR de RNA dos DIs após 4 dias de inoculação,
um tempo muito longo para um RNA sem CAP 5' e poli-A permanecer em uma folha
sem estar sendo replicado ou ao menos protegido contra degradação pelo
nucleocapsídeo viral. No momento, as construções contendo GFP estão em fase de
conclusão para continuidade dos experimentos incluindo o sistema de culturas
vegetais em protoplastos. Foram realizados também ensaios de indução de
reassortment por meio de forte pressão seletiva para a manutenção de isolado
recombinado partindo de um isolado mutante de TSWV que produz uma proteína NSs
não-funcional e transcritos in vitro de S RNA tipo-selvagem provenientes de outro
isolado de TSWV (BR20).
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Sw-5 gene cluster: understanding tomato resistance and susceptibility to
Tomato spotted wilt virus
Athos Silva de Oliveira, Richard Kormelink, Renato De Oliveira Resende
[email protected]
Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the runner-up of most economically/scientifically
important plant virus since it causes significant losses on vegetable production. Up to
now there are only two natural resistance sources against TSWV. One of them is the
Sw-5b gene, a paralog of the Sw-5 gene cluster which was firstly reported in Solanum
peruvianum and has been introgressed in many commercial cultivars of tomato
(Solanum lycopersicon). The Sw-5 gene cluster codify putative Resistance (R)
proteins, cellular receptors able to identify directly or indirectly the Avirulence (Avr)
determinants from pathogens. In this study, we show that the cell-to-cell movement
protein of TSWV (NSm) is the Avr of the Sw-5b-mediated resistance. In addition, high
accumulation of Sw-5b upon its co-expression with RNA silencing suppressors (RSS)
leads to auto-immunity in Nicotiana benthamiana. These two observations allowed us
to analyze the Sw-5 homologs from resistant and susceptible tomatoes for Avr
recognition and HR activation as uncoupled events. Truncated versions of the Sw-5
homologs were also analyzed, indicating the role of each main domain in such events.
Finally, a single mutation has been found to be associated with loss-of-function in a
Sw-5 homolog from susceptible tomato.
132
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Early proteomic changes of adherent cervical adenocarcinoma cells (HeLa)
induced by the treatment with a snake venom derived catalytically inactive
phospholipase A2
Jéssica Kele Arruda; Joanitti, G.A., Azevedo, R.B., Pires Júnior, O.R.; Fontes, W. , Sherman, N.E.,
Shannon, J. D., Castro. M.S.;Fox, J.W.
[email protected]
Bioquímica
The emergence of resistance by cancer cells to chemotherapeutic drugs available
makes the development of new agents of great importance and urgency. Toxins
isolated from animal venoms, including snake venoms has been the subject of
numerous studies due to their potential biotechnological and medical applications. We
have demonstrated with a Lys49 phospholipase A2 recently isolated from Bothrops
marmoratus venom (BmPLA2) that it is capable to induce the apopotic death of diverse
cell lines such as cervical cancer (HeLa), skin cancer (B16F10). In this study we
investigate a subpopulation of HeLa tumor cells which demonstrate resistance to
apoptosis by virtue of their maintaining cell adhesion following treatment with BmPLA2
for 24h at the IC50 concentration. We hypothesize that these cells would not
demonstrate typical proteomic changes associated with apoptosis and cell death and
perhaps yield insight into apoptosis-resistance mechanisms. The experimental
approach was to lyse the treated, adherent cells followed by decomplexation of the
cellular lysates using SDS-PAGE and then analyze by LC/MS/MS using a LC-MS/MS
Thermo Electron Orbitrap Velos. From these studies, BmPLA2 can be efficiently
purified from crude venom with only one chromatographic step, without loss in its
biological activity. This PLA2 is able to decrease cell viability in HeLa cells 24 hours
following treatment, showing an IC50 of 8,78 µM and induces cell death through
apoptosis. Furthermore, the subpopulation of cells that remain adherent after the
treatment, despite the presence of apoptotic signals, also present a slight change of
protein expression related with the normal death pathway caused by PLA2s, including
p38 MAPK pathway proteins, Bcl-2 and Bax, which could be associated with the
increased resistance. In addition to apoptosis, this approach allowed the identification
of other pathways that may be altered which requires confirmation. The snake venom
phospholipase BmPLA2 causes tumor cell death via the extrinsic apoptotic pathway;
The proteomic analysis of tumor and normal cells treated with BmPLA2 suggests
potential mechanisms for enhanced tumor cell sensitivity to the phospholipase.
133
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Display de proteínas imunogênicas do vírus da Febre amarela na superfície de
Baculovírus
Lorena Carvalho De Souza Chaves, Anamélia L. Bocca; Gary W. Blissard
[email protected]
A prevenção contra Febre Amarela se dá através de vacinação utilizando vacina de
vírus atenuado. Porém, vacinas de vírus atenuado podem ser perigosas para pessoas
com sistema imune comprometido. Como alternativa vacinal, vacinas que contenham
apenas regiões imunogênicas, capazes de desencadear a resposta imune, são
eficazes, seguras e econômicas. O genoma do vírus da febre amarela codifica três
proteínas estruturais (Pr/M, C e E) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A e B,
NS3, NS4A e B e NS5). A proteína de Envelope (E) é responsável pela entrada da
partícula viral na célula hospedeira e o principal alvo da resposta imune. A proteína E
é dividida em três domínios, I, II e III. O domínio III (EDIII) possui os epítopos que são
reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes. A proteína NS1 é uma proteína
essencial para replicação viral, e é encontrada tanto no interior quanto na superfície
celular, sendo também altamente secretada. O Display• de proteínas heterólogas na
superfície de baculovírus é uma alternativa eucariótica importante para a expressão
de proteínas com fins biotecnológicos. Foram selecionados os genes que codificam
as proteínas E, NS1, EDIII e ESRH (E sem regiões hidrofóbicas) para serem
fusionados a uma forma truncada e funcional do gene da proteína de envelope GP64
de dois diferentes baculovírus, AcMNPV (Autographa californica multiple
nucleopolyhedrovirus)
e
AgMNPV
(Anticarsia
gemmatalis
multiple
nucleopolyhedrovirus). Dessa forma, as proteínas recombinantes foram expressas,
(juntamente com a proteína GP64) na superfície de novas partículas virais. As
partículas virais recombinantes foram produzidas utilizando o sistema Bac-to-Bac
(Invitrogen), e estão sendo purificadas por centrifugação em colchão de sacarose. A
expressão de cada proteína será confirmada porWestern Blot e seu potencial
imunogênico será avaliado em camundongos. No caso do EDIII, todo esse processo
já foi realizado e as partículas virais recombinantes (expressando EDIII e GP64
fusionadas) foram purificadas e testadas em camundongos. Um dos testes
imunológicos avaliados foi o de proliferação de linfócitos que indicou uma maior
proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII
fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparados com o
controle LPS, entretanto, não foi observado a produção de citocinas específicas da
resposta imune adaptativa. Porém, o teste de proliferação de linfócitos pode ser uma
pista de que o sistema imune esteja sendo ativado de forma diferente. Testes
complementares serão feitos, agora para avaliar se a resposta imune esta sendo
ativada através de células B.
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PROGRAMAÇÃO:
Apresentações de Painéis
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Dia: 19/11/2014
R3- Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of a medical
interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals
a new transcription terminator factor possibly acquired from the host.
R5- Amanda Araújo Souza - Caracterização físico-química e molecular da enzima
bifuncional Fosfatase/Fitase produzida por Trichoderma harzianum ALL42.
R6- Mariana Martins Severo de Almeida - Estudo da Capacidade Evolutiva de
Tospovirus via Rearranjo Genético e Sua Implicação na Epidemiologia Viral.
R8- Deborah Vasconcellos Ambrósio - Cultivo e caracterização de membros do
domínio Archaea a partir de sedimentos lacustres do Cerrado.
R12- Camila Louly Corrêa - Study of the Lignocellulosic Potential in the Fungus
Aspergillus Terreus Grown on Agro-industrial residues.
R13- Rayane Nunes Lima - Interações Tospovírus-Planta: Caracterização estrutural
de proteínas de tospovírus e identificação de interações entre proteínas virais e
celulares.
R15- Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita
dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no
inseto alvo.
R17- Rosiane Andrade da Costa - Caracterização lipopeptídeos antimicrobianos
produzidos por Paenibacillus sp.
R19- Jhon Eric Alves Fernandes - Selection profiles in the recent evolutionary history
of baculoviruses.
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R22- Daniel Mendes Pereira Ardisson de Araújo - Perigonia lusca single
nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV) genome reveals acquisition of a peculiar nucleotide
metabolism fused gene that changed a recombinant prototypic baculovirus in vitro
infection.
R24- Letícia Stock Vieira - Inativação do Filtro de Seletividade de um Canal de
Potássio.
R25- Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of gramnegative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule.
R26- João Paulo Campos Fernandes - Estrutura do complexo entre o peptídeo PTRY
e tripsina.
R27- Lídia Nascimento Queiroz - Desenvolvimento de estratégias baseadas em RNA
interferente para resistência ampla a begomovírus em tomateiro (Solanum
lycopersicum).
R31- Thompson França Tomatieli - Caracterização de Anticorpos Humanos AntiPeçonha de Serpentes do Gênero Bothrops.
R33- Maria Jose Chiabai - Avaliação dos efeitos imunomodulatório e antiinflamatório
de anticorpos monoclonais anti- CD3 e anti-IL1β produzidos por Lactococcus lactis
em modelo de diabetes autoimune.
R34- Samuel Dias Araújo Júnior - Desenvolvimento de sistema para a triagem de
grande desempenho de compostos com atividade antibacteriana a partir de
bibliotecas metagenômicas.
R35- Luciana Gomes Ferreira - Análise da expressão dos genes bbrizgid1 e bbrizipt9
relacionados à síntese de fitohormônios em ovários de Brachiaria brizantha.
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R39- Marcelo Henrique Soller Ramada - Peptídeos antimicrobianos intragênicos de
diferentes plantas.
R40- Camila Ferreira Thé Pontes - Coevolução Molecular em Canais Iônicos e
Neurotoxinas.
R41- Abdulrazak Baba Ibrahim - Development of whitefly resistant transgenic soybean
plants via RNAi.
R46- Helder Andrey Rocha Gomes - Characterization and biotechnological
applications of pectinolytic enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on
fruit residues.
R47- Fernanda Guimarães Bernardes - Identificação de genes cry de Bacillus
thuringiensis eficientes no controle de pragas agrícolas.
R48- Fabiana Brandão Alves Silva - Effect of histone deacetylases inhibitors on the
virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans.
R50- Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli engenheirada
metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de
aranha e origina fibra sintética.
R52- Mariana Magalhães Nóbrega- Synthesis, purification and characterization of
Bioactive Peptides.
R54- Antonielle Vieira Monclaro - Produção e caracterização de uma endoglucanase
da família GH6 proveniente de metagenoma de solo de canavial.
R56- Bárbara Gomes Paes - Engenharia metabólica de Saccharomyces cerevisiae
para aproveitamento de xilose na produção de etanol lignocelulósico.
138
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R59- Samuel Coelho Mandacaru - Mapeamento de sítios de glicosilação de MRJP1 e
sua influência nas estruturas terciárias e oligoméricas.
R60- Bárbara Muller Salomão de Faria - Genômica aplicada ao cajueiro: tecnologias
de genotipagem de alto desempenho para a caracterização de germoplasma e
seleção genômica ampla.
R61- Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of a novel
bacterial protease selected in a metagenomic approach.
R63- Waldeyr Mendes Cordeiro da Silva - Workflow para reconstrução in silico de
redes metabólicas de fungos.
R65- Daniel Carneiro Moreira - Papel de antioxidantes endógenos como parte do
sistema adaptativo de um anfíbio para sobrevivência nas secas da Caatinga.
R67- Ana Gabriela Borges Leite. - Validação funcional de neuropeptídeos de
Anthonomus grandis via silenciamento gênico.
R68- Beatriz Elena Sarmiento Certuche - Caracterização dos principais mecanismos
fisiopatológicos envolvidos com a sintomatologia dos acidentes gerados pelo peixe
Pimelodus maculatus e avaliação da atividade proteolítica do extrato proteico de sua
peçonha.
R79- Christiane Ribeiro Janner - Construção e caracterização de nanosensor para o
monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
R81- Maritza Ocampo Betancur - Estratégias para Integração Múltipla de Vetores no
Genoma de Pichia pastoris.
R82- Pollyne Borborema Alves de Almeida - Estratégias de engenharia de leveduras
para super produção de L-ácido lático.
139
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R85- Bárbara Calheiros Neumann - Produção, purificação e caracterização de
xilanases de Aspergillus foetidus e sua aplicação no aproveitamento de resíduos
agroindustriais.
R86- Brenda Rabello de Camargo - Análise proteômica e genômica funcional de
Clostridium thermocellum (Isolado B8) em diferentes fontes de carbono .
R87- Bruno Ferreira de Oliveira - Película de amido de milho no controle pós-colheita
da antracnose em frutos tropicais.
R88- Caroline Barbosa Farias Mourão - Caracterização biológica de um peptídeo
inibidor de protease isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus .
R89- Diane Sthefany Lima De Oliveira - Diferentes isotipos IgG de região variável
idêntica apresentam distintos padrões de ligação a Cryptococcus neoformans.
R90- Fabiana Brandão Alves Silva - Effect of histone deacetylases inhibitors on the
virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans.
R91- Heidi Muniz Silva - Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas
produzidas por tecnologia de phage display.
R93- Lucas Luiz Vieira - Expressão heteróloga de rim8 visando a caracterização do
gene como alvo molecular de novas drogas antifúngicas..
R96- Luciana R. Farias - Prospecção de transcritos relacionados à olfação em
percevejos-praga da soja.
Dia: 20/11/2014
R0- Mayara Simonelly Costa dos Santos - Seleção in silico de sequências de
imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display.
140
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R1- Solange Cristina Rego Fernandes - Síntese racional de análogos de toxinas
escorpiônicas com ação em canais KV1.3 visando uma abordagem terapêutica contra
a esclerose múltipla.
R2- Débora Torres Alves Figueiredo - Engenharia metabólica de soja e edição de
genoma de genes associados a ácidos graxos.
R4- Jônatas Cunha Barbosa Lima - Análise estrutural da proteína PPARγ in silico e
por difração de raios X.
R7 - Juan Fernando Riasco - Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de
FvFc em células de mamíferos.
R9 - Ronny Petterson dos Santos Araujo - Estudo da interação da cadeia variável
pesada de imunoglobulina associada a cadeia VpreB com ssDNA.
R10 - Miguel de Souza Andrade - Análise molecular/evolutiva do processo de
envelopamento múltiplo em baculovírus.
R11- Amanda Gregorim Fernandes - Análise e comparação de duas β-glicosidases
no sinergismo de enzimas celulolíticas microbianas na degradação da fração de
celulose de bagaço de cana de açúcar.
R14- Diogo Martins de Sá - A model for the interaction between cadherin-like receptor
BT-R1 and three Cry1a family toxins from Bacillus thuringiensis.
R16- Juliana Mayumi Hosoume - Investigação da Interação do Sevoflurano com o
Canal Iônico Kv1.2.
R20- Marco Antônio de Oliveira - Avaliação do papel de microRNAs regulatórios na
resposta imune inata à infecção por Paracoccidioides brasiliensis.
141
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R21- Henrique César Teixeira Veras - Biologia de sistemas para estudo comparativo
de leveduras fermentadoras de xilose.
R23- Tarcila Zuleica Zaparolli Lopes - Construção e Expressão de Anticorpos que
reconhecem o antígeno CD20 humano.
R28- Layssa Miranda de Oliveira - Desenvolvimento de clone infeccioso de Norovírus
Humano.
R29- Caio Silva Souza, Barbara Neumann - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor
Domains.
R30- Andressa da Cunha Quintana Martins - Prospecção e caracterização de genes
envolvidos na resistência de Arachis stenosperma ao Meloidogyne arenaria.
R32- Renata Velozo Timbó - Estudo das teias tróficas do predador Hippodamia
convergens (Coleoptera: Coccinellidae) pela análise metagenômica do DNA
mitocondrial presente no conteúdo gastrointestinal.
R36- Cristiana Moura Andrade - Plantas de tabaco resistentes à Sclerotinia mediada
por RNAi.
R37- Nayhanne Tizzo de Paula - Interfering RNA as a strategy for silencing the rep
gene of begomoviruses infecting tomato (Solanum lycopersicum) in Brazil.
R38- Rafael Corrêa - Lysophosphatidylcholine induces IL-1β secretion and lipid
droplet biogenesis in inflammasome-mediated pathway.
R42- José Antonio Fagundes Assumpção - Estudo da relação entre o estado de
diferenciação celular e a hipótese de Warburg.
142
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R43- Caio de Oliveira Gorgulho Silva - Aproveitamento de licores resultantes de prétratamento Liquid Hot Water de resíduos agroindustriais como fonte de carbono para
produção de enzimas xilanolíticas por Aspergillus foetidus.
R44- Lorena Cardoso Cintra - Análise do sinergismo de enzimas xilanolíticas
microbianas na degradação da fração de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar.
R45- Mariana Senna Quirino - Next-generation sequencing applied for identification
of viruses in watermelon (Citrullus lanatus) plants.
R49- Diogo César Ferreira - Desenvolvimento de potenciais estatísticos para
simulação de enovelamentos proteicos.
R51- Karen Ofuji Osiro - Characterization and comparison between the cellulosome
and the crude extract produced by a new isolate of Clostridium thermocellum.
R53- Mikhail Oliveira Leastro - The functional analysis of distinct tospovirus movement
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R55- João Heitor Colombelli Manfrão Netto - Estudo do efeito da Metilação do DNA e
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R57- Julianna Barbosa Peixoto - Identificação e caracterização de moléculas
microbianas associadas à biodegradação de polietileno.
R58- Thiago Rodrigues de Oliveira - Obtenção de proteínas de camada S de Archaea
para possíveis aplicações biotecnológicas.
R62- Alice da Cunha Morales Álvares- Bowman- Birk Protease Inhibitor from Vigna
unguiculata Seeds Enhances the Action of Bradykinin Related Peptides.
R66- Carolina Veónica Attallah - Procurando para um peptídeo sinal para expressar
proteínas em diferentes tipos de células de mamíferos.
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R69- Elias Ferreira Sabiá Júnior- Detecção e Caracterização de Proteínas
Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Cãncer
Humano.
R70- Myrna Barbosa Gomes- Desenvolvimento de Bioprocesso para a Produção de
Álcoois por Linhagem de Clostridium acetobutylicum Modificada Geneticamente.
R71- Daniel Pereira de Paiva- Desenvolvimento de uma linhagem industrial de
Saccharomyces cerevisiae para fermentação de amido.
R72 - Saluana Rocha Craveiro-, Análise comparativa do genoma e caracterização do
gene DNA photolyase de isolados de Pseudoplusia includens SNPV.
R75- Luíza Cesca Piva- Uso do gene amdS (acetamidase) como uma marca de
seleção dominante e reciclável em Pichia pastoris.
R76- Yara Cavalcante Vieira- Detecção de genes de enterotoxinas STX-1 e STX-2
em Escherichia coli pertencentes ao banco de germoplasma do Laboratório de
Microbiologia Médico Veterinária da Universidade de Brasília.
R77- Aline Belmok de Araújo Dias- Análise da diversidade de Archaea em solos de
Cerrado sensu stricto submetidos ou não a queimadas bienais.
R78- Paula Marcela Duque Jaramillo- Desenvolvimento e validação de métodos
inovadores para a garantia da qualidade do biodiesel e de suas misturas ao diesel.
R80- Debora Farage Knupp dos Santos - Caracterização do resistoma do solo de
Cerrado strictu sensu e potencial biotecnológico na biorremediação de amostras
ambientais contaminadas com resíduos aromáticos
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APOIO
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Anais do IV Simpósio do Programa de Pós

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