FSH IRMA - Meditecno

Transcrição

FSH IRMA
®
Coat-A-Count FSH IRMA
English
Intended Use: Coat-A-Count FSH IRMA
is an immunoradiometric assay designed
for the quantitative measurement of follicle
stimulating hormone (FSH, follitropin) in
serum. It is intended strictly for in vitro
diagnostic use as an aid in the diagnosis
and treatment of pituitary and gonadal
disorders.
Catalog numbers: IKFS1 (100 tubes),
IKFS2 (200 tubes).
The 100-tube kit contains less
than 20 microcuries
125
(740 kilobecquerels) of I
polyclonal anti-FSH, and the 200-tube kit
contains less than 40 microcuries
(1,480 kilobecquerels).
Summary and Explanation of
the Test
Follicle stimulating hormone (FSH) is
secreted by the β-cells of the anterior
pituitary under the control of the
gonadotropin releasing hormone produced
in the hypothalamus. It is a glycoprotein
with a molecular weight of approximately
28,000, consisting of two polypeptide
chains designated alpha and beta. The
alpha chains of FSH, LH, TSH and HCG
are biochemically identical, whereas the
beta chains are biochemically unique and
confer biological and immunological
specificity. Bioactivity is also determined
by the beta chain.
FSH facilitates the development and
maintenance of gonadal tissues, which
synthesize and secrete steroid hormones.
Circulating levels of FSH are controlled by
a negative feedback effect on the
hypothalamus by steroidal hormones.
Although FSH and LH are required for
normal sexual function in both males and
females, the secretory patterns are very
different for the two sexes. In sexually
mature adults, FSH and LH are not
secreted in constant amounts; rather,
secretion occurs in pulses which result in
rapid fluctuations over the entire reference
range (i.e., up or down by 50 to 100%).
Because of this pulsatile secretion,
2
samples obtained within the same day
from the same patient may fluctuate
widely within the reference range,
reflecting physiological variation rather
than errors in technique or methodology.
In mature females, FSH initiates the
growth and development of ovarian
follicles. During ovulation, when the follicle
is ruptured, the follicle, now called the
corpus luteum, secretes estradiol and
progesterone, which control the circulating
levels of FSH by a negative feedback
effect on the hypothalamus. In
menopause, with diminished ovarian
function, there is a resulting decrease in
estradiol secretion. Due to the lack of a
negative feedback mechanism, with
diminished estradiol, the circulating FSH
levels become significantly increased.
In the mature male, FSH is associated
with the stimulation and maintenance of
spermatogenesis. Testosterone and
estradiol have the role of providing the
negative feedback mechanism to the
hypothalamus for controlling the release of
FSH. Infertility in males may be due to
hypogonadism as a result of primary
testicular failure. Testicular failure may be
functional failure to mature or a result of
germ cell damage. Whatever the etiology,
the conditions of hypogonadism have the
net result of dramatically raising the
circulating FSH levels, due to the lack of a
negative feedback mechanism. There are
other testicular disorders which
demonstrate low FSH values, but these
are probably due to insufficient
gonadotropin production and are
indicative of pituitary or hypothalamic
dysfunction.
Pituitary dysfunction is often a causative
agent of secondary gonadal failure. This
will result in decreased secretion of both
FSH and LH. The net effect in both males
and females is infertility. This is also
observed with central nervous system
disorders and following administration of
certain depressant drugs, such as the
phenothiazines.
Principle of the Procedure
Coat-A-Count FSH IRMA is a solid-phase
immunoradiometric assay based on
Coat-A-Count FSH IRMA (PIIKFS-9, 2010-11-02)
monoclonal and polyclonal anti-FSH
125
antibodies: I-labeled anti-FSH
polyclonal antibody in liquid phase and
monoclonal anti-FSH antibody
immobilized to the wall of a polystyrene
tube.
In the procedure:
FSH is captured between monoclonal
anti-FSH antibody immobilized on the
inside surface of the polystyrene tube and
the radiolabeled polyclonal anti-FSH
tracer.
125
Unbound I-labeled anti-FSH antibody is
removed by decanting the reaction mixture
and washing the tube; this reduces
nonspecific binding to a very low level,
and ensures excellent low-end precision.
The FSH concentration is directly
proportional to the radioactivity present in
the tube after the wash step. The
radioactivity is measured using a gamma
counter, after which the concentration of
FSH in the patient sample is determined
by comparing the patient counts per
minute with those obtained for the set of
calibrators provided.
Reagents to Pipet: 1
Total Incubation Time: 1 hour (on a rack
shaker)
Total Counts at Iodination:
approximately 300,000 cpm
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
Water: Use distilled or deionized water.
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals — and strictly
for in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
3
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Buffered Wash Solution Concentrate
(1TSBW)
40 mL of a concentrated buffered saline
solution, with surfactants, and with sodium
azide as preservative. Using a transfer
container, dilute the contents of each vial
with 400 mL distilled water, for a total
volume of 440 mL. Stable at 2–8°C for 6
months after preparation.
IKFS1: 1 vial x 40 mL.
IKFS2: 2 vials x 40 mL.
Materials Supplied – Initial
Preparation
Materials Required But Not
Provided
FSH Ab-Coated Tubes (IFS1)
Polystyrene tubes coated with murine
monoclonal antibody to FSH and
packaged in zip-lock bags. Store
refrigerated and protected from moisture,
carefully resealing the bags after opening:
stable at 2–8°C until the expiration date
marked on the bag.
IKFS1: 100 tubes. IKFS2: 200 tubes.
125
I FSH Ab (IFS2)
Iodinated anti-FSH polyclonal goat
antibody, with preservative. The reagent is
supplied in liquid form, ready to use. Each
vial contains 5.5 mL. Stable at 2–8°C for
30 days after opening, or until the
expiration date marked on the label.
IKFS1: 2 vials. IKFS2: 4 vials.
FSH Calibrators (FSI3–9)
Seven vials, labeled A through G, of FSH
calibrators in a nonhuman serum/buffer
matrix, with preservative. The calibrators
are supplied in liquid form, ready to use.
The zero calibrator vial A contains 5 mL,
while the remaining calibrator vials B
through G contain 2 mL each. Stable at
2–8°C for 30 days after opening. For
longer storage, aliquot and freeze: stable
at –20°C for 6 months.
IKFS1: 1 set. IKFS2: 1 set.
The calibrators contain, respectively, 0,
1.5, 5, 15, 30, 60 and 100
milli-International Units of FSH per milliliter
(mIU/mL) in terms of the World Health
Organization's Second International
Reference Preparation of Pituitary FSH,
number 78/549 (2nd IRP 78/549).
Gamma counter — compatible with
standard 12x75 mm tubes
Rack shaker — set at approximately 200
strokes per minute.
Reagent Preparation
Distilled or deionized water
Graduated cylinder — for dispensing
400 mL.
Plastic storage container with lid — for
preparation and storage of Buffered Wash
Solution.
Immunoassay
Micropipets: 100 µL
Dispenser — for delivering 2.0 mL of
Buffered Wash Solution.
Foam decanting rack — available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR).
3-cycle log-log graph paper
A tri-level, human serum-based
immunoassay control, containing FSH as
one of over 25 assayed constituents, is
available from Siemens Healthcare
Diagnostics (catalog number: CON6).
Specimen Collection
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
13
Collect blood by venipuncture into plain
tubes (without anticoagulant), and
separate the serum from the cells. Note
the time of collection.
The use of an ultracentrifuge is
recommended to clear lipemic samples.
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
4
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. Coat-ACount FSH IRMA has not been tested with
all possible variations of tube types.
Consult the section on Alternate Sample
Types for details on tubes that have been
tested.
Pipet directly to the bottom.
Samples expected to contain FSH
concentrations greater than the
highest calibrator (100 mIU/mL)
should be diluted in the zero
calibrator. The use of disposable-tip
micropipets is recommended, to avoid
carryover from sample to sample.
Positive-displacement pipets and
automatic pipettor-diluters should be
used only if the possibility of carryover
has been evaluated and found to be
insignificant.
Volume Required: 100 µL per tube
Storage: 2–8°C for 2 days, or 2 months at
–20°C.
Before assay, allow the samples to come
to room temperature (15–28°C) and mix
by gentle swirling or inversion. Aliquot, if
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. Do not attempt to thaw frozen
specimens by heating them in a
waterbath.
Coat-A-Count FSH IRMA has a working
range of up to 100 mIU/mL. All samples
expected to contain FSH concentrations
greater than this value should be diluted
with the zero calibrator before assay.
3
Shake for 60 minutes on a rack
shaker.
5
Decant thoroughly. Add 2 mL
Buffered Wash Solution to each tube.
Wait 1 to 2 minutes, then decant
thoroughly. Again add 2 mL Buffered
Wash Solution, wait 1 to 2 minutes,
and decant thoroughly.
T*
—
A (NSB)
0
B
1.5
C
5
D
15
E
30
F
60
G ("MB")
100
* Optional
2
Removing all visible moisture will
greatly enhance precision. After the
second wash, decant the contents of
all tubes (except the T tubes) using a
foam decanting rack, and allow them
to drain for 2 or 3 minutes. Then strike
the tubes sharply on absorbant paper
to shake off all residual droplets.
Label sixteen FSH Ab-Coated Tubes
A (nonspecific binding) and B through
G ("maximum binding") in duplicate.
Label additional FSH Ab-Coated
Tubes, also in duplicate, for controls
and patient samples.
mIU/mL
WHO 2nd IRP 78/549
Pipet 100 µL of each calibrator,
control and patient serum sample into
the tubes prepared.
I FSH Ab to every
4
All components must be at room
temperature (15–28°C) before use.
Calibrators
125
Pipet directly to the bottom. Make
sure that sample and tracer are
thoroughly mixed. A repeating
dispenser is recommended. Set the
(optional) T tubes aside for counting at
step 6; they require no further
processing.
Immunometric Assay
Procedure
1
Add 100 µL of
tube.
6
Count for 1 minute in a gamma
counter.
In multi-head gamma counters, the
(optional) total counts tubes should be
separated from the remaining assay
tubes by at least one space, to
minimize the possibility of spillover.
Calculation and Quality Control
To calculate results (in terms of
concentration units) from a log-log
representation of the calibration curve, first
correct the counts per minute (CPM) of
each pair of tubes by subtracting the
average CPM of the nonspecific binding
tubes (calibrator A):
5
Net Counts = Average CPM minus Average
NSB CPM
Then determine percent binding (relative
to that of the highest calibrator) – here
called "%B/MB" – of each pair of tubes as
a percent of "maximum binding," with the
NSB-corrected counts of the highest
calibrator taken as 100%:
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
Using the 3-cycle log-log graph paper, plot
Percent Bound versus Concentration for
each of the nonzero calibrators, and draw
a curve approximating the path of these
points. (Connect the calibration points with
arcs or straight line segments. Do not
attempt to fit a single straight line to the
data.) Concentrations for controls and
unknowns within range of the nonzero
calibrators may then be estimated from
the calibration curve by interpolation. An
additional plot of Percent Bound versus
Concentration for the three lowest
calibrators on linear-linear graph paper
may be used for interpolation near zero
dose.
Comments: Although other approaches
are acceptable, data reduction by the
method just described has certain
advantages from the standpoint of quality
control. In particular, it yields a calibration
curve that is relatively linear in both log-log
and linear-linear representations, and
relatively stable from assay to assay. It
also yields valuable QC parameters,
namely, Percent Bound (%B/MB) values
for the nonzero calibrators. A still more
informative graph, conveying a sense of
within-assay reproducibility as a function
of concentration, can be obtained by
plotting the Percent Bound values of
individual calibrator tubes directly, i.e.
without first averaging the CPM of
replicates.
Alternatives: Although Percent Bound
can be calculated directly from Average
CPM, correction for nonspecific binding
usually produces a calibration curve that is
more nearly linear throughout its range. A
calibration curve can also be constructed
by plotting CPM or Average CPM directly
against Concentration on either log-log or
linear-linear graph paper. (Semi-log graph
paper should not be used.) This approach
has the virtue of simplicity, but is less
6
desirable from the standpoint of quality
control.
Computerized Data Reduction: "Pointto-point" methods, including linear and
cubic spline fits, are suitable; but since
they provide little assistance in monitoring
the integrity of an assay, it is important to
prepare the recommended log-log plot of
the calibration curve, either manually or by
computer, as a quality control step. Data
reduction techniques based on the logistic
model may also be applicable. Within this
family, curve-fitting routines based on the
4- or 5-parameter logistic are the most
suitable candidates. However, some
algorithms currently in use may not
converge successfully, even when the
logistic model is true to the data. If a
logistic method is adopted, it is essential
to verify its appropriateness for each day's
assay by monitoring the backcalculation of
the calibrators, and other parameters. In
addition, a plot of the calibrator curve in a
log-log representation is highly
recommended, as this is more informative
than the conventional semi-log plot.
Sample Handling: The instructions for
handling and storing patient samples and
components should be carefully observed.
Dilute patient samples expected to contain
FSH concentrations greater than the
highest calibrator (100 mIU/mL) with the
zero calibrator before assay. All samples,
including the calibrators and controls,
should be assayed at least in duplicate. It
is important to use a disposable-tip
micropipet, changing the tip between
samples, to avoid carryover
contamination. Positive-displacement
pipets and automatic pipettor-diluters
should be used only if the possibility of
carryover has been evaluated and found
to be insignificant. Pairs of control tubes
may be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
Inspect the results for agreement within
tube pairs.
Gamma Counter: To minimize the
possibility of spillover in multi-well gamma
counters, the optional total counts tubes
(T) should be separated by one or more
spaces from the other assay tubes.
Alternatively, add only 25 µL of the tracer
to each of the T tubes at step 3, and
multiply the observed counts per minute in
these tubes by 4.
Controls: Controls or serum pools with at
least two FSH concentration levels (low
and high) should routinely be assayed as
unknowns, and the results charted from
day to day as described in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981; 27:493-501. Repeat
samples are a valuable additional tool for
monitoring interassay precision.
QC Parameters: We recommend keeping
track of these performance measures:
T = Total Counts (as counts per minute)
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Net MB Counts / Total Counts)
And the Percent Bound ("%B/MB") values
of all but the highest of the nonzero
calibrators, for example:
%C/MB = 100 × (Net Calibrator "C" Counts / Net
MB Counts)
Record Keeping: It is good laboratory
practice to record for each assay the lot
numbers of the components used, as well
as the dates when they were first
reconstituted or opened.
Further Reading: See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
Example Run: For illustration only, not for
calculating results from another run. (See
“Example Run” table.)
Expected Values
Studies on healthy individuals were
carried out at two separate facilities using
the Coat-A-Count FSH IRMA kit, which is
standardized in terms of the WHO 2nd
IRP 78/549.
FSH
Adult male
Median Central 95%
mIU/mL Range mIU/mL
3.9
n
1.1 – 13.5*
16
38
Adult female
follicular
5.0
3.3 – 8.8
midcycle
10.1
5.4 – 20*
10
luteal
3.1
1.6 – 8.7
45
oral
contraceptives
1.3
ND – 4.6*
12
postmenopausal
73
42 – 126*
12
postmenopausal,
estrogenreplacement
therapy
27
9.5 – 113*
16
0.9
0.1 – 3.4*
14
Prepubertal
(1 – 13 yr)
ND: Not detectable
* Equivalent to absolute range
Laboratories should consider these results
as guidelines only. Each laboratory should
establish its own reference ranges.
Limitations
In certain cases of infertility, treatment with
human gonadotropins poses a potential
problem for the accurate measurement of
FSH levels. The FSH that is administered
can cause the patient to produce
antibodies to FSH which will interfere with
the assay.
Because of pulsatile secretion, samples
obtained within the same day from the
same patient may fluctuate widely within
the reference range, reflecting
physiological variation rather than errors in
technique or methodology.
Performance Data
See Tables and Graphs for data
representative of the assay's performance.
Results are expressed as
milli-International Units per milliliter
(mIU/mL) in terms of the World Health
Reference Preparation of Pituitary FSH,
number 78/549 (2nd IRP 78/549).
Calibration Range: Up to 100 mIU/mL
(WHO 2nd IRP 78/549).
Analytical Sensitivity: 0.06 mIU/mL.
High-dose Hook Effect: None up to
10,000 mIU/mL.
7
Intraassay Precision (Within-Run):
Statistics were calculated for samples
from the results of 20 pairs of tubes in a
single assay. (See “Intraassay Precision”
table.)
Interassay Precision (Run-to-Run):
Statistics were calculated for samples
from the results of pairs of tubes in 20
different assays. (See “Interassay
Precision” table.)
Specificity: The Coat-A-Count FSH IRMA
antiserum is highly specific for FSH, with
low crossreactivity to structurally related
glycoprotein hormones such as HCG, LH
and TSH.
Linearity: Samples were assayed under
various dilutions. (See "Linearity" table for
representative data.)
End-of-Run Effect: none up to
approximately 300 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.)
Recovery: Samples spiked 1 to 19 with
three FSH solutions (185, 370, and
575 mIU/mL) were assayed. (See
"Recovery" table for representative data.)
Bilirubin: Presence of bilirubin in
concentrations up to 200 mg/L has no
effect on results, within the precision of the
assay.
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 30 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
Alternate Sample Type: To assess the
effect of alternate sample types, blood
was collected from 41 volunteers into
plain, heparinized, EDTA and Becton
®
Dickinson SST vacutainer tubes. All
samples were assayed by the Coat-ACount FSH IRMA procedure, with the
following results.
(EDTA) = 0.96 (Serum) + 0.0 mIU/mL
r = 0.9995
(Heparin) = 1.03 (Serum) – 0.2 mIU/mL
r = 0.999
(SST) = 1.02 (Plain Tubes) – 0.2 mIU/mL
r = 0.999
Means:
8.0 mIU/mL (Serum)
8.1 mIU/mL (Heparin)
7.7 mIU/mL (EDTA)
8.0 mIU/mL (SST)
Method Comparison: The Coat-A-Count
FSH IRMA procedure was compared to
8
IMMULITE FSH on 37 patient samples
with FSH concentrations ranging from
approximately 1 to 86 mIU/mL. (See
graph) By linear regression:
(CAC IRMA) = 1.00 (IML) – 0.02 mIU/mL
r = 0.993
Means
26.5 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA)
26.5 mIU/mL (IMMULITE)
References
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model for validation of radioimmunoassay kit
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the collection of diagnostic blood specimens by
venipuncture; approved standard. 4th ed.
NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS,
1998.
Technical Assistance
In the United States, contact Siemens
Healthcare Diagnostics Technical
Services department. Tel: 877.229.3711.
To place an order: Tel: 800.255.3232.
Outside the United States, contact your
National Distributor.
Intraassay Precision (mIU/mL)
Mean1
www.siemens.com/diagnostics
The Quality System of Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
SD2
CV3
1
1.6
0.06
3.8%
2
4.5
0.10
2.2%
3
10
0.24
2.4%
4
27
0.64
2.4%
5
73
2.8
3.8%
Tables and Graphs
Interassay Precision (mIU/mL)
Mean1
Example Run
Tube1
T
7
Duplicate Average
CPM2
CPM3
Net
CPM4
Percent FSH
Bound5 mIU/mL6
293,323
293,535
293,746
SD2
CV3
1
4.6
0.26
5.7%
2
6.1
0.28
4.6%
3
11
0.44
4.0%
4
13
0.74
5.7%
5
25
1.2
4.8%
6
38
1.9
5.0%
A
8
(NSB)
550
525
B
2,138
2,185
2,162
1,624
2.9%
1.5
C
5,690
5,635
5,663
5,125
9.0%
5
D
14,239
14,617
14,428
13,891
24%
15
E
26,547
26,090
26,319
25,781
45%
30
—
1.8
—
—
F
40,745
41,112
40,929
40,391
71%
60
A
12
11
109%
G
9
("MB")
57,584
57,259
B
21
21
100%
57,422
56,884
100%
100
C
29
31
94%
—
2.1
—
—
A
11
11
100%
538
0
—
0
Solution1 Observed2 Expected3 % O/E4
10
Unknowns
5,167
5,016
5,092
4,554
8.0%
4.4
X2
11,484
11,862
11,673
11,136
20%
12
X3
21,557
21,755
21,656
21,119
37%
24
27,474
27,239
1
2
X1
X4
Recovery (mIU/mL)
27,357
26,819
Quality Control Parameters:
T7 = 293,535 cpm
%NSB8 = 0.2%
%MB9 = 19%
47%
3
32
11
4
B
21
21
100%
C
29
31
94%
—
2.2
—
—
A
11
11
100%
B
20
21
95%
C
28
31
90%
—
2.4
—
—
A
12
12
100%
B
21
21
100%
C
30
31
97%
9
Linearity (mIU/mL)
Dilution
1
2
3
4
5
1
Method Comparison
2
Observed Expected
3
4
%O/E
16 in 165
24
—
—
8 in 16
13
12
108%
4 in 16
6.2
6.0
103%
2 in 16
2.9
3.0
97%
1 in 16
1.6
1.5
107%
16 in 16
36
—
—
8 in 16
19
18
106%
4 in 16
8.8
9.1
97%
2 in 16
4.7
4.5
104%
1 in 16
2.4
2.3
104%
32 in 32
48
—
—
16 in 32
24
24
100%
8 in 32
12
12
100%
4 in 32
5.9
6.0
98%
2 in 32
2.8
3.0
93%
1 in 32
1.5
1.5
100%
32 in 32
68
—
—
16 in 32
32
34
94%
8 in 32
17
17
100%
4 in 32
8.4
8.5
99%
2 in 32
4.0
4.3
93%
1 in 32
1.9
2.1
90%
32 in 32
76
—
—
16 in 32
39
38
102%
8 in 32
19
19
100%
4 in 32
9.0
9.5
95%
2 in 32
4.4
4.8
92%
1 in 32
2.2
2.4
92%
End-of-Run Effect (mIU/mL)
Tubes1
34-45
Tubes
116-127
Tubes
174-185
Tubes
290-301
Tubes
348-359
1
1.6
1.5
1.5
1.5
1.5
2
6.0
5.9
5.7
6.0
5.9
3
8.8
8.5
8.3
8.6
8.0
4
14
13
13
14
13
5
25
25
23
24
24
6
39
37
38
38
38
10
(CAC IRMA) = 1.00 (IML) – 0.02 mIU/mL
r = 0.993
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6FSH, mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB,
10
Unbekannte, 11Qualitätskontrollparameter.
Intraassay Precision: 1Mittelwert, 2SD
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Interassay Precision:
1
Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Linearity: 1Verdünnung,
2
Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E, 516 in
16. Recovery: 1Lösung, 2Beobachtet (B),
3
Erwartet (E), 4% B/E. End-of-Run-Effect:
1
Tubes.
Español. Ejemplo de ejecución: 1Tubo,
2
Duplicado de CPM, 3Promedio de CPM, 4 CPM
Netas, 5Porcentaje de Uniones, 6FSH, mIU/mL,
7
Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconocido,
11
Parámetros del control de calidad. Intraassay
Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Interassay
Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Linearity: 1
Dilución, 2Observado (O), 3Esperado (E),
4
%O/E, 516 en 16. Recovery: 1Solución,
2
Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E. End-ofRun-Effect: 1Tubos.
Français. Exemple de série: 1Tube, 2Doublet,
3
Moyenne cpm, 4 cpm corrigé, 5Pourcentage
liaison, 6FSH, mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB,
10
Patients, 11Paramètres Contrôle de Qualité.
Intraassay Precision: 1Moyenne, 2SD, 3CV.
Interassay Precision: 1Moyenne, 2SD, 3CV.
Linearity: 1Dilution, 2Observé (O), 3Attendu (A),
4
%O/A, 516 dans 16. Recovery: 1Solution,
2
Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A. End-ofRun-Effect: 1Tubes.
Italiano. Example Run: 1Provetta, 2CPM del
Duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netto,
5
Percentuale di Legato, 6FSH, mIU/mL, 7Totale,
8
%NSB, 9%MB, 10non noti, 11Parametri per il
Controllo di Qualità. Intraassay Precision:
1
Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV
(Coefficiente di Variazione). Interassay
Precision: 1Media, 2SD (Deviazione Standard),
3
CV (Coefficiente di Variazione). Linearity:
1
Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A,
5
16 in 16. Recovery: 1Soluzione, 2Osservato
(O), 3Atteso (A), 4%O/A. End-of-Run-Effect:
1
Provette.
Português. Série de Exemplo: 1Tubo, 2 CPM
Duplicada, 3 CPM Média, 4CPM Líquida,
5
Percentagem de Ligação, 6FSH, mIU/mL,
7
Total, 8%NSB, 9%MB, 10Amostras
Desconhecidas, 11Parâmetros do controlo de
qualidade. Intraassay Precision: 1Média,
2
Desvio padrão, 3Coeficiente de variação.
Interassay Precision: 1Média, 2Desvio padrão,
3
Coeficiente de variação. Linearity: 1Diluição,
2
Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E, 516 em
16. Recovery: 1Solução, 2Observado (O),
3
Esperado (E), 4%O/E. End-of-Run-Effect:
1
Tubos.
Deutsch
Anwendung: Der Coat-A-Count FSH
IRMA ist ein immunradiometrischer Assay
zur quantitativen Bestimmung des
follikelstimulierenden Hormons (FSH,
Follitropin) im Serum. Der Assay ist
ausschließlich in der In-Vitro Diagnostik im
Zusammenhang mit der Diagnose und
Therapie hypophysärer und gonadaler
Erkrankungen einzusetzen.
Artikelnummern: IKFS1 (100 Tests),
IKFS2 (200 Tests)
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 20 Microcurie
125
(740 Kilobequerel) an Ipolyklonalen Anti-FSH; und die Packung
mit 200 Röhrchen enthält weniger als 40
Microcurie (1 480 Kilobecquerel).
Klinische Relevanz
Follikelstimulierendes Hormon (Follitropin,
FSH) wird durch die ß-Zellen des vorderen
Hypophysenlappens sezerniert und
unterliegt der Kontrolle durch das
Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH)
des Hypothalamus. Es ist ein Glykoprotein
mit einem Molekulargewicht von ca.
28 000 und besteht aus zwei Polypeptid
Ketten, Alpha und Beta. Die Alpha-Ketten
von FSH, LH, TSH und HCG sind
biochemisch identisch, während die BetaKetten biochemisch verschieden sind und
für die biologische und immunologische
Spezifität verantwortlich sind. Die
Bioaktivität wird ebenfalls durch die BetaKette bestimmt.
FSH ermöglicht die Entwicklung und
Erhaltung des gonadalen Gewebes, das
die Steroidhormone synthetisiert und
freisetzt. Die zirkulierenden FSH-Spiegel
werden durch die Steroidhormone über
einen negativen Rückkopplungsmechanismus auf den Hypothalamus
gesteuert. Obwohl FSH und LH zur
normalen sexuellen Funktion beider
Geschlechter erforderlich sind, zeigen sich
erhebliche Unterschiede im sekretorischen
Muster für Männer und Frauen. FSH und
LH werden beim geschlechtsreifen
Erwachsenen nicht in konstanter Menge
sezerniert, sondern pulsatil ausgeschüttet,
was zu schnellen Veränderungen der
Werte innerhalb des Referenzbereichs
führt (z. B. Anstieg bzw. Abfall um 50 bis
100%). Aufgrund der pulsatilen Sekretion
können Proben eines Patienten vom
gleichen Tag deutliche
Konzentrationsunterschiede innerhalb des
Referenzbereiches aufweisen, welche die
physiologische Variation widerspiegeln
und nicht auf Fehler in der Technologie
oder der Durchführung zurückzuführen
sind.
Bei Frauen im fertilen Alter, initiiert das
FSH das Wachstum und die Entwicklung
ovarieller Follikel. Während der Ovulation,
nach dem Aufbrechen des Follikels,
produziert der Follikel, jetzt Corpus
luteum, Östradiol und Progesteron. Diese
beiden Hormone regulieren die
zirkulierenden FSH-Spiegel über eine
negative Rückkopplung auf den
Hypothalamus. In der Menopause kommt
es auf Grund der verringerten ovariellen
Funktion zu einer merklichen
Abschwächung der Östradiol-Freisetzung.
Das Fehlen einer Östradiol gesteuerten
negativen Rückkopplung, verursacht
einen beträchtlichen Anstieg der FSHKonzentrationen.
Beim erwachsenen Mann ist das FSH
assoziiert mit der Stimulation und
Aufrechterhaltung der Spermatogenese.
Testosteron und Östradiol haben die
Aufgabe das negative
Rückkopplungssignal zum Hypothalamus
zu unterstützen, um die Freisetzung des
FSH zu kontrollieren. Die Infertilität bei
Männern kann in einem Hypogonadismus
begründet sein, der auf primäre testikuläre
Störungen zurückzuführen ist.
11
Testikulären Störungen können
funktionelle Störungen in der Reifung zu
Grunde liegen. Aber auch die Zerstörung
von Keimzellen kann zu gleichen
Symptomen führen. Was auch immer die
ätiologische Ursache ist, Hypogonadismus
führt im Ergebnis zu einem dramatischen
Anstieg der messbaren FSHKonzentrationen, da der negative
Rückkopplungseffekt nicht greifen kann.
Es gibt auch andere testikuläre
Erkrankungen, die mit niedrigen FSH
Konzentrationen einhergehen, welche
durch verminderte GonadotropinProduktion verursacht sind und ein
Indikator für Erkrankungen des
Hypothalamus oder der Hypophyse sind.
Radioaktivität wird in einem GammaCounter gemessen. Die FSH
Konzentration in der Patientenprobe wird
durch den Vergleich der gemessenen
Counts pro Minute mit denen der
mitgelieferten Standards unterschiedlicher
Konzentration ermittelt.
Eine Dysfunktion der Hypophyse steht oft
in kausalem Zusammenhang mit einer
sekundären Erkrankung der Gonaden.
Dies führt zu einer verminderten Sekretion
von FSH und LH mit dem Resultat der
Infertilität bei Mann und Frau. Der gleiche
Effekt kann bei Erkrankungen des
Zentralnervensystems und nach der Gabe
von Antidepressiva, wie Phenotiazinen
beobachtet werden.
Zur In-vitro-Diagnostik.
Methodik
Der Coat-A-Count FSH IRMA ist ein
Festphasen immunradiometrischer Assay
(beschichtete Röhrchen) mit
monoklonalen und polyklonalen anti-FSH
125
Antikörpern: I-markierte polyklonale
anti-FSH Antikörper liegen in der flüssigen
Phase vor und monoklonale anti-FSH
Antikörper sind auf der Wand eines
Röhrchens immobilisiert.
Testablauf:
FSH wird zwischen den auf der Wand
eines Polystyrolröhrchens immobilisierten
monoklonalen anti-FSH Antikörpern und
dem radioaktiv markierten polyklonalen
anti-FSH Tracer gebunden.
125
Ungebundene I-markierte anti-FSH
Antikörper werden durch Dekantieren des
Reaktionsgemisches und anschließendem
Waschen der Röhrchen entfernt; dies
reduziert die unspezifischen Bindungen
sehr stark und gewährleistet eine
exzellente Präzision bei niedrigen
Konzentrationen.
Die FSH Konzentration ist der nach dem
Waschen im Röhrchen verbliebenen
Radioaktivität direkt proportional. Die
12
Zu pipettierende Reagenzien: 1
Gesamtinkubationszeit: 1 Stunde (auf
einem Schüttler)
Totalaktivität zum Zeitpunkt der
Markierung: ca. 300 000 cpm
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Einige Komponenten des Kits können
Material humanen Ursprungs und/oder in
anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe
enthalten, die es unbedingt notwendig
machen, die folgenden
Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten:
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um
die Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
Die Standards enthalten 0, 1,5; 5; 15; 30;
60 und 100 mIU/ml FSH kalibriert an der
“World Health Organization's Second
International Reference Preparation” für
hypophysäres FSH, 78/549 (2nd IRP
78/549).
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Gepufferte Waschlösung, Konzentrat
(1TSBW)
40 ml einer konzentrierten gepufferten
Salzlösung mit Detergenz und
Natriumazid als Konservierungsmittel.
Unter Zuhilfenahme eines Transferbehälters jede Flasche Konzentrat mit
400 ml destilliertem Wasser lösen, das
Endvolumen beträgt 440 ml. Bei 2–8°C für
6 Monate nach Zubereitung stabil
IKFS1: 1 Flasche á 40 ml.
IKFS2: 2 Flaschen á 40 ml.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall
sind unter Beachtung der gültigen
Richtlinien zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
FSH Antikörper-beschichtete Röhrchen
(IFS1)
Polystyrolröhrchen beschichtet mit
monoklonalen FSH Antikörpern von der
Maus, verpackt in wiederverschließbaren
Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor
Feuchtigkeit schützen und nach dem
Öffnen wieder sorgfältig verschließen.
Lagerung bei 2–8°C bis zum
Verfallsdatum.
IKFS1: 100 Röhrchen.
IKFS2: 200 Röhrchen.
125
I FSH Antikörper (IFS2)
Jodierte polyklonale anti-FSH Antikörper
von der Ziege, mit Konservierungsmitteln.
Das Reagenz wird gebrauchsfertig in
flüssiger Form geliefert. Jede Flasche
enthält 5,5 ml. Bei 2–8°C für 30 Tage
nach dem Auflösen haltbar oder bis zum
Verfallsdatum auf der Flasche.
IKFS1: 2 Flaschen. IKFS2: 4 Flaschen.
FSH Standards (FSI3 – 9)
7 Flaschen, A–G, mit FSH in einer
nichthumanen Serum/Puffer-Matrix mit
Konservierungsmitteln, gebrauchsfertig.
Der Nullstandard (A) enthält 5,0 ml
während die Standards B–G je 2,0 ml
enthalten. Bei 2–8°C bis 30 Tage nach
dem Öffnen haltbar. Für längere Lagerung
bei –20°C portioniert tiefgefrieren: bei
–20°C bis 6 Monate haltbar.
IKFS1: 1 Set. IKFS2: 1 Set.
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gammacounter – kompatibel mit
12x75 mm Röhrchen
Schüttler - ca. 200 Zyklen pro Minute
einstellen.
Reagenzienvorbereitung
Destilliertes oder entionisiertes Wasser
Messzylinder – zum Abmessen von
400 ml
Plastikbehälter mit Verschluss – zur
Herstellung und Lagerung der gepufferten
Waschlösung.
Immunoassay
Micropipetten: 100 µl
Dispenser – Für die Zugabe von 2,0 ml
der gepufferten Waschlösung.
Dekantierständer – erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
FDR).
Logarithmisches Papier, 3 Dekaden
Immunoassay-Kontrollen (mehrere
Parameter, 3 Konzentrationen)
(Artikelnummer: CON6).
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
13
Venenpunktion in Röhrchen ohne
Zusätze, Trennung des Serums von den
Blutzellen, Abnahmezeitpunkt notieren.
13
Der Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur
Klärung von lipämischen Proben
empfohlen.
Bei hämolysierten Proben besteht die
Möglichkeit einer unsachgemäßen
Handhabung vor Eintreffen im Labor,
daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu
interpretieren.
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count IRMA
FSH sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
Details der getesteten Röhrchenarten sind
dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu
entnehmen.
2
3
Der Coat-A-Count FSH IRMA hat einen
Messbereich von bis zu 100 mIU/ml. Alle
Proben mit Konzentrationen oberhalb des
Messbereiches müssen vor der Messung
mit 0-Standard verdünnt werden, damit
das Messsignal innerhalb des
Standardkurvenbereichs fällt.
Beschichtete Röhrchen: Jeweils 2
FSH-Antikörper-beschichtete
Röhrchen mit A (unspezifische
Bindung, 0-Standard) und von B bis G
(Maximalbindung) beschriften. Jeweils
2 weitere Antikörper-beschichtete
Röhrchen für Kontrollen und
Patientenproben beschriften.
—
0
B
1,5
C
5
D
15
E
30
F
60
G ("MB")
100
Jeweils 100 µl der Standards,
Kontrollen und Patientenproben in die
vorbereiteten Röhrchen pipettieren.
In jedes Röhrchen 100 µl
Antikörper pipettieren.
125
I FSH
Direkt auf den Boden pipettieren.
Vergewissern Sie sich, dass Probe
und Tracer gut gemischt sind. Die
Verwendung eines Dispensers wird
empfohlen. Die T-Röhrchen bis zur
Messung (siehe Schritt 6) beiseite
stellen; sie bedürfen keiner weiteren
Behandlung.
Testdurchführung
1
T*
A (NSB)
Direkt auf den Boden des
Röhrchens pipettieren.
Patientenproben mit Konzentrationen
oberhalb des Messbereichs bis
100 mIU/ml müssen vor der Messung
mit 0-Standard verdünnt werden. Um
Verschleppung zu vermeiden, wird die
Verwendung von Einmal-Pipettenspitzen empfohlen. Verdrängungspipetten, sowie automatische PipettorDilutoren sollten nur verwendet
werden, wenn eine mögliche
Verschleppung untersucht und für
vernachlässigbar befunden wurde.
Lagerung: 2–8°C für 2 Tage, oder
2 Monaten bei –20°C.
Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
mIU/ml
WHO 2nd IRP 78/549
* Optional
Erforderliche Menge: 100 µl pro
Röhrchen
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15–28°C) bringen und
vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes
Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei
Bedarf portionieren. Gefrorene Proben
dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad
aufgetaut werden.
Standards
4
60 Minuten auf einem Schüttler
inkubieren.
5
Vollständig dekantieren. 2 ml
gepufferte Waschlösung in jedes
Röhrchen geben, 1–2 Minuten stehen
lassen, dann erneut vollständig
dekantieren. Nochmals 2 ml
gepufferte Waschlösung in jedes
Röhrchen geben, 1–2 Minuten stehen
lassen, dann erneut vollständig
dekantieren.
Vollständiges Entfernen der
Flüssigkeit verbessert die Präzision
deutlich. Nach dem 2. Waschgang,
14
mit Hilfe eines Dekantierständers alle
Röhrchen (außer die T-Röhrchen)
dekantieren und 2–3 Minuten umgedreht stehen lassen. Anschließend
werden die Röhrchen kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um alle restlichen
Tröpfchen zu entfernen.
6
Alle Röhrchen 1 Minute im GammaCounter messen.
In Mehrkanal-Gamma-Countern
sollten die T-Röhrchen mindestens 1
Position Abstand von den übrigen
Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden.
Berechnung der Ergebnisse
Um die Konzentrationen aus der Log-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen
werden zunächst der Mittelwert jedes
Röhrchenpaars, bereinigt um den
Mittelwert der NSB (Standard A) Counts
pro Minute (cpm) berechnet:
Netto CPM = Mittelwert CPM minus Mittelwert
NSB CPM
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB, Bmax) bestimmt
(%B/MB). Hierzu werden die mittleren
CPM des G-Standards korrigiert um die
mittlere NSB als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
Die Prozentbindungen der Standards
werden gegen die Konzentration auf
Logarithmenpapier mit je 3 Dekaden
aufgetragen und durch eine Kurve mit
bestmöglicher Annäherung an diese
Punkte verbunden. (Die einzelnen
Standardpunkte sollten jeweils mit einem
Bogen oder einer geraden Linie aber nicht
durch eine gerade Linie durch alle Punkte
verbunden werden.) FSH Konzentrationen
innerhalb des KonzentratioNSBereichs
der Standards können an der Kurve durch
Interpolation abgelesen werden. Die
Prozentbindungen der drei niedrigsten
Standards können zusätzlich auf linearem
Papier gegen die Konzentration
aufgetragen werden, um durch
Interpolation Ergebnisse in der Nähe von
0 genauer zu ermitteln.
Hinweis: Obwohl auch andere Verfahren
akzeptabel sind, hat die beschriebene
Berechnung der Daten Vorteile im Sinne
der Qualitätskontrolle. Man erhält eine
Standardkurve, die sowohl in der Log-Log,
als auch in der Lin-Lin Darstellung
weitgehend linear verläuft und sich von
Ansatz zu Ansatz nur wenig verändert.
Man erhält so auch wichtige Parameter für
die Qualitätskontrolle wie die
Prozentbindungen der Standards mit
Konzentrationen ungleich 0 (%B/Bmax oder
"%B/MB"). Mehr Informationen über die
Intra-Assay-Präzsion als Funktion der
Konzentration vermittelt die direkte
Darstellung der Prozentbindung jedes
einzelnen Standard-röhrchens und nicht
des Mittelwertes.
Alternative Berechnung: Obwohl die
Berechnung der Prozentbindung auch
direkt aus dem Mittelwert der CPM
erfolgen kann, führt die Korrektur um die
NSB normalerweise eher zu einer über
den gesamten Messbereich linear
verlaufenden Kurve. Eine Standardkurve
kann auch durch das direkte Auftragen
der CPM, bzw. mittleren CPM gegen die
Konzentration auf Log-Log oder Lin-Lin
Papier erstellt werden.
(Halblogarithmisches Papier sollte nicht
verwendet werden.) Dieses Verfahren ist
zwar einfacher, aber weniger hilfreich für
die Qualitätskontrolle von Lauf zu Lauf.
Computergestützte Berechnung:
"Punkt-zu-Punkt" Methoden,
iNSBesondere lineare und kubische-spline
Berechnungen können für den Coat-ACount FSH IRMA angewendet werden.
Auch wenn die Berechnung durch ein
Computer-programm erfolgt, ist die
grafische Log-Log Darstellung der
Standardkurve (manuell oder automatisch)
als ein weiterer Schritt der
Qualitätskontrolle empfehlenswert. Für die
Berechnung der Daten sind auch sog.
logistische Verfahren anwendbar. Aus
dieser Gruppe sind die 4- oder 5Parameter Logistik am besten geeignet.
Es ist zu berück-sichtigen, dass manche
der üblichen Algorithmen sich nicht
erfolgreich annähern, selbst wenn
logistische Modelle die Daten richtig
erfassen. Wird ein logistisches Verfahren
angenommen, ist es in jedem Fall
erforderlich, die Korrek-theit des täglichen
Ansatzes mit Hilfe der Rückberechnung
der Standards und anderer Parameter zu
beurteilen. Zusätz-lich wird die grafische
Darstellung in Log-Log-Form empfohlen,
da diese mehr Informationen bietet als die
15
konventionelle halblogarithmische
Darstellung.
Proben-Handhabung: Die Anweisungen
zur Handhabung und Lagerung von
Proben und Komponenten müssen
beachtet werden. Patientenproben mit
erwarteten Konzentrationen über dem
höchsten Standard (100 mIU/ml) müssen
vor dem Einsatz in den Test mit 0Standard verdünnt werden. Alle Proben,
inklusive Standards und Kontrollen, sollten
in Doppelbestimmung gemessen werden.
Um Verschleppung zu vermeiden ist es
wichtig, Pipetten mit Einwegspitzen zu
verwenden und diese zwischen den
Proben zu wechseln. Verdrängungspipetten, sowie automatische PipettorDilutoren sollten nur verwendet werden,
wenn eine mögliche Verschleppung
untersucht und für vernachlässigbar befunden wurde. Kontrollpaare sollten an
verschiedenen Stellen des Testansatzes
platziert werden, um eine eventuelle Drift
zu erkennen. Die Einzelergebnisse der
Duplikate sollten auf Übereinstimmung
überprüft und Verschleppung von Probe
zu Probe vermieden.
Gamma Counter: In Mehrkanal-GammaCountern sollten die T-Röhrchen
mindestens 1 Position Abstand von den
übrigen Teströhrchen haben, um ein
“Spillover” zu vermeiden. Alternativ
können auch nur 25 µl in die Röhrchen mit
der Totalaktivität im Schritt 3 pipettiert und
anschließend die CPM mit dem Faktor 4
multipliziert werden.
Kontrollen: Kontrollen mit mindestens 2
FSH Konzentrationen (niedrig und hoch)
sollten routinemäßig als unbekannte
Proben eingesetzt und von Tag zu Tag
protokolliert werden.
Wiederholungsmessungen von Proben
sind ein wertvolles Hilfsmittel in der
Beurteilung der Interassay Präzsion.
Qualitätskontroll-Parameter: Es wird
empfohlen die folgenden Parameter zu
protokollieren:
T = Total Counts (als counts pro minute)
%NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Netto MB Counts / Total Counts)
Und die Prozentbindungen (%B/Bmax oder
"%B/MB") aller Standards mit Ausnahme
des höchsten Standards, zum Beispiel:
%C/MB = 100 × (Netto Calibrator "C" Counts /
Netto MB Counts)
Aufzeichnungen: Es ist gute Laborpraxis
die Chargennummern, das Datum der
ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der
verwendeten Komponenten, sowie
Kontrollergebnisse und
Qualitätskontrollparameter zu
protokollieren.
Literatur: Siehe auch: Dudley RA, et al.
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet, Werte aus einem anderen
Testansatz damit zu ermitteln. (Siehe
“Example Run” Tabelle)
Referenzwerte
Es wurden an zwei Instituten Proben von
Gesunden mit dem Coat-A-Count FSH
IRMA gemessen, der an dem WHO 2nd
IRP 78/549 Standard kalibriert ist.
Median 95% Bereich
mIU/ml
mIU/ml
FSH
Männer
3,9
n
1,1 – 13,5*
16
38
Frauen
Follikelphase
5,0
3,3 – 8,8
Mittelzyklus
10,1
5,4 – 20*
10
Lutealphase
3,1
1,6 – 8,7
45
Orale
Kontrazeptiva
1,3
NN – 4,6*
12
postmenopausal
73
42 – 126*
12
postmenopausal,
unter Östrogensubstitution
27
9,5 – 113*
16
0,9
0,1 – 3,4*
14
Prepubertal
(1–13 Jahre)
NN: Nicht nachweisbar
* Absolutbereich
Die genannten Bereiche sind als
Richtwerte zu interpretieren. Jedes Labor
sollte seine eigenen Referenzbereiche
etablieren.
Grenzen der Methode
In bestimmten Fällen der Infertilität kann
die Behandlung mit menschlichen
16
Gonadotropinen ein potentielles Problem
für die genaue Messung der FSH-Spiegel
darstellen. Das zugegebene FSH kann
eine FSH-Antikörperbildung im Patienten
hervorrufen. Dies kann eine Störung des
Assays bewirken.
Daten entnehmen Sie bitte der Tabelle
„Recovery“.)
Aufgrund der pulsatilen Sekretion des LH
können Proben, die am gleichen Tag vom
gleichen Patienten stammen, innerhalb
des Referenzbereiches deutlich
schwanken. Dies entspricht der
physiologischen Variabilität des LH.
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml
keinen Einfluss auf die Messung, der
größer als die Impräzision des Assays
selbst ist.
Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen
von bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die
Ergebnisse, der größer als die
Unpräzision des Assays selbst ist.
Siehe Tabellen und Grafiken mit
repräsentativen Daten für den Assay. Die
Ergebnisse sind in mIU/ml angegeben,
kalibriert an der World Health
Reference Preparation für hypophsäres
FSH, 78/549 (2nd IRP 78/549).
Alternativer Probentyp: Um die
Auswirkungen von verschiedenen
Probenarten zu untersuchen, wurde Blut
von 41 Freiwilligen in Röhrchen ohne
Additiva, in Heparin-, EDTA- und Becton
®
Dickinson SST Vacutainer-Rörchen
gesammelt. Alle Proben wurden mit dem
Coat-A-Count IRMA FSH Assay mit den
nachfolgend aufgeführten Ergebnissen
bestimmt.
Messbereich: Bis 100 mIU/ml
(WHO 2nd IRP 78/549).
(EDTA) = 0,96 (Serum) + 0,0 mIU/ml
r = 0,9995
Analytische Sensitivität: 0,06 mIU/ml,
(Heparin) = 1,03 (Serum) – 0,2 mIU/ml
r = 0,999
Leistungsdaten
High-Dose-Hook-Effect: Tritt bis zu einer
Konzentration von 10 000 mIU/ml nicht
auf.
Intraassay-Präzision Statistische
Berechnung der Ergebnisse von 3
Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in
einem Ansatz gemessen wurden. (Siehe
Tabelle “Intraassay Precision”.)
Interassay-Präzision Statistische
Berechnung der Ergebnisse von 3
Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in
mehreren Ansätzen gemessen wurden.
(Siehe Tabelle “Interassay Precision”.)
Spezifität: Das im Coat-A-Count FSH
IRMA verwendete Antiserum ist
hochspezifisch für FSH, mit niedriger
Kreuzreaktivität zu strukturell ähnlichen
Glykoprotein-Hormonen wie HCG, LH und
TSH.
Linearität: Proben wurden in
verschiedenen Verdünnungen getestet.
(Repräsentative Daten entnehmen Sie
bitte der Tabelle „Linearität“.)
End-of-Run Effect: Tritt bis ca.
300 Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle
"End-of-Run Effect".)
Wiederfindung: Proben wurden 1:20 mit
FSH Lösungen (185, 370 und 575 mIU/ml)
versetzt und gemessen. (Repräsentative
(SST) = 1,02 (einfachen Röhrchen) – 0,2 mIU/ml
r = 0,999
Mittelwerte:
8,0 mIU/ml (Serum)
8,1 mIU/ml (Heparin)
7,7 mIU/ml (EDTA)
8,0 mIU/ml (SST)
Methodenvergleich: Der Coat-A-Count
FSH IRMA wurde mit dem IMMULITE
FSH Assay an 37 Patientenseren mit
FSH-Konzentrationen von ca. 1 bis 86
mIU/ml verglichen. (Siehe Grafik) Durch
lineare Regression:
(CAC IRMA) = 1,00 (IML) – 0,02 mIU/ml
r = 0,993
Mittelwert
26,5 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA)
26,5 mIU/ml (IMMULITE)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
17
Español
Utilidad del análisis: Coat-A-Count FSH
IRMA es un ensayo inmunométrico
diseñado para medir cuantitativamente la
estimulación hormonal del folículo (FSH)
en suero. De uso exclusivo para el
diagnóstico in vitro, como ayuda en el
diagnóstico y el tratamiento de los
desórdenes gonadales e hipofisarios.
Referencia: IKFS1 (100 tubos),
IKFS2 (200 tubos)
El Kit de 100 tubos contiene
menos de 20 microcurios
125
(740 kilobecquerelios) de I antiFSH policlonal; el Kit de 200-tubos
contiene menos de 40 microcurios
(1 480 kilobecquerelios).
Resumen y Explicación del
Test
La hormona estimuladora del folículo
(FSH) es secretada por las células β de la
hipófisis anterior bajo el control de la
hormona liberadora de gonadotropina
producida en el hipotálamo. Es una
glicoproteína con un peso molecular de
aproximadamente 28 000, que consiste
en dos cadenas polipeptídicas
denominadas alfa y beta. Las cadenas
alfa de la FSH, LH, TSH y HCG son
bioquímicamente idénticas, mientras las
cadenas beta son bioquímicamente
exclusivas y confieren especificidad
biológica e inmunológica. La bioactividad
también se determina en la cadena beta.
La FSH posibilita el desarrollo y
mantenimiento de los tejidos gonadales,
que sintetizan y secretan hormonas
esteroideas. Los niveles circulantes de
FSH están controlados mediante un
feedback negativo sobre el hipotálamo por
las hormonas esteroideas. Aunque la FSH
y la LH se requieren para una función
sexual normal tanto en hombres como en
mujeres, los patrones de secreción son
muy diferentes en los sexos. En adultos
sexualmente maduros, FSH y LH no son
secretados en cantidades constantes; de
hecho, la secreción tiene lugar en pulsos
que resultan en rápidas fluctuaciones de
todos los rangos de referencia (ej., arriba
18
o abajo entre el 50 y el 100%). Debido a
esta secreción pulsátil, las muestras
obtenidas en el mismo día y del mismo
paciente pueden fluctuar ampliamente
dentro del rango de referencia, reflejando
variaciones fisiológicas más que errores
de la técnica o metodología.
En mujeres sexualmente maduras, la FSH
inicia el crecimiento y desarrollo de los
folículos ováricos. Durante la ovulación,
cuando el folículo se rompe, el folículo,
ahora llamado cuerpo lúteo, secreta
estradiol y progesterona, que controlan
los niveles circulantes de FSH mediante
un feedback negativo sobre el hipotálamo.
En la menopausia, con la función ovárica
disminuida, hay un decremento resultante
de la secreción de estradiol. Debido a la
carencia de un mecanismo feedback
negativo, con el estradiol disminuido, los
niveles de FSH se elevan de modo
significativo.
En hombres sexualmente maduros, la
FSH está asociada con la estimulación y
el mantenimiento de la espermatogénesis.
La testosterona y el estradiol tienen el
papel de proporcionar un feedback
negativo al hipotálamo para controlar la
liberación de FSH. La infertilidad en
hombres puede ser debido al
hipogonadismo como resultado de una
falla testicular primaria. La falla testicular
puede ser una falla funcional a maduros o
un resultado de daño a células de
germen. De cualquier forma, las
condiciones de hipogonadismo tienen el
benéfico resultado de elevar los niveles
de FSH circulantes, debido a la falta de un
feedback negativo. Existen otros
desórdenes testiculares, los cuales
demuestran niveles bajos de FSH, pero
estos son probablemente debido a la
producción insuficiente de gonadotropina
y son indicativos de disfunción pituitaria o
hipotalámica.
La disfunción pituitaria es comúnmente un
agente causante de falla gonadal
secundaria. Esto resultará en decremento
de secreción de ambas, FSH y LH. El
efecto neto en ambos, hombres y
mujeres, es la infertilidad. Esto también se
observa con desórdenes del sistema
nervioso central y después de la
administración de ciertas drogas
sedantes, así como las fenotiazidas.
Principio del análisis
Coat-A-Count FSH IRMA es un ensayo
inmunométrico en fase sólida basado en
anticuerpos monoclonales y policlonales
FSH: anticuerpo policlonal en fase líquida
125
anti-FSH marcado con I- y anticuerpo
monoclonal anti-FSH inmovilizado a las
paredes del tubo de polipropileno.
En el procedimiento:
El FSH es capturado entre el anticuerpo
anti-FSH monoclonal inmovilizado en las
paredes del tubo de polipropileno y el
125
trazador policlonal marcado con I- anti–
FSH.
125
El anticuerpo marcado I suelto es
removido decantando la mezcla de
reacción y lavando el tubo; esto reduce la
unión no específica a un nivel muy bajo, y
asegura una excelente precisión.
La concentración de FSH es directamente
proporcional a la radioactividad
presentada en el tubo después del paso
de lavado. Se mide usando un contador
gama, después de ser medida la
concentración de FSH en la muestra del
paciente, es determinada por medio de la
comparación de las cuentas del paciente
por minuto con aquellas obtenidas en el
juego de calibradores provistos.
Reactivos a pipetear: 1
Tiempo total de incubación: 1 hora (en
un agitador).
Cuentas totales en la iodización:
aproximadamente 300 000 cpm
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Reactivos: Almacenar de 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radioactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesiten
ciertas precauciones:
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al HIV 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sódica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminación,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitución de residuos de
azidas metálicas, potencialmente
explosivas, en las cañerías de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada.
Radioactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
general) emitido a la aduana de los
EE.UU. se registrará en los ficheros de
Siemens Healthcare Diagnostics antes de
que se puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radioactivo. Estos
materiales radioactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radioactivos
pueden adquirirse solo por médicos,
veterinarios en la práctica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales — y estrictamente para la
clínica in vitro o tests de laboratorio que
no conlleven la administración interna o
externa de material radioactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EE.UU. o de un Estado con el NRC para
su consiguiente control.
Manejar los materiales radioactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos
radioactivos de acuerdo con los
19
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radioactivos
como residuos no radioactivos, después
de retirar las etiquetas. Licencias
específicas (NRC Form 313) se deben
referir al Título 10, Código de
Regulaciones Federales, Parte 20. Las
licencias en Estados Asociados deben
referirse a las normativas de su
correspondiente Estado. Licencias
generales pueden eliminar sus residuos
líquidos radioactivos contenidos en este
tipo de productos como cualquier otro
material líquido, quitando las etiquetas de
los contenedores y procesándolos como
residuos sólidos. Licencias específicas
pueden eliminar pequeñas cantidades de
residuos líquidos radioactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido. Refiérase a la
normativa aplicable a su laboratorio.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Tubos recubiertos de anticuerpo frente
FSH (IFS1)
Tubos de poliestireno recubiertos con un
anticuerpo monoclonal anti-FSH y
embalados en bolsas de cierre hermético.
Almacenar refrigerados y protegidos de la
condensación, cerrando cuidadosamente
las bolsas después de su uso. Estable a
2–8°C hasta la fecha de caducidad
impresa en la bolsa.
IKFS1: 100 tubos. IKFS2: 200 tubos.
125I FSH Ab (IFS2)
Anticuerpo anti-FSH de cabra policlonal
125
marcado con I, con conservante. El
reactivo se suministra en forma líquida,
listo para usar. Cada vial contiene 5,5 ml.
Estable a 2–8°C durante 30 días después
de su apertura, o hasta la fecha de
caducidad impresa en el vial.
IKFS1: 2 viales. IKFS2: 4 viales.
Calibradores de FSH (FSI3–9)
Siete viales de calibradores de FSH,
marcados A – G, en una matriz de suero
no humano y solución amortiguadora, con
conservante. Los calibradores se
suministran en forma líquida, listos para
usar. El vial A ó calibrador cero contiene
5,0 ml, mientras que el resto de
calibradores, viales B – G, contienen cada
uno 2,0 ml. Estable a 2–8°C durante 30
20
días después de su apertura. Para
almacenar por más tiempo, alicuotar y
congelar: estable a –20°C durante 6
meses.
IKFS1: 1 juego. IKFS2: 1 juego.
Los calibradores tienen valores de FSH
lote-específicos, aproximadamente: 0, 1,5,
5, 15, 30, 60 y 100 mIU/ml; en términos de
la Segunda Referencia Internacional de
Preparación de la Pituitaria FSH número
78/549 (2nd IRP 78/549) de la World
Health Organization.
Concentrado de solución
amortiguadora de lavado (1TSBW)
40 ml de una solución salina
amortiguadora concentrada, con
surfactantes, y con azida sódica como
conservante. Usando un recipiente de
transferencia, diluir los contenidos de
cada vial con 400 ml de agua destilada,
para obtener un volumen total de 440 ml.
Estable a 2–8°C durante 6 meses
después de preparar.
IKFS1: 1 vial x 40 ml.
IKFS2: 2 viales x 40 ml.
Materiales Requeridos pero no
suministrados
Contador Gamma compatible con los
tubos de 12 x 75 mm
Agitador de rack – a aproximadamente
200 movimientos por minuto.
Preparación de los reactivos
Agua destilada o desionizada
Probeta graduada – para dispensar
400 ml.
Recipiente plástico con tapa – para la
preparación y el almacenamiento de la
Solución Amortiguadora de Lavado.
Inmunoensayo
Micropipetas: 100 µl
Dispensador – para dispensar 2,0 ml de la
Solución Amortiguadora de Lavado.
Rack de espuma para decantación –
disponible en Siemens Healthcare
Diagnostics (Referencia: FDR).
Papel gráfico log-log de 3 ciclos
Control del inmunoensayo de tres niveles,
basado en suero humano, que contiene
FSH como uno de más de 25
constituyentes analizados, disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Referencia: CON6).
1
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
13
venipunción en tubos sin anticoagulante,
y separar el suero de las células
sanguíneas.
Se recomienda el uso de una
ultracentrífuga para aclarar las muestras
lipémicas.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de la muestra
antes de ser recibida por el laboratorio; en
este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. El FSH Coat-A-Count
IRMA no ha sido analizado con todos los
distintos tipos de tubos. Para obtener
detalles sobre los tipos tubos que se han
analizado, consulte la sección de Tipos de
Muestras Alternativos.
2
3
Coat-A-Count FSH IRMA tiene un rango
de trabajo de hasta 100 mIU/ml. Las
muestras que se espera contengan
mayores concentraciones que este valor
deben ser diluidas con un calibrador cero
antes del ensayo.
Todos los componentes deben llevarse a
temperatura ambiente (15–28°C) antes de
su uso.
mIU/ml
WHO 2nd IRP 78/549
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
C
5
D
15
E
30
F
60
G ("MB")
100
Pipetear 100 µl en cada calibrador,
controles y muestras de los pacientes
en sus correspondientes tubos.
Pipetear directamente en el fondo
del tubo. Las muestras que se espera
que contengan concentraciones de
FSH mayores que la del calibrador
más alto (100 mIU/ml) deberán
diluirse con el calibrador cero. Se
recomienda usar micropipetas con
puntas desechables para evitar el
arrastre de una muestra a otra. Sólo
se deberán usar pipetas de
desplazamiento positivo y equipos de
dilución automática si se ha evaluado
la posibilidad de arrastre y se ha
determinado que esta sería
insignificante.
Conservación: 2 días a 2–8°C o 2 meses
a –20°C.
Procedimiento del Ensayo
Inmunométrico
Calibradores
* Opcional
Volumen requerido: 100 µl por tubo
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente (15–
28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si
es necesario, para evitar repetir la
congelación y descongelación. No intentar
la descongelación de muestras
congeladas calentándolas en un baño de
agua.
Marcar dieciséis tubos recubiertos de
anticuerpo frente a la FSH Ab: A
(unión no específica) y B hasta G
(máxima unión) por duplicado. Marcar
tubos recubiertos de anticuerpo
adicionales, también por duplicado,
para controles y muestras de
pacientes.
Añadir 100 µl de
los tubos.
125
I FSH Ab a todos
Pipetear directamente en el fondo
del tubo. Asegurar que la muestra y
el trazador estén bien mezclados. Se
recomienda usar un dispensador de
repetición. Dejar de lado los tubos T
(opcional) para contarlos en el paso 6;
estos tubos no requieren procesado
posterior.
4
Poner en el agitador por 60 minutos.
5
Decantar completamente. Añadir 2 ml
de la Solución Amortiguadora de
Lavado a cada tubo. Esperar 1 a 2
21
minutos, luego dejar que decante
completamente. Nuevamente, añadir
2 ml de la Solución Amortiguadora de
Lavado, esperar 1 a 2 minutos y dejar
que decante completamente.
Eliminar toda la humedad visible para
mejorar la precisión. Decantar o
aspirar el contenido de todos los
tubos (excepto los tubos T) y dejar
escurrir durante 2 o 3 minutos.
Golpear los tubos contra papel
absorbente para eliminar las gotas
residuales.
6
Contar durante 1 minuto en un
contador gamma.
En contadores gamma de
multicabezas, las cuentas totales
debe hacerse por separado de los
tubos de ensayos restantes por lo
menos un espacio, para minimizar la
posibilidad de derrame.
Cálculo de resultados
Para calcular los resultados (en términos
de unidades de concentración) a partir de
la representación log-log de la curva de
calibración, corregir primero las cuentas
por minuto (CPM) de cada par de tubos,
restando la Media CPM de los tubos de
unión no específica (calibrador A).
Cuentas netas = Media CPM menos Media NSB
CPM
Luego, determinar el porcentaje de unión
(relativo al del calibrador más alto) – aquí
llamado “%B/MB” – de cada par de tubos
como un porcentaje de “unión máxima”,
tomando como 100% a las cuentas
corregidas de NSB del calibrador más
alto.
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
Usando un papel gráfico log-log de 3
ciclos, representar el Porcentaje de Unión
en función de la Concentración para cada
uno de los calibradores no cero, y trazar
una curva aproximando la trayectoria de
estos puntos. (Conectar los puntos de
calibración con arcos o segmentos rectos.
No intentar acomodar una sola recta a los
datos). Las concentraciones de los
controles y las concentraciones
desconocidas que estén dentro del rango
de los calibradores no cero pueden
entonces estimarse a partir de la curva de
22
calibración por interpolación. Además, se
puede graficar el Porcentaje de Unión en
función de la Concentración para los tres
calibradores más bajos en un papel
gráfico lineal-lineal, para interpolar cerca
de la dosis cero.
Comentarios: Si bien se pueden utilizar
otras aproximaciones, la reducción de
datos por el método recién descrito tiene
ciertas ventajas desde el punto de vista
de control de calidad. En particular, este
produce una curva de calibración que es
relativamente lineal en las
representaciones log-log y en las
representaciones lineal-lineal, y es
relativamente estable de un ensayo a
otro. También produce parámetros de
Control de Calidad valiosos,
concretamente, valores de Porcentaje de
Unión (%B/MB) para los calibradores no
cero. Incluso se puede obtener un gráfico
más informativo que expresa la
reproducibilidad intraensayo, graficando
directamente los valores de Porcentaje de
Unión de los tubos de los calibradores
individuales, es decir, sin primero
promediar las CPM de los duplicados.
Alternativas: Si bien el Porcentaje de
Unión puede calcularse directamente de
la Media CPM, la corrección de la unión
no específica generalmente produce una
curva de calibración que es más lineal en
todo su rango. También se puede obtener
una curva de calibración graficando
directamente las CPM o la Media CPM en
función de la Concentración, ya sea en
papel gráfico log-log o en papel gráfico
lineal-lineal. (No se deberá usar papel
semilogarítmico). Esta aproximación tiene
la ventaja de la simplicidad pero es menos
deseable desde el punto de vista del
control de calidad.
Reducción de los datos por ordenador:
Los métodos de “punto a punto”,
incluyendo los ajustes lineales y de spline
cúbico, son adecuados, pero, como no
son muy útiles para controlar la integridad
de un ensayo, es importante preparar el
gráfico log-log de la curva de calibración
recomendado, ya sea manualmente o por
ordenador, como un paso de control de
calidad. Las técnicas de reducción de
datos que se basan en el modelo logístico
también pueden ser aplicables. Dentro de
esta familia, las rutinas de ajuste de
curvas que se basan en la logística de 4 o
5 parámetros son las más adecuadas. Sin
embargo, algunos algoritmos que se usan
actualmente pueden no converger
exitosamente, aun cuando el modelo
logístico se cumple para los datos. Si se
adopta un método logístico, es esencial
verificar si este es apropiado para el
ensayo diario, controlando el cálculo
inverso de los calibradores y otros
parámetros. Además, una gráfica de la
curva de calibración en una
representación log-log es muy
recomendable, ya que esta es más
informativa que la gráfica semilogarítmica
convencional.
Manipulación de la muestra: Se deberá
observar cuidadosamente las
instrucciones para manipular y guardar las
muestras de los pacientes y los
componentes. Antes de analizar, diluir las
muestras de los pacientes que se espera
que contengan concentraciones de FSH
mayores que la del calibrador más alto
(100 mIU/ml) con el calibrador cero.
Todas las muestras, incluyendo los
calibradores y los controles, deberán
analizarse por lo menos por duplicado. Es
importante usar una micropipeta con
punta desechable, cambiando la punta
entre muestras para evitar la
contaminación por arrastre. Sólo se
deberán usar pipetas de desplazamiento
positivo y equipos de dilución automática
si se ha evaluado la posibilidad de
arrastre y se ha determinado que este
sería insignificante. Se pueden espaciar
tubos controles a lo largo del ensayo para
ayudar a verificar que no haya una
desviación significativa. Inspeccionar la
concordancia de los resultados entre los
pares de tubos.
Contador Gama: Para minimizar la
posibilidad de derrames en los contadores
gamas multi-well, los tubos opcionales de
cuentas totales (T) deberán separarse de
los otros tubos del análisis uno o más
espacios. Alternativamente, añadir sólo 25
µl del trazador a cada uno de los tubos T
en el paso 3, y multiplicar por 4 las
cuentas por minuto observadas en estos
tubos.
A multi-rule chart for quality control. Clin
Chem 1981;27:493-501. Las muestras
repetidas son una herramienta de valor
adicional para controlar la precisión
interensayo.
Parámetros de Control de Calidad:
Recomendamos mantener un registro de
estos parámetros de rendimiento del
análisis:
T = Cuentas totales (como cuentas por minuto)
%NSB = 100 × (Media de cuentas NSB /
Cuentas totales)
%MB = 100 × (Cuentas netas MB / Cuentas
totales)
Y de los valores de Porcentaje de Unión
(“%B/MB”) de todos los calibradores no
cero excepto por el más alto, por ejemplo:
%C/MB = 100 × (Cuentas netas del Calibrador
“C” / Cuentas netas MB)
Registro de los ensayos: Es una buena
práctica de laboratorio registrar para cada
ensayo los números de lote de los
componentes usados, así como las fechas
en las que fueron reconstituidos por
primera vez o abiertos.
Más información: Ver Dudley RA, et al.
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados.
(Ver la tabla “Example Run”)
Valores esperados
Los estudios en personas sanas fueron
realizados en instalaciones separadas
usando el kit Coat-A-Count FSH IRMA, el
cual es estandarizado en términos de la
WHO 2nd IRP 78/549.
Controles: Se deben analizar
rutinariamente controles o pools de suero
de al menos dos niveles distintos de
concentración (bajo y alto) de FSH, como
si fuesen concentraciones desconocidas,
y los resultados diarios deben graficarse
como se describe en Westgard JO, et al.
23
FSH
Media Rango central
mIU/ml 95% mIU/ml
Adulto hombre
3,9
1,1 – 13,5*
n
16
Adulto mujer
Folicular
5,0
3,3 – 8,8
38
Medio ciclo
10,1
5,4 – 20*
10
Lúteo
3,1
1,6 – 8,7
45
Anticonceptivos
orales
1,3
ND – 4,6*
12
Posmenopausia
73
42 – 126*
12
Posmenopausia,
terapia de
reemplazo de
estrógenos
27
9,5 – 113*
16
0,9
0,1 – 3,4*
14
Prepubertad
(1–13 años)
ND: No detectable
* Equivalente al rango absoluto
Considerar estos límites sólo como una
guía. Cada laboratorio deberá establecer
sus propios intervalos de referencia.
Limitaciones
En ciertos casos de infertilidad, el
tratamiento con gonadotropina humana,
plantea un problema potencial para la
medición precisa de los niveles de FSH.
La FSH administrada puede causar que el
paciente produzca anticuerpos de FSH
que van a intervenir con el ensayo.
Debido a la secreción pulsátil, las
muestras obtenidas el mismo día con la
misma muestra del paciente pueden
fluctuar extensamente dentro del rango de
referencia, reflejando variación fisiológica
mas que errores en técnica o
metodología.
Características analíticas
Para ver resultados representativos de las
cualidades del ensayo, consulte las tablas
y los gráficos. Los resultados se expresan
en (mIU/ml) en términos de Referencia de
Preparación Internacional de la Pituitaria
FSH numero 78/549 (2nd IRP 78/549 de
la World Health.
Intervalo de calibración: Hasta
100 mIU/ml (WHO 2nd IRP 78/549).
Sensibilidad analítica: 0,06 mIU/ml
Efecto de gancho a altas dosis:
Ninguno hasta 10 000 mIU/ml.
24
Precisión intraensayo (dentro de una
tanda) Las estadísticas fueron calculadas
en muestras de resultados de 20 pares de
tubos en un solo ensayo. (Ver la tabla
"Intraassay Precision").
Precisión entre ensayos (de una tanda
a otra) Las estadísticas fueron calculadas
de los resultados de pares de tubos de 20
muestras diferentes. (Ver la tabla
“Interassay Precision”).
Especificidad: El anticuerpo Coat-ACount FSH IRMA es altamente específico
para la FSH, con poca reactividad cruzada
para hormonas glicoproteicas
estructuralmente relacionadas tales como
HCG, LH y TSH.
Linealidad: Las muestras fueron
analizadas con varias diluciones. (Ver la
tabla "Linearity" para resultados
representativos.)
Efecto deriva: ninguno hasta
aproximadamente 300 tubos. (Ver la tabla
“End-to-Run Effect”).
Recuperación: Fueron realizadas de 1 a
19 muestras marcadas con tres
soluciones FSH (185, 370, y 575 mIU/ml).
(Ver la tabla "Recovery" para resultados
representativos).
Bilirrubina: La presencia de bilirrubina en
concentraciones hasta 200 mg/l no afecta
los resultados, en lo concerniente a la
precisión del ensayo.
Hemólisis: La presencia de eritrocitos
hasta concentraciones de 30 µl/ml no
tiene efecto en los resultados, en lo
concerniente a la precisión del ensayo.
Tipo de Muestra Alternativa: para
evaluar el efecto de los diferentes tipos de
muestras alternativos, se recogió sangre
de 41 voluntarios en tubos normales,
tubos con Heparina, tubos con EDTA y
®
tubos vacutainer SST de Becton
Dickinson. Todas las muestras fueron
analizadas con el procedimiento FSH
Coat-A-Count IRMA, con los siguientes
resultados.
(EDTA) = 0,96 (Suero) + 0,0 mIU/ml
r = 0,9995
(Heparina) = 1,03 (Suero) – 0,2 mIU/ml
r = 0,999
(SST) = 1,02 (tubos simples) – 0,2 mIU/ml
r = 0,999
Medias:
8,0 mIU/ml (Suero)
8,1 mIU/ml (Heparina)
7,7 mIU/ml (EDTA)
8,0 mIU/ml (SST)
Comparación de los métodos: El
procedimiento Coat-A-Count FSH IRMA
fue comparado al FSH IMMULITE en 37
muestras de pacientes con
concentraciones que se extienden de 1 a
86 mIU/ml. (Ver gráfico). Por regresión
lineal:
(CAC IRMA) = 1,00 (IML) – 0,02 mIU/ml
r = 0,993
Medias
26,5 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA)
26,5 mIU/ml (IMMULITE)
Asistencia técnica
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Français
Domaine d'utilisation: Coat-A-Count
FSH IRMA est un dosage
radioimmunométrique destiné à la mesure
quantitative de l'hormone folliculostimulante (FSH, follitropin) dans le sérum.
Il est réservé à un usage diagnostic in
vitro et constitue une aide au diagnostic et
au traitement des désordres pituitaires et
gonadiques.
Référence catalogue : IKFS1 (100 tubes),
IKFS2 (200 tubes)
Le coffret de 100 tubes contient
moins de 20 microcuries
(740 kilobecquerels) d'anticorps
polyclonal anti-FSH marqué à l'iode 125 ;
le coffret de 200 tubes contient moins de
40 microcuries (1 480 kilobecquerels).
Introduction
L'hormone folliculostimulante (FSH) est
sécrétée par les cellules bêta de
l'antéhypophyse sous le rétrocontrôle de
l'hormone gonadotrophine releasing
(GnRH) produite par l'hypothalamus. C'est
une glycoprotéine d'un poids moléculaire
approximatif de 28 000, constituée de 2
chaînes polypeptidiques : alpha et bêta.
Les chaînes alpha de la FSH, de la LH, de
la TSH et de l'hCG sont biochimiquement
identiques, alors que les chaînes bêta
sont biochimiquement différentes leur
conférant la spécificité immunologique et
leur rôle biologique. La bioréactivité n'est
déterminée que par la chaîne bêta.
La FSH facilite le développement et
l'entretien du tissu gonadique, lequel
synthétise et sécrète les hormones
stéroïdiennes. Le taux circulant de FSH
est régulé par un rétrocontrôle négatif sur
l'hypothalamus par les hormones
stéroïdiennes. La FSH et la LH sont
nécessaires au fonctionnement sexuel
normal à la fois chez l'homme et chez la
femme, mais les modalités sécrétoires
sont différentes. Chez l'adulte mûr, la FSH
et la LH ne sont pas sécrétées en quantité
constante, mais plutôt selon une sécrétion
pulsatile avec de rapides fluctuations dans
le domaine de normalité (pouvant aller de
50 % à 100 %). A cause de cette sécrétion
pulsatile, les résultats sur un même jour
chez un même patient peuvent fluctuer à
l'intérieur du domaine de normalité,
reflétant les variations physiologiques
plutôt que des problèmes techniques ou
méthodologiques.
Chez la femme mûre, la FSH déclenche la
croissance et le développement des
follicules ovariens. Pendant l'ovulation, le
follicule est rompu, il est alors appelé le
corps jaune et sécrète l'estradiol et la
progestérone, lesquels contrôlent le taux
circulant de FSH par un rétrocontrôle
négatif sur l'hypothalamus. Au cours de la
ménopause, il y a diminution de la
fonction ovarienne ; il en résulte une
décroissance de la sécrétion d'estradiol.
Une baisse du rétrocontrôle négatif, due à
la diminution de l'estradiol, entraîne une
augmentation significative du taux de FSH
circulant.
Chez l'homme mûr, la FSH est associée à
la stimulation et au maintien de la
spermatogenèse. La testostérone et
l'estradiol sont à l'origine du rétrocontrôle
négatif de l'hypothalamus et contrôlent la
sécrétion de FSH. La stérilité masculine
peut être due à un hypogonadisme lié à
une insuffisance testiculaire. L'insuffisance
testiculaire peut être liée à une
insuffisance fonctionnelle acquise ou être
25
le résultat d'une infection microbienne.
Quelque soit son étiologie, l'insuffisance
testiculaire a une incidence très nette sur
les taux circulants de la FSH, qui sont
augmentés de façon spectaculaire, en
raison de l'absence de rétrocontrôle
négatif. Il y a d'autres désordres
testiculaires pour lesquels on observe des
taux bas de FSH, mais ils ont
probablement pour origine une
insuffisance de production des
gonadotrophines d'origine hypophysaire
ou d'un dysfonctionnement
hypothalamique.
Le dysfonctionnement hypophysaire est
souvent un problème secondaire à une
insuffisance gonadique. La FSH et la LH
auront une sécrétion diminuée. La
conséquence, tant chez les hommes que
chez les femmes, est une stérilité. Ceci
s'observe également avec des troubles du
système nerveux central et à la suite
d'administration de certains sédatifs tels
que les phénothiazines.
Principe du test
Coat-A-Count FSH IRMA est un dosage
radioimmunométrique en phase solide
utilisant des anticorps monoclonaux et
polyclonaux anti-FSH: un anticorps
polyclonal anti-FSH, marqué à l'iode 125,
en phase liquide et un anticorps
monoclonal anti-FSH fixé à la paroi du
tube en polystyrène.
Dans le protocole:
La FSH est capturée entre l'anticorps
monoclonal anti-FSH fixé à la surface
interne du tube en polystyrène et
l'anticorps polyclonal anti-FSH du traceur
radiomarqué.
L'anticorps libre anti-FSH marqué à l'iode
125 est éliminé du mélange réactionnel
par décantation et lavage du tube; il en
résulte une très faible liaison non
spécifique, assurant ainsi une excellente
précision pour les valeurs basses.
La concentration de FSH est directement
proportionnelle à la radioactivité présente
dans le tube après l'étape de lavage. La
radioactivité est mesurée grâce à un
compteur gamma et les concentrations de
FSH dans les échantillons de patients sont
obtenues en comparant les cpm du
patients à ceux obtenus par la gamme
d'étalonnage.
26
Réactifs à distribuer: 1
Temps total d'incubation: 1 heure (sur
un portoir mélangeur)
Activité totale en début de marquage:
approximativement 300 000 cpm
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2–8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-VHC et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Eau : utiliser de l'eau distillée ou
désionisée.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est reservé à l'usage
in vitro*
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à + 4/+
8° C dans leur conditionnement d'origine
avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés.
Les réactifs radioactifs ne peuvent être
vendus qu'à des personnes habilitées à
manipuler des substances radioactives.
Autorisation DGSNR.
Matériel fourni – Préparation
initiale
Tubes revêtus d'anticorps anti-FSH
(IFS1)
Tubes en polystyrène revêtus d'anticorps
monoclonal murin anti-FSH, conditionnés
dans des sachets hermétiques à glissière.
Ils doivent être conservés au réfrigérateur
et protégés de l'humidité. Refermer
soigneusement les sachets après
ouverture. Ils sont colorés en violet et
stables à + 2/+8° C jusqu'à la date de
péremption indiquée sur le sachet.
IKFS1: 100 tubes. IKFS2: 200 tubes.
Anticorps anti-FSH marqué à l'iode 125
(IFS2)
Anticorps polyclonal de chêvre anti-FSH
marqué à l'iode 125, avec conservateur.
Le réactif est fourni sous forme liquide,
prêt à l'emploi. Chaque flacon contient
5,5 ml. Stable à +2–8°C pendant 30 jours
après ouverture, ou jusqu'à la date
d'expiration marquée sur l'étiquette.
IKFS1: 2 flacons. IKFS2: 4 flacons.
Standards FSH (FSI3–9)
Sept flacons, étiquetés de A à G, de
standard FSH dans une matrice sérique
non humaine en tampon, avec
conservateur. Les standards sont fournis
sous forme liquide, prêts à l'emploi. Le
flacon de standard zéro A contient 5 ml,
alors que les autres flacons de standard,
de B à G, contiennent 2 ml chacun. Stable
à +2–8°C pendant 30 jours après
ouverture. Pour une conservation plus
longue, aliquoter et congeler : stable à
–20°C pendant 6 mois.
IKFS1: 1 jeu. IKFS2: 1 jeu.
Les standards contiennent respectivement
0, 1.5, 5, 15, 30, 60 et 100 milli-Unités
Internationales de FSH par millilitre
(mUI/ml) obtenus à partir de la seconde
préparation internationale de référence de
FSH hypophysaire de l'OMS (2nd IRP
78/549).
Solution de tampon de lavage
concentrée (1TSBW)
40 ml d'une solution tampon saline
concentrée, avec surfactants et azide de
sodium comme conservateur. Utiliser un
récipient de transfert, diluer le contenu de
chaque flacon avec 400 ml d'eau distillée,
pour obtenir un volume total de 440 ml.
Stable à +2–8°C 6 mois après
préparation.
IKFS1: 1 flacon x 40 ml.
IKFS2: 2 flacons x 40 ml.
Matériel requis mais on fourni
Compteur Gamma – permettant
l'utilisation de tubes standards 12x75 mm
Agitateur — environ 200 tpm
Préparation des réactifs
Eau distillée ou désionisée
Eprouvette gradué — pour distribuer
400 ml.
Flacon de conservation en plastique avec
couvercle— pour la préparation et le
27
stockage de la solution de tampon de
lavage.
Immunodosage
Micropipettes: 100 µl
Distributeur — pour distribuer 2,0 ml de
solution de tampon de lavage.
Un portoir de décantation – disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : FDR).
Papier graphe Log-log 3-cycles
Un contrôle, à base de sérum humain, à
trois niveaux de concentration, contenant
de la FSH (parmi les 25 paramètres
dosables), est disponible chez Siemens
Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : CON6).
pas tenter de décongeler les spécimens
congelés à l'aide d'un bain-marie.
La trousse Coat-A-Count FSH IRMA a un
domaine de mesure allant jusqu'à
100 mUI/ml. Les échantillons dont le taux
de FSH est suspecté supérieur à cette
valeur, doivent être dilués dans le
standard A avant le dosage.
Protocole de dosage
Immunométrique
Chaque composant doit être à
température ambiante avant utilisation
(15°C–28°C).
1
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
13
Prélever le sang par ponction veineuse
sur tubes secs, en évitant l'hémolyse, et
séparer le sérum des cellules. Noter
l'heure de prélèvement.
Il est recommandé de clarifier les
échantillons hyperlipémiques par
ultracentrifugation.
Des échantillons hémolysés peuvent être
révélateurs d'une préparation inadéquate
du prélèvement avant son envoi au
laboratoire ; il faudra donc interpréter les
résultats avec prudence.
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
coffret FSH Coat-A-Count IRMA n'a pas
été testé sur tous les types de tubes
possibles. Veuillez consulter le chapitre
intitulé Autres Types d'Échantillons pour
plus de renseignements sur les tubes qui
ont été évalués.
Volume nécessaire : 100 µl par tube
Conservation: 2 jours à +2–8°C ou
2 mois à –20°C.
Avant le dosage, laisser les échantillons
parvenir à température ambiante (15°C–
28°C) et mélanger par légères rotations
ou retournements. Aliquoter, si
nécessaire, afin d'éviter de répéter les
cycles congélation / décongélation. Ne
28
Etiqueter 16 tubes coatés d'anticorps
anti-FSH en duplicate, A (liaison non
spécifique) et de B à G (liaison
maximale LM). Etiqueter les tubes
coatés d'anticorps supplémentaires,
également en duplicate, pour les
échantillons de patients et les
contrôles.
standards
mUI/ml
WHO 2nd IRP 78/549
T*
—
A (LNS)
0
B
1,5
C
5
D
15
E
30
F
60
G ("LM")
100
* Optionnel
2
Pipeter 100 µl de chaque standard,
contrôle et échantillon sérique de
patient dans les tubes préparés.
Distribuer directement au fond du
tube. Les échantillons de patients
suspectés de contenir des
concentrations de FSH supérieures au
standard le plus élevé (100 mUI/ml)
doivent être dilués avec le standard
zéro avant le dosage. Il est bon
d'utiliser des embouts de
micropipettes jetables, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
Les pipettes à « capillaire » et les
pipetteurs-diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
3
contamination a été évalué et jugé
insignifiant.
LNS des tubes G tubes considérés à
100%:
Ajouter 100 µl d'anticorps anti-FSH
marqué à l'iode 125 dans chaque
tube.
% liaison = (cpm corrigés / Cpm LM corrigé) ×
100
Distribuer directement au fond du
tube. Bien s'assurer que l'échantillon
et le traceur sont parfaitement
mélangés. Une multipette est
recommandée. Les tubes T peuvent
être mis de côté jusqu'au comptage
(étape 6); ils n'ont besoin d'aucun
autre traitement.
4
Incuber 60 minutes sous agitation.
5
Décanter complètement. Ajouter à
chaque tube 2 ml de solution tampon
de lavage. Attendre 1 à 2 minutes et
décanter parfaitement. Ajouter de
nouveau 2 ml de solution tampon de
lavage, attendre 1 à 2 minutes et
décanter totalement.
Eliminer toute trace d'humidité pour
améliorer la précision. Après le
second lavage, utiliser un portoir de
décantation, décanter le contenu de
chacun des tubes (excepté les tubes
T) et laisser égoutter pendant 2 ou 3
minutes. Retourner alors
vigoureusement les tubes sur du
papier absorbant afin d'éliminer les
gouttelettes résiduelles.
6
Compter 1 minute sur compteur
gamma.
Pour les compteurs gamma multipuits, les tubes T (optionnels) doivent
être séparés des autres tubes par au
moins un espace, afin de minimiser
les risques de contamination.
Calcul et Contrôle de qualité
Pour calculer les concentrations de FSH à
partir d'une courbe standard représentée
en log-log, il faut, dans un premier temps,
corriger les coups par minute (cpm) de
chaque paire de tubes en soustrayant la
moyenne des cpm des tubes à liaison non
spécifique (standard A):
Cpm corrigé = Moyenne CPM moins Moyenne
CPM LNS
Puis déterminer pour chaque doublet la
capacité de liaison en pourcentage
(%B/B150, ici nommée "%B/MB") de liaison
maximale (LM), corrigée des cpm dus au
Utiliser le papier log-log pour la
construction de la courbe, en portant sur
l'axe des ordonnées les pourcentages de
liaison, et sur l'axe des abscisses les
valeurs des standards différents de zéro.
Tracer la droite qui passe
approximativement par ces points. Relier
les points par des arcs ou des segments
de droite. Ne pas chercher à réaliser une
seule droite à partir des résultats. Les
concentrations des contrôles et des
inconnus dans le domaine de mesure du
standard zéro peuvent être lues à partir de
la droite par interpolation. Il est possible
de tracer un autre graphe à partir des 3
premiers standards pour apprécier les
valeurs proches de zéro.
Commentaires: Bien que d'autres
approches de calcul soit aussi
acceptables, la réduction des données
avec la méthode indiquée ci-dessus a
certains avantages du point de vue du
contrôle de qualité. En particulier, elle
donne une courbe d'étalonnage qui est
relativement linéaire avec les
représentations log-log et linéaire-linéaire,
et est relativement stable d'une dosage à
l'autre. Elle donne également des
paramètres déterminants pour le contrôle
de qualité, plus précisément, les valeurs
de % de liaison (%B/B150 ou "%B/Mb) pour
les standards différents de zéro. Un
graphique encore plus utile, donnant une
idée de la reproductibilité intra-essai, peut
être obtenu en représentant directement
le pourcentage de liaison de chaque
standard, par exemple sans faire un calcul
de valeur moyenne à partir des cpm des
doublets.
Alternatives: Le pourcentage de liaison
peut être aussi calculé directement à partir
de la moyenne des cpm, la correction par
la liaison non spécifique produit
habituellement une courbe de calibration
qui est pratiquement linéaire sur tout le
domaine. Une courbe de calibration peut
être aussi créée en portant directement
sur l'ordonnée les cpm ou la moyenne des
cpm et en abscisse la concentration sur
du papier log-log ou linéaire-linéaire (le
papier semi-log ne doit pas être utilisé).
Cette méthode à l'avantage de sa
29
simplicité mais elle est moins
recommandée pour ce qui concerne le
Contrôle de Qualité.
Traitement informatique des données:
Les méthodes "Point-par-point", incluant
les fonctions de lissage linéaire, peuvent
être utilisées ; bien qu'elles ne permettent
qu'une faible assistance pour le suivi de la
qualité des tests, il est important de tracer
en log-log, selon les recommandations, la
courbe d'étalonnage, soit manuellement
soit informatiquement, en considérant que
c'est une étape du Contrôle de Qualité. Le
traitement des données utilisant des
fonctions polynomiales de 4ème ou 5ème
degré est aussi possible et est adapté.
Garder à l'esprit, cependant, que certains
algorithmes actuellement utilisés peuvent
ne pas être adaptés. Si une de ces
méthodes semble adaptée, il est essentiel
de vérifier qu'elle reste appropriée dans le
temps, par recalcul des concentration de
standards et d'autres paramètres. De plus,
un tracé log-log de la courbe de
calibration est fortement recommandé car
il est plus informatif que le tracé habituel
en semi-log.
Traitement des échantillons: Les
recommandations données concernant
l'utilisation et la conservation des sérums
doivent être respectées. Les échantillons
de patients suspectés de contenir des
concentrations de FSH supérieures au
standard le plus élevé (100 mUI/ml)
doivent être dilués avec le standard zéro
avant le dosage. Tous les échantillons,
standards et contrôles inclus, doivent être
dosés en duplicate. Il est important
d'utiliser des micropipettes à embouts
jetables, de changer d'embout entre les
échantillons de manière à éviter toute
contamination. Les pipettes de transfert et
les pipeteurs diluteurs automatiques ne
doivent être utilisés que si le risque de
transmission de contamination a été
évalué et considéré comme insignifiante.
Les doublets de tubes de contrôles
doivent être espacés au long de la série
de dosage afin de vérifier l'absence de
dérive significative. Vérifier la
concordance des résultats entre les
doublets de tubes.
un espace. Alternativement, ajouter
seulement 25 µl de traceur à chacun des
tubes T (cpm T) lors de l'étape 3, et
multiplier par 4 le nombre de cpm obtenus
sur ces tubes.
Contrôles: Les contrôles ou pools de
sérum avec au moins deux niveaux de
concentration de FSH (bas et élevé)
doivent être dosés en routine comme
inconnus, et les résultats notés jour après
jour comme décrit par exemple dans
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Un redosage d'échantillon peut être
précieux pour suivre la précision inter
essai.
Paramètres du Contrôle de Qualité:
Nous recommandons de garder une trace
de ces résultats de performances:
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne LNS cpm / Activité
totale)
%LM = 100 × (Cpm standard C corrigés / Cpm
LM corrigés)
Et toutes les valeurs de pourcentage de
liaison (%B/B150 ou "%B/MB") sauf la plus
élevée des standards différents de zéro,
par exemple:
%C/LM = 100 × (Cpm standard C corrigé / Cpm
LM corrigé)
Conservation des données: Il est bon
d'enregistrer pour chaque dosage les
numéros de lots et la date de
reconstitution et/ou ouverture des
composants utilisés.
Bibliographie: Se reporter à Dudley RA,
et al. Guidelines for immunoassay data
Exemple de série: A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série. (Voir
le tableau “Example Run”.)
Valeurs de référence
Des études sur des individus sains ont été
menées dans deux établissements
différents avec le test Coat-A-Count FSH
IRMA, (standard OMS 2nd IRP 78/549).
Compteur gamma: Afin de minimiser
l'éventualité d'une contamination dans le
compteur gamma multi-puits, il convient
de séparer les tubes d'activité totale T
(optionnel) des autres tubes par au moins
30
FSH
Homme adulte
Médiane Intervalle centré à
mUI/ml
95% mUI/ml
3,9
n
1,1 – 13,5*
16
38
Femme adulte
Stade folliculaire
5,0
3,3 – 8,8
Milieu de cycle
10,1
5,4 – 20*
10
Phase luétale
3,1
1,6 – 8,7
45
Contraceptifs
oraux
1,3
ND – 4,6*
12
postménopause
73
42 – 126*
12
Thérapie
oestrogénique de
remplacement
postménopause,
27
9,5 – 113*
16
0,9
0,1 – 3,4*
14
Prépuberté
(1 – 13 ans)
ND: Non détectable
* Equivalent au domaine absolu
Utiliser ces valeurs à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire devra
établir ses propres valeurs de référence.
Limites
Dans certains cas de stérilité, les
traitements avec des gonadotrophines
humaines posent des problèmes pour la
mesure du taux exact de FSH.
L'administration de cette FSH peut
conduire à la production d'anticorps antiFSH qui interfèrent dans le dosage.
Précision intra-dosage (au sein d'une
même série)
Les statistiques ont été calculées pour les
échantillons à partir des résultats de 20
doublets de tubes dans une même série.
(Voir le tableau “Intraassay Precision”.)
Précision inter-dosage (entre plusieurs
séries) Les statistiques ont été calculées
pour les échantillons à partir des résultats
de doublets de tubes dans 20 séries
différentes. (Voir le tableau “Interassay
Precision”.)
Spécificité : L'anticorps utilisé dans la
technique Coat-A-Count FSH IRMA est
hautement spécifique de la FSH, avec de
très faibles réactions croisées pour des
hormones glycoprotéiques comme la LH,
l'hCG et la TSH.
Test de dilution : Des échantillons ont
été dosés à différentes concentrations.
(Voir le tableau « Linearity » pour des
données représentatives.)
Effet de la position des tubes : Aucun
jusqu'à 300 tubes. (Se reporter au tableau
"End-of-Run-Effect".)
Test de récupération : Des échantillons
chargés dans un rapport de 1 à 19 avec
trois solutions de FSH (185, 370, et
575 mUI/ml) ont été dosés. (Voir le
tableau « Recovery » pour des données
représentatives.)
La sécrétion étant pulsatile, les résultats
obtenus pour un même patient sur un
même jour peuvent varier à l'intérieur du
domaine de normalité, reflétant la variation
physiologique sans qu'aucune erreur
technologique ou méthodologique soit
imputable.
Bilirubine : La présence de bilirubine n'a
aucun effet sur la précision du dosage ni
sur les résultats si sa concentration ne
dépasse pas 200 mg/l.
Performances du test
Consulter les tableaux et graphiques pour
obtenir les données représentatives des
performances de ce test. Les résultats de
la FSH sont exprimés en milli-unités
Internationales par millilitre (mUI/ml) à
partir de la seconde préparation
internationale de référence de FSH
hypophysaire de l'OMS (2nd IRP 78/549).
Autres types d'échantillons: pour
estimer l'effet de l'utilisation de différents
type d'échantillons, 41 volontaires ont été
prélevés sur tubes secs, héparinés, EDTA
®
et sur tubes vacutainer SST Becton
Dickinson. Tous les échantillons ont été
dosés avec le protocole Coat-A-Count
FSH IRMA et ont donné les résultats
suivants.
Intervalle de linéarité : jusqu'à
100 mUI/ml (WHO 2nd IRP 78/549).
(EDTA) = 0,96 (Sérum) + 0,0 mUI/ml
r = 0,9995
Sensibilité analytique : 0,06 mUI/ml,
(Hépariné) = 1,03 (Sérum) – 0,2 mUI/ml
r = 0,999
Effet-crochet aux doses élevées :
aucune jusqu'à 10 000 mUI/ml.
(SST) = 1,02 (tubes ordinaires) – 0,2 mUI/ml
r = 0,999
Hémolyse : La présence d'agrégat
d'hématies jusqu'à une concentration de
30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats
ni sur la précision du dosage.
31
Moyennes :
8,0 mUI/ml (Sérum)
8,1 mUI/ml (Hépariné)
7,7 mUI/ml (EDTA)
8,0 mUI/ml (SST)
Comparaison de méthodes: Le dosage
Coat-A-Count FSH IRMA a été compare
au test IMMULITE FSH sur 37
échantillons de patients dont les
concentrations en FSH allaient d'environ 1
to 86 mUI/ml. (voir les graphiques) Par
régression linéaire :
(CAC IRMA) = 1,00 (IML) – 0,02 mUI/ml
r = 0,993
Moyennes
26,5 mUI/ml (CAC IRMA)
26,5 mUI/ml (IMMULITE)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Italiano
Uso: Il dosaggio radioimmunologico CoatA-Count FSH IRMA determina in maniera
quantitativa l'ormone follicolo stimolante
(FSH, follitropina) nel siero. E' a solo uso
diagnostico in vitro quale ausilio nella
diagnosi e nella terapia dei disturbi delle
gonadi e dell'ipofisi.
Codice: IKFS1 (100 provette), IKFS2 (200
provette)
Un kit da 100 determinazioni
contiene meno di 20 microcurie
(740 kilobecquerel) di anticorpo
125
policlonale anti-FSH marcato con I ; il kit
da 200 determinazioni contiene meno di
40 microcurie (1 480 kilobecquerel).
Riassunto e Spiegazione del
Dosaggio
L'ormone follicolo stimolante (FSH) è
secreto dalle cellule β dell'ipofisi anteriore
sotto il controllo dell'ormone che rilascia le
gonadotropine prodotto nell'ipotalamo. Si
tratta di una glicoproteina con un peso
molecolare di circa 28 000 dalton, formata
32
da due catene di polipeptidi chiamate alfa
e beta. Le catene alfa dell'FSH, LH, TSH
ed HCG sono biochimicamente identiche,
mentre le catene beta sono
biochimicamente uniche e conferiscono
specificità biologica ed immunologica. La
bioattività è anche determinata dalla
catena beta.
L'FSH facilita lo sviluppo ed il
mantenimento dei tessuti gonadici, che
sintetizzano e secernono gli ormoni
steroidei. I livelli di FSH in circolo sono
controllati da un feedback negativo
sull'ipotalamo da parte degli ormoni
steroidei. Benché l'FSH e l'LH siano
necessari al normale funzionamento
sessuale sia nell'uomo che nella donna, le
secrezioni sono molto diverse per i due
sessi. Negli adulti sessualmente maturi,
l'FSH e l'LH non sono secreti in
quantitativi costanti, ma piuttosto la
secrezione avviene per impulsi
provocando rapide fluttuazioni sull'intero
range di riferimento (ad es. oscillazioni dal
50 al 100%). A causa di queste secrezioni
ad impulsi, i campioni ottenuti lo stesso
giorno dallo stesso paziente potrebbero
fluttuare molto entro il range di riferimento,
riflettendo le variazioni fisiologiche
piuttosto che gli errori nella tecnica o nella
metodologia.
Nelle donne adulte, l'FSH dà avvio alla
crescita ed allo sviluppo dei follicoli
ovarici. Durante l'ovulazione, quando il
follicolo si rompe, il follicolo, ora chiamato
corpo luteo, secerne estradiolo e
progesterone, che controllano i livelli di
FSH circolante attraverso un effetto di
feedback negativo sull'ipotalamo. In
menopausa, quando la funzionalità
ovarica rallenta, vi è una corrispondente
diminuzione della secrezione di estradiolo.
A causa di un meccanismo di feedback
negativo, con una diminuzione
dell'estradiolo, i livelli di FSH circolanti
aumentano in maniera significativa.
Negli uomini adulti, l'FSH viene associato
alla stimolazione e mantenimento della
spermatogenesi. Il testosterone e
l'estradiolo hanno la funzione di innescare
un meccanismo di feedback negativo
all'ipotalamo per il controllo del rilascio
dell'FSH. L'infertilità nei maschi può
essere dovuta ad ipogonadismo quale
risultato di un mal funzionamento
testicolare primario. Questo mal
funzionamento può essere legato
all'incapacità di portare a maturazione gli
spermatozoi o il risultato di un danno alle
cellule germinative. Qualsiasi sia
l'eziologia, l'ipogonadismo ha come
risultante un innalzamento dei livelli di
FSH in circolo, a causa della mancanza di
un feedback negativo. Esistono altri
disturbi dei testicoli che dimostrano valori
bassi di FSH, ma questi ultimi sono
probabilmente dovuti ad una produzione
insufficiente di gonadotropina e sono
indicativi di una disfunzione ipofisaria o
ipotalamica.
La disfunzione dell'ipofisi è spesso uno
degli agenti causativi di disfunzioni
gonadiche secondarie. Ciò provoca una
secrezione diminuita sia di FSH che di LH.
L'effetto netto sia negli uomini che nelle
donne è l'infertilità. La stessa si osserva
anche nei disturbi del sistema nervoso
centrale e successiva somministrazione di
alcuni antidepressivi quali le fenotiazine.
Principio del Dosaggio
Il dosaggio Coat-A-Count FSH IRMA è un
dosaggio immunoradiometrico in fase
solida basato su anticorpi monoclonali e
policlonali anti-FSH: un anticorpo
125
monoclonale Anti-FSH marcato con I è
in fase liquida, mentre l'altro anticorpo
policlonale anti-FSH è adeso alle pareti di
una provetta di polistirene
Nel Dosaggio:
L'FSH viene catturato tra l'anticorpo
monoclonale anti-FSH adeso alla
superficie interna della provetta di
polistirene ed il tracciante marcato con
l'anticorpo policlonale anti-FSH.
L'anticorpo non legato anti-FSH marcato
125
con I viene rimosso decantando la
miscela di reazione e lavando la provetta;
ciò riduce il legame non specifico ad un
livello molto basso ed assicura la
precisione.
La concentrazione di FSH è direttamente
proporzionale alla radioattività presente
nella provetta dopo il lavaggio. La
radioattività viene misurata utilizzando un
gamma counter, dopo di ché la
concentrazione di FSH nel campione
viene ottenuta comparando le conte per
minuto del paziente con quelle ottenute
dal set di calibratori forniti.
Reagenti da Dispensare: 1
Tempo di Incubazione Totale: 1 ora (su
uno shaker)
Conte Totali alla Iodinazione:
circa 300 000 cpm
Avvertenze e Precauzioni
A solo uso diagnostico in vitro.
Reagenti: Conservare a 2–8°C in un
frigorifero appositamente destinato al
materiale radioattivo. Eliminare secondo la
normativa di legge vigente.
Non utilizzare i reagenti oltre la data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale di origine
umana e/o altre sostanze potenzialmente
pericolose che necessitano di precauzioni
nell'utilizzo.
Seguire le precauzioni generali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati analizzati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli anticorpi anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B;
e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o
deionizzata.
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
33
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. I possessori
di licenza generica (possessori di NRC
Form 483) possono eliminare i rifiuti
radioattivi solidi come non radioattivi, dopo
aver rimosso l'etichetta.
I detentori di autorizzazioni specifiche
(NRC Form 313) devono fare riferimento
al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
34
Materiali Forniti: Preparazione
Iniziale
Provette FSH Coattate con Anticorpo
(IFS1)
Provette di polistirene coattate con un
anticorpo monoclonale di topo anti-FSH e
confezionati in buste sigillate. Conservare
refrigerate e protette dall'umidità,
risigillando le buste dopo l'apertura. Stabili
a 2–8°C fino alla data di scadenza
indicata sull'etichetta della busta.
IKFS1: 100 provette. IKFS2: 200 provette.
125
Anticorpo FSH marcato con I (IFS2)
Anticorpo policlonale iodinato di capra
anti-FSH, con conservanti. Il reagente
viene fornito in forma liquida, pronto
all'uso. Ogni flacone contiene 5,5 mL.
Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo
l'apertura o fino alla data indicata
sull'etichetta.
IKFS1: 2 flaconi. IKFS2: 4 flaconi.
Calibratori FSH (FSI3–9)
Sette flaconi, etichettati dalla A alla G di
calibratori FSH in una matrice/tampone di
siero non umano, con conservanti. I
calibratori vengono forniti in forma liquida,
pronti all'uso. Il calibratore zero flacone A
contiene 5 mL, mentre i rimanenti
calibratori, flaconi dalla B alla G
contengono 2 mL ciascuno. Stabili a
2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura. Per
una conservazione prolungata, aliquotare
e congelare: stabile a –20°C per 6 mesi.
IKFS1: 1 set. IKFS2: 1 set.
I calibratori contengono, rispettivamente,
0, 1.5, 5, 15, 30, 60 e 100 milli unità
Internazionali di FSH (mIU/mL) in termini
di World Health Organization's Seconda
Preparazione Internazionale di
Riferimento dell'FSH Ipofisario, numero
78/549 (2° IRP 78/549).
Soluzione di Lavaggio Concentrata
(1TSBW)
40 mL di una soluzione di lavaggio salina
concentrata, con surfactanti, e con sodio
azide come conservante. Utilizzando un
contenitore di trasferimento, diluire il
contenuto di ciascun flacone con 400 mL
di acqua distillata, per un volume totale di
440 mL. Stabile a 2–8°C per 6 mesi dopo
la preparazione.
IKFS1: 1 flacone x 40 mL.
IKFS2: 2 flaconi x 40 mL.
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter — compatibile con
provette standard 12x75 mm
Shaker — settato a circa 200 colpi al
minuto.
Preparazione dei Reagenti
Acqua distillata o deionizzata.
Pipetta — per la dispensazione di 5,5 mL
Beuta graduata — per la dispensazione di
400 mL.
Contenitori in plastica con coperchio – per
la preparazione e la conservazione della
Soluzione di Lavaggio.
Immunodosaggio
Micropipette: da 100 µL
Dispensatore — per la dispensazione di
2,0 mL di Soluzione di Lavaggio.
Foam per la decantazione — disponibile
presso Siemens Healthcare Diagnostics
(Codice: FDR).
Carta millimetrata per grafici a 3-cicli
log-log
riguardante Campioni Alternativi per
dettagli sulle provette testate.
Volume Richiesto: 100 µL per provetta.
Conservazione: 2 giorni a 2–8°C o 2
mesi a –20°C.
Prima del dosaggio, fare in modo che i
campioni siano a temperatura ambiente
(15°C–28°C) e mescolare agitando o
capovolgendo la provetta. Aliquotare, se
necessario, per evitare cicli ripetuti di
congelamento e scongelamento. Non
tentare di scongelare campioni congelati
riscaldandoli in un bagnetto termostatato.
Il dosaggio Coat-A-Count FSH IRMA ha
un range di lavoro fino a 100 mIU/mL.
Tutti i campioni con concentrazioni attese
di FSH superiori a questo valore devono
essere diluiti con il calibratore zero prima
del dosaggio.
Dosaggio Immunometrico
Tutti i componenti devono essere a
temperatura ambiente (15–28°C) prima
dell'utilizzo.
1
Controllo a tre livelli, su base sierica
umana, contenente FSH tra gli oltre 25
diversi componenti dosati (Codice: CON6)
disponibile presso Siemens Healthcare
Diagnostics.
Etichettare con A sedici Provette
Coattate con Anticorpo FSH (legame
non specifico) e da B a G (“legame
massimo”) in duplicato. Etichettare
altre Provette Coattate con Anticorpo
FSH, anch'esse in duplicato, per i
controlli ed i campioni.
Prelievo dei Campioni
Non è necessario che il paziente sia a
digiuno, non sono necessarie preparazioni
13
particolari. Prelevare il sangue in
provette semplici, facendo attenzione ad
evitare l'emolisi ed a separare il siero dalle
cellule. Annotare il momento del prelievo.
Calibratori
mIU/mL
WHO 2° IRP 78/549
T*
—
A (NSB)
0
B
1.5
C
5
Si consiglia l'utilizzo di un'ultracentrifuga
per schiarire i campioni lipemici.
D
15
E
30
I campioni emolizzati posson indicare il
trattamento non idoneo del campione
prima dell'arrivo al laboratorio; per questo
motivo, i risultati devono essere
interpretati con prudenza.
F
60
G ("MB")
100
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
L'Coat-A-Count IRMA FSH non é stato
verificato con tutte le possibili variazioni di
tipi di provette. Consultare la sezione
* Opzionale
2
Dispensare 100 µL di ciascun
calibratore, controllo e campione di
siero nelle provette preparate.
Pipettare direttamente al fondo
delle provette. Campioni con
concentrazioni attese di FSH superiori
al calibratore più alto (100 mIU/mL)
devono essere diluiti con il calibratore
35
zero. Si consiglia l'utilizzo di
micropipette con puntale monouso,
per evitare il carryover da un
campione all'altro. Debbono essere
utilizzate pipette a ripetizione e
pipettatori-diluitori automatici solo se
la possibilità che si verifichi il
carryover è stata valutata e
considerata irrilevante.
3
Aggiungere 100 µL di un anticorpo
125
FSH marcato con I FSH ad ogni
provetta.
Pipettare direttamente al fondo
delle provette. Assicurarsi che il
campione ed il tracciante siano
accuratamente mescolati. Si consiglia
l'utilizzo di un dispensatore a
ripetizione di tipo. Lasciare da parte le
provette T (opzionali) per le conte al
punto 6; non sono richiesti ulteriori
processi.
4
Scuotere per 60 minuti su uno
shaker.
5
Decantare completamente.
Aggiungere 2 mL di
Soluzione/Tampone di Lavaggio ad
ogni provetta. Attendere da 1 a 2
minuti, quindi decantare
completamente. Quindi aggiungere
2 mL di Soluzione di Lavaggio,
attendere da 1 a 2 minuti e decantare
completamente.
La rimozione di ogni traccia di umidità
visibile aumenterà enormemente la
precisione. Dopo il secondo lavaggio,
con l'utilizzo di un foam, decantare il
contenuto di tutte le provette (ad
eccezione delle provette T) e fare in
modo che asciughino per 2 o 3 minuti.
Quindi asciugare le provette su carta
assorbente fino a completo
assorbimento di tutta l'umidità residua.
6
Contare per 1 minuto in un gamma
counter.
Nei gamma counter multi-testina,
(opzionali) le provette delle Conte
Totali dovrebbero essere separate
dalle rimanenti provette del dosaggio
almeno di uno spazio per minimizzare
la possibilità di fuoriuscite.
Calcolo e Controllo di Qualità
Per calcolare i risultati (in termini di unità
di concentrazione) da una
rappresentazione log-log della curva di
36
calibrazione, innanzitutto correggere le
conte per minuto (CPM) di ciascuna
coppia di provette sottraendo il CPM
medio delle provette del legame non
specifico (calibratore A):
Conte Nette = CPM Medio meno NSB CPM
Medio
Quindi determinare la percentuale di
legame (relativa a quella del calibratore
più alto) – qui chiamato "%B/MB" – di
ciascuna coppia di provette come
percentuale del “legame massimo”, con le
conte corrette NSB del calibratore più alto
preso al 100%:
Conte Nette = (Conte Nette / Conte Nette MB) ×
100
Utilizzando una carta millimetrata a 3-cicli
log-log, tracciare la Percentuale di Legato
rispetto alla Concentrazione per ciascuno
dei calibratori non zero e tracciare una
curva approssimativamente lungo questi
punti. (Collegare i punti della calibrazione
con archi o segmenti retti. Non tentare di
utilizzare un'unica linea retta per
congiungere i dati). Si possono stimare le
concentrazioni per i controlli ed i campioni
non noti entro il range dei calibratori non
zero dalla curva di calibrazione per
interpolazione. Può essere utilizzata un
ulteriore linea tra la Percentuale di Legato
e la Concentrazione per i tre calibratori più
bassi su carta millimetrata lineare-lineare
da utilizzarsi per l'interpolazione della
concentrazione prossima a zero
Commenti: Benché altri tipi di approccio
siano accettabili, la riduzione dei dati
attraverso il metodo appena descritto ha
alcuni vantaggi dal punto di vista del
controllo di qualità. In particolare, produce
una curva di calibrazione che è
relativamente lineare sia nella
rappresentazione log-log che linearelineare e relativamente stabile da
dosaggio a dosaggio. Produce anche
validi parametri di CQ, cioè valori di
Percentuale di Legato ("%B/MB") per i
calibratori diversi da zero. Un grafico che
contiene più informazioni, e che fornisce
l'andamento della riproducibilità intradosaggio in funzione della
concentrazione, può essere ottenuto
tracciando i valori della Percentuale di
Legato dei singoli calibratori, cioè senza
prima effettuare la media dei CPM dei
replicati.
Alternative: Benché la Percentuale di
Legato possa essere calcolata
direttamente dal CPM Medio, la
correzione per il legame non specifico
produce solitamente una curva di
calibrazione che è più prossima alla
linearità lungo tutto il range del dosaggio.
Una curva di calibrazione può anche
essere costruita tracciando i CPM o i CPM
medi direttamente verso la
Concentrazione sia su carta log-log che su
carta lineare-lineare. (Non deve essere
utilizzata carta semi-log). Questo
approccio ha la virtù della semplicità, ma è
meno desiderabile dal punto di vista del
controllo di qualità.
Calcolo Computerizzato dei Dati:
possono essere utilizzati i metodi “Punto a
punto”, inclusi lo spline lineare e cubico.
Tuttavia, poiché forniscono poche
informazioni sul monitoraggio dell'integrità
di un dosaggio, è importante preparare il
grafico Log-log della curva di calibrazione
sia manualmente che utilizzando il
computer quale sistema per il controllo di
qualità. Possono anche essere applicate
le tecniche di calcolo dei dati basate sul
modello logistico. All'interno di questa
famiglia, le verifiche della curva basate
sulla logistica a 4-o-5 parametri sono le
candidate più probabili. Occorre avere
presente che alcuni algoritmi ad oggi
utilizzati potrebbero non convergere in
modo vincente, anche quando il modello
logistico è in linea con i dati. Se viene
adottato il metodo logistico, è essenziale
verificarne l'appropriatezza per ciascun
giorno del dosaggio monitorando i risultati
dei calibratori e di altri parametri nel
tempo. Inoltre, si consiglia l'utilizzo di una
curva di calibrazione in una
rappresentazione log-log, poiché fornisce
informazioni più accurate della
rappresentazione semi-log.
Manipolazione dei Campioni: Occorre
osservare attentamente le istruzioni per la
manipolazione e la conservazione dei
campioni e dei componenti. Diluire i
campioni dei pazienti con concentrazioni
attese di FSH superiori al calibratore più
elevato (100 mIU/mL) nel calibratore zero
prima del dosaggio. Tutti i campioni,
inclusi i calibratori ed i controlli devono
essere dosati in duplicato. E' importante
utilizzare una micropipetta a puntale
monouso, cambiando il puntale tra un
campione e l'altro per evitare la
contaminazione da carryover. L'utilizzo di
pipette multiple e di diluitori-dispensatori
automatici deve essere effettuato solo se
la possibilità che si verifichi il carryover è
stata valutata ed esclusa. Coppie di
provette di controllo possono essere
collocate in ordine sparso lungo tutto il
dosaggio per aiutare a verificare l'assenza
di variazioni significative. Verificare i
risultati per valutare la correlazione
all'interno delle coppie di provette.
Gamma Counter: Per minimizzare la
possibilità di fuoriuscite nei gammacounter multi-pozzetto, le provette delle
conte totali (opzionali) (T) devono essere
separate da uno o più spazi dalle altre
provette del dosaggio. In alternativa,
aggiungere solo 25 µL di tracciante a
ciascuna delle provette T (conte totali) al
punto 3, e moltiplicare per 4 le conte al
minuto osservate in queste provette
Controlli: I controlli o i pool di sieri con
almeno due livelli di concentrazione di
FSH (basso ed alto) dovrebbero essere
dosati di routine come campioni
sconosciuti ed i risultati monitorati di
giorno in giorno come descritto in
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. I campioni ripetuti costituiscono un
ulteriore strumento per monitorare la
precisione inter-dosaggio.
Parametri QC: Consigliamo di conservare
i risultati delle prestazioni ottenute:
T = Conte Totali (conte per minuto)
%NSB = 100 × (Conte Medie NSB / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette MB / Conte Totali)
Ed i valori della Percentuale di Legato
("%B/MB") di tutti i calibratori ad
eccezione del calibratore più elevato tra
quelli non zero, ad esempio:
%C/MB = 100 × (Conte Nette del Calibratore
"C" / Conte Nette MB)
Archivio delle informazioni: Si consiglia
di annotare per ciascun dosaggio i numeri
di lotto e le date di ricostituzione o
apertura dei componenti utilizzati.
Ulteriori Informazioni: Vedi Dudley RA,
et al. Guidelines for immunoassay data
Seduta Esemplificativa: A solo titolo
esemplificativo, non per calcolare i risultati
37
di un'altra seduta. (Vedi tabella “Example
Run”.)
Internazionale di Riferimento dell'FSH
Ipofisario, numero 78/459 (2° IRP 78/549).
Valori Attesi
Range di Calibrazione : Fino a
100 mIU/mL (WHO 2° IRP 78/549).
I valori di FSH sono stati studiati presso
due centri clinici utilizzando il dosaggio
Coat-A-Count FSH IRMA che è
standardizzato in termini di WHO 2° IRP
78/549.
FSH
Maschi Adulti
Sensibilità Analitica: 0,06 mIU/mL.
Effetto Gancio a Dosi Elevate: Nessuno
fino a 10 000 mIU/mL.
Mediana Range Centrale
mIU/mL 95% mIU/mL n
3.9
1.1 – 13.5*
16
folliculare
5.0
3.3 – 8.8
38
Metà ciclo
10.1
5.4 – 20*
10
luteinico
3.1
1.6 – 8.7
45
Contraccettivi
orali
1.3
ND – 4.6*
12
postmenopausa
73
42 – 126*
12
postmenopausa,
Terapia sostitutiva
con estrogeni
27
9.5 – 113*
16
0.9
0.1 – 3.4*
14
Femmine Adulte
Prepuberali
(1–13 anni)
ND: Non rilevabile
* Equivalente al range assoluto
Considerare questi limiti solo come linee
guida. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i
propri range di riferimento.
Limiti
In alcuni casi di infertilità, la terapia con
gonadotropine umane pone un problema
potenziale per la misurazione accurata dei
livelli di FSH. L'FSH somministrato può
indurre la produzione di anticorpi anti-FSH
che possono interferire con il dosaggio.
A causa della secrezione ad impulsi, i
campioni ottenuti nel corso dello stesso
giorno da parte dello stesso paziente
possono fluttuare enormemente entro il
range di riferimento, riflettendo le
variazioni fisiologiche piuttosto che gli
errori nella tecnica o nella metodologia.
Prestazioni del Dosaggio
Vedi Tabelle e Grafici per dati
rappresentativi delle prestazioni del
Dosaggio. I risultati sono espressi in milli
unità Internazionali per millilitro (mIU/mL)
in termini di WHO 2° Preparazione
38
Precisione Intra-Dosaggio (IntraSeduta): Sono state calcolate statistiche
per i campioni dai risultati di 20 coppie di
provette in un unico dosaggio. (Vedi
tabella “Intraassay Precision”.)
Precisione Inter-Dosaggio (Da Seduta a
Seduta): Sono state calcolate statistiche
per i campioni dai risultati di coppie di
provette in 20 dosaggi diversi. (Vedi
tabella “Interassay Precision”.)
Specificità: L'antisiero Coat-A-Count FSH
IRMA è molto specifico per l'FSH, con una
crossreattività bassa verso gli ormoni
glicoproteici strutturalmente simili quali
l'HCG, l'LH ed il TSH.
Linearità: I campioni sono stati dosati a
varie diluizioni. (Vedi tabella "Linearity" per
dati rappresentativi.)
Effetto fine Seduta: nessuno fina a circa
300 provette. (Vedi tabella "End-of-Run
Effect".)
Recupero: Ai campioni sono state
aggiunte tre soluzioni di FSH 1:19 (185,
370, e 575 mIU/mL) e quindi dosati. (Vedi
tabella "Recovery" per dati
rappresentativi).
Bilirubina: La presence di bilirubina in
concentrationi fino a 200 mg/L non ha
nessun effetto sui risultati entro il range di
precisione del dosaggio.
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni fino a
30 µL/mL non ha nessun effetto sui
risultati, entro il range di precisione del
dosaggio.
Tipo di Campione Alternativo: Per
determinare l'effetto di campioni
alternativi, è stato prelevato del sangue da
41 volontari in provette semplici,
eparinizzate, EDTA e Becton Dickinson
®
vacutainer SST . L'FSH è stata aggiunta a
tutti i campioni; poi i campioni sono stati
analizzati mediante il procedimento di
FSH dell'Coat-A-Count IRMA, con i
risultati seguenti.
(EDTA) = 0,96 (Siero) + 0,0 mIU/mL
r = 0,9995
(Eparina) = 1,03 (Siero) – 0,2 mIU/mL
r = 0,999
(SST) = 1,02 (tubi semplici) – 0,2 mIU/mL
r = 0,999
Valore medio:
8,0 mIU/mL (Siero)
8,1 mIU/mL (Eparina)
7,7 mIU/mL (EDTA)
8,0 mIU/mL (SST)
Comparazione di Metodi: Il dosaggio
Coat-A-Count FSH IRMA è stato
comparato al dosaggio IMMULITE FSH su
37 campioni con concentrazioni di FSH
approssimativamente da 1 ad 86 mIU/mL.
(Vedi grafico) Mediante regressione
lineare:
(CAC IRMA) = 1.00 (IML) – 0,02 mIU/mL
r = 0,993
Valori Medi
26,5 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA)
26,5 mIU/mL (IMMULITE)
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
Português
Utilização: O Coat-A-Count FSH IRMA é
um ensaio imunoradiométrico concebido
para a medição quantitativa da hormona
folicoestimulante (FSH, folitropina) no
soro. Destina-se estritamente a uso de
diagnóstico in vitro como auxiliar no
diagnóstico e tratamento de disfunções
hipofisárias e gonádicas.
Números de catálogo: IKFS1 (100 tubes),
IKFS2 (200 tubes)
O kit de 100 tubos contém menos
de 20 microcuries (740
quilobecquerels) de anti-FSH
125
policlonal I; o kit de 200 tubos contém
menos de 40 microcuries (1 480
quilobecquerels).
Sumário e Explicação do Teste
A hormona folicoestimulante (FSH) é
segregada pelas células beta da glândula
pituitária anterior sob o controlo da
hormona responsável pela libertação de
gonadotropina produzida no hipotálamo.
Trata-se de uma glicoproteína com um
peso molecular de aproximadamente
28 000 daltons, composta por duas
cadeias polipeptídeas denominadas alfa e
beta. As cadeias alfa da FSH, LH, TSH e
HCG são bioquimicamente idênticas,
enquanto as cadeias beta são
bioquimicamente únicas e conferem
especificidade imunológica e biológica. A
bioactividade é também determinada pela
cadeia beta.
A FSH propicia o desenvolvimento e
manutenção do tecido gonádico, que
sintetiza e segrega as hormonas
esteróides. Os níveis de FSH em
circulação são controlados pelas
hormonas esteróides, através de um
feedback negativo no hipotálamo. Embora
a FSH e a LH sejam necessárias para
uma função sexual normal, tanto
masculina como feminina, os padrões de
secreção são muito diferentes para os
dois sexos. Em indivíduos adultos com
maturidade sexual, a FSH e a LH não são
segregadas em quantidades constantes;
pelo contrário, a secreção pulsátil resulta
em flutuações rápidas ao longo de toda a
gama de referência (i.e., como uma
variação de ± 50–100%). Devido a esta
secreção pulsátil, as amostras do mesmo
paciente obtidas no mesmo dia podem
apresentar uma ampla variação dentro da
gama de referência, traduzindo uma
variação fisiológica e não erros na técnica
ou na metodologia.
Em indivíduos do sexo feminino com
maturidade sexual, a FSH inicia o
crescimento e o desenvolvimento dos
folículos dos ovários. Durante a ovulação,
quando o folículo entra em ruptura, o
folículo, agora denominado corpus
luteum, segrega estradiol e progesterona,
que controlam os níveis de FSH em
circulação através de um feedbak
negativo no hipotálamo. Na menopausa, a
diminuição da função dos ovários resulta
numa diminuição na secreção do
estradiol. Devido à ausência de um
mecanismo de feedback negativo, com o
estradiol reduzido, os níveis de FSH em
39
circulação tornam-se significativamente
mais baixos.
Em indivíduos do sexo masculino com
maturidade sexual, a FSH está associada
à estimulação e manutenção do
espermatogénese. A testosterona e o
estradiol fornecem o mecanismo de
feedbak negativo ao hipotálamo para
controlar a libertação de FSH. A
infertilidade masculina pode dever-se a
hipogonadismo causado por insuficiência
testicular primária. A insuficiência
testicular pode ser resultado de uma falha
funcional de maturação ou de danos ao
nível da célula germinativa. Qualquer que
seja a sua etiologia, as condições de
hipogonadismo têm como resultado
líquido o aumento drástico dos níveis de
FSH em circulação, devido à ausência de
um mecanismo de feedback negativo.
Existem outras disfunções testiculares
que apresentam baixos valores de FSH,
que se devem contudo provavelmente a
uma produção insuficiente de
gonadotropina e são indicativas de
disfunções hipofisiárias e hipotalámicas.
A disfunção da glândula pituitária é muitas
vezes um agente causador de
insuficiência gonádica secundária. Isto
resulta numa diminuição da secreção quer
de FSH quer de LH. O efeito líquido, tanto
em homens como em mulheres, é a
infertilidade. Isto observa-se também nas
disfunções do sistema nervoso central e a
seguir à administração de determinados
fármacos depressores, como as
fenotiazinas.
Princípio do Procedimento
O Coat-A-Count FSH IRMA é um ensaio
imunoradiométrico de fase sólida baseado
em anticorpos anti-FSH monoclonais e
policlonais: o anticorpo anti-FSH policlonal
125
marcado com I na fase líquida e o
anticorpo anti-FSH monoclonal
imobilizado na parede de um tubo de
poliestireno.
decantação da mistura de reacção e da
lavagem do tubo; isto reduz a ligação não
específica para um nível muito baixo e
garante uma excelente precisão de gama
baixa.
A concentração de FSH é directamente
proporcional à radioactividade presente
no tubo depois da fase de lavagem. A
radioactividade é medida usando um
contador gama; seguidamente, a
concentração de FSH na amostra de
paciente é obtida comparando as
contagens por minuto do paciente com as
obtidas para o conjunto de calibradores
fornecido.
Reagentes para Pipetar: 1
Tempo de Incubação Total: 1 hora (num
agitador mecânico)
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: aproximadamente 300 000 cpm
Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado a materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com as
leis aplicáveis.
Não utilize reagentes que tenham
ultrapassado o seu prazo de validade.
Alguns componentes fornecidos com este
kit podem conter matéria de origem
humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções.
Manipule com as devidas precauções
todos os materiais capazes de transmitir
doenças infecciosas. As matérias primas,
obtidas de soro humano, foram testadas,
revelando resultados negativos para a
sífilis, para os anticorpos do vírus da
imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2;
para o antigénio de superfície da hepatite
B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus
da hepatite C.
A FSH é capturada entre o anticorpo
anti-FSH monoclonal imobilizado na
superfície interior do tubo de poliestireno
e o marcador anti-FSH policlonal marcado
radioactivamente.
Azida de sódio foi adicionada como
conservante; para evitar acumulações de
azidas metálicas explosivas em
canalizações de cobre e alumínio, os
reagentes devem ser rejeitados no esgoto
apenas se estiverem diluídos e forem
lavados com grandes volumes de água.
O anticorpo não ligado anti-FSH marcado
125
com I é removido através da
Água: Utilize água destilada ou
desionizada.
No procedimento:
40
Radioactividade
Uma cópia de uma licença de utilização
de produtos radioactivos (Específica ou
Geral) emitida para um cliente dos EUA,
deve estar em poder da Siemens
Healthcare Diagnostics antes do envio
dos kits ou componentes que contenham
material radioactivo. Estes materiais
radioactivos podem ser adquiridos por
qualquer cliente que possua a necessária
licença Específica. Com uma licença
generalista, estes produtos radioactivos
só podem ser adquiridos por médicos,
veterinários na prática de medicina
veterinária, laboratórios clínicos e
hospitais - e estritamente para uso clinico
in vitro ou testes laboratoriais que não
envolvam a administração externa ou
interna do material radioactivo ou a sua
radiação para seres humanos ou outros
animais. A sua aquisição, prescrição,
armazenamento, utilização, transporte e
eliminação estão sujeitos aos
regulamentos legais e a licença (Geral ou
Específica) emitida pela Comissão
Reguladora Nuclear dos E.U.A. ou por um
Estado com o qual a NRC (Comissão
Reguladora Nuclear) tenha estabelecido
um protocolo para o exercício do controlo
regulador.
Tratar os materiais radioactivos de acordo
com os requisitos da sua licença,
Específica ou Generalista. Para minimizar
a exposição à radiação, deve o utilizador
seguir as instruções da publicação do
Departamento Nacional de Normas em
(Utilização Segura de Materiais
Radioactivos(Livro No. 92, publicado em 9
de Março de 1964) e publicações
seguintes de Autoridades Federais e
Estaduais.
Limpar imediatamente os derrames e
descontaminar as superfícies afectadas.
Evitar os aerossóis. Eliminar os resíduos
sólidos radioactivos de acordo com os
requisitos da licença Os detentores de
licenças generalistas (titulares da licença
483 da NRC) podem eliminar os resíduos
sólidos radioactivos como resíduos não
radioactivos depois de remover os rótulos.
Os detentores de licenças Específicas
(Licença 313 da NRC) devem ter em
conta o Capitulo 10 do artigo 20, do
Código de Normas Federais. Os
detentores de licenças de Estados
abrangidos no Acordo devem ter em
atenção as normas apropriadas do seu
próprio estado. Os detentores de licenças
generalistas podem eliminar os resíduos
líquidos radioactivos do tipo dos resíduos
contidos neste produto através de um
esgoto de laboratório. As entidades
licenciadas devem remover ou tornar
ilegíveis os rótulos dos contentores vazios
de materiais radioactivos antes da sua
eliminação como resíduos sólidos. Os
detentores de licenças específicas podem
eliminar pequenas quantidades de
resíduos líquidos radioactivos do tipo
usado neste produto através de um
esgoto de laboratório. Devem ser
cumpridas as normas em vigor aplicáveis
ao seu laboratório.
Materiais Fornecidos –
Preparação Inicial
Tubos Revestidos com Anticorpos FSH
(IFS1)
Tubos de poliestireno revestidos com
anticorpos FSH monoclonais murinos e
embalados em saquetas de fecho
hermético. Armazenar refrigerado e
protegido da humidade, voltando a fechar
cuidadosamente as saquetas depois de
abertas: estável a uma temperatura de
2–8°C até ao prazo de validade indicado
na saqueta.
IKFS1: 100 tubos. IKFS2: 200 tubos.
125
Anticorpos FSH I (IFS2)
Anticorpo anti-FSH policlonal de cabra
iodado, com conservante. O reagente é
fornecido na forma líquida, pronto a usar.
Cada frasco contém 5,5 mL. Estável a
uma temperatura de 2–8°C durante 30
dias depois de aberto ou até ao prazo de
validade indicado no rótulo.
IKFS1: 2 frascos. IKFS2: 4 frascos.
Calibradores FSH (FSI3–9)
Sete frascos, rotulados de A a G, de
calibradores FSH numa matriz de soro
não humano/tampão, com conservante.
Os calibradores são fornecidos na forma
líquida, prontos a usar. O frasco A do
calibrador zero contém 5 mL, enquanto os
restantes frascos de calibradores de B a
G contêm 2 mL cada. Estável a uma
temperatura de 2–8°C durante 30 dias
depois de aberto. Para períodos de
armazenamento mais prolongados,
aliquotar e congelar: estável a uma
temperatura de –20°C durante 6 meses.
IKFS1: 1 conjunto. IKFS2: 1 conjunto.
41
Os calibradores contêm, respectivamente,
0, 1,5, 5, 15, 30, 60 e 100 mili-Unidades
Internacionais de FSH por mililitro
(mIU/mL) nos termos da Segunda
Referência Internacional para a
Preparação de FSH da Glândula
Pituitária, número 78/549 (2ª IRP 78/549)
da Organização Mundial de Saúde.
Concentrado de Solução de Lavagem
Tamponizado (1TSBW)
40 mL de uma solução salina
tamponizada concentrada, com
surfactantes e azida de sódio como
conservante. Usando um recipiente de
transferência, diluir o conteúdo de cada
frasco com 400 mL de água destilada,
para um volume total de 440 mL. Estável
a uma temperatura de 2–8°C durante 6
meses depois de preparado.
IKFS1: 1 frasco x 40 mL.
IKFS2: 2 frascos x 40 mL.
Materiais Necessários mas Não
Fornecidos
Contador Gama — compatível com tubos
standard 12x75 mm
Agitador mecânico — definido para
aproximadamente 200 movimentos por
minuto.
Preparação dos Reagentes
Água destilada ou desionizada
Proveta graduada — para uma dose de
400 mL.
Contentor plástico de armazenamento
com tampa — para preparação e
armazenamento de Solução de Lavagem
Tamponizada
Imunoensaio
Micropipetas: 100 µL
Dispensador — para uma dose de 2,0 mL
de Solução de Lavagem Tamponizada.
Dispositivo de decantação de espuma —
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: FDR).
Papel milimétrico log-log de 3 ciclos
Um controlo de três níveis de
imunoensaio baseado em soro humano,
contendo FSH como um dos mais de 25
constituintes submetidos a ensaio, está
disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo:
CON6).
42
Colheita
O paciente não necessita de estar em
jejum. Não são necessárias preparações
especiais. Colher sangue por punção
13
venosa para tubos lisos (sem
anticoagulante), e separar o soro das
células. Anotar a data e hora da colheita.
Recomenda-se o uso de uma ultra
centrífuga para clarear amostras
lipémicas.
Amostras hemolisadas podem indicar
tratamento incorrecto de uma amostra
antes do envio para o laboratório; portanto
os resultados devem ser interpretados
com cuidado.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count FSH
IRMA não foram ainda testados com
todas as possiveis variações originadas
pelos tipos de tubos. Consultar a secção
Tipos de Amostras Alternativas para obter
detalhes sobre os tubos que foram
testados.
Volume de Amostra: 100 µL por tubo
Armazenamento: 2–8°C a 2 dias, ou 2
meses a –20°C.
Antes do ensaio, deixar as amostras à
temperatura ambiente (15–28°C), e
misturar com movimentos suaves ou por
inversão. Aliquotar, se necessário, a fim
de evitar o descongelamento e
congelamento repetidos. Não tentar
descongelar espécimens congelados
aquecendo-os em banho-maria.
O Coat-A-Count FSH IRMA tem uma
gama de trabalho até 100 mIU/mL. Todas
as amostras que se preveja que
contenham concentrações de FSH
superiores a este valor deverão ser
diluídas com o calibrador zero antes do
ensaio.
Procedimento de Ensaio
Imunométrico
Todos os componentes devem estar à
temperatura ambiente (15–28°C) antes da
sua utilização.
1
Rotular dezasseis Tubos Revestidos
com Anticorpos FSH como A (ligação
não específica) e de B a G ("ligação
máxima") em duplicado. Rotular
Tubos Revestidos com Anticorpos
FSH adicionais, também em
duplicado, para controlos e amostras
de paciente.
Calibradores
mIU/mL
2ª IRP 78/549 da OMS
T*
—
A (NSB)
0
B
1,5
C
5
D
15
E
30
F
60
G ("MB")
100
* Opcional
2
Pipetar 100 µL de cada calibrador,
controlo e amostra de soro de
paciente para os tubos preparados.
Pipetar directamente para a base
do tubo. As amostras que se preveja
que contenham concentrações de
FSH superiores ao calibrador mais
elevado (100 mIU/mL) deverão ser
diluídas no calibrador zero.
Recomenda-se a utilização de
micropipetas de ponta descartável, a
fim de evitar contaminação entre
amostras. Devem ser utilizadas
pipetas de transporte e pipetadoresdiluidores automáticos apenas se a
possibilidade de contaminação tiver
sido avaliada e considerada como não
significativa.
3
Adicionar 100 µL de Anticorpos FSH
125
I a todos os tubos.
Pipetar directamente para a base
dos tubos. Garantir que a amostra e
o marcador estão completamente
misturados. Recomenda-se um
dispensador de repetição. Reservar
os tubos T (opcionais) para contagem
na etapa 6; não necessitam de mais
processamento.
4
Misturar durante 60 minutos num
agitador mecânico.
5
Decantar completamente. Adicionar
2 mL de Solução de Lavagem
Tamponizada a cada tubo. Esperar 1
a 2 minutos, e de seguida, decantar
completamente. Adicionar novamente
2 mL de Solução de Lavagem
Tamponizada, esperar 1 a 2 minutos,
e decantar completamente.
Remover toda a humidade visível
melhorará significativamente a
precisão. Depois da segunda
lavagem, decantar o conteúdo de
todos os tubos (à excepção dos tubos
T) usando um dispositivo de
decantação de espuma, e deixá-los
escorrer durante 2 ou 3 minutos. De
seguida, agitar fortemente os tubos e
eliminar todas as gotas residuais com
papel absorvente.
6
Contar 1 minuto num contador gama.
Em contadores de cabeça múltipla, os
tubos (opcionais) de contagem total
deverão ser separados dos restantes
tubos do ensaio pelo menos um
espaço, a fim de minimizar a
possibilidade de derrame.
Cálculos e Controlo de
Qualidade
Para calcular os resultados (em termos de
unidades de concentração) a partir de
uma representação log-log da curva de
calibração, corrigir primeiro as contagens
por minuto (CPM) de cada par de tubos,
subtraindo a CPM média dos tubos de
ligação não específica (calibrador A):
Contagens Líquidas = CPM Média menos CPM
Média com NSB
Determinar de seguida a percentagem de
ligação (relativamente à do calibrador
mais elevado) – aqui designada "%B/MB"
– de cada par de tubos como uma
percentagem de "ligação máxima",
considerando as contagens corrigidas
com NSB do calibrador mais elevado
como 100%:
Percentagem de Ligação = (Contagens Líquidas
/ Contagens MB Líquidas) × 100
Usando papel milimétrico log-log de 3
ciclos, representar a Percentagem de
Ligação relativamente à Concentração
para cada um dos calibradores diferentes
de zero, e desenhar uma curva
aproximando a trajectória destes pontos.
(Ligar os pontos de calibração com arcos
ou segmentos de linha recta. Não tentar
aplicar uma única linha recta aos dados.)
É então possível calcular as
43
concentrações de controlos e amostras
desconhecidas dentro da gama dos
calibradores diferentes de zero com base
na curva de calibração por interpolação.
Pode ser usada uma representação
adicional da Percentagem de Ligação
relativamente à Concentração para os três
calibradores mais baixos em papel
milimétrico linear-linear para interpolação
próximo da dose zero.
Observações: Embora sejam aceitáveis
outras abordagens, a redução de dados
pelo método que acabamos de descrever
apresenta certas vantagens do ponto de
vista do controlo da qualidade. Em
particular, produz uma curva de calibração
relativamente linear tanto nas
representações log-log como linear-linear,
e relativamente estável de ensaio para
ensaio. Produz igualmente parâmetros de
CQ úteis, tais como valores de
Percentagem de Ligação (%B/MB) para
os calibradores diferentes de zero. Pode
obter-se um gráfico ainda mais informativo
que veicula uma ideia de reprodutibilidade
intra-ensaio em função da concentração,
representando directamente os valores da
Percentagem de Ligação de tubos de
calibrador individuais, ou seja, sem ter de
calcular primeiro a média da CPM das
réplicas.
Alternativas: Embora a Percentagem da
Ligação possa ser calculada directamente
a partir da CPM Média, a correcção da
ligação não específica produz
normalmente uma curva de calibração
mais próxima da linearidade em toda a
sua amplitude. Também é possível gerar
uma curva de calibração representando
directamente a CPM ou a CPM Média
relativamente à Concentração em papel
milimétrico log-log ou linear-linear. (Não
deve ser usado papel milimétrico semilogarítmico). Esta abordagem tem a
vantagem de ser mais simples, mas é
menos recomendável do ponto de vista do
controlo da qualidade.
Redução de Dados Computadorizada:
Os métodos “ponto-a-ponto”, incluindo as
aproximações lineares e por spline cúbico,
são adequadas; todavia, uma vez que
fornecem pouca ajuda na monitorização
da fiabilidade de um ensaio, é importante
preparar a representação log-log
recomendada da curva de calibração,
manualmente ou por computador, como
etapa do controlo da qualidade. As
44
técnicas de redução de dados baseadas
no modelo logístico poderão também ser
aplicadas. Nesta família, as rotinas de
aproximação de curvas baseadas em
logística de 4 ou 5 parâmetros são as
possibilidades mais adequadas. Deve
contudo ter-se em atenção que alguns
algoritmos actualmente utilizados podem
não convergir com êxito, mesmo quando o
modelo de logística é fiel aos dados. Se
for adoptado um método logístico, é
essencial verificar a sua adequabilidade
ao ensaio de cada dia, monitorizando o
cálculo de confirmação dos calibradores e
outros parâmetros. Além disso, é
altamente recomendada uma
representação da curva de calibração em
log-log, já que é mais informativa do que a
representação semi-logarítmica
convencional.
Manuseamento de Amostras: Devem
ser criteriosamente respeitadas as
instruções de manuseamento e
armazenamento das amostras do
paciente e componentes. Diluir as
amostras de paciente que se preveja que
excedam a concentrações de FSH
superiores à do calibrador mais elevado
(100 mIU/mL) com o calibrador zero antes
do ensaio. Todas as amostras, incluindo
os calibradores e controlos, devem ser
submetidas a ensaio pelo menos duplo. É
importante usar uma micropipeta de ponta
descartável, substituindo a ponta entre
cada amostragem, a fim de evitar
contaminação entre amostras. Deverão
ser usadas pipetas de transporte e
pipetadores-diluidores automáticos
apenas se a possibilidade de
contaminação tiver sido avaliada e
considerada como não significativa. Os
pares de tubos de controlo podem ser
espaçados ao longo do ensaio a fim de
ajudar a confirmar a ausência de desvio
significativo. Analisar os resultados para
verificar a concordância entre pares de
tubos.
Contador Gama: Para minimizar a
possibilidade de derrame em contadores
gama de reservatório múltiplo, os tubos
opcionais de contagem total (T) deverão
ser separados por um ou mais espaços
dos restantes tubos do ensaio.
Alternativamente, adicionar apenas 25 µL
do marcador a cada um dos tubos T na
etapa 3, e multiplicar por 4 as contagens
por minuto observadas nestes tubos.
Controlos: Os controlos ou os pools de
soro com pelo menos dois níveis de
concentração de FSH (elevado e baixo)
devem por rotina ser submetidos a ensaio
como amostras desconhecidas, e os
resultados devem ser representados em
gráfico dia a dia de acordo com o
procedimento descrito em Westgard JO,
et al. Um gráfico de regras múltiplas para
controlo da qualidade. Clin Chem 1981;
27:493-501. As amostras de repetição
constituem uma ferramenta adicional útil
para monitorizar a precisão inter-ensaios.
Parâmetros de CQ: Recomendamos o
acompanhamento destas medições de
desempenho:
FSH
Homens adultos
Mediana Central 95%
mIU/mL Gama mIU/mL n
3,9
1,1 – 13,5*
16
38
Mulheres adultas
Folicular
5,0
3,3 – 8,8
Meio do ciclo
10,1
5,4 – 20*
10
Luteal
3,1
1,6 – 8,7
45
Contraceptivos
orais
1,3
ND – 4,6*
12
Pós-menopausa
73
42 – 126*
12
Pós-menopausa,
terapia de
substituição de
estrogénios
27
9,5 – 113*
16
0,9
0,1 – 3,4*
14
T = Contagens Totais (como contagens por
minuto)
Pré-pubertário
(1 – 13 anos)
%NSB = 100 × (Contagens NSB Médias /
Contagens Totais)
ND: Não detectável
* Equivalente a intervalo absoluto
%MB = 100 × (Contagens Líquidas MB /
Contagens Totais)
Os laboratórios deverão considerar estes
resultados apenas como directrizes. Cada
laboratório deve estabelecer os seus
próprios valores de referência.
E os valores de Percentagem de Ligação
("%B/MB") de todos os calibradores
excepto do calibrador diferente de zero
mais elevado, por exemplo:
%C/MB = 100 × (Contagens Líquidas Calibrador
"C" / Contagens Líquidas MB)
Manutenção de Registos: É boa prática
laboratorial registar para cada ensaio os
números de lote dos componentes
usados, bem como as datas em que os
mesmos foram reconstituídos ou abertos
pela primeira vez.
Literatura Adicional: Ver Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
Exemplo de Ensaio: Apenas para
ilustração, não para calcular resultados de
outro ensaio. (Ver tabela "Exemplo de
Ensaio".)
Valores de Referência
Foram realizados estudos em indivíduos
saudáveis em duas instalações separadas
usando o kit Coat-A-Count FSH IRMA,
conforme com a 2ª IRP 78/549 da OMS.
Limitações
Em certos casos de infertilidade, o
tratamento com gonadotropinas humanas
coloca um potencial problema à medição
rigorosa dos níveis de FSH. A FSH
administrada pode fazer com que o
paciente produza anticorpos contra a
FSH, o que terá interferência no ensaio.
Devido à secreção rítmica, as amostras
do mesmo paciente obtidas durante o
mesmo dia podem ter uma ampla
variação dentro da gama de referência,
traduzindo uma variação fisiológica e não
erros na técnica ou na metodologia.
Características do Ensaio
Consulte Tabelas e Gráficos para dados
representativos do desempenho do
doseamento. Os resultados são
expressos em mili-Unidades
Internacionais por mililitro (mIU/mL) de
acordo com a Segunda Referência
Internacional para Preparação de FSH
Pituitária, número 78/549 (2ª IRP 78/549)
da Organização Mundial de Saúde.
Calibração: Até 100 mIU/mL
(WHO 2nd IRP 78/549).
Sensibilidade Analítica: 0,06 mIU/mL,
45
Efeito Hook de Alta Dose: nenhum até
10 000 mIU/mL.
Precisão Intra-ensaio (Entre ensaios)
Foram calculadas estatísticas para
amostras a partir dos resultados de 20
pares de tubos num único ensaio. (Ver
tabela “Precisão Intra-ensaio”.)
Precisão Inter-ensaio (Ensaio a ensaio)
Foram calculadas estatísticas para
amostras a partir dos resultados de pares
de tubos em 20 ensaios diferentes. (Ver
tabela “Precisão Inter-ensaio”.)
Especificidade: O anti-soro Coat-ACount FSH IRMA é altamente específico
para FSH, com baixa reactividade cruzada
a hormonas de glicoproteína
estruturalmente relacionadas tais como
HCG, LH e TSH.
Médias:
8,0 mIU/mL (Soro)
8,1 mIU/mL (Heparina)
7,7 mIU/mL (EDTA)
8,0 mIU/mL (SST)
Comparação de Métodos: O
procedimento Coat-A-Count FSH IRMA foi
comparado com o IMMULITE FSH em 37
amostras de paciente com concentrações
de FSH entre os valores aproximados de
1 a 86 mIU/mL. (Ver gráfico) Regressão
linear:
(CAC IRMA) = 1,00 (IML) – 0,02 mIU/mL
r = 0,993
Médias
26,5 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA)
26,5 mIU/mL (IMMULITE)
Assistência Técnica
Linearidade: As amostras foram
doseadas sob várias diluições. (Consulte
a tabela "Linearidade" para dados
representativos.)
Por favor contacte o seu Distribuidor
Nacional.
Efeito Fim-de-Série: nenhum até
aproximadamente 300 tubos. (Ver tabela
"Efeito Fim-de-Série".)
O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está registado sob a norma ISO
13485:2003.
Recuperação: Foram submetidas a
ensaio amostras a que foram adicionadas
três soluções de FSH de 1 para 19 (185,
370, e 575 mIU/mL). (Ver tabela de
"Recovery" para dados representativos.)
Bilirrubina: A presença de bilirrubina nas
concentrações até 200 mg/L não tem
qualquer efeito nos resultados, dentro da
precisão do ensaio.
Hemolise: A Presença de eritrocitos em
concentrações até 30 uL/mL não tem
efeito no resultado, dentro da precisão do
ensaio.
Tipo de amostra alternativa: Para
determinar o efeito de amostras
alternatives, foi colhido sangue de 41
voluntários em tubos secos, com EDTA,
®
heparinizados e tubos de vacum SST da
Becton Dickinson. Todas as amostras
foram ensaiadas pelo método Coat-ACount IRMA FSH, com os seguintes
resultados.
(EDTA) = 0,96 (Soro) + 0,0 mIU/mL
r = 0,9995
(Heparina) = 1,03 (Soro) – 0,2 mIU/mL
r = 0,999
(SST) = 1,02 (tubos simples) – 0,2 mIU/mL
r = 0,999
46
IMMULITE® and Coat-A-Count® are trademarks
of Siemens Healthcare Diagnostics.
©2010 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. All
rights reserved.
Origin: US
Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
Los Angeles, CA 90045 USA
Siemens Healthcare Diagnostics Ltd.
Sir William Siemens Sq.
Frimley, Camberley, UK GU16 8QD
2010-11-02
PIIKFS – 9
Changes in this Edition:
cc#19759: Removed IKFS5 kit size and all
associated component sizes and radioactivity
information. In Materials Required But Not
Provided section, added FDR catalog number
for foam decanting rack; removed “available
from Siemens” claim for graph paper ZPIRM,
rack shaker DPSR1/DPSR2 and 2 mL dispenser
DB2ML. Removed Technical Bulletin ZJ019
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symboles suivants peuvent apparaître sur les
étiquettes des produits : / Sull'etichetta del
prodotto possono essere presenti i seguenti
simboli: / Os seguintes símbolos podem
aparecer no rótulo dos produtos:
Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
Symbol Definition
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro Biológico
Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
47
Symbol Definition
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
LOT
48
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
Symbol Definition
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente

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