Resumo_aula de ver?o 2014

 27 de janeiro a 07 de fevereiro
IX Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular
Departamento de Bioquímica - Instituto de Química – USP-2014
Professores
Amanda Carolina Padilha Salviatto
[email protected]
Amanda Wanderley
[email protected]
Cícero Alves Lima Júnior
[email protected]
Gabriel Braga Oliveira
[email protected]
Gilberto Hideo Kaihami
[email protected]
Hellio Danny Nobrega de Souza
[email protected]
Laura Farkuh
[email protected]
Laura Sardá Arroyo
[email protected]
Luís Bruno da Cruz e Alves de Moraes
[email protected]
LABORATÓRIOS E DOCENTES RESPONSÁVEIS
1. Laboratório Biologia Molecular do Câncer - Profa. Dra. Daniela Sanchez Bassères - Bloco 9I sala 924
2. Laboratório de Bioquímica de Insetos - Profa. Dra. Clélia Ferreira - Bloco 12I sala 1212
3. Laboratório de Sistemas Biomiméticos - Profa. Dra. Iolanda Midea Cuccovia - Bloco 10I sala 1001
4. Laboratório de Neurociências - Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich - Bloco 08S sala 858
5. Laboratório de Fisiologia Molecular de Plantas - Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta – Bloco 09S sala 953
6. Laboratório de Genômica e Expressão Gênica em Câncer - Prof. Dr. Eduardo M. R. Reis - Bloco 12I sala 1208
7. Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias Patogênicas – Profa. Dra. Regina L. Baldini – Bloco 12I sala 1211
SECRETARIA DO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA – BLOCO 3S SALA 351
([email protected])
Fábio Batista da Silva
Carolina Nóbrega da Rocha Martins
Laura Ribeiro da Silva
Simone Corrêa
Viviane Santos Mendonça de Oliveira
([email protected])
([email protected])
([email protected])
([email protected])
([email protected])
COORDENADORES
Prof. Dr. Fabio Luis Forti
Profa. Dra. Leticia Labriola
Profa. Dra. Nadja C. de Souza Pinto
([email protected])
([email protected])
([email protected])
Bloco 9I sala 924
Bloco 9I sala 908
Bloco 10S sala 1065
HORÁRIOS E ATIVIDADES
Dias
Horário
Atividade
Local
Apresentação
Anfiteatro CINZA
8:30 – 12:30
Laboratório
27/01
14:00 – 18:00
Laboratório
8:30 – 12:30
Laboratório
14:00 – 18:00
Laboratório
8:30 – 12:30
Laboratório
28/01 a 04/02
05/02
14:00 – 18:00
Seminários dos Laboratórios 1, 2 e 3
Anfiteatro CINZA
Seminários dos Laboratórios 4 e 5
Anfiteatro CINZA
8:30 – 12:30
Visita a Central Analítica
06/02
Seminários dos Laboratórios 6 e 7
Anfiteatro CINZA
14:00 – 18:00
Visita ao Confocal/FACS/Odyssey
8:30 – 12:30
Visita ao Instituto Butantan
14:00
Preenchimento de Formulário de Avaliação
Anfiteatro CINZA
15:00
Encerramento
Praça de Integração
07/02
SEMINÁRIOS
DIA
05/02
05/02
05/02
TÍTULO
Biologia Molecular do Câncer
Bioquímica de Insetos
Sistemas Biomiméticos
06/02
Neurociências
PALESTRANTE
Amanda Carolina Padilha Salviatto
Gabriel Braga Oliveira
Laura Farkuh
Hellio Danny Nobrega de Souza
Bioquímica Biologia Molecular de Algas
Laura Sardá Arroyo
Amanda Wanderley
Fisiologia Molecular de Plantas
Genômica e Expressão Gênica em Câncer
Biologia Molecular de Bactérias Patogênicas
Cícero Alves Lima Júnior
Luís Bruno da Cruz Alves de Moraes
Gilberto Hideo Kaihami
06/02
06/02
06/02
PARTICIPANTES E LABORATÓRIOS
ALUNOS
27, 28, 29
29, 30,31
03, 04, 05
janeiro
janeiro
fevereiro
1.
João Paulo da Luz Silva
1
6
5
2.
Railmara Pereira da Silva
1
3
7
3.
Rodrigo Duarte Silveira
4
6
3
4.
João Ronielly Campelo Araújo
5
7
3
5.
José Lopes Pereira Júnior
3
4
5
6.
Felipe Akihiro Melo Otsuka
4
2
3
7.
Talita Nayara Bezerra Lins
7
1
4
8.
Nivaldo do Nascimento Junior
3
4
6
9.
Jonatas da Silva Franco
5
4
7
10.
Victor Daniel Vasquez Matsuda
3
2
4
11.
Maryanne Melanie Gonzales Carazas
3
4
1
12.
Jerônimo Pimentel
6
1
2
13.
Larisa Santos de Oliveira
5
7
1
14.
Marciano Alves dos Santos
4
5
7
15.
Marcus Aurelio da Costa Tavares Sabino
7
1
4
16.
Jessica Pinheiro Silva
7
5
2
17.
Cleberson Souza da Silva
1
3
2
18.
Isadora Gonçalves Martins
6
5
4
19.
Iane da Silva Guimarães
6
1
7
20.
Raphael Santos das Mercês
3
6
5
21.
Michela Ferreira Borges
2
7
6
22.
Emili Bortolon dos Santos
4
7
2
23.
Gabrielle Rosa Silva
1
4
7
24.
Giana Blume Corssac
4
2
1
25.
Thomas Hailliot Bilhar da Silva
2
1
6
26.
Amanda Cristina Rodde
2
5
6
27.
Marcela Rodrigues Lima
5
6
4
28.
Kathleen Liedtke Kolb
6
3
5
29.
Ingryd Fortes Souza
6
3
1
30.
Juliana Marques Kirk
7
2
5
31.
Pollyana Rosa dos Santos Martins
2
7
1
32.
Edson Galdino do Nascimento Filho
7
6
3
33.
Laura Gonçalves Costa Martins
1
2
6
34.
Lucas Carrijo de Oliveira
5
3
2
35.
Maria Eliza Caldas dos Santos
2
5
3
27-29/01
29-31/01
03-05/02
LAB1
LAB2
LAB3
LAB4
LAB5
LAB6
LAB7
1
21
5
3
4
12
7
2
25
8
6
9
18
15
17
26
10
14
13
19
16
23
31
11
22
27
28
30
33
35
20
24
34
29
32
7
6
2
5
14
1
4
12
10
17
8
16
3
13
15
24
28
9
18
20
21
19
30
29
11
26
27
22
25
33
34
23
35
32
31
11
12
3
7
1
8
2
13
16
4
10
5
21
9
24
17
6
15
20
25
14
29
22
32
18
28
26
19
31
34
35
27
30
33
23
Agradecimentos
Pró-Reitoria de Cultura e Extensão
Pró-Reitoria de Graduação
Pró-Reitoria de Pós-Graduação
Instituto de Química
Secretaria do Departamento de Bioquímica Lab1 1. Laboratório de Biologia Molecular do Câncer
Responsável: Profa. Dra. Daniela Bassères
Monitor: Amanda Padilha Salviatto
Introdução
k-Ras e câncer
A k-Ras é uma pequena GTPase que atua como um gatilho molecular convertendo
estímulos extracelulares em respostas intracelulares. Esta transmissão de sinal é feita
através da ativação de uma cascata de vias de sinalização efetoras, culminando no aumento
da proliferação e sobrevida celulares. Quando ativada patologicamente, a k-Ras causa a
transformação maligna. Mutações pontuais que ativam o oncogene k-Ras são muito
frequentes em diversas neoplasias humanas, principalmente no carcinoma pancreático,
onde são encontradas em mais de 90% de pacientes com câncer de pâncreas. Apesar
destas mutações estarem ligadas à oncogênese, diferentes abordagens para inibir as
proteínas Ras diretamente fracassaram na clínica. A ausência de tratamentos eficazes para
este tipo de câncer impulsiona o desenvolvimento de novas terapias, porém, se faz
necessário que os mecanismos moleculares que desencadeiam o câncer induzido por k-Ras
sejam desvendados. Uma abordagem diferente para o desenvolvimento de novas terapias é
identificar alvos da k-Ras, que sejam críticos para o processo oncogênico.
O objetivo geral do laboratório é identificar os mecanismos moleculares acionados
pela k-Rasoncogênica, que são importantes para a transformação maligna e para a
manutenção do fenótipo transformado. Também é nosso objetivo identificar alvos da k-Ras
que tenham potencial terapêutico. Para atingir este objetivo nós utilizamos estratégias
genéticas e farmacológicas tanto em células humanas em cultura quanto em modelos
animais.
A razão fundamental que rege o nosso programa de pesquisa é que espera-se que
este fornecerá novas informações importantes sobre os mecanismos moleculares acionados
pela k-Ras, enquanto que, ao mesmo tempo, espera-se que este programa valide uma nova
direção terapêutica.
Geração de células tumorais pancreáticas (MiaPaca) knockdown para K-Ras de forma
induzível
Nós geramos clones estáveis com inibição de k-Ras em linhagens pancreáticas
MiaPaca (Yunis AA, et al. 1977). O silenciamento gênico destes clones foi realizado a partir
da transfecção de partículas lentivirais. Estas partículas são vetores que carregam o
plasmídeopTRIPz (Open Biosystems), que, sob indução com o antibiótico doxiciclina,
expressam um shRNA (shorthairpinRNA) que promove o silenciamento gênico do gene alvo
(k-Ras), através de RNA de interferência, promovendo assim ainibição da expressão
(knockdown) de k-Ras com o silenciamento do seu mRNA. Como controle, foi usada uma
outra preparação lentiviral, contendo um shRNA sem homologia a mRNAs humanos,
denominada shNTCtrl.
As células com o vetor de interesse, além de possuírem resistência à puromicina,
ainda contém um gene repórter para expressão de proteína fluorescente vermelha, RFP
(redfluorescentprotein), e estão sob o controle de um promotor regulado por doxiciclina. Na
ausência de doxiciclina a expressão do hairpin e da RFP não ocorre, pois esta depende da
interação da proteína regulatória “reverse tetracyclinetransactivator 3” (rtTA3, expressa no
1 Lab1 mesmo vetor a partir de um promotor constitutivo – UBC), o que só ocorre na presença de
doxiciclina.
Após a transdução viral, as células foram selecionadas com puromicida por 15 dias.
As células resistentes foram então plaqueadas (1000 células) em placa de 150 mm, a fim de
formarem colônias celulares isoladas, as quais foram expandidas em placas 35 mm e
induzidas com doxiciclina por 5 dias e testadas quanto à eficiência de knockdown (figura 1).
A
B
Figura 1: Células MiaPaca shRNA para k-Ras após 5 dias de indução com doxiciclina. A) células sob luz
branca e B) células em luz fluorescente, mostrando a expressão da proteína RFP.
Durante o período de seleção e indução as células foram observadas em microscopia
de fluorescência em comprimento de onda de 553ηm, sendo avaliada a proporcionalidade e
intensidade de fluorescência emitida (figura 1). As células com maior expressão da proteína
fluorescente foram selecionadas para análise em nível de proteína, por meio de Western
blotting.
Objetivo
Nesse curso iremos avaliar o resultado do knockdown para k-Ras em células
pancreáticas MiaPaca. Para atingir esse objetivo, utilizaremos células induzidas e não
induzidas com doxiciclina avaliando a expressão da proteína k-Ras, a partir de lisados
celulares e quantificação de proteínas pelo método de Bradford e técnicas de SDS-PAGE e
Western Blotting
Western Blotting
As proteínas podem ser obtidas através de amostras celulares e teciduais. Cada
proteína possui uma carga negativa ou positiva variando as distribuições dos aminoácidos
constituintes em sua cadeia. A técnica de Western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette
1981; Towbinand Gordon 1984) permite separar essas proteínas por um fracionamento
eletroforético em um gel de poliacrilamida e eletrotransferência das proteínas do gel para um
suporte sólido (geralmente uma membrana de nitrocelulose). As quais são marcadas com
anticorpo que reconhecem especificamente o alvo protéico imobilizado. Podem ser
resumidamente divididas em cinco passos: 1) extração e quantificação das proteínas totais;
2) fracionamento das amostras; 3) transferência do produto fracionado para suporte sólido;
4) incubação com anticorpos específicos para detecção do alvo protéico imobilizado e 5)
revelação e análise quantitativa dos dados.
Procedimento:
As células pancreáticas MiaPaca com shRNA para k-Ras foram plaqueadas em
placas de 100mm e induzidas por 5 dias com doxiciclina.
2 Lab1 1- Protocolo de extração de proteínas totais
O grupo receberá as placas de cultura com células previamente tratadas e as
mesmas serão visualizadas no microscópio, observando a confluência e a indução (proceder
com as anotações).
As placas de cultura serão levadas para a bancada para iniciar o protocolo de
extração das proteínas totais.
O tampão utilizado nesta etapa permite lisar as células, já que contém detergentes
(SDS, Triton X-100, Deoxicolato de sódio) e solubilizar as proteínas com os detergentes e
sais que compõem o tampão. Possuindo ainda efeito tamponante em pH 7,2. Os inibidores
que serão adicionados permitem a maior integridade dessas proteínas diminuindo a sua
degradação por proteases e remoção enzimática de fosfatos presentes. O procedimento
seguirá as seguintes etapas:
a) Descartar meio de cultura e lavar placa 2X com PBSA gelado para remoção de proteínas
do meio.
b) Com um raspador, coletar células e transferi-las para um tubo de 1,5mL.
c) Centrifugar por 2 minutos a aproximadamente 3.000g, a 4ºC e descartar sobrenadante.
d) Ressuspender pellet de células em tampão de lise RIPA, com inibidores de fosfatase e
protease;
e) Centrifugar lisado à velocidade máxima (aproximadamente 15.000g), por 20 min, a 4ºC.
f) Coletar o sobrenadante (extrato total de proteínas).
g) Fazer pequenas alíquotas e estocar a -80ºC.
2. Quantificação de Proteínas pelo Método de Bradford
O método de Bradford baseia-se na utilização de um reagente colorimétrico, chamado
Comassiebrilliant blue, que é capaz de se ligar a aminoácidos básicos e aromáticos,
estabilizando a forma aniônica do reagente que possui a coloração azul. De acordo com
esse princípio, podemos estimar quantitativamente a concentração protéica destes lisados,
comparando a coloração obtida através de concentrações crescentes de amostra
conhecidas, comumente obtida com soroalbumina bovina (BSA) por construção de uma
curva de padronização, com suas absorbâncias lidas em 595nm em um espectrofotômetro.
A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os
valores médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da
concentração das proteínas. Para maior confiabilidade dos resultados o coeficiente de
correlação linear deve ser maior que 0,98.
O ensaio de Bradford será realizado em placa de ELISA de 96 poços, consistindo
num volume final de 200 ul para cada poço da placa.
a) Preparar 10 mL do reagente de Bradford, diluindo 1 parte do reagente concentrado em 4
partes de H2O deionizada (MilliQ).
b) Preparar curva padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0,125 ug/ul; 0,25 ug/ul;
0,5 ug/ul; 1,0ug/ul; 2,0 ug/ul; e 4,0ug/ul.
c) Pipetar 5ul de cada padrão por poço, em triplicata.
d) Pipetar também 5ul de cada amostra por poço, em triplicata. O ideal é diluir amostras
concentradas 10X antes da pipetagem, pois geralmente as mesmas se encontram muito
concentradas.
e) Após aplicar as amostras de proteína na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de reagente
Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampão de extração de proteínas
(seguir mesma mistura que as proteínas: 5 ul de tampão + 195 ul de reagente Bradford).
f) Incubar as amostras, por 5 minutos.
g) Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595nm em espectrofotômetro.
3 Lab1 h) Construir curva de padronização, com as concentrações de BSA na abscissa e as
absorbâncias médias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equação de ajuste linear.
i) Medir a absorbância da amostra do extrato total de proteína (média das triplicatas) e
estimar o valor da concentração de proteínas na amostra (variável “x”) substituindo o valor
da absorbância na equação linear resultante da curva padrão (variável “y”).
3. Preparo das amostras
As amostras devem ser previamente tratadas com detergente aniônico SDS em
combinação com agente redutor (B-mercaptoetanol) e calor, para dissociar e desnaturar
completamente as proteínas antes da eletroforese. Os polipeptídios desnaturados se ligam
aos SDS, adquirindo carga negativa, e a quantidade ligada é proporcional ao seu peso
molecular e independente da sequencia de aminoácidos. O complexo SDS-polipeptídeo
migra através do gel de poliacrilamida em função do peso molecular, já que a carga efetiva
da proteína é “mascarada” pelo SDS.
a) Determinar o volume de amostra a ser pipetado no gel, correspondente à quantidade de
proteína que se deseja aplicar.
b) Adicionar tampão de amostra 3X (com B-mercaptoetanol e SDS) de modo a obter
concentração final 1X.
c) Aquecer as amostras a 100ºC por 10 minutos e transferi-las imediatamente para o gelo.
Preparação das Placas
Lavagem
a. Lavar as placas com papel limpo embebido com sabão neutro líquido;
b. Enxaguar com água corrente abundante;
c. Enxaguar com álcool absoluto e deixar secar a temperatura ambiente;
d. Caso seja necessária uma secagem rápida, usar papel seco limpo.
Montagem das Placas
a. Colocar a placa maior e a menor juntas com a face contendo os espaçadores voltada para
dentro, produzindo um estreito espaço entre elas que será preenchido pelo gel (ver
ilustração abaixo);
b. Introduzir as placas unidas dentro do suporte (peça verde de plástico) tomando o cuidado
de manter o suporte apoiado perpendicularmente sobre a superfície plana da bancada.
Apertar as abas de pressão (ver ilustração abaixo);
4 Lab1 c. Colocar o suporte na base apoiando cuidadosamente a parte inferior das placas sobre a
almofada de borracha cinza. Prender o suporte com a presilha sobre a porção superior das
placas (ver ilustração abaixo).
d. Marcar sobre a placa menor o limite entre o gel de migração e o gel de empilhamento com
o auxílio de uma régua. Posicionar a régua sobre a base de maneira que a marcação de 0
cm coincida com a superfície superior da almofada onde as placas estão apoiadas. Usar
uma caneta a base de álcool e marcar a posição referente a 5,5 cm (ver ilustração abaixo).
Preparação do Gel
Solução dos Géis de Migração e Empilhamento (para 2 géis)
PSA 10 % (persulfato de amônia): 0,3 g em 3 ml de H2O miliQ. Deixar o PSA e o TEMED no
gelo antes de serem acrescentados (devem ser acrescentados no momento de montar os
géis).
Montagem do Gel
a. Vortexar o tubo contendo a solução para o gel de separação a 12% e depositar a solução
dentro do espaço compreendido entre as placas maior e menor com o auxílio de uma pipeta
P1000. Preencher o espaço até a marcação de 5,5 cm. Tomar o cuidado de não gerar
5 Lab1 bolhas. Isso pode fazer com que a interface entre os géis de migração e empilhamento não
esteja totalmente reta.
b. Após depositar o gel de migração, em seguida adicione cuidadosamente um pequeno
volume de isopropanol (~100 uL) para a retirada das bolhas. Deixar polimerizar (~ 15-20
minutos).
c. Cumprido o tempo de polimerização, eliminar o isopropanol e secar com papel 3MM. Não
tocar o gel durante esse passo de secagem. Isso pode danificar o gel.
d. Adicionar os devidos volumes de TEMED e PSA (10%) à solução do gel de empilhamento
e despejar diretamente dentro do espaço restante acima do gel de migração.
e. Em seguida, colocar o pente cuidadosamente para não deixar bolhas na extremidade dos
dentes. Isso pode produzir anormalidades na migração e, conseqüentemente, na forma da
banda. Deixar polimerizar (~ 15-20 minutos).
f. Retirar o pente e transferir as placas para o suporte de placas (branco) com a face da
placa menor voltada para o interior do suporte (ver ilustração a seguir). Se preferir, marcar a
base dos poçinhos com uma caneta a base de álcool para facilitar a pipetagem das
amostras.
g. Colocar o aparelho de eletroforese dentro da cuba encaixando as laterais do aparelho nas
laterais da cuba (ver ilustração abaixo).
h. Preencher a cuba com Tampão de Corrida.
4. Eletroforese – Fracionamento proteico
As amostras preparadas e armazenadas no gelo serão aplicadas no gel para o
fracionamento eletroforético. Sua carga foi “mascarada” com o tratamento com SDS (sodium
6 Lab1 dodecyl sulfate) permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo positivo dentro do
campo elétrico, além da quebra de ligações dissulfeto S-S promovidas pelo agente redutor
β-mercaptoetanol, mantendo as proteínas linearizadas (fig.2), podendo assim ser separadas
apenas pelo seu tamanho; já que o fracionamento eletroforético em gel de SDSpoliacrilamida (SDS-PAGE) forma uma espécie de peneira molecular (fig.3) com poros
ajustáveis de acordo com a concentração de acrilamida.
Figura 2. Amostras tratadas para aplicação.
Figura 3. Representação simplificada do fracionamento eletroforético SDS-PAGE.
Aplicação:
Aparato devidamente montado, proceder:
a. Lavar os poçinhos do gel com Tampão de Corrida com a ajuda de uma pipeta P1000
antes de aplicar as amostras
b. Carregar 2,5 µl do Marcador de Peso Molecular em um dos lados do gel. Em seguida,
carregar as amostras atentando aos devidos volumes estimados.
Corrida
c. Preencher a cuba com tampão de corrida. Fixar a tampa da cuba prestando atenção para
não inverter os polos da corrente (vermelho=positivo e preto=negativo). Conectar os cabos
na fonte de alimentação e regular a voltagem. Correr em 85 Volts até a amostra percorrer
7 Lab1 todo o gel de empilhamento. Passar para 125 Volts para correr pelo gel de migração durante
aproximadamente 60 min (o tempo de migração é relativo podendo variar de acordo com a
concentração do gel de migração e tamanho da banda de interesse).
5. Transferência para membrana
Para a análise das proteínas individuais, as proteínas precisam ser identificadas por
anticorpos específicos, mas para isso, necessitamos transferir as proteínas separadas em
gel para um suporte sólido, como uma membrana de nitrocelulose. A transferência é uma
eletrotransferência (fig.4).
Figura 4. Esquema de transferência das proteínas do gel de SDS-PAGE para a membrana.
6. Western blotting
Montagem do “Sandwich”:
a. Cortar a Membrana de Nitrocelulose com a ajuda da placa menor de eletroforese para que
a dimensão da membrana não exceda as dimensões do gel. Isso evita gastos excessivos de
membrana. Usar a mesma placa para cortar 6 pedaços de papel 3MM que serão utilizados
para gerar a força de capilaridade.
b. Encharcar 3 papéis 3MM em Tampão de Transferência e acomodá-los sobre a superfície
do Modulo de Transferência previamente umedecido. Em seguida hidratar a membrana em
Tampão de Transferência durante 2 minutos e colocá-la sobre os papéis 3MM. Rolar
levemente uma pipeta de vidro sobre o pré-sandwich para eliminar possíveis borbulhas
localizadas entre os papéis e a membrana.
c. Retirar o aparelho de eletroforese da cuba e desacoplar cuidadosamente as placas do
cassete. Com o auxílio de uma espátula (verde, BioRad), separar as duas placas de vidro,
sem aplicar uma força exagerada. Isso pode romper uma das placas e danificar o gel.
d. Molhar as pontas dos dedos (usando luvas) com o Tampão de Transferência e transferir o
gel para o sandwich depositando o gel sobre a membrana. Colocar os 3 papéis 3MM
umedecidos restantes sobre o gel e eliminar as borbulhas como descrito no item anterior (fig
5).
Transferência
e. Acomodar o modulo de transferência na cuba de eletroforese e adicionar tampão de
transferência até o nível marcado.
f. Aplicar uma corrente constante de 44 mA durante 1 hora e 30 minutos para géis de
0,75mm e 2 horas para géis de 1,5mm.
8 Lab1 Figura 5. Montagem do “Sandwich” e esquema do aparato de transferência.
Desmontagem do Sandwich
a. Retirar a plataforma superior do modulo de transferência com cuidado. Remover os
papéis 3MM sem mover o gel. Verificar se a transferência funcionou erguendo o canto do gel
onde foi carregado o Marcador de Peso Molecular.
b. Caso tenha transferido, as bandas do Marcador serão bem visualizadas na membrana.
Cortar a membrana com o auxílio de um estilete ou bisturi fora das 4 laterais do gel.
Transferir a membrana para um recipiente contendo água destilada.
c. Enxaguar brevemente o excesso de sal e adicionar um volume de Solução Vermelho de
Ponceau (0.1% em 5% de ácido acético) suficiente para deixar o gel imerso. Deixar a
solução agir durante 15 segundos e recuperar a solução. Enxaguar várias vezes com água
destilada até que as amostras em cada canaleta sejam visualizadas.
d. Enxaguar com Tampão de Lavagem até que o Ponceau tenha desaparecido
completamente (3X com TBST por 5 minutos em agitador).
7. Detecção da proteína específica
Bloqueio de sítios inespecíficos
Descartar a solução do Tampão de Lavagem e adicionar um volume de Tampão de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso. Deixar a membrana bloqueando sob leve
agitação (orbital) durante 30 minutos a 1 hora a temperatura ambiente. O tempo e a
temperatura de bloqueio dependem da especificidade de cada anticorpo primário. Em todos
os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
Incubação com o Anticorpo Primário
Descartar a solução do Tampão de Bloqueio e lavar 3X com TBSTpor 5 minutos cada
lavagem. Adicionar 10 ml da Solução do Anticorpo Primário. (200mg de BSA + 10mL de
tampão de lavagem + Anticorpo). Vamos usar o anticorpo para pan-Ras para detecção das
proteínas Ras e como normalizador, usaremos uma proteína house keeping de β-actina ou
β-tubulina.
9 Lab1 O Anticorpo primário deve ser diluído segundo as recomendações do fabricante,
porém pode ser necessário padronizar esta diluição. Vedar o recipiente com veda-filme e
incubar a membrana “overnight” (tempo ideal para anticorpos novos) sob leve agitação
orbital a 4°C. (Obs: pode incubar por um tempo menor, devendo ser ajustado conforme o
anticorpo).
A visualização da proteína de interesse ocorre pela formação complexo anticorpoantígeno. O anticorpo primário é produzido em um animal (geralmente em camundongos ou
coelhos) e pode ser monoclonal ou policlonal. Não possuem marcações ou conjugações. A
incubação da membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight a 4ºC e,
depois disso, a membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar todo
o anticorpo que não está especificamente ligado à proteína de interesse.
Depois das lavagens, a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse
anticorpo é um anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo,
se foi utilizado um anticorpo primário anti uma proteína de interesse, produzido em
camundongo, será utilizado um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo, que
reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundário
possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse. No nosso
experimento usamos anticorpos com um fluoróforo que será posteriormente excitado com
um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, e então as regiões onde o
anticorpo se ligou serão evidenciadas (fig. 6).
Figura 6: Detecção da proteína através da associação do anticorpo com fluoróforo. A) Esquema representativo
de fluorescência; B) Scanning de western blotting revelado com fluorescência.
Incubação com o Anticorpo Secundário
Recuperar a Solução do Anticorpo Primário e lavar a membrana 3X com TBST por 5
minutos cada lavagem. Adicionar 10mL da Solução do Anticorpo Secundário e incubara a
membrana por 1h no escuro.
Recuperar a Solução do Anticorpo Secundário e lavar a membrana 3X com TBST por
5 minutos cada lavagem.
Preparar a membrana para revelação.
Revelação e quantificação
O Odyssey é um equipamento de detecção de fluorescência. Sua principal vantagem
é usar lasers (excitação) e filtros (detecção) para os comprimentos de onda do vermelho
próximo (uma das faixas de infravermelho), o que permite o uso de fluoróforos mais estáveis
e também reduzir o alto background das detecções feitas nos comprimentos visíveis do
espectro eletromagnético. Os anticorpos secundários (que se ligam aos anticorpos primários
10 Lab1 (que por sua vez estão ligados à sua proteína de interesse) são conjugados à fluoróforos
excitáveis em ~680 e 800nm, que emitem fluorescência em ~720 e 820nm ao retornarem
para o estado fundamental. A detecção desta fluorescência emitida é usada para construir a
imagem que o software nos mostra.
Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que
excitar o fluoróforo associado ao anticorpo secundário utilizado no experimento (700 ou
800nm).
Quantificar as bandas geradas com o software do próprio equipamento.
Discussão
1- Quando houve a revelação, as bandas obtidas com as marcações do anticorpo
controle (house keeping) foram homogêneas? Se não foram, o que isso significa?
2- Caso sua quantificação tenha sido ruim, o que você espera que aconteça com as
suas amostras? Isso interferirá diretamente no seu resultado?
3- Quando você observa as marcações obtidas para k-Ras, o que você conclui com as
diferenças entre a densidade das bandas controle (não induzido) versus a amostra
induzida?
4- Os resultados obtidos respondem a sua pergunta? Houve inibição de k-Ras pelo
sistema induzível proposto?
5- Após a quantificação, os resultados ainda correspondem às suas observações iniciais
sobre uma breve observação das bandas marcadas?
6- Quais foram suas maiores dificuldades para entender o procedimento da técnica?
Proponha uma sugestão para que ela se torne mais fácil?
7- Você conseguiu imaginar um ensaio usando a técnica de western blot? Qual seria?
8. Soluções Usadas
Tampão RIPA:
50mM Tris-HCl, pH 7,2
1% Triton X-100
0,5% Deoxicolato de sódio
0,1% SDS
500mM NaCl
10mM Mg Cl2
Inibidores (Concentração final)
0,2µg/ml Leupeptina
1mM PMSF
1mM DTT
2µg/ml Aprotinina
2µg/ml Pepstatina A
1mM Na3VO4
1mM NaF
5X Sample buffer
Mix: 3.75g SDS (Lauryl Sulfate)
15 mLglycerol
2 mL azul de bromofenol 0,1%
2,5 mL Tris 1M pH 6,8
Add água destilada para volume final 50 mL
11 Lab1 Armazenar a 4ºC (ocorre a precipitação de SDS!!)
Tris 2M pH 8,8
242g Tris base em 700 mL de água
Ajustar o pH em 8,8 com HCl concentrado e volume final para 1L
Tris 1M pH 6,8
121,14g Tris base em 700 mL de água
Ajustar o pH em 6,8 com HCl concentrado e volume final para 1L
Tampão de Corrida 10X
Mix: 30,3g Tris base
144,1 Glicina
Volume final de 1L
Tampão Tris-Glicina 10X
Tris-Base (480nM): 29g
Glicina (390nM): 14,5g
Água para 500 mL106
Tampão de Transferência
Tampão Tris-glicina 10X: 20 mL
SDS 10%: 74 uL
Metanol: 40 mL
Água para 200 mL
Tampão Fosfato de Sódio 0,5M pH7,4
Solução A (0,5M): 15,6g NaH2PO4-2H2O em 200 mL de água
Solução B (0,5M): 56,8g Na2HPO em 800 mL de água
Ajuste o pH de B para 7,4 com a solução A
Tampão de Lavagem
Tampão Fosfato 0,5M: 80 mL
NaCl 5M: 24 mL
Tween 20 5%:8 mL
Completar o volume para 800 mL
Tampão de Bloqueio
Leite em pó molico: 1,5g
Tampão de Lavagem: ressupender para 30 mL
Este volume é suficiente para bloquear 2 membranas.
Ponceau estoque
Ponceau S: 2g
Ácido tricloroacético: 30g
Ácido sulfosalicílico: 30g
Água para 100 mL
Diluir a solução estoque (1 parte para 9 partes de água) no momento do uso e descartar
após usar.
12 Lab2 2. Laboratório de Bioquímica de Insetos
Responsável: Profa. Dra. Clélia Ferreira
Monitor: Gabriel Braga Oliveira
Atividade enzimática das amilases digestivas de Tenebrio molitor
Introdução
Os insetos são o grupo de organismos mais bem sucedidos da terra, representando
75% das espécies animais conhecidas e que se adaptaram para habitar diferentes
ambientes, desde florestas tropicais até inóspitas regiões de desertos, assim como rios e
mares (figura 1). São considerados os maiores competidores do homem por recursos
alimentares, destruindo em torno de 10% dos recursos produzidos, de acordo com dados do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Além disso, insetos hematófagos
podem transmitir patógenos durante sua alimentação, sendo vetores de diversas doenças
que podem afetar tanto o homem quanto animais domésticos ou destinados à pecuária.
Sendo assim, é recorrente a necessidade do desenvolvimento de estratégias para o controle
de insetos.
http://www.calacademy.org/
Figura 1: Número relativo de espécies descritas no mundo
Figura 1: Número relativo de espécies descritas na terra
Na metade do século XX, foram desenvolvidos diferentes inseticidas sintéticos que
desempenharam muito bem esse papel. No entanto, logo começaram a surgir estudos dos
impactos ambientais causados pelo uso indiscriminado desses inseticidas sintéticos,
organoclorados, em sua maioria. Desde então, houve uma constante busca por novas
tecnologias que fossem eficientes no controle de pragas e que causassem um menor
impacto ambiental. Atualmente, o controle de insetos-praga tem sido dirigido para o
fortalecimento de plantas contra os herbívoros, como na produção de plantas transgênicas
1 Lab2 capazes de expressar inibidores de proteases, reduzindo a disponibilidade de aminoácidos
para a síntese proteica, ocasionando numa redução do desenvolvimento e crescimento da
praga.
Um dos grandes limitantes para o uso dessas práticas no controle de insetos é a falta
de informações a respeito da organização da digestão desses animais, assim sendo é
necessário um maior conhecimento sobre aspectos da fisiologia digestiva de insetos, tendo
em vista que o seu intestino é uma grande área de interface relativamente desprotegida
desses seres com o ambiente.
Tenebrio molitor
O Tenebrio molitor é um besouro da ordem Coleóptera, conhecido também como
verme da farinha ou tenebrião da farinha, é largamente utilizado na alimentação de aves e
répteis (figura 2). Este inseto é considerado uma praga agrícola por causar grandes
prejuízos em estoques de grãos e cereais.
Em nosso laboratório, o Tenebrio molitor é cultivado sob abrigo da luz em farelo de
trigo, a uma temperatura média de 25ºC e umidade relativa de 70 a 75%.
Nos experimentos programados para o curso, serão utilizados insetos alimentados e
com desenvolvimento próximo ao último estágio larval (figura 2).
Figura 2: Exemplares de Tenebrio molitor no estágio de larva, pupa e adulto (figura retirada de
http:qqinsects.tamu.edu/)
Estrutura do tubo digestivo dos insetos
Atualmente, a conscientização da necessidade de desenvolver métodos ou técnicas
para o controle dos insetos pragas que não seja cause danos ao meio ambiente esta cada
vez mais evidente. Aliado a esta percepção de que o intestino é uma interface grande e
relativamente pouco protegida nos insetos, levou os cientistas a uma intensa pesquisa sobre
o sistema digestório dos insetos, a fim de entender seu funcionamento (LAW et. al., 1992).
2 Lab2 Figura 3 - Esquema geral do tubo digestivo de insetos (Adaptado de Gilbert, -2012).
O intestino de insetos pode ser dividido em três partes (figura 3):
- intestino anterior: constituído pela boca (onde alguns insetos apresentam glândulas
salivares), faringe, esôfago, papo (câmara de armazenagem do alimento) e proventrículo
(órgão triturador, podendo também atuar como uma válvula de controle da entrada de
alimento no intestino médio);
- intestino médio: principal local de digestão e absorção de nutrientes, constituído por
ventrículo (um tubo simples que pode sofrer ramificações, dando origem ao ceco gástrico,
que processa a digestão final e a absorção dos alimentos). Na maioria dos insetos, o
intestino médio é revestido por uma estrutura quitinosa, a membrana peritrófica (permite a
passagem de alimentos decompostos, enzimas e água), que separa o conteúdo luminal em
dois compartimentos: espaço endoperitrófico e espaço ectoperitrófico.
- intestino posterior: local de absorção de água e íons. Na região do esfíncter, que
separa o intestino médio do superior, são encontrados os túbulos de Malpighi (órgãos de
excreção).
Digestão
Digestão é o processo no qual macromoléculas são quebradas em moléculas
menores, que podem ser absorvidas pelas células intestinais. As macromoléculas
encontradas nos alimentos são polímeros de açúcares (como o amido, a celulose e a
hemicelulose) ou de aminoácidos (como as proteínas). A digestão dessas moléculas ocorre
em três fases (figura 4):
- fase inicial: os polímeros ingeridos, sob ação das enzimas polímero hidrolases
(exemplos: amilase, celulase, hemicelulase, tripsina, quimotripsina), sofrem redução de peso
molecular;
- fase intermediária: os oligômeros produzidos na etapa anterior são processados
pelas oligômeros hidrolases, enzimas que removem sequencialmente resíduos glicosil da
extremidade redutora de pequenos oligossacarídeos (exemplo: glicoamilase), ou que
removem sequencialmente resíduos de aminoácidos das extremidades de peptídeos
(exemplos: carboxipeptidase, aminopeptidase);
- fase final: os dímeros formados na etapa anterior são hidrolisados aos seus
monômeros constituintes pela ação de dímero hidrolases (exemplos: maltase, dipeptidase).
3 Lab2 Digestão de Carboidratos
A digestão inicial e intermediária de amido ou glicogênio é realizada pela α-amilase.
Essa enzima é responsável por clivar ligações internas do polissacarídeo até este seja
reduzido a pequenos oligossacarídeos ou dissacarídeos (figura 4).
As amilases não são muito ativas em relação a grânulos intactos de amido, dessa
forma a mastigação torna-se importante. As suas massas moleculares estão entre 48KDa e
68KDa e seus pH ótimos variam de acordo com o táxon dos insetos, variando de 4,8 a 9,8.
A digestão final das cadeias de amido ocorre sob ação das α-glicosidases, enzimas
que removem sequencialmente moléculas de glicose das extremidades redutoras
(extremidade que está localizado o carbono anomérico) de oligomaltossacarídeos (figura4).
Se o sacarídeo for um dissacarídeo, ele é chamado de maltose (figura 4). Por isso, αglicosidases também é chamada de maltase. De regra, a sacarose também é hidrolisada por
esta mesma enzima.
Figura 4: Digestão de carboidratos: Quebra dos polímeros de amido em monômeros de glicose.
OBJETIVOS
Os objetivos do nosso laboratório durante este curso é verificar a atividade das
enzimas amilases presente no intestino médio do inseto Tenebrio molitor. A partir delas,
apresentar técnicas e discutir dados encontrados durante o período de curso.
4 Lab2 DESCRIÇÃO DE TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS
Dissecção de insetos
A dissecção consiste em isolar o tubo digestivo das larvas dos insetos do restante de
seu corpo.
1º Colocar as larvas coletadas sobre o gelo para anestesia, facilitando a dissecção,
uma vez que os insetos não estarão se movendo devido à redução do seu metabolismo.
Colocar também no gelo o frasco contendo a solução salina que será utilizada, um tubo tipo
eppendorf de 2 mL, onde será depositado o material coletado, e as lâminas que serão
utilizadas. A dissecção deve ser feita o mais rápido possível para evitar a degradação do
material.
2º Posicionar uma lâmina sob a lupa, colocando uma larva imobilizada nela. Remover
a cabeça da larva, segurando firmemente com duas pinças finas a cabeça e o primeiro
segmento torácico e puxando para os dois lados.
3º Desprender cuidadosamente os dois últimos segmentos abdominais. Segurar o
corpo e puxar os últimos segmentos, com cuidado para não romper o intestino.
4º Colocar o tubo em uma lâmina contendo uma gota de solução salina (NaCl 342
mM). A solução deve ter concentração osmótica aproximadamente igual à da hemolinfa da
larva.
5º Isolar o intestino médio, removendo com a pinça de dissecção os corpos
gordurosos, os túbulos de Malpighi e a porção posterior do tubo digestivo.
6º Coletar o intestino médio inteiro para ser utilizado como fonte de amilase.
7º Juntar o material proveniente da dissecção de 20 larvas num tubo tipo eppendorf
em gelo.
5 Lab2 Tratamento do material obtido na dissecção
Esse passo consiste em transformar o material numa solução homogênea, que será
utilizada nas etapas subsequentes.
1º Colocar o material proveniente da dissecção num Potter-Elvehjem (tubo de vidro
dentro do qual está acoplado um pistilo de metal com a extremidade revestida por teflon).
2º Acrescentar 2 mL de água bidestilada. Colocar o material no homogeneizador, que
deve estar em gelo. Com o pistilo em movimentos rotacionais, subir e descer o pistão em
torno de dez vezes.
3º Após a homogeneização, o material deve ser transferido para um tubo de vidro
especial (Corex), que será fornecido. Colocar em uma centrífuga ajustada em uma
velocidade de 25.000 g o tubo por 30 minutos. A centrifugação tem como fim a remoção de
restos de células e alimentos, ou outros componentes mais pesados que as proteínas
solúveis.
4º Recolher o sobrenadante, que será utilizado nas etapas posteriores. Separar o
material em alíquotas de 1 mL, em tubos tipo eppendorfs de 1,5 mL, e congelar em gelo
seco o que não for utilizado imediatamente, guardando posteriormente em freezer de – 20
ºC.
Determinação da concentração de proteínas por Bradford
Os dois métodos de quantificação proteica mais utilizados até recentemente eram os
métodos de biureto e de Lowry e colaboradores. O método de biureto baseia-se na reação
entre sulfato de cobre alcalino com ligações peptídicas, resultando em um complexo de cor
violeta. O método de Lowry e colaboradores, um aperfeiçoamento do método anterior,
adiciona uma solução fenólica concentrada à mistura de sulfato de cobre alcalino e proteína,
resultando em uma cor bem mais intensa, possibilitando uma maior sensibilidade do
método.
Estes dois métodos sofrem restrições devido a interferências causadas por vários
compostos, requerem concentrações relativamente altas de proteínas e não formam a cor
instantaneamente. O método de Bradford, mais amplamente utilizado atualmente, elimina
muitos desses problemas dos procedimentos descritos acima, utilizando o corante Comassie
Brilliant Blue G-250, que existe em duas diferentes formas, azul amarronzada e azul. A
forma azul amarronzada é a cor predominante em solução e é convertida a forma azul
quando de sua ligação à proteína. Acredita-se que a ligação do corante se dê com as
regiões hidrofóbicas da proteína. A reação é altamente reproduzível, é rápida e
essencialmente a cor é formada após 2 minutos, permanecendo estável até cerca de 1 hora.
O método sofre interferências por parte dos detergentes dodecil sulfato de sódio (SDS) e
Triton X-100, quando em altas concentrações.
Preparação das Soluções.
a) Preparação do reagente:
- pesar 10 mg de Coomassie Blue G e dissolvê-lo em 5,0 ml de metanol.
Em seguida, adicionar vagarosamente (gotejando), com agitação, 10 ml de ácido fosfórico
85%.
Posteriormente, em uma proveta, levar o volume para 100 ml com água bidestilada.
6 Lab2 b) Preparação da solução de ovoalbumina padrão:
- em tubo de ensaio, pesar 4 mg de ovoalbumina.
Adicionar 2,0 ml de água bidestilada.
Em seguida, diluir esta solução em 10 vezes.
Curva-padrão para a determinação de proteínas
Utilizando o estoque de 0,2 mg / mL de ovoalbumina fornecido, preparar a curvapadrão como apresentado na tabela abaixo. Após 5 minutos, ler a absorbância em
espectrofotômetro e construir um gráfico da absorbância medida em função da massa de
proteína por tubo (µg).
Curva-padrão
Tubo de
ensaio
1
2
3
4
5
6
7
B
Albumina
0,2mg/mL
(μL)
10
20
30
40
50
60
80
-
Água
(μL)
Reagente
(mL)
90
80
70
60
50
40
20
100
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Quantidade
de proteína
(μg)
Absorbância
em 595 nm
Determinação de proteína nas amostras
Repetir o procedimento feito anteriormente na curva-padrão, seguindo a tabela abaixo
apresentada. Fazer os cálculos necessários para determinar a concentração de proteína das
amostras de homogenato.
Homogenato
Tubo de
ensaio
Amostra
(μL)
Água
(μL)
Reagente
(mL)
Absorbância
em 595 nm
Quantidade
de proteína
(μg)
8
10
90
1,0
9
20
80
1,0
10
50
50
1,0
B¹
40
60
1,0
Concentração de proteína na amostra:
Eletroforese
A Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolvem
a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de
potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor
massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato
7 Lab2 das moléculas também tem influência, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo
gel.
Atividade enzimática em gel de eletroforese
Para realizar o ensaio e ver a atividade enzimática em gel são necessários alguns
passos. O primeiro deles é a preparação dos géis, tanto de separação quanto de
empilhamento ou stacking.
Preparação do gel de eletroforese
Gel de separação – 0,375 M Tris, pH 8,8
Gel para Stacking – 4,6%, 0,125 M Tris, pH 6,8
Após a polimerização dos géis nas mini-placas, faremos a aplicação das amostras.
As amostras foram obtidas através da dissecção dos insetos, e esta foi misturada ao
tampão de amostra na proporção de 1:4.
8 Lab2 Com as amostras aplicadas no gel, este será submetido a uma “corrida”, onde
utilizaremos a fonte de energia com os seguintes parâmetros: 150 Volts, 400 mA por
aproximadamente 1 hora.
Finalizado o período de “corrida” do gel, este será submetido à uma renaturação de
suas proteínas, encubando-o em Triton x-100 na concentração de 2,5% em temperatura
ambiente.
Com a renaturação, todas as enzimas presentes no gel, voltarão a sua forma nativa
com atividade catalítica. Assim, este será encubado com amido 1% em tampão acetato de
sódio 100mM e pH 7,0 por dois períodos, o primeiro de 30 minutos e o segundo de 60
minutos. Após incubação, estes serão corados com lugol a 0,1 %
A coloração formada pela reação do amido com o lugol, indicará uma coloração
negativa, onde veremos a degradação do amido no gel de eletroforese através do consumo
da gelatina presente.
Determinação da atividade enzimática nas amostras
DETERMINAÇÃO DE GRUPOS REDUTORES EM SACARÍDEOS COM O REAGENTE DO
ÁCIDO DINITROSSALICÍLICO (DNS)
A. Preparação do Reagente de DNS
Em um grama de ácido 3,5 dinitrossalicílico, adicionar 20 ml de NaOH 2N e 50 ml de
H2O bidestilada. Levar ao agitador magnético até dissolver completamente o DNS.
Adicionar 30 g de tartarato de sódio e potássio. Após dissolver completamente, elevar
o volume para 100 ml com H2O bidestilada. Se a solução resultante não estiver límpida,
filtrar em lã de vidro.
Observação: proteger da luz e CO2.
B. Obtenção de curva padrão.
1) Preparar solução padrão de 0,1 g glicose em 50 ml de H2O bidestilada.
2) Pipetar as soluções nos tubos como indica o quadro abaixo:
Após pipetar a glicose e a água bidestilada, agitar todos os tubos. Adicionar 0,4 ml de
solução de DNS a cada tubo, agitar bem no VORTEX.
9 Lab2 Tampar cada tubo com papel alumínio e levar ao banho-maria em ebulição por 5
minutos. Tirar a estante do banho e esfriar os tubos em água corrente. Adicionar a cada tubo
0,4 ml de água bidestilada, agitar no VORTEX.
Ler absorbâncias a 550 nm contra branco (tubo B). Não permitir que o DNS entre em
contato com o papel alumínio.
Determinação da atividade das amilases
Serão realizados ensaios de 4 tempos para determinar a concentração de atividade
de amilase no homogenato.
Pipetar em 4 tubos: 50 μL de homogeneizado e 50 μL de substrato/tampão (Tampão
acetato 100mM, pH 7,0/amido 1%) na proporção de 1:1.
1.
Incubar por 4 períodos diferentes (15, 30, 45 e 60 minutos) a 30 °C como
estabelecido no protocolo.
2.
Após incubar pelo período do protocolo, retirar o tubo e acrescentar 100 μL de DNS
(ácido 3,5 dinitrosalicílico).
3.
Após a parada de todos os tempos, e o acréscimo de DNS, ferver os tubos por 5
minutos.
4.
Após fervura, acrescentar 200 μL de H2O bidestilada e fazer a leitura das soluções em
550 nm no espectrofotômetro.
Homogenato
Substrato
Tampão
Amostra Tempo
Tubo
Amido
(μL)
(μL)
(min)
(μL)
1
25
25
50
15
2
25
25
50
30
3
25
25
50
45
4
25
25
50
60
B
25 H2O
25 H2O
50 H2O
60
B1
25 H2O
25 H2O
50
60
Concentração de atividade na amostra:
Absorbância
( 405 nm)
Produto
(nmol)
Determinação da atividade enzimática com inibidor nas amostras
Determinação da atividade das amilases com inibidor
Serão realizados ensaios de 4 tempos para determinar a concentração de atividade
de amilase no homogenato.
Pipetar em 4 tubos: 50 μL de homogeneizado e 50 μL de substrato/tampão (Tampão
acetato 100mM, pH 7,0/amido 1%) na proporção de 1:1.
1.
Incubar a 30 °C as amostras com inibidor por 15 minutos.
10 Lab2 2.
Incubar por 4 períodos diferentes (15, 30, 45 e 60 minutos) a 30 °C como estabelecido
no protocolo.
3.
Após incubar pelo período do protocolo, retirar o tubo e acrescentar 100 μL de DNS
(ácido 3,5 dinitrosalicílico).
4.
Após a parada de todos os tempos, e o acréscimo de DNS, ferver os tubos por 5
minutos.
5.
Após fervura, acrescentar 200 μL de H20 bidestilada e fazer a leitura das soluções em
550 nm no espectrofotômetro.
Homogenato
Substrato
Amostra
Amido
(μL)
(μL)
1
25
25
50
2
25
25
50
3
25
25
50
4
25
25
50
B
25 H2O
25 H2O
50 H2O
B1
25 H2O
25 H2O
50
Concentração de atividade na amostra:
Tubo
Tampão
(μL)
Tempo
(min)
Absorbância
(405 nm)
Produto
(nmol)
15
30
45
60
60
60
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and function. Comparative Biochemistry and Physiology., v. 109b, p. 1-62. 1994.
11 Lab3 3. Laboratório de Sistemas Biomiméticos
Responsável: Profa. Dra. Iolanda Midea Cuccovia
Monitora: Laura Farkuh
INTRODUÇÃO
Os glicerofosfolipídios são lipídios que possuem em sua estrutura ácidos graxos
(saturados ou insaturados) unidos a uma molécula de glicerol por uma ligação éster e ácido
fosfórico (fosfato). Este fosfato pode estar unido também a um grupo polar variável, que
pode ser colina, etanolamina, inositol ou serina, de acordo com o tipo substituição. Estes
fosfolipídios apresentam duas grandes “caudas” hidrofóbicas – dois ácidos graxos – e uma
“cabeça” hidrofílica (polar) – o grupo que contém o fosfato; portanto, são moléculas
anfipáticas: possuem afinidade por moléculas hidrofóbicas e por moléculas hidrofílicas – em
regiões distintas da molécula (FIGURA 1). Também são os principais componentes das
membranas celulares, e tanto sua anfipatia como as características de seus ácidos graxos
(número de carbonos, presença de duplas ligações) lhes conferem muitas de suas
propriedades, como por exemplo, a sua capacidade de formar bicamadas lipídicas.
Figura 1. Estrutura de um fosfolipídio.
A dispersão dos fosfolipídios em água leva à formação espontânea de uma
organização similar a das membranas celulares, de forma que as cabeças hidrofílicas dos
fosfolipídios fiquem expostas para a água e suas caudas hidrofóbicas, dispostas no interior,
de forma a evitar o contato entre as caudas e a água. Este princípio de auto-associação, na
qual a união de estruturas complexas depende exclusivamente de propriedades físicoquímicas de seus componentes moleculares, é característico dos sistemas vivos. Outras
moléculas anfifílicas também podem assumir esta organização ou similares.
Moléculas anfifílicas apresentam uma grande variedade de estruturas, podendo ser
neutras, zwitteriônicas, com carga positiva ou negativa, possuir uma, duas ou até três
caudas hidrofóbicas (FIGURA 2). Dependendo destas propriedades estruturais, os anfifílicos
se associam espontaneamente em água formando monocamadas, bicamadas, micelas,
vesículas e outros agregados (FIGURA 3).
Figura 2. SDS (DodecilSulfato de Sódio) e PG (Fosfatidilglicerol).
1 Lab3 Figura 3. Organização dos agregados anfifílicos em solução aquosa.
Estes sistemas apresentam interesse científico e amplo campo de aplicações, já que
essencialmente as reações biológicas ocorrem em interfaces. Na indústria, anfifílicos são
largamente usados, entre outros, em produtos alimentícios, cosméticos, transportadores de
fármacos, adjuvantes de vacinas, extração de petróleo (Fendler, 1982, Farn, 2006).
Micelas, vesículas e monocamadas, quando usadas para estudar aspectos
específicos da biologia, podem ser consideradas como sistemas biomiméticos.
Uma forma de se estudar sistemas biomiméticos (membranas biológicas,
monocamadas de surfactantes, micelas, etc.) é através da Dinâmica Molecular (DM). A DM
é um método computacional que simula os movimentos de átomos e moléculas em função
do tempo, baseado na equação de movimento de Newton (F=m.a) (Haile, 1997).
A DM fornece a possibilidade de se visualizar sistemas no nível molecular; a partir da
trajetória gerada, pode-se calcular diversas propriedades. Em bicamadas lipídicas, por
exemplo, pode-se determinar organização das cadeias lipídicas em diferentes condições –
temperatura, pH, sais adicionados, etc. A hidratação das superfícies e da região hidrofóbica
pode ser analisada, determinando-se a distância entre átomos e moléculas de água. A
interação de moléculas de interesse inseridas na membrana (proteínas, por exemplo) pode
ser investigada. Energias de interação membrana-proteína e proteína-solvente podem ser
calculadas, bem como a orientação e localização destas moléculas na membrana. Estudos
sobre a especificidade iônica – a diferença de afinidade entre diferentes sais e superfícies –
podem ser realizados em sistemas de bicamadas, micelas ou mesmo na interface água/ar
(Hyvönen, 2001).
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
OBJETIVOS
Como podemos preparar e caracterizar um modelo de membrana?
Qual é atividade de uma molécula sobre a membrana?
MATERIAIS
Para responder essa pergunta serão empregadas LUV’s (large unilamellar vesicles –
vesículas unilamelares grandes) como sistema de membranas modelo (lipossomas)
contendo ou não um fluoróforo em seu interior. Estes lipossomas serão caracterizados e
avaliados quanto a sua interação com o peptídeo Melitina.
2 Lab3 1. Peptídeo
Melitina: peptídeo hemolítico da abelha (Apis mellifera)
Sequência peptídica = GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
2. Lipídios
Fosfatidilglicerol (PG)
Fosfatidilcolina (PC)
3. Molécula fluorescente ou fluoróforo
5(6)-Carboxifluoresceína (CF)
MÉTODOS
1. Fluorescência
ENERGIA O fenômeno de fluorescência é caracterizado pela emissão de fótons com energia na
região do ultravioleta (UV), visível ou infravermelho de uma espécie eletronicamente
excitada. Uma molécula é capaz de absorver energia passando para um estado eletrônico
excitado (S2), porém ela pode de forma não radiativa ir para um estado menos energético
(relaxar) (S1) e então retornar ao seu estado fundamental (S0) emitindo a energia
remanescente na forma de radiação elétrica (fótons) (FIGURA 4).
(relaxação)
Figura 4. Diagrama de Jablonski adaptado demonstrando os estados energéticos de uma molécula: o diagrama de Jablonski mostra os processos de absorção e relaxação de um átomo ou molécula quando submetidos à radiação eletromagnética, a absorção no UV ou visível induz uma transição eletrônica do estado fundamental, S0, até algum nível vibracional dos estados eletrônicos excitados, S1 ou S2.
A fluorescência sofre uma forte influência do microambiente ao redor da molécula
fluorescente, podendo assim ser utilizada para investigações físico-químicas, bioquímicas e
em sistemas biológicos.
3 Lab3 A 5(6)-carboxifluoresceína (CF) é uma sonda fluorescente aquossolúvel caracterizada
por apresentar o fenômeno conhecido como auto-supressão da fluorescência quando se
encontra em alta concentração. Isto significa que quando preparada a uma concentração
alta, na ordem de 50 mM neste caso, a CF não fluoresce. Mas se preparada em baixas
concentrações apresentará fluorescência. Este fenômeno nos auxilia no estudo da
permeabilização de vesículas, uma vez vesículas preparadas com CF em seu interior numa
concentração alta não apresentam fluorescência; a saída da CF para o meio extravesicular,
a favor do gradiente de concentração, através da lesão originada na vesícula por qualquer
agente que destrua a sua barreira de permeabilidade, conduz à diluição da CF no meio
externo e, portanto, ao aumento da fluorescência (FIGURA 5). Este aumento pode ser
medido em função do tempo e da concentração do agente lítico (agente responsável pela
lesão na membrana) e assim obter o curso temporal e a dose dependência da
permeabilização.
Meio extravesicular
CF fluoresce
Carboxifluoresceína
Figura 5. Atuação da carboxifluoresceína em diferentes concentrações.
2. Membranas modelo
A membrana citoplasmática atua como uma barreira seletiva entre o interior e o exterior
de uma célula. A membrana é formada por uma bicamada lipídica contendo diversas
proteínas. A sua alta complexidade (composição lipídica e conteúdo proteico) juntamente
com as dificuldades no uso de sistemas celulares em estudos biofísicos torna o uso de
membranas modelo (micelas, monocamadas lipídicas, bicamadas lipídicas) uma alternativa
interessante para estudos da interação de uma molécula com membranas.
2.1. Preparo de membranas modelo (bicamadas lipídicas)
Filme lipídico
1° Calcule as massas dos lipídios que serão pesados para obter as concentrações molares
desejadas (Tabela 1);
2° Pese as quantidades adequadas dos lipídios em um tubo de ensaio;
3° Adicione 0,5 mL de diclorometano;
ATENÇÃO: Alguns solventes orgânicos apresentam toxicidade em graus variados,
dependendo de sua natureza físico-química. Desta forma, é sempre importante conhecer o
solvente utilizado e saber qual a melhor forma de se proteger e evitar acidentes no
laboratório.
4 Lab3 No caso do diclorometano, a principal via de exposição é inalatória e a substância apresenta
baixa toxicidade aguda. Deve-se evitar contato com o líquido e o vapor, trabalhando
preferencialmente em capela, usando vestimentas adequadas.
4° Evapore o solvente dos tubos de ensaio com um fluxo baixo de N2 de modo a formar um
filme lipídico no fundo do tubo;
5° Remova o restante do solvente deixando os tubos sob vácuo por 1 hora.
Tabela 1. Cálculo das massas e concentrações dos fosfolipídios
MM PC= 750g/mol; MM PG 750 g/mol; Conc: [PC] 25 mM; [PG] 25 mM;
Volume: 0,5 mL
C = massa
MM V(L)
Vesículas multilamelares (multilamellar vesicles; MLV)
Os lipossomas podem ser classificados tanto com relação ao seu tamanho e número de
lamelas.
De acordo com os diametros médios podem ser divididos em três categorias: Vesículas
Multilamelares (MLV – Multilamelar Vesicles), Vesículas unilamelares grandes (LUV – Large
Unilamelar vesicles) e Vesículas unilamelares pequenas (SUV – Small Unilamelar Vesicles).
Um tipo de membrana modelo são as vesículas multilamelares (MLV), as quais são
vesículas lipídicas formadas por bicamadas fosfolipídicas concêntricas (também chamadas
lamelas) intercaladas por compartimentos aquosos, cujos diâmetros variam de 400 a 3.500
nm (FIGURA 6).
Figura 6. Esquema das estruturas vesiculares: Vesículas unilamelares pequenas (small unilamellar vesicles,
SUV), vesículas unilamelares grandes (large unilamellar vesicles, LUV) e vesículas multilamelares
(multilamellar vesicles, MLV).
2.2. Encapsulamento da CF
1º Prepare dois filmes lipídicos (composição: 70%PC:30%PG) com concentração final de
25mM;
5 Lab3 2º Prepare MLV’s de um desses filmes ressuspendendo-o em 500 µL de uma solução de 50
mM de CF. O outro filme será ressuspendido em 500 µL de tampão Tris HCl (com NaCl)
filtrado e utilizado no item 3.1, armazene a 4º C;
3º Agite o tubo no vortex por 1 minuto;
4º Coloque em banho de ultrassom por alguns minutos, para garantir que todo filme seja
removido do tubo de ensaio;
Vesículas unilamelares grandes (LUV)
Vesículas unilamelares grandes (LUV) são formas vesiculares constituídas por
apenas uma bicamada fosfolipídica. Neste caso serão preparadas vesículas com 100 nm de
diâmetro. Para o preparo, utiliza-se um extrusor (FIGURA 7).
Ao adicionar uma fase aquosa sobre o filme lipídico, formam-se espontaneamente
vesículas multilamelares, sendo necessária a extrusão desta solução, que a obriga a passar
por uma membrana de 100 nm de diâmetro, obtendo-se vesículas unilamelares grandes
(LUVs)
2.3. Extrusão
1° Monte o extrusor conforme a figura abaixo:
Figura 7. Montagem do extrusor.
2° Coloque as vesículas com CF preparadas no item 2.2 na seringa marcada e realize 11
ciclos de extrusão (pressione a seringa 11 vezes).
Obs.: As LUV’s preparadas dessa maneira conterão CF tanto dentro quanto fora das
vesículas. Porém, para realizar os ensaios de atividade será necessário retirar as
moléculas de CF livres em solução (veja seção 2.4).
2.4. Cromatografia por exclusão de tamanho
A cromatografia de permeação em gel (GPC), também conhecida como cromatografia
por exclusão de tamanho (SEC), ou cromatografia de filtração em gel (CFG), é uma técnica
cromatográfica que separa as moléculas dissolvidas com base no seu tamanho à medida
que passam por uma resina porosa (fase estacionária).
Moléculas grandes não podem, ou podem apenas parcialmente penetrar nos poros,
enquanto moléculas menores podem acessar a maioria dos poros. Dessa forma, moléculas
6 Lab3 maiores eluem primeiro, moléculas menores eluem depois e moléculas que conseguem
acessar todos os poros eluem por último da coluna.
Para separar as vesículas que incorporaram carboxifluoresceína em seu interior da
CF livre (não incorporada), usamos a cromatografia de exclusão por tamanho. Os
lipossomas com CF serão eluídos primeiro, sendo a primeira fração a sair da coluna, uma
vez que não são pequenos o bastante para passar pelos poros da resina. Já a CF livre,
demora mais para ser eluída, uma vez que passa por dentro dos poros e percorre um maior
caminho.
Procedimento:
1º Utilize uma coluna de Sephadex G-25 (médio) (FIGURA 8)
2º Adicione tampão Tris HCl 10 mM (com NaCl 300 mM) sob fluxo contínuo pela coluna.
Obs.: o tampão deve sempre estar cobrindo a Sephadex G-25.
3º Deixe o tampão eluir até o menisco da coluna, então aplique toda amostra extrusada. Não
deixe a coluna secar, complete o volume com tampão. Feche a coluna e observe a
separação.
4° Recolha a primeira fração da coluna (fração de cor alaranjada).
Figura 8. Esquema da Cromatografia de Exclusão
2.5 Experimento de fluorescência
1º Adicione em uma cubeta de quartzo 400 µL de tampão Tris HCl 10 mM (com NaCl 300
mM);
2º Adicione 25 µL da solução de vesículas preparadas no item 2.4. Coloque a cubeta no
fluorímetro;
3° Digite os parâmetros (tempo, λEx, λEm) no programa do Fluorímetro;
4º Meça a fluorescência por 100 segundos;
5º Adicione 25µL do peptídeo. Meça a fluorescência até 1300 segundos;
6º Adicione 20µL de Polidocanol (10%). Meça a fluorescência até 1500 segundos;
7º Pare a medida de fluorescência.
7 Lab3 RESULTADOS
Processamento dos dados
1° - Monte uma tabela no Excel e calcule eficiência de vazamento, E(%), utilizando a
equação:
Onde Fp(Intensidade de fluorescência após 10 min), FT (Intensidade de fluorescência
total) e F0 (Intensidade de fluorescência inicial).
2º - Abra o programa Origin 8.0.
3º - Faça o gráfico E% em função da concentração do peptídeo (µM).
Gráfico:
DISCUSSÃO
1. Qual a atividade da Melitina sobre a membrana?
2. Como a técnica de cromatografia utilizada separa as vesículas de 100nm?
3. Como funciona o processo de extrusão?
8 Lab3 3. Espalhamento dinâmico (“Dynamic light-scattering”; DLS)
O espalhamento dinâmico de diferentes radiações como microondas, infravermelho
próximo, visível ou UV ou raio X permite investigar a estrutura e dinâmica de diferentes
materiais dispersos em meio líquido. Ao incidir um feixe de luz sobre uma dispersão coloidal,
parte dessa luz pode ser absorvida, espalhada ou transmitida. A turbidez frequentemente
associada ao aspecto leitoso de diversas dispersões coloidais é definida pela expressão It/Io
= exp[-TI], onde Io é a intensidade da luz incidente, It é a intensidade da luz transmitida, T é
a turbidez e I é o caminho percorrido pela luz através da dispersão, e pode ser determinada
por espectrofotômetros comuns (FIGURA 9). Entretanto, frequentemente é necessário
caracterizar as dispersões quanto ao tamanho das partículas individuais ou à distribuição de
tamanho dessas partículas.
Figura 9. Espalhamento de luz ao incidir sobre uma dispersão coloidal.
Para medir o tamanho de partículas assim como a distribuição, a técnica de DLS é
muito versátil e útil. Essa técnica baseia-se na flutuação de intensidade de luz espalhada
pela dispersão ao longo de tempo que decorreu do movimento browniano de suas
partículas. O decaimento da função de auto correlação temporal dessas flutuações de
intensidade de luz espalhada é usado para medir diretamente o coeficiente de difusão
translacional, D, o qual, por sua vez, está inversamente relacionado ao raio hidrodinâmico da
partícula, R. Desta forma podemos medir o raio hidrodinâmico de partículas esféricas em
uma dispersão diluída.
3.1. Espalhamento dinâmico
1º - Adicione em uma cubeta1 mL da solução de vesículas preparadas no item 1.2 diluída
em tampão Tris HCl filtrado;
2º - Coloque a cubeta no DLS;
3°- Digite os parâmetros (cubeta, solventes, temperatura) no programa do DLS;
4º - Meça o raio hidrodinâmico da vesícula;
5º - Observe os parâmetros da medida.
9 Lab3 Gráfico:
DISCUSSÃO
1. Qual o raio hidrodinâmico da vesícula?
2. Como a técnica DLS pode ser utilizada em ensaios biológicos?
3. Quais parâmetros devem ser observados para um bom resultado no DLS?
10 Lab3 4. Dosagem de fosfolipídios
O método colorimétrico de determinação de fosfato inorgânico foi desenvolvido por Fiske e
SubbaRow ( ROUSER, G.; FLEICHER, S.; YAMAMOTO, A., 1970), baseado na reação dos
íons fosfato com molibdato de amônia em um meio ácido, formando um complexo de
fosfomolibdato de amônio. Por ação do ácido ascórbico, em meio alcalino, o complexo
formado é reduzido pelo azul de molibdênio, cuja absorbância é medida em 797 nm, sendo
diretamente proporcional a medida de fosfolipídios na amostra em questão.
1. Separar 100 µL da amostra de lipossomas com carboxifluoresceína eluída pela
coluna e recolher em tubo pyrex.
2. Colocar a solução padrão de fosfato de KH2PO4 1mM, que será utilizada na
construção na curva padrão, em 5 tubos pyrex. Serão colocados os seguintes
volumes de KH2PO4, um em cada tubo: 10, 30, 50, 70 e 100 µL.
3. Utilizar dois tubos pyrex para usar como branco, não contendo fosfato.
É importante fazer o mesmo tratamento para todas as amostras!!
4. Secar todas as amostras dos tubos em estufa a uma temperatura >120ºC.
5. Adicionar a cada tubo 0,4 mL de HClO4 concentrado e colocar em banho seco a 180
ºC por 1h. Esperar esfriar.
CUIDADO!
O ácido perclórico concentrado libera vapores muito corrosivos, tanto para a pele e olhos e
deve ser manuseado com extremo cuidado, sempre com o uso de óculos de proteção e
luvas de borracha, de preferência em capela. Ele pode causar ignição ou explodir em
contato com roupas ou madeira.
6. Adicionar 1mL de água, 0,4 mL de molibdato de amônio a 1,25% (m/v) e agitar.
7. Adicionar 0,4 mL de ácido ascórbico, agitar e colocar em banho-maria fervente por 5
minutos.
8. Esfriar em água e ler a absorbância das amostras a 797 nm.
Gráfico:
11 Lab3 Discussão
1)
Qual foi a concentração final de fosfolipídios das amostras que saíram da coluna (item
2.4)?
2)
Por que o HClO4 deve ser adicionado a todos os tubos?
3)
Em que outros tipos de experimento poderíamos utilizar uma curva padrão?
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Brasileira de Ciências Farmacêuticas, Vol. 43, No. 2, 2007, p. 168-179.
FERREIRA, H. et al. Utilização de modelos membranares na avaliação da actividade de
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FRÉZARD, F. et al. Lipossomas: Propriedades Físico-Químicas e Farmacológicas,
Aplicações na Quimioterapia à Base de Antimônio. Química Nova, Vol. 28, No. 3, 511-518,
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TORCHILIN, V. P. Recent Advances with Liposomes as Pharmaceutical Carriers. Nature
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12 Lab4 4. LABORATÓRIO DE NEUROCIÊNCIAS
Responsável: Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich
Monitores: Héllio Danny Nóbrega de Souza e Laura Sardá
Bases Moleculares da Diferenciação de Células-Tronco e Células Progenitoras
Neurais P19
I – INTRODUÇÃO
O sistema nervoso e as células-tronco e progenitoras
O sistema nervoso é composto por uma rede formada por trilhões de neurônios com
diferentes fenótipos e diversos outros tipos de células de sustentação. A imensa variedade
fenotípica de células do sistema nervoso central (SNC) deve-se ao desenvolvimento
diferencial de células tronco e progenitoras, que dão origem a neurônios, astrócitos e
oligodendrócitos (Figura 1). Este processo de neurogênese é dirigido pela ativação de
inúmeros receptores na superfície das células em diferenciação (Trujillo et al., 2009; Ulrich
and Majumder, 2006).
Células-tronco (CT) são células não especializadas com capacidade de
autorrenovação, isto é, com capacidade de gerar uma cópia idêntica a si mesma através de
divisão celular simétrica ou sob certos fatores fisiológicos, como estímulos específicos
podem, através de divisão celular assimétrica, originar células especializadas de diferentes
tecidos do organismo, tais como músculo, células sanguíneas ou tecido nervoso (Trujillo et
al., 2009).
Figura 1: Etapas da diferenciação neural de células-tronco e progenitores da linhagem P19. Etapas da geração
da diversidade neuronal por divisão celular simétrica e divisão celular assimétrica.
As CT podem ser classificadas segundo sua capacidade de gerar novos tipos
celulares, ou seja, sua potencialidade. Células totipotentes são células capazes de originar
células de todos os tecidos que formam o corpo humano, incluindo os anexos embrionários
(placenta e saco amniótico). O zigoto e as primeiras células originadas de sua divisão são
1 Lab4 exemplos de células totipotentes. Células pluripotentes são aquelas que podem diferenciarse em quase todos os tecidos, menos em anexos embrionários. As células da massa interna
do blastocisto são exemplo de células pluripotentes. Células multipotentes têm capacidade
de originar apenas alguns tipos celulares, por exemplo, CT da medula óssea que originam
diversos tipos de células sanguíneas. Quanto à sua origem as CT podem ser classificadas
em embrionárias ou adultas.
As células-tronco embrionárias (ES, do inglês embryonic stem) podem ser mantidas
indiferenciadas em cultura ou podem ser induzidas a se diferenciar em todos os tipos
celulares do organismo. Estas células formam estruturas tridimensionais chamadas corpos
embrióides, que dão origem espontaneamente a uma grande variedade de tipos celulares.
Embora seja um modelo conveniente para o estudo de diferenciação celular, o uso de
células ES em terapias torna-se limitado devido à possibilidade de desenvolvimento de
tumores, apesar de já terem sido utilizadas em testes clínicos (Nelson et al., 2002). A
facilidade de manipulação das células ES aliada à possibilidade de diferenciar estas células
em tipos celulares específicos, dependendo apenas da forma que são cultivadas, as torna
uma importante ferramenta para o estudo de eventos fundamentais que ocorrem durante o
processo de diferenciação celular. Recentemente, descrevemos a importância das células
ES como modelo para o entendimento da cinética de expressão gênica e secreção de
fatores extrínsecos necessários à diferenciação neuronal (Ulrich and Majumder, 2006). Elas
oferecem um sistema in vitro capaz de recapitular as vias de sinalização envolvidas na
determinação do fenótipo neural a partir de células embrionárias, durante o desenvolvimento
do sistema nervoso central (SNC). Embora os processos morfogenéticos que ocorrem na
formação do SNC possam ser facilmente visualizados in vivo, os passos intermediários nos
quais as CT neurais (CTN) se diferenciam são pouco entendidos, pois há vários fatores que
atuam neste processo, tais como moléculas de matriz extracelular, moléculas de adesão
celular, fatores solúveis, interações célula-célula, neurotransmissores e seus respectivos
receptores (Sobeit and Corfas, 2002).
Estudos recentes sugerem que o cérebro humano contém praticamente a mesma
proporção de neurônios e células gliais. Um homem adulto teria cerca de 86 bilhões de
neurônios e 85 bilhões de células da glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia). Até pouco
tempo atrás consideradas apenas suporte físico para os neurônios, as células da glia,
palavra de origem grega que significa cola, vêm ganhando importância com a verificação de
que executam funções tão relevantes quanto os neurônios: auxiliam na transmissão dos
impulsos nervosos e na defesa do sistema nervoso central contra microrganismos invasores
(Ulrich and Majumder, 2006).
Para uma melhor compreensão do processo de sinalização durante a diferenciação
neural, precisamos entrar no nível molecular das proteínas e dos neurotransmissores. A
sinalização neuronal depende de uma rápida mudança na diferença do potencial elétrico
através da membrana celular. Essa rápida mudança no potencial da membrana e a
transmissão do impulso elétrico são mediadas pelos canais iônicos, uma classe de proteínas
integrais de membrana que se abrem ou se fecham em resposta a um estímulo químico,
elétrico ou mecânico, além de reconhecer e permitir a passagem de íons através da
membrana.
Na sinapse, um neurônio estimulado libera neurotransmissores que se difundem até
aos receptores do neurônio pós-sináptico, ativando-os; o que, por sua vez, resulta na
despolarização da membrana e transformação desse estímulo químico em resposta elétrica.
Esses receptores podem ser classificados em dois grandes grupos: os receptores
ionotrópicos são canais que respondem a um neurotransmissor específico; os receptores
metabotrópicos agem indiretamente nos canais iônicos pela ativação de um segundo
mensageiro na célula pós-sináptica. A atividade dos dois tipos de receptores pode resultar
em excitação ou inibição. Sendo assim, o neurônio conduz o potencial de ação (resposta
elétrica) a uma alta velocidade, e a sinapse comunica e modula o estímulo entre neurônios,
2 Lab4 possibilitando que um pequeno número de neurotransmissores produza uma grande
variedade de efeitos.
Modelo de diferenciação in vitro
A linhagem P19 derivada de teratocarcinoma murino será utilizada como modelo de
diferenciação neuronal in vitro. A diferenciação neuronal de P19 é bem caracterizada quanto
à expressão de marcadores neuronais e a obtenção de neurônios funcionais semelhantes ao
que ocorre no neuroectoderma e no epitélio neural embrionário (Figura 2).
A linhagem P19 tem o potencial de diferenciação semelhante à células-tronco
multipotentes isoladas do cérebro em desenvolvimento, que em cultura podem crescer em
monocamadas ou em suspensão na forma de agregados celulares heterogêneos, chamados
neuroesferas, e se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos (Reynolds &
Weiss, 1996; Gage, 2000). No início do processo de diferenciação, as células P19 formam
agregados celulares chamados corpos embrióides, compostos por CT e precursores neurais
mais comprometidos (Figuras 1 e 2). A terminologia “células progenitoras neurais” (CPN) é
utilizada para descrever ambos os tipos celulares presentes nos corpos embrióides
(Svendsen and Smith 1999). Como algumas dessas células não estão comprometidas, os
efeitos genéticos e sinais do meio ambiente no seu desenvolvimento podem ser
manipulados in vitro. Assim sendo, questões fundamentais a respeito dos mecanismos de
desenvolvimento neuronal e glial podem ser respondidas. Schwindt e colaboradores
demonstraram que CPN humanas e murinas sofrem influência ambiental e, em resposta a
alterações ambientais, modificam o padrão de expressão gênica de fatores tróficos e
proteínas neurais, além de apresentarem alteração na diferenciação (Schwindt et al., 2009a;
Schwindt et al.,2009b). Além disso, numerosos estudos indicam que uma parte das células
progenitoras obtidas de cultura de telencéfalo embrionário sobreviveram a transplantes em
animais, formando conexões sinápticas com neurônios do hospedeiro (Svendsen and Smith,
1999). Portanto, a cultura de células P19 possui relevância como modelo de diferenciação
neuronal in vitro.
Figura 2: Diferenciação in vitro da linhagem P19. (Adaptado de Trujillo et al. 2009). As células P19 são cultivadas em
suspensão para a formação de corpos embrióides na presença do indutor neurogênico ácido retinóico (AR). Após uma
semana, os corpos embrióides são dissociados e plaqueados para a formação de rosetas neurais e posteriormente a
geração de progenitores neurais (estes progenitores expressão o marcador Nestina). Ao final do processo de indução da
diferenciação por AR em torno do 5º dia, as células diferenciadas passam a expressar marcadores neuronais (β3-tubulina e
MAP2) e gliais (S100-β e GFAP).
3 Lab4 O íon cálcio e a sinalização intracelular
O íon cálcio [Ca2+] participa de várias funções importantes nos organismos vivos.
Muitas cascatas de sinalização são iniciadas por mobilização rápida de Ca2+ extracelular ou
por mobilização Ca2+ de compartimentos membranares (Figura 3). O cálcio opera como um
importante regulador numa grande variedade de processos neuronais. A ativação de
diversos receptores, tais como os receptores purinérgicos, promove esse aumento da
concentração intracelular de cálcio livre ([Ca2+]i), principalmente no sistema nervoso central.
Receptores purinérgicos ionotrópicos (P2X) e metabotrópicos (P2Y) participam de processos
sinápticos, principalmente em neurotransmissão, em associação com receptores de
acetilcolina, GABA e glutamato. Sabe-se que alterações de transientes de [Ca2+]i estão
envolvidas em eventos de diferenciação celular e embriogênese. Porém, os mecanismos de
sinalização que controlam o processo de neurogênese ainda são pouco elucidados.
Recentemente, o laboratório (Resende et al., 2007, 2008) utilizando células P19 como
modelo de diferenciação neural in vitro, verificou uma evidência direta da participação dos
receptores purinérgicos durante a diferenciação neural. Deste modo, utilizando um modelo
que reflete as condições de diferenciação neuronal em estágios precoces (Lembre-se que a
linhagem P19 apresenta semelhanças funcionais ao que ocorre no neuroectoderma e no
epitélio neural embrionário) e que possui certa homogeneidade de tipos celulares ao longo
do processo, pretendemos entender o papel dos receptores purinérgicos e dos transientes
de cálcio intracelulares espontâneos no processo de diferenciação neuronal de células
tronco da linhagem P19.
O nosso grupo demonstrou que o influxo de cálcio ([Ca2+]i) mediado tanto por
receptores nicotínicos quanto por receptores purinérgicos de ATP influi na diferenciação das
células P19 em neurônios. O entendimento do mecanismo de neurotransmissão pelos
receptores poderá ter implicações profundas para o desenvolvimento de terapias para
patologias e dependência de drogas. Além disso, já foi comprovada a participação de
receptores de neurotransmissores no desenvolvimento celular; e a modulação da expressão
e atividade dos receptores na diferenciação neuronal está sendo estudada pelo nosso
Laboratório de Neurociências.
Além disso, a produção de uma quantidade maior de neurônios pode ser interessante
em algumas situações, além de ajudar a entender certa capacidade que o cérebro tem de se
recuperar de lesões. Existe a chance de que, ao se controlar a formação de neurônios a
partir de células-tronco, seja possível substituir as células mortas em caso de doenças
neurodegenerativas, a exemplo do mal de Parkinson, ou em caso de isquemia, a interrupção
do fluxo de oxigênio e nutrientes por entupimento dos vasos sanguíneos.
4 Lab4 Figura 3: Dinâmica e homeostase da sinalização por cálcio. Durante as reações de entrada de cálcio há
formação de mensageiros secundários, que liberam o cálcio presente no retículo endoplasmático, que então
liga-se aos efetores para ativação de vários processos celulares. Nas reações do resequestro de cálcio, este
não mais está ligado aos efetores e é removido do citoplasma por translocadores e bombas (NCX, PMCA,
SERCA). Cálcio, círculos em vermelho; [Ca2+], concentração de cálcio; Ins(1,4,5)P3R, receptor de Inositol1,4,5-trifosfato; RYR, receptor de rianodina. Adaptado de Berridge M. J. et al, 2003.
Avaliação do papel do ATP sobre culturas
imageamento de Ca2+ por microscopia confocal
celulares
neuronais
utilizando
O ATP, em adição às regras clássicas como fonte de energia intracelular, é conhecido
como molécula sinalizadora extracelular. Existem múltiplos mecanismos pelo qual o ATP
pode ser liberado pelas células. Primeiro, o ATP pode sair pelas membranas danificadas de
células mortas ou lesionadas. Segundo, o ATP pode passar pelas membranas intactas por
transportadores, canais ou gap junction. Terceiro, o ATP pode ser liberado por exocitose de
vesículas sinápticas, em neurônios, ou grânulos intracelulares, em células não neuronais.
Não obstante, evidências recentes sugerem que O ATP e outras purinas estão estocados no
sistema nervoso e podem atuar como neuromediadores na regulação da diferenciação
neuronal. O nosso grupo tem recentemente demonstrado que o ATP é diferencialmente
utilizado durante a diferenciação neuronal de uma linhagem de carcinoma embrionário in
vitro. Neste contexto, iremos estudar a resposta de células de origem neuronal (glias e
neurônios diferenciados a partir de células P19) referentes à sua resposta do segundo
mensageiro cálcio quando estimuladas por ATP.
A concentração livre de cálcio intracelular em células vivas pode ser determinada
utilizando sequestradores de cálcio célula-permeável, os quais, quando ligados a um ou
mais íons de cálcio, emitem fluorescência num determinado comprimento de onda
(Grynkiewcz et al., 1985). Essas sondas de cálcio intracelular são análogas ao EGTA,
acoplado a um éster de acetoximetil. O éster de acetoximetil permite a passagem do
fluoróforo para o citossol da célula, onde é clivado por hidrolases intracelulares. O fluoróforo
liberado fica preso nas células, deixando-as prontas para medidas de cálcio (Figuras 3 e 5).
5 Lab4 2- OBJETIVOS
Mediante tratamento com agentes químicos em protocolos bem estabelecidos, células
P19 expressam uma variedade de marcadores moleculares de diferenciação neuronal e
comportam-se como neurônios em ensaios de eletrofisiologia. Assim, nossos objetivos são:
- Avaliar a expressão proteica de marcadores presentes durante a diferenciação neuronal
que caracterizam neurônios e glias diferenciadas a partir da linhagem P19 de células tronco;
- Caracterizar o padrão dos transientes de cálcio intracelulares em células da linhagem P19
diferenciadas em neurônios por imageamento de ([Ca2+]i).
3- METODOLOGIA
3.1- Diferenciação neuronal in vitro e avaliação da expressão protéica de marcadores
presentes durante a diferenciação neuronal que caracterizam neurônios e glias
diferenciadas
Cultura e diferenciação de células progenitores neurais
As células P19 serão cultivadas em suspensão para a formação de corpos embrióides
na presença do indutor neurogênico ácido retinóico em meio DMEM/F12 suplementado com
10% soro fetal bovino (Cultilab – Campinas, Brasil). Após uma semana, os corpos
embrióides serão dissociados e plaqueados para a formação de rosetas neurais e
posteriormente a geração de progenitores neurais. Em seguida, 5x105 células serão
plaqueadas em placas de 24 poços com 1ml de volume em meio de cultura em meio
DMEM/F12 70/30% em conjunto com suplementos, 10% de soro fetal bovino, sem fatores de
crescimento. O meio da diferenciação será trocado a cada 3 dias em um total de 4 a 7 dias
de diferenciação. Esta etapa será realizada previamente à realização dos experimentos de
imunocitoquímica que serão desenvolvidos durante o curso de verão 2014.
3.2- Imunocitoquímica
Para a determinação dos fenótipos celulares neurais será utilizado o método de
imunocitoquímica (Figura 4). Para isso, as células serão fixadas em paraformaldeído (PFA)
4% e permeabilizadas com Triton X-100 0,05% em PBS por 15 minutos. Após a
permeabilização, as células serão incubadas com soro de cabra 2% por 30min a
temperatura ambiente para o bloqueio de sítios inespecíficos. Na sequência, será feita uma
incubação dessas células com anticorpos primários “overnight” a 4°C. Após lavagens com
PBS, as células serão re-bloqueadas por 30 minutos com PBS contendo soro de cabra
0,5%, Triton X-100 0,1% e incubadas com anticorpos secundários por 1 hora em presença
de DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 1:1.000 para evidenciar os núcleos. As lâminas
serão lavadas e cobertas com lamínulas utilizando o meio Vectashield (Sigma).
Serão utilizados anticorpos direcionados contra marcadores para células progenitoras
(nestina), e neurônios (MAP2 e -3-tubulina) e glias (S-100 e GFAP) (Figura 3).
6 Lab4 Figura 4: Esquematização do protocolo de imunicitoquímica.
• Sumarização dos experimentos de imunocitoquímica:
1º DIA
- Fixação (PFA 4%)
- Permeabilização (Triton X-100 0,05% em PBS - 30 minutos)
- Bloqueio de sítios inespecíficos (soro de cabra 2% - 30min)
- Anticorpos primários (4°C - “overnight”)
2º DIA
- Re-bloqueio de sítios inespecíficos (30 minutos)
- Incubação com anticorpos secundários (1h)
2+
3.3- Determinação da variação de [Ca ]i em células individuais utilizando microscopia
confocal
A concentração de Ca2+ intracelular será analisada através de microscopia de
fluorescência e analisado pelo programa Nis elements AR. As células serão transferidas, 48
horas antes dos ensaios, para placas de cultura de 35 mm (Nalge Nunc international). Antes
de iniciar as medidas, as células serão incubadas a 37°C por 30 minutos, com 5µM de Fluo3AM (Invitrogen), 0,5% Me2SO e 0,1% do surfactante plurônico F-127 em meio extracelular
sem magnésio (140 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de
HEPES, 10 mM de glicose, pH 7,4). Após incubação com Fluo-3AM, as células serão
lavadas e mantidas em meio extracelular sem magnésio por 20min para garantir uma
completa desesterificação do grupo acetoximetil (AM) do Fluoróforo. A avaliação de
transientes de cálcio intracelulares espontâneos será realizada por captação na variação da
intensidade de fluorescência emitida (F), que indica a [Ca2+]i, observada em imagens
sequenciais (inicialmente com intervalos de 1s) utilizando microscópio de fluorescência
Nikon. Seguido da adição de 5µM ionóforo de cálcio (ionomicina ou 4-Br-A23187) para
aquisição da fluorescência máxima (Fmax) por formar vários poros na membrana celular
específicos para esse íon, e então pela adição de 10mM EGTA como quelante para
aquisição da fluorescência mínima possível (Fmin). O Fluo-3AM será excitado com uma
7 Lab4 lâmpada de xenônio com filtro no comprimento de onda de 488nm, a luz emitida a 515nm
será detectada usando um filtro de long-pass acima de 510 nm. A [Ca2+]i será calculada pela
equação:
[Ca2+]i = Kd.(F - Fmin)/(Fmáx – F)
Kd é a constante de dissociação do fluoróforo de cálcio (Kd Fluo-3AM = 450 nM); Fmin
é a fluorescência mínima obtida após adição de 10mM de EGTA, e Fmax é a fluorescência
máxima obtida após aplicação de 5µM de ionóforo, e F é a fluorescência medida na célula,
nesse caso sem adição de neutransmissores (Martins et al.2005) .
2+
Figura 5: Medições de alteração de [Ca ] utilizando fluoróforos sensíveis a cálcio. (A) Entrada e ativação do
i
2+
fluo-3 acetoximetil para o interior da célula. (B) Emissão da fluorescência aumenta em função da [Ca ] . (C)
i
Imagem de neurônios P19 não estimulados. (D) Imagem de neurônios P19 estimulados com 1mM de ATP. (A e
B) retirado do catálogo da Molecular Probes.
• Sumarização dos experimentos de imageamento de [Ca2+]i:
- Incubação das células por 30 minutos com Flua 3-AM – (30min).
- Lavagem das células em meio extracelular sem magnésio por 20min - para garantir uma
completa desesterificação do grupo acetoximetil (AM) do Fluoróforo.
- A avaliação de transientes de cálcio intracelulares pela aplicação de ATP utilizando
microscópio de fluorescência Nikon.
- Adição de 5µM ionóforo de cálcio (ionomicina ou 4-Br-A23187) para extinção das
respostas.
8 Lab4 REFERÊNCIAS
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Cytometry – Part A. 75A: 38-53.
Ulrich H, Majumder P. (2006). Neurotransmitter receptor expression and activity during
neuronal differentiation of embryonal carcinoma and stem cells: From basic research towards
clinical applications. Cell Prolif. 39:281-300. 9 Lab5 5. Laboratório de Fisiologia Molecular de Plantas
Responsável: Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta
Monitores: Amanda Wanderley e Cicero Alves
Análise da oscilação circadiana dos níveis de mRNA da nitrato redutase em
Rhodophyta.
Introdução
As algas desempenham um papel ecológico muito importante como produtores
primários dos ecossistemas em que ocorrem e têm grande aplicação nas indústrias
alimentícia, farmacêutica e biotecnológica (Critchley, 1993; McHugh, 2003). Gracilaria
tenuistipitata (Fig. 1) é uma alga vermelha (Rhodophyta) usada mundialmente como
organismo modelo em estudos fisiológicos, bioquímicos e de biologia molecular.
Figura 1. Talos gametofíticos (n) de Gracilaria tenuistipitata. Foto: Amanda Wanderley.
As algas empregadas em estudos científicos ou industrialmente podem ser coletadas
diretamente de seu ambiente natural ou cultivadas. O cultivo in vitro (em laboratório) e em
larga escala (tanques, estuários, mar aberto) é estimulado visando a proteção dos bancos
naturais (McHugh, 2003). O cultivo in vitro é ideal para o controle dos fatores abióticos aos
quais as algas estão submetidas, como irradiância, fotoperíodo, concentração de nutrientes
e temperatura, permitindo a análise de variantes isoladas sobre o metabolismo do
organismo. Nestas condições controladas, aspectos bioquímicos e moleculares da fisiologia
desses organismos podem ser estudados.
Nitrogênio é um dos principais nutrientes limitantes ao crescimento e desenvolvimento
das algas, por ser um elemento constituinte de diversas macromoléculas orgânicas, sendo
que nitrato é fonte inorgânica com maior disponibilidade no ambiente marinho. A nitrato
redutase é uma enzima citoplasmática presente em algas e plantas terrestres, responsável
pela redução de nitrato a nitrito, utilizando NAD(P)H como poder redutor. O nitrito é
transportado para o cloroplasto e é reduzido a amônio através da nitrito redutase, utilizando
ferredoxina reduzida (Fd-red) com fonte de equivalentes de redução. O amônio é
1 Lab5 posteriormente incorporado ao glutamato (esqueleto carbônico imediato) pela ação da
enzima glutamina sintetase (GS), originando glutamina. O grupo amida da glutamina é
transferido para o 2-oxoglutarato, através da enzima glutamina:2-oxoglutarato
aminotransferase (GOGAT), que utiliza NADH ou Fe-red como redutor, formando duas
moléculas de glutamato. Uma vez assimilado em glutamina e glutamato, o nitrogênio é
incorporado em outros aminoácidos por meio de reações de transaminação, catalisadas por
aminotransferases (AT) (Fig. 2) (Crawford, 1995; Lobban & Harrison, 1994; Tischner, 2000;
Taiz & Zeiger, 2004; Suzuky & Knaff, 2005).
Figura 2. Assimilação de nitrato. NR = nitrato redutase; NiR = nitrito redutase; GS = glutamina sintetase;
GOGAT = glutamina:2-oxoglutarato aminotransferase; AT = aminotransferase. Retirado de Wanderley, 2009.
A atividade da nitrato redutase pode ser regulada em diferentes níveis, incluindo
controles transcricionais e pós-transcricionais (síntese e degradação do mRNA)
(Solomonson & Barber, 1990; Crawford & Arst, 1993) e controles pós-traducionais por
modulação redox e alostérica (De la Rosa, 1989), fosforilação/desfosforilação (Crawford &
Arst, 1993; Kaiser & Huber, 2001; Lillo et al., 2004) ou proteólise (Solomonson & Barber,
1990). A expressão gênica e a atividade da nitrato redutase são influenciadas por diversos
fatores ambientais e intracelulares, incluindo intensidade luminosa e seu comprimento de
onda, disponibilidade de nutrientes nitrogenados e CO2, metabólitos do nitrogênio e do
carbono e também pelo relógio biológico. O principal mecanismo de regulação imediata, em
curto prazo, é pós-traducional, através de processos de fosforilação/desfosforilação, que
envolvem a ação das enzimas proteína quinase (PK) e proteína fosfatase do tipo 2A (PP2A)
e a ligação de proteínas inibitórias da família 14-3-3 à forma fosforilada da NR (forma inativa;
Fig. 3).
Ritmos circadianos estão envolvidos em grande parte dos processos fisiológicos e
permitem a antecipação de mudanças ambientais e sincronização temporal e espacial de
vias metabólicas (Bell-Perdesen et al., 2005; Gardner et al., 2006; Harmer, 2009). O relógio
biológico pode estar em constante modificação para melhorar o desempenho e
produtividade de diversos organismos de acordo com as mudanças ambientais, resultando
em sensíveis mudanças de fase e/ou de periodicidade dos ritmos, que servem de
indicadores de mudanças ambientais (Dunlap, 1999; Luning, 1994; Pittendrigh & Takamura,
1897).
2 Lab5 Figura 3. Modelo da regulação da expressão gênica e da atividade da nitrato redutase (modificado de Heldt &
Piechulla, 2011).
A Fig. 4 mostra a relação de regulação cíclica entre os fatores de transcrição
responsáveis pelas oscilações circadianas em plantas. O círculo escurecido engloba os
osciladores centrais que coordenam todos os outros. Estes podem ser conservados e
estarem presentes em outros grupos de eucariotos fotossintetizantes. Os fatores PRR
apresentam domínios muito conservados evolutivamente, inclusive em Rhodophyta.
Diversos genes associados ao ritmo apresentam estruturas e mecanismos conservados
evolutivamente como peroxirredoxinas e criptocromos (Edgar et al., 2012; Heijde et al.,
2010; Lin & Shalitin, 2003), mas a única planta em que se conhece detalhadamente os
mecanismos do relógio é Arabidopsis.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) é
uma das técnicas mais comumentes utilizadas em laboratórios de Biologia Molecular. A
técnica pode ser utilizada para amplificar sequências de DNA e consiste em simular ciclos
de replicação in vitro, utilizando um molde (template) de DNA, segmentos de DNA
iniciadores específicos (primers) e desoxirribonucleotídeos para produção de uma nova fita
de DNA, em uma reação catalisada por uma DNA polimerase termoestável. A reação é
incubada em diferentes temperaturas, sucessivamente, de modo a permitir ciclos
sequenciais de ligação dos primers com o DNA molde, polimerização e desnaturação das
fitas resultantes. A técnica de PCR pode ser qualitativa, utilizada para a identificação de
sequências gênicas, ou quantitativa, utilizada para a medida de número de cópias de
determinada sequência, quando os devidos controles são incluídos.
Uma modificação dessa técnica pode ser utilizada para quantificar o número de
cópias de um determinado RNA em uma amostra biológica, Nesse caso, primeiro o RNA
deve ser convertido ao DNA complementar (cDNA), pela atividade da enzima transcriptase
reversa (RT-PCR, do inglês Reverse Transcriptase-PCR). Esta reação converte o RNA, que
é pouco estável e muito sensível a altas temperaturas presentes na reação, em uma
molécula de DNA dupla fita, mais estável. Esta etapa precede a amplificação do DNA,
permitindo que as sequências transcritas possam ser amplificadas. Com isto, tem-se uma
quantidade de DNA proporcional à concentração de RNA inicial.
3 Lab5 Figura 4. Modelo de interações baseadas em transcrição da rede regulatória do relógio circadiano de
Arabidopsis. O núcleo do oscilador consiste do CCA1/LHY e do TOC1 (círculo cinza). Outros componentes
interagem formando múltiplos ciclos de retroalimentação negativa e uma rede complexa de regulação. Linhas
pretas pontilhadas indicam auto-inibição da transcrição. Linhas pretas com setas indicam ativação da
transcrição e linhas pretas com traços na ponta indicam repressão da transcrição. LUX, ELF3 e ELF4
interagem formando o Evening Complex (EC), que demonstra uma consequência das interações de
componentes do ritmo com reguladores processos fisiológicos, como o crescimento do hipocótilo (Nagel & Kay,
2012).
A PCR em Tempo Real (qPCR), por sua vez, é capaz de monitorar o progresso da
reação de PCR enquanto ela acontece (ou seja, em tempo real). Os dados são desta forma,
coletados ao longo do tempo de reação e permitem uma análise temporal precisa. A PCR
em tempo real utiliza como indicador quantitativo o número de ciclos da reação no qual a
amplificação de um alvo é detectada pela primeira vez, o que é proporcional à quantidade
inicial de DNA. O acompanhamento da reação em tempo real é feito através da medida de
emissão de alguma molécula fluorescente que é incorporada ao produto amplificado de
modo quantitativo e, assim, quanto maior o número de cópias iniciais do ácido nucleico alvo,
mais rápido será observado o aumento significativo na fluorescência.
Quando utilizada para determinação da expressão gênica, a PCR comumente envolve
a quantificação relativa do gene: mede-se a mudança de variação de expressão de um
determinado gene de interesse, em relação a outro gene referência. Usa-se um gene de
referência de expressão constitutiva, para o qual não se espera mudanças na expressão nas
condições experimentais que se deseja testar. Esta mudança de expressão do gene de
interesse é referida como Fold Change, de uma condição experimental em relação a outra,
tomando-se como referência o gene controle.
4 Lab5 Figura 5. Exemplo de gráfico de qPCR em tempo real. Observa-se que a linha vermelha representa uma
amostra que ultrapassa a linha basal (fluorescence threshold) em um ciclo mais baixo que as outras amostras.
Assim, conclui-se que esta amostra possui mais RNA que as outras, ou seja, quanto mais RNA, mais cDNA e,
consequentemente, mais rápido será a obtenção de uma fluorescência mínima.
Nos ciclos iniciais da PCR quantitativa, ocorre pouca mudança no sinal de
fluorescência. Esse sinal é considerado basal (baseline) no gráfico de amplificação. Um
aumento na fluorescência acima do nível basal indica a detecção de alvo acumulado. Um
valor fixo de corte para a fluorescência é determinado (threshold) acima desse basal,
servindo como referência para a comparação de curvas. O parâmetro Ct (threshold cycle) é
definido como o número de ciclos necessários para que a fluorescência ultrapasse o
threshold, que será sempre inversamente proporcional à quantidade inicial do DNA alvo, isto
é, quanto menor o Ct, maior a quantidade de DNA de um determinado gene no início da
reação. Um parâmetro a ser testado antes da utilização dos primers é a determinação da
eficiência de amplificação do produto. Nos experimentos de quantificação relativa é muito
importante que a eficiência de amplificação do controle endógeno seja semelhante à
eficiência de amplificação do gene de interesse que se deseja quantificar. Para esta
determinação, são realizadas reações de amplificação, contendo primers em uma
concentração ideal e uma diluição em série do DNA template. A análise de regressão linear
dos valores de Cts em função do logaritmo da respectiva diluição fornece o coeficiente
angular da reta (a, em y=ax+b), que é utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação
do produto pelos primers, utilizando-se a seguinte fórmula:
Ef = 10-1/coeficiente angular
Ef (%) = (Ef-1) x 100
A análise da expressão diferencial é realizada calculando-se a diferença entre a
média dos Cts da amostra referência e a média dos Cts da amostra estudada. Esta
diferença é definida como ∆Ct. O cálculo de ∆Ct é realizado para os dados do gene de
interesse e para os dados dos genes de expressão constitutiva. A diferença de expressão de
genes entre as amostras pode ser calculada pela seguinte relação:
( Ef )
GeneAlvo
D Ct GeneAlvo
( Ef )
ControleEnd geno
D Ct
ControleEnd geno
5 Lab5 Devido à alta sensibilidade da técnica de RT-PCR, alguns cuidados básicos devem
ser tomados para evitar contaminações da reação e artefatos na interpretação dos
resultados:
• Utilizar sempre luvas sem talco.
• Utilizar placas e tampas óticas, e evitar ao máximo o contato com a superfície das tampas
(a leitura da fluorescência é realizada de cima para baixo).
• Utilizar ponteiras com filtro para minimizar possíveis contaminações cruzadas provocadas
pela pipeta.
• Em cada placa colocar sempre amostras controles sem template (NTC – non template
control) para cada um dos primers e amostras de RNA não transcritos reversamente (NRT
control) para cada cDNA analisado.
Justificativa
Acredita-se que todos os organismos vivos possuam ritmos internos de expressão de
fatores de transcrição que modulam a expressão diária de diversos genes essenciais para a
manutenção de respostas a estímulos ambientais. Organismos do grupo Rhodophyta são os
eucariotos fotossintetizantes multicelulares mais primitivos. O estudo dos ritmos circadianos
nesses organismos pode evidenciar mecanismos conservados ao longo da evolução das
plantas e ajudar a elucidar o surgimento e desenvolvimento de mecanismos complexos de
regulação da rede do relógio biológico e da adaptação desses organismos ao seu ambiente
e as suas variações diárias e sazonais.
Objetivo
Verificar a oscilação circadiana dos níveis do mRNA da nitrato redutase de Gracilaria
tenuistipitata utilizando a técnica de PCR em tempo real.
Descrição de técnicas e procedimentos
Cultivo in vitro de Gracilaria tenuistipitata
Gracilaria tenuistipitata var liui Zhang et Xia será cultivada em água do mar natural
filtrada e esterilizada, enriquecida com uma solução de von Stosch que contém nitrato,
fosfato, metais e vitaminas (Tab. 1).
Tabela 1. Composição química final do meio de cultura enriquecido com a solução de von
Stosch
Componente
Concentração
NaNO3
0,50 mMol.L-1
Na2HPO4.12H2O
30 µMol.L-1
FeSO4.7H2O
1µMol.L-1
MnCl2.4H2O
0,1 µMol.L-1
Na2EDTA.2H2O
10 µMol.L-1
Tiamina.HCl (B1)
0,59 µMol.L-1
Biotina (B8)
4,10 nMol.L-1
Cianocobalamina (B12)
1,0 nMol.L-1
6 Lab5 Os experimentos serão realizados em câmaras de cultivo nas seguintes condições:
500 mg.L-1 biomassa fresca/meio, temperatura média de 25 ± 1oC, sob regime de
claro:escuro de 12:12 horas, salinidade 35, pH 8, densidade de fluxo fotônico de 100 ± 5
μE.m-2.s-1 gerado por 2 lâmpadas tubulares de 1,5 m 40W fluorescentes. Serão feitas duas
coletas de algas: uma ao meio dia e outra à meia noite.
Outro cultivo sob iluminação contínua será feito em paralelo sob as mesmas
condições de forma a reiniciar todos os ciclos independentes dos ciclos endógenos.
Extração de RNA
As extrações do RNA de serão feitas de acordo com o protocolo descrito pelo manual
do kit de extração de RNA de plantas PureLinkTM Plant RNA reagent (Invitrogen), que
permite a purificação de RNA total materiais vegetais, especialmente aqueles ricos em
polifenóis e amido.
Amostras de 700 mg da sexta hora de luz e da sexta hora de escuro de cada
experimento serão coletadas, trituradas e congeladas em nitrogênio líquido. A seguir, 5 mL
do reagente de extração será adicionado, a mistura será homogeneizada com uso de vortex
e incubada em temperatura ambiente por 5 min. Após a centrifugação a 2600 x g, ao
sobrenadante serão adicionados NaCl a 5 mol.L-1 e clorofórmio para separação de fases e
álcool isopropílico para precipitação. Após a extração, as amostras serão quantificadas em
espectrofotômetro para verificar a pureza e concentração de RNA, sendo confirmadas em
seguida por eletroforese em gel de agarose a 1,2%. Abaixo segue o detalhamento do
protocolo.
Manuseando RNA
Para evitar contaminação deve-se observar os seguintes cuidados:
1 - Usar sempre luvas descartáveis e trocá-las com frequência.
2 - Usar técnicas assépticas de microbiologia para evitar contaminação.
3 - Usar plásticos descartáveis e estéreis.
4 - Usar pipetas reservadas apenas para RNA.
5 - Usar ponteiras aerosol-resistentes para evitar contaminação entre amostras ou dos
reagentes.
6 - Tratar descartáveis com inibidor de RNases.
7 - Aquecer a vidraria a 150 ºC por 4 h.
8 - Embeber plásticos não descartáveis em 0,5 M de NaOH por 10 min e enxaguar com
água DEPC.
Materiais
1 - Nitrogênio líquido.
2 - Almofariz e pistilo.
3 - Tubos de microcentrífuga livres de RNase.
4 - 5 M de NaCl.
5 - Clorofórmio.
6 - Álcool isopropílico.
7 - Etanol 75%.
8 - Água DEPC.
Preparação da amostras
1 - Congelar tubos de microcentrífuga em nitrogênio líquido antes de transferir o material
triturado.
2 - Triturar o material até a obtenção de um pó fino utilizando-se pistilo e almofariz.
3 - Manter o material triturado a – 80 ºC até seu uso.
7 Lab5 Procedimento para extração de RNA de plantas (até 100 mg)
1 - Adicionar 0,5 mL do reagente PureLink Plant RNA frio (4 ºC) a até 100 mg de material
triturado congelado. Misturar brevemente no vortex.
2 - Incubar o tubo horizontalmente em temperatura ambiente por 5 min.
3 - Clarificar a solução por centrifugação a 12000 x g em microcentrífuga em temperatura
ambiente por 2 min.
4 - Transferir o sobrenadante para um tubo livre de RNase.
5 - Adicionar 0,1 mL de NaCl 5 M. Homogeneizar com leves batidas no tubo.
6 - Adicionar 0,3 mL de clorofórmio à amostra. Misturar por inversão.
7 - Centrifugar a 12000 x g a 4 ºC por 10 min.
8 - Transferir a fase aquosa superior para outro tubo livre de RNase.
9 - Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e deixar em temperatura
ambiente por 10 min.
10 - Centrifugar a 12000 x g a 4 ºC por 10 min.
11 - Descartar o sobrenadante, cuidando para não perder o pellet, e adicionar 1 mL de
etanol 75%.
12 - Centrifugar a 12000 x g em temperatura ambiente por 1 min. Descartar o sobrenadante,
centrifugar novamente e coletar o liquido residual com uma pipeta.
13 - Adicionar 10-30 μL de água DEPC. Pipetar o liquido várias vezes para ressuspender o
RNA.
14 - Centrifugar novamente a 12000 x g em temperatura ambiente por 1 min e retirar o
sobrenadante com RNA para outro tubo.
15 - Armazenar o RNA purificado a – 80 ºC.
RT-PCR
Amostras de 1 μg do RNA extraído serão submetidas a tratamento com DNAse,
seguindo o protocolo Turbo DNA-Free (Ambion). A PCR reversa será feita com o kit
SuperScript® III First-Strand Synthesis System utilizando primers randômicos. A síntese do
cDNA será iniciada com a desnaturação do RNA a 65 °C por 5 min, seguida da adição de 10
µL do mix de síntese e corrida de um ciclo de 10 min a 25 °C para anelamento dos primers,
50 min a 50 °C para síntese e 5 min a 85 °C para inativação da transcrição reversa. Abaixo
segue o detalhamento do protocolo.
PCR
SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix
Nº de Amostras
6
Volume Final(µL)
8
[__]inicial
[__]final
Vp/ 1
Anneling Buffer (µL)
2
1
4,0
Oligo dT (μmol)
50
5
0,8
RNA (ng/µL)
300
100
2,7
Vfinal + 10%
26,4
5,3
17,6
1 - Incubar a 65 ºC por 5 min. e colocar em gelo imediatamente por no mínimo 1 min.
2 - Preparar o seguinte MIX:
8 Lab5 Volume Final(µl)
Tampão 10X
MgCl2 (mM)
DTT mM
RNAse OUT
(U/μL)
SuperScript III RT
(SSIII RT) (U/μL)
20
[__]inicial
10
25
0,1
[__]final
1
5
0,01
Vp/ 1
2,0
4,0
2,0
Vfinal + 10%
13,2
26,4
13,2
40
2
1,0
6,6
200
10
1,0
6,6
3 - Incubar a 50 ºC por 50 min.
4 - Finalizar a reação a 85 ºC por 5 min.
5 - Adicionar 1 μL de RNAseH e incubar a 37 ºC por 20 min.
qPCR
Para quantificação da expressão gênica, a PCR quantitativa (qPCR) será realizada
com a adição de 5 ng do cDNA a 5 µL dos iniciadores relativos à nitrato redutase e EF-1α
em concentrações de 400 a 1000 nmol.L-1 e 10 µL do mix do reagente SYBR Green (Applied
Biosystems). A mistura será submetida a 1 ciclo de 2 min a 50 °C e 10 min a 95 °C para
ativação da polimerase, seguido de 40 ciclos de termociclagem, constituídos por 95 °C por
30 s e 60 °C por 1 min. As reações serão realizadas no termociclador de PCR em tempo real
StepOne Plus (Applied Biosystems) e serão analisadas pelo programa Sequence Detection,
versão 1.2, Applied Biosystems.
O gene GAPDH será utilizado como referência. As sequencêas de iniciadores serão:
F: 5’ – GCGGCGCGAAGAAGGT – 3’ e R: 5’ – CAAACATGGGCGCATCCT – 3’ com
temperatura de anelamento de 57°C gerando um produto de PCR de 54 pb para GAPDH e
F:5´- CGCCAA,GAACCACCAATGTA–3´ e R:5´- CGTCCGGGCTGTTTTTGT– 3´ com
temperatura de anelamento de 56°C, gerando um fragmento de 56 pb nitrato redutase.
Abaixo segue o detalhamento do protocolo
qPCR
Nº de
Amostras
Volume
Final(µL)
H2O
DEPC(µL)
PRIMER R
(μmol)
PRIMER F
(μmol)
Tampão
SYBR (X)
cDNA (ng/µL)
6
25
[inicial]
[__]final
Vp/
1
Vfinal +
20%
\
\
6,09
43,848
20
0,9
20
0,9
2
1
12,5
90
100
100
TOTAL
4,16
25
150,048
1,12
5
1,12
5
8,1
8,1
9 Lab5 Análise dos resultados
Os resultados serão analisados através da comparação do nível de expressão relativa
de cada amostra, dado pela comparação dos Cts da nitrato redutase e do GAPDH em
diferentes horas do dia, como explicado na introdução.
Perguntas
1. Por que se fez cultivo em claro constante?
2. O que você pode inferir sobre os resultados obtidos, em relação ao controle endógeno do
ritmo circadiano de processos metabólicos?
3. O que a PCR em tempo real REALMENTE está medindo?
4. Podemos dizer que o controle da expressão gênica da nitrato redutase ocorre no nível de
transcrição?
5. Poderíamos ter feito uma PCR comum para alcançar os mesmos resultados?
6. Se o gene de referência tivesse oscilação circadiana, ele ainda poderia ser usado?
7. Se a curva de melting tivesse gerado 2 picos, o isso sugeriria?
8. Sugira um tipo de abordagem a mais que poderíamos fazer para confirmar os resultados.
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Nature 485: 459-464.
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Biology 60: 357-377.
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HELDT, H.W. & PIECHULLA, B. 2011. Plant Biochemistry. 4. ed. Londres, Reino Unido:
Elsevier, p. 618
KAISER, W.M. & HUBER, S.C. 2001. Post-translational regulation of nitrate reductase:
mechanism, physiological relevance and environmental triggers. J. Exp. Bot. 52 (363): 19811989. 10 Lab6 6. LABORATÓRIO DE GENÔMICA E EXPRESSÃO GÊNICA EM CÂNCER
Responsável: Prof. Dr. Eudardo Moraes Rego Reis
Monitor: Luís Bruno da Cruz e Alves de Moraes
Avaliação da expressão gênica em células tumorais humanas.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Expressão gênica
As propriedades biológicas de uma célula estão intrinsecamente relacionadas com as
proteínas que nela são expressas. Em qualquer momento do ciclo de vida da célula, apenas
uma pequena parcela dos genes presentes em seu genoma estará ativa, e esse perfil de
produtos gênicos varia tanto em relação ao tipo quanto aos níveis de RNA e proteínas que
são produzidos nesse dado momento. Em linhas gerais, a expressão gênica pode ser
definida, então, como o processo pelo qual a informação contida em uma sequência de DNA
(gene) é convertida em um produto gênico funcional, seja uma proteína ou uma molécula de
RNA. A regulação da expressão gênica, por sua vez, refere-se especificamente ao
controle da síntese dos transcritos gênicos e de seus eventuais produtos proteicos. Tal
processo permite à célula manter sua estrutura, controlar suas funções, promover mudanças
no seu estágio de desenvolvimento e fazer frente às variações do ambiente, constituindo-se
assim como a base para a diferenciação celular e a capacidade de adaptação dos
organismos.
Os mecanismos de controle da expressão gênica nas células eucarióticas, em especial,
são altamente complexos e requerem uma variedade de proteínas regulatórias e de
interações entre elas e o DNA, a fim de manter silenciada a maior parte do genoma e ao
mesmo tempo gerar inúmeros padrões de expressão. O processo de expressão dos genes
nesses organismos pode sofrer regulação em qualquer uma de suas etapas, seja por (1)
modificações químicas e estruturais do DNA ou da cromatina (metilação, acetilação,
remodelamento, etc.), (2) ação de moduladores durante o processo de transcrição do DNA
em RNA, (3) modificações pós-transcricionais no RNA, (4) controle do transporte do RNA do
núcleo para o citoplasma, (5) aumento ou diminuição da velocidade de degradação do RNA,
(6) controle da tradução e (7) modificações pós-traducionais na proteína sintetizada. Com
tantos e tão sofisticados recursos de regulação, o ligamento ou desligamento de genes pode
ocorrer prontamente em resposta a alterações no metabolismo ou no programa de
desenvolvimento da célula, contribuindo assim para gerar a imensa diversidade de funções e
fenótipos observados nas células dos eucariotos.
Mecanismo geral da expressão gênica nas células eucarióticas (Barton et al., 2007).
1 Lab6 1.2. Análise da expressão gênica no câncer
As neoplasias, de um modo geral, são originadas pela ausência ou diminuição da
expressão de genes essenciais para o controle da proliferação celular, comumente
chamados de genes supressores de tumor. Tais falhas podem ocorrer por causas diretas,
como mutações que impedem a transcrição ou a tradução correta desses genes, ou por
motivos indiretos, como alteração nas funções de outros fatores que estão envolvidos nas
mesmas vias de controle. A caracterização do perfil de expressão gênica em tumores
humanos é, por esta razão, uma poderosa abordagem para o delineamento das vias
moleculares e processos celulares alterados nas neoplasias. Na pesquisa oncológica e
translacional, essa abordagem é extremamente importante, tanto na busca de novos
marcadores de diagnóstico precoce ou de prognóstico clínico, quanto na identificação de
potenciais alvos terapêuticos ou de resistência aos tratamentos quimioterápicos.
No Laboratório de Genômica e Expressão Gênica em Câncer são utilizadas
abordagens genômicas (hibridização de microarranjos de DNA, sequenciamento em largaescala de bibliotecas de cDNA, etc.) para investigar modificações no padrão de expressão
de RNAs codificadores e não-codificadores de proteína que se correlacionem com a
transformação maligna ou com a progressão de tumores humanos de alta prevalência e/ou
morbidade. Outra abordagem utilizada pelo Laboratório para identificar e caracterizar genes
relevantes no contexto do câncer baseia-se na análise informática do conjunto de
sequências expressas nos tecidos humanos que foram amostradas experimentalmente e
que se encontram depositadas nas bases de dados públicas. Essa abordagem permite a
identificação in silico de genes alterados em tumores humanos, que a seguir são
selecionados para caracterização molecular detalhada no laboratório, com o auxílio de
ferramentas de bioquímica e biologia molecular.
O caso do gene VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor), situado no braço curto
do cromossomo 3 (3p25.3), é um exemplo bastante didático a ilustrar como a disfunção de
um gene supressor de tumor resulta no desenvolvimento do câncer. A mutação de VHL
causa a doença de von Hippel-Lindau, uma síndrome familial autossômica dominante rara
(1:36.000), que inclui predisposição ao adenocarcinoma renal. A função desse gene é tão
importante, que entre os casos esporádicos (não hereditários) da neoplasia, cerca de 80%
se devem à sua inativação. A proteína codificada por ele é componente de um complexo
proteico que está envolvido na ubiquitinação e degradação – a ubiquitina é uma proteína que
permite à célula eliminar proteínas de maneira específica, marcando as que são indesejadas
de modo a que sejam degradadas por organelas chamadas proteassomas – do fator de
transcrição HIF (hypoxia-inducible factor), que desempenha papel central na regulação da
expressão gênica pela concentração de oxigênio. Portanto, por sua importância para o
surgimento e progressão do adenocarcinoma renal, este gene foi escolhido para ser o objeto
de análise nos experimentos que farão parte do curso prático oferecido aos participantes do
IX Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular (IQ-USP) que optaram pelo estágio
no Laboratório de Genômica e Expressão Gênica em Câncer.
2. OBJETIVO
O objetivo do Laboratório de Genômica e Expressão Gênica em Câncer no IX Curso de
Verão em Bioquímica e Biologia Molecular (IQ-USP) é apresentar aos seus participantes as
técnicas básicas empregadas em um ensaio de análise de expressão gênica. Para isto, será
avaliada, em um conjunto de cinco aulas práticas, a expressão do gene VHL em linhagens
de células tumorais e não tumorais de rim humano.
2 Lab6 3. METODOLOGIA
AULA 1: EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO RNA TOTAL
A. EQUIPAMENTOS:










Agitador de tubos do tipo VORTEX.
Banho seco, regulado a 50°C.
Microcentrífuga refrigerada.
Isopor com gelo picado.
Cooler.
Pipetas sorológicas descartáveis (10 mL e 25 mL).
Pipetas automáticas de volume variável (P-200 e P-1000).
Ponteiras estéreis e livres de RNases.
Tubos do tipo FALCON™ estéreis (15 mL).
Tubos do tipo EPPENDORF, estéreis e livres de RNases (1,5 mL).
B. REAGENTES:












Células tumorais e não-tumorais de rim humano (769-P, 786-O e RC-124).
Meio de cultura.
Tampão fosfato (PBS; 0,1 M; pH 7,2).
Tripsina/EDTA (5 mg/mL)
Reagente de extração TRIzol. (1)
Clorofórmio P.A. (2)
Etanol 75% P.A. (3)
Isopropanol P.A. (4)
Água tratada com dietil pirocarbonato (DEPC).
Etanol 100% P.A. (3)
β-mercaptoetanol. (1)
Kit de purificação illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit (GE Healthcare).
(1) Tóxico por inalação e absorção pela pele. Corrosivo.
(2) Irritante por inalação.
(3) Inflamável.
(4) Inflamável. Irritante.
3 Lab6 C. PREPARO DOS REAGENTES:
1. TAMPÃO PBS (PHOSPHATE BUFFERED SALINE; 0,1 M; pH 7,2):
1.1. Dissolver 2,76 g de fosfato monobásico de sódio (NaH2PO4) e 10,94 g de fosfato
bibásico de sódio (Na2HPO4) em 800 mL de água deionizada;
1.2. Acertar o pH para 7,2 com ácido acético ou HCl;
1.3. Completar o volume para 1 L com água deionizada.
2. SOLUÇÃO DE ETANOL 75% P.A.:
2.1. Em uma proveta ou cilindro graduados de 100 mL, estéreis e livres de RNases,
adicionar etanol 100% P.A. até 75 mL;
2.2. Completar o volume para 100 mL com água tratada com DEPC;
2.3. Homogeneizar e transferir a solução para um frasco estéril e livre de RNases.
D. PROCEDIMENTO:
1. RECUPERAÇÃO DAS CÉLULAS EM CULTURA:
1.1. Retirar o meio de cultura de cada garrafa (175 mm3) com células confluentes (pelo
menos 5 x 106 células) que será utilizada para a extração de RNA;
1.2. Adicionar 25 mL de PBS para a lavagem das células e, em seguida, descartá-lo;
1.3. Adicionar 2 mL de tripsina/EDTA (5 mg/mL) e deixar a garrafa por 5 minutos na
estufa de CO2;
1.4. Quando as células estiverem desprendidas do fundo da garrafa, adicionar 8 mL de
meio de cultura;
1.5. Transferir as células para um tubo FALCON™ de 15 mL e centrifugar a 325 x g por 5
minutos;
1.6. Descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 5 mL de PBS e centrifugar a
325 x g por 5 minutos;
1.7. Descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 1 mL de PBS e transferir as
células para um tubo EPPENDORF de 1,5 mL;
1.8. Centrifugar as células a 325 x g por 5 minutos e descartar o sobrenadante.
ATENÇÃO: A partir deste ponto, todo o procedimento deve ser realizado com material
RNase free. Antes de iniciá-lo, limpar a bancada e pipetas com hipoclorito 1%, H2O, álcool
70%, RNase exterminator e H2O, nesta mesma sequência.
2. EXTRAÇÃO E HOMOGENEIZAÇÃO DO RNA:
2.1. Adicionar 1 mL de TRIzol gelado a cada tubo com o pellet de células;
2.2. Incubar o homogenato por 5 minutos à temperatura ambiente, para permitir a
completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas.
3. SEPARAÇÃO EM FASES:
3.1. Adicionar 200 L de clorofórmio a cada tubo EPPENDORF;
3.2. Inverter e agitar vigorosamente os tubos por 15 segundos; em seguida, incubá-los à
temperatura ambiente por 3 minutos;
3.3. Centrifugar o homogenato a 12.200 x g por 15 minutos a 0°C;
4 Lab6 3.4. Após a centrifugação, a mistura separa-se em uma fase mais densa de coloração
rosa (fenol-clorofórmio), no fundo do tubo, contendo as proteínas; em uma interface
branca, contendo o DNA precipitado; e em uma fase sobrenadante aquosa, incolor,
onde está contido o RNA solúvel;
3.5. Transferir, com a pipeta, a fase aquosa (~500 L) para um novo tubo (1,5 mL), tendo
o cuidado de não retirar também o DNA precipitado ou a fase rosa.
4. PRECIPITAÇÃO:
4.1. Adicionar 500 L de isopropanol (promoverá a precipitação do RNA) a cada tubo e
misturar bem, por inversão;
4.2. Incubar a solução por 10 minutos à temperatura ambiente;
4.3. Centrifugar a 12.200 x g por 10 minutos a 0°C;
4.4. Remover o sobrenadante, tendo o cuidado de não aspirar o precipitado que se
encontra no fundo do tubo; o RNA precipitado, frequentemente invisível antes da
centrifugação, formará um pellet de consistência gelatinosa.
5. LAVAGEM:
5.1. Adicionar a cada tubo 1 mL de etanol a 75%; misturar por inversão e utilizar a própria
ponteira como instrumento de fragmentação do centrifugado; homogeneizar a
solução em agitador do tipo VORTEX;
5.2. Centrifugar a solução a 7.000 x g por 5 minutos a 0°C;
5.3. Remover o sobrenadante, tendo o cuidado de não aspirar o precipitado que se
encontra no fundo do tubo (o pellet está solto nessa etapa);
5.4. Repetir toda a operação até mais duas vezes se desejado.
6. REDISSOLUÇÃO:
6.1. Deixar os tubos abertos para secar os pellets por 5 a 10 minutos, à temperatura
ambiente; ter cuidado para não desidratá-los totalmente, se não o RNA não irá
ressuspender;
6.2. Ressuspender cada pellet em 100 L de água tratada com DEPC (RNase free), préaquecida a 50°C;
6.3. Incubar as amostras a 50°C por 10 minutos para ressuspender totalmente o RNA (a
temperatura elevada facilita a dissolução do precipitado e neutraliza RNases);
6.4. Armazenar as amostras de RNA em freezer a –80°C ou encaminhá-las
imediatamente para purificação.
7. PURIFICAÇÃO (illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit):
5 Lab6 ATENÇÃO: Todo o procedimento deve ser realizado em temperatura ambiente, com
materiais RNAse free. A capacidade máxima de cada coluna do kit é de 100 µg de RNA.
Portanto, para evitar a perda e o desperdício de material das amostras, não ultrapassar essa
quantidade.
7.1. Aplicação das amostras nas colunas de purificação:
7.1.1. Colocar em um tubo EPPENDORF 100 µL da amostra de RNA;
7.1.2. Acrescentar 350 µL de tampão RA1;
7.1.3. Acrescentar 3,5 µL de β-mercaptoetanol;
7.1.4. Homogeneizar e acrescentar 250 µL de etanol 100%;
7.1.5. Aplicar os 703,5 µL da mistura na coluna (a coluna comporta até 750 µL);
7.1.6. Centrifugar a 8.000 x g por 1 minuto;
7.1.7. Substituir o tubo coletor;
7.1.8. Adicionar 350 µL de tampão MDB (membrane desalting buffer) e centrifugar a
11.000 x g por 1 minuto;
7.1.9. Descartar o filtrado.
7.2. Tratamento com DNase:
7.2.1. Adicionar à coluna a mistura de DNase reaction buffer (90 µL) e DNase I (10
µL);
7.2.2. Incubar por 55 minutos à temperatura ambiente.
7.3. Lavagem e eluição:
7.3.1. Pipetar na coluna 200 µL de tampão RA2 e centrifugar a 11.000 x g por 1
minuto. Descartar o filtrado;
7.3.2. Pipetar na coluna 600 µL de tampão RA3 e centrifugar a 11.000 x g por 1
minuto. Descartar o filtrado;
7.3.3. Pipetar na coluna 250 µL de tampão RA3 e centrifugar a 11.000 x g por 2
minutos. Descartar o filtrado;
7.3.4. Transferir a coluna para um tubo EPPENDORF;
7.3.5. Pipetar 100 µL de água RNase free pré-aquecida a 50°C e incubar por 3
minutos;
7.3.6. Centrifugar a 11.000 x g por 1 minuto;
7.3.7. Se desejado, para melhorar a eficiência da purificação, passar o eluído
novamente na coluna, incubando por 1 minuto, e centrifugar a 11.000 x g por 1
minuto.
8. ALIQUOTAGEM DAS AMOSTRAS PARA TESTES DE QUALIDADE:
8.1. Separar três tubos EPPENDORF de 0,2 mL e colocar no cooler;
8.2. Colocar em cada tubo 1,6 µL da amostra de RNA para (1) quantificação no
NANODROP®, (2) análise da qualidade no BIOANALYZER® e (3) verificação da
contaminação da amostra com DNA genômico por PCR (este terceiro teste não será
realizado no curso).
6 Lab6 AULA 2: QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE DA INTEGRIDADE DO RNA
NANODROP
A. MATERIAL:




Papel higiênico macio.
Pipeta automática de volume variável (P-2 ou P-10).
Ponteiras estéreis e livres de RNases.
Recipiente de descarte de ponteiras.
B. PROCEDIMENTO:
1. Ligar o estabilizador.
2. Iniciar o programa ND-1000 V3.2.1 clicando no ícone abaixo:
3. Aparecerá um quadro com o seguinte menu:
4. Selecionar a opção “Nucleic Acid”. Aparecerão então os seguintes quadros:
7 Lab6 5. Carregar o pedestal de amostras com 1,5 L de água DEPC.
6. Baixar o braço de amostras (“Sampling Arm”, figura acima). Clicar em “OK” (figura
abaixo).
7. Surgirá a seguinte página:
8. Abrir a chave onde se lê “DNA” com o fundo verde (figura acima).
9. Selecionar “RNA 40”.
8 Lab6 10. Secar/limpar o pedestal de amostra (figura abaixo).
11. Carregar o pedestal de amostras com 1,5 L de água DEPC. Baixar o braço de amostras
e clicar em “Blank” para zerar o aparelho.
12. O espectrofotômetro, agora zerado, apresentará o valor 0.0 indicando que o aparelho
aceitou a água como “valor zero” de concentração de RNA.
9 Lab6 13. Secar/limpar o pedestal de amostra. Carregar o pedestal novamente com 1,5 L de água
DEPC. Baixar o braço de amostra e clicar em “Measure” para verificar o “traçado” do
espectro de absorção e o valor registrado da água. Caso o traçado ou o valor da
concentração obtida não sejam adequados, deve-se repetir todos os procedimentos a
partir do passo 11.
14. Secar/limpar o pedestal de amostra, carregá-lo com 1,5 L da amostra de RNA, baixar o
braço de amostra, identificar a amostra no campo “Sample ID” e clicar em “Measure”. A
partir daqui, todas as identificações, assim como as concentrações obtidas, serão
armazenadas.
15. Ao final de todas as quantificações, clicar em “Print Report” para imprimir o reporte dos
resultados (não esquecer de ligar a impressora). A quantificação do RNA, em ng/µl, é feita
pela leitura da absorbância das amostras nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A
pureza é determinada pela razão desses valores (A260/A280), uma vez que contaminações
proteicas irão resultar em um aumento de A280. As amostras são consideradas de boa
qualidade quando o valor da razão A260/A280 varia entre 1,9 e 2,1.
10 Lab6 16. Para finalizar o programa, clicar em “Exit”. Aparecerá uma caixa de aviso. Nesta caixa
clicar em “EXIT Esc”.
17. Carregar o pedestal de amostras com 10 L de água DEPC, aguardar alguns segundos e
então secar.
18. Desligar o estabilizador.
19. Desligar a impressora.
OBSERVAÇÃO: Nunca esquecer o braço de amostra levantado.
11 Lab6 BIOANALYZER
A. ESPECIFICAÇÕES:
1. NANO:
2. PICO:
B. PROCEDIMENTO:
1. PREPARAR O GEL-DYE MIX:
1.1. Deixar o RNA 600 Nano dye concentrate (azul) à temperatura ambiente por 30
minutos;
1.2. Nesse intervalo, ligar o termociclador e diluir as amostras, se necessário, para uma
concentração de 25-500 ng/L (faixa quantitativa, na ordem de nanograma, para a
análise de RNA total);
1.3. Depois dos 30 minutos, vortexar o RNA 600 Nano dye concentrate por 10 segundos,
dar um spin e adicionar 1 L desse corante na alíquota G (gel filtrado aliquotado, 65
L);
1.4. Vortexar a solução;
12 Lab6 1.5. Centrifugar a 13.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente;
1.6. Nesse intervalo, limpar o equipamento: 1 minuto de RNase exterminator e 1 minuto
de água.
2. CARREGAR O GEL-DYE MIX NO CHIP:
2.1. Colocar o Chip no aparato para Chips;
2.2. Pipetar 9 L do Gel-Dye Mix no poço marcado com G;
2.3. Deixar o êmbolo da seringa na posição de 1 mL e fechar o aparato;
2.4. Pressionar a seringa até encaixá-la no suporte;
2.5. Esperar exatamente 30 segundos e então liberar a seringa;
2.6. Esperar 5 segundos e, lentamente, voltar o êmbolo para a posição de 1 mL;
2.7. Abrir o aparato e pipetar 9 L do Gel-Dye Mix nos outros poços marcados com G;
2.8. Descartar o que sobrar do Gel-Dye Mix.
3. MARCADOR:
3.1. Pipetar 5 L do marcador M tanto no poço do Ladder quanto nos 12 poços das
amostras.
4. ADICIONAR AS AMOSTRAS E O LADDER:
4.1. Aquecer as amostras e o Ladder no termociclador a 72°C por 2 minutos;
4.2. Pipetar 1 L do ladder no poço marcado;
13 Lab6 4.3. Pipetar 1 L das amostras em cada poço para amostras. Se o número de amostras
for menor que o de poços, pipetar 1 L do marcador M nos poços restantes;
4.4. Colocar o Chip no spin próprio e vortexar a 2.400 r.p.m. por 1 minuto.
5. FAZER A CORRIDA:
5.1. Correr o Chip no BIOANALYZER (não demorar mais do que 5 minutos para iniciar a
corrida após a montagem do Chip);
5.2. Esperar o término da corrida (cerca de 30 minutos);
5.3. Imprimir o reporte com os resultados da análise e verificar se as amostras de RNA
estão com boa qualidade. A qualidade das amostras é determinada pelo valor de RIN
(RNA integrity number), que varia de a 0 a 10. Quanto maior o valor deste parâmetro,
maior a integridade e menor a degradação das moléculas de RNA na amostra.
5.4. Finalizada a corrida, colocar o Chip de água para limpar o aparelho.
14 Lab6 AULA 3: TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-PCR)
A. EQUIPAMENTOS:







Agitador de tubos do tipo VORTEX.
Microcentrífuga refrigerada.
Termociclador.
Isopor com gelo picado.
Pipetas automáticas de volume variável (P-2 e P-20).
Ponteiras estéreis, RNase e DNase free, com filtro.
Tubos EPPENDORF, estéreis e RNase e DNase free (0,2 mL).
B. REAGENTES:
 Kit SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix:
o SuperScript III/RNaseOUT™ Enzyme Mix (contém a transcriptase reversa e um
inibidor de RNase).
o 2X First-Strand Reaction Mix (contém 10 mM de MgCl2 e 1 mM de cada dNTP).
o Annealing Buffer (tampão de anelamento).
o Oligo(dT)20 (50 M) (iniciador).
o Água tratada com DEPC.
C. PROCEDIMENTO:
1. CÁLCULO DOS VOLUMES DAS AMOSTRAS DE RNA QUE SERÃO UTILIZADOS
PARA A TRANSCRIÇÃO REVERSA:
1.1. A partir dos resultados das quantificações no NANODROP®, elaborar uma tabela
para o cálculo da quantidade total de RNA, em nanogramas, contida em cada uma
das amostras. Este número é obtido multiplicando-se o valor da concentração da
amostra (ng/µl) pelo seu volume inicial (100 µl subtraídos dos volumes retirados para
a quantificação e testes de qualidade). Opcionalmente, pode-se ajustar o volume das
amostras pela adição de volumes variáveis de água DEPC, de acordo com suas
quantidades de RNA total, de modo a que todas tenham a mesma concentração, ou
seja, concentração igual à da amostra menos concentrada. Este procedimento nem
sempre é utilizado, mas pode ser útil para facilitar o cálculo e unificar o volume a ser
retirado de cada amostra de RNA para a realização da síntese do cDNA.
Amostra
ng/µl
Volume
inicial
ng
total
Volume
ajustado
15 Lab6 2. LINEARIZAÇÃO DA CADEIA DE RNA (DESNATURAÇÃO):
2.1. Transferir um volume que contenha 1 g de RNA de cada amostra de RNA para
tubos EPPENDORF de 0,2 mL (mantê-los em gelo picado);
2.2. Acrescentar 1 L de Oligo(dT)20 (50 M);
2.3. Acrescentar 1 L de Annealing Buffer;
2.4. Completar o volume para 8 L com água DEPC;
2.5. Incubar os tubos no termociclador a 85°C por 3 minutos;
2.6. Transferir os tubos para o gelo picado e incubar por 1 minuto.
3. SÍNTESE DO DNA COMPLEMENTAR (cDNA):
3.1. Adicionar a cada tubo 10 L de 2X First-Strand Reaction Mix;
3.2. Adicionar a cada tubo 2 L de SuperScript III/RNaseOUT™ Enzyme Mix;
3.3. Misturar a solução gentilmente com a pipeta e dar um rápido spin;
3.4. Colocar os tubos no termociclador e realizar o seguinte programa de incubação:




25°C por 7 minutos
50°C por 50 minutos
85°C por 5 minutos
4°C por tempo indefinido
3.5. Armazenar as amostras de cDNA em freezer a –20°C ou utilizá-las imediatamente
para amplificação (PCR).
AULA 4: AMPLIFICAÇÃO DO cDNA (PCR)
A. EQUIPAMENTOS:







Agitador de tubos do tipo VORTEX.
Microcentrífuga.
Termociclador.
Isopor com gelo picado.
Pipetas automáticas de volume variável (P-2 e P-20).
Ponteiras estéreis, RNase e DNase free, com filtro.
Tubos EPPENDORF, estéreis e RNase e DNase free (0,2 mL e 1,5 mL).
B. REAGENTES:






5X Colorless Go Taq Reaction Buffer (contém 7,5 mM de MgCl2).
Go Taq DNA Polymerase (5 U/L).
Desoxinucleotídeos trifosfatados (dNTP’s) (10 mM).
Forward primer (10 M).
Reverse primer (10 M).
Água tratada com DEPC.
OBSERVAÇÃO: As amostras de cDNA serão amplificadas utilizando-se iniciadores
(primers) para o marcador molecular VHL produzidos pelo software Primer 3, por meio de
16 Lab6 suas sequências de RNAm obtidas no GenBank. No quadro abaixo são apresentadas
três opções de pares de iniciadores. Um desses pares será selecionado para utilização
nas reações de amplificação do cDNA.
Primer Especificidade
Exon 1
Exon 2
Exon 3
VHL
Amplicon
78 pb
Sequência
F – 5’-CGCCGCATCCACAGCTA-3’
R – 5’-GGCTTCAGACCGTGCTATCG-3’
F – 5’CAATGTTGACGGACAGCCTATTT-3’
VHL
101 pb
R – 5’GTCTATCCTGTACTTACCACAACAACC
T-3’
F – 5’-GACCTGGAGCGGCTGACA-3’
VHL
101 pb
R – 5’TACCATCAAAAGCTGAGATGAAACA-3’
pb = pares de bases; F = forward primer; R = reverse primer
C. PREPARO DOS REAGENTES:
1. SOLUÇÃO ESTOQUE DE dNTP’s:
1.1. Utilizar soluções concentradas de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) a 100
mM;
1.2. Para uma concentração final de 10 mM para cada dNTP, fazer a seguinte diluição,
em um tubo EPPENDORF estéril (1,5 mL), RNase e DNase free, com água DEPC:





250 L da solução concentrada de dATP (100 mM)
250 L da solução concentrada de dCTP (100 mM)
250 L da solução concentrada de dGTP (100 mM)
250 L da solução concentrada de dTTP (100 mM)
1,5 mL de água DEPC
1.3. Fazer 25 alíquotas de 100 L e armazenar em freezer a –20°C.
D. PROCEDIMENTO:
1. Preparar, em um tubo EPPENDORF de 1,5 mL, um mix de reação contendo, para cada
amostra de cDNA, os seguintes reagentes:






10 l de 5X Colorless Go Taq Reaction Buffer
1 l de dNTP’s (10 mM)
1 l de primer F (10 M)
1 l de primer R (10 M)
0,25 l de Taq DNA polimerase
35,75 l de água DEPC (para completar 49 l)
OBSERVAÇÃO: Os volumes indicados são para uma reação. Os volumes exatos
para cada reagente são obtidos multiplicando-se os valores acima pelo número de
17 Lab6 amostras de cDNA que serão amplificadas mais a reação de controle negativo
(“branco”, reação em que 1 l de água DEPC é colocado no lugar de 1 l de cDNA).
Uma reação de controle positivo, utilizando primers para um gene de expressão
constitutiva (housekeeping gene), também deve ser realizada. Neste experimento,
será utilizado o gene da tubulina, uma proteína do citoesqueleto. Recomenda-se
desenhar em um papel um mapa da placa de PCR, descrevendo a sequência e a
disposição das amostras e controles, de modo a evitar dúvidas caso a marcação dos
tubos se apague.
2. Pipetar em um tubo EPPENDORF de 0,2 mL, 49 l da mistura de reação;
3. Adicionar 1 l da amostra de cDNA (50 l de volume final) e misturar as soluções
gentilmente com a pipeta. Fazer isto com todas as amostras;
4. Incubar os tubos no termociclador a 95°C por 5 minutos, para a desnaturação inicial;
5. Realizar 35 ciclos de amplificação nas seguintes condições:
 95°C por 30 segundos, para a desnaturação
 60°C por 30 segundos, para o anelamento dos iniciadores
 72°C por 40 segundos, para a extensão
5.1. Finalizar a extensão, após o último ciclo, a 72°C por 7 minutos e deixar as amostras a
4°C por tempo indefinido;
5.2. Armazenar as amostras em freezer a –20°C.
AULA 5: ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
A. EQUIPAMENTOS:









Balança semi-analítica.
Forno de microondas.
Cuba de eletroforese e acessórios.
Fonte de corrente elétrica contínua.
Transiluminador com lâmpadas de UV (1).
Béquer (100 mL).
Espátula de aço inoxidável.
Pipetas automáticas de volume variável (P-2, P-20 e P-200).
Ponteiras estéreis e livres de DNases.
(1) A exposição direta ao UV pode causar câncer de pele e queimaduras na córnea.
B. REAGENTES:
 Agarose.
18 Lab6  Tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) 1X (40 mM Tris, 20 mM acetato, 1 mM EDTA; pH 8,0).
(2)
 Solução de brometo de etídeo (10 mg/mL). (3)
 Loading buffer 6X (Thermo Scientific™ 6X DNA Loading Dye).
 DNA ladder (100 ng/L) (Thermo Scientific™ GeneRuler DNA Ladder Mix).
(2) Irritante.
(3) Carcinogênico e potencialmente mutagênico. Dever ser manipulado em capela e
com equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
C. PREPARO DOS REAGENTES:
1. SOLUÇÃO DE EDTA (ÁCIDO ETILENODIAMINO TETRACÉTICO; 0,5 M; pH 8,0)
1.1. Adicionar 186,1 g de Na2EDTA.2H2O a 700 mL de água deionizada;
1.2. Agitar vigorosamente;
1.3. Ajustar o pH para 8,0 com hidróxido de sódio (~20 g ou ~50 mL de solução NaOH 10
M);
1.4. Completar com água deionizada para 1 L;
1.5. Esterilizar por autoclavagem.
OBSERVAÇÃO: O sal dissódico do EDTA é de difícil dissolução e não irá permanecer
em solução até que o pH seja ajustado a aproximadamente 8,0, pela adição de NaOH.
2. TAMPÃO TAE 50X (SOLUÇÃO DE ESTOQUE):
2.1. Dissolver 242 g de Tris Base (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol) em 500 mL de
água deionizada;
2.2. Adicionar 57,1 mL de ácido acético glacial;
2.3. Adicionar 100 mL da solução de EDTA (0,5 M; pH 8,0);
2.4. Completar com água deionizada para 1 L.
3. TAMPÃO TAE 1X (SOLUÇÃO DE TRABALHO):
3.1. Medir, em uma proveta, 5 mL de tampão TAE 50X;
3.2. Transferir o conteúdo para outra proveta, de 250 mL;
3.3. Completar o volume para 250 mL com água deionizada.
OBSERVAÇÃO: O pH dos tampões com Tris varia significativamente com a temperatura,
caindo cerca de 0,028 unidade para cada 1°C de elevação. O pH das soluções tamponadas
com Tris deve ser ajustado, portanto, na mesma temperatura em que estas serão usadas.
Como o pK do Tris é 8,08, o tampão não deve ser usado em pH abaixo de 7,2 e nem acima
de 9,0.
4. SOLUÇÃO DE BROMETO DE ETÍDEO (10 mg/mL):
4.1. Pesar 100 mg de brometo de etídeo e transferir para um tubo FALCON™ de 15 mL;
19 Lab6 4.2. Adicionar 10 mL de água deionizada e homogeneizar em agitador orbital ou
basculante até a completa dissolução do brometo de etídeo (2 a 4 dias).
D. PROCEDIMENTO:
1. PREPARO DO GEL DE AGAROSE (1,5%):
1.1. Tarar um béquer de 100 mL na balança semi-analítica e pesar, com o auxílio de uma
espátula, 0,45 g de agarose.
1.2. Acrescentar ao béquer 30 mL de tampão TAE 1X.
1.3. Levar o béquer com a agarose e o tampão ao forno de micro-ondas, regulado na
intensidade máxima;
1.4. Interromper o aquecimento de tempos em tempos para misturar o conteúdo com uma
espátula de aço inoxidável;
1.5. Desligar o forno e verificar se houve a total solubilização da agarose.
1.6. Se ainda existirem pequenos grumos, aquecer novamente a solução de agarose e
manter a homogeneização (caso haja evaporação excessiva, repor o volume perdido
completando-o com água deionizada);
1.7. Resfriar a solução até ±70°C ou até quando já for possível segurar o béquer com as
mãos;
1.8. Misturar à agarose, ainda liquefeita, 1,5 L de solução de brometo de etídeo (10
mg/mL);
1.9. Verter a agarose liquefeita no suporte para gel, previamente montado, colocar o
pente desejado e aguardar a polimerização;
OBSERVAÇÃO: Evitar a inalação dos vapores desprendidos após a adição do
brometo de etídeo. Os vapores contendo brometo de etídeo são carcinogênicos e
potencialmente mutagênicos.
1.10.
Estando o gel polimerizado, retirar as cunhas de contenção da cuba de
eletroforese (cunhas pretas de alumínio), cobrir o gel com tampão TAE 1X e remover
cuidadosamente o pente.
2. PREPARO E APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE AMPLIFICADO:
2.1. Transferir 4 L de loading buffer 6X para um tubo EPPENDORF de 0,2 mL ou para
um poço de placa de ELISA com fundo em “U”;
2.2. Transferir 20 L do amplificado de PCR para o mesmo tubo ou poço, e
homogeneizar por meio de diversas pipetagens;
2.3. Transferir a mistura para o poço do gel, dispensando lentamente a amostra que, por
possuir densidade maior que o TAE 1X, irá se deslocar para o fundo do orifício;
20 Lab6 2.4. Aplicar no gel, em um dos poços laterais, um marcador de tamanho molecular (DNA
ladder), que deve ser preparado do mesmo modo que as amostras.
3. CORRIDA ELETROFORÉTICA:
3.1. Baixar a tampa do suporte externo da cuba de eletroforese, sem chacoalhar, e
conectar os cabos de condução elétrica: o cabo negro (pólo negativo) deve ser
conectado à tomada negra da cuba e da fonte de corrente elétrica contínua; o cabo
vermelho (pólo positivo) deve ser conectado à tomada vermelha da cuba e da fonte.
Ter atenção para não inverter as polaridades;
3.2. Ligar a fonte e selecionar a voltagem/amperagem necessária: maior
voltagem/amperagem para maior velocidade ou menor voltagem/amperagem para
menor velocidade. Utilizar entre 80 e 100 volts;
3.3. Observar a migração do loading buffer e interromper a corrente elétrica quando o
corante (azul de bromofenol) tiver percorrido cerca de 2/3 a 3/4 da extensão do gel.
21 Lab6 OBSERVAÇÃO: O loading buffer migra ligeiramente mais rápido que o DNA e um pouco
mais lento que as sobras de reação. Portanto, acompanhar a migração de sua coloração
em função do tamanho do amplificado.
4. REVELAÇÃO DO GEL:
4.1. Remover o gel da cuba de eletroforese e acomodá-lo sobre o transiluminador com
lâmpadas de UV (MiniBIS Pro®);
4.2. Visualizar o DNA. Cada amplificado será visualizado como um pequeno traço
(banda) da largura do poço do gel;
M
A1 A2 A3 A4 A5
4.3. Capturar a imagem do gel e salvá-la no computador.
OBSERVAÇÃO: Ao fazer uso de lâmpadas UV, deve-se evitar irradiação desta luz sobre
a pele, face e principalmente olhos. Para tanto, utilizar máscara que cubra todo o rosto e
não somente óculos de proteção.
22 Lab6 4. QUESTÕES PARA DISCUSSÃO
A. Há diferença entre as bandas das amostras das diferentes linhagens celulares? Em quais
dessas linhagens o gene VHL é expresso? Relacione esse padrão de expressão com as
características de cada linhagem.
B. Qual o tamanho, em pares de bases, dos fragmentos de DNA representados pelas
bandas das amostras? O tamanho desses fragmentos corresponde àquele previsto para
os amplicons no quadro que descreve os primers para VHL?
C. Quantas bandas apareceram para cada uma das amostras? Se mais de uma, qual o
tamanho (em pares de bases) e a intensidade de cada uma delas? Quais seriam as
possíveis explicações para a presença de bandas extras para uma mesma amostra?
D. É possível fazer inferências a respeito da qualidade das amostras de DNA, e sobre
eventuais contaminações, a partir do padrão de bandas no gel? Justifique sua resposta.
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2002;94(20):1569-75. 24 Lab7 7. Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias Patogênicas
Responsável: Profa. Dra. Regina Lucia Baldini
Monitor: Gilberto Hideo Kaihami
1. Pseudomonasaeruginosa
Pseudomonasaeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama que habita a água e o
solo, sendo encontrada em associação com plantas e animais, comportando-se como um
patógeno oportunista. A capacidade de metabolizar fontes alternativas de carbono e
nitrogênio e de crescer tanto aeróbica quanto anaerobicamente permite que esta bactéria
cresça em diversos ambientes e se adapte a diferentes nichos, refletindo seu vasto
repertório genético. Em humanos, P. aeruginosa é frequentemente associada a infecções
oportunistas em pacientes sob quimioterapia, portadores de AIDS, de fibrose cística, ou com
queimaduras graves, sendo responsável também por infecções respiratórias,
gastrointestinais e do trato urinário, além de ceratite, otite média e bacteremia [1, 2].
As infecções por P. aeruginosa são geralmente de difícil tratamento utilizando-se de
antibioticoterapias convencionais, pois esta bactéria é intrinsecamente resistente a muitos
desses fármacos, principalmente pela presença de diversas bombas de membrana e à
aquisição de mecanismos de resistência a antibióticos [1, 3-9]. A persistência de formas
tolerantes a antibióticos também contribui para sua difícil erradicação [10].
Recentemente, tem se buscado por novas drogas anti-infectivas, em contraponto a
drogas bactericidas e bacteriostáticas, supondo-se que essas drogas não causem uma
pressão seletiva que leve à aquisição de resistência do patógeno e tendo como alvo a
inibição de fatores envolvidos com sua virulência, ao invés da sobrevivência [9, 11]. Para
que essa busca tenha sucesso e novas drogas contra alvos específicos possam ser
planejadas racionalmente, os mecanismos de patogenicidade precisam ser entendidos em
detalhes. Assim, torna-se cada vez mais relevante a busca por estratégias alternativas de
tratamento contra P. aeruginosa, com interesse crescente de vários grupos de pesquisa,
tanto básica quanto aplicada, na compreensão de seus mecanismos de adaptação e de
patogenicidade.
2. Sistemas de dois componentes
Sistemas de dois componentes são cascatas de sinalização prevalentes em bactérias,
constituindo uma forma de transdução de sinal eficiente para a percepção e a resposta
adequada a alterações no meio ambiente. Além das bactérias, esses sistemas estão
presentes também em plantas e em microrganismos dos domínios Archaea e Eucarya,
porém não há descrições desses sistemas em mamíferos/animais[12], o que os torna um
possível alvo para o desenvolvimento de anti-infectivos.
O protótipo de sistemas de dois componentes encontrados em bactérias é
caracterizado pela presença de uma proteína sensora, capaz de se autofosforilar em um
resíduo de histidina conservado, em resposta a um estímulo. Essa proteína fosforilada
transfere o grupo fosforila para um resíduo de aspartato conservado no domínio REC do
regulador de resposta (RR) (Figura 1). A fosforilação e a desfosforilação do RR, por sua
vez, muda a conformação desta proteína, frequentemente modulando sua atividade [13].
Alguns reguladores de resposta ligam-se ao DNA atuando como ativadores ou inibidores da
transcrição [14], existem também outros domínios que podem estar associados aos
domínios REC.
Existem variações desse protótipo, sendo a mais comum chamada de fosforelê
(Figura 1). Neste sistema, a proteína sensora híbrida contêm tanto o domínio sensor como
um domínio REC. Nestes casos, há a necessidade da participação de intermediária um
1 Lab7 módulo Hpt (histidine-containing phosphotransfer), que é capaz de transferir o grupo fosforila
entre o aspartato da proteína sensora para o aspartato do RR. O módulo Hpt pode constituir
um domínio da proteína sensora ou funcionar como uma proteína independente, como no
exemplo mostrado na Figura 1. Na ausência de sinal, a proteína sensora pode funcionar
como uma fosfatase do RR, aumentando o nível de controle do sistema.
Figura 1. Sistemas de dois componentes canônicos (A) e de fosforelê (B).
Em resposta a um sinal, a histidina quinasesensora é auto-fosforilada. Este grupo
fosforila é então transferido a um cognato regulador de resposta (A). Após a autofosforilação
da histidina quinase hibrida, o grupo fosforila é transferido intramolecularmente a um
domínio REC, este então transfere fosforila a uma Hpt (histidinephosphotransfer), que pode
fosforilar a um regulador de resposta (B).
Como os sistemas de dois componentes estão ausentes em humanos, eles são um
interessante alvo para o desenvolvimento de novos fármacos. Para tal, a compreensão dos
mecanismos de regulação desses sistemas, bem como os fatores de virulência que eles
regulam e como essa regulação ocorre em nível molecular são de fundamental importância
para que uma nova droga seja desenvolvida racionalmente. Portanto, neste curso de verão
iremos estudar as proteínas que o regulador de resposta PA14_26570, que foi
correlacionado envolvido na virulência por nosso grupo, pode estar regulando. Para tal, será
utilizada uma estratégia proteômica descrita abaixo.
3. Proteômica
A proteômica consiste no mapeamento de todas as proteínas, expressas e suas
modificações pós-translacionais em um determinado momento. Ela pode ser empregada em
células, tecidos, órgãos ou fluídos biológicos, sejam eles patológicos ou fisiológicos. Estudos
de proteômica só são possíveis hoje devido ao desenvolvimento de novas técnicas para o
estudo de bioquímica de proteínas que acompanharam a era pós-genômica. A proteômica
utiliza várias técnicas; géis bidimensionais, cromatografia líquida e espectrometria de massa,
que em conjunto são capazes de separar e identificar múltiplas proteínas e suas
modificações pós-translacionais (pós-traducionais)[15].
Géis bidimensionais ou géis 2-D, foram descritos, inicialmente, em 1975 por O'Farrell.
Estes géis permitem uma melhor separação das proteínas, pois as proteínas são separadas
por dois critérios. Na primeira dimensão as proteínas são separadas pela diferença de carga
elétrica, já na segunda dimensão elas são separadas por sua massa relativa [16].
A primeira dimensão do gel 2-D consiste na focalização isoelétrica (FIE) de cada
proteína, onde a mistura proteica é aplicada a um gel contendo um gradiente imobilizado de
anfóteros e submetido a altas voltagens. Este gradiente é crítico para a separação das
proteínas, pois estas irão migrar neste gradiente impulsionadas por suas cargas elétricas até
encontrarem uma região de pH que se equipare com seu ponto isoelétrico (pI), onde deixam
de se movimentar pelo gel.
2 Lab7 A tecnologia de géis 2-D só pôde ser desenvolvida como a conhecemos hoje devido a
uma característica peculiar dos aminoácidos que formam as proteínas. Os aminoácidos são
moléculas anfotéricas, ou seja, capazes de se comportar como receptores e doadores de
prótons, reagindo mediante o pH do meio. Assim, todos os aminoácidos possuem cargas
elétricas finais que variam de acordo com o pH do meio onde estão solúveis. Cada
aminoácido possui um determinado ponto isoelétrico (pI) característico, que consiste em um
valor de pH onde a carga final do aminoácido é zero ou neutra. Para valores de pH menores
que o pI do aminoácido, este encontrará se com carga positiva, e o inverso é verdadeiro,
para valores de pH acima do pI a carga final será negativa. Desta forma é correto dizer que
a carga final ou o pI de uma proteína consiste no somatório total de todas as cargas de seus
aminoácido. Cada proteína possui um pI específico e único e esta é a principal característica
utilizada na primeira dimensão de um gel 2-D para a separação de misturas proteicas
complexas (Figura 2).
Figura 2: A carga da proteína versus a variação do pH. O ponto de interseção da curva na abscissa representa
o ponto isoelétrico da proteína. (Adaptado 2-D Electrophoresis; Handbooks from GE Healthcare)[17].
Para que a FIE seja feita corretamente é necessário que as proteínas se encontrem
em estados conformacionais homogêneos, sem estarem agregadas. Para isso são utilizados
agentes caotrópicos que causam a ruptura de complexos moleculares e desfazem ligações
tipo ponte de hidrogênio, Van der Waals e interações hidrofóbicas; para tanto se utilizam
detergentes não-iônicos, como o triton X-100, ou zwitterionicos, como por exemplo o
CHAPS, (Figura 3), que solubilizam as proteínas e desfazem interações hidrofóbicas sem
interferir com suas cargas finais; e agentes redutores para a quebra de pontes dissulfetos.
Após a FIE das proteínas na primeira dimensão, as proteínas são novamente
reduzidas, pela ação de agentes redutores como DTT ou análogos, e os grupamentos tióis
expostos são alquilados para evitar a reoxidação. As proteínas são desnaturadas pela ação
de detergentes iônicos e corre-se a segunda dimensão aonde as proteínas antes separadas
por carga, agora são separadas pelo seu peso molecular [17].
A segunda dimensão de um gel 2-D consiste na separação das proteínas por seu
peso molecular relativo em um gel de SDS-PAGE (do inglês: sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis). O SDS é um detergente aniônico, que forma micelas
globulares em meio aquoso. Estas micelas são capazes de interagir com proteínas criando
uma estrutura tipo cordão (necklace-like) na proporção de 1:1.4 proteína/SDS, mascarando,
desta forma, a carga total da proteína e conferindo-lhe uma carga negativa igual por unidade
de massa. A resolução da separação das proteínas na segunda dimensão irá depender do
tamanho do gel e da malha formada pela poliacrilamida polimerizada. Uma vez aplicadas em
um gel SDS-PAGE, as proteínas irão migrar do polo negativo para o positivo apenas por sua
massa ou peso relativo quando aplicamos uma voltagem, esta migração é chamada
mobilidade eletroforética.[17].
Ao final do gel 2-D, com a separação promovida pela primeira e segunda dimensão, o
passo seguinte consiste da forma mais adequada para a detecção das proteínas que
aparecem como pontos ou spots. (Figura4). A detecção é feita corando-se o gel utilizando
reagentes de acordo com o objetivo desejado. Atualmente, existem vários métodos de
coloração/ revelação que podem ou não ser compatíveis com os passos seguintes das
3 Lab7 técnicas de proteômica, como por exemplo, a espectrometria de massa. Alguns métodos são
mais sensíveis que outros, permitindo uma visualização melhor, ou mais específica, de um
número maior de spots de proteínas.
Figura 3: Detergente não-iônico (A), não apresenta carga liquida porém apresenta uma parte polar, como o
Triton X-100. Detergente zwitterionico (B), que apresenta carga líquida zero, porém apresenta pelo menos dois
grupos ionizáveis, um positivo e outro negativo resultando em uma molécula eletricamente neutra, como por
exemplo, o CHAPS e os aminoácidos.
Figura 4: Coloração com Comasie Blue Coloidal de um gel bi-dimensional aonde as proteínas foram separadas
na primeira dimensão pelo seu ponto isoelétrico e na segunda dimensão pelo seu peso molecular.
Existem alguns métodos para a detecção das proteínas fosforiladas. A adição de
fosfato altera o PI das proteínas as tornando mais ácidas desta forma após a fosforilação
num gel bi-dimensional a proteína corre mais perto da faixa de pH ácido. Existem ainda
corantes fluorescentes que coram especificamente proteínas fosforiladas. Podemos ainda
detectar proteínas fosforiladas pela técnica de Western blot utilizando-se anticorpos para
resíduos fosforilados. Neste caso os géis são transferidos para uma membrana de
nitrocelulose e as proteínas fosforiladas detectadas utilizando-se anticorpos anti-fosfoserina,
treonina e tirosina (Figura 5).
4 Lab7 Figura 5: Detecção de proteínas em géis 2D. A esquerda coloração de proteínas totais pelo método de
Coomassie blue e a direita proteínas fosforiladas detectadas por Western blot com anticorpos anti-fosfoserina/
treonina.
4. Preparação de lisados para géis bidimensionais (extração de proteína):
Alguns pontos importantes devem ser considerados quando se deseja utilizar a
metodologia de 2-D. O primeiro ponto é a origem do material a ser analisado e a forma como
será feito a extração proteica. Geralmente o material proveniente de cultura de células é
tratado de forma completamente diferente de um material oriundo de fluidos corpóreos.
Baseando-se em alguns trabalhos já publicados, cada pesquisador deverá adequar os
protocolos de acordo com as suas necessidades. Entretanto, alguns cuidados são universais
em todos os tipos de preparações, entre eles encontram-se a total ruptura de agregados
proteicos, a retirada de sais, lipídeos, polissacarídeos e ácidos nucleicos, que podem
interferir no FIE e causar “estriamento” dos spots.
5. Extração de proteínas totais bacterianas (P.aeruginosa):
Para a obtenção dos extratos proteicos totais, culturas bacterianas serão crescidas até
DO600nm=1, as células serão lavadas duas vezes com Tris-HCl pH 8 (primeiramente 100mM
e depois 10mM) e suspensas em um tampão de lise (8M ureia, 2M tioureia, 2% CHAPS[3[(3- colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano sulfonato], 40mM DTT [Ditiotreitol] e 2%
pharmalyte 3-10). A ruptura das células será realizada por sonicação em banho de gelo, no
Branson-Sonifier 450 e o lisado centrifugado 40 minutos a 12000 g a 4ºC por duas vezes,
para separar a fração solúvel dos restos celulares. A determinação da concentração proteica
será realizada através do método de Bradford, utilizando uma curva-padrão construída com
soluções de albumina.
6. Géis Bidimensionais:
O sistema IPGphor 3 para Géis bidimensionais (GE) será utilizado nesta etapa. As
amostras serão inicialmente separadas por seu PI por focalização isoelétronica (FIE) na
primeira dimensão e em seguida por peso molecular em gel SDS-PAGE. Os protocolos
utilizados são os considerados padrões seguindo as instruções do fabricante (GE) [17].
6.1. Reidratação
Algumas proteínas, principalmente as de caráter mais básico, possuem maior dificuldade
para se focalizarem no FIE e de passarem da primeira para a segunda dimensão. É
importante determinar qual é a melhor forma de carregar as proteínas nos géis da primeira
5 Lab7 dimensão. Em geral as proteínas são bem adsorvidas pelo método de reidratação. Porém
dependendo das características do lisado (proteínas mais ácidas ou básicas) para obter uma
melhor resolução dos spots podemos carregar as proteínas pelos eletrodos (anôdo ou
catôdo).
Volume
total por
fita
Quantidade de amostra
Immobiline DryStrip gel
adequada (μg de proteína)
Tamanho
Silver
(cm)
(pH)
(μl)
stain
Coomassiestain
3–11 NL, 3–10 NL, 3–10
3–6
30–60
4–7
4–8
25–150
7
125
3–5.6 NL, 5.3–6.5, 6.2–7.5, 6–
11, 7–11 N
8–16
40–240
3–11 NL, 3–10
7–15
50–120
4–7
10–20
50–300
11
200
6–11, 3–5.6 NL, 5.3–6.5,6.2–
7.5, 7 –11 NL
20–40
100–600
3–11 NL, 3–10 NL, 3–10
10–20
50–240
4–7
15–30
75–450
13
250
6–11 narrow and medium
intervals†
30–60
150–900
3–11 NL, 3–10 NL, 3–10
20–40
100–500
4–7
30–60
150–900
18
340
6–11, 6–9, narrow and medium
intervals§
60–120
300–1500
3–11NL, 3–10 NL, 3–10
30–60
200–600
4–7, 3–7 NL
45–90
200–1300
24
450
6–9, narrow and medium
intervals§
80–170
400–2000
† ImmobilineDryStrip gels, Intervalo de pH: 3–5.6 NL,5.3–6.5, 6.2–7.5, and 7–11 NL.
§ ImmobilineDryStrip gels, Intervalo de pH: 3–5.6 NL, 5.3–6.5, 6.2–7.5, 7–11 NL,
3.5–4.5, 4.0–5.0, 4.5–5.5, 5.0–6.0, and 5.5–6.7.
Os lisados proteicos serão carregados por reidratação, conforme demonstrado na figura 5.
As proteínas terão o volume ajustado em uma solução tampão de solubilizacão (8M ureia,
2M tioureia, 2% CHAPS, 40mM DTT, 2% pharmalyte 3-10 e 10% glicerol) e serão
carregadas em fitas de focalização isoelétrica de acordo com a tabela dependendo da
separação a ser realizada.
6.2. Eletrofocalização
A eletrofocalização será realizada utilizando o sistema EttanIPGphor III. Esse sistema
utiliza tensões muito elevadas (até 10 000 V, dependendo do tamanho da fita utilizado) e
corrente muito baixa (tipicamente inferior a 50 µA por fita), devido à baixa força iônica dentro
ImmobilineDryStrip géis. Durante a FIE, a intensidade da corrente diminui, enquanto a
tensão (diferença de potencial) aumenta à medida que as proteínas e outros componentes
carregados migram para as suas posições de equilíbrio. Um típico protocolo FIE geralmente
decorre através de uma série de passos de tensão, que se inicia com um valor relativamente
baixo. A tensão vai aumentando gradualmente até a focalização final desejada, que é
realizada durante várias horas. A baixa tensão inicial minimiza agregação e permite a
6 Lab7 separação da amostra paralela e com diferentes concentrações de sal. O gradual aumento
da tensão é aconselhável para cargas mais elevadas de proteína (100 ug ou mais por gel
ImmobilineDryStrip). Muitos fatores afetam a quantidade de tempo necessário para a
focalização por completo(composição da amostra e da solução de reidratação, tamanho e
gradiente de pH da fita) com isso, uma otimização (empírica)é requerida para obtenção de
bons resultados. Íons residuais, que migrarão para as extremidades das fitas antes da
focalização das proteínas, e a presença do tampão IPG ou Pharmalyte, que contribuem para
a força iônica do meio de eletroforese, são fatores que aumentam o tempo de focalização
necessário. Uma alta concentração de tampão de IPG aumenta a condutividade da fita,
resultando em uma voltagem final inferior quando o sistema está limitado pela configuração
máxima de corrente.
Figura 6: Etapas ilustrativas da processo de rehidratação e eletrofocalização (Adaptado 2-D Electrophoresis;
Handbooksfrom GE Healthcare)[17].
6.3. Segunda Dimensão (Gel SDS-PAGE):
Ao final da focalização isoelétrica, a fita será equilibrada e transferida para um gel SDSPAGE onde irá ocorrer a segunda dimensão de separação. O equilíbrio da fita de FIE é feito
em duas etapas de 15 minutos cada. Na primeira, a fita é imersa em solução Tampão de
Equilíbrio SDS (Quadro1) contendo DTT (100 mg por 10 ml) para que ocorra a redução das
pontes disulfeto. Enquanto que, na segunda etapa, a fita é imersa na mesma solução
contendo desta vez Iodoacetamida (250 mg por 10 ml) para que ocorra a alquilação de
cisteínas impedindo a reformação das pontes dissulfeto.
7 Lab7 6.4. Detecção e análise das Proteínas diferencialmente expressas:
Os géis bidimensionais realizados em triplicatas serão corados com uma solução de
Coomassie blue G250 (Candiano et al., 2004) e digitalizados com auxílio do programa
LabScan 6.0 (GE Healthcare) no ImageScanner 3 (GE Healthcare). Para a análise das
imagens, será adotado o programa Delta 2D 4.2 (Decodon). Diferenças na expressão
proteica, serão consideradas por alterações de volume normalizado dos spots com 5% de
significância no teste estatístico de ANOVA (analysis of variance) ou t Test. Os spots que
apresentarem alteração de volume; ou seja; diferente grau de expressão, serão excisados
do gel, digeridos e sequenciados por espectrometria de massas (apêndice 2) para a sua
identificação.
Solução de Coomassie Coloidal (Candiano, 2004)
0,1% Coomassie Brilliant Blue G250
2% Ácido Fosfórico
10% Sulfato de Amônio
20% Metanol
Protocolos:
Soluções:
1)
2)
3)
4)
5)
Caldo LB: 10g/L triptona, 5g/L NaCl, 10 g/L Extrato de levedura
100 mM Tris-HClpH 8
10 mM Tris-HClpH 8
Reagente de Bradford
Tampão de Lise:8M ureia, 2M tioureia, 2% CHAPS[3-[(3- colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfonato], 40mM DTT [Ditiotreitol] e 2% pharmalyte 3-10
6) 8M ureia, 2M tioureia, 2% CHAPS, 40mM DTT, 2% pharmalyte 3-10 e 10% glicerol,
inibidor de proteases Complete® (ROCHE)
7) Solução de 1mg/mL BSA
Procedimento 1:Crescimento das bactérias
1-) No dia anterior fazer um pré-inoculo da bactéria em meio LB
2-) No dia seguinte diluir a bactéria a DO600nm 0,1 em 25mL de meio LB (Erlenmeyer de 125
mL).
3-) Após 2 horas de crescimento (DO600nm ~1), coletar as bactérias por centrifugação ( 6000
rpm, 15 minutos a 4ºC).
4-) Descartar o sobrenadante
5-) Adicionar ao pellet 25mL de 100 mM Tris-HCl pH 8
6-) Centrifugar 6000 rpm, 15 minutos a 4ºC
7-) Descartar o sobrenadante
8-)Adicionar ao pellet 25mL de 10 mM Tris-HCl pH 8
9-) Centrifugar 6000 rpm, 15 minutos a 4ºC
10-) Descartar o sobrenadante
11-) Armazenar o pellet a -80ºC, ou utilizar para as próximas etapas
Procedimento 2: Lise das células por sonicação
1-) Suspender o pellet em 350µL da Solução de Lise
8 Lab7 2-) Transferir o material a um microtubo de 1,5mL
3-) Sonicar a amostra em banho de gelo, 2 ciclos de 15 segundos
4-) Centrifugar a amostra 16000 x g por 30 min
5-) Transferir o sobrenadante com cuidado para não pegar o pellet a um novo microtubo de
1,5mL
6-) Centrifugar a amostra 16000 x g por 30 min
7-) Transferir o sobrenadante com cuidado para não pegar o pellet a um novo microtubo de
1,5mL
8-) Manter a amostra a -80ºC, ou utilizar para as próximas etapas
Procedimento 3: Quantificação das proteínas totais
1-) Diluir seriadamente o BSA (bovine serum albumin) para a curva padrão
2-) Diluir a amostra 10x e 20x em H2O
3-) Adicionar 5µL da amostra ou da curva padrão em triplicata técnica na microplaca de 96
poços
4-)Adicionar 250µL de Reagente de Bradford em cada poço que contenha amostra
5-) Incubar 5 minutos a temperatura ambiente sob rotação
6-) Ler em leitor de microplaca utilizando o comprimento de onda de 595nm
7-) Fazer o gráfico com a equação da reta no Excel
8-) Utilizar a equação da reta para quantificar as amostras obtidas anteriormente
Procedimento 4: Reidratação da fitas (7cm NL 4-10) para focalização isoelétrica (1º
Dimensão)
1-) Adicionar 125µg/mL de proteínas totais e completar o volume para 125mL com solução
de solubilização
2-) Manter sob agitação constante por 15 minutos
3-) Centrifugar as amostras a 16000 x g 10 min a 18ºC
4-) Adicionar gentilmente ao longo do suporte de reidratação a solução
5-) Colocar suavemente a fita de pH imobilizado sob a solução mantendo homogênea a sua
distribuição
Obs: Não pode haver bolhas na fita no momento da reidratação
6-) Para a FIE utilizar os parâmetros descritos na seção 6.1.
Procedimento 5: Gel de SDS-PAGE (2º Dimensão)
1-) Montar as placas com espaçador
2-) Preparar o gel de resolução 12% (Tabela 1).
3-) Aplicar o gel de resolução no aparato até o nível desejado (no mínimo 0,5cm abaixo do
pente).
4-) Aplicar butanol (80%) para nivelar o gel.
5-) Após polimerização, retirar o álcool, lavar bem o gel e secar com papel.
6-) Equilibrar as fitas em solução de equilíbrio com DTT
7-) Descartar a solução
8-) Equilibrar as fitas em solução de equilíbrio com IAA
9-) Aplicar as fitas e selá-lo com solução de agarose 8%.
10-) Montar o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida.
11-) O tampão de corrida na parte inferior da cuba deve estar concentrado 1X. Enquanto que
na porção superior da cuba, ele deve estar 2X concentrado.
12-) Realizar eletroforese (15mA/gel durante 15 minutos e em seguida a corrida deve ser
realizada a 40 mA/gel).
9 Lab7 Quadro 1.
Tabela 1 retirada do livro “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” [5]
10 Lab7 Procedimento 5: Digestão das proteínas
Obs: Todos os ácidos e solventes orgânicos devem ser manipulados com muito cuidado e
sempre no interior de capela de exaustão e descartados de acordo com as normas para
descarte de resíduos. Acetonitrila e Metanol são tóxicos e o ácido fórmico é corrosivo.
Dessa forma, devem ser manipulados com muito cuidado.
Obs: Cuidados a serem tomados para minimizar contaminações com queratina, polímeros e
outras impurezas que podem interferir na qualidade das amostras:
i)
ii)
iii)
Use luvas de nitrila: www.danny.com.br o tempo todo e lave-as, caso necessário,
para evitar contato com poeira e fios de cabelo que eventualmente podem ficar
aderidos devido à estática do material das luvas.
Utilize sempre químicos (grau MS), ponteiras e microtubos novos, graduados e
não siliconizados (Tabela 1), para evitar contaminação por polímeros na amostra
assim como para evitar ligação das proteínas de interesse no plástico. Mantenha
os tubos em locais livres de poeira e não autoclave-os. Se possível, utilize pipetas
exclusivas para tal finalidade.
Sempre verifique a limpeza dos tubos e frascos de preparo dos tampões. É
aconselhável separar a vidraria que deve ser de borosilicato (Tabela 1), se
possível. Evite o uso de detergentes poliméricos, tais como: Triton X100, SDS,
Tween, etc.. Recomendase fazer um enxágue da vidraria com metanol, antes do
uso.
Soluções:
Obs: As soluções devem ser novas (CRÍTICO), preparadas na quantidade necessária, no
dia do uso. Não devem ser estocadas. O bicarbonato de amônio é extremamente volátil.
Obs: É recomendável, preparar um volume maior de 50 mM AmBic ( Bicarbonato de
amônio) e a partir dessa solução, preparar todas as outras.
1) Solução de descoloração: 50% (v/v) de acetonitrila (ACN) (CAS# 75-05- 8, Fluka, cat#
34967) e 25 mM de bicarbonato de amônio (AmBic) (NH4HCO3, CAS# 1066-33-7, Sigma,
cat# 9830 MW= 79.06) = [0.1 g/50 mL H2O milliQ]. Essa solução pode ser feita a partir da
solução estoque de 50 mM AmBic.
Obs: Essa solução de descoloração é utilizada para o caso de spots de géis corados
com Coomassie. Géis corados com prata devem ser descorados com Acetonitrila
100%.
2) Acetonitrila (ACN) 100%.
3) Solução de redução: 20mM ditiotreitol(DTT, BioRad, cat# 161-0611, MW=154.3) = [30
mg/10 mL de solução 50 mMAmBic = [0.2 g/50 mL H2O milliQ].
4) Solução de alquilação: 55 mM de iodoacetamida (IAA, GE, cat# RPN 6302V, MW=185.0)
= [102 mg/10 mL de solução 50 mMAmBic. Obs: o IAA é sensível à luz! (CRÍTICO).
5) Solução de tripsina (PromegaTrypsin, Part No. V511): estoque de 10 ng/μL.
6) Solução bloqueadora: 5% (v:v) ácido fórmico 96% (Fluka/Sigma- Aldrich, cat# 56302)
em 50% (v:v) ACN. Para 2mL, aliquotar 1 mL de ACN 100% em um frasco de vidro, pipetar
104.16 μL de ácido fórmico (96%) e completar o volume para 2 mL, com H2O milliQ (895.84
μL).
11 Lab7 7) Solução de eluição I: 1% (v:v) ácido fórmico (96%) em 60% (v:v) metanol (Merck, cat#
1.06009.1000). Para 2mL, aliquotar 1.2 mL de metanol 100% em um frasco de vidro, pipetar
20.83 μL de ácido fórmico (96%) e completar o volume para 2 mL, com H2O milliQ (779.17
μL).
8) Solução de eluição II: 1% (v:v) ácido fórmico em 50% (v:v) ACN. Para 2mL, aliquotar 1 mL
de ACN 100% em um frasco de vidro, pipetar 20.83 μL de ácido fórmico (96%) e completar o
volume para 2 mL, com H2O milliQ (979.17 μL).
Preparo dos spots/bandas
1) Corte os spots/bandas dos géis, com auxílio de uma ponteira de 1 mL (adaptar a ponta
com auxílio de uma gilete, para o tamanho do spot) ou para o caso de bandas, utilizar uma
lâmina de bisturi pequena.
2) Pique os spots/bandas em fragmentos de aproximadamente 1 mm3 (use placas de Petri
de vidro previamente enxaguadas com metanol e água milliQ) e transfira-os para tubos
eppendorf com auxílio de uma pipeta Pasteur de vidro e água milliQ.
Descoloração dos fragmentos de gel: lave-os (3X ou mais, até a remoção completa do
corante) com solução de descoloração (200 μL/spot) e agite (vórtex). Espere 5 a10 min a
cada lavagem. Obs: alguns spots, mesmo depois de várias lavagens não descoram
(prossiga mesmo assim).Obs: Os spots de géis corados com prata devem ser
descorados com Acetonitrila 100%.
3) Remova a solução de descoloração, com auxílio de uma pipeta Pasteur de vidro e
desidrate o gel com 100% ACN (200 μL/spot), por 10 min. Dê um pulso na centrífuga, para
remoção completa da ACN. Os fragmentos de gel devem ficar bem branquinhos. Repita o
processo até desidratação completa do gel (normalmente 1X), ou seja, percebe-se que os
fragmentos de gel se soltam da parede do tubo. O resíduo remanescente do gel deve
evaporar à temperatura ambiente, em capela (15 min). Obs: Nesse ponto, caso seja
necessário, pode-se interromper o procedimento e manter as amostras a -20⁰C por 1 a
2 horas, antes de prosseguir.
4) Redução: reidrate os fragmentos de gel, pela adição de solução de redução (40 μL/spot).
Mantenha as amostras a 56⁰C, por 40 min. Obs: No caso de spots de géis corados com
prata deve-se repetir (1 X) a etapa de redução.
5) Dê um pulso na centrífuga. Descarte o sobrenadante para remoção completa da solução
de redução.
6) Desidrate o gel com 100% ACN (200 μL/spot), por 10 min. Remova a ACN. A ACN
residual remanescente deve evaporar à temperatura ambiente, em capela (15 min).
7) Alquilação: adicione a solução de alquilação (de forma a cobrir os fragmentos de gel,
40μL/spot). Incube as amostras no escuro, à temperatura ambiente, por 30 min. Obs: No
caso de spots de géis corados com prata deve-se repetir (1 X) a etapa de alquilação.
8) Dê um pulso na centrífuga. Descarte o sobrenadante e lave os spots com 25 mM AmBic
(200 μL/spot), com auxílio do vórtex, seguido de desidratação com 100% ACN (2X). Dê um
pulso na centrífuga para remoção completa da ACN. O resíduo remanescente do gel deve
evaporar à temperatura ambiente, em capela de exaustão (15 a 20 min). Obs: Nesse ponto,
caso seja necessário, pode-se interromper o procedimento e manter as amostras a 20⁰C por 1 a 2 semanas,antes de prosseguir com a digestão.
Preparo da Tripsina
Obs: A tripsina geralmente é fornecida pelo fabricante liofilizada (100 ug em 5vials de 20 μg
da (PromegaTrypsin, Part No. V511A). A quantidade de enzima deve ser ressuspendida
12 Lab7 vagarosamente (Não utilize VÓRTEX!) no tampão de ácido acético 50 mM, que vem
juntamente com a enzima.
Preparo da tripsina para digestão em gel: 20 μg de tripsina em 200 μL de 50 mM ácido
acético (Conc. Final = 100 ng/μL). Distribua alíquotas de 60 μL em “vials”- Waters Total
Recovery Vial (Waters Part No. 186000385c, 100/pkg, preslit PTFE/silicone caps).
Congele (-80⁰C) esses tubos até o momento do uso. Recomenda-se manter a tripsina
armazenada congelada em ácido acético e deve-se evitar ciclos de descongelamento.
Digestão
1) No momento do uso, o volume das alíquotas (10 μL) da solução de tripsina (100ng/μL),
que está congelada, deve ser completado para 50 μL com solução de AmBic (50 mM)
gelada. Assim, a concentração final da enzima será de 20 ng/μL em cada tubo. Essa é a
concentração de enzima que será utilizada na digestão.
2) Adicione 15μL (no mínimo) da solução de tripsina (20 ng/μL) sobre os fragmentos de géis
desidratados.
3) Deixe as amostras 15 min a 4⁰C para que a tripsina penetre nos fragmentos de gel. Retire
o excesso da solução de tripsina, caso haja.
4) Adicione 50 mM de AmBic até cobertura completa dos spots (40μL).
Incube as amostras a 37⁰C, por 14 horas.
Eluição dos peptídios
1) A ação da tripsina deve ser interrompida pela adição de 15 μL de solução bloqueadora.
Recupere o sobrenadante (= 55 μL) e transfira-o para um tubo novo. Obs: Nesse ponto,
caso seja necessário, pode-se interromper o procedimento e manter as amostras a 20⁰C por 1 semana.
2) Eluição I: adicione volume suficiente de solução de eluição I para cobrir os fragmentos de
gel remanescentes nos tubos da digestão (40 μL). Incube as amostras por 15 min a 40⁰C,
com agitação (vórtex), a cada 5 min. Repita esse passo. Recupere o sobrenadante de cada
passo e transfira-os para o mesmo tubo que contém o sobrenadante da digestão e a solução
bloqueadora (= 135 μL). Guarde os “tips” nos tubos iniciais, que contêm os fragmentos de
géis remanescentes, para utilizá-los nos próximos passos.
3) Eluição II: adicione volume suficiente de solução de eluição II para cobrir os fragmentos
de gel (40 μL). Incube as amostras por 15 min a 40⁰C, com agitação (Vortex), a cada 5 min.
Repita esse passo. Recupere o sobrenadante de cada passo e transfira-os para o mesmo
tubo que contêm os sobrenadantes resultantes da Eluição I (= 215 μL).
4) Eluição III: adicione volume suficiente (40 μL) de ACN 100% para desidratar os
fragmentos de gel. Recupere o sobrenadante e transfira-o para o mesmo tubo que contêm
os sobrenadantes da Eluição I e II. (= 295 μL). Obs: Nesse ponto, caso seja necessário,
pode-se interromper o procedimento e manter as amostras a -20⁰C por 1 a 2 semanas.
5) A solução final (~300 μL), contendo os peptídios eluídos do gel, deve ser concentrada em
concentrador a vácuo (“speedvac”), à temperatura ambiente, até 1 μL(ir acompanhando de
tempos em tempos, +/- 1min/μL). Armazenar a amostra a -20⁰C até a ressuspensão da
mesma, para análise de espectrometria de massas. Obs: Nesse ponto, as amostras
podem ficar armazenadas por 1 a 2 meses até a análise.
6) A amostra deve ser ressuspendida em 10 μL TFA 0.1% (v:v) em H2O milliQ(SigmaAldrich, cat# 299537, CAS# 76-05-1), agitada (vórtex), dessalinizada com auxílio do ZipTip
(ver protocolo site), eluída em 10 μL de 50% (v:v) ACN em H2O milliQ e transferida para
“vials”- Waters Total Recovery Vial (Waters Part No. 186000385c, 100/pkg, preslit
PTFE/silicone caps). Seque a amostra no “speedvac” caso seja necessário armazená-la (13 Lab7 80⁰C). No caso de análise por MALDI-TOF-TOF, reduza o volume da amostra eluída, com
auxílio do “speedvac” para 5μL e utilize 2μL (1+1) para aplicar na placa de MALDI-TOFTOF.
7) Já no caso da análise pelo SynaptG2, após a passagem da amostra pelo ZipTip e eluição
em 10 μL de 50% (v:v) ACN em H2O milliQ, devese secar a mesma a vácuo (“speedvac”), à
temperatura ambiente, até 1 μL(ir acompanhando de tempos em tempos, +/- 1min/μL). Após
secagem, ressuspendê-la em 13 μL de ácido fórmico 0.1% (v/v), preparado em H2O milliQ
(Fluka/Sigma-Aldrich, cat# 56302), e agitá-la(vortex). Do total de 13 μL, utilizar 3.3 μL na
injeção.
Procedimento 6:Identificação por Espectrometria de Massas em tandem.
Amostras resultantes de digestão tríptica dos spots serão purificadas (em resina de C18; tal
como ZipTip - MilliPore), e o eluato de peptídeos purificados será transferido para um novo
tubo; o qual será submetido à liofilização para descarte de solventes. O pellet será
solubilizado na solução de 0,1% de TFA; em aproximadamente 10 uL. Desta;
aproximadamente 1uL resultante será adicionado à plate de metal do equipamento MALDITOF/TOF; acrescido de Matriz HCCA (a-cyano-4-hydroxy cinnamicacid) na proporção: 2 uL
Matriz:1 uL Amostra, e será submetido à secagem em temperatura ambiente.
A proteína será identificada pela análise dos peptídeos resultantes após a digestão tríptica,
em que serão submetidos a analise em um espectrômetro de massas MALDI-TOF/TOF
(UltrafleXtreme -Bruker), utilizando como range de m/z no primeiro MS de 600 à 4000 e
MS/MS dos 6 picos de maior contagem relativa. Utilizaremos shots MS 2000 e no MS/MS
3000 shots de laser no modo positivo.
Os espectros de massas das amostras dos diferentes tratamentos serão processados
através do programa BioTools (Bruker) e analisados para a identificação proteica no
programa MASCOT MS/MS IonsSearch (http://www.matrixscience.com). Neste, utilizamos
como parâmetros para identificação:
Database: SwissProt;
Taxonomy: Mus musculus or Eubacteria;
Enzyme: Trypsin;
Fixed modification: Carbamidomethyl (C);
Variable modifications: Oxidation (M); Phosphorylation (S or T);
Peptide tol.: +- 100ppm;
MS/MS tol.: +- 0.8 Da;
Peptide charge: 1+.
14 Lab7 Fluxograma das atividades a serem desenvolvidas neste curso.
15 Lab7 Referências
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