Identificação Molecular de Mamíferos Aquáticos - CAR-SPAW-RAC

 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO – UEMA CENTRO DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – CECEN DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOLOGIA CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS NATHALI GARCIA RISTAU Identificação Molecular de Mamíferos Aquáticos provenientes de Encalhes e de Interações Antrópicas no Estado do Maranhão ‐ Brasil São Luis – MA 2012
ii NATHALI GARCIA RISTAU Identificação Molecular de Mamíferos Aquáticos provenientes de Encalhes e de Interações Antrópicas no Estado do Maranhão ‐ Brasil Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Maranhão para a obtenção do título de Licenciada em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Péricles Sena do Rêgo Co‐Orientador: PhD. Salvatore Siciliano São Luis – MA 2012
Ristau, Nathali Garcia.
Identificação Molecular de Mamíferos Aquáticos provenientes de
encalhes e de Interações Antrópicas no Estado do Maranhão - Brasil/
Nathali Garcia Ristau.– São Luis, 2012.
50 f
Monografia (Graduação) – Curso Ciências Biológicas, Universidade
Estadual do Maranhão, 2012.
Orientador: Prof.Dr.Péricles Sena do Rêgo.
1.Identificação de espécies.
4.Carcaça.
I.Título
2.Mamíferos Aquáticos.
3.mtDNA.
CDU: 639.371/.374 (812.1)
iii NATHALI GARCIA RISTAU Identificação Molecular de Mamíferos Aquáticos provenientes de Encalhes e de Interações Antrópicas no Estado do Maranhão ‐ Brasil Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Maranhão para a obtenção do título de Licenciada em Ciências Biológicas. Aprovada em 09 /02 /2012 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Péricles Sena do Rêgo Orientador ‐ UFPA Prof.ª Dr.ª Ana Lúcia Abreu UEMA Prof.ª Dr.ª Raimunda Fortes UEMA
iv A Raymundo e Iracema, meus primeiros mestres, meus maiores exemplos, “in memorian”
v AGRADECIMENTOS A Deus, por plantar essa sementinha em mim e permitir que ela germinasse, crescesse e florescesse firme e forte. A Roberto Menks, um pai de coração, que sempre com palavras doces me mostrou a direção e o caminho a seguir. Obrigada por acreditar em mim. A você, EU DEVO MUITO! À minha mãe Irene pelo apoio e paciência ao longo desses anos. A Leonardo, "mon petit prince", meu grande menino. "[...]Eu cuidarei do seu jantar, do céu e do mar e de você e de mim". Ao amigo e parceiro Fagner Magalhães por dividir além de um ofício, um sonho nas pesquisas com os mamíferos aquáticos. A Péricles Sena por me inserir no “fantástico mundo da genética e biologia molecular”, por todo ensinamento, atenção e dedicação. Por sentar ao nosso lado pacientemente nos trabalhos de bancada e mesmo nos erros ter apenas palavras de encorajamento como o tão característico "perfeito!" ...rs. Você, Péricles, além de um ser humano admirável, é o meu referencial de docência. Ao professor e pró‐reitor Walter Canales Sant’Ana, por todo apoio e incentivo nas reuniões da REMANOR, encontros de especialistas e pesquisas com os mamíferos aquáticos. Aos pesquisadores Salvatore Siciliano, Miriam Marmontel e Paulo Flores por todo ensinamento, carinho e atenção, por compartilharem comigo conteúdos e experiências essenciais à minha formação e relação com os mamíferos aquáticos. Ao querido P.A., em especial, pelo jogo do Avaí na Ressacada. “FELOMENAL”!!! Aos amigos Mariana S., Rafaela, Mariana B., Cristiano e Luis Eduardo que se tornaram irmãos pela convivência e desafios enfrentados no PROCEMA e PROMAR, pela harmonia e aprendizado ao longo desses anos. Sempre vou levar vocês e nossas histórias no meu coração, onde quer que eu vá. "Belas lembranças, doces recordações". A Rafael Meneses, pela ajuda nos trabalhos de campo, pelo companheirismo e dedicação ao longo dessa jornada. Muito obrigada! vi À grande amiga e companheira Glaucia Pereira, por todo esforço, dedicação, incentivo e apoio nos trabalhos com os mamíferos aquáticos. Obrigada por tudo, por me ajudar “desse tanto” e despender seu tempo nos trabalhos comigo. Esse trabalho é NOSSO! À Danielle Lima, amiga que descobri no primeiro olhar e aprendi a compartilhar sonhos, choros e risos. Obrigada por tudo e, principalmente, por aturar minhas falhas. Você é muito especial pra mim! Aos melhores presentes que a Universidade me deu, meus amigos queridos Raimundo (Tanga), Alex (Tuba), Edyane (Tiúba), Fabrício (Biscoito), Moisés e Juan Jethro. Aos meus pupilos queridos Luis Eduardo, Camila, Leila, Priscilla, Rayana, Bruno e Gleycka com quem dividi as mais gostosas gargalhadas e a quem torço fortemente pelo sucesso nessa caminhada. Sempre estarei aqui quando precisarem. Aos professores do CCB Raimunda Fortes, Tadeu Gomes, Vera Maciel, Jackson Sá, Andréa Azevedo, Ilka Serra, Ribamar Barros e em especial a Zafira Almeida e Francisca Helena pelo crédito e confiança nos trabalhos. Aos funcionários do DQB e biblioteca, em especial à Neuzinha, Jujú, Laurinete e Geni pela ajuda, paciência e por sempre atenderem carinhosamente aos meus pedidos. Ao Centro Mamíferos Aquáticos ‐ CMA/ICMBio pela concessão das amostras, em especial a Fábia Luna e Inês Serrano pela parceria e confiança creditada. Aos pescadores e moradores do litoral maranhense que tanto contribuem ao meu trabalho, em especial ao “Punk” (corretamente), Dona Mocinha, “Macaco”, Ernesto, Diel, Pinto e Babuça. E por fim, a Gilberto Salvador, minha melhor companhia, pela confecção dos mapas, mas principalmente por todo apoio, orientação, paciência e carinho até aqui. Você é o meu exemplo mais bonito de homem, irmão, filho, enteado, amigo, orientador, namorado... Sem você, meu céu cairia! A todos vocês, MUITO OBRIGADA!!! vii “[...] Penso no que faço, com fé. Faço o que devo fazer, com amor. Eu me esforço para ser cada dia melhor, pois bondade também se aprende. Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o DECIDIR." Cora Coralina “Uma vez encontrado o caminho, o importante é segui‐lo, e segui‐lo até ao fim!” Antoine Saint Exupéry ‐ Vôo Noturno viii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 13 2. REFERENCIAL TEÓRICO 14 2.1 MAMÍFEROS AQUÁTICOS 14 2.1.1 Cetáceos 14 2.1.2 Sirênios 18 2.1.3 Mustelídeos 19 2.2 ENCALHES 20 2.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR 21 3. OBJETIVOS 23 3.1 Objetivo Geral 23 3.2 Objetivos Específicos 23 4. MATERIAL E MÉTODOS 23 4.1 AMOSTRAGEM 23 4.1.1 Área de Estudo 23 4.1.2 Obtenção das Amostras 25 4.2 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 28 4.2.1 Tombamento e Extração do Material Genético 28 4.2.2 Amplificação por PCR 28 4.2.3 Purificação e Sequenciamento 30 4.3 ANÁLISES COMPUTACIONAIS 31 5. RESULTADOS 31 5.1 IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES 31 5.2 QUALIDADE E MÉTODOS DE ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO 34 5.3 ESPÉCIES IDENTIFICADAS E DISTRIBUIÇÃO DOS ENCALHES 35 6. DISCUSSÃO 40 7. CONCLUSÃO 42 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43 ix RESUMO Mamíferos aquáticos são representados pelas ordens Cetacea, Sirenia, Pinnipedia e Carnivora. Suas espécies são amplamente distribuídas em mares, oceanos, rios e estuários por todo o mundo. Em função do ambiente que habitam e da escassez de fomento, as pesquisas envolvendo esses grupos são incipientes. Encalhes são comuns entre cetáceos e sirênios, além de Interações antrópicas que afetam também os mustelídeos. Em ambos os casos são gerados carcaças que representam fontes importantes de informações, sobre a biologia, ecologia e comportamento dessas espécies. No entanto, o processo natural de decomposição pode dificultar ou inviabilizar até mesmo a identificação da espécie. Estudos genéticos têm sido amplamente utilizados para inferir sobre diversos fatores, entre eles incertezas taxonômicas, estruturas populacionais, identificação de espécies e outros. O presente estudo relaciona oito espécies de ocorrências registradas para o litoral maranhense através de encalhes, mas com identificação possível somente através do uso dos marcadores moleculares mitocondriais, como Cyt‐b e 16S. Para tal foi realizado o isolamento do material genético de tecidos coletados de carcaças em diferentes estados de conservação encalhadas no litoral maranhense. O material genético foi isolado de acordo com o protocolo de extração rápido via fenol/clorofórmio seguido da precipitação de acetato de sódio/isopropanol e os Kits de extração Invitrogen e PROMEGA. Após extração do DNA foram realizadas amplificações através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), de sequencias das regiões Cyt‐b e 16S. As sequencias geradas, foram editadas e comparadas a sequencias depositadas no GenBank de acordo com similaridade entre elas. O presente estudo aponta a identificação de sete espécies através de marcadores moleculares, algumas de ocorrência e distribuição desconhecidas para o Maranhão, como o golfinho nariz‐de‐garrafa ‘Tursiops truncatus’, o golfinho clymene ‘Stenella clymene’ e o cachalote anão ‘Kogia sima’. Espécies como baleia jubarte ‘Megaptera novaeangliae’, o cachalote ‘Physeter macrocephalus’, a lontra neotropical ‘Lontra longicaudis’, o peixe‐boi marinho ‘Trichechus manatus’, além do mais comumente encontrado boto‐cinza ‘Sotalia guianensis’, também tiveram ocorrência registrada para esse litoral. Palavras‐chave: Identificação de espécies, Mamíferos Aquáticos, mtDNA, Carcaças. x ABSTRACT Aquatic mammals, represented by the orders Cetacea, Sirenia, Pinnipedia and Carnivora, are widely distributed in seas, oceans, rivers and estuaries around the world. In Brazil, few studies involving this group were realized because of the living environment and the limited financial support for researchs. Carcasses represent a important source of biology, ecology and behavior information of this group and often are generated by strandings and anthropogenic interactions. However, the natural decomposition process can hinder or even tamper species identification. Genetic studies have been used as a tool to help on species identification and solving some taxonomic uncertainties. The present study worked with aquatic mammals identification on Maranhão State, Brazil, from strandings and anthropogenic interactions, but with identification possible only through the use of mitochondrial markers. The genetic material of tissues was collected from carcasses in various states of preservation, and the genetic material was isolated. The material isolation has occurred according to the extraction protocol via quick phenol/chloroform followed by precipitation of sodium acetate/isopropanol, and the extraction kits, Invitrogen and PROMEGA. DNA amplifications was performed using the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR), sequences of regions 16S and Cyt‐b. The sequences generated were edited and compared with the sequences deposited in GenBank under similarity between them. This study shows the identification of seven species using molecular markers, some of occurrence and distribution unknown to Maranhão, as the bottlenose dolphin 'Tursiops truncatus', Clymene dolphin 'Stenella clymene' and dwarf sperm whales 'Kogia sima'. Species such as humpback whale 'Megaptera novaeangliae’, the sperm whale ‘Physeter macrocephalus', neotropical otter ‘Lontra longicaudis', the manatee 'Trichechus manatus', besides the most commonly encountered estuarine dolphin 'Sotalia guianensis' were also reported for this coast. Keywords: Species Identification, Aquatic Mammals, mtDNA, Carcasses. xi LISTA DE FIGURAS Figura 1 ‐ Estado do Maranhão e litoral maranhense 24 Figura 2 ‐ Caixa de figuras 1 ‐ encalhes 26 Figura 3 ‐ Caixa de figuras 2 ‐ encalhes 27 Figura 4 ‐ Genoma mitocondrial de vertebrado 29 Figura 5 ‐ DNA isolado 32 Figura 6 ‐ DNA amplificado por PCR 32 Figura 7 ‐ Eletroferograma 33 Figura 8 ‐ Kogia sima 35 Figura 9 ‐ Distribuição dos encalhes 39 xii LISTA DE TABELAS Tabela 1 ‐ Mamíferos aquáticos registrados no litoral maranhese 15 Tabela 2 ‐ Táxons encontrados nesse estudo 33 Tabela 3 ‐ Amostras, marcadores e similaridade GenBank 37 13 1.
INTRODUÇÃO Os mamíferos aquáticos são compostos por organismos placentários, agrupados na classe Mammalia, constituindo um grupo altamente diversificado e adaptado ao ambiente aquático. Atualmente são conhecidas mais de 141 espécies viventes, distribuídas em 4 ordens todas elas com representantes na América do Sul (BASTIDA et al., 2007; DI BENEDITTO et al., 2010). Essas espécies são amplamente distribuídas, habitando desde mares e oceanos em todo mundo, até rios e estuários, das regiões polares às tropicais (JEFFERSON et al., 1993). Eventos de encalhes são frequentes em muitas espécies de mamíferos aquáticos, principalmente os oceânicos. As causas de tais eventos podem ser as mais variadas e vão desde doenças, alterações ambientais a até mesmo interações antrópicas, como por exemplo, emalhes em redes de pesca (GERACI; LOUNSBURY, 1993; LODI, 1999; SANTOS, 1999). Os encalhes são hoje, por sua vez, a principal fonte de informações no que se refere aos estudos com mamíferos aquáticos, possibilitando não só o conhecimento da biologia e comportamento, mas também da ecologia e saúde do ambiente onde estão inseridos. Mesmo com os eventos de encalhes, muitas das informações são perdidas em virtude do processo natural de decomposição das carcaças. Informações essas como caracteres diagnósticos fundamentais e inerentes à identificação dessas espécies. No que diz respeito ao processo de identificação das espécies a partir de material biológico, a genética e a biologia molecular apresentaram grandes avanços nas últimas décadas, mostrando‐se eficaz na elucidação de incertezas e aspectos da biologia das espécies, como efeitos da endogamia, perda de diversidade genética, resolução de questões taxonômicas, identificação de espécies através da genética e molecular forense, entre outros, fundamentais para o manejo e conservação da biodiversidade (FRANKHAN et al., 2008). Em relação ao conhecimento da ocorrência de espécies de mamíferos aquáticos no Estado do Maranhão, o mesmo só foi possível anteriormente através de identificações morfológicas em observações no ambiente natural ou de carcaças ou ossadas incompletas de animais encalhados pelo litoral maranhense (SICILIANO; ALMEIDA, 1992; MAGALHÃES et al., 2005a; 2005b; 2006a; 2006b; 2007a; 2008). 14 Nesse sentido, o presente trabalho tem como objetivo principal a identificação de espécies de mamíferos aquáticos encalhados no litoral maranhense ou acometidos por interações antrópicas através de análise de técnicas genéticas moleculares. 2. REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 MAMÍFEROS AQUÁTICOS Os mamíferos aquáticos compreendem quatro ordens: Cetacea, Sirenia, Pinnipedia e Carnívora, sendo a ordem Carnívora representada pelas famílias Mustelidae e Ursidae. Seus representantes são animais na grande maioria de hábitos exclusivamente aquáticos, como os cetáceos (baleias, botos e golfinhos) e os sirênios (peixes‐boi e dugongos). Já os pinípedes (leões marinhos, lobos marinhos, focas e morsas), os mustelídeos (lontras e ariranha) e o urso polar (Ursidae), possuem adaptações tanto para a vida aquática quanto para a terrestre. Embora esses grupos se distribuam dos polos aos trópicos, pinípedes e o urso polar não atingem a porção norte da América do Sul (JEFFERSON et al., 1993; BASTIDA et al., 2007; DI BENEDITTO et al., 2010). A principal característica em comum entre os mamíferos aquáticos é o fato desses animais dependerem total ou parcialmente, embora incisiva, da água para obtenção de alimento (JEFFERSON et al., 1993; 2008; DI BENEDITTO et al., 2010). Esses animais sempre despertaram o interesse e a curiosidade quanto a sua biologia, hábitos e comportamento, mas devido à complexa e intricada observação in situ, as informações acerca desses indivíduos se tornam escassas e fragmentadas. 2.1.1 Cetáceos A ordem Cetacea (do grego Ketos = baleia), representada pelas baleias, botos e golfinhos, é constituída pelos mamíferos muito bem adaptados ao ambiente aquático e suas 86 espécies viventes estão divididas em duas subordens: os misticetos, que inclui 4 famílias e 14 espécies, distribuídos exclusivamente no ambiente marinho; e os odontocetos, com 10 famílias e 72 espécies, distribuem‐se tanto no ambiente marinho, quanto em rios e estuários (SICILIANO et al., 2006; DI BENEDITTO et al. 2010). De acordo 15 com Siciliano (2006, p. 16), no Brasil ocorrem mais de 40 espécies de cetáceos. Algumas dessas espécies possuem hábitos marinhos costeiros, enquanto que outras são caracteristicamente oceânicas (DI BENEDITTO et al., 2001; 2010). No Estado do Maranhão, 10 espécies de mamíferos aquáticos entre sirênio e cetáceos marinhos já foram registradas até o momento (MAGALHÃES et al., 2008; SICILIANO et al., 2008), como mostra a tabela a Tabela 1. Tabela 1. Lista de espécies de mamíferos aquáticos registrados no litoral do Estado do Maranhão, Brasil. NOME COMUM REFERÊNCIA Peixe‐boi marinho DOMNING, 1981 Boto‐cinza BOROBIA et al.,1991 Golfinho‐de‐Risso SICILIANO e MOREIRA, Megaptera novaeangliae BOROWSKI, 1781 Baleia‐Jubarte 1992 MAGALHÃES et al., 2005b Globicephala macrorhynchus GRAY, 1846 Baleia‐piloto‐de‐peitorais‐curtas ERBER et al., 2005a Baleia‐de‐Bryde MAGALHÃES et al., 2006a Orca‐pigméia MAGALHÃES et al., 2006b Cachalote TOSI et al., 2006 Baleia‐Minke‐anã MAGALHÃES et al., 2007a Golfinho‐de‐Fraser TOSI et al.,2008 ESPÉCIE Trichechus manatus LINNAEUS, 1758 Sotalia guianensis VAN BÉNÉDEN, 1864 Grampus griséus CUVIER, 1812 Balaenoptera edeni ANDERSON, 1879 Feresa attenuata GRAY, 1874 Physeter macrocephalus LINNAEUS, 1758 Balaenoptera acutorostrata LACÉPÈDE, 1804 Lagenodelphis hosei FRASER, 1956 Os misticetos são conhecidos como baleias verdadeiras. Apresentam simetria cranial, falta de uma sínfise mandibular óssea, o esterno consistindo em um único osso e o aparelho bucal modificado em uma fileira de cerdas bucais na maxila superior para filtrar alimentos, chamado de barbatanas, o que torna sua alimentação diferenciada. (PALAZZO JR.; BOTH, 1988; BASTIDA et al., 2007; JEFFERSON et al., 2008; DI BENEDITTO et al., 2010). As barbatanas são estruturas constituídas de quitina e queratina que podem chegar a 4 metros, estando presas à maxila superior e possibilitam a esses animais a 16 ocupação de um novo nicho alimentar, diminuindo a competição alimentar com animais carnívoros (BANNISTER, 2002; WOODWARD et al., 2006; DI BENEDITTO et al., 2010). A alimentação desses mamíferos de certa forma é paradoxal em relação às suas proporções, pois estão totalmente adaptados a alimentar‐se dos menores organismos aquáticos, entre eles o zooplâncton e alguns peixes pelágicos. Esses animais variam em tamanho, desde a baleia‐minke‐anã (Balaenoptera acutorostrata) medindo 8 metros, ao maior mamífero do planeta, a baleia‐azul (Balaenoptera musculus LINNAEUS, 1758), podendo atingir cerca de 30 metros de comprimento e 100 toneladas (BANNISTER, 2002; SICILIANO et al., 2006; BASTIDA et al., 2007). Possuem dois orifícios respiratórios chamados de espiráculos e na região ventral há a presença de sulcos ou pregas ventrais que variam de 12 a 100 de acordo com cada espécie (PINEDO et al., 1992; SICILIANO et al., 2006). No momento da captura das presas, essa estrutura é inflada acondicionando uma maior quantidade de alimento e posteriormente é comprimida, esgotando quase que totalmente a água presente, ficando o alimento retido nas barbatanas (BANNISTER, 2002; WOODWARD et al., 2006; JEFFERSON et al., 2008) . De acordo com Di Beneditto (2010), a distribuição e os deslocamentos desses animais são mais previsíveis por serem migrantes verdadeiros e possuírem áreas de alimentação e reprodução definidas. No Brasil, ocorrem duas das quatro famílias, dentre os representantes de maior frequência estão a baleia‐jubarte (Megaptera novaeangliae) e a baleia‐franca‐do‐sul (Eubalaena australis DESMOULINS 1822), mais conhecidas por migrarem do continente antártico à costa brasileira no inverno e primavera, local de reprodução e cria dos filhotes (BANNISTER, 2002; SICILIANO et al., 2006). Os odontocetos, conhecidos como botos e golfinhos se diferenciam dos misticetos principalmente pela presença de dentes ao longo da vida. Todas as espécies, com exceção do boto‐vermelho (Inia geoffrensis BLAINVILLE 1817), possuem homodontia nos pares mandibulares e em número que variam entre 2 a 200 e seus dentes não são utilizados para a mastigação, sendo o alimento capturado engolido inteiro (PALAZZO JR.; BOTH, 1988; SICILIANO et al., 2006; BASTIDA et al., 2007; Di BENEDITTO et al., 2010). 17 Características tais como número, forma, tamanho e o posicionamento dos dentes são considerados caracteres taxonômicos na identificação e classificação dessas espécies (Di BENEDITTO et al., 2010). Embora possuam apenas um orifício respiratório, a região da cabeça é repleta de sacos nasais, além de uma estrutura extremamente complexa conhecida como melão, constituída por uma grossa camada de gordura e localizada na região anterior da cabeça, ambos atuando na emissão de sons e possibilitando o funcionamento do sistema de ecolocalização, definido por Au (2002) como “o processo em que um animal obtém uma avaliação do seu ambiente através da emissão de sons e a captação de ecos em forma de ondas sonoras refletidas em objetos diferentes no ambiente”, tão peculiar a essas espécies (SICILIANO et al., 2006; BASTIDA et al., 2007; JEFFERSON et al., 2008; Di BENEDITTO et al., 2010). Em geral, os odontocetos apresentam tamanho pequeno a mediano, mas variações morfológicas vão desde espécies muito pequenas como a vaquita (Phocoena sinus NORRIS & MCFARLAND 1958) que mede em média 1.45 metros, ao gigante cachalote (P. machocephalus) podendo atingir em torno de 18 metros de comprimento, ambas as medidas para machos adultos (SICILIANO et al., 2006; BASTIDA et al., 2007; JEFFERSON et al., 2008). Possuem coloração variada, podendo ser discreta como a toninha (Pontoporia blainvillei GERVAIS & D’ORBIGNY 1844) ou complexa e chamativa como no caso do golfinho comum (Delphinus delphis LINNAEUS 1758), a orca (Orcinus orca LINNAEUS 1758), entre outros (BASTIDA et al., 2007; JEFFERSON et al., 2008). A dieta alimentar pode ser bastante variável na maioria dos odontocetos, sendo composta em geral por cefalópodes, peixes e crustáceos, com exceção dos cachalotes (P. macrocephalus) e as orcas (O. orca), que se alimentam preferencialmente por lulas gigantes (Architeuthis spp.) e outros mamíferos marinhos, respectivamente, inclusive filhotes (BASTIDA et al., 2007). A distribuição geográfica dos odontocetos é mais restrita que das grandes baleias, visto que não realizam grandes migrações, com exceção do cachalote macho (P. 18 macrocephalus) que percorre longas distâncias (BASTIDA et al., 2007). Além disso, seus deslocamentos estão diretamente relacionados com a movimentação de suas presas (Di BENEDITTO et al., 2010). Com exceção das famílias Monodontidae (narval ‐ Monodon monocerus LINNAEUS 1758 e beluga ‐ Delphinapterus leucas PALLAS 1776) e Platanistidae (golfinho‐do‐rio‐Ganges – Platanista gangetica ROXBURGH 1801), outras sete famílias de odontocetos possuem representantes no Brasil (SICILIANO et al., 2006; BASTIDA et al., 2007; Di BENEDITTO et al., 2010). 2.1.2 Sirênios A ordem Sirenia é constituída por duas famílias distintas (Dugongidae e Trichechidae), sendo formada apenas por quatro espécies viventes. A família Dugongidae possui dois gêneros: Hydrodamalis, com a espécie Hydrodamalis gigas ZIMMERMAN 1780 (vaca marinha de Steller) extinta em 1768 e o Dugongidae com uma única espécie, Dugong dugong MÜLLER 1776 (dugongo), semelhante anatomicamente aos peixes‐boi, porém com um entalhe recortando a porção mediana da nadadeira caudal, como das baleias e golfinhos (MARSH et al., 1986). Único sirênio exclusivo de águas marinhas, sua distribuição restringe‐se à região tropical e subtropical e águas costeiras de ilhas dos oceanos Índico e Pacífico, entre 27º N e 27º S (HUSAR, 1978c; MARSH; LEFEBVRE, 1994; LUNA; PASSAVANTE, 2010). A família Trichechidae é composta por três espécies: Trichechus senegalensis LINK 1795 (peixe‐boi africano) habitante de lagoas costeiras, rios e litoral costeiro da África ocidental, entre o Senegal e o norte de Angola; Trichechus inunguis NATTERER 1883 (peixe‐boi amazônico) endêmico e de distribuição por toda bacia amazônica, é o sirênio de menor tamanho, habitando exclusivamente águas doces (COIMBRA FILHO, 1972; HUSAR, 1978a, BERTRAM; BERTRAM, 1973; DOMMING, 1981; BEST, 1984; TIMM, ALBUJA; CLAUSON, 1986; REEVES et al., 1996; MARMONTEL et al., 2005 BASTIDA et al., 2007). Seus caracteres diagnósticos são a ausência de unhas nas nadadeiras peitorais, o couro liso e preto, além de uma mancha branca ventral, característica a cada espécime, podendo se apresentar com uma região um pouco mais clara (MARSH et al., 1986; ROSAS, 1994; 19 LUNA, 2001). Por fim, Trichechus manatus LINNAEUS 1758 (peixe‐boi marinho ou das Antilhas) encontrado tanto em rios, estuários e o ambiente marinho, distribuído no Oceano Atlântico na média porção do continente americano, da Flórida ao nordeste brasileiro aos seus 12ºS aproximadamente (HUSAR, 1978b; MARSH et al., 1986; BASTIDA et al., 2007; LUNA; PASSAVANTE, 2010). Com base em diferenças anatômicas craniométricas (DOMNING; HAYEK, 1986) e posteriores análises genético‐moleculares (VIANA et al., 2006; CANTANHEDE et al., 2005), o peixe‐boi marinho (Trichechus manatus) foi dividido em duas subespécies proposto por HATT, 1934: Trichechus manatus manatus LINNAEUS 1758 para a espécie que habita a América Central e do Sul e Trichechus manatus latirostris HARLAM 1824 para as populações encontradas na região tropical da América do Norte (BASTIDA et al., 2007). 2.1.3 Mustelídeos A família Mustelidae compreende um pouco mais que 60 espécies, estando entre elas as lontras e ariranhas. No Brasil, encontramos a lontra comum, Lontra longicaudis OLFERS 1818, distribuída por todo o território brasileiro e a ariranha ou lontra gigante, Pteronura brasiliensis GMELIN 1788, endêmica da América do Sul, que por sua vez tem sua distribuição restrita ao Suriname, Guiana, Guiana Francesa e bacia amazônica, com dados de extinção em sua antiga distribuição (ROSAS et al., 1991; CARTER; ROSAS, 1997; BASTIDA et al., 2007). A lontra comum (L. longicaudis) possui dimorfismo sexual, com seus machos ligeiramente maiores que as fêmeas, atingindo o comprimento em torno de 80 cm a 1,20m e 14 kg. De hábitos noturnos e solitários, agrupam‐se apenas em períodos reprodutivos (EMMONS; FEER, 1997; CHEIDA et al., 2006; BASTIDA et al., 2007). A ariranha (P. brasiliensis) é um dos maiores carnívoros de água doce da América do Sul e o maior membro da subfamília Lutrinae. Chegam a 1,80m de comprimento, havendo registros de indivíduos de até 2,40m em um corpo totalmente hidrodinâmico (CARTER; ROSAS, 1997). Possuem uma calda achatada dorsoventralmente que auxilia na 20 natação, membranas interdigitais e manchas pardo‐amareladas no pescoço e peito que possibilitam a identificação de cada indivíduo (ROSAS, 2004; BASTIDA et al., 2007). 2.2 OS ENCALHES Os primeiros estudos com cetáceos foram realizados a partir de carcaças oriundas da atividade baleeira, que tinha como alvo os misticetos. Por meio de análise das carcaças foi possível obter informações sobre o comportamento (organização social, estratégias de acasalamento, composição de grupo e outros) e a biologia (idade, sexo, maturação, tamanho, anatomia e outros) destes animais (SAMUELS; TYACK, 2000). Espécies oceânicas, de águas profundas, solitárias e de comportamento discreto na superfície impossibilitam a observação dos animais in situ, tornando‐se desconhecidas ou com poucas informações, oriundas de raríssimas avistagens no mar. Por conta de tais aspectos, ressalta‐se a importância da análise de carcaças provenientes dos encalhes, que é a principal fonte e origem das poucas informações sobre essas espécies (SICILIANO et al., 2006; MEDEIROS, 2006). O encalhe é um evento descrito em mamíferos aquáticos da ordem Cetacea e Sirenia, no qual o animal vem a terra, não conseguindo posteriormente retornar à água (JEFFERSON, et al., 1993). Podem ser classificados em individual quando apenas um animal encalha e “em massa” (em grupo) quando dois ou mais animais encalham ao mesmo tempo e local, com exceção do par fêmea/filhote (GERACI; LOUNSBURY, 1993; HETZEL; LODI, 1993). Encalhes podem ocorrer devido a causas naturais, como pelo tempo natural de vida do indivíduo ou doenças naturais ou ainda não‐naturais, sendo estas últimas relacionadas à atividade humana, como: a) emalhe em redes de pesca; b) colisão com embarcações; c) derramamento de óleo, que provoca a degradação do habitat influenciando a abundância e diversidade de presas, aumenta o stress e a suscetibilidade a infecções, e d) raramente, vítimas de arma de fogo (GERACI; LOUNSBURY, 1993). 21 Diferente dos cetáceos e sirênios, no grupo dos mustelídeos não ocorre o evento de encalhe. Contudo, esses animais são freqüentemente atingidos por interações antrópicas, tais como a pesca, a caça ilegal para uso de pele e até mesmo atropelamentos em estradas e rodovias tem sido reportados em todo o país (QUADROS, 2006). 2.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR Estudos com mamíferos aquáticos sempre foram complexos devido a diversos fatores, como a grande mobilidade e dispersão desses animais, a dificuldade de identificação em espécies que não apresentam padrões de coloração diferenciáveis, às próprias dificuldades que o ambiente aquático oferece além da escassez de recursos financeiros. Durante muito tempo, as poucas informações a respeito foram obtidas somente a partir da indústria baleeira e posteriormente baseados em estudos observacionais (HOELZEL, 1992). Estudos preliminares de genética de populações têm mostrado que estudos observacionais podem apresentar falhas. Por sua vez, análises genéticas podem inferir sobre aspectos importantes, como estimativas de tamanho efetivo populacional (WAPLES, 1991), diversidade genética e detalhes sobre o comportamento, como sucesso reprodutivo (HOELZEL, 1992). A identificação de espécies através do uso de marcadores genético moleculares tem sido utilizada para vários grupos de organismos, tais como moluscos (IGNÁCIO et al., 2000), crustáceos (GUSMÃO et al., 2002; 2005), elasmobrânquios (SOLÉ‐CAVA et al., 1983), entre outros. Para mamíferos aquáticos foram reportados diversos trabalhos relacionados ao uso de marcadores genético moleculares, entre eles, os principais são: separação de espécies crípticas (CUNHA et al., 2005; CABALLERO et al., 2007); identificação de espécies comercializadas ilegalmente através da genética forense (BAKER et al., 1996; GRAVENA et al., 2008; SHOLL et al., 2008); identificação de Unidades Evolutivamente Significativas ‐ ESUs (BANGUERA‐HINESTROZA et al., 2002); rastreamento genético de espécies protegidas (CIPRIANO et al., 1999); estrutura genética de populações (PALUMBI; BAKER, 22 1994); e incertezas taxonômicas resolvidas através de estudos filogenéticos (HOELZEL, 1992; 1994; ARNASON; GULBERG, 1996; GARCÍA‐RODRIGUES et al., 1998; VIANNA et al., 2006; GARCIA et al., 2007). Por sua vez, o DNA mitocondrial (mtDNA) é encontrado em abundância na mitocôndria das células e apresentam características peculiares à herança materna. Além disso, o DNA mitocondrial tem mostrado grande eficiência em questões de estrutura populacional e história evolutiva das espécies, e em muitos casos, foi o primeiro marcador genético utilizado em estudos genéticos de espécies raras ou ameaçadas de extinção, das quais se destacam espécies de mamíferos aquáticos (BAKER et al., 1993; HOELZEL et al., 1993; SCHAEFF et al., 1993; AVISE; HAMRICK, 1996). No Estado do Maranhão, os animais encalhados geralmente são encontrados em alto grau de decomposição, em virtude, principalmente, da grande extensão territorial litorânea maranhense e do seu difícil acesso. Contudo, outras formas de pesquisas se fazem necessárias no estudo dessas espécies, uma vez que a maior parte dessas informações é perdida pela rápida decomposição, como padrão de coloração, morfologia externa e de suas estruturas, entre outros, o que torna imprecisa até mesmo a identificação das espécies (GERACI; LOUNSBURY, 1993). Neste contexto, a utilização de técnicas moleculares tem sido cada vez mais utilizada para o processo de identificação e avaliação dos estoques populacionais destas e outras espécies (BAKER et al., 1996; ALEIXO, 2002; AVISE, 2004). Para o manejo efetivo de uma área faz‐se necessário o conhecimento e conservação da biodiversidade existente no local, contribuindo substancialmente para o conhecimento da biologia das espécies em questão. A escassez de estudos locais em relação aos mamíferos aquáticos no litoral maranhense, levando‐se em conta a própria dinâmica do local, o impacto causado pelas diversas atividades realizadas, como a pesca, a petrolífera e o turismo numa região com diversas Unidades de Conservação (UCs) distribuídas na faixa litorânea do Estado, torna este estudo ainda mais relevante para a região. 23 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Identificar ao nível específico mamíferos aquáticos provenientes de encalhes ou de interações antrópicas no Estado do Maranhão, através de técnicas moleculares, utilizando carcaças em diferentes estados de conservação. 3.2 Objetivos específicos ‐ Identificar espécies de mamíferos aquáticos encalhados no litoral maranhense e/ou provenientes de interações antrópicas utilizando regiões do mtDNA referentes aos genes mitocondriais Cytocromo‐b e rRNA 16S; ‐ Avaliar a qualidade do DNA isolado de carcaças em diferentes tecidos; ‐ Avaliar a eficiência de diferentes métodos de isolamento; ‐ Construir uma lista de ocorrência das espécies, mapear os locais de encalhe e ocorrência das espécies. 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostragem 4.1.1 Área de Estudo O Estado do Maranhão (Figura 1) detém o segundo maior litoral brasileiro com cerca de 640 km em extensão, estendendo‐se desde a foz do rio Gurupi – PA, até a foz do rio Parnaíba ‐ PI (PALMA, 1979). A costa é dividida em três macro‐regiões: a porção Ocidental ou litoral Oeste, que vai desde a divisa do Pará até Alcântara, abrigando as Reentrâncias Maranhenses, caracterizada por uma extensa e recortada faixa de manguezais, dando origem a baixos e estuários que estão ligados por canais laterais. A 24 porção central, chamada Golfão Maranhense, é composta por duas grandes baías, São Marcos e São José, separadas pela ilha de São Luis (PALMA, 1979; STRIDE, 1992; ALMEIDA et al.,2010). Por fim, o litoral Oriental ou Leste, tem início na baía do Tubarão e limite na divisa do Piauí. É composto por uma grande faixa de dunas e lagoas costeiras e detentora de um dos ambientes mais peculiares do mundo, os Lençóis Maranhenses (PALMA, 1979; STRIDE, 1992). A hidrografia da plataforma da região Norte é condicionada pela Corrente Norte do Brasil, impulsionada por ventos alísios predominantes em todo o ano. A região é marcada pela forte influência de macromarés, alcançando uma amplitude de 7 m na capital maranhense, diminuindo a Noroeste, podendo ainda, atingir 7,5 nós (BRASIL, 1972). De acordo com Palma (1979) as condições climáticas, a drenagem fluvial de grandes rios e a circulação oceânica são fatores determinantes na diferenciação morfológica deste litoral.
Figura 1: Mapa com a localização do Estado do Maranhão e litoral maranhense – Brasil. 25 A malha rodoviária maranhense, por sua vez, é composta de grandes rodovias Federais e Estaduais como as BRs 316, 135, 222, 226, 230, 010 e as MAs 308 e 402. Essas rodovias, além de possuíram grande fluxo automotivo, cortam todo o Estado e seus principais rios: Pindaré, Grajaú, Itapecurú, Mearim e Munim (BRASIL, 2012). Muitos incidentes envolvendo atropelamento de animais silvestres são relatados diariamente nestas rodovias, estando inserido nesta lista os representantes da família Mustelidae. 4.1.2 Obtenção das Amostras As amostras foram obtidas através de carcaças de animais encalhados no litoral maranhense no período de 2006 até final de 2011 (Figuras 2 e 3), coletados por colaboradores locais e pesquisadores em trabalhos de campo. Também foram provenientes de atendimentos a encalhes pelo Centro Mamíferos Aquáticos do Instituto Chico Mendes para a Conservação da Biodiversidade CMA/ICMBio, ao qual foram concedidas as amostras através de um Acordo de Cooperação Técnica entre a Universidade Estadual do Maranhão e o CMA/ Sede Itamaracá – PE e Base Avançada Maranhão. As amostras coletadas contemplaram fragmentos de tecidos de partes corpóreas distintas tais como pele, músculo, fígado, rins, pulmão, olhos, ossos e dentes e em diferentes estados de conservação, havendo indivíduos desde o estado “fresco” até mumificados ou em alto grau de decomposição, classificados de acordo com Geraci e Lounsbury (1993), como mostra as Figuras 2 e 3. 26 a b c d e Figura 2: a) Encalhe de um neonato de misticeto. Foto: Arquivos CMA/ICMBio; b, c) Encalhe de cetáceo não identificado em alto grau de decomposição. Foto: Alex Reis; d) encalhe de delfinídeo em decomposição; e) Encalhe de delfinídeo com indícios de Interação Antrópica. Fotos: Arquivos CMA/ICMbio. 27 a b c Figura 3: a) Encalhe de delfinídeo. Foto: Arquivos CMA/ICMBio; b) Encalhe de delfinídeo com indícios de Interações Antrópicas. Foto: Alex Reis; c) Encalhe vivo de neonato de cachalote (Physeter macrocephalus). Foto: Arquivos CMA/ICMBio. 28 4.2 Procedimentos Laboratoriais 4.2.1 Tombamento e Extração do material genético As amostras de mamíferos aquáticos receberam identificação de tombamento de acordo com os critérios adotados pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular – UEMA, onde a sigla adotada foi composta pela letra inicial referente ao gênero e as duas iniciais referentes a espécie. Exemplo: para Sotalia guianensis a sigla de tombamento é SGU. Posteriormente foram acondicionadas em tubos eppendorf e imersas em etanol 95%, mantidas em freezers a ‐20° para sua preservação até o momento do isolamento do material genético. A extração do material genético (DNA total) foi realizada utilizando‐se enzimas (Ribonuclease e Proteinase K), de acordo com o protocolo de extração rápido fenol/clorofórmio, seguido de precipitação por acetato de sódio/Isopropanol (SAMBROOK et al., 1989). Depois de isolado, o material genético foi submetido à migração em gel de Agarose a 1% corado com brometo de etídio, durante 15 minutos por 70 volts. Após a migração, as amostras foram visualizadas sob luz ultravioleta em um transluminador para confirmação do processo de isolamento, quantificação e análise da qualidade do material isolado. 4.2.2 Amplificação por PCR A partir do material genético extraído, foram realizadas amplificações através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) de segmentos dos genes mitocondrial Citocromo B (Cyt‐b) e rRNA 16S (16S) localizados entre os genes mitocondriais ND1 e ND 6 (Figura 4), utilizando os iniciadores externos (primers): CB‐out1, 5’‐
AATGAYATGAAAARYCATCGTTG‐3’; CB‐out2 5’‐TCTTCCTTGAGTCTTAGGGAG‐3’, descritos por Cassens et al. (2000) e 5'‐GCCTCGCCTGTT‐TACCAAAAAC‐3 '(L‐1987) e 5'‐
CCGGTCTGAACTCA‐GATCACGT‐3 '(H‐2609) descritos por Palumbi et al. (1991). 29 Figura 4. Genoma mitocondrial de vertebrado, com a localização dos genes Cyt‐b e 16S. A reação da PCR baseia‐se na hibridização e na extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizadas como iniciadores (primers) que delimitam (flanqueiam) a região a ser amplificada. O volume total adotado para cada reação dos dois marcadores foi de 25 µL , contendo 4 µL da mistura de desoxinucleotídeos (dNTPs – 1.5 mM), 2.5 µL do tampão (Invitrogen: Tris‐HCl e EDTA) da enzima Taq (10X), 1 µL de MgCl2 (25 mM), 0.3 µL de cada primer (200 ng/ µL), 2 µL de DNA total extraído (equivalente a 20 ng de DNA segundo padrão de intensidade de banda), 0.25 µL da enzima Taq polimerase (5 U/ µL – Invitrogen) e água destilada estéril para completar o volume final da reação. As condições para amplificação do segmento do gene mitocondrial Cyt‐b e rRNA 16S foram as mesmas descritas por Cassens et al. (2000) e Palumbi et al. (1991) respectivamente, consistindo em uma etapa inicial a 94°C por 120 segundos; 40 ciclos iniciando a 94°C por 60 segundos; 55°C por 60 segundos e 72°C por 90 segundos, finalizando com uma fase de extensão a 72°C por 10 minutos para Cyt‐b e uma etapa de desnaturação inicial a 94 ° C por 5 minutos, seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 94 ° C, 1 30 minuto a 50 ° C e 2 minutos a 72 ° C. A temperatura de extensão final foi de 72 ° C por 5 minutos para o marcador 16S. Terminada a reação de PCR, uma alíquota de 3,0 µL de DNA foi submetida à eletroforese em gel de Agarose 1% corado com brometo de etídio a 0,3 µg/mL para estimativa de qualidade e concentração dos produtos. 4.2.3 Purificação e Sequenciamento Para otimizar o resultado de amostras em mau estado de conservação, foram realizadas a purificação do produto da PCR. A purificação consistiu em isolar somente o fragmento amplificado de DNA, eliminando qualquer outro componente que não tenha sido incorporado na reação. Suas etapas consistiram na adição de 10μL de PEG (Polyethylene glycol – 8000 20%), 10μL de DNA vortexando por 2 e aquecido por 30 minutos em estufa a 37ºC a 4000 rpm. Após 30 minutos a placa foi invertida bruscamente e adicionado 100μL de álcool a 80%. Repetiu‐se esse processo por duas vezes. Em seguida, secou‐se a placa na estufa até atingir 800 rpm. Após secagem, adicionou‐se 10 μL de H2O e foi deixado em overnight. Para a reação de sequenciamento, os purificados foram submetidos a uma nova reação de PCR pelo método didesoxiterminal (SANGER et al., 1977), com reagentes do Kit Big Dye (ABI PrismTM Dye Terminator Cycle Sequencing Reading Reaction ‐ Perkin Elmer). A reação de sequenciamento de cada amostra foi realizada em um microtubo de 0,2 mL contendo os seguintes componentes: 2 – 6 μL do purificado, 1 μL de um dos oligonucleotídeos (concentração de 200 ng/μL), 6 μL de tampão Save Money (Tris 0,4 M pH 9,0; MgCl2 25 mM), 2 μL do mix Big Dye e água destilada estéril para completar o volume de 20 μL. Os microtubos foram colocados em um Termociclador PTC‐100, programado para realizar as seguintes etapas: 25 ciclos de desnaturação – 96 oC por 50 segundos, “annealing” – 50 oC por 5 segundos e extensão – 60 oC por 4 minutos. O sequenciamento das amostras foram efetuadas no seqüenciador automático ABI‐3500 (Applied Biosystems). 31 4.3 Análises computacionais Gerado as sequencias, as mesmas foram alinhadas e editadas, corrigindo a presença de sítios com dualidade através de visualização do seu cromatograma, com o auxílio do aplicativo Bio Edit 7.0.5 (HALL, 1999). Após edição, as sequências foram alinhadas e comparadas às sequências depositadas no banco mundial de sequencias – GenBank, da Plataforma de busca BLAST – NCBI, afim de se comparar o grau de similaridade com sequências de indivíduos da mesma espécie ou similares e, desta forma, identificar indivíduos da mesma espécie. A identificação consistiu em obter fragmentos com o maior tamanho possível, para que após editada e corrigida pelo BioEdit fossem comparadas com bases de sequencias presentes no GenBank. Após busca pelo sistema BLAST foi encontrado padrões de similaridade variáveis para cada sequência independente do seu tamanho, sendo o padrão adotado para confirmação da espécie valores iguais ou superiores a 99% de similaridade. Valores inferiores a este foram utilizados apenas para identificação a nível de gênero. 5. RESULTADOS 5.1 Identificação de Espécies As coletas e doações realizadas resultaram em um total de 24 amostras correspondentes a 24 indivíduos de identificação desconhecida ou duvidosa, distribuídas por localidades que compõem o litoral maranhense. Após o processo de isolamento do material genético (Figura 5) e amplificação dos fragmentos mitocondriais (Figura 6), foi obtido sucesso no sequenciamento e identificação molecular em 17 das 24 amostras. 32 Figura 5. Visualização de material genético isolado via fenol/clorofórmio em gel de Agarose a 1%. Figura 6. Visualização de amplificação do gene mitocondrial rRNA 16S por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em gel de Agarose a 1%. As sequencias obtidas para os dois marcadores variaram em tamanho entre 450 ‐ 800 pares de bases (Figura 7) devido a fatores como qualidade das amostras e condições de laboratório. 33 Figura 7. Eletroferograma obtido após reação de sequenciamento do gene mitocondrial Citocromo b. Após comparação com sequencias presentes no GenBank, um total de sete espécies (Tabela 2) foram confirmadas a partir das 17 de. As identificações moleculares corresponderam a representantes distribuídos em três Ordens: Cetacea (subordens Mysticeti e Odontoceti), Sirenia e Carnívora, subdivididos em cinco famílias: Balaenopteridae, Delphinidae e Physeteridae para os cetáceos; Trichechidae e Mustelidae para os únicos representantes dos grupos sirênios e carnívoros, sucessivamente. Tabela 2. Divisão dos grupos de mamíferos aquáticos encontrados no processo de identificação molecular neste estudo. ORDEM SUBORDEM FAMÍLIA ESPÉCIE NÚMERO DE ESPÉCIMES CETACEA Mysticeti Balaenopteridae Megaptera novaeangliae 2 Odontoceti Physeteridae Physeter macrocephalus 1 Delphinidae Tursiops truncatus MONTAGU, 1981 1 Stenella clymene GRAY, 1850 1 Sotalia guianensis van BÉNÉDEN, 1864 11 SIRENIA CARNÍVORA Caniformia Trichechidae Trichechus manatus 2 Mustelidae Lontra longicaudis 1 34 Não foi possível a diagnose em nível de espécie para alguns indivíduos desde o atendimento aos encalhes, devido a alterações morfológicas ocasionadas pelo processo de decomposição, como perda do padrão de coloração e inchaço devido a formação de gases. Esses indivíduos foram necropsiados e seu material biológico submetido diretamente à identificação através de análises genética moleculares. 5.2 Qualidade e Métodos de Isolamento do DNA Diferentes tecidos foram utilizados para o processo de isolamento do material genético, entre eles músculo, fígado, pele e ossos. Tecidos como músculo e fígado apresentaram além de uma quantidade maior de material genético, uma rápida digestão do tecido, facilitando o processo e garantindo um aproveitamento de 100% do tecido macerado. Já o tecido epitelial, apresentou rigidez ao imergido em álcool tornando o processo mais demorado, além de perdas pelo descarte de material não digerido. Não foi possível o isolamento do material genético de tecido ósseo. No que diz respeito à conservação das amostras, as mesmas apresentaram maior qualidade e integridade do material genético quando conservadas em álcool absoluto. Algumas amostras como SGU 08, SGU 09 E TMA 02 foram conservadas em Formol a 10%, fixando o tecido e, portanto, impossibilitando o isolamento do material genético através dos protocolos de extração padrão. Amostras de tecido epitelial, muscular e dentes com restos teciduais da maxila como SGU 10 e TTR 02 apresentaram estado “mumificado” e/ou ressecados, totalmente desidratadas e sem nenhuma solução conservante, impedindo o isolamento do DNA. Em relação aos métodos de isolamento de DNA, o protocolo rápido via fenol/clorofórmio descrito por Sambrook et al. (1989) apresentou grande eficiência quando utilizado para amostras frescas, em bom estado de conservação ou ainda para amostras em estado regular de conservação de tecidos de fácil digestão como músculo e fígado. Kits de extração rápida como o Mini Kit de extração de DNA Genômico – INVITROGEN e o Kit de extração rápida PROMEGA, mostraram uma maior eficiência no 35 que diz respeito à digestão e separação do material genético, além da agilidade no processo. 5.3 Espécies e Distribuição dos Encalhes Foram identificadas através da ferramenta molecular sete espécies de mamíferos aquáticos para o Estado do Maranhão (Tabela 3). Uma das amostras, a KSI 01 correspondente a família Kogidae, encontrou‐se contaminada por DNA humano, apresentando 100% de similaridade para Homo sapiens. A contaminação se deu, muito provavelmente, pela ausência de materiais essenciais à proteção e contaminação no momento da coleta do material biológico, como luva, máscaras e outros. Este exemplar foi único registro de encalhe para a espécie Kogia sima (Figura 8) no Estado até o presente momento. Sua identificação foi confirmada através caracteres diagnósticos, como tamanho e formato da nadadeira dorsal, observados em arquivos fotográficos e inseridos dessa forma na lista de espécies registradas. Figura 8. Encalhe de cachalote‐anão (Kogia sima), praia do Calhau – São Luis. Foto: Flora Dolores. Os encalhes de cetáceos não apresentaram um padrão definido de distribuição, sendo os mesmos ocorridos com frequência por toda a extensão da costa maranhense, como mostra a Figura 8. No que se refere aos encalhes de peixe‐boi marinho (T. manatus), os mesmos se restringiram a áreas de manguezais, protegidos por baías, como ocorre na 36 baía do Tubarão (Figura 9), área reconhecida como habitat de alto potencial para reprodução de T. manatus (ALVITE, 2008). Já em relação ao único espécime de L. longicaudis amostrado nesse estudo, a obtenção da amostra se deu através de um exemplar atropelado, denotando a necessidade de maior atenção para áreas de habitats em potencial de possível distribuição desta espécie e o risco que interações antrópicas podem oferecer a elas. 37 Tabela 3. Lista de amostras utilizadas nesse estudo, com nome da espécie, sigla de tombamento, local de encalhe, marcadores genéticos utilizados, pares de bases encontrados, grau de similaridade e número de registro de artigo relacionado no GenBank. P = positivo e N = negativo para os respectivos marcadores. MARCADORES NÚMERO DE GRAU DE NÚMERO DE ESPÉCIE NOME COMUM TOMBO LOCAL ENCALHE UTILIZADOS PARES DE BASES SIMILARIDADE REGISTRO Cyt‐b 16S ENCONTRADOS GENBANK GENBANK Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 01 ‐2°33'49.84"‐ 44°3'22.36" ‐ P 560 pb 100% (16S) AF304061.1 Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 02 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐ P ‐2°27'52.78" ‐44°11'43.19" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 03 ‐ P 560 pb 100% (16S) AF304061.1 2°33'58.77" 42°44'26.94" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 04 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐ P ‐2°33'58.77" ‐42°44'26.94" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 05 ‐ P 1160 ‐ 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐2°28'54.41" ‐44°15'17.35" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 06 860 pb 100% (Cyt‐b) EF488223.1; P ‐ ‐2°20'26.99" ‐43°22'39.36" DQ086827.1 Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 07 ‐ P 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐2°29'14.48" ‐44°16'55.63" Boto‐cinza SGU 08 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ N N Sotalia guianensis ‐1°58'29.59 ‐44°29'30.91" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 09 N N ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐2°24'21.27" ‐43°08'22.99" Boto‐cinza SGU 10 ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ N N Sotalia guianensis ‐2°25'38.53" ‐43°05'00.38" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 11 P P 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐2°30'17.22" ‐44°19'06.29" Boto‐cinza SGU 12 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐ P Sotalia guianensis ‐2°37'41.16" ‐42°38'32.87" Sotalia guianensis Boto‐cinza SGU 13 P P 560 pb 100% (16S) AF304061.1 ‐2°31'31.41" ‐ 44°18'14.57" Trichechus manatus Peixe‐boi marinho TMA 01 560 pb 100% (16S) AM904728.1; N P ‐2°30'28.27" ‐43°35'06.89" U97337.2 38 Trichechus manatus Peixe‐boi marinho TMA 02 Trichechus manatus Peixe‐boi marinho TMA 03 Tursiops truncatus Golfinho‐nariz‐de‐garrafa TTR 01 Tursiops truncatus Golfinho‐nariz‐de‐garrafa TTR 02 Cachalote‐anão KSI 01 Cachalote PMA 01 Golfinho‐clymene NID 01 Megaptera novaeangliae Baleia Jubarte NID 02 Megaptera novaeangliae Baleia Jubarte MNO 01 Lontra longicaudis Lontra comum LLO 01 Kogia sima Physeter macrocephalus Stenella clymene ‐2°28'48.88" ‐43°34'25.32" ‐2°28'36.69" ‐43°34'19.47" ‐2°21'09.81" ‐43°16'01.00" ‐2°20'20.87" ‐43°18'39.53" ‐2°28'56.18" ‐44°14'43.49" ‐1°28'47.24" ‐44°50'33.38" ‐2°27’55.00” ‐44°11’59.00” ‐2°0'30.30" ‐44°30'34.41" ‐2°27'5.40" ‐44° 9'39.49" ‐1°46'46.04" ‐46°15'05.55" Formol ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐‐‐ N P 550 pb 100% (16S) P N 1120 pb 100% (Cyt‐b) ‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐ contaminado “Homo sapiens” 100% (16S) P ‐ 680 pb 100% (Cyt‐b) N P 1160 pb 99% (16S) P N 839 pb 99% P P 1180 pb 99% (Cyt‐b) N P 689 pb 98% (16S) Lutra lutra N N ‐‐‐‐‐‐‐
AM904728.1; U97337.2 JN571478.1; EU557093.1 ‐‐‐‐‐‐‐ ‐‐‐‐‐‐‐ AJ277029.2 AF084083.1 AP006467.1; U13117.1 GQ353256.1 EF672696.1; FJ236015.1 39 Figura 9. Mapa do litoral maranhense com a distribuição dos encalhes de mamíferos aquáticos utilizados nesse estudo. 40 6. DISCUSSÃO A dificuldade na obtenção de amostras de mamíferos aquáticos no Estado do Maranhão representa um fator limitante a trabalhos como este, em virtude da escassez de pesquisas na área e da dificuldade de logística em um litoral tão extenso e recortado. Em virtude também da dimensão do litoral maranhense, as dificuldades se concentram em se atingir o animal encalhado em tempo adequado à coleta de material biológico, reforçando a necessidade de parcerias e orientação de representantes locais. Os registros dos encalhes de mamíferos aquáticos representam a principal fonte de informações dessas espécies, através até mesmo de registros únicos, considerando a dificuldade em se trabalhar com esses animais vivos ‘in situ’, além de muitas delas serem caracteristicamente oceânicas e conhecidas apenas através de encalhes, ressaltando a importância desta atividade. No Maranhão, espécies como M. novaeangliae (MNO 01 e BNID 01) possui distribuição pouco conhecida para essas áreas, tendo um único registro anteriormente através de uma ossada incompleta (MAGALHÃES et al., 2005b). Eventos como esse sugere a importância e necessidade de ampliação dos esforços na área, principalmente no que diz respeito a uma possível reprodução e cria dos filhotes em virtude do encalhe de um neonato da espécie na Ilha de São Luis e outro, ocorrido anteriormente ao neonato, localizado mais à Oeste do Estado. Este só identificado através de técnicas moleculares em razão do avançado estado de decomposição. Encalhes como o neonato de Physeter macrocephalus (PMA 01) e outros quatro indivíduos anteriormente registrados no Estado do Maranhão, três em fases de neonato a filhotes (TOSI et al., 2006), representam forte indicativo de área reprodutiva para a espécie. Registros como o de Trichechus manatus são de extrema importância para espécie, uma vez que a mesma tem distribuição restrita ao Norte e Nordeste brasileiro (MARSH et al., 1986) e é frequentemente afetada por interações antrópicas. A mesma foi estimada 41 no último censo em apenas 500 indivíduos para a costa brasileira e classificada pela União Internacional para a Conservação da Natureza – IUCN (2012) como vulnerável à extinção. As informações registradas para Sotalia guianensis representam um importante passo e contribuição ao Plano de Ação Nacional à espécie que é costeira, amplamente distribuída no Brasil e frequentemente atingida por interações com a pesca (ROSAS, 2011). O conhecimento da ocorrência de Tursiops truncatus, Kogia sima e Stenella clymene reportam os primeiros registros para tais espécies na costa maranhense, ampliando não só o número de espécies ocorrentes no Estado, mas também informações importantes acerca de sua distribuição e biologia, fundamentais para a construção de estratégias de conservação para esses organismos. Registros como o de Lontra longicaudis são fundamentais para a construção de estratégias de conservação para a espécie que é amplamente distribuída, mas que vêm perdendo seu habitat principalmente pela interferência humana e teve seu status de conservação classificado pela IUCN (2012) como “deficiente”. A amostra do único exemplar de L. longicaudis abordado nesse estudo foi obtido através da coleta de um espécime atropelado na rodovia MA 106, divisa entre o Pará e Maranhão, área de habitats em potencial para a espécie, mas com estudos inexistentes. A Biologia Molecular se apresenta como uma forte e eficiente ferramenta no que diz respeito à identificação de espécies, neste caso os mamíferos aquáticos, principalmente aqueles que em virtude do processo de decomposição perderam características morfológicas fundamentais ao reconhecimento das mesmas, como padrão de coloração, formato do corpo, entre outros, sendo a identificação possível apenas através de análises genéticas moleculares (BAKER et al., 1993; HOELZEL et al., 1993). A identificação molecular consiste em obter fragmentos com maior tamanho possível para comparação com sequencias de indivíduos da mesma espécie disponíveis no banco mundial de sequencias – GenBank (SHOLL et al., 2008; GRAVENA et al., 2008). Em cumprimento ao objetivo principal deste trabalho, os fragmentos obtidos pelo 42 sequenciamento do gene mitocondrial Cyt‐b embora não completos, foram satisfatórios no que se refere à identificação de espécies, uma vez que o gene 16S apresenta alto grau de conservação e, portanto, poderia, em alguns casos, não apresentar identificação ao nível específico, apontando apenas espécies mais relacionadas filogeneticamente ao gênero. 7. CONCLUSÃO ‐ A identificação molecular mostrou‐se um método eficiente e confiável no que se refere à identificação de espécies, mesmo aquelas em alto grau de decomposição; ‐ Tecidos rígidos como ossos e dentes e amostras conservadas em formol são fontes potenciais de material genético merecendo novos testes para obtenção dos mesmos com reagentes adequados à sua constituição; ‐ Os marcadores genéticos Citocromo b (CytB) e rDNA 16S (16S) apresentaram um desempenho satisfatório no que se refere a identificação de espécies; ‐ A identificação molecular apontou a ocorrência de sete espécies de mamíferos aquáticos, entre elas a baleia jubarte (Megaptera novaeangliae), o cachalote (Physeter macrocephalus), o golfinho nariz‐de‐garrafa (Tursiops truncatus), o golfinho clymene (Stenella clymene), o boto‐cinza (Sotalia guianensis), o peixe‐boi marinho (Trichechus manatus), a lontra neotropical (Lontra longicaudis), além do cachalote anão (Kogia sima) identificado morfologicamente; ‐ A ampla diversidade de mamíferos aquáticos no litoral maranhense, evidenciado pelos encalhes e identificados pela genética molecular revelou a necessidade de estratégias direcionadas para o maior conhecimento e manutenção destes organismos; 43 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALEIXO, A. Molecular systematics and the role of the ‘‘varzea’’–‘‘terra‐firme’’ ecotone in the diversification of xiphorhynchus woodcreepers (aves: dendrocolaptidae). Louisiana: The Auk 119 (3):621–640, 2002. ALMEIDA, Z. S.; ISAAC, V.; SANTOS, N. B. ; PAZ, A. C. Diagnóstico dos Sistemas de Produção Pesqueiros Artesanais do Litoral do Maranhão. 1. ed. São Luís: Editora UEMA, 2010. v. 1. 125 p. ALVITE, C.M.C. Indicadores populacionais e ecológicos de peixes‐bois‐marinhos (Trichechus manatus) em áreas de manguezais e marismas no litoral do Maranhão. 2008. 118 p. Dissertação (Mestrado em Sustentabilidade de Ecossistemas) – Universidade Federal do Maranhão, 2008. AVISE, J. C.; J. L. HAMRICK. Conservation genetics. Case histories from nature. Chapman & Hall, New York, NY. 1996. AVISE, J. C. Molecular Markers, Natural History and Evolution. Second Edition. Sinauer. Sunderland. 2004. 341 pp. ARNASON, U.; GULLBERG, A. Cytochrome b nucleotide sequences and the identification of five primary lineages of extant cetaceans. Mol. Biol. Evol. 13, 407–417. 1996. AU, WHITLOW. W.L. Echolocation: in Encyclopedia of Marine Mammals, eds. Perrin, W., Wursig, B. & Thewissen, J. G. M. (Academic, San Diego), 348 – 357 p. 2002. BAKER, C. S.; PERRY, J. L. A.; BANNISTER, M. T.; WEINRICH, R. B.; ABERNETHY, J.; CALAMBOKIDIS, J.; LIEN, R. H.; LAMBERTSEN, J.; URBAN RAMIREZ, 0. VASQUEZ, CLAPHAM, A. P. J. ; ALLING, S. J.; O’BRIEN; PALUMBI, S. R. Abundant mitochondrial DNA variation and world‐wide population structure in humpback whales. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 9023239‐ 8243. 1993. BAKER, C. S.; F. CIPRIANO, A. S.; PALUMBI, S. R. Molecular genetic identification of whale and dolphin products from commercial markets in Korea and Japan. Mol. Ecol. 5:671–685. 1996. BANGUERA‐HINESTROZA, E.; CARDENAS, M.; RUı´Z‐GARCı´A, H.; MARMONTEL, M.; GAITAN, E.; VASQUEZ, R.; GARCı´A‐VALLEJO, F. Molecular identification of evolutionarily significant units in the Amazon River dolphin Inia sp. (Cetacea: Iniidae). Journal of Heredity 93:9–19. 2002. BANNISTER, John L. Baleen Whales (Mysticetes): in Encyclopedia of Marine Mammals, eds. Perrin, W., Wursig, B. & Thewissen, J. G. M. (Academic, San Diego), pp. 80–89. 2002. BASTIDA, R., D. RODRÍGUEZ, E. SECCHI & V. DA SILVA. Mamíferos acuáticos de Sudamérica y Antártida. Vazquez Vazquez Mazzini, Buenos Aires, 366 pp. 2007. 44 BERTRAM, G.C.L.; BERTRAM, C.K.R. The modern Sirenia: their distribution and status. Biol. J. Linn. Soc. 5, 297–338. 1973. BEST, R. C. The aquatic mammals and reptiles of the Amazon. In: H. Sioly. The Amazon, Limnology and Landscape Ecology of a mighty tropical river and its basin, Dr. W Junk Publisher, Netherlands, p. 371‐412. 1984. BOROBIA, M.; SICILIANO, S.; LODI, L.; HOEK, W. Distribution of the South American dolphin Sotalia fluviatilis. Canadian Journal of Zoology, 69:1025‐1039. 1991. BRASIL. Ministério da Marinha. Diretoria de Hidrografia e Navegação. Cartas de corrente de Maré – proximidade da baía de São Marcos e portos de São Luis e Itaqui. São Luis, 1972.27 p. BRASIL. (2012). Ministério dos transportes, BIT. Em Mapas brasileiros. <http://www2.transportes.gov.br/bit/01‐inicial/index.html>. Acesso em 03 de fevereiro de 2012. CABALLERO, S.; TRUJILLO, F.; VIANNA, J.A.; BARRIOS‐GARRIDO, H.; MONTIEL, M.G.; BELTRÁNPEDREROS, S.; MARMONTEL, M.; SANTOS, M.C.; ROSSI‐SANTOS, M.; SANTOS, F.R.; BAKER, C.S. Taxonomic status of the genus Sotalia: species level ranking for ‘‘tucuxi” (Sotalia fluviatilis) and ‘‘costero” (Sotalia guianensis) dolphins. Mar. Mammal Sci. 23, 358–
386. 2007. CANTANHEDE, A. M.; SILVA. V.M.; FARIAS. I.P.; HRBEK. T.; LAZZARINI. S.M.; ALVES‐
GOMES. J. Phylogeography and population genetics of the endangered Amazonian manatee, Trichechus inunguis, Natterer, 1883 (Mammalia, Sirenia). Molecular Ecology, 14, 401 ‐ 413. 2005. CARTER, S.K.; ROSAS, F.C.W. Biology and conservation of the giant otter Pteronura brasiliensis. Mammal Review 27:1‐26. 1997. CASSENS, I.; VICARIO, S.; WADDE, V. G.; BALCHOWSKY, H.; BALLE, D. V.; WANG, D. et al. Independent adaptation to riverine habitats allowed survival of ancient cetacean lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, p. 11343 ‐ 11347, 2000. CHEIDA, C.C.; NAKANO‐OLIVEIRA, E.; FUSCO‐COSTA, R.; ROCHA‐MENDES, F.; QUADROS, J. Ordem Carnivora. In: N.R. REIS; A.L. PERACCHI; W.A. PEDRO; I.P. LIMA (eds.). Mamíferos do Brasil. Londrina, Editora da Universidade Estadual de Londrina, p. 231‐275. 2006. CIPRIANO, F.; S. R. PALUMBI. Genetic tracking of a protected whale. Nature 397:307–308. 2006. 45 COIMBRA‐FILHO, A.F. Mamíferos ameaçados de extinção no Brasil. In: Academia Brasiliera de Ciências. Espécies da MEGADIVERSIDADE. Volume 1. Nº 1. Julho 2005 fauna brasileira ameaçada de extinção. pp.13‐98. Academia Brasiliera de Ciências, Rio de Janeiro. 1972. CUNHA, H. A.; DA SILVA, V. M. F.; LAILSON‐BRITO, J. J.; SANTOS, M. C. O.; FLORES, P. A. C.; MARTIN, A. R.; AZEVEDO, A. F.; FRAGOSO, A. B. L.; ZANELATTO, R. C.; SOLE´‐CAVA, A. M. Riverine and marine ecotypes of Sotalia fluviatilis are different species. Marine Biology 148:449–457. 2005. DI BENEDITTO, A. P. M.; RAMOS, R. M. A.; LIMA, N. R. W. Os golfinhos: origem, classificação, captura acidental, hábito alimentar. Ed. Cinco Continentes, Porto Alegre, Brasil, 152pp. 2001. DI BENEDITTO, A. P.; SICILIANO, S.; RAMOS, R. Cetáceos: Introdução à Biologia e a Metodologia Básica para o Desenvolvimento de Estudos. Fundação Oswaldo Cruz; Escola Nacional de Saúde Pública, Rio de Janeiro, 100p. ISBN: 978‐85‐88026‐48‐3. 2010. DOMNING, D. P. Distribution and Status of manatees in spp. In Brazil c. 1785‐1973. Biological Conservation. V. 21, p. 85‐87. 1981. DOMNING, D. P.; HAYEK, L. Interspecific and intraspecific morphological variation in manatees (Sirenia: Trichechidae). Marine Mammal Science, 2, 87 –141. 1986. EMMONS, L. H.; FEER, F. Neotropical rainforest mammals: A field guide. 2ª ed., Chicago, The University of Chicago Press, 307 p. 1997. ERBER, C.; MOREIRA, S.; FERNANDES, T.; CARNEIRO, A.; ALENCASTRO, P.; POLETTO, F.; FIGUEIREDO, L.; FORTES, R.; BERTONCINI, A.; GRANDO, A.; RINALDI, G.; FIGNA, V.; SILVA, E.; MORAES, E.; RAMOS, R. The monitoring of marine mammals on board seismic vessels as tool for the knowledge of the distribution of the Genus Stenella in the Brazilian coast. In: ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR CONSERVATION BIOLOGY, 19., 2005a, Brasília. Abstracts. Brasília: Universidade de Brasília. p.68. 2005a. FRANKHAM, R.; BALLOU, J. D.; BRISCOE, D. A. Fundamentos de Genética da Conservação. Ribeirão Preto: Editora SBG, 2008. GARCIA, D. M.; MARMONTEL, M.; ROSAS, F. C. W.; SANTOS, F.R. Conservation genetics of the giant otter (Pteronura brasiliensis (Zimmermann, 1780) (Carnivora, Mustelidae). Brazilian Journal of Biology, 67 (4, Suppl.), 819‐827. 2007. GARCIA‐RODRIGUEZ, A. I.; BOWEN, B. W.; DOMNING, D.; MIGNUCCI‐GIANNONI, A. A.; MARMONTEL, M.; MONTOYA‐OPINA, R. A.; MORALES‐VELA, B.; RUDIN, M.; BONDE, R. 46 K.; MCGUIRE, P. M. Phylogeography of the West Indian manatee (Tirchechus manatus): how many populations and how many taxa? Mol. Ecol. 7: 1137–1149. 1998. GERACI, J. R.; LOUNSBURY, V. J. Marine Mammals Ashore: A field guide for strandings. Galveston, Texas, Texas A&M Universty, 305 p. 1993. GRAVENA, W.; HRBEK, T.; DA SILVA, V.M.F.; FARIAS, I.P. Amazon River dolphin love fetishes: from folklore to molecular forensics. Marine Mammal Science, 24(4), 969–978. 2008. GUSMÃO, J.; LAZOSKI, C.; SOLÉ‐CAVA, A. M. Um sistema de diagnóstico molecular para a identificação de espécies comerciais de camarões marinhos brasileiros. CIVA 2002: Comunicaciones y Foros de Discusión. I. Blas, Zaragosa, Spain, pp 754‐764. 2002. GUSMÃO, J.; LAZOSKI, C.; SOLÉ‐CAVA, A. M. Populacion Genetic structure in Brazilian shrimp species (Farfantepenaeus spp. and Lithopenaeus schimidti Decapoda: Penaeide). Genet. Mol. Biol. 28, 165‐171. 2005. HETZEL, B.; LODI, L. Baleias, botos e golfinhos: guia de identificação para o Brasil. Rio de Janeiro: nova fronteira, 279 p. 1993. HOELZEL, A. R. Conservation genetics of whales and dolphins. Molecular Ecology 1, 119–
125. 1992. HOELZEL, A. R.; HALLEY, J.; OBRIEN, S. J.; CAMPAGNA, C.; ARNBOM, T.; LE BOEUF, B.; RALLS, K.; DOVER, G. A. Elephant seal genetic variation and the use of simulation models to investigate historical population bottlenecks. Journal of Heredity 84:443‐449. 1993. HOELZEL, A. R. Genetics and ecology of whales and dolphins. Annu. Ver. Ecol. Syst. 25:377–399. 1994. HUSAR, S. L. Trichechus inunguis – Mammalian Species. N. 72, p. 1‐4. 1977a. HUSAR, S. L. Trichechus senegalensis – Mammalian Species. N. 89, p. 1‐3. 1978a. HUSAR, S. L. Trichechus manatus – Mammalian Species. N. 93, p. 1‐5. 1978b. HUSAR, S. L. Dugong dugong – Mammalian Species. N. 88, p. 1‐7. 1978c. IGNACIO, B. L.; ABSHER, T.M.; LAZOSKI, C.; SOLÉ‐CAVA, A.M. Genetic evidence of the presence of two species of Crassostrea (Bivalvia: Ostreidae) on the coast of Brazil. Marine Biology, Londres. Vol. 136, no. 6, p. 987‐991. 2000. 47 IUCN. (2012): IUCN Red List of Threatened Species. Version 2012. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 06 February 2012. JEFFERSON, T. A.; LEATHERWOOD, S.; WEBBER, M. A. Marine mammals of the world. Rome: FAO, 320 p. 1993. JEFFERSON, T. A.; WEBBER, M. A.; PITMAN, R. L. Marine Mammals of the World: a Comprehensive Guide to their Identification. Academic Press, San Diego. 2008. LODI, L. Socorro para baleias e golfinhos encalhados. Ciência Hoje 26 (155); 68‐71. 1999. LUNA, F. O. Distribuição, status de conservação e aspectos tradicionais do peixe‐boi marinho (Trichechus manatus manatus) no litoral norte do Brasil. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, 122pp. 2001. LUNA, F. O.; PASSAVANTE, J. Z. O. Projeto Peixe‐boi/ICMBio: 30 anos de conservação de uma espécie ameaçada. Brasília: Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, ICMBio, 2010. 108 p. MAGALHÃES, F. A.; GARRI, R. G.; TOSI, C. H. Ossadas coletadas de um exemplar de baleia‐
jubarte (Megaptera novaeangliae) no litoral do Maranhão, Região Nordeste do Brasil. In: ENCONTRO NACIONAL SOBRE CONSERVAÇÃO E PESQUISA DE MAMÍFEROS AQUÁTICOS, 4., 2005, Itajaí‐Sc. Livro de Programação e Resumos. Itajaí‐SC: Universidade do Vale do Itajaí. p.11. 2005b. MAGALHÃES, F. A.; TOSI, C. H.; GARRI, R. G.; COSTA, A.; AMÂNCIO, A. C.; CHELLAPPA, S. Novos registros de encalhes de baleia‐de‐Bryde (Balaenoptera edeni) no litoral do Maranhão, Brazil. In: REUNIÓN INTERNACIONAL SOBRE EL ESTUDIO DE LOS MAMÍFEROS ACUÁTICOS SOMEMMA‐SOLAMAC, ÁREAS NATURALES PROTEGIDAS: UNA ESTRATEGIA DE CONSERVACIÓN, 1., 2006, Mérida, México. Resúmenes. Mérida: SOMEMMA‐
SOLAMAC. p.122. 2006a. MAGALHÃES, F. A.; GARRI, R. G.; TOSI, C. H.; SICILIANO, S.; CHELLAPPA, S. Primeiro registro confirmado de orca‐pigméia (Feresa attenuata) para o litoral norte do Brasil. In: REUNIÓN INTERNACIONAL SOBRE EL ESTUDIO DE LOS MAMÍFEROS ACUÁTICOS SOMEMMA‐SOLAMAC, ÁREAS NATURALES PROTEGIDAS: UNA ESTRATEGIA DE CONSERVACIÓN, 1., 2006, Mérida, México. Resúmenes. Mérida: SOMEMMA‐SOLAMAC. p.119. 2006b. MAGALHÃES, F. A.; SEVERO, M. M.; TOSI, C. H.; GARRI, R. G.; ZERBINI, A. N.; CHELLAPPA, S.; SILVA, F. J. L. Record of a dwarf minke whale (Balaenoptera acutorostrata) in northern Brazil. Journal of the Marine Biological Association of the UK‐ JMBA2 – Biodiversity Records, Cambridge, UK, n.5600. 2007a. Disponível em: <http:/ /www.mba.ac.uk/jmba/jmba2biodiversityrecords.php>. Acesso em: 26 janeiro 2012. 48 MAGALHÃES, F. A.; TOSI, C. H.; GARRI, R. G.; CHELLAPPA, S.; SILVA, F. L. Cetacean diversity on the Parnaiba Delta, Maranhão State, northeastern Brazil. Revista Brasileira de Biologia = Brazilian Journal of Biology,vol. 68, no. 3, p. 545‐551. 2008. MARMONTEL, M.; ROSAS, F. C. W.; CALVIMONTES, J. Seasonal movements and migratory routes of Amazonian Manatees Trichechus inunguis (Mammalia, Sirenia). In the Mamirauá and Amanã Sustainable Development Reserves, Western Brazilian Amazon. In prep, 2005. 2005. MARSH, H.; O’SHEA, T. J.; BEST, R. C. Research on Sirenians. AMBIO. A Journal of the Human Evironment. V. 15, n. 3, p. 177‐180. 1986. MARSH, H.; LEFEBVRE, L. W. Sirenian status and conservation efforts. Aquatics Mammals. V.20, n. 3, p. 155‐170. 1994. MEDEIROS, P. I. A. P. Encalhes de cetáceos ocorridos no período de 1984 a 2005 no litoral do Rio Grande do Norte, Brasil. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil, 2006. 57 p. PALMA, J. J. C. Geomorfologia da plataforma continental brasileira. In: CHAVES, H.A.F. (Ed.). Geomorfolgia da margem continental brasileira e das áreas oceânicas adjacentes: relatório final. Rio de Janeiro: PETROBRÁS/CENPES/DINTEP, 1979. 25‐52. (Série Projeto REMAC, v.7). PALAZZO Jr.; J. T.; BOTH, M. C. Guia dos Mamíferos marinhos do Brasil. Sagra, 1988. 158 p. 1988. PALUMBI, S. R.; MARTIN, A. P.; ROMANO, S.; MCMILAN, W. O.; STICE, L.; GRABOWSKI, G. The simple fool’s guide to PCR. University of Hawaii. 1991. PALUMBI, S. R.; BAKER, C. S. Contrasting populations structure from nuclear intron sequences and mtDNA or humpback whales. Mol. Biol. Evol. 11:426–435. 1994. PINEDO, M. C.; ROSAS, F. C. W.; MARMONTEL, M. Cetáceos e Pinipedes do Brasil. UNEP/FUA. 1992. QUADROS, J. Ordem Carnivora. In: REIS, N. R.; A. L. PERACHI; W. A. PEDRO; I. P. LIMA (Eds). Mamíferos do Brasil. Londrina: Nélio R. Reis. 2006. 231, 275p. REEVES, R. R.; LEATHERWOOD, S.; JEFFERSON, T. A.; CURRY, B. E. Amazonian manatees, Trichechus inunguis. in Peru: distribution, exploitation, and conservation status. Interciencia 21, 246–254. 1996. ROSAS, F. C. W.; COLARES, E. P.; COLARES, I. G.; DA SILVA, V. M. F. Mamíferos aquáticos da Amazônia. 405‐411 pp. in VAL, A. L., FIGLIUOLO, R. AND FELDBERG, E. (Eds) Bases 49 Científicas para Estratégias de Preservação e Desenvolvimento da Amazônia: Fatos e perspectivas. Vol. I Manaus, AM, Brazil. 1991. ROSAS, F.C.W. Biology, conservation and status of the Amazonian manatee Trichechus inunguis. Mammal. Rev. 24, 49–59. 1994. ROSAS, F.C.W. Ariranha Pteronura brasiliensis. Pages 265‐269 in CINTRA, R. (Ed.) Historia Natural, Ecologia e Conservação de Algumas Espécies de Plantas e Animais da Amazônia. EDUA/INPA, Manaus, Amazonas, Brasil. 2004. ROSAS, F. W. Boto‐cinza. In: Rocha‐Campos, C. C.; Câmara, I. G.; Pretto, D. J.. (Org.). Plano de Ação Nacional para a Conservação dos Mamíferos Aquáticos ‐ Pequenos Cetáceos. 1 ed. Brasília: Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, 2011, v. 1, p. 24‐26. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. SAMUELS, A.; TYACK, P. L. Flukeprints: A history of studying cetacean societies, p. 9 – 44. In: MANN, J.; CONNOR, R.C.; TYACK, P.L.; WHITEHEAD, H. (Ed.). Cetacean Societies, Chicago, University of Chicago Press, p. 433. 2000. SANGER, F.; NICKLEN S.; COULSO; A. R. DNA sequencing with chain‐terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.74: 5463‐5467, 1977. SANTOS, M. C. O. Novas Informações Sobre Cetáceos no Litoral Sul de São Paulo e Norte do Paraná com Base em Estudos Sobre Encalhes e na Aplicação da Técnica de Foto‐
identificação Individual de Sotalia fluviatilis (Cetacea, Delphinidae). MSc thesis, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil. 1999. SCHAEFF, C. M.; KRAUS, S. D.; BROWN, M. W.; WHITE, A. B. W. Assessment of the population structure of western North Atlantic right whales (Eubalaena glacialis) based on sighting and mtDNA data. Canadian Journal of Zoology 71:339‐ 345. 1993. SHOLL, T.G.C.; NASCIMENTO, F.F.; LEONCINI, O.; BONVICINO, C.R.; & SICILIANO, S. Taxonomic identification of dolphin love charms commercialized in the Amazonian region through the analysis of cytochrome b DNA. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 88(6), 1207–1210. 2008. SICILIANO, S.; EMIN‐LIMA N. R.; COSTA, A. F.; RODRIGUES, A. L. F.; MAGALHÃES, F. A.; TOSI, C. A.; GARRI, R. G.; SILVA, C. R.; SILVA, J. S. Jr. Revisão do conhecimento sobre os mamíferos aquáticos da costa norte do Brasil. Arquivos do Museu Nacional, Rio de Janeiro 66: 1–21. 2008. 50 SICILIANO S., MORENO I.B., SILVA E.D. & ALVES V.C. Baleias, botos e golfinhos na Bacia de Campos. Série Guias de Campo: Fauna Marinha da Bacia de Campos. São Miguel, Caxias do Sul. 100p. 2006. SICILIANO, S.; MOREIRA, L. M. P. Mamíferos marinhos do litoral maranhense, Brasil. In: REUNIÓN DE ESPECIALISTAS EN MAMÍFEROS ACUÁTICOS DE AMÉRICA DEL SUR, 5., 1992, Buenos Aires. Resúmenes. Argentina: Museo Argentino de Ciencias Naturales. p.62. 1992. SOLE‐CAVA, A. M.; VOREEN, C. M.; LEVY, J. A. Isozymic Differentiation of Two Sibling Species of Squatina (Chondrichthyes) in South Brazil. Comparative Biochemistry and Physiology. 75B: 355‐358. 1983. STRIDE, R. K. Diagnóstico da pesca artesanal marinha do Estado do Maranhão. São Luis: CORSUP/EDUFMA, 1992.v.2. TIMM, R.; ALBUJA, V.; CLAUSON, B. Ecology, distribution, harvest, and conservation of the Amazonian manatee Trichechus inunguis in Ecuador. Biotropica 18, 150–156. 1986. TOSI, C. H.; MAGALHÃES, F. A.; GARRI, R. G. Meat consumption of a Fraser sic] dolphin (Lagenodelphis hosei) stranded alive on the northern Brazilian coast. Journal of the Marine Biological Association of the UK‐ JMBA2 – Biodiversity Records, Cambridge, UK, n. 5969. 2008. Disponível em: <http://www. mba.ac.uk/jmba/jmba2biodiversityrecords.php?5969>. Acesso em: 31 jan. 2008. TOSI, C. H.; GARRI, R. G.; MAGALHÃES, F. A. Encalhes de cachalote (Physeter macrocephalus) (Linnaeus, 1758) no Estado do Maranhão‐Brasil. In: Reunión Internacional sobre el Estudio de los Mamíferos Acuáticos Somemma‐Solamac, Áreas Naturales Protegidas: Una Estrategia De Conservación, Mérida, Yucatán, México. Resúmenes. Mérida: SOMEMMA‐SOLAMAC 2006. p.101. WAPLES, R. S. Genetic methods for estimating the effective size of cetacean populations. Reports of the International Whaling Commission, Special Issue, 13, 279‐300. 1991. WOODWARD, B. L.; WINN, J. P.; FISH, F. E. Morphological Specializations of Baleen Whales Associated With Hydrodynamic Performance and Ecological Niche. (Ed.) Wiley InterScience 2006. Journal of Morphology 267:1284–1294. 2006. VIANNA, J. A.; BONDE, R. K.; CABALLERO, S.; GIRALDO, J. P.; LIMA, R. P.; CLARK, A.; MARMONTEL, M.; MORALES‐VELA, B.; DE SOUZA, M. J.; PARR, L.; RODRı´GUEZ‐LOPEZ, M. A.; MIGNUCCI‐GIANNONI, A. A.; POWELL, J. A.; SANTOS, F. R. Phylogeography, phylogeny, and hybridization in Trichechid sirenians: Implications for manatee conservation. Molecular Ecology 15:433–447. 2006.