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Transcrição

RODRIGO CAYÔ DA SILVA
Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp.
isoladas no Brasil e na Espanha
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
São Paulo
2012
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Disciplina de Infectologia - Universidade Federal de São
Paulo - UNIFESP.
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido
pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES).
São Paulo
2012
ii
DA SILVA, Rodrigo Cayô
Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter
spp. isolados no Brasil e na Espanha. Rodrigo Cayô da Silva - São Paulo, 2012.
xxvi, 239f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Dynamics of β-lactams resistance in clinical samples of
Acinetobacter spp. isolated in Brazil and Spain.
Key-words: Acinetobacter spp., β-lactâmicos, Brasil, Espanha, resistência aos
antimicrobianos, biologia molecular, carbapenems.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Alvaro Nagib Atallah
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros
São Paulo
2012
iv
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do
Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP.
Titulares:
Profa. Dra. Gertrudes Corção
Professora Associada III do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Básicas da
Saúde - ICBS e Vice-diretora do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal
do Rio Grande do Sul - UFRGS.
Profa. Dra. Marina Baquerizo Martinez
Professora Titular da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo USP e Diretora do Laboratório Clínico do Hospital Universitário da USP.
Prof. Dr. Nilton Erbet Lincopan Huenuman
Professor Doutor do Instituto de Ciências Biomédicas - ICB da Universidade de São Paulo USP.
Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Marra
Médico Infectologista Pesquisador da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São
Paulo - UNIFESP e Coordenador do Grupo de Suporte em Infecção do CTI-A do Hospital
Israelita Albert Einstein - HIAE.
Suplentes:
Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin
Professora Associada do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo e Presidente da Comissão de Controle de Infecção
Hospitalar do Hospital das Clínicas - HC-FMUSP.
Prof. Dr. Afonso Luís Barth
Professor Adjunto do Departamento de Análises da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS e Chefe do Serviço de Patologia Clínica do Hospital das
Clínicas de Porto Alegre.
v
Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora
e fazer um novo fim.
Francisco Cândido Xavier
vi
Dedico este trabalho aos meus amados pais, Evandro e Elizabeth, cujo amor incondicional me
fizeram sentir especial e amado em todos os momentos da minha vida. Obrigado por terem me
dado princípios e educação, e pelo incansável incentivo para que eu lutasse pelos meus sonhos.
vii
Agradeço as minhas queridas irmãs Cida, Cristina, Alessandra e Ana Paula (in memorian),
pelo apoio e carinho constantes, e junto dos nossos pais me mostraram o verdadeiro significado
da palavra família.
viii
Agradeço a DEUS, por dar sentido a minha vida, por ser a força em todos os momentos, e por
estar sempre ao meu lado, mesmo quando não me lembro dele.
ix
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Profa. Dra. Ana Cristina Gales pelo exemplo e determinação como
profissional e microbiologista. Pelos ensinamentos constantes que permitiram a conclusão dessa
tese. Pelo carinho e atenção que sempre teve comigo, por acreditar na minha capacidade e no
meu trabalho, possibilitando a minha ida ao exterior para continuar os meus estudos. Por ter me
confiado a supervisão do Laboratório ALERTA, permitindo o meu crescimento como
microbiologista. Por ter me mostrado que é possível trabalhar com razão e sensibilidade. Muito
obrigado por tudo. Sinto-me honrado por ter tido a sua orientação no meu doutorado.
Ao Prof. Dr. Luis Mártinez Mártinez, meu tutor no estágio sanduíche, por ter me ensinado
tanto, com muita atenção e paciência. Por ter me entregado um projeto tão pessoal, como foi o
projeto das PBPs, e por ter confiado sempre no meu trabalho e na minha capacidade. Por ter
feito eu me sentir parte do grupo durante os quase dois anos em que vivi na Espanha. Pelos
valiosos conselhos que sempre levarei comigo ao longo da minha vida acadêmica. Fico muito
feliz e honrado pela oportunidade de ter trabalhado com você. Além de tutor, sei que posso te
chamar de amigo.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari por ter acreditado na minha capacidade,
permitindo que começasse meu estagio no LEMC a muitos anos atrás. Por ter sido meu
orientador no meu mestrado e por ter me incentivado a fazer meu doutorado sanduíche. Sei que
sempre esteve torcendo pela minha vitória. Muito obrigado.
Aos meus queridos amigos de Santander Jorge, Mapi, Javi, Pepe, Carmen e Liset por terem
sido tão carinhosos e gentis comigo. Agradeço em especial a Jorge e a Mapi cujas palavras
x
dispensadas agora serão poucas para expressar toda a minha gratidão pelo tanto que me foi
oferecido por vocês dois. Além de amigos, vocês dois são exemplos de que as dificuldades da
vida são efêmeras quando se tem determinação e força de vontade. Fui tão feliz nos dois anos
em que passei junto a vocês meus amigos, conheci lugares tão bonitos cujas lembranças desses
momentos tão especiais estarão sempre comigo. Sei que não existe distancia, quando existe
amizade verdadeira.
Aos meus colegas do “Laboratorio de Investigación” do Hospital Universitário Marqués de
Valdecilla - HUMV Belén Ruiz, Belén Campo, Fabián Unda, Alícia Marques, María Romo,
Cristina Mirones, Elena Román, Patrícia Goicochea, Maria-Cruz Rodrigues e Alain Ocampo
Sosa pela alegre e agradável companhia. A Maria-Cruz muito obrigado por todo o conhecimento
transmitido que foram muito importantes no estudo das PBPs. Aprendi muito com você. A Belén
Ruiz, cujo carisma e personalidade fizeram do nosso convívio tão alegre e descontraído. Ao
querido grupo do “Cámara-café” pelos divertidos momentos que faziam nossas manhãs tão
agradáveis.
A todos os funcionários do “Servicio de Microbiología” do Hospital Universitário Marqués de
Valdecilla - HUMV por terem me recebido tão bem, sempre com um sorriso no rosto para todas
as minhas dúvidas. Em especial agradeço a todos os médicos e farmacêuticos microbiologistas
responsáveis por cada seção do “Servicio de Microbiología”: Prof. Dr. Jesus Aguero Balbin, Dr.
Jorge Calvo Montes, Dra. Maria Eliecer Cano Garcia, Dr. Carlos Fernandez Mazarrasa, Dra.
Celia Garcia de la Fuente, Dra. Maria Asuncion Rodriguez Feijoo, Dra. Maria Pia Roiz
Mesones, Dra. Ana Saez Lopez, Dr. Carlos Antonio Salas Venero, Dra. Maria Victoria San
Juan Bilbao, Dra. Raquel Viar Diego, Dra. Maria Antonia Bernal Rubio, Dr. Ricardo Salesa
Gutiérrez de Rozas e Dra. Begoña Perea; e também aos residentes: Carlos Ruiz de Alegria,
xi
Maitane Aranzamendi, Monica Gonzalo, Inmaculada Concepción Bernal, Omara Rivera e
Laura Guzman.
A todos os grupos de pesquisa na Espanha aos quais tive a oportunidade de trabalhar em
conjunto para a conclusão de alguns dos trabalhos aqui apresentados: Prof. Dr. Jordí Vila do
Hospital Clinic de Barcelona, Prof. Dr. Gérman Bou do Complejo Hospitalario Universitario A
Coruña de La Coruña, Prof. Dr. Juan A. Ayala do Centro de Biología Molecular Severo Ochoa
de Madrid, Prof. Dr. Álvaro Pascual e Prof. Dr. Felipe Fernández-Cuenca do Hospital Virgen
Macarena de Sevilha e Dra. Lucrecia Yañez San Segundo e Dra. Maria Aranzazu Bermúdez
Rodríguez do Servicio de Hematología do HUMV de Santander. Em especial agradeço a Paula
Espinal e a María Merino.
As minhas queridas amigas e colegas de laboratório Raquel Girardello e Cecilia Carvalhaes
pelo apoio e incentivo diários. Muito obrigado pela força e companheirismo e principalmente
pelos braços abertos com que me receberam na minha volta ao Brasil. A Raquel pela
personalidade forte e decidida, sempre disposta a me ajudar nos meus experimentos e na
supervisão do laboratório. A Cecilia pelo carinho e companheirismo e por ter sido pra mim o
Brasil na Espanha.
Aos meus queridos amigos Alinne Guimarães e André Doi pelos momentos tão alegres e
descontraídos que passamos juntos e com quem sei que posso contar sempre. A Alinne por ser
meu ombro amigo, sempre disposta a me escutar com um conselho de ânimo. Prezo muito a
nossa amizade. Ao André pelo profissionalismo e pelos conselhos. Obrigado por serem meus
amigos.
xii
As amigas Kelly Santiago e Fernanda Inoue pela amizade e pelos momentos diários
compartilhados. Já faz tanto tempo que começamos juntos no LEMC, bons momentos e
lembranças que certamente levaremos conosco. Obrigado pela força nos momentos de
dificuldade. Quando se está longe da família os amigos se tornam uma segunda família.
Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA Adriana Nicolletti, Adriana Pereira, Ana
Carolina Ramos, Bruna Nonato, Danilo Xavier, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda
Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg, Lucas
Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Rafael Affini e Talita Barone pela agradável e
divertida convivência, pelos conhecimentos divididos e as experiências compartilhadas. Obrigado
por me aguentarem diariamente na supervisão do laboratório. Em especial agradeço as minhas
co-orientandas Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Juliana Provasi e Lygia Schandert,
por me permitirem transmitir o pouco que sei e aprendi.
Ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, onde comecei e por quem tenho
um enorme carinho e muitas boas lembranças. Em especial agradeço a Rosana Capecce pela
ajuda, amizade e carinho constantes.
Aos “meus” acinetos que foram meu objeto de estudo e cuja diversidade e complexidade
taxonômica tornaram meus últimos quatro anos ocupados e felizes.
xiii
Sumário
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................................. XVII
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................................. XX
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ XXI
RESUMO .................................................................................................................................. XXII
ABSTRACT.............................................................................................................................. XXIV
1 - INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................................... 5
2.1 - Agente Etiológico .............................................................................................................. 5
2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter ............................... 15
2.3 - Epidemiologia das Infecções por Acinetobacter spp. ...................................................... 21
2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Acinetobacter spp. ............ 27
2.4.1 - Polimixinas ............................................................................................................... 27
2.4.2 - Tigeciclina ................................................................................................................ 29
2.4.3 - Ampicilina/Sulbactam ............................................................................................... 30
2.4.4 - Minociclina ............................................................................................................... 31
2.4.5 - Carbapenens ........................................................................................................... 32
2.5 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos por Acinetobacter spp. .......................... 36
2.5.1 - Produção de β-Lactamases ..................................................................................... 38
2.5.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa ................................................................ 50
2.5.3 - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ................................................................... 54
2.5.4 - Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ....................................... 57
3 - APRESENTAÇÃO .................................................................................................................. 61
4 - ARTIGOS CIENTÍFICOS ........................................................................................................ 62
4.1 - Analysis of Genes Encoding for Penicillin-Binding Proteins in Clinical Isolates of
Acinetobacter baumannii ......................................................................................................... 64
4.2 - OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in
Acinetobacter pittii in Spain ..................................................................................................... 93
4.3 - Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North
of Spain ................................................................................................................................. 119
xiv
4.4 - Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute
Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation ................... 132
4.5 - Low Prevalence of blaOXA-143 in Private Hospitals in Brazil............................................. 143
4.6 - Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in a Brazilian
Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil. 148
4.7 - Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil:
a case report.......................................................................................................................... 162
5 - DISCUSSÃO......................................................................................................................... 170
6 - CONCLUSÕES..................................................................................................................... 193
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 196
xv
Índice de Abreviaturas e Siglas
ABC - ATP-Binding Cassette
ADC - Acinetobacter-Derived Cephalosporinases
AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism
AIM - Australian Imipenemase
APACHE II - Acute Physiological and Chronic Health Evaluation II
ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
ATCC - American Type Culture Collection
C - Citosina
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase
CIP - Collection of l’Institut Pasteur
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
CTX-M - Cefotaximase
DBL - DBL numbering system
DHP-1 - Deidropeptidase-1
DMT - Drug-Metabolite Transporter
DNA - Ácido desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético
ESAC - Extended-Spectrum AmpC
βL - Extended Spectrum β-Lactamase
ESβ
EUA - Estados Unidos da América
G - Guanina
xvi
GES - Guiana Extended Spectrum
GIM - German Imipenemase
HSP - Hospital São Paulo
HUMV - Hospital Universitário Marqués de Valdecilla
ICS - Infecção de Corrente Sanguínea
IFIMAV - Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla
IJSEM - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
IMI - Imipenem-hydrolysing β-Lactamase
IMP - Imipenemase
IS - Insertion Sequence
KCTC - Korean Collection for Type Cultures
KHM - Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
LPS - Lipopolissacarídeo
LPSN - List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature
MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass
Spectrometry
MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion
Mβ
βL - Metalo-β-Lactamase
MDR - Multi-Drug Resistance
MFS - Major Facilitator Superfamily
MRSA - Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
NaCl - Cloreto de Sódio
NMC-A - Nonmetallocarbapenamase of Class A
xvii
OMP - Outer Membrane Protein
OXA - Oxacilinase
PAβ
βN - Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide
PBP - Penicillin-Binding Protein
PCR - Polymerase Chain Reaction
PDEE - Programa de Doutorado com Estágio no Exterior
PER - Pseudomonas Extended Resistant
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
PI - Ponto Isoelétrico
qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction
REIPI - Red Española de Investigación en Patología Infecciosa
RND - Resistance-Nodulation-Division
rRNA - RNA Ribossomal
SBSV - Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire
SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SFC - Serratia fonticola carbapenemase
SHV - Sulfhydryl-Variable β-Lactamase
SIM - Seul Imipenemase
SME - Serratia marcescens enzyme
SMR - Small Multidrug Resistance
SPM - São Paulo Metallo-β-Lactamase
TEM - Temoniera β-Lactamase
tRNA - RNA transportador
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
xviii
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
VEB - Vietnamese Extended-Spectrum β-lactamase
VIM - Verona Imipenemase
xix
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de
Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas, mas ainda não validadas até o
momento.................................................................................................................................................. 8
Tabela 2 - Genetic characterization of the 26 A. baumannii clinical isolates.......................................... 86
Tabela 3 - The penicillin-binding proteins (PBPs) of A. baumannii……………………………................. 87
Tabela 4 - Point mutations observed in the PBP genes in susceptible and resistant A. baumannii
strains to carbapenems........................................................................................................................... 89
Tabela 5 - Point mutations observed in the PBP genes of the 10 A. baumannii genomes and the
reference strain RUH-134........................................................................................................................ 91
Tabela 6 - MICs determined by broth microdilution for OXA-207-producing clinical isolate A. pittii
HUMV-1588, recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone, clone A. baylyi ADP1 harboring
the plasmid pETRA with blaOXA-24, and clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid pETRA with
blaOXA-207 are shown……………………………......................................................................................... 116
.
Tabela 7 - Kinetic parameters of purified β-lactamases OXA-24 and OXA-207……….......................... 117
Tabela 8 - ARDRA profile, source of infection and CHDL content according to Acinetobacter
species…………………………................................................................................................................. 128
Tabela 9 - Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the carbapenemase
coding genes ………………..………………………………........................................................................ 146
Tabela 10 - Frequency of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates in a Brazilian
teaching hospital during an 18-year period............................................................................................. 148
xx
Índice de Figuras
Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o
conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter .............................................. xxv
Figura 02 - Martinus W. Beijerinck no seu laboratório em 12 de maio de 1921.................................... 05
Figura 03 - Comparação das estruturas química dos ácidos oliovânicos, tienamicina e dos
carbapenens........................................................................................................................................... 34
Figura 04 - Estrutura da parede celular, mecanismos de resistências aos β-lactâmicos em
Acinetobacter spp. e principais proteínas envolvidas........................................................................... 37
Figura 5 - Identification of the conserved motifs in the consensus sequences encoded by the HMM
PBP genes of A. baumannii genomes used for the classification of PBPs, according to the work of
Sauvage et al……………………………………………………………………………………………........... 92
Figura 6 - Alignment of the amino acid sequences of the OXA-24 and its variants (OXA-25, OXA-26,
OXA-72, OXA-139, OXA-143, OXA-160, OXA-182 and OXA-207)....................................................... 118
.
Figura 7 - Dendrogram of the 86 different Rep-PCR patterns obtained between the 603 A.
calcoaceticus-baumannii complex isolates during the period of 2004 to 2008…................................... 127
Figura 8 - Distribution of the 86 Acinetobacter spp. isolates showing different Rep-PCR patterns
according to ARDRA method……………………………………………………………………...…............. 130
Figura 9 - Distribution of the 603 Acinetobacter spp. isolates in the period of 2004 to 2008……….…. 131
xxi
Resumo
Durante mais de quatro décadas o gênero Acinetobacter sofreu com as constantes modificações
na sua taxonomia o que atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies pertencentes a
esse gênero. Atualmente o gênero Acinetobacter compreende 33 espécies descritas e mais 28
grupos genômicos aguardando uma posição taxonômica definitiva em relação a sua
nomenclatura. Dentre essas espécies destacam-se o complexo A. calcoaceticus-baumannii
devido a sua importância clínica, principalmente aquela que é um dos mais importantes
patógenos da atualidade, A. baumannii. Devido a fenótipo de multirresistência apresentado pelos
isolados de A. baumannii, os carbapenens são uma das poucas opções no limitado arsenal
terapêutico para o tratamento de infecções causadas por esses micro-organismos. Entretanto,
surtos causados por cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens tem se tornado um
problema mundial. A erradicação das cepas de A. baumannii no ambiente hospitalar é difícil, pois
uma vez que clones multirresistentes se estabelecem nesse nicho, eles se tornam endêmicos.
Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens em A. baumannii, somente a produção
de β-lactamases tem sido estudada com maior frequência. Embora se saiba que o principal
grupo de carbapenemases produzidas por isolados de A. baumannii seja o grupo das
oxacilinases, que hidrolisam fracamente os carbapenens, esse fato reforça a hipótese de que
outros mecanismos poderiam estar contribuindo nesse fenótipo. Sendo assim, os artigos aqui
apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas
de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Artigo científico 1: Ainda é limitada as
informações sobre o papel das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) na resistência aos βlactâmicos em Acinetobacter baumannii. Este estudo teve como objetivo determinar as
sequências de nucleotídeos dos genes que codificam as PBPs em A. baumannii e analisar as
variações alélicas nesses genes em isolados sensíveis ou resistentes aos β-lactâmicos. Sete
genes de PBPs e um gene codificador de uma transglicosilase monofuncional (MGT) foram
identificadas nos seis genomas de A. baumannii sequenciados, codificadores de (i) quatro
proteínas de alto peso molecular (dois da classe A, PBP1a [ponA] e PBP1b [mrcB], e duas PBPs
de classe B, PBP2 [pbpA/mrdA] e PBP3 [ftsI]), (ii) três PBPs de baixo peso molecular (sendo
duas do Tipo-5, PBP5/6 [dacC] e PBP6b [dacD], e uma PBP do Tipo-7 (PBP7/8 [pbpG]), e (iii)
uma enzima monofuncional (MtgA [mtgA]). Regiões de grandes variações foram observadas,
embora a maior parte das alterações alélicas encontradas foram traduzidas em mutações
silenciosas. As sequências de aminoácidos dos genes das PBPs nos genomas e nos isolados
clínicos apresentaram ser altamente conservadas. As mutações encontradas nas sequencias de
aminoácidos estavam mais associadas aos perfis clonais, do que diretamente relacionadas
sensibilidade ou resistência aos β-lactâmicos. Artigo científico 2: Uma cepa de A. pittii
resistente aos carbapenems carreando um nova variante do cluster OXA-24 foi isolada em
Santander, localizada no norte da Espanha em 2008. O isolado também apresentava altos níveis
de resistência à penicilina e aos monobactâmicos, e era sensível às cefalosporinas de amplo
espectro. A análise da sequência de nucleotídeos confirmou a presença do gene blaOXA-207
codificador de uma nova carbapenemase, que apresenta uma mutação pontual Gly222Val em
relação à OXA-24. Clonagem e análise da cinética enzimática mostrou que a OXA-207
apresenta uma redução na eficiência catalítica contra carbapenems, mas aumentou
consideravelmente a especificidade para a oxacilina comparada com OXA-24, de acordo com os
dados anteriores da função estrutural dessa. Artigo científico 3: Oitenta e seis isolados clínicos
identificados pelo sistema MicroScan-WalkAway ® como complexo A. calcoaceticus-baumannii e
coletados durante o período 2004-2008 em um hospital universitário e terciário, teve sua
identificação confirmada por ARDRA. Apenas 44,2% dos isolados foram confirmados como
sendo A. baumannii carreando 12 tipos diferentes de gene blaOXA-51-like. Foram também
xxii
identificados oito diferentes espécies não-baumannii, sendo A. pittii (41,8%) a espécie mais
freqüente. Todos os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens carreavam os genes
blaOXA-24/40 ou blaOXA-51 associado a ISAba1. O gene blaOXA-58 foi encontrado em 19 dos 24
isolados de A. pittii pertencentes a um clone sensível aos carbapenems. Espécies emergentes
de Acinetobacter foram identificadas em nosso hospital e sua incidência real pode ser
subestimada pela identificação apenas por meio de sistemas automatizados. Artigo científico 4:
Acinetobacter junii é um patógeno humano raro associado a bacteremia em recém-nascidos e
pacientes de unidade de oncologia pediátrica. Apresentamos um caso de A. junii causando
bacteremia em um paciente adulto transplantado com leucemia. A correta identificação de
espécies de Acinetobacter pode esclarecer o real significado clínico das diferentes espécies
deste gênero. Artigo científico 5: Uma alta prevalência de blaOXA-23 e uma baixa prevalência de
blaOXA-143 foi encontrada entre os isolados de A. baumannii em hospitais privados brasileiros. A
prevalência das CHDLs pode variar de acordo com o clone disseminado em um hospital ou em
uma região geográfica específica e realçam a importância da aderência adequada às medidas
de controle de infecção hospitalar. Assim, estudos de vigilância nacionais são necessários para
analisar a prevalência real da CHDLs nos hospitais brasileiros. Artigo científico 6: O objetivo
deste estudo foi avaliar a dinâmica temporal de carbapenemases em uma coleção de isolados
de Acinetobacter spp coletados durante um período de 18 anos em um hospital brasileiro. Um
total de 215 isolados apresentando altas taxas de resistência aos carbapenenens foi analisado
no período de 1993 a 2010. A. baumannii foi responsável por 96,3% dos isolados. O gene blaOXA23 foi detectada em 36,7% (79/215) das amostras, seguido por blaOXA-143 (n=49, 22,7%), blaIMP-1
(n=24, 11,2%), blaIMP-10 (n=3, 1,4%) e blaOXA-72 (n=2, 0,9%). O primeiro isolado de A. baumannii
carreando gene blaOXA-143 foi identificado em 1995, sete anos antes da introdução do clone de A.
baumannii produtor de OXA-23 em 2002. Nós descrevemos pela primeira vez, a presença de
IMP-1 em A. pittii e A. bereziniae, e a OXA-58 em A. genomic species "Close to 13TU". A OXA143 demonstrou ser uma enzima antiga em nosso hospital. A dinâmica da produção
carbapenemase é complexa e varia drasticamente em função do tempo. Artigo científico 7:
Este estudo relata a ocorrência da OXA-231, uma nova variante do cluster OXA-143, em uma
cepa clínica de A. baumannii resistente aos carbapenens isolada em um hospital de terciário
universitário localizado no Sul do Brasil.
xxiii
Abstract
During four decades the genus Acinetobacter suffered with the constant changes in their
taxonomy which delayed understanding of the epidemiology of the species belonging to that
genus. Currently the genus Acinetobacter comprises 33 described species and 28 other genomic
groups awaiting a definitive taxonomic position in relation to its nomenclature. Among these
species highlights the A. calcoaceticus-baumannii complex due to its clinical importance,
especially one that is one of the most important pathogens of nowadays, A. baumannii. Because
of multidrug resistance phenotype displayed by isolates of A. baumannii, carbapenems are one of
the few limited therapeutic options for the treatment of infections caused by these microorganisms. However, outbreaks caused by strains of A. baumannii resistant to carbapenems
have become a global problem. The eradication of the A. baumannii strains from the hospital
environment is difficult, because once multiresistant clones are established in this niche, they
become endemic. Among the mechanisms of resistance to carbapenems in A. baumannii, only
the production of β-lactamases has been studied most frequently. Although it is known that the
main group of carbapenemases produced by A. baumannii isolates is the group of oxacilinases
that weakly hydrolyze carbapenems, this fact reinforces the hypothesis that other mechanisms
could be contributing in this phenotype. Thus, the articles presented here aimed to assess the
dynamics of resistance to β-lactams in clinical samples of Acinetobacter spp. isolated in Brazil
and Spain. Article 01: There is limited information on the role of penicillin-binding proteins
(PBPs) in the resistance of Acinetobacter baumannii to β-lactams. This study aimed to determine
the nucleotide sequences of the genes encoding for PBPs in A. baumannii and to analyze their
allelic variations in isolates susceptible or resistant to β -lactams. Seven PBP genes and one
monofunctional transglycosylase (MGT) gene were identified in the six genomes, encoding (i)
four high molecular mass proteins (two of class A, PBP1a [ponA] and PBP1b [mrcB], and two of
class B, PBP2 [pbpA/mrdA] and PBP3 [ftsI]), (ii) three low-molecular-mass proteins (two of Type5, PBP5/6 [dacC] and PBP6b [dacD], and one of Type-7 (PBP7/8 [pbpG]), and (iii) a
monofunctional enzyme (MtgA [mtgA]). Hotspot mutation regions were observed, although most
of the allelic changes found translated into silent mutations. The amino acid consensus
sequences corresponding to the PBP genes in the genomes and the clinical isolates were highly
conserved. The changes found in amino acid sequences were associated with concrete clonal
patterns but were not directly related to susceptibility or resistance to β-lactams. Article 2: A
carbapenem-resistant A. pittii strain carrying an OXA-24-like enzyme was isolated in Santander,
Northern Spain in 2008. The isolate also exhibited high level resistance to penicillins and
monobactams, and remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. Sequence
analysis confirmed the presence of the novel blaOXA-207 carbapenemase gene that presented a
point Gly222Val substitution with respect to that of OXA-24. Cloning and kinetic analysis showed
that OXA-207 presents a reduction in the catalytic efficiency against carbapenems and a
noticeably increased in specificity for oxacillin compared with OXA-24, in agreement with the
previous structural-function data of OXA-24. The mutation probably caused a misorientation of
carbapenems to gain access to the active center of the OXA-enzyme. Article 3: Eighty six no
repetitive clinical isolates identified by MicroScan-WalkAway® as A. calcoaceticus-baumannii
complex collected during 2004-2008 period in a tertiary teaching hospital, had their identification
confirmed by ARDRA. Only 44.2% of isolates was confirmed to be A. baumannii harboring 12
different blaOXA-51-like genes. Eight different non-baumannii species were also identified and A. pittii
(41.8%) was the most frequent among them. All carbapenem-resistant A. baumannii isolates
carried the blaOXA-24/40 or blaOXA-51-like-ISAba1 genes. The blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24
isolates of a carbapenem-susceptible A. pittii clone. Emerging Acinetobacter species have been
identified in our hospital and their actual incidence could be underestimated by using only
xxiv
automated identification systems. Article 4: Acinetobacter junii is a rare human pathogen
associated with bacteraemia in neonates and paediatric oncology patients. We present a case of
A. junii causing bacteraemia in an adult transplanted patient with leukaemia. The correct
identification of Acinetobacter species can highlight the clinical significance of the different
species of this genus. Article 5: A high prevalence of blaOXA-23 and a low prevalence of blaOXA-143
were found among A. baumannii isolates in private Brazilian hospitals. The prevalence of CHDLs
may vary according to the disseminated clone in a specific hospital or region and emphasize the
importance of appropriate adherence to infection control measures. Thus, wide national
surveillance studies are necessary to analyze the real prevalence of CHDLs in Brazilian hospitals.
Article 6: The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a
collection of Acinetobacter spp. isolates collected during an 18 year-period in a Brazilian hospital.
A 215 non-duplicate isolates showing high carbapenem resistance rates were analyzed from
1993 to 2010. A. baumannii was responsible for 96.3% of the isolates. The blaOXA-23 gene was
detected in 36.7% (79/215) of the isolates, followed by blaOXA-143 (n=49, 22.7%), blaIMP-1 (n=24,
11.2%), blaIMP-10 (n=3, 1.4%) and blaOXA-72 (n=2, 0.9%). The first A. baumannii isolate carrying the
blaOXA-143 gene was identified in 1995, seven years before the introduction of blaOXA-23 in 2002
and its widespread in the following 8 years of the study. We described for the first time the
presence of IMP-1 in A. pittii and A. bereziniae, and OXA-58 in A. genomic species “Close to
13TU”. The OXA-143 is an ancient enzyme. The dynamic of carbapenemase production is
complex and varied drastically according to time. Article 7: This study reports the occurrence of
OXA-231, a novel variant of OXA-143, in an A. baumannii clinical isolate (Ac-141 strain)
recovered from a tertiary teaching hospital located in Southern Brazil.
xxv
Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o
conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter. Figura obtida do artigo
de Ledermann (2007).
xxvi
Introdução
1 - Introdução
Até o final da década de 80 pouco ou quase nada se sabia a respeito das espécies
pertencentes ao gênero Acinetobacter spp., e ainda não havia sido descrita aquela que viria a
ser um dos mais importantes patógenos multirresistentes causadores de infecções nosocomiais
da atualidade, A. baumannii (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Passados pouco mais de 30
anos, A. baumannii é um dos micro-organismos mais importantes, prevalentes e bem adaptados
ao ambiente nosocomial (Higgins et al., 2010a). Isso se deve em parte, a sua incrível rapidez em
adquirir ou desenvolver resistência aos antimicrobianos, aliada ao seu já amplo espectro de
resistência intrínseca. Este fato é contrário à maioria das bactérias patogênicas tradicionais, que
parecem necessitar de um tempo maior para adquirirem mecanismos de resistência efetivos em
resposta à introdução de novas estratégias terapêuticas. Essa habilidade de adaptação
verificada em A. baumannii talvez seja uma consequência da sua exposição evolucionária, por
um longo período, na complexa e competitiva tarefa de manter-se no meio ambiente. Além disso,
o uso indiscriminado de antimicrobianos nas últimas décadas pode também ter contribuído para
o sucesso desse patógeno oportunista.
Nas últimas décadas, surtos causados por isolados de A. baumannii resistentes aos
carbapenens têm se tornado um problema mundial e infecções causadas por estes microorganismos estão associadas a uma maior morbi-mortalidade (Perez et al., 2007). Os últimos
dados do programa SENTRY para a América Latina demonstram que a taxa de resistência aos
carbapenens no Brasil aumentou de 12,6% entre 1997 a 1999 para 71,4% entre 2008 e 2010,
um aumento de quase 60% em apenas uma década (Gales et al., 2012). Os dados gerais da
América Latina também seguem essa mesma tendência, apresentando uma taxa de resistência
aos carbapenens > 66% (Gales et al., 2012).
1
Introdução
Quando se avalia as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por
cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens, o panorama é estarrecedor (Neonakis et
al., 2011). As polimixinas (B e E) geralmente constituem um dos únicos antimicrobianos
clinicamente eficazes. Entretanto, os seus efeitos colaterais aliados aos escassos dados da sua
farmacocinética e farmacodinâmica tem limitado o uso das polimixinas (Maragakis & Perl, 2008).
A tigeciclina somente é aprovada para o uso em infecções de pele e partes moles, pneumonia
comunitária e infecções intra-abdominais, restringindo o seu emprego terapêutico. Além disso,
estudos clínicos tem demonstrado cautela quanto ao uso desse antimicrobiano para o tratamento
de infecções causadas por A. baumannii, já que tem sido observado o surgimento de resistência
durante o tratamento clínico (Fishbain & Peleg, 2010). Já o sulbactam, que no Brasil é
comercializado na formulação ampicilina/sulbactam, é outra opção, mas com resultados
discrepantes quanto a sua real eficácia terapêutica (Fishbain & Peleg, 2010; Neonakis et al.,
2011). Embora a resistência aos carbapenens tenha aumentado a cada dia, e no Brasil os dados
sejam alarmantes, variando drasticamente de acordo com a região geográfica, o uso desses
antimicrobianos ainda é factível e importante, devido a sua boa tolerabilidade associado a efeitos
adversos mínimos e pela sua excelente concentração na grande maioria dos tecidos (Nicolau,
2008).
A produção de β-lactamases, principalmente as carbapenemases de classe D, é o
mecanismo de resistência mais estudado em A. baumannii, talvez por ser o mais “fácil” de ser
caracterizado, o que relegou os demais mecanismos a uma relativa obscuridade e
esquecimento, principalmente no que concerne ao estudo das PBPs. Esse grupo de proteínas de
membrana interna é alvo de todos os β-lactâmicos e um dos meios mais efetivos de aquisição
de resistência bacteriana a estes antimicrobianos, principalmente em Gram positivos (Sauvage
et al., 2008). Entretanto, assim como ocorre com outros bacilos Gram negativos de importância
clínica, raros são os estudos que se dedicaram a estudar tais proteínas em A. baumannii. Talvez
2
Introdução
o desinteresse em estudar esse grupo de proteínas esteja fundamentado na teoria de que o
papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos em bacilos Gram negativos teria uma
importância secundária frente aos demais mecanismos de resistência, uma vez que esses
mecanismos atuariam em fases anteriores à ligação do β-lactâmico às PBPs. Apesar disso, os
resultados obtidos indicam que a alteração ou modificação nas PBPs em A. baumannii pode
estar relacionada à resistência aos carbapenens nesse micro-organismo (Gehrlein et al., 1991;
Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Russo et al., 2009; Cayô et al., 2011b; Yun et
al., 2011).
Ainda que a produção de carbapenemases de classe D seja o mecanismo mais
prevalente em A. baumannii, essas enzimas hidrolisam fracamente os carbapenems e não
apresentam atividade frente às cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010). Além
disso, a grande maioria dos genes codificadores dessas β-lactamases necessita da presença de
sequências de inserção, que trazem um promotor forte, para aumentar a expressão enzimática
(Poirel et al., 2010). Tais observações somente aumentam a importância de outros mecanismos
adjuvantes na elevação das concentrações inibitórias mínimas, não somente para os
carbapenens, como também para os demais β-lactâmicos. Outro dado importante a ser
enfatizado é que, de algum modo ao longo da sua escala evolutiva, A. baumannii desenvolveu,
de maneira única, sequências de inserção em seu genoma de modo a reorganizar a expressão
de diferentes genes conforme a sua necessidade e com menor custo energético (Vallenet et al.,
2008). A presença de varias cópias nos genomas de A. baumannii sequenciados comprova a
importância dessas sequências de inserção para sua adaptação e sobrevivência.
A realidade de A. baumannii nos hospitais brasileiros e em diversas partes do mundo é
alarmante e tende a agravar-se, uma vez que o desenvolvimento de novas opções terapêuticas
não acompanha a rapidez e a evolução da resistência aos antimicrobianos expressa por esse
micro-organismo. O conhecimento do papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos e como
3
Introdução
funciona a interação entre esses compostos, poderia fornecer informações valiosas sobre
possíveis novos alvos terapêuticos e minimizar o panorama preocupante verificado nos nossos
isolados de A. baumannii.
Sendo assim, os artigos aqui apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência
aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha.
Obviamente, a complexidade e abrangência da epidemiologia que envolve esses microorganismos não permitiu responder todas as perguntas propostas, e com certeza outras tantas
surgiram a partir dos resultados obtidos. Mas com certeza fica a satisfação de ter contribuído,
ainda que pouco, com a caracterização do fascinante gênero Acinetobacter.
4
Revisão Bibliográfica
2 - Revisão Bibliográfica
2.1 - Agente Etiológico
Acinetobacter é uma palavra composta
derivado das palavras gregas “ακινητο” ou “akineto”
que significa não móvel e “bakter” de bactéria, e
juntas significam bacilo não móvel (Howard et al.,
2012). O gênero Acinetobacter tem uma longa e
complicada história de mudanças quanto a sua
taxonomia (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996;
Towner, 2009). A história deste gênero bacteriano
começou em 1911, na cidade holandesa de Delft,
onde o microbiologista e botânico holandês
Martinus Willem Beijerinck (16 de Março de 1851 a
1 de Janeiro de 1931) (Chung & Ferris, 1996),
mostrado na Figura 1, isolou e descreveu em uma
amostra
de
solo,
usando
meios
Figura 02. Martinus W. Beijerinck no
seu laboratório em 12 de maio de 1921.
Foto obtida dos arquivos da Delft
School of Microbiology.
mínimos
enriquecidos com acetato de cálcio (Beijerinck, 1911), o primeiro exemplar de um microorganismo que seria posteriormente chamado Acinetobacter (Towner, 2009; Howard et al.,
2012). Desde então, os membros desse gênero foram classificados durante décadas com
diferentes nomes, sendo alguns destes Mima polymorpha (De Bord, 1939), Bacterium anitratum
(Schaub & Hauber, 1948), Moraxella lwoffii (Piéchaud et al., 1956) e Micrococcus calcoaceticus
(Juni, 1978). A falta de um consenso e a confusão causada em decorrência disso resultou no
atraso em se estabelecer a importância clínica e a epidemiologia desses micro-organismos
(Towner, 2009).
5
Originalmente descrito como Micrococcus calco-aceticus, o gênero Acinetobacter
somente foi proposto depois de 43 anos por Brisou e Prevot em 1954, para diferenciá-lo dos
organismos móveis dentro do gênero Achromobacter (Brisou & Prevot, 1954). Entretanto, essa
denominação foi amplamente aceita somente em 1968, quando Baumann e colaboradores
(1968) publicaram um estudo no qual avaliaram diferentes micro-organismos como Micrococcus
calco-aceticus, Alcaligenes hemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginicola
e Bacterium anitratum (Baumann et al., 1968). Os autores concluíram que todos esses microorganismos pertenciam a um único gênero e não poderiam mais ser classificados como espécies
diferentes com base apenas nas suas características fenotípicas (Baumann et al., 1968). Em
1971, o “Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas” oficialmente
reconheceu o gênero Acinetobacter com base nos resultados do estudo de 1968 (Howard et al.,
2012). Apesar disso, até 1986, apenas as espécies Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter
lwoffii haviam sido descritas como pertencentes a esse gênero (Bouvet & Grimont, 1986).
Atualmente o gênero Acinetobacter é classificado no reino Bacteria, filo Proteobacteria,
classe Gammaproteobacteria, ordem Pseudomonadales e família Moraxellaceae (Rossau et al.,
1991; Vaneechoutte et al., 2011). Na mesma família ainda estão incluídos os gêneros Moraxella
spp., Oligella spp. e Psychrobacter spp. (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). As
espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter são cocobacilos Gram negativos, não
fermentadores da glicose, estritamente aeróbicos, não fastidiosos, motilidade negativa, catalase
positiva, oxidase negativa e com um conteúdo G + C no seu DNA variando de 39% a 47%
(Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012). Pelo menos
quatro espécies podem apresentar hemólise em ágar sangue: A. beijerinckii, A. gyllenbergii, A.
junii (positivo para 11 a 89% dos isolados) e A. haemolyticus (Vaneechoutte et al., 2011). No
teste de Gram, frequentemente esses micro-organismos podem apresentar dificuldade na etapa
de descoloração, podendo, portanto, serem identificados erroneamente como Gram positivos e
6
na maioria das vezes como cocos Gram lábeis (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996;
Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012).
Até o momento, foram descritas 27 espécies reconhecidas e validadas e mais seis
espécies propostas, mas ainda não reconhecidas pela comunidade internacional, como
mostrado na Tabela 01.
7
Tabela 1. Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas,
mas ainda não validadas até o momento.a
Dados Clínicos
Designação
Atual
Designação Prévia
A. calcoaceticus
A. genoespécie 1,
Micrococcus calcoaceticus, Moraxella
calcoacetica
+
3
A. baumannii
A. genoespécie 2,
Bacterium anitratum
++++
A. pittii
A. genoespécie 3,
Herellea vaginicola
+++
Cepa
Referência
Local de Isolamento
Etimologia
Referência
ATCC 23055
solo, humanos
O nome calcoaceticus se refere ao meio
usado por Beijeirink em 1911
enriquecido com acetato de cálcio para
o cultivo do primeiro isolado de
Acinetobacter spp.
Bouvet & Grimont,
1986
1
ATCC 19606
humanos, animais
Homenagem a Paul e Linda Baumann,
microbiologistas americanos
Bouvet & Grimont,
1986
1
ATCC 19004
humanos, solo e
vegetais
Homenagem a Tyrone Pitt, médico
microbiologista britânico
Nemec et al., 2011
Nemec et al., 2011
Frequência Significância
A. nosocomialis
A. genoespécie 13TU,
Acinetobacter anitratus
+++
1
RUH 2376
humanos
O nome nosocomialis deriva do latim
nosocomium que significa
hospital/enfermaria e do sufixo -alis
usado com sentido de pertencente ao
hospital
A. haemolyticus
A. genoespécie 4,
Achromobacter
haemolyticus
+
3
ATCC 17906
humanos
O nome haemolyticus vem do latim
haima que significa sangue e lutikos que
significa capaz de dissolver
Bouvet & Grimont,
1986
A. juniib
A. genoespécie 5,
Achromobacter
citrocaligenes
++
2
ATCC 17908
humanos, lodo
Homenagem a Elliot Juni,
microbiologista americano
Bouvet & Grimont,
1986
8
A. genoespécie 7,
Achromobacter
metalcaligenes
+
3
ATCC 17909
humanos, animais
Homenagem a John L. Johnson, médico
americano
Bouvet & Grimont,
1986
A. lwoffii
A. genoespécie 8/8TU,
Moraxella lwoffii
++
2
ATCC 15309
humanos, animais
Homenagem a André Michael Lwoff,
microbiologista francês
Bouvet & Grimont,
1986
A. bereziniae
A. genoespécie 10,
Achromobacter anitrata
++
2
ATCC 17924
humanos, animais,
esgoto
Homenagem a Eugénie BergogneBérézin, médica microbiologista
francesa
Nemec et al., 2010
A. guillouiae
A. genoespécie 11
A. johnsonii
++
2
ATCC 11171
humanos, leite, água,
Homenagem a Marie-Laure Joly-Guillou,
solo, esgoto, lodo
microbiologista francesa
ativado
Nemec et al., 2010
A. genoespécie 12
+
3
ATCC 43998
humanos, solo,
algodão
O nome radioresistens deriva do latim
radius que significa raio e do latim
resistens que significa resistente
(resistente ao raio), se referindo à alta
resistência aos raios gama verificada
nesta espécie
A. ursingiic
NA
+
3
LUH 3792
humanos
Homenagem a Jan Ursing,
bacteriologista e taxonomista sueco
Nemec et al., 2001
A. schindleri
NA
+
3
LUH 5832
humanos
Homenagem a Jiri Schindler,
microbiologista e taxonomista checo
Nemec et al., 2001
A. radioresistens
Nishimura et al., 1988
9
A. parvus
A. baylyi
NA
NA
+
-
3
4
humanos, animais
O nome parvus significa em latim
pequeno, se referindo ao tamanho
diminuto da colônia em meio de cultura
comparado as demais espécies do
gênero Acinetobacter spp.
Nemec et al., 2003
CIP 107474
solo
Homenagem a Ronald Bayly,
microbiologista australiano que
contribuiu com o conhecimento da
fisiologia do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
Homenagem a Jean Brisou,
microbiologista francês que contribuiu
com o conhecimento da taxonomia do
Anandlham et al., 2011
LUH 4616
A. brisouii
NA
-
4
DSM 18516
turfa (material vegetal
decomposto em
pântanos)
A. rudis
NA
-
4
DSM 24031
leite, água
O nome rudis em latim significa cru
(isolado de produtos não processados)
Vaz-Moreira et al.,
2011
A. soli
NA
-
4
B1
Solo, humanos
O nome soli que em latim significa solo
Kim et al., 2009
A. indicus
NA
-
4
DSM 25388T
Hexaclorociclohexano
– HCH (lixão)
O nome indicus se refere ao país de
isolamento, Índia
Mallotra et al., 2012
10
A.
antiviralisd
A. bouvetii
A. towneri
A. tandoii
A. tjernbergiae
A. gerneri
NA
NA
NA
NA
NA
NA
-
-
-
-
-
-
4
4
4
4
4
4
KCTC 0699BP
CIP 107468
CIP 107472
CIP 107469
CIP 107465
CIP 107464
planta do tabaco
O nome antiviralis que deriva do grego
anti que siginifica contra e do latim
viralis que siginifca pertecente ao virus
(antiviral)
Lee et al., 2009
lodo
Homenagem a Philippe Bouvet,
microbiologista francês que contribuiu
com o conhecimento da taxonomia do
Carr et al., 2003
lodo
Homenagem a Kevin Towner,
microbiologista britânico que contribuiu
com o conhecimento da genética do
Carr et al., 2003
lodo
Homenagem a Valter Tandoi,
bacteriologista italiano que contribuiu
com o conhecimento de Acinetobacter
em lodo
Carr et al., 2003
lodo
Homenagem a Ingela Tjernberg,
microbiologista e taxonomista sueca que
genética do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
lodo
Homenagem a Peter Gerner-Smidt,
microbiologista dinamarquês que
taxonomia do gênero Acinetobacter spp.
Carr et al., 2003
11
A. beijerinckii
NA
+
3
LUH 4759
humanos, animais,
solo e água
Homenagem a Martinus Beijeirink,
microbiologista holandês que descreveu
o primeiro isolado
Nemec et al., 2009
A. gyllenbergii
NA
+
3
RUH 422
humanos
Homenagem a Helge G. Gyllenberg,
bacteriologista e taxonomista finlandês
Nemec et al., 2009
Vaneechoutte et al.,
2008
A. venetianus
NA
-
4
ATCC 31011
água do mar
O nome venetianus vem da palavra
venetian que significa veneziano (uma
das cepas foi isolada da lagoa de
Veneza no Mar Adriático)
A. marinusd
NA
-
4
DSM 16312T
água do mar
O nome marinus que em latim significa
marinho (do oceano)
Yoon et al., 2007
A. seohaensisd
NA
-
4
DSM 16313T
água do mar
O nome seohaensis deriva do nome
Seohae, nome coreano do Mar Amarelo,
onde foi isolada a espécie
Yoon et al., 2007
A.oryzaed
NA
-
4
B23
arroz
O nome oryzae que em latim siginifca
arroz, onde foi isolada a primeira cepa
Chaudhary et al., 2012
Kang et al., 2011
Lee & Lee, 2010
oleivoransd
NA
-
4
KCTC 23045
arroz
O nome oleivorans deriva do latim
oleum que significa óleo e do latim
vorans que siginifica que devora (aquele
que devora óleo/hidrocarboneto)
A. kyonggiensisd
NA
-
4
JCM 17071
esgoto
O nome kyonggiensis se refere a
Kyonggi University
A.
12
a. Abreviações e símbolos: NA - não se aplica; (++++) muito frequente; (+++) frequente; (++) ocasionalmente; (+) raro; (-) nunca foi isolado em humanos;
(1) principal espécie patogênica ao homem; (2) raros casos de doença comprovada; (3) isolado de humanos, significância desconhecida; (4) não são
espécies patogênicas; ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, Md, USA; CIP - Collection de l’Institut Pasteur, Institut Pasteur, Paris,
França; LUH e RUH - Collection Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda; KCTC - Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Coréia do
Sul; DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen;
b. Recentemente foi demonstrado que Acinetobacter grimontii (Carr et al., 2003) na verdade se trata de Acinetobacter junii (Vaneechoutte et al., 2008).
c. Acinetobacter septicus que inicialmente foi descrita como sendo uma nova espécie (Kilic et al., 2008), teve sua classificação contestada pelo principal
grupo de taxonomia de Acinetobacter na atualidade (Nemec et al., 2008), que propuseram que estes isolados fossem considerados como sendo
Acinetobacter ursingii;
d. Novas espécies de Acinetobacter propostas, mas que ainda não foram validadas pela “List of new names and new combinations previously effectively,
but not validly, published” publicada periodicamente pelo “International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - IJSEM” (anteriormente
chamado International Journal of Systematic Bacteriology) (http://ijs.sgmjournals.org/) e, consequentemente, não foram ainda incluídas na “List of
Prokaryotic names with Standing in Nomenclature - LPSN” para o gênero Acinetobacter (http://www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html) do Professor
Jean Paul Marie Euzéby da “Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire (SBSV)” - França (Euzéby, 1997).
.
13
Outros 28 grupos genômicos ou genoespécies, que assim são classificados por
compreenderem diversas cepas em cada grupo, ainda aguardam uma posição taxonômica
definitiva em relação a sua nomenclatura (Towner, 2009). Dentre esses, encontram-se as
seguintes genoespécies mais conhecidas: A. genoespécie 6 - previamente Moraxella
glucidolytica (Bouvet & Grimont, 1986), A. genoespécie 13BJ/14TU (Bouvet & Jeanjean, 1989;
Tjernberg & Ursing, 1989), A. genoespécie 14BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie
15BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 16 - previamente Alcaligenes haemolyticus
(Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 17 (Bouvet & Jeanjean, 1989) e A. genoespécie
15TU (Tjernberg & Ursing, 1989). Recentemente, quatro genoespécies de importância clínica
tiveram a sua nomeclatura definida e validada, sendo classificadas em A. pittii (A. genoespécie
3), A. nosocomialis (A. genoespécie 13TU), A. bereziniae (A. genoespécie 10) e A. guillouiae (A.
genoespécie 11) (Nemec et al., 2010; Nemec et al., 2011), como mostrado na Tabela 01. Além
disso, ainda existem pelo menos 21 cepas de Acinetobacter spp. que não foram incluídas em
nenhuma espécie ou genoespécie descritas até o momento (Towner, 2009), tornando ainda mais
diverso e complexo esse grupo de micro-organismos.
Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A.
nosocomialis apresentam características fenotípicas muito similares, e por isso, foi proposto que
tais espécies fossem referidas como um único grupo em 1991, o chamado “complexo A.
calcoaceticus-baumannii” (Gerner-Smidt et al., 1991). Esta classificação foi defendida como
forma de facilitar e simplificar a identificação desses micro-organismos, aliada à necessidade
“questionável” de uma identificação mais criteriosa pelos laboratórios de rotina em microbiologia
das diferentes espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter. Desde então, tais espécies tem
sido referenciadas pelos laboratórios de rotina e por muitos estudos epidemiológicos publicados
em todo o mundo pelo nome “genérico” (Lin et al., 1998; l-Tawfiq & Al-Tawfiq & Mohandhas,
2007; Park et al., 2012). A praticidade do uso do termo “complexo A. calcoaceticus-baumannii” é
14
inegável, uma vez que a diferenciação precisa desses micro-organismos por provas bioquímicas
(Bouvet & Grimont, 1986) é difícil e trabalhosa, o que a torna inviável na rotina laboratorial, o
mesmo não se justifica nas publicações médicas-científicas. Sendo assim, cabe aos relatos de
infecções
causadas
pelos
membros
do
complexo
A.
calcoaceticus-baumannii,
a
responsabilidade em descrever e caracterizar as demais espécies do complexo (Towner, 2009),
sempre que essas forem identificadas, já que as mesmas acabam sendo ofuscadas pela espécie
mais importante e prevalente do grupo, A. baumannii. A partir dessas informações será possível
uma melhor compreensão a respeito da epidemiologia desses micro-organismos como
patógenos hospitalares.
2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter
Devido à complexidade e heterogeneidade das espécies pertencentes ao gênero
Acinetobacter, nenhum esquema de identificação foi ainda proposto que incorpore tanto a
praticidade e a confiabilidade exigida pela rotina laboratorial, como a abrangência que se espera
para um grupo tão dinâmico (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Sendo assim, a diferenciação das
espécies dentro do gênero Acinetobacter acaba sendo frequentemente problemática (Nowak &
Kur, 1996). Esse fator limitante é um sério obstáculo no conhecimento sobre a biologia,
patogenicidade ou ecologia dessas espécies por parte dos microbiologistas e clínicos. Uma
identificação incorreta pode ter, muitas vezes, consequências diretas no diagnóstico, tratamento
e controle de infecções causadas por esses micro-organismos.
Até o momento poucos métodos foram validados para uma identificação eficaz da
maioria das espécies, genoespécies e demais cepas sem classificação pertencentes ao gênero
Acinetobacter e, apesar dos avanços na identificação rápida de bactérias com base na
sequência de DNA, a técnica de hibridização DNA-DNA ainda é considerada a técnica padrãoouro para avaliar taxonomicamente esses micro-organismos (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Nessa
15
metodologia, genomas inteiros são comparados, e a semelhança é estimada através da
percentagem de ligação relativa ou pelas diferenças na estabilidade térmica dos híbridos.
Embora a técnica de hibridização DNA-DNA tenha um grande valor na taxonomia bacteriana, por
exemplo, a classificação taxonômica atual de Acinetobacter é baseada principalmente na
similaridade DNA-DNA, esta técnica também apresenta desvantagens (Dijkshoorn & Nemec,
2008). Primeiramente, diferentes resultados podem ser obtidos (Grimont et al., 1980), quando se
utiliza um dos cinco diferentes protocolos descritos para o gênero Acinetobacter (Bouvet &
Grimont, 1986; Tjernberg & Ursing, 1989; Nemec et al., 2001; Carr et al., 2003; Nemec et al.,
2003). Outra desvantagem é o fato da hibridização DNA-DNA ser muito laboriosa e exigir mão de
obra altamente qualificada, sendo, portanto, realizada somente em um número restrito de
laboratórios de taxonomia bacteriana (Dijkshoorn & Nemec, 2008).
Idealmente, para se avaliar uma nova espécie de um determinado gênero, o DNA da
mesma deve ser comparado aos DNAs de todas as espécies pertencente àquele gênero
específico. Os representantes das novas espécies têm de ser hibridados reciprocamente aos
pares. Devido as dificuldades da técnica de hibridização DNA-DNA, as novas linhagens somente
foram testadas para essa metodologia após terem apresentado uma similaridade interespécie
maior que 97% para o gene 16S rDNA (Stackebrandt & Goebel, 1994). Recentemente, essa
regra foi alterada, mudando o ponto de corte para uma faixa de similaridade de 98,7% a 99%
(Stackebrandt & Evers, 2002). Embora a hibridização DNA-DNA seja um método crucial para a
classificação atual das espécies dentro do gênero Acinetobacter, devido à sua complexidade
metodológica e do grande número de grupos de hibridização dentro do gênero, essa
metodologia dificilmente pode ser considerada como uma opção para o delineamento de novas
espécies adicionais, e muito menos como um método para identificação de espécies
(Stackebrandt et al., 2002).
16
Embora vários estudos tenham objetivado a criação de esquemas de identificação
confiáveis baseados na homologia de DNA (Ibrahim et al., 1997; Rainey et al., 1994), nas
características fenotípicas (Gerner-Smidt et al., 1991), no perfil de proteínas da membrana
externa (Ino & Nishimura, 1989) e na comparação do envelope celular (Alexander et al., 1984),
todos estes métodos produziram resultados inconsistentes. Inicialmente, Bouvet e Grimont
(1986) propuseram um sistema de 25 provas bioquímicas para identificar as primeiras 12
genoespécies descritas. Posteriormente, esse sistema foi melhorado através da inclusão de
novas genoespécies, todos previamente identificados e confirmados pela técnica de hibridização
DNA-DNA (Gerner-Smidt et al., 1991). Infelizmente, mesmo este sistema não é capaz de separar
as espécies estreitamente relacionadas do complexo A. calcoaceticus-baumannii (Gerner-Smidt
et al., 1991). As características fenotípicas expressas pelas diferentes espécies de Acinetobacter
spp. são influenciadas pelas condições nas quais elas são cultivadas (Gerner-Smidt et al., 1991).
Isso se deve ao fato de que os membros desse gênero apresentam uma grande quantidade de
genes dedicados às vias catabólicas conhecida como “arquipélago de diversidade catabólica”
que leva à adaptação à maioria dos substratos (Barbe et al., 2004). Desse modo, o uso de
auxanogramas, bateria de provas bioquímicas que tem como princípio a assimilação de fonte de
carbono e nitrogênio, tem uma utilidade limitada na diferenciação das espécies de Acinetobacter
spp. (La Scola et al., 2006).
Embora, o padrão ouro para a identificação da grande maioria das espécies bacterianas
tem sido o sequenciamento do gene codificador da porção 16S do rRNA, tal metodologia
também não é confiável para a identificação de Acinetobacter spp., devido a baixa natureza
polimórfica verificada nesse gene entre as genoespécies estreitamente relacionadas dentro do
gênero Acinetobacter (Ibrahim et al., 1997; La Scola et al., 2006). Devido a isso, identificações
errôneas podem ocorrer, como descrito por La Scola e colaboradores (2001) onde isolados de A.
baumannii foram identificados como A. calcoaceticus usando o gene 16S rRNA (La Scola et al.,
17
2006). Um teste alternativo ao sequenciamento do gene 16S rRNA, seria a amplificação do
mesmo gene pela reação em cadeia da polimerase - PCR (~1.500 bp) seguida da restrição com
cinco diferentes enzimas de restrição (CfoI, AluI, MboI, RsaI e MspI), sendo conhecido como
“Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis” - ARDRA (Vaneechoutte et al., 1995). Este teste
tem a vantagem de substituir o sequenciamento do gene 16S rRNA, apresentando os mesmos
resultados e de maneira mais rápida. Embora os resultados sejam na maioria das vezes
confiáveis, é recomendado a confirmação do resultado através do sequenciamento de outros
genes (Yamamoto et al., 1999; Krawczyk et al., 2002; La Scola et al., 2006), principalmente
quando espécies poucos frequentes são encontradas. Além disso, algumas das novas espécies
descritas ainda não têm o seu perfil de ARDRA conhecido, dificultando a sua comparação.
As dificuldades enfrentadas pelos microbiologistas na diferenciação e identificação das
diferentes espécies do gênero Acinetobacter usando as metodologias convencionais tanto
fenotípicas como moleculares, fizeram necessário a busca por novos genes candidatos à
identificação. Dois alvos foram propostos apresetando resultados significativos, sendo estes o
gene recA, codificador da recombinase A (Krawczyk et al., 2002), e o gene gyrB, codificador da
subunidade β da DNA girase (Yamamoto et al., 1999). Apesar dos resultados animadores, esses
dois alvos ainda carecem de um fator limitante quanto à descrição das sequências de
nucleotídeos obtidas de cepas referências para as novas espécies de Acinetobacter descritas
recentemente e depositadas no GenBank (La Scola et al., 2006).
Vários estudos têm demonstrado o uso do gene rpoB, codificador da porção β da RNA
polimerase, como sendo uma excelente ferramenta para a diferenciação e classificação
taxonômica de espécies pertencentes a gêneros cuja identificação é impossível ou inviável pelos
métodos convencionais (Drancourt & Raoult, 2002; Khamis et al., 2004). Sendo assim, La Scola
e colaboradores (2006) investigaram a aplicabilidade desse gene para a identificação e
diferenciação de 24 espécies e genoespécies diferentes de Acinetobacter. Os autores
18
encontraram quatro regiões altamente variáveis, incluindo duas zonas polimórficas internas ao
gene rpoB (zona 1, 350 bp e zona 2, 450 bp) e duas regiões intergênicas, cujos tamanhos
variam na primeira região de 301 bp a 310 bp e na segunda região de 86 bp a 177 bp (La Scola
et al., 2006). Tais regiões demonstraram ser um esquema factível e confiável para a identificação
das espécies de Acinetobacter, sendo atualmente aceita e recomendada como prova
confirmatória de espécie. Apesar disso, o pesadelo ainda continua para alguns raros isolados de
A. baumannii e entre as espécies A. grimontii/A. junii e A. baylyi, como descrito pelos próprios
autores (La Scola et al., 2006). Posteriormente, o mesmo grupo publicou um estudo validando a
técnica, incluindo um maior número de isolados e espécies de Acinetobacter spp. (Gundi et al.,
2009).
Além dessas metodologias, outras também foram propostas com o intuito de facilitar a
identificação das espécies de Acinetobacter spp., como por exemplo: análise do polimorfismo de
comprimento de fragmentos - AFLP (Janssen et al., 1996; Nemec et al., 2001), ribotipagem
(Gerner-Smidt et al., 1991), sequenciamento das regiões espaçadoras intergênicas da porção
16S-23S ribossomal (Chang et al., 2005), análise de restrição das regiões espaçadoras
intergênicas da porção 16S-23S ribossomal (Dolzani et al., 1995), análise dos perfis das
proteínas do envelope celular (Dijkshoorn et al., 1987; Dijkshoorn et al., 1990) e análise de
anticorpos monoclonais para antígeno O (Pantophlet et al., 2002). Embora, muitas das
metodologias anteriormente referenciadas apresentem resultados promissores, muitas delas não
conseguem diferenciar as quatro espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii, exatamente
as mais prevalentes no ambiente nosocomial, ou somente identificam as mesmas (Dijkshoorn et
al., 1987; Dolzani et al., 1995; Chang et al., 2005), mas não as demais espécies/genoespécies
do gênero. Além disso, as poucas metodologias que abrangem o maior número possível de
espécies e genoespécies não são aplicáveis à rotina laboratorial, devido ao custo elevado
(Gerner-Smidt et al., 1991; Yamamoto et al., 1999; Krawczyk et al., 2002; Chang et al., 2005; La
19
Scola et al., 2006) e/ou por serem muito laboriosas (Dijkshoorn et al., 1987; Ino & Nishimura,
1989; Dijkshoorn et al., 1990; Dolzani et al., 1995; Vaneechoutte et al., 1995; Janssen et al.,
1996; Nemec et al., 2001; Pantophlet et al., 2002).
Na tentativa de solucionar esse impasse, estudos tem tentado aplicar, aquela que talvez
seja a grande inovação na detecção de patógenos de importância clínica, a técnica de ionização
e dessorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF MS, do inglês “matrix
assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry”) na diferenciação das
espécies do gênero Acinetobacter spp. (Espinal et al., 2011; Alvarez-Buylla et al., 2012; Kempf et
al., 2012). A técnica de MALDI-TOF MS inova pela rapidez, acurácia e baixo custo na liberação
dos resultados e por apresentar excelentes resultados mesmo para gêneros de difícil
diferenciação na rotina laboratorial (Seng et al., 2009). Sendo assim, a técnica de MALDI-TOF
MS mostrou-se uma excelente ferramenta para a detecção de A. baumannii (Kempf et al.,
2012a) e na diferenciação das demais espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii, desde
que seja incluída no banco de dados do aparelho os espectros proteicos de A. nosocomialis
(Espinal et al., 2011). Entretanto, mesmo o MALDI-TOF MS não foi capaz de diferenciar as
demais espécies do gênero (Alvarez-Buylla et al., 2012).
Devido a todos os problemas aqui expostos referentes não somente a complexidade
taxonômica dentre do gênero Acinetobacter, como também em escolher qual a melhor
metodologia a ser usada para identificar as espécies pertencentes a esse gênero, proponho o
esquema a seguir a ser usado pela rotina laboratorial de microbiologia: primeiramente seria a
implementação da técnica de (i) MALDI-TOF MS (Espinal et al., 2011), uma vez que essa
metodologia identifica as três espécies mais prevalentes; quando o MALDI-TOF MS liberasse
resultados inconclusivos quanto a espécie, (ii) o sequenciamento do gene rpoB deveria ser
utilizado (La Scola et al., 2006; Gundi et al., 2009). Na impossibilidade em sequenciar o gene
rpoB, (iii) a técnica de ARDRA deveria ser utilizada (Vaneechoutte et al., 1995).
20
2.3 - Epidemiologia das Infecções por Acinetobacter spp.
Em geral, bactérias Gram negativas não toleram a dessecação tão bem quando
comparadas as bactérias Gram positivas e, a ocorrência daquelas na pele é normalmente
confinado a áreas úmidas (Hanlon, 2005). Entretanto, relatos demonstraram que isolados de
Acinetobacter spp. possuem capacidade de sobreviver durante longos períodos em superfícies
abióticas e persistem como contaminantes da pele humana (Seifert et al. 1997; Wendt et al.,
1997; Jawad et al., 1998). Inclusive, um estudo comprovou que A. calcoaceticus consegue
sobreviver até 13 dias em superfícies secas, ao contrário de outras bactérias Gram negativas,
que somente conseguiram permanecer viáveis por apenas três dias (Getchell-White et al., 1989).
Devido a essa capacidade, as espécies do gênero Acinetobacter têm demonstrado ser uma das
bactérias Gram negativas mais frequentemente envolvidas na contaminação das mãos dos
profissionais de saúde (Guenthner et al., 1987).
Sendo assim, não é surpresa que diferentes espécies de Acinetobacter spp. tenham sido
encontradas na pele de pelo menos um quarto dos indivíduos saudáveis do sexo masculino
(Forster & Daschner, 1998), em particular em regiões úmidas, tais como axilas, virilha e espaços
interdígitos (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Entretanto, sua presença na orofaringe e no
reto é rara (Forster & Daschner, 1998). Seifert e colaboradores (1997), em um interessante
estudo realizado na Alemanha, mostraram que 75% dos pacientes hospitalizados e não
infectados avaliados e 42,5% dos controles (pessoas saudáveis não internadas e profissionais
de laboratório) estavam colonizadas por diferentes espécies de Acinetobacter spp., e as taxas de
colonização aumentavam conforme o tempo de internação (Seifert et al., 1997). As espécies
mais frequentes encontradas no estudo foram A. lwoffii (47%), A. johnsonii (21%), A.
radioresistens (12%) e A. pittii (11%), sendo que as duas últimas espécies somente foram
encontradas em pacientes hospitalizados. Já as espécies A. baumannii e A. nosocomialis
somente foram isolados em 0,5% e 1% dos pacientes, respectivamente. Os autores concluíram
21
que talvez a pele fosse o habitat natural de algumas espécies de Acinetobacter spp.,
principalmente A. lwoffii, A. johnsonii e A. pittii e, talvez, A. radioresistens. Esses resultados
podem justificar o porquê da frequência com que essas espécies, em particular, foram
encontradas causando infecções de corrente sanguínea (ICS) relacionadas a cateter (Seifert et
al., 1994). Entretanto, Jawad e colaboradores (1998) mostraram que durante um surto causado
por A. baumannii em uma unidade de terapia intensiva (UTI), esse patógeno foi isolado com uma
alta frequência da pele e das fezes dos pacientes internados na mesma unidade (Jawad et al.,
1998). As taxas de colonização de pacientes por Acinetobacter spp., em situações de surto,
podem ser elevadas no trato respiratório (Mulin et al., 1997), na pele (Allen & Green, 1987), no
trato urinário (Mulin et al., 1995) e no trato gastrointestinal (Timsit et al., 1993), dependendo das
características específicas do surto (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Jawad e colaboradores
também verificaram que tanto cepas não endêmicas como cepas endêmicas são capazes de
sobreviver por longos períodos em superfícies secas, demonstrando uma característica inerente
a esses micro-organismos (Jawad et al., 1998). Por outro lado, cepas endêmicas eram mais
resistentes aos antimicrobianos que as cepas não endêmicas (Jawad et al., 1998).
As espécies do gênero Acinetobacter são frequentemente consideradas ubíquas, uma
vez que esses micro-organismos podem ser recuperados, usando meios de culturas
enriquecidos, a partir de quase todas as amostras provenientes de solo ou de água (Peleg et al.,
2008; Howard et al., 2012). Entretanto, esses achados contribuíram para que muitos equívocos
sobre a espécie A. baumannii se perpetuassem na literatura médica-científica (Fournier & Richet,
2006). Entre os equívocos, Towner (2009) ressalta os três principais: (i) A. baumannii é um
micro-organismo ubíquo ou altamente prevalente na natureza; (ii) pode ser facilmente
recuperado a partir água, solo e animais; e (iii) faz parte da microbiota comensal da pele e da
orofaringe de humanos. Enquanto estas declarações certamente se aplicam aos membros do
gênero Acinetobacter quando considerado como um todo, para a espécie A. baumannii e seus
22
parentes próximos (A. pittii e A. nosocomialis) isso não se aplica, já que não são organismos
ubíquos (Towner, 2009). Embora A. baumannii possa ser isolado em pacientes hospitalizados e
no ambiente hospitalar durante um período de surto (Jawad et al., 1998), esta espécie não
apresenta um habitat natural conhecido fora do hospital (Peleg et al., 2008), sendo, inclusive,
muito raramente isolada de solo, água ou de outras amostras ambientais (Towner, 2009). Na
verdade, mesmo no ambiente nosocomial, durante períodos em que não estejam acontecendo
surtos, raramente é isolado (Peleg et al., 2008; Towner, 2009). Apesar disso, cepas de
Acinetobacter spp. causadoras de surtos têm a capacidade de sobreviver mais tempo no
ambiente em comparação com cepas ATCCs, sendo demonstrado, inclusive, que as espécies do
complexo A. calcoaceticus-baumannii tendem a ser mais resistentes à dessecação do que as
espécies A. lwoffii, A. haemolyticus e A. junii (Jawad et al., 1996).
Dentre as 33 espécies descritas para o gênero Acinetobacter (Tabela 01), pelo menos
16 dessas já foram descritas causando infecções em humanos (Bouvet & Grimont, 1986;
Nishimura et al., 1988; Nemec et al., 2001; Nemec et al., 2003; Nemec et al., 2009; Nemec et al.,
2010; Nemec et al., 2011). Dentre essas, aquelas pertencentes ao complexo A. calcoaceticusbaumannii são de longe as espécies mais frequentemente isoladas em infecções em humanos,
sendo muitas vezes responsáveis por mais de 75% dos isolados de Acinetobacter spp. em
amostras clínicas (Henwood et al., 2002), e as que apresentam as maiores taxas de resistência
aos antimicrobianos (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Forster & Daschner, 1998; Hanlon,
2005; Peleg et al., 2008; Towner, 2009; Howard et al., 2012).
Das quatro espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii, A.
calcoaceticus apresentam uma epidemiologia distinta das outras três espécies, sendo um microorganismo majoritariamente ambiental e muito raramente é o agente etiológico de infecções em
humanos (Filka et al; 2000; Gopal et al., 2000; Hunt et al., 2000), ainda que cepas resistentes,
eventualmente, possam causar infecções (Merino et al., 2010). Sendo assim, as espécies A.
23
baumannii, A. pittii e A. nosocomialis são os principais patógenos causadores de infecções em
humanos (Koh et al., 2012), ainda que a real prevalência das duas últimas espécies acabe sendo
subestimada pelas dificuldades metodológicas em diferenciar essas espécies de A. baumannii,
como discutido anteriormente no item 2.2.
Embora A. baumannii seja a espécie mais prevalente e importante, os resultados obtidos
a partir de estudos epidemiológicos que fizeram uma identificação correta das espécies
pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii demonstraram que, dependendo do
hospital ou região geográfica, a frequência de isolamento de A. pittii e A. nosocomialis pode ser
igual ou até mesmo superior à de A. baumannii (Molina et al., 2010; Lee et al., 2011; Lai et al.,
2012), podendo essas duas espécies, inclusive serem capazes de causarem surtos (McDonald
et al., 1999; De Vegas et al., 2006). Apesar disso, a grande maioria das informações sobre a
epidemiologia das infecções causadas por Acinetobacter spp. está quase que exclusivamente
vinculada a A. baumannii, e por isso será abordada com mais ênfase no texto a partir deste
momento.
A. baumannii é um dos mais importantes patógenos oportunistas causadores de
infecções nosocomiais, e frequentemente está associado a surtos de difícil controle (BergogneBérézin & Towner, 1996), ocorrendo principalmente em UTIs (Young et al., 2007; MonterrubioVillar et al., 2009) e em unidades de queimados (Chim et al., 2007). Este micro-organismo está
relacionado a uma variedade de complicações clínicas, tais como, pneumonia (Chan et al., 2007;
Mai et al., 2007), sepse (Lee et al., 2007), infecções de pele (Ng et al., 2004) e meningite
(Rodriguez et al., 2008), especialmente em pacientes imunocomprometidos ou com doença de
base severa, geralmente levando a um aumento da morbidade e mortalidade (Urban et al.,
2003). Além disso, tais infecções têm sido frequentemente associadas com a contaminação de
equipamentos ou das mãos de profissionais de saúde (Chan et al., 2007).
24
Alguns fatores têm contribuído para o sucesso e longevidade desse micro-organismo em
causar surtos epidêmicos, sendo eles: (i) capacidade de A. baumannii em sobreviver em
superfícies secas, relacionado à sua reduzida necessidade nutricional mínima para crescer
(Wendt et al., 1997); (ii) habilidade em se manter viável em diferentes faixas de temperaturas e
pH (Jawad et al., 1998); e (iii) propensão em adquirir genes de resistência aos antimicrobianos
devido a sua permeabilidade para a troca de material genético (Higgins et al., 2010). Em um
estudo publicado por Wendt e colaboradores (1997) ficou demonstrada que a capacidade das
cepas de A. baumannii para sobreviver em superfícies secas varia muito e, surpreendentemente,
esta característica está relacionada com a fonte a partir do qual a cepa foi isolada. Cepas
isoladas a partir de fontes úmidas não sobrevivem tão bem como aquelas isoladas de fontes
secas (Wendt et al., 1997). A persistência de isolados de A. baumannii frente a condições
ambientais adversas é superior, inclusive, a outros dois grandes patógenos, Staphylococcus
aureus e Pseudomonas aeruginosa (Musa et al., 1990).
A erradicação de cepas de A. baumannii é extremamente difícil, principalmente quando
estas se tornam endêmicas em uma unidade hospitalar, devido, em parte, ao fato de que as
medidas habituais de controle de infecção hospitalar são muitas vezes insuficientes para deter a
sua transmissão (Perez et al., 2008; Towner, 2009). Entretanto, medidas eficazes, concentradas
no controle da contaminação ambiental podem ser bem sucedidas na erradicação de surtos
(Wilks et al., 2006). As principais medidas incluem: (i) o uso de um sistema de aspiração traqueal
fechado para todos os pacientes que receberam ventilação mecânica; (ii) descontaminação das
mãos usando álcool gel; (iii) estratégias bem definidas para a limpeza dos equipamentos e do
ambiente; e uma outra medida que tem sido utilizada, ainda que controversa, é (iv) o uso de
polimixina B inalatória para pacientes com evidência de pneumonia, leve a moderada, associada
à ventilação mecânica. A implementação do isolamento do paciente e/ou fechamento da unidade
hospitalar por períodos de até quatro semanas, nos casos onde as medidas acima citadas não
25
foram suficientes, podem auxiliar na contenção do surto (Denton et al., 2004; Pimentel et al.,
2005). É sabido que no âmbito hospitalar, o papel das mãos dos profissionais de saúde como
veículo de transmissão e disseminação de patógenos multirresistentes, principalmente A.
baumannii (Chan et al., 2007), é essencial. Sendo assim, um estudo conduzido por Borer e
colaboradores (2007) concluiu que a desinfecção diária de todo o corpo de pacientes
ingressados na UTI com solução de gluconato de clorexidina a 4%, após culturas (inguinal e
axilar) positivas de pele, reduziu significativamente a presença de A. baumannii desses
pacientes.
Infecções por A. baumannii tem sido associadas a climas quentes e úmidos (Berg et al.
1995; Anstey et al., 2002). Desde 1974, o “Centers for Disease Control and Prevention” - CDC
observou taxas mais elevadas de infecções nosocomiais por A. baumannii no verão do que em
outras estações do ano (Ramphal, 1979). McDonald e colaboradores (1999) avaliaram 3.447
infecções causadas por Acinetobacter em adultos e crianças internados em UTIs que foram
relatados ao CDC entre 1987 a 1996. Os autores verificaram um aumento de 50% entre os
meses de verão no hemisfério norte, de Julho a Outubro, do que nos demais meses do ano, e
associou esse aumento às temperaturas mais quentes e úmidas nessa época do ano, o que
teoricamente favoreceria o crescimento de Acinetobacter spp. em seus habitats naturais, tendo
os aparelhos de ar condicionado apontados como os responsáveis pela epidemia (MacDonald et
al., 1999). Entretanto, ao longo das duas últimas décadas, infecções por estes patógenos tem se
tornado cada vez mais um problema em países de climas temperados (Munoz-Price &
Weinstein, 2008). Como fatores de risco para colonização e infecção por A. baumannii temos:
internação prévia em UTI, cirurgia recente, cateter venoso central, traqueostomia, ventilação
mecânica, dieta parenteral, e terapia prévia com fluoroquinolonas, cefalosporinas de amplo
espectro ou carbapenens (Villegas & Hartstein, 2003; Munoz-Price & Weinstein, 2008; Towner,
2009).
26
Como forma de resumir a complexa epidemiologia de Acinetobacter spp., Towner (2009)
dividiu apropriadamente o gênero Acinetobacter em três grandes populações, sendo estas: (i)
isolados multirresistentes (MDR) que seriam encontrados principalmente em ambientes
nosocomiais e durante situações de surto, sendo capazes de colonizar e infectar pacientes
hospitalizados. Estes isolados compreenderiam principalmente A. baumannii, A. pittii e A.
nosocomialis; (ii) isolados sensíveis à maioria dos antimicrobianos e que fariam parte da flora
comensal normal da pele de humanos (estima-se que colonizem entre 25% a 70% dos
indivíduos) e animais, podendo também ser encontrados como parte da flora de deterioração de
muitos alimentos. Neste grupo entrariam as espécies A. johnsonii, A. lwoffii e A. radioresistens; e
(iii) isolados ambientais sensíveis aos antimicrobianos que poderiam ser encontrados no solo ou
em águas residuais, compreendendo principalmente as espécies A. calcoaceticus e A. johnsonii.
Os habitats naturais das demais espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter (Tabela I) são
ainda mal definidos, e necessitam ainda de estudos adicionais para melhor caracterização.
2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Acinetobacter spp.
2.4.1 - Polimixinas
Dentre as limitadas opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por
isolados de Acinetobacter spp. MDR, as polimixinas são os antimicrobianos que apresentam os
melhores resultados (Neonakis et al., 2011), com taxas de cura em torno de 75% a 87% (Kallel
et al.,. 2007; Falagas et al.,. 2010a). Embora as polimixinas tenham sido descobertas no final da
década de 40 (Stansly et al., 1947), apenas dois membros pertencentes a essa classe de
antimicrobianos estão disponíveis na prática clínica atualmente, sendo estes, a polimixina B e a
polimixina E, também conhecida como colistina (Velkov et al.,. 2010). Ambos os compostos são
metabólitos peptídicos secundários produzidos pela bactéria de solo Paenibacillus polymyxa,
compartilhando uma sequência comum primária e se diferenciando na posição 6, que é ocupada
27
por uma D-Phe na polimixina B e uma D-Leu na colistina. As polimixinas são detergentes
catiônicos que se ligam ao lipídio A do lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano perturbando a
membrana citoplasmática e, dessa forma, aumentando a permeabilidade da parede celular, com
consequente vazamento do conteúdo citoplasmático e finalmente lise celular.
As polimixinas foram abandonadas nas décadas de 1960 e 1970 devido a ocorrência
frequente de nefrotoxicidade e neurotoxicidade (Wolinsky & Hines, 1962; Koch-Weser et al.,
1970). Entretanto, com o surgimento de bacilos Gram negativos MDR e a falta de novas opções
terapêuticas, fizeram com que as polimixinas voltassem ao cenário clínico nos últimos anos.
Estudos recentes mostraram uma menor toxicidade, possivelmente devido ao uso de doses
menores, novas formulações e um monitoramento minucioso do transcurso clínico dos pacientes
que fazem uso desses antimicrobianos. Além disso, a neurotoxicidade associada ao tratamento
com polimixinas se tornou incomum (Falagas & Kasiakou, 2006b).
As polimixinas apresentam uma atividade bactericida contra isolados de A. baumannii, e
as taxas de resistência tem se mantido relativamente baixa, variando, em média, de 1,7% a 3%
(Gales et al., 2006; Souli et al., 2006; Gales et al., 2011). Apesar disso, Ko e colaboradores
(2007) relataram uma taxa de 27,9% de resistência entre os 214 isolados de A. baumannii
avaliados de dois hospitais sul-coreanos (Ko et al., 2007). Embora os mecanismos de resistência
as polimixinas ainda não estejam bem esclarecidos (Falagas et al., 2010b), já se sabe que
alterações na composição de LPS da parede celular bacteriana (Beceiro et al., 2011; Arroyo et
al., 2011), expressão reduzida de proteínas de membrana externa (OMPs) específicas (Vila et
al., 2007), redução do teor de lipídeos e redução na carga elétrica (Mg+2 e Ca+2) do envelope
celular (Soon et al., 2011), são fatores importantes neste fenótipo.
As polimixinas foram testadas extensivamente em combinação com carbapenens,
quinolonas e aminoglicosídeos contra isolados de A. baumannii MDR, com resultados
promissores (Pankuch et al., 2004; Yoon et al., 2004; Tan et al., 2007). Além disso, atenção
28
especial deve ser tomada na realização dos testes de sensibilidade às polimixinas, uma vez que
diferenças na composição de cátions dos meios de Mueller-Hinton disponíveis comercialmente
interferem na concentração inibitória mínima - CIM obtida para esses antimicrobianos (Girardello
et al., 2012), necessitando o ajustamento das concentrações dos cátions, quando necessário,
segundo as recomendações do “Clinical Laboratory Standards Institute” - CLSI (CLSI, 2012).
2.4.2 - Tigeciclina
A tigeciclina é o único membro da relativa nova classe de antimicrobianos, as
glicilciclinas (Chopra, 2001). Esse antimicrobiano semi-sintético é uma modificação da molécula
de minociclina e apresenta um amplo espectro de atividade, que inclui bactérias Gram positivas
(incluindo estafilococos resistentes à meticilina - MRSA e enterococos resistentes à vancomicina
- VRE) (Garrigós et al., 2011; Polidori et al., 2011), Gram negativas (incluindo enterobactérias
produtoras de β-lactamases de espectro ampliado - ESβL) (Silva-Sanchez et al., 2011) e
anaeróbios (Jump et al., 1996). A tigeciclina inibe a síntese proteica bacteriana através da
ligação à subunidade ribossomal 30S (Bergeron et al., 1996) e apresenta uma atividade
bacteriostática contra isolados de A. baumannii (Maragakis & Perl, 2008). Similarmente ao que
ocorre com as polimixinas, a concentração dos cátions no meio Mueller-Hinton também podem
interferir nos resultados obtidos nos testes de sensibilidade para tigeciclina (Cayô et al., 2010)
levando a resultados discrepantes quando comparados as metodologias de disco difusão e Etest
com a microdiluição em caldo (Fernández-Mazarrasa et al., 2009). Além disso, a tigeciclina pode
sofrer degradação por um processo de oxidação, que causa a perda de sua potência (Bradford
et al., 2005). Embora o uso de tigeciclina para o tratamento de infecções causadas por A.
baumannii seja “off-label”, as CIMs relativamente baixas (CIM50 0,5-1 mg/L e CIM90 1-2 mg/L)
obtidas em diferentes estudos tornaram o uso desse antimicrobiano atraente contra A. baumannii
(Reinert et al., 2007; Garrison et al., 2009). Entretanto, apesar da boa atividade in vitro contra
29
isolados de A. baumannii MDR, a eficácia clínica da tigeciclina continua a ser controversa
(Karageorgopoulos et al., 2008; Gallagher & Rouse, 2009). Além disso, a resistência a tigeciclina
em A. baumannii ocorre pela hiperexpressão de sistemas de efluxo, principalmente o sistema
AdeABC, presente no cromossomo desse micro-organismo (Peleg et al., 2007).
2.4.3 - Ampicilina/Sulbactam
Sulbactam é um inibidor de β-lactamase com uma estrutura semelhante aos βlactâmicos que possue atividade contra isolados de A. baumannii porque se liga à proteína
ligadora de penicilina 2 (PBP2) (Zavascki et al., 2010). Estudos tem demonstrado que sulbactam,
que no Brasil é comercializado juntamente com ampicilina, pode ser uma opção terapêutica para
o tratamento de infecções causadas por A. baumannii MDR com resultados satisfatórios (Levin
et al., 2003). Levin e colaboradores (2003) trataram 40 pacientes com infecções por A.
baumannii MDR com ampicilina/sulbactam, sendo a maioria dos casos ICS e pneumonia, e
observaram um taxa de cura de 67,5% (Levin et al., 2003). O mesmo grupo de pesquisa, em
outro estudo, compararam retrospectivamente pacientes com infecções por Acinetobacter spp.
resistentes aos carbapenens que haviam feito terapia com polimixina B e ampicilina/sulbactam
separadamente (Oliveira et al., 2008). Foi observado que ampicilina/sulbactam foi mais eficaz no
tratamento de A. baumannii MDR do que a polimixina B. Inclusive o uso de polimixina B foi
considerado no estudo como um fator independente de mortalidade, apresentando alto valor de
“Acute Physiological and Chronic Health Evaluation II” - APACHE II (Oliveira et al., 2008). Devido
aos resultados encorajadores, chegou-se se a conclusão de que para infecções causadas por
isolados de A. baumannii sensíveis à ampicilina/sulbactam, dever-se-ia priorizar esse
antimicrobiano como opção terapêutica (Neonakis et al., 2011). Além disso, foi demonstrado que
o custo do tratamento com ampicilina/sulbactam é significativamente menor quando comparado
com imipenem/cilastatina (1.500 dolares - imipenem-cilastatina vs 500 dolares -
30
ampicilina/sulbactam, p=0.004) (Jellison et al., 2001). As desvantagens no uso do sulbactam
seria o fato de que em muitos países, como o Brasil, somente existe a formulação 2:1 de
ampicilina/sulbactam, respectivamente, e as altas taxas de resistência verificadas em algumas
regiões geográficas, variando de 46,7% na Espanha (Fernández-Cuenca et al., 2004) a 70% em
Tawain (Yang et al., 2010).
2.4.4 - Minociclina
Introduzido no final da década de 60 (Redin, 1966), a minociclina, juntamente com a
doxiciclina, sofreram modificações na estrutura inicial da tetraciclina, e representam a segunda
geração desses antimicrobianos (Neonakis et al., 2011). Tais modificações permitiram a
minociclina apresentar características únicas, como uma meia-vida longa, melhor absorção oral,
e maior penetração tecidual (Nelson & Levy, 2011). Além disso, a minociclina mantém atividade
contra bactérias resistentes à tetraciclina. Assim como as demais tetraciclinas, seu mecanismo
de ação é a inibição da síntese proteica bacteriana, se ligando aos ribossomos e impedindo,
dessa forma, a ligação do aminoacil-tRNA (Chopra et al., 1992). A minociclina apresenta
atividade tanto contra bactérias Gram positivas como Gram negativas (Bishburg & Bishburg,
2009), e os mecanismos de resistência estão relacionados, na maioria das vezes, a dois grupos
de genes (tet e otr) que codificam sistemas de efluxo e proteínas protetoras ribossomais (Chopra
& Roberts, 2001). Tais grupos de genes podem conferir padrões distintos de resistência entre as
tetraciclinas (Bishburg & Bishburg, 2009). O uso da minociclina caiu em desuso devido à
introdução de agentes antimicrobianos mais potentes (Neonakis et al., 2011). Entretanto, devido
a sua concentração sérica/tecidual ideal e sua notável penetração no sistema nervoso central,
aliado ao aumento de infecções por A. baumannii MDR, esse antimicrobiano voltou a ganhar
destaque (Bishburg & Bishburg, 2009; Neonakis et al., 2011). Os relatos na literatura, ainda que
escassos, têm demonstrado resultados animadores para o tratamento de infecções de pele
31
(Griffith et al., 2008) e pneumonia (Wood et al., 2003; Griffith et al., 2008) causadas por A.
baumannii.
2.4.5 - Carbapenens
Os β-lactâmicos apresentam uma excelente eficácia, segurança e tolerabilidade no
tratamento de infecções bacterianas e, por isso, tem sido amplamente prescritos nos últimos 60
anos. Esses antimicrobianos são divididos em pelo menos cinco subclasses, sendo essas,
penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactâmicos e carbapenens. O mecanismo de ação
de todos os β-lactâmicos consiste na ligação desses antimicrobianos com as PBPs, localizadas
na membrana interna bacteriana, inibindo a síntese da parede celular, uma vez que as PBPs
catalisam a síntese e a remodelação do peptídeoglicano, principal componente da parede celular
(Sauvage et al., 2008; Llarrull et al., 2010). A inibição ocorre devido ao fato dos β-lactâmicos
mimetizarem o dipeptídeo D-Ala-D-Ala, sendo reconhecidos pelas PBPs, e dessa forma atuarem
como inibidores suicidas (Zapun et al., 2008). O sítio ativo serina das PBPs ataca o radical
carbonila do anel β-lactâmico, resultando na abertura do anel e na formação de um complexo
covalente enzima-acil. Uma vez ligado às PBPs, o β-lactâmico é hidrolisado muito lentamente,
impedindo efetivamente que as PBPs realizem novas reações de síntese da parede celular
bacteriana (Zapun et al., 2008).
Dentre as subclasses dos β-lactâmicos, os carbapenens são aos antimicrobianos mais
potentes e com o maior espectro de atividade antimicrobiana in vitro (Zhanel et al., 2007;
Nicolau, 2008; Papp-Wallace et al., 2011). A história desses antimicrobianos começa no final da
década de 60, quando o uso da penicilina na pratica clínica foi ameaçado pelo surgimento das βlactamases, e a busca por inibidores dessas enzimas se tornaram uma necessidade (PappWallace et al., 2011). Somente em 1976, os primeiros inibidores de β-lactamase foram
descobertos, e foram chamados de ácidos olivânicos (Figura 2A). Esses compostos eram
32
naturalmente produzidos pela bactéria Streptomyces clavuligerus, e apresentavam em suas
estruturas o que mais tarde constituiria espinha dorsal da molécula dos carbapenens (Brown et
al., 1976; Papp-Wallace et al., 2011). Entretanto, devido à instabilidade química e à pouca
penetração na célula bacteriana, esses compostos foram esquecidos, sendo substituídos por
dois outros inibidores mais potentes, o ácido clavulânico (isolado de S. clavuligerus) e a
tienamicina (isolado de Streptomyces cattleya), sendo a tienamicina (Figura 2B) considerada o
precursor dos carbapenens (Núñez et al., 2003; Papp-Wallace et al., 2011). A partir da molécula
da tienamicina derivou-se o imipenem (Figura 2C), que em 1985 se tornou o primeiro
carbapenem usado para o tratamento de infecções bacterianas (Miyadera et al., 1983; PappWallace et al., 2011). Posteriormente, outros carbapenens foram sendo desenvolvidos (Zhanel et
al., 2007; Nicolau, 2008), sendo meropenem (Figura 2E), ertapenem (Figura 2F) e doripenem
(Figura 2H) os mais importantes, pois constituem os compostos mais utilizados mundialmente.
Os primeiros carbapenens, tais como imipenem e biapenem, eram frequentemente
susceptíveis à degradação pela enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) localizada nos túbulos
renais e sendo, portanto, necessária a coadministração com a cilastatina ou com o betamiprom,
que são inibidores da DHP-1 (Zhanel et al., 2007). Os demais carbapenens desenvolvidos
posteriormente (meropenem, ertapenem e doripenem) apresentam uma modificação na sua
estrutura molecular, com a inserção de um radical 1β-Metil (Figura 2 - círculos em azul), que
protege o grupo carbonil β-lactâmico reduzindo assim a hidrólise catalisada pela DHP-1. Dessa
forma, os carbapenens posteriores ao imipenem e ao biapenem são administrados sem a
associação com a cilastatina (Hammond, 2004; Papp-Wallace et al., 2011).
33
A
B
C
D
E
F
H
G
Radical Trans-1-hidroxietil
Radical 1β
β -metil
Substituição meta-ácido benzoico
Anel β-lactâmico
Figura 02 - Comparação das estruturas química dos ácidos oliovânicos, tienamicina e dos
carbapenens. A - ácido oliovânico; B - tienamicina; C - imipenem, antigo MK-0787 (Horadam et
al., 1980); D - panipenem, antigo RS-533 (Miyadera et al., 1983); E - meropenem, antigo SM7338 (Sentochnik et al., 1989); F - ertapenem, antigo MK-0826 (Goldstein et al., 2000);G biapenem, antigo L-627 (Ubukata et al., 1996); H - doripenem, antigo S-4661 (Iso et al., 1996).
Estruturas químicas modificadas a partir da figura original obtidas de Papp-Wallace e
colaboradores (2011).
34
Imipenem,
meropenem
e
doripenem
apresentam
meias-vidas
in
vivo
de
aproximadamente 1 hora, enquanto ertapenem tem uma meia-vida de aproximadamente 4 horas
tornando-o adequado para uma única administração diária (Zhanel et al., 2007). Essa
característica única do ertapenem está relacionada à inclusão de uma substituição meta de um
radical de ácido benzoico (Figura 2F - círculo em lilás), que modificou as propriedades
antibacterianas e farmacológicas do ertapenem, fazendo com esse composto se ligasse mais
facilmente às proteínas do plasma humano (Hammond, 2004). Este aumento na ligação às
proteínas do plasma permite à administração de uma dose única diária de 1 g de ertapenem
comparado às três e quatro doses diárias usadas para o meropenem e imipenem,
respectivamente (Cunha, 2002).
Os carbapenens apresentam atividade contra muitas bactérias Gram positivas, Gram
negativas e anaeróbios (Zhanel et al., 2007; Papp-Wallace et al., 2011). Geralmente, imipenem,
panipenem e doripenem são potentes contra bactérias Gram positivas, enquanto meropenem,
biapenem, ertapenem e doripenem são ligeiramente mais potentes contra bactérias Gram
negativas (Papp-Wallace et al., 2011). Ertapenem é o carbapenem que apresenta o espectro
mais limitado, já que não possui atividade frente a P. aeruginosa e A. baumannii (Cunha, 2002).
Além disso, todos os carbapenens não apresentam atividade contra Enterococcus faecium,
Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) e Stenotrophomonas maltophilia (PappWallace et al., 2011; Nicolau, 2008).
Diferente do ocorre com muitas das demais subclasses de β-lactâmicos, os carbapenens
são estáveis frente à maioria das β-lactamases, incluindo as do tipo AmpC (item 2.5.1.2) e as
ESβLs (item 2.5.1.3) (Papp-Wallace et al., 2011). As β-lactamases que contém um resíduo de
serina no sítio ativo utilizam a reatividade química intrínseca dos β-lactâmicos para inativá-los. A
enzima associa-se não covalentemente ao anel β-lactâmico, e então o radical hidroxila livre do
resíduo de serina presente no sítio ativo da enzima ataca o anel β-lactâmico, formando uma
35
ligação covalente acil-éster. A hidrólise do éster formado libera a enzima ativa e o β-lactâmico
hidrolisado e inativado (Livermore, 1995). O radical trans-1-hidroxietil (Figura 2 - círculos em
verde), presente nos carbapenens, retira a molécula de água do sítio ativo da β-lactamase,
necessária para uma hidrólise enzimática eficiente, estabilizando a enzima acilada e inativa.
Entretanto, a capacidade dos carbapenens de se manterem estáveis frente as β-lactamases não
se estende às carbapenemases, entre elas as metalo-β-lactamases - MβLs (item 2.5.1.5) item e
as carbapenemases de classe D (item 2.5.1.6) (Poirel et al., 2010; Cornaglia et al., 2011). Apesar
disso, entre os carbapenens, o doripenem é o que apresenta melhor estabilidade frente às
carbapenemases; sendo hidrolisado de 2 a 150 vezes mais lentamente que o imipenem (PappWallace et al., 2011).
Embora os β-lactâmicos seja uma das classes mais importantes para o tratamento de
infecções por bactérias Gram negativas, nenhuma nova subclasse foi descrita nos últimos 30
anos, e o desenvolvimento de novos representantes diminuiu drasticamente (Chambers, 2006;
Poulakou & Giamarellou, 2008). Llarrull e colaboradores (2010) fizeram uma excelente e
pessimista discussão sobre o futuro dos β-lactâmicos, na qual, inclusive tentam entender o
descaso da indústria farmacêutica em relação a estes antimicrobianos: (i) a diminuição do
interesse pela indústria farmacêutica em todos os aspectos relacionados ao desenvolvimento
antibacteriano; (ii) a crença de que a interação estrutura-atividade para os β-lactâmicos chegou a
um nível de complexidade que o esforço/custo já não se justifica, e que (iii) o uso indiscriminado
dos β-lactâmicos durante décadas contribuiu para a seleção de diversos e efetivos mecanismos
de resistência (Llarrull et al., 2010).
2.5 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos por Acinetobacter spp.
Os β-lactâmicos são os agentes antimicrobianos mais frequentemente utilizados na
prática médica. A resistência a esses agentes limita drasticamente as opções terapêuticas e
36
aumenta a morbidade e os custos com o paciente (Falagas et al., 2006a). A resistência
bacteriana aos β-lactâmicos pode estar relacionada com qualquer uma das etapas envolvidas no
mecanismo de ação desses antimicrobianos, sendo quatro os mecanismos descritos: (i)
degradação enzimática do antimicrobiano pela produção de β-lactamases (Figura 04a); (ii) perda
ou diminuição da expressão das proteínas de membrana externa (Figura 04b); (iii)
hiperexpressão dos sistemas de efluxo (Figura 04c); e (iv) alteração da afinidade ou expressão
das PBPs (Figura 04d) (Llarrull et al., 2010).
4b - Alteração de proteínas de
Membrana Externas
Localização: Membrana Externa
Proteínas importantes: Omp25,
OmpW, CarO, 33-36 kDa,
OmpHMP, OprD-like
Meio Externo
Membrana
Externa
Espaço
periplásmico
4c - Hiperexpressão de Sistemas
de Efluxo
Localização: Membrana Externa
Sistemas envolvidos: AdeABC,
AdeDE, AdeFGH, Ade IJK
4d – Alteração do Sítio Alvo
Localização: Membrana Interna
Proteínas importantes: PBP1a,.
PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6,
PBP6b, PBP7/8, MtgA
Membrana
Interna
Citoplasma
4a - Produção de ß- lactamases
Localização: Espaço periplásmico
Enzimas importantes: OXA-23, OXA-24,
OXA-51, 58, OXA-143, IMP-like, VIM-like,
GIM-1, SIM-1, NDM-like, ADC
Figura 04 - Estrutura da parede celular, mecanismos de resistências aos β-lactâmicos em
Acinetobacter spp. e principais proteínas envolvidas. Figura modificada a partir da figura original
obtida de Munoz & Weinstein (2008).
37
Diferente das bactérias Gram positivas (Mainardi et al., 2008), nas quais a alteração das
PBPs é o principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos (Wu et al., 1994; Ligozzi et al.,
1996; Dowson et al., 1990), nos bacilos Gram negativos o mecanismo principal é a produção de
β-lactamases. A degradação enzimática em bactérias Gram positivas ocorre mais raramente,
com alguns relatos em isolados de Staphylococcus aureus (Livorsi et al., 2012) e Enterococcus
spp. (Chow et al., 1993). A constituição da parede celular entre esses dois grupos de bactérias
(Silhavy et al., 2010) tem um papel importante e essencial nessa diferença, elegendo a
predominância de um mecanismo de resistência sobre os demais. As bactérias Gram negativas
apresentam uma maior complexidade em sua parede celular (Silhavy et al., 2010) o que,
consequentemente, influenciará na diversidade dos mecanismos de resistência observados
nesses micro-organismos (Figura 04).
2.5.1 - Produção de β-Lactamases
As β-lactamases são enzimas que catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, tornandoos inativos (item 2.4.5). Os genes que as codificam podem estar localizados tanto no
cromossoma bacteriano como em plasmídeos (Bush et al., 1995). Algumas dessas enzimas
utilizam íons de zinco como cofatores enzimáticos, enquanto a grande maioria opera via
produção de ésteres de serina (Livermore, 1995). A quantidade de enzima produzida, a
habilidade dessa enzima em hidrolisar o β-lactâmico e a velocidade com que o antimicrobiano
penetra na célula são fatores que irão influenciar o grau da resistência. Essas enzimas são
produzidas por inúmeras espécies bacterianas, tanto Gram positivas como Gram negativas,
diferindo quanto as suas estruturas e localizações (Bush et al., 1995). Nas bactérias Gram
positivas, as β-lactamases são secretadas no meio extracelular e, portanto são menos eficientes
que as enzimas produzidas pelas bactérias Gram negativas, que se encontram estrategicamente
38
no espaço periplásmico, onde podem alcançar altas concentrações agindo de modo mais eficaz
sobre os β-lactâmicos, antes desses atingirem o seu sítio alvo, as PBPs (Livermore, 1993).
A primeira β-lactamase foi identificada em Escherichia coli, antes mesmo do
desenvolvimento da penicilina para uso na prática clínica (Abraham & Chain, 1988; Bradford,
2001). Isso é justificável, uma vez que muitas das classes de antimicrobianos utilizadas na
prática clínica são compostos derivados de metabólitos secundários previamente isolados de
micro-organismos ambientais (Barreiro et al., 2012). A penicilina, por exemplo, descoberta em
1928 pelo médico e bacteriologista escocês Sir Alexander Fleming, é um antimicrobiano natural
isolado do fungo Penicillium chrysogenum (ou Penicillium notatum) causador do bolor do pão
(Barreiro et al., 2012). A competição pela sobrevivência no meio ambiente é árdua e os microorganismos precisam produzir substâncias para se defenderem e conquistarem o seu próprio
nicho ecológico (Fredrickson & Stephanopoulos, 1981).
As β-lactamases são a principal causa de resistência aos β-lactâmicos em bacilos Gram
negativos e tem sido objeto de extensas investigações microbiológicas, bioquímicas e genéticas
(Bush et al., 1995). Embora, novos antimicrobianos resistentes à ação hidrolítica das βlactamases têm sido desenvolvidos, com o uso clínico de cada nova classe, novas β-lactamases
surgem causando resistência a estes novos antimicrobianos. Presumidamente, a pressão
seletiva do uso indiscriminado desses agentes no tratamento de infecções, tem selecionado
novas variantes de β-lactamases (Bradford, 2001). Embora novas β-lactamases vem sendo
descobertas a cada ano, a classificação proposta por Bush, Jacoby e Medeiros (1995) ainda é a
mais utilizada e aceita, combinando aspectos estruturais e funcionais das β-lactamases.
Posteriormente, os mesmos autores fizeram uma atualização da classificação, incluindo novas
β-lactamases que não eram contempladas na classificação anterior e criaram novos subgrupos
(Bush & Jacoby, 2010). Outra importante classificação é aquela descrita por Ambler (1980), na
39
qual as β-lactamases foram agrupadas em quatro classes (A, B, C e D), levando em
consideração as suas sequencias de aminoácidos.
2.5.1.2 - Produção de β -Lactamases de classe C - AmpC
As β-lactamases do tipo AmpC pertencem ao grupo 1 de Bush (Bush et al., 1995) e a
classe molecular C de Ambler (Ambler, 1980), sendo encontradas tanto no cromossomo
bacteriano como em plasmídeos (Jacoby, 2009; Philippon et al., 2002). As enzimas
cromossomais pertencentes a este grupo já foram descritas em uma variedade de microorganismos, principalmente nos membros do grupo CESP (Citrobacter freundii, Enterobacter
spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, P. aeruginosa e Morganella morganii), nos quais
essas β-lactamases são induzíveis (Bush et al., 1995; Jacoby, 2009), ou em micro-organismos
como E. coli e A. baumannii, nos quais a indução não ocorre (Jacoby, 2009).
Entre os membros do grupo CESP, existem três proteínas (AmpD, AmpG, e AmpR) que
estão relacionadas ao mecanismo de indução e regulação das β-lactamases cromossomais do
tipo AmpC, sendo necessário a presença de todos esses genes para a correta indução dessas
β-lactamases (Kuga et al., 2000). A presença de alguns β-lactâmicos como a cefoxitina e o
imipenem são fortes indutores, podendo aumentar de 100 a 600 vezes a expressão dessas βlactamases (Jones, 1998). A principal diferença entre indutores fortes e fracos é a afinidade com
que os diferentes β-lactâmicos tem pela PBP4 e/ou PBP7, que funcionam como sinalizadores
para o aumento da expressão do gene blaAmpC. O mecanismo de indução é extremamente
complexo e quando os β-lactâmicos indutores são retirados, a produção pode voltar a níveis
basais (Sanders et al., 1997).
A maioria das β-lactamases do tipo AmpC hidrolisam ureidopenicilinas (piperacilina),
cefamicinas (cefoxitina e cefotetan), e, a um nível inferior, as oximinocefalosporinas (ceftazidima,
cefotaxima e ceftriaxona) e os monobactâmicos (aztreonam) (Jacoby, 2009; Philippon et al.,
40
2002). As cefalosporinas zwiteriônicas (cefepima e cefpiroma), ou seja, moléculas que
apresentam pólos positivos e negativos, e os carbapenens não são hidrolisados por essas βlactamases (Jacoby, 2009; Philippon et al., 2002). Entretanto, surgiram variantes das
cefalosporinases do grupo 1 de Bush (CMY-10, CMY-19 e CMY-37) apresentando substituições
de aminoácidos ou inserções/deleções em quatro regiões específicas que localizadas próximos
ao sítio ativo da enzima, e devido a essas mutações passaram a hidrolisar as
oximinocefalosporinas, cefepima e, em alguns casos, até imipenem (Rodríguez-Martínez et al.,
2009). Sendo assim, Bush & Jacoby (2010), ao atualizarem a sua classificação das β-lactamases
de 1995 (Bush et al., 1995), decidiram dividir o grupo 1 de Bush em dois subgrupos (1 e 1e). No
subgrupo 1e foram incluídas as AmpCs que conferem sensibilidade reduzida para todas as
cefalosporinas e foram genericamente chamadas de AmpCs de espectro ampliado (ESAC “Extended-Spectrum AmpC”) (Bush & Jacoby, 2010).
Em 1990, foi descrito uma enzima localizada em um plasmídeo com 90% de similaridade
com o gene ampC de E. cloacae, dando início a um novo grupo de enzimas pertencentes a
classe C, conhecidas como AmpC plasmidiais (Papanicolaou et al., 1990). As AmpCs plasmidiais
já foram descritas em todo o mundo, sendo encontradas principalmente em K. pneumoniae, K.
oxytoca, Salmonella spp., Proteus mirabilis e E. coli. Essas enzimas apresentam o mesmo
espectro de ação das AmpCs cromossomais, podendo ser induzíveis ou não (Philippon et al.,
2002). Até o momento já foram descritas nove tipos de AmpCs plasmidiais: CFE-1, LAT-1, CMY
(92 variantes), FOX (10 variantes), MOX (oito variantes), ACT (16 variantes), ACC (cinco
variantes), MIR (cinco variantes) e DHA (oito variantes). Na literatura consta somente um relato
de DHA-like em isolados de A. baumannii na China, com uma alta frequência (19,4%) (Yin et al.,
2008)
No caso de A. baumannii, a expressão da AmpC cromossômica, que é intrínseca da
espécie, não é induzida pelo fato de que neste micro-organismo o gene ampR está ausente,
41
sendo, portanto, expressa em níveis basais, e, dessa maneira não confere resistência às
oximinocefalosporinas (Bou & Martínez-Beltrán, 2000). Entretanto, a resistência as
oximinocefalosporinas em A. baumannii está geralmente relacionada com a hiperprodução de
AmpC, quando a sequência de inserção (IS) ISAba1 está inserida a montante do gene,
conferindo um promotor forte (Boo et al., 2009b; Lin et al., 2010). Além disso, foi proposto uma
nomenclatura específica para as β-lactamases do tipo AmpC de A. baumannii, sendo sugerido o
nome ADC derivado de “Acinetobacter-derived cephalosporinases”, já que essas enzimas
apresentam um único ancestral comum e se distanciam substancialmente do outros genes ampC
descritos em outros micro-organismos (Hujer et al., 2005). Entre as enzimas ADC, algumas já
foram descritas como sendo ESAC, como as variantes ADC-33 (Rodríguez-Martínez et al., 2010)
e ADC-56 (Tian et al., 2011), ambas conferindo resistências às cefalosporinas de quarta
geração.
βL
2.5.1.3 - Produção de β -Lactamases de Espectro Ampliado - ESβ
As ESβLs pertencem ao grupo 2be de Bush (Bush et al., 1995) e a classe molecular A
de Ambler (Ambler, 1980). É um grupo heterogêneo e apresentam uma serina no sítio ativo,
representando o maior grupo de β-lactamases estudadas atualmente (Turner, 2005). Descritas
inicialmente em K. pneumoniae e E. coli, as ESβLs se disseminaram para as demais espécies
de enterobactérias, e, embora, sejam também encontradas em P. aeruginosa (Picão et al.,
2009), raramente são descritas em A. baumannii. Os genes que codificam as ESβLs estão
localizados em grandes plasmídeos que também podem codificar resistência aos
aminoglicosídeos, tetraciclina, cloranfenicol, e trimetoprim/sulfametoxazol, o que pode explicar o
fenótipo MDR verificado muitas vezes em bactérias produtoras dessas enzimas (Winokur et al.,
2001; Turner, 2005). As ESβLs conferem resistência às penicilinas, às cefalosporinas de amplo
espectro e ao aztreonam, mas não são ativas contra as cefamicinas e os carbapenens (Bradford,
42
2001; Turner, 2005). Além disso, a expansão do sítio ativo que permite a estas enzimas um
aumento da atividade contra as cefalosporinas de amplo espectro resulta no aumento da
sensibilidade aos inibidores de β-lactamases (Bradford, 2001; Turner, 2005).
Entre as ESβLs, as enzimas do tipo TEM (202 variantes) e SHV (167 variantes) são
derivadas das β-lactamases do tipo TEM-1, TEM-2 e SHV-1, que pertencem ao grupo 2b de
Bush (Bush et al., 1995) e apresentam espectro de atividade limitado, não sendo capazes de
hidrolisar oximinocefalosporinas. Estão incluídas entre as ESβLs também as enzimas do tipo
CTX-M (133 variantes), que hidrolisam preferencialmente cefotaxima, e apresentam pouca
similaridade (40%) com as enzimas do tipo TEM e SHV. A variante CTX-M-2 é a ESβL mais
prevalente e disseminada no Brasil (de Oliveira Garcia et al., 2008; Picão et al., 2009). As ESβLs
do tipo OXA hidrolisam muito bem a oxacilina ou cloxacilina, fato este que deu origem ao nome
do grupo, e pertencem ao grupo 2de de Bush (Bush et al, 1995) e a classe molecular D de
Ambler (Ambler, 1980). Essas enzimas não apresentam similaridade genética com as demais
ESβLs e são mais frequentes em P. aeruginosa (Poirel et al., 2010). Essas enzimas serão
abordadas com mais detalhe no item 2.5.1.6.
Embora as ESβLs sejam muito prevalentes nas enterobactérias, raros são os relatos de
A. baumannii carreando essas enzimas. Talvez isso se deva à dificuldade em se detectar essas
enzimas em isolados de A. baumannii pelos laboratórios de rotina, já que foram comprovados
resultados falsos positivos usando métodos fenotípicos (Beceiro et al., 2008). Até o momento, as
ESβLs mais frequentemente descritas em Acinetobacter spp. são: PER-1 (Turquia - Vahaboglu
et al., 2001; Bélgica - Naas et al., 2006; Romênia - Naas et al., 2007b; Bulgária - Strateva et al.,
2008; Índia - Litake et al., 2009; Coréia do Sul - Bae et al., 2011), VEB-1 (Bélgica - Naas et al.,
2006; França - Brasme et al., 2007; Hungria - Szábo et al., 2008; Argentina - Poirel et al., 2009),
seguida da CTX-M-15 (Haiti - Potron et al., 2011; Índia - Shakil & Khan, 2010). Além disso,
outras variantes também foram descritas em isolados de A. baumannii: SHV-5 (EUA - Naas et
43
al., 2007a), CTX-M-2 (Japão - Nagano et al., 2004), CTX-M-43 (Bolívia - Celenza et al., 2006),
TEM-92 (Itália - Edimiani et al., 2007), PER-2 (Argentina - Pasterán et al., 2006), PER-7(França Bonnin et al., 2011; Emirados Árabes - Opazo et al., 2012), GES-11 (França – Moubareck et al.,
2009; Bélgica - Bogaerts et al., 2010) GES-12 (Bélgica - Bogaerts et al., 2010) e GES-14 (França
- Bonnin et al., 2011).
2.5.1.4 - Produção de Carbapenemases de Classe A
A produção de carbapenemases é o meio mais efetivo para a aquisição de resistência
aos carbapenens em bacilos Gram negativos (Queenan & Bush, 2007). As serinocarbapenemases ou carbapenemases de classe A pertencem ao grupo 2f de Bush (Bush et al.,
1995) e a classe molecular A de Ambler (Ambler, 1980). Fazem parte desse grupo as enzimas
do tipo GES (22 variantes), KPC (11 variantes), SME (três variantes), IMI (duas variantes), NMCA e SFC-1 (Walther-Rasmussen & Høiby, 2007). Anteriormente, as enzimas do tipo GES foram
classificadas como sendo pertencentes a grupo das ESβLs (grupo 2be de Bush), entretanto
após a descrição de GES-2 em P. aeruginosa, que apresentava atividade contra imipenem, este
grupo foi transferido para o grupo 2f (Queenan & Bush, 2007). Outra enzima que foi incluída
neste grupo foi a SHV-38 (Poirel et al., 2003), que apresenta uma pequena atividade contra o
imipenem, diferindo-se apenas por uma substituição de aminoácidos da SHV-1 (WaltherRasmussen & Høiby, 2007).
Entre as carbapenemases de classe A, destacam-se as β-lactamases do tipo KPC
devido a sua disseminação mundial, principalmente em isolados de K. pneumoniae, o que
contribuiu drasticamente para o aumento das taxas de resistência aos carbapenens neste
patógeno e nas demais enterobactérias (Cuzon et al., 2010). Em A. baumannii, a prevalência de
carbapenemases de classe A é rara, quando comparado com as carbapenemases de classe B
(item 2.5.5) e de classe D (item 2.5.6). Até o momento foram descritas as seguintes
44
carbapenemases de classe A em A. baumannii: KPC-2, KPC-3, KPC-4 e KPC-10 (Porto Rico Robledo et al., 2010); GES-11 (França - Moubareck et al., 2009; Bélgica - Bogarerts et al., 2010)
e GES-12 e GES-14 (Bélgica - Bogarerts et al., 2010; França - Bonnin et al., 2011).
2.5.1.5 - Produção de Carbapenemases de Classe B - Mβ
βL
As MβLs são enzimas que inicialmente pertenciam ao grupo 3 de Bush (Bush et al.,
1995) e a classe molecular B de Ambler (Ambler, 1980). Após a atualização da classificação
funcional (Bush & Jacoby, 2010), esta passou a incluir três subgrupos (3a, 3b e 3c), equivalentes
as três subclasses moleculares (B1, B2 e B3), respectivamente. Os subgrupos 3a, 3b e 3c se
diferem não só pelo seu alto grau de diversidade de sequência de aminoácidos, mas também
nos seus sítios ativos. As MβLs das subclasses B1 e B3 contêm dois íons de zinco no sítio ativo,
enquanto os membros da subclasse B2 contém apenas um íon de zinco (Bush & Jacoby, 2010;
Cornaglia et al., 2011). Um valor ≥ 30% de diferença na sequência de aminoácidos é usado
como ponto de corte para a classificação de uma enzima como uma nova MβLs (Cornaglia et al.,
2007). Estão incluídas no subgrupo 3a (B1) as principais MβLs, sendo essas: IMP (38 variantes),
VIM (34 variantes), NDM (sete variantes), SPM-1, GIM-1, SIM-1, AIM-1 e KHM-1 (Queenan &
Bush, 2007; Cornaglia et al., 2011), sendo encontradas principalmente em isolados de P.
aeruginosa e A. baumannii (Bush & Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011). A maioria dessas
MβLs aquiridas são codificadas por cassetes gênicos localizados em elementos genéticos
móveis (integrons de classe 1), podendo estar inseridos tanto no cromossomo como no
plasmídeo bacteriano (Walsh et al., 2005). O subgrupo 3b (B2) contém um pequeno grupo de
MβLs que hidrolisam preferencialmente os carbapenens do que as penicilinas e as
cefalosporinas (Walsh et al., 2005; Bush & Jacoby, 2010). Neste subgrupo está incluída a MβL
cromossômica CphA de Aeromonas spp.. O grupo 3c (B3) incluí a MβL L1 que é intrínseca de
Stenotrophomonas maltophilia (Walsh et al., 2005; Bush & Jacoby, 2010).
45
As MβLs hidrolisam todos os β-lactâmicos comercialmente disponíveis, a exceção do
aztreonam (Walsh et al., 2005). Essas enzimas caracterizam-se por geralmente: (i) necessitarem
de dois íons divalentes, usualmente zinco, como co-fator para a atividade catalítica; (ii) por terem
a estrutura tridimensional semelhantes; e (iii) por apresentarem resíduos conservados, os quais
são responsáveis pela interação da enzima com cátions divalentes (Bush & Jacoby, 2010;
Cornaglia et al., 2011). Além disso, essas enzimas são inibidas pelo ácido etilenodiaminoacético
(EDTA) ou por compostos derivados do ácido tiolático (ácido mercaptopropiônico), não sofrendo
ação dos inibidores das serino-β-lactamases, como o ácido clavulânico (Walsh et al., 2005; Bush
& Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011).
Em um excelente estudo de revisão, Cornaglia e colaboradores (2011) relataram todas
as MβLs descritas em A. baumannii até o momento: IMP-1 (Japão), IMP-2 (Itália), IMP-4 (China),
IMP-5 (Portugal), IMP-8 (China), IMP-10 (Japão), VIM-1 (Grécia), VIM-2 (Coréia do Sul), VIM-3
(Tawain), VIM-4 (Grécia), VIM-11 (Tawain), SIM-1 (Coreia do Sul), NDM-1 (Índia) e NDM-2
(Emirados Árabes) (Cornaglia et al., 2011; Ghazawi et al., 2012). Além disso, diferentes MβLs
foram descritas em outras espécies de Acinetobacter spp.: IMP-1 em A. ursingii (Japão - Endo et
al., 2012), VIM-2 e SIM-1 em A. bereziniae (Coreia do Sul - Lee et al., 2010), IMP-4 em A. junii
(Austrália - Peleg et al., 2006), NDM-1 em A. lwoffii (China - Fu et al., 2012) e NDM-1 em A. pittii
(China - Fu et al., 2012).
2.5.1.6 - Produção de Carbapenemases de Classe D (CHDLs)
As β-Lactamases de classe D (Ambler, 1980), ou oxacilinases, apresentam
características tão diversas, que fazem dessas enzimas um grupo extremamente heterogêneo e
complexo (Poirel et al., 2010). Devido a isso, as oxacilinases são classificadas em três
subgrupos diferentes de Bush (Bush & Jacoby, 2010), sendo eles: (i) 2d - oxacilinases de
espectro restrito, presente em enterobactérias, e capaz de hidrolisar fortemente a
46
oxacilina/cloxacilina; (ii) 2de - oxacilinases do tipo ESβL (item 2.5.1.3), encontradas
principalmente em P. aeruginosa (integrons de classe 1), hidrolisam bem, ainda que de maneira
diferencial, as oximinocefalosporinas e cefepima; (iii) 2df - conhecidas como “CarbapenemHydrolyzing Class D β-Lactamase” (CHDLs), quase que exclusivamente restritas a A. baumannii,
não hidrolisam as oximinocefalosporinas e cefepima, e hidrolisam fracamente os carbapenens
(inferior às MβLs) (Bush & Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010). Embora anteriormente as
oxacilinases fossem definidas pela sua capacidade em hidrolisar oxacilina/cloxacilina mais
rapidamente que as benzilpenicilinas, com o surgimento de variantes apresentando essa
capacidade reduzida, atualmente se utiliza a hidrólise das aminopenicilinas e das
carboxipenicilinas como característica primordial desse grupo de β-Lactamases (Poirel et al.,
2010).
As oxacilinases juntamente com as enzimas das classes A e C são serino-β-Lactamases
(Poirel et al., 2010). Todas as oxacilinases apresentam três motivos conservados no seu sítioativo serina, sendo estes: STFK (posições 70 a 73), F/YGN (posições 144 a 146) e KTG
(posições 216 a 218). As posições assinaladas anteriormente para os motivos conservados
estão de acordo com o “DBL numbering system”, como descrito por Poirel e colaboradores
(2010). O segundo motivo conservado é específico das oxacilinases, enquanto os outros dois
são comuns também às classes A e C de Ambler (Walther-Rasmussen & Høiby, 2007). As
oxacilinases usualmente não são inibidas pelos inibidores de serino-β-Lactamases (ácido
clavulânico, tazobactam e sulbactam), mas geralmente são totalmente inibidas por cloreto de
sódio (NaCl) a uma concentração de 100 mM (Poirel et al., 2010).
Atualmente já foram descritas 250 variantes de oxacilinases, sendo a maioria CHDLs
(http://www.lahey.org/Studies/). Embora Walther-Rasmussen e Høiby (2007) tenham dividido as
CHDL em oito diferentes clusters, neste item somente serão discutidos os clusters descritos em
A. baumannii. Sendo assim, até o momento, já foram descritos seis clusters diferentes de CHDLs
47
neste micro-organismo, sendo estes: OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58, OXA-143 e OXA-182
(Brown & Amyes, 2006; Walther-Rasmussen & Høiby, 2007; Higgins et al., 2009; Kim et al.,
2010; Poirel et al., 2010). A primeira CHDL descrita em A. baumannii, foi a OXA-23 em 1985 no
Reino Unido (Panton et al., 1993), e na época foi chamada de ARI-1. Esta enzima apresenta
uma identidade de sequência de aminoácidos de 56% com a OXA-51 (Poirel & Nordmann,
2006). O cluster OXA-23 apresenta sete variantes conhecidas, sendo estas a OXA-23, OXA-27,
OXA-49, OXA-73, OXA-134 e OXA-146 (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP). Assim como a
maioria das CHDLs em A. baumannii, a OXA-23 hidrolisa fracamente os carbapenens, sendo
necessário a presença de uma IS, geralmente a ISAba1 (ou ISAba4), a montante do gene, para
conferir o aumento da expressão do gene que a codifica (Poirel & Nordmann, 2006). A OXA-23
tem sido descrita em diferentes países, demonstrando ser provavelmente a CHDL de A.
baumannii mais prevalente no mundo (Queenan & Bush, 2007; Poirel et al., 2010), inclusive no
Brasil (Carvalho et al., 2009;. Martins et al., 2009). Recentemente, Poirel e colaboradores (2008)
encontraram OXA-23 em isolados de A. radioresistens, considerada uma espécie comensal e
presente na pele de pacientes internados. Os autores concluíram que A. radioresistens constituiu
o reservatório do gene que codifica a OXA-23, o qual foi transferido para A. baumannii (Poirel et
al., 2008). Entre as CHDLs de A. baumannii, somente a OXA-23 foi descrita em uma
enterobactéria, sendo um isolado de P. mirabilis (Bonnet et al., 2002).
A segunda CHDL a ser descrita em A. baumannii foi a OXA-24 (idêntica à OXA-40) em
1997 na Espanha (Bou et al., 2000), e apresenta uma identidade de sequência de aminoácidos
de 63% com a OXA-51 (Peleg et al., 2008). Atualmente o cluster OXA-24 engloba cinco
variantes conhecidas, sendo elas: OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139 e OXA-160 (análise
Laboratório ALERTA-UNIFESP). A variante OXA-24/40 é endêmica em Portugal e na Espanha e
tem sido descrita nos Estados Unidos, enquanto a variante OXA-72 tem sido descrita em
diferentes países do mundo (Poirel et al., 2010). Dentre todas as CHDLs, o cluster OXA-24 é o
48
único, juntamente com a OXA-143 e a OXA-182, em que os genes codificadores dessas enzimas
não estão relacionados a IS, o que sugere que essas enzimas sejam as mais potentes CHDLs
em A. baumannii. O processo de mobilização dessas enzimas ocorre por um processo de
recombinação homóloga (Poirel et al., 2010). Além disso, a OXA-24/40 também foi descrita em
isolados de P. aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009).
O terceiro cluster a ser descrito foi OXA-51, em 1994, na Argentina (Brown et al., 2005).
Atualmente, existe mais de 65 variantes descritas (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP), e
durante muito tempo o cluster OXA-51 foi considerado como sendo codificado por um gene
cromossomal e intrínseco de A. baumannii (Queenan & Bush, 2007; Walther-Rasmussen &
Høiby, 2007), sendo dessa maneira utilizado para confirmação indireta da identificação da
espécie. Entretanto, foi descrito recentemente na região de Tawain a presença desses genes
tanto no cromossoma, como no plasmídeo em isolados de A. baumannii (Chen et al., 2010).
Mais tarde esses plasmídeos foram encontrados em isolados clínicos de A. nosocomialis (Lee et
al., 2012). Portanto, a presença do gene blaOXA-51-like não é presuntivo da identificação da espécie
de A. baumannii. Além disso, assim como ocorre com os genes blaOXA-23-like e blaADC-like, os genes
codificadores das CHDLs do cluster OXA-51 também estão associados com a ISAba1 para
aumentar a sua expressão e dessa forma levar ao fenótipo de resistência aos carbapenens
(Poirel & Nordmann, 2006; Queenan & Bush, 2007; Walther-Rasmussen & Høiby, 2007).
O quarto cluster a ser descrito foi a OXA-58 em 2003 na França (Poirel et al., 2005) e
apresenta uma identidade de sequência de 59% com a OXA-51 (Peleg et al., 2008). Já foram
descritas duas variantes, sendo elas: OXA-96, OXA-97 e OXA-164 (análise Laboratório
ALERTA-UNIFESP). Estudos avaliando o contexto genético da OXA-58, verificaram que o gene
blaOXA-58-like pode estar associado a diferentes IS, como ISAba1, ISAba2, ISAba3 e IS18 (Poirel &
Nordmann, 2006), todas relacionadas ao aumento da expressão do gene que codifica a OXA-58.
Por último, recentemente, foram propostos dois novos clusters de CHDLs em A. baumannii,
49
sendo estes os clusters OXA-143 (Higgins et al., 2009) e OXA-182 (Kim et al., 2010). O cluster
OXA-143 foi descrito em um isolado brasileiro, em 2009, e o cluster OXA-182 descrito na Coréia
do Sul, em 2010 (Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010). Ambos os clusters apresentam alta
identidade de sequência de aminoácidos (> 80%) com o cluster OXA-24 (Peleg et al., 2008;
Poirel et al., 2010). Assim como ocorre com o cluster OXA-24, a OXA-143 e a OXA-182 não
estão relacionadas à IS para aumentar a sua expressão.
Dentre os clusters de CHDLs descritos em outras espécies, apenas merece destaque a
CHDL plasmidial OXA-48 (Poirel et al., 2004), devido a repercussão que vem tomando nos
últimos dois anos, associado a sua disseminação para diferentes espécies de enterobactérias
em mais de 23 países da Europa e regiões vizinhas (Poirel et al., 2012). A produção de
diferentes classes de cabapenemases, bem como os demais mecanismos de resistência aos βlactâmicos, em isolados clínicos de Acinetobacter spp. no Brasil, serão abordados
detalhadamente na discussão.
2.5.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa
Bactérias Gram negativas apresentam uma parede celular complexa, composta por uma
membrana externa, que é uma estrutura membranosa presente externamente à membrana
citoplasmática e a camada de peptídeoglicano entre as duas membranas. A principal função da
membrana externa é atuar como uma barreira permeável que elimina os compostos tóxicos à
célula que existem no meio externo (Vila et al., 2007). O fato dessa membrana excluir compostos
lipofílicos e grandes (> 600 daltons), muitos antimicrobianos tem pouca atividade contra
bactérias Gram negativas, embora eles sejam ativos contra bactérias Gram positivas. Muito
deste fluxo através da membrana ocorre por meio de canais formados por proteínas (Nikaido,
1994).
50
Para muitos antimicrobianos, um grupo de proteínas de membrana externa (OMPs),
conhecidas como porinas, capazes de formar canais constituídos de água no seu interior, é o
principal meio de transporte através da membrana bacteriana (Nitzan et al., 2002). As porinas se
diferem das demais OMPs por serem triméricas e, portanto, formam poros na membrana
externa, enquanto as demais OMPs são monoméricas e não formam poros (Nikaido, 1994). As
porinas são geralmente divididas em duas classes: porinas não específicas, que permitem a
difusão de moléculas hidrofílicas abaixo de um certo tamanho, e porinas específicas, as quais
facilitam a difusão de substratos específicos (Nikaido, 1994).
O tamanho, a carga e a hidrofobicidade dos β-lactâmicos interferem na sua capacidade
em atravessar os canais de uma porina. Sendo assim, moléculas de alto peso molecular e
moléculas carregadas negativamente apresentam dificuldade em atravessar as porinas da célula
bacteriana. Por outro lado, moléculas pequenas, zwiteriônicas ou com características hidrofílicas,
como a cefepima e o imipenem, atravessam rapidamente pelas porinas (Nikaido, 1994). As
porinas podem aumentar ou diminuir as taxas de penetração dos β-lactâmicos na célula
bacteriana (Nitzan et al., 2002) e diferenças na permeabilidade da membrana externa variam de
acordo com cada micro-organismo (Nikaido, 1994).
Embora a produção de β-lactamases seja um tema bem caracterizado, os demais
mecanismos relacionados a resistência aos β-lactâmicos ficaram relegados a quase total
obscuridade. Uma das limitações do conhecimento a respeito da resistência aos carbapenens
em Acinetobacter spp. é a falta de informação a respeito das porinas, e das propriedades de
permeabilidade de sua membrana incluindo uma melhor caracterização das suas OMPs (Vila et
al., 2007). Até agora, apenas poucas OMPs foram relatadas e suas funções ainda permanecem
na maioria das vezes desconhecidas (Poirel & Nordmann, 2006; Vila et al., 2007). Acredita-se
que o tamanho pequeno e o limitado número de porinas em Acinetobacter spp. seja o
responsável pela resistência intrínseca aos antimicrobianos observada neste micro-organismo
51
(Vila et al., 2007). Esse conceito que se tinha sobre a permeabilidade de A. baumannii foi em
parte confirmado por um interessante estudo publicado recentemente (Sugawara & Nikaido,
2012). Nesse estudo, foi observado que a permeabilidade da membrama externa de A.
baumannii para cefalotina e cefaloridina era 100 vezes menor do que a permeabilidade
observada para a E. coli K12, demonstrando que naturalmente A. baumannii apresenta uma
baixa permeabilidade de membrana externa (Sugawara & Nikaido, 2012). Além disso, foi
observado que embora a OmpA, também conhecida como OmpHMP (36,5 kDa), apresente uma
capacidade mínima de formar poros, quando o gene ompA foi deletado, houve uma diminuição
de 2-3 vezes na permeabilidade para cefalotina e cefaloridina (Sugawara & Nikaido, 2012). Os
autores concluem que a baixa permeabilidade dessa porina aliada à hiperexpressão de βlactamases intrínsecas, como as CHDLs do cluster OXA-51 e as cefalosporinases do tipo
ADC/AmpC, e de sistemas de efluxo poderiam ser essenciais para os altos níveis de resistência
intríseca observada para muitos antimicrobianos em isolados clínicos de A. baumannii
(Sugawara & Nikaido, 2012).
Embora ainda sejam poucos os estudos que avaliaram o papel das porinas na
resistência aos carbapenens em A. baumannii, os dados obtidos mostram que essas proteínas
desempenham um papel importante na resistência aos carbapenens (Limansky et al., 2002;
Dupont et al., 2005; Mussi et al., 2005; Tomas et al., 2005). Sendo assim, Limansky e
colaboradores (2002) demonstraram que a resistência a imipenem em um isolado de
Acinetobacter spp. não produtor de carbapenemase, estava associada à perda de uma proteína
de 29 kDa, designada CarO. Resultado semelhante foi observado por um estudo conduzido por
Mussi e colaboradores (2005), no qual foi demonstrado que a resistência a imipenem e a
meropenem em A. baumannii também estava associado a perda dessa porina, pela inativação
do gene carO por uma IS. Recentemente, outros dois estudos, comparando a proteômica de
isolados sensíveis e resistentes de A. baumannii, observeram alterações estruturais na CarO,
52
principalmente nas estruturas primárias e quartenárias dessa porina (Siroy et al., 2006; Vashist
et al., 2010). Foi também observado que as isoformas alteradas não transportavam
eficientemente os carbapenens como a porina “selvagem” (Vashist et al., 2010). Dessa forma,
isolados de A. baumannii resistentes, provavelmente, alterariam a CarO de modo a diminuir a
entrada de carbapenem na célula bacteriana. Da mesma forma, outras duas porinas foram
descritas relacionadas à resistência aos carbapenens em A. baumannii: uma proteína chamada
33-36 kDa (Tomas et al., 2005), com um tamanho estimado de 31 kDa, e outra de 43 kDa, que
demonstra homologia peptídica com a OprD (D2) de P. aeruginosa (Dupont et al., 2005). Como
nenhum sítio de ligação ao imipenem pode ser detectado na CarO, acredita-se que esta porina
seja um canal inespecífico de entrada para os carbapenens (Siroy et al., 2005), enquanto a
proteína de 43 kDa (OprD-like) seria o canal específico para estes antimicrobianos (Vila et al.,
2007).
Outra porina descrita em A. baumannii é a OmpW (21 kDa), que demonstra uma alta
homologia com a OmpW de E. coli e P. aeruginosa. Embora sua função em A. baumannii ainda
não esteja bem esclarecida, Vila e colaboradores (2007) observaram uma diminuição in vitro da
expressão dessa porina em mutantes de A. baumannii resistentes à colistina (Vila et al., 2007).
Entretanto, Tiwari e colaboradores (2012) avaliando a proteômica de isolados de A. baumannii
resistentes aos carbapenens, observaram uma diminuição da expressão de OmpW, comparada
com a cepa ATCC 19606 de A. baumannii sensível aos carbapenens. Embora, em um estudo
similar, Siroy e colaboradores (2005) não tenham observado alteração na expressão da OmpW,
eles relataram a presença de pelo menos quatro isoformas diferentes dessa OMP no gel de
dodecil-sulfato de sódio em poliacrilamida - SDS-PAGE (Siroy et al., 2006). Vashist e
colaboradores (2010) também observaram a presença de isoformas de OmpW e, em
decorrência desse achado, os autores inferiram que era possível que a OmpW, sendo uma
53
porina pequena, fosse importante para realizar a função de transporte na ausência ou alteração
das porinas principais em isolados resistentes de A. baumannii (Vashist et al., 2010).
2.5.3 - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo
Sistemas de efluxo são transportadores expressos em qualquer célula viva, protegendoa dos efeitos tóxicos de substâncias químicas orgânicas (Vila et al., 2007). Em bactérias, os
genes codificadores desses sistemas estão majoriatariamente localizados no cromossomo ou
em plasmídeos (Coyne et al., 2011), como é o caso do sistema de efluxo QepA que extrui
especificamente fluoroquinolonas (Yamane et al., 2007). Os sistemas de efluxo podem ser
específicos para um determinado substrato ou podem transportar uma gama de compostos
estruturalmente diferentes, incluindo antimicrobianos de diferentes classes, como macrolídeos,
aminoglicosídeos, quinolonas, cloranfenicol, tetraciclinas, trimetoprim e recentemente a
tigeciclina (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011). Dessa forma, o fenótipo MDR está
frequentemente associado à hiperexpressão desses sistemas, já que reduzem o acúmulo de
muitos antimicrobianos no interior da bactéria, ao mesmo tempo (Piddock, 2006; Vila et al., 2007;
Coyne et al., 2011). Embora esses sistemas possam conferir diminuição da sensibilidade a
muitos antimicrobianos, nem sempre essa diminuição resulta em resistência (Piddock, 2006).
Cinco superfamílias de sistemas de efluxo estão associadas a resistências aos
antimicrobianos em bactérias (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011), sendo elas: transportadores
do tipo ABC (ATP-Binding Cassette), superfamília MFS (Major Facilitator Superfamily), família
MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), família SMR (Small Multidrug Resistance) e
família RND (Resistance Nodulation Division). Uma sexta família é considerada por Poole
(2002), sendo esta a superfamília DMT (Drug-Metabolite Transporter). Dentre essas famílias, a
família RND engloba os mais importantes sistemas de efluxo em bactérias Gram negativas
(Coyne et al., 2011), e é composta por três proteínas: (i) uma proteína transportadora,
54
responsável pela ejeção (bomba), localizada na membrana interna (citoplasmática); (ii) uma
proteína acessória ou de fusão localizada no espaço periplasmático; e (iii) uma OMP localizada
na membrana da bactéria (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011).
O formato tripartido presente na família RND confere a ela a capacidade de ejetar o
maior número possível de substratos diferentes, ao contrário dos sistemas de efluxo formados
por somente uma única proteína, que, ejetam um número pequeno de compostos (Coyne et al.,
2011). A família RND faz uso de prótons como força motriz, um gradiente eletroquímico no qual
o movimento de íons de hidrogênio impulsiona o transporte do substrato (Piddock, 2006).
Diversos sistemas de efluxo foram descritos em A. baumannii, a partir da análise dos
cromossomas sequenciados (Coyne et al., 2011). Entretanto, até o momento, somente três
sistemas do tipo RND (AdeABC, AdeIJK e AdeFGH), dois sistemas do tipo MFS (CraA e AmvA)
e um sistema cada dos tipos MATE (AdeM) e SMR (AdeS) demonstraram estar envolvidos na
ejeção de antimicrobianos (Vila et al., 2007; Coyne et al., 2011).
O sistema AdeABC, é talvez o mais importante e conhecido. Ele é formado por três
proteínas: AdeA que forma a proteína de fusão, AdeB que forma o componente trans-membrana
e AdeC que forma a proteína de membrana externa. Este sistema é regulado por dois
componentes o AdeR (repressor) e AdeS (sensor quinase), codificados por genes que estão no
operon adeRS, localizado a motante do operon adeABC, e são transcritos em direção oposta
(Marchand et al., 2004; Coyne et al., 2011). Mutações pontuais nestes componentes estão
associadas à hiperexpressão desse sistema levando ao fenótipo de multirresistência em A.
baumannii (Marchand et al., 2004). A inativação do gene adeB em isolados de A. baumannii que
hiperexpressavam o sistema AdeABC, demonstrou que os principais substratos desse sistema
são os aminglicosídeos, as fluoroquinolonas, as tetraciclinas, a tigeciclina, os macrolideos, o
cloranfenicol, o trimetoprim e o brometo de etídio (Magnet et al., 2001; Marchand et al., 2004;
Higgins et al., 2004). A real contribuição do sistema AdeABC na resistência aos carbapenens
55
ainda não está esclarecida, uma vez que estudos utilizando inibidores de sistemas de efluxo,
como a “phenyl-arginine-b-naphthylamide” (PAβN), mostraram resultados contraditórios
(Pournaras et al., 2006; Peleg et al., 2007). Os resultados obtidos até o momento sugerem que
esse sistema esteja relacionado à resistência a meropenem, mas não para imipenem em
isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 que tiveram o gene adeB deletado (Wong et al.,
2009). Provavelmente, somente a hiperexpressão do sistema AdeABC não seja suficiente para
causar altos níveis de resistências aos carbapenens, necessitando da associação de outros
mecanismos (Coyne et al., 2011).
O sistema AdeIJK está relacionado com a resistência intrínseca à ticarcilina, às
cefalosporinas, ao aztreonam, às fluoroquinolonas, às tetraciclinas, às lincosamidas, à
rifampicina, ao cloranfenicol, ao trimetoprim, à novobiocina e ao ácido fusídico (Damier-Piolle et
al., 2008). Entretanto, os aminoglicosídeos não são substratos para esse sistema (Coyne et al.,
2010a). Embora o sistemas AdeABC e AdeIJK ejetem a tigeciclina, a associação desses dois
sistema aumenta drasticamente a extrusão da mesma (Damier-Piolle et al., 2008; Coyne et al.,
2011). Diferente do que ocorre com o sistema AdeABC, não foi encontrado nenhum gene
regulatório do sistema AdeIJK (Damier-Piolle et al., 2008). O terceiro sistema da família RND em
A. baumannii, AdeFGH, apresenta o AdeL como regulador da sua expressão. Os dados a
respeito desse sistema demonstram que ele está associado com altos níveis de resistência às
fluoroquinolonas, ao cloranfenicol, ao trimetoprim e à clindamicina e à diminuição da
sensibilidade às tetraciclinas, à tigeciclina e ao sulfametoxazol (Coyne et al., 2010b). Entretanto,
os aminoglicosídeos e os β-lactâmicos não são substratos para esse sistema (Coyne et al.,
2010b). Além disso, o sistema AdeFGH não está presente em todos os isolados de A. baumannii
(Coyne et al., 2011).
Pelo menos dois sistemas de efluxo foram identificados em espécies de Acinetobacter
spp., sendo outras que não A. baumannii (Coyne et al., 2011). O sistema AdeXYZ apresenta
56
97% de identidade com o sistema AdeIJK de A. baumannii e está presente em 90% dos isolados
de A. pittii (Chu et al., 2006). Esse sistema está relacionado à resistência aos β-lactâmicos, à
ciprofloxacina, à tetraciclina, à rifampicina e ao cloranfenicol. Já foi também encontrado em um
isolado de A. nosocomialis e em um isolado de A. genoespécie 17 (Chu et al., 2006). O sistema
AdeDE é encontrado em 70% dos isolados de A. pittii e também foi encontrado em A.
nosocomialis e A. genoespécie 17 (Chu et al., 2006). Esse sistema apresenta 40% de identidade
com o sistema AdeAB e ejetam aminoglicosídeos, carbapanens, ceftazidima, fluoroquinolonas,
eritromicina, tetraciclina, rifampicina e cloranfenicol (Chau et al., 2006). Não foi encontrado um
gene de porina no operon adeDE, demonstrando que o sistema deve recrutar outra proteína para
fomar os sistema tripartido (Chau et al., 2006).
2.5.4 - Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs)
PBPs são uma família de enzimas que compartilham uma origem evolutiva comum.
Essas enzimas catalisam a síntese de peptídeoglicano, o principal componente da parede celular
bacteriana, e também estão associados com a morfogênese celular e com o complexo de divisão
celular (Sauvage et al., 2008). As PBPs têm sido classificadas em dois grupos, as PBPs de alto
peso molecular (HMM-PBP) e as PBPs de baixo peso molecular (LMM-PBP). Essa classificação
baseia-se no peso molecular aparente no gel de SDS-PAGE, nas sequências de aminoácidos e
nas funções celulares e enzimáticas das PBPs (Goffin & Ghuysen, 1998; Ghosh et al., 2008;
Sauvage et al., 2008). De acordo com a estrutura do domínio N-terminal (Sauvage et al., 2008),
as HMM-PBPS podem ser divididas em classe A (funcionalmente envolvidas nas reações de
transpeptidação e transglicosilação) (Bertsche et al., 2005; Born et al., 2006) ou em classe B
(funcionalmente envolvidas nas reações de transpeptidação, elongação ou divisão celular) (Den
Blaauwen et al., 2003; Piette et al., 2004). Os LMM-PBPs ou de classe C, são DDcarboxipeptidades e/ou endopeptidases envolvidas na separação celular durante o processo de
57
divisão, na maturação do peptideoglicano ou na reciclagem da parede celular bacteriana (Ghosh
et al., 2008). As transglicosilases monofuncionais (MGTs) é um grupo de enzimas presentes em
algumas bactérias, com um único domínio glicosiltransferase semelhante às PBPs de classe A,
cuja função é ainda desconhecida (Spratt et al., 1996; Sauvage et al., 2008).
As PBPs são o sítio alvo dos β-lactâmicos e estão relacionadas a síntese do
peptídeoglicano, principal componente da parede celular bacteriana. A afinidade dos βlactâmicos a estas proteínas é bem variada e mutações podem alterar a sua estrutura levando a
uma baixa afinidade de ligação aos β-lactâmicos ou a produção de PBPs suplementares que
também podem apresentar baixa afinidade. A mudança na conformação das PBPs leva a
resistência aos β-lactâmicos (Zapun et al., 2008). A inibição das PBPs produz um desequilíbrio
no metabolismo da parede celular bacteriana, resultando na inibição do crescimento ou lise. O
que acontece entre a inibição das PBPs e o resultado biológico decorrente ainda permanece mal
compreendido (Zapun et al., 2008).
Recentemente, um estudo conduzido por Moya e colaboradores (2009), mostrou pela
primeira vez que o papel das PBPs na resistência aos carbapenens em Gram negativos poderia
ser muito mais complexo e fascinante do que se poderia imaginar. Nesse estudo os autores
observaram que a PBP4, em P. aeruginosa, funciona como uma “armadilha” para os βlactâmicos. Uma vez se ligado a essa PBP, é desencadeado uma complexa e eficiente reposta
conduzida pela hiperprodução de AmpC e ativação do sistema de dois componentes CreBC
(Moya et al., 2009). O mesmo grupo de pesquisa publicou um outro estudo no qual observaram
que a hiperprodução de AmpC e a ativação do sistema de dois componentes CreBC pela
inativação da PBP4 ocorre de maneira diferencial em uma coleção não relacionadas clonalmente
de P. aeruginosa (Zamorano et al., 2010). Esses dois estudos representam um marco na
maneira como se consideravam o papel das PBPs na resistência aos carbapenens em bacilos
Gram negativos.
58
De todos os estudos descritos enfocando as bases bioquímicas e genéticas da
resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii, raríssimos são aqueles que se
dedicaram a estudar o papel dos genes codificadores das proteínas ligadoras de penicilinas
(PBPs) nesse fenótipo em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; FernándezCuenca et al., 2007; Russo et al., 2009; Yun et al., 2011). Estudos publicados da década de 90
avaliando o perfil das PBPs de A. baumannii através do gel de SDS-PAGE, encontraram PBPs
com baixa afinidade para os carbapenens (Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Urban et
al., 1995). Gehrlein e colaboradores (1991) observaram sete PBPs em um isolado clínico de A.
baumannii com aparentes tamanhos moleculares no gel de SDS-PAGE de 94, 84, 65, 61, 48, 40
e 24 kDa. No estudo de Gehrlein e colaboradores (1991) foi observado que, na presença de
imipenem, ocorre uma complexa reorganização das PBPs que leva a resistência aos
carbapenens in vitro. Já Fernández-Cuenca e colaboradores (2003), usando géis de SDS-PAGE
a 12% marcado com ampicilina e
125I,
avaliaram isolados clínicos sensíveis e resistentes aos
carbapenens. Os isolados resistentes mostraram expressão reduzida de uma PBP de 73,2 kDa,
chamada PBP2, associada com a produção de CHDLs e, em alguns isolados, com a perda de
um porina de 22,5 kDa. Em outro estudo, foi relatado um isolado clínico de A. baumannii
resistente a imipenem mostrando PBPs com baixa afinidade para os inibidores de β-lactamase,
principalmente o ácido clavulânico (Urban et al., 1995). O mesmo estudo também mostrou que o
sulbactam se liga melhor às PBPs do que tazobactam, mesmo nos isolados resistentes a
imipenem, o que pode explicar a satisfatória atividade deste composto frente a isolados de A.
baumannii multirresistentes (Piette et al., 2004; Michalopoulos & Falagas, 2010).
Obara & Nakae (1991) avaliaram 12 isolados de A. calcoaceticus sensíveis a imipenem,
detectando seis PBPs no gel de SDS-PAGE com tamanhos de 94, 92, 86, 74, 59 e 42 kDa.
Mutantes selecionados in vitro e que apresentavam resistência à cefoxitina, à cefoperazona ou à
ceftazidima, mostraram expressão reduzida de porinas, bem como alterações na expressão das
59
PBPs (Obara & Nakae, 1991). Em um estudo recente, Yun e colobaradores (2011) avaliaram a
regulação proteômica de um isolado de A. baumannii resistente a imipenem sob condições de
estresse causadas por diferentes antimicrobianos. Na presença de imipenem, eles observaram
um aumento dos níveis de transcrição dos genes codificadores de PBPs ponA (PBP1a), ftsI
(PBP3) e dacC (PBP5/6), dos sistemas de efluxo AdeABC e AdeJIK, e da β-lactamases
cromossomal AmpC. Entretanto, foi observada a repressão dos genes codificadores das
proteínas de membrana externa OmpHMP (OmpA-like) e OmpW. Esses dois estudos (Obara &
Nakae, 1991; Yun et al., 2011) demonstram uma associação complexa e multifatorial na
resistência aos carbapenens em A. baumannii.
60
Apresentação
3 - Apresentação
Nesta tese de doutorado serão apresentados sete artigos, sendo quatro destes
recentemente publicados no Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC), Journal of
Antimicrobial Chemotherapy (JAC) e Journal of Medical Microbiology (JMM), e os outros três em
fase de submissão. Quatro desses artigos foram realizados durante meu estágio de doutorado
Sanduíche, com bolsa do Programa de Doutorado com Estágio no Exterior (PDEE) da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), no período de
fevereiro de 2009 a janeiro de 2010, e com bolsa de estudos finaciada pelo “Instituto de
Formación e Investigación Marqués de Valdecilla - IFIMAV” no período de fevereiro a outubro de
2010. O estágio foi realizado no “Laboratório de Investigación” do “Servício de Microbiología” do
“Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV”, sob supervisão do Professor Dr. Luis
Martínez Martínez. O HUMV está localizado na cidade de Santander, capital da “Comunidad
Autonoma de Cantabria”, norte da Espanha, sendo um dos mais importantes centros
hospitalares e de pesquisa médica desse país.
61
Artigos Científicos
4 - Artigos Científicos
4.1 - Artigo Científico 1: Analysis of genes encoding penicillin-binding proteins in clinical isolates
of Acinetobacter baumannii.
Publicado em Dezembro de 2011 no periódico “Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC)”, volume 55, número
12, páginas 5907-5913. Os resultados parciais desse estudo também foram apresentados na forma oral na seção
de resistência em Acinetobacter spp. no “8th International Symposium on the Biology of Acinetobacter”, realizado no
período de 1 a 3 de setembro de 2010 na cidade de Roma, Itália.
4.2 - Artigo Científico 2: OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem
resistance in Acinetobacter pittii in Spain.
Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma oral e pôster na no “XIV Congreso de la
Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica - SEIMC”, realizado no período de 19 a 22
de maio de 2010 na cidade de Barcelona, Espanha. O presente artigo será submetido ao periódico “Antimicrobial
Agents and Chemotherapy (AAC)”.
4.3 - Artigo Científico 3: Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University
Hospital in the North of Spain.
Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma de pôster na no “European Congress of Clinical
Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID”, realizado no período de 7 a 10 de maio de 2011 na cidade de
Milão, Itália. O presente artigo será submetido ao periódico “Journal of Antimicrobial Chemotherapy (JAC)”.
4.4 - Artigo Científico 4: Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with
Acute Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation.
Publicado em Março de 2011 no periódico “Journal of Medical Microbiology (JMM)”, volume 60, número 3, páginas
375-377.
62
4.5 - Artigo Científico 5: Low prevalence of blaOXA-143 in private hospitals in Brazil.
Publicado em Setembro de 2011 no periódico “Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC)”, volume 55, número
9, páginas 4494-4495.
4.6 - Artigo Científico 6: Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter
baumannii (Acb) in a Brazilian Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier
Dissemination of blaOXA-143 in Brazil.
Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma de pôster na no “51th Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC”, realizado no período de 17 a 20 de setembro de 2011 em
Chicago, Estados Unidos. O presente artigo será submetido ao periódico Antimicrobial Agents and Chemotherapy
(AAC).
4.7 - Artigo Científico 7: Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter
baumannii from Brazil: a case report.
Aceito para publicação em Junho de 2012 no periódico “Jornal of Antimicrobial Chemotherapy (JAC)”. Os resultados
parciais desse estudo também foram apresentados na forma oral no “26º Congresso Brasileiro de Microbiologia CBM”, realizado no período de 2 a 6 de outubro de 2011 na cidade de Foz do Iguaçu, Brasil.
63
Artigos Científicos - Espanha
Analysis of Genes Encoding for Penicillin-Binding Proteins in Clinical Isolates of
Acinetobacter baumannii
Rodrigo Cayô1*, María-Cruz Rodríguez1§, Paula Espinal2, Felipe Fernández-Cuenca3, Alain A.
Ocampo-Sosa1, Álvaro Pascual3, Juan A. Ayala4, Jordi Vila2 and Luis Martínez-Martínez1,5.
Short running title: Analysis of Penicillin-Binding Proteins in A. baumannii.
1Service
of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander, Spain;
2Service
of Microbiology, Hospital Clinic, School of Medicine, University of Barcelona, Barcelona,
Spain;
3Service
of Microbiology, University Hospital Virgen Macarena, Seville, Spain;
4Centro
de Biología Molecular Severo Ochoa - CSIC-UAM, Campus de Cantoblanco, Madrid,
Spain.
5Department
§Current
of Molecular Biology, School of Medicine, University of Cantabria, Santander, Spain.
address: Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, Santander, Spain.
*Corresponding author.
Current Address: Laboratorio Especial de Microbiologia Clínica - LEMC/ALERTA, Universidade
Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, 04025-010, São
Paulo - SP, Brazil. Tel.: +55 11 50812965. Fax.: +55 11 50812965. E-mail:
[email protected].
64
ABSTRACT
There is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) in the resistance of
Acinetobacter baumannii to β-lactams. This study presents an analysis of the allelic variations of
PBP genes in A. baumannii isolates. Twenty six A. baumannii clinical isolates (susceptible or
resistant to carbapenems) from three teaching hospitals in Spain were included. Antimicrobial
susceptibility profile, clonal pattern and genomic species identification were also evaluated.
Based on the six complete genomes of A. baumannii, the PBP genes were identified and primers
were designed for each gene. The nucleotide sequences of the genes identified that encode
PBPs and the corresponding amino acid sequences were compared with those of the ATCC
17978. Seven PBP genes and one monofunctional transglycosylase (MGT) gene were identified
in the six genomes, encoding (i) four high molecular mass proteins (two of class A, PBP1a [ponA]
and PBP1b [mrcB], and two of class B, PBP2 [pbpA/mrdA] and PBP3 [ftsI]), (ii) three lowmolecular-mass proteins (two of Type-5, PBP5/6 [dacC] and PBP6b [dacD], and one of Type-7
(PBP7/8 [pbpG]), and (iii) a monofunctional enzyme (MtgA [mtgA]). Hotspot mutation regions
were observed, although most of the allelic changes found translated into silent mutations. The
amino acid consensus sequences corresponding to the PBP genes in the genomes and the
clinical isolates were highly conserved. The changes found in amino acid sequences were
associated with concrete clonal patterns but were not directly related to susceptibility or
resistance to β-lactams. An insertion sequence disrupting the gene encoding the PBP6b was
identified in an endemic carbapenem-resistant clone in one of the participant hospitals.
65
INTRODUCTION
Acinetobacter baumannii is an opportunistic nosocomial pathogen responsible for a variety of
serious infections, especially in intensive care units (ICU) (23,27). Its ability to survive on dry
surfaces (6,21,41) and to acquire antimicrobial resistance, as well as being suited for genetic
exchange have contributed to the success and longevity of this microorganism to cause epidemic
spread outbreaks (19). Carbapenems are currently one of the few options for treatment of
infections caused by multi-drug resistant A. baumannii (15). However, since the early 1990s, the
frequence of outbreaks caused by carbapenem-resistant A. baumannii isolates has increased
worldwide (5,16), becoming a significant public health concern (40).
The mechanisms underlying resistance to carbapenems in A. baumannii include: (I) the
production of beta-lactamases, particularly acquired carbapenem-hydrolyzing class D βlactamases (CHDLs) (7,31), metallo-β-lactamases (30) and in rare cases, class A
carbapenemases (32); (II) outer membrane impermeability, associated with the loss or decreased
expression of porins (25) and, probably, (III) the overproduction of efflux pumps (20). However,
there is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) on this phenotype in A.
baumannii (12,13,26).
PBPs are a family of enzymes that share a common evolutionary origin. These enzymes catalyze
the synthesis of peptidoglycan, the primary component of the bacterial cell wall, and are also
associated with cell morphogenesis and cell division complex (33). PBPs have been classified
into two groups, the high-molecular-mass (HMM) and low-molecular-mass (LMM) PBPs,
according to their apparent molecular weights on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) gels, their amino acid sequences, and their enzymatic and cellular
functions
(4,14,17,33).
The
HMM
PBPs
can
be
divided
in
class
A
(transpeptidase/glycosyltransferase activities) (2,3) or class B (transpeptidase activity, elongase
activity or divisome) (10,29), depending on the structure of their N-terminal domain (33). The
66
LMM PBPs or class C PBPs, are DD-carboxypeptidades and/or endopeptidases involved in cell
separation, peptidoglycan maturation or recycling (14). The monofunctional enzymes (MGTs) is a
group of enzymes present in some bacteria, with a single glycosyltransferase domain similar to
those of class A PBPs, and their function is still unknown (35).
This study aimed to determine the nucleotide sequences of the genes encoding for PBPs in A.
baumannii and to analyze their allelic variations in isolates susceptible or resistant to β-lactams.
(This work was presented in part as an oral presentation at the 8th International Symposium on
the Biology of Acinetobacter in Rome, 2010).
67
MATERIALS AND METHODS
Bacterial isolates.
A total of 26 nonduplicate A. baumannii clinical isolates, presenting different carbapenem
susceptibility profiles were collected in three teaching hospitals in Spain: the University Hospital
Marqués de Valdecilla, Santander (n = 12), the Hospital Clínic, Barcelona (n = 12), and the
University Hospital Virgen Macarena, Seville (n = 2) (Table 1). The two isolates from the third
hospital have been described previously (12). These isolates were representative of the most
prevalent clones in each institution. Presumptive identification of the isolates as A. baumannii was
carried out by amplifying the complete open reading frame of blaOXA-51-like gene, which is
considered chromosomally intrinsic to A. baumannii (31), using primers pairs OXA-69A and OXA69B as described previously (18). Both primers were also used to detect the presence of ISAba1
upstream of the blaOXA-51-like gene (18). Amplified rRNA gene restriction analysis (ARDRA), using
the CfoI, AluI, MboI, RsaI, and MspI enzymes, was carried out as described previously (39), to
confirm the genomic species identification of A. baumannii. The reference strain A. baumannii
RUH-134 (11) was included as control for both genomic identification and PCR amplification of
PBP genes.
Testing of susceptibility to antimicrobial drugs.
Tigecycline and colistin MICs were determined at the three participating centers by broth
microdilution according to Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) guidelines (8). The MICs
of imipenem, meropenem, cefepime, ceftazidime, ceftriaxone, cefotaxime, aztreonam, amikacin,
gentamicin, minocycline and ciprofloxacin were also determined by microdilution for the isolates
from the Hospital Clínic and University Hospital Virgen Macarena, but for the isolates from the
University Hospital Marqués de Valdecilla, the MICs of these drugs were determined with Etest
strips according to the manufacturer’s (AB bioMérieux, Solna, Sweden) recommendations. The
68
results for tigecycline were interpreted according to the U.S. Food and Drug Administration (FDA)
breakpoints for Enterobacteriaceae (for susceptibility, ≤ 2 µg/mL; for intermediacy, 4 µg/mL, for
resistance, ≥ 8 µg/mL), and the results for the other antimicrobial agents tested were interpreted
according to the CLSI breakpoints (9). Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia
coli ATCC 25922 were used as quality control strains.
Molecular typing by PFGE.
The clonal relationships of the A. baumannii isolates were determined by pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) using the ApaI restriction enzyme (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN),
as described elsewhere (34). The restriction fragments were separated on 1% (wt/vol) agarose
gels in 0.5% Tris-borate-EDTA (TBE) buffer in a CHEF-DR (contour-clamped homogeneous
electric field–dynamically regulated) III Mapper electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA) for 19 h at 14°C using a pulse ramping rate changing from 5 to 20 s at 6 V/cm.
DNA fingerprints were interpreted as recommended by Tenover et al. (37). The reference strains
A. baumannii RUH-875 and RUH-134 (11), representatives of major international clones I and II,
respectively, were also used as comparators.
Identification of PBP genes.
The genes encoding PBPs were identified on the basis of the six complete genomes of A.
baumannii that had been deposited in GenBank by the time this study was started. The following
organisms were considered: A. baumannii strains AB0057 (accession no. NC_011586), ATCC
17978 (accession no. NC_009085), SDF (accession no. NC_010400), AYE (accession no.
NC_010410), ACICU (accession no. NC_010611), and AB307-0294 (accession no. NC_011595).
Consensus sequences were obtained for each PBP gene identified, and a series of primers for
PCR amplification and sequencing was designed, as listed in Table S1 in the supplemental
69
material. The A. baumannii genomes deposited in GenBank after the beginning of this study were
also considered for comparison and analysis of the PBP genes. These genomes include those of
A. baumannii strains AB056 (accession no. NZ_ADGZ01000571), AB058 (accession no.
NZ_ADHA01000108), AB059 (accession no. NZ_ADHB01000264), AB900 (accession no.
NZ_ABXK01000007), and ATCC 19606 (accession no. NZ_ACQB00000000).
Analysis of the PBP genes in A. baumannii clinical isolates.
Genomic DNA from clinical isolates was extracted with InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA), according to manufacturer’s recommendations. PBP genes
were amplified by PCR using the following conditions: 95ºC for 5 min, followed by 35 cycles of
95ºC for 30 s, 55ºC for 30 s and 72ºC for 1 to 3 min, according to the amplicon size, followed by
72ºC for 7 min. PCR products were analyzed on a 1 % (w/v) agarose gels stained with ethidium
bromide. PCR products were purified by using a High Pure PCR Product Purification Kit (Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany). Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen
Inc. (Seoul, South Korea). Each PBP gene was named and classified based on the homologies
obtained with others PBP sequences from different microorganisms, deposited in the GenBank,
as well as on the recognition of the conserved motifs. All PBP sequences were compared with
those of A. baumannii ATCC 17978 (1).
Analysis of the PBP genes in A. baumannii clinical isolates.
Genomic DNA from clinical isolates was extracted with InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA) according to the manufacturer’s recommendations. PBP genes were amplified by
PCR under the following conditions: 95°C for 5 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 s, 55°C
for 30 s, and 72°C for 1 to 3 min, according to the amplicon size, and finally 72°C for 7 min. PCR
products were analyzed on 1% (wt/vol) agarose gels stained with ethidium bromide. PCR
70
products were purified by using a High Pure PCR product purification kit (Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany). Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen Inc. (Seoul,
South Korea). Each PBP gene was named and classified on the basis of homology with other
PBP sequences from different microorganisms deposited in GenBank, as well as by the
recognition of conserved motifs. All PBP sequences were compared with those of A. baumannii
ATCC 17978 (1).
Nucleotide sequence accession numbers.
The nucleotide sequences of the PBP genes of the A. baumannii clinical isolates in this study
have been deposited in the GenBank nucleotide sequence database and were assigned the
following accession numbers, according to each PBP/MTG gene and strain: for ponA, JF746077
to JF746102; for mrcB, JF746103 to JF746128; for pbpA, JF745973 to JF745998; for ftsI,
JF745999 to JF746024; for dacC, JF746025 to JF746050; for dacD, JF746051 to JF746074; for
pbpG, JF746129 to JF746154; and for mtgA, JF745947 to JF745972.
71
RESULTS
PBP genes in A. baumannii.
Seven PBP genes and one MTG gene were identified in the six A. baumannii genomes analyzed
in this study (Table 2). Four HMM PBPs were found: PBP1a (encoded by ponA), PBP1b (mrcB),
PBP2 (pbpA or mrdA), and PBP3 (ftsI). According to their N-terminal domains, they were
assigned to class A (PBP1a and PBP1b) or class B (PBP2 and PBP3). Sequence alignment
revealed the five conserved motifs [EDXXFXXHXG, GXSTXX(M/Q)QXXK, RKXXE, KXXIXXYXN,
and RXXXXL (where X is any amino acid)] of the glycosyltransferase N-terminal domain in both
HMM class A PBPs (Fig. 1A). In the C-terminal penicillin-binding (PB) domain, with
transpeptidase activity, the residue following motif 3 [K(T/S)GT] was a threonine in class A PBPs
(KTGTT for PBP1a and KSGTT for PBP1b) and an alanine in class B PBPs (KTGTA), as
expected (Fig. 1B). The HMM class A PBPs, PBP1a and PBP1b, are the major
transglycosylases-transpeptidases in A. baumannii and are probably involved in the elongation of
non-cross-linked glycan chains of peptidoglycan.
The presence of an aspartic acid residue at the third position of motif 2 (SXD) in the active site of
PBP2 (pbpA) and the presence of an asparagine residue at the same position in PBP3 confirmed
the classification of these PBPs into subclasses B2 and B3, respectively (Fig. 1C). Both PBP2
and PBP3 are monofunctional transpeptidases. PBP2 is a member of subclass B2, a group of
proteins involved in cell elongation. PBP3, as a member of subclass B3, is probably associated
with cell division. The fstI gene was localized in the A. baumannii genomes in an operon with the
mraW, mraY, ftsL, murE, and murF genes, which are associated with the divisome. MtgA
(encoded by mtgA) is a monofunctional transglycosylase with a glycosyltransferase domain
similar to those of PBP1a and PBP1b.
Three LMM PBPs have been found in A. baumannii: PBP5/6 (encoded by dacC), PBP6b (dacD),
and PBP7/8 (pbpG). These LMM PBPs are associated with cell separation and the maturation or
72
recycling of peptidoglycan. Analysis of the genes encoding PBP5 and PBP6 in A. baumannii
genomes showed that they are identical at the nucleotide and amino acid levels. Thus, this PBP
is referred to as PBP5/6 (dacC). This PBP and PBP6b (dacD) were classified as class C type 5
PBPs, and both are presumably D-Ala-D-Ala-carboxypeptidases. PBP7/8 (pbpG) is a class C
type 7 PBP with putative endopeptidase activity. No class C type 4 PBP genes seem to be
present in A. baumannii.
Hot spot mutations in PBP genes and β-lactam resistance.
The 26 clinical isolates were identified as A. baumannii by ARDRA, and all isolates carried a
blaOXA-51 allele (Table 1). PFGE profile analysis revealed that the 26 isolates were categorized
into 11 different clones. All A. baumannii isolates were susceptible to colistin and tigecycline, with
MICs ranging from 0.25 to 1 µg/ml and 0.5 to 1 µg/ml, respectively. Minocycline also showed
good coverage against the A. baumannii isolates tested (73.1% susceptibility; MIC at which 50%
of isolates were inhibited [MIC50], 2 µg/ml). High resistance rates were observed for expandedspectrum cephalosporins (MIC50, 32 µg/ml), cefepime (MIC50, ≥ 32 µg/ml), and aztreonam
(MIC50, >16 µg/ml). The MICs of imipenem and meropenem ranged from 0.25 to >32 µg/ml, and
for 53% of the isolates, the MICs of both these antimicrobial agents were >32 µg/ml. The majority
of the isolates were resistant to ciprofloxacin (MIC50, >2 µg/ml) and aminoglycosides (MIC50s, >8
µg/ml for gentamicin and >16 µg/ml for amikacin). All the A. baumannii isolates resistant to
carbapenems (n = 14) carried the plasmid-borne carbapenemase gene blaOXA-24 or the insertion
sequence ISAba1 upstream of the chromosomal blaOXA-51-like gene and/or AmpC (data not shown).
Analysis of the nucleotide sequences of the seven PBP genes and one MGT gene in the A.
baumannii clinical isolates revealed specific hot spot mutation regions in all genes. However,
most of the allelic variations observed were silent mutations (data not shown). The main changes
in the different PBP genes relative to the sequences of strain ATCC 17978 are shown in Table 3.
73
Although a few mutations were found in the amino acid sequences of the PBPs, none of these
mutations could be related to β-lactam resistance. The observed changes in the amino acid
sequence were associated with specific clonal patterns, and in general, the same mutations were
observed in organisms from the different hospitals as well as in the 10 genomes already
sequenced (Table 4). Interestingly, comparison of the amino acid consensus sequence
corresponding to each PBP gene in the A. baumannii genomes deposited in GenBank with the
corresponding amino acid consensus sequence of the 26 A. baumannii clinical isolates showed
that these genes were highly conserved (identity, 99.6% to 100.0%).
In two isolates (HUMV-1319 and HUMV-5118) of an endemic carbapenem-resistant clone (MIC,
>32 µg/ml) from one of the participating centers, PCR amplification of the carboxypeptidase
PBP6b gene showed a fragment of 2,410 bp instead of the expected 1,320 bp. Sequencing of
this amplicon indicated the presence of an insertion sequence (IS) disrupting the PBP6b gene.
This IS was identical to an IS30 family transposase found in the genome of A. baumannii strain
ACICU and was similar to ISAba125, differing only in His222Tyr codons in the transposase gene.
Two imperfect inverted repeats (IR-L [AAACTTGAAGTCGACA] and IR-R [TGTCGCACCTCA
TGTTT]) bordering the transposase gene were also identified. The IS was not found in the carO
gene in these two isolates (data not shown).
74
DISCUSSION
PBPs are involved in the metabolism of peptidoglycan, an essential component of the bacterial
cell wall (33). β-Lactams mimic the D-Ala-D-Ala dipeptide and act as suicide inhibitors binding
covalently to the PBPs (45). Inhibition of PBPs causes instability in the cell wall, resulting in
growth inhibition or lysis (42). In this study, seven PBP genes and one MGT gene were found in
the genomes of several A. baumannii strains, encoding PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6,
PBP6b, PBP7/8, and MtgA. The amino acid sequences of these PBPs in the A. baumannii clinical
isolates were compared with those in strain ATCC 17978. This strain was isolated in the early
1950s (1), prior to the development of the majority of the antimicrobial agents used in clinical
practice. This comparison showed that PBP genes are highly conserved in all A. baumannii
strains analyzed. The few point mutations observed could not be associated with carbapenem
resistance, since they were found in both susceptible and resistant strains. Some point mutations
were observed in specific isolates, especially in the genome of strain SDF (Table 4), a
multisusceptible A. baumannii strain. It is most probable that these variations are associated with
clonal patterns.
PBPs with low affinity for β-lactams had been described for Acinetobacter spp. (13, 26, 38).
Gehrlein et al. (13) described seven PBPs in an A. baumannii clinical strain with apparent
molecular sizes of 94, 84, 65, 61, 48, 40, and 24 kDa, based on phenotypic assays; the first six
could be identified as PBP1a (94.74 kDa), PBP1b (88.26 kDa), PBP2 (74.42 kDa), PBP3 (67.66
kDa), PBP5/6 (48.84 kDa), and PBP6 (41.78 kDa), respectively, but the last PBP did not correlate
with PBP7/8 (36.86 kDa). They also observed that imipenem could select in vitro for a resistant A.
baumannii mutant showing a complex reorganization of PBPs. Because no alterations in outer
membrane proteins (OMPs) or in β-lactamase production were detected in the imipenemresistant mutant, the authors associated the alterations in PBP profiles with the observed
75
imipenem resistance. In another study, Obara and Nakae (26) evaluated 12 imipenemsusceptible strains of Acinetobacter calcoaceticus and detected six PBP bands of 94 (PBPla), 92
(PBPlb), 86 (PBPlc), 74 (PBP2), 59 (PBP3), and 42 (PBP4) kDa. In vitro-selected mutants
resistant to cefoxitin, cefoperazone, or ceftazidime showed reduced expression of porins, as well
as alterations in PBP expression and/or affinity for β-lactams. In another study, an imipenemresistant nosocomial strain of A. baumannii showing PBPs with low affinity for β-lactamase
inhibitors, especially clavulanic acid, was reported (38). This study also showed that sulbactam
bound to PBPs better than tazobactam, even in imipenem-resistant strains, which may explain
the satisfactory in vitro activity of sulbactam against some multidrug-resistant A. baumannii
isolates (22, 28).
Fernández-Cuenca et al. (12) used 12% SDS-PAGE gels marked with 125I-labeled ampicillin to
evaluate the PBP profiles of two groups of A. baumannii isolates with imipenem and meropenem
MICs of 0.25 to 2 µg/ml and 4 to 32 µg/ml, respectively. Isolates HUS-31 and HUS-457, included
in the present study, are representative of these two groups, respectively. Isolates with
carbapenem MICs of ≥4 µg/ml showed reduced expression of a 73.2-kDa PBP named PBP2
(which may correspond to the PBP2 identified in this study [74.42 kDa]), associated with the
production of several β-lactamases, including oxacillinases (which has been confirmed in the
present study), and, in some isolates, with the loss of a 22.5-kDa porin. We have not observed
any mutations in PBP2 (or any other PBP) of strain HUS-457, suggesting that regulatory
mechanisms could be involved in the reported decreased expression of the 73.2-kDa protein in
this isolate.
An IS has been found to disrupt the dacD gene (encoding PBP6b) in two isolates of a
carbapenem-resistant endemic clone. This IS is similar to ISAba125, which was previously
reported to disrupt the carO gene (25), coding for a porin associated with resistance to
carbapenems in A. baumannii. Although E. coli mutants lacking one or all of the LMM PBPs failed
76
to substantially affect cell division or elongation (14), Moya et al. (24) have reported that in P.
aeruginosa, inactivation of the dacB gene (encoding the nonessential PBP4, but absent in A.
baumannii) is associated with a complex high-level β-lactam resistance, triggering ampC
overproduction and the specific activation of the CreBC two-component regulator, which also
activates the expression of β-lactamase in an Aeromonas PBP4-like mutant (36). Zamorano et al.
(44) also showed that dacB inactivation produced significantly higher MICs of antipseudomonal
penicillins and cephalosporins than ampD inactivation. We may speculate that the importance of
inactivation of the PBP6 gene in carbapenem resistance might be marginal. It was observed in
only 2 of the 14 carbapenem resistant isolates we studied (both of which belonged to the same
clone), in which resistance can be explained by the production of OXA-24. In fact, other OXA-24producing isolates are also resistant to carbapenems (Table 1), even though they do not have an
inactivated PBP6 gene. Unfortunately, attempts to silence the dacD gene in the carbapenem
susceptible A. baumannii strain ATCC 19606 (to verify the actual role of PBP6b in β-lactam
resistance) were unsuccessful until now. Additional studies on this topic are warranted.
Recently, Yun et al. (43) evaluated proteome regulation in an imipenem-resistant A. baumannii
strain under antibiotic stress conditions. They observed that the levels of RND family transporters
(AdeABC and AdeJIK), the PBP genes ponA (PBP1a), ftsI (PBP3), and dacC (PBP5/6), and,
noticeably, AmpC β-lactamase were increased in the presence of imipenem. In contrast,
repression of the OMPs OmpA and OmpW was observed under the same conditions. These
results suggest that together such mechanisms contribute to imipenem resistance in A.
baumannii.
77
ACKNOWLEDGMENTS
This work was partially supported by Instituto de Salud Carlos III, Spanish Network for Research
in Infectious Diseases (REIPI, RD06/0008) and FIS (PI080209). We are grateful to the
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), which gave a PDEE
grant to R.C. (protocol 4149/08-4). L. Dijkshoorn is thanked for providing A. baumannii strains
RUH-134 and RUH-875. We acknowledge the funding of MICINN (BFU2009-09200) to J.A.A.
TRANSPARENCY DECLARATIONS
We have no conflicts of interest to report.
78
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84
Table 1 - Genetic characterization of the 26 A. baumannii clinical isolates.
µg/ml) of:b
MIC (µ
PFGE
Strain
Hospitala/City
Oxacilinases types
clone
IPM MEM FEP CAZ CRO CTX ATM AMK GEN MIN
CIP
TGC
CST
HUMV-823
HUMV/Santander
A
>32
>32
>32
>32
>32
>32
>16
>16
>8
8
>2
1
0.5
OXA-51-like+ISAba1
HUMV-1175
HUMV/Santander
A1
>32
>32
>32
>32
>32
>32
>16
>16
>8
8
>2
1
0.5
OXA-51-like+ISAba1
HUMV-3743
HUMV/Santander
A2
>32
>32
>32
>32
>32
>32
>16
>16
>8
8
>2
1
0.5
OXA-51-like+ISAba1
HUMV-1102
HUMV/Santander
B
2
2
8
16
>32
>32
16
≤8
≤4
4
>2
1
1
OXA-51-like
HUMV-2790
HUMV/Santander
B
1
1
8
>32
>32
>32
>16
≤8
≤4
4
>2
1
1
OXA-51-like
HUMV-1319
HUMV/Santander
C
>32
>32
>32
16
>32
>32
>16
>16
>8
2
>2
1
0.5
OXA-51-like, OXA-24
HUMV-5118
HUMV/Santander
C
>32
>32
>32
>32
>32
>32
>16
>16
>8
1
>2
1
0.5
OXA-51-like, OXA-24
HUMV-2471
HUMV/Santander
D
>32
>32
8
≤8
4
4
8
>16
>8
2
>2
0.25
0.25
OXA-51-like, OXA-24
HUMV-4066
HUMV/Santander
D
>32
>32
>32
≤8
32
32
>16
>16
>8
2
>2
0.25
0.5
OXA-51-like, OXA-24
HUMV-6457
HUMV/Santander
D
>32
>32
>32
16
8
8
16
≤8
≤4
2
>2
0.25
0.5
OXA-51-like, OXA-24
HUMV-2120
HUMV/Santander
E
0.25
0.25
4
≤8
8
8
16
≤8
≤4
1
≤0.125
0.5
0.5
OXA-51-like
HUMV-4674
HUMV/Santander
F
0.5
0.5
8
≤8
8
8
16
≤8
≤4
0.5
1
2
0.5
OXA-51-like
HC-360
HC/Barcelona
G
1
2
32
32
>32
>32
>16
>16
>8
2
>2
1
0.25
OXA-51-like
HC-3581
HC/Barcelona
G
1
2
32
32
>32
>32
>16
>16
>8
2
>2
1
0.25
OXA-51-like
85
HC-4249
HC/Barcelona
G
>32
>32
>32
32
>32
>32
>16
16
>8
<0.5
>2
0.5
0.5
HC-4275
HC/Barcelona
G
>32
>32
>32
32
>32
>32
>16
>16
>8
1
>2
1
0.125
OXA-51-like+ISAba1, OXA-24
HC-60
HC/Barcelona
H
1
4
32
≤8
16
16
>16
16
>8
<0.5
1
1
0.125
OXA-51-like
HC-3343
HC/Barcelona
H
1
4
32
≤8
16
16
>16
16
>8
<0.5
1
1
0.125
OXA-51-like
HC-4256
HC/Barcelona
H
>32
>32
16
≤8
32
32
>16
≤8
>8
<0.5
1
0.5
0.25
OXA-51-like, OXA-24
HC-3202
HC/Barcelona
H
>32
>32
32
32
>32
>32
>16
>16
>8
2
>2
1
0.25
OXA-51-like, OXA-24
HC-771
HC/Barcelona
I
1
4
16
>32
>32
>32
>16
16
>8
8
>2
0.5
0.25
OXA-51-like
HC-769
HC/Barcelona
I
1
8
16
>32
>32
>32
>16
>16
>8
8
>2
1
0.25
OXA-51-like
HC-181
HC/Barcelona
I
>32
>32
16
>32
>32
>32
>16
>16
>8
8
>2
0.5
0.25
OXA-51-like+ISAba1
HC-1959
HC/Barcelona
I
>32
>32
>32
>32
>32
>32
>16
>16
8
8
>2
0.5
0.25
OXA-51-like+ISAba1
HUS-31
HUVM/Seville
J
0.25
0.5
32
16
>32
>32
>16
>16
>8
2
>2
2
0.25
OXA-51-like
HUS-457
HUVM/Seville
K
4
4
4
16
32
32
>16
16
>8
<0.5
>2
0.5
0.125
OXA-51-like
OXA-51-like, OXA-24
a. HUMV - Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, HC - Hospital Clinic, HUVM - Hospital Universitario Virgen Macarena.
b. IPM, imipenem; MEM, meropenem; FEP, cefepime; CAZ, ceftazidime; CRO, ceftriaxone; CTX, cefotaxime; ATM, aztreonam; AMK, amikacin; GEN,
gentamicin; MIN, minocycline; CIP, ciprofloxacin; TGC, tigecycline; CST, colistin.
86
Table 2 - The penicillin-binding proteins (PBPs) of A. baumannii.
% Identity with:
PBP (gene)
PBPs classificationa
Molecular function
Possible physiological
functionb
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia
coli
PBP1a (ponA)
HMM Class A (subclass A1)
Transglycosylase and
transpeptidase
Peptidoglycan synthesis
43
36
PBP1b (mrcB)
HMM Class A (subclass A2)
Transglycosylase and
transpeptidase
Peptidoglycan synthesis
42
32
Monofunctional enzymes (MGTs)
Monofunctional transglycosylase
Unknown
34
32
PBP2 (mrdA/pbpA)
HMM Class B (Subclass B2)
Transpeptidase
Cell elongation
45
39
PBP3 (ftsI)
HMM Class B (Subclass B3)
Transpeptidase
Septum formation
(Cell division)
39
39
PBP5/6 (dacC)
LMM Class C (Type-5)
D-ala-D-ala-carboxypeptidase
Unknown
48
40
PBP6b (dacD)
D-ala-D-ala-carboxypeptidase
Unknown
PBP7/8 (pbpG)
Endopeptidase
Unknown
MtgA (mtgA)
31
38
34
a. HMM, High molecular mass; LMM, Low molecular mass.
87
b. Enzymatic activities and functions predicted by sequence homology analysis.
c. Amino acid sequence homology for the PBP and MGT proteins from the genomes of the P. aeruginosa PA7 strain (accession no. NC_009656), E. coli
O157:H7 strain EDL933 (accession no. NC_002655.2) and A. baumannii SDF strain (accession no. NC_010400). Analysis was performed using the
CLUSTAL W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
88
Table 3 - Point mutations observed in the PBP genes in susceptible and resistant A. baumannii strains to carbapenems.
Point Mutation(s)c(clonal pattern[s])
origina
Strains
and
susceptibilityb
HUMV
(Imipenem-susceptible)
HUMV
(Imipenem-resistant)
HC
HC
(Imipenem-resistant)
HUVM
PBP1a
PBP1b
PBP2
PBP3
PBP5/6
PBP6b
PBP7/8
MtgA
ponA
mrdA
pbpA
fstl
dacC
dacD
pbpG
mtgA
0d
N329S (B),
T374V (B, E),
N296D (B, E),
N307S (B, E)
P28S (B),
T188P (B)
T45S (B, F),
A84T (B)
F18L (B, E, F) ,
T49P (B, E, F),
I54V (E, F),
N179S (B, E, F)
N329S (A, C, D),
T374V (A),
N296D (A),
N307S (A)
P28S (A),
A277T (D),
V350I (D),
S429N (D)
T45S (A, C,
D), A84T (A)
F18L (A, C, D),
T49P (A, C, D),
Q100E (C),
N179S (A, C, D)
N329S (I)
P28S (I),
T188P (G)
T39I (I),
T45S (G, H, I),
A84T (I)
F18L (G, H, I),
T49P (G, I),
Q100E (G),
N179S (G, H, I)
L147I (B),
T636A (E)
P112S (B)
P665A (E)
A244T (C),
S382N (C),
T636A (C, D)
P112S (A),
P764S (C)
V509I (C),
G V (C)
E110Q (D) 523
P112S (I),
P764S (G)
G V (G),
V509I (G) 523
H370Y (I)
T38A (H),
L147I (I),
A244T (G),
S382N (G),
T636A (G)
L147I (I),
A244T (G, H),
S382N (G, H),
T636A (G, H)
A244T (J),
S382N (J),
T636A (J)
P112S (I),
P764S (G, H)
P764S (J)
V509I (G)
G523V (G),
H370Y (I)
V509I (J),
G523V (J)
E110Q (K)
N329S (I)
0
T39I (I),
P28S (I),
T45S (G, H, I),
T188P (G, H)
A84T (I)
A277T (K),
V350I (K),
S429N (K)
T45S (J, K)
F18L (G, H, I),
T49P (G, I),
Q100E (G, H),
N179S (G, H, I)
F18L (J, K),
T49P (J, K),
Q100E (J),
N179S (J, K)
a. HUMV - Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, HC - Hospital Clinic, HUVM - Hospital Universitario Virgen Macarena.
89
b. Imipenem-susceptible (MIC ≤ 4 µg/mL) and Imipenem-resistant (MIC ≥ 16 µg/mL).
c. Amino acid substitution(s) relative to the genome of A. baumannii strain ATCC 17978.
d. No mutations relative to the genome of A. baumannii strain ATCC 17978 were observed.
90
Table 4 - Point mutations observed in the PBP genes of the 10 A. baumannii genomes and the reference strain RUH-134.
Strain
Point Mutations
PBP3
PBP5/6
fstl
dacC
PBP1a
ponA
PBP1b
mrdA
PBP2
pbpA
RUH-134
L147I
0a
0
0
ACICU
L147I
P112S
0
SDF
A224T, T636A
S274A, R590H, Q601E, R712H,
Q765E
AYE
T38A, A244T
AB0057
AB307-0294
AB900
AB056
AB058
AB059
ATCC 19606
PBP6b
dacD
PBP7/8
pbpG
MtgA
mtgA
N329S
P28S
A84T
F18L, T49P
A346V, H370Y
0
P28S, K229Q
T45S, A84T
0
0
S5 N
S418N
T45S, R218H
N513H
P665A
0
0
0
T45S
T38A, A244T
N513H
P665A
0
0
0
T45S
T38A, A244T,
A613T
N513H
P665A
0
N329S
0
T45S
T636A
0
E110Q
0
0
A277T, V350I,
S429N
T45S
0
P665A
0
0
0
T45S
0
P665A
V565L
0
0
T45S
0
P665A
0
0
0
T45S
0
0
0
0
Q143K
T45S
T38A, A244T,
T776A
T38A, A244T,
T776A
T38A, A244T,
T776A
V623I
F18L, T49P,
N179S
V8M, F18M,
T49P, Q100E,
N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
Q100E, N179S
F18L, T49P,
N179S
a. No mutations relative to the A. baumannii ATCC 17978 genome were observed.
91
A
Motif 1
Motif 2
Motif 3
Motif 4
Motif 5
B
C
Figure 1. Identification of the conserved motifs in the consensus sequences encoded by the
HMM PBP genes of A. baumannii genomes used for the classification of PBPs, according to the
work of Sauvage et al. (33). (A) Localization of the five characteristic conserved motifs of the Nterminal domain (boxed) in both HMM class A PBPs, PBP1a and PBP1b. (B) Arrows indicates
differences in the motif 3 of the C-terminal domain (underlined) between the HMM class A and
class B PBPs. (C) Arrows indicate the motif 2 residues in third position of the active site of the
HMM of class B PBPs, used to divide these PBPs in subclasses B2 and B3. The first two
residues of the active site are underlined.
92
OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in Acinetobacter
pittii in Spain
Rodrigo Cayô1§*, María Merino2§, Belén Ruiz del Castillo1, María Eliecer Cano1, Jorge Calvo1,
Germán Bou2 and Luis Martínez-Martínez1,3.
§Both
authors have equally contributed to this work.
Short running title: blaOXA-207 in A. pittii.
1Servicio
de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander,
Spain;
2Laboratorio
de Microbiología, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC) - INIBIC,
La Coruña, Spain;
3Departmento
de Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Cantabria,
Santander, Spain.
[email protected].
93
ABSTRACT
A carbapenem-resistant A. pittii strain carrying an OXA-24-like enzyme was isolated in
Santander, Northern Spain in 2008. The isolate also exhibited high level resistance to penicillins
and monobactams, and remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. Sequence
analysis confirmed the presence of the novel blaOXA-207 carbapenemase gene that presented a
point Gly222Val substitution with respect to that of OXA-24. This residue was located adjacent to
Met-223, which defines a tunnel-like entrance to the active site of OXA-24. Analysis of the genetic
context of blaOXA-207 showed the presence of the site-specific XerC/XerD-like recombination
binding sites flanking the oxacillinase gene which was identical to the corresponding structures
flanking the blaOXA-24 gene in A. baumannii strains isolated in the same institution. Cloning and
kinetic analysis showed that OXA-207 presents a reduction in the catalytic efficiency against
carbapenems and a noticeably increased in specificity for oxacillin compared with OXA-24, in
agreement with the previous structural-function data of OXA-24. In summary, a novel OXA-type
enzyme has been isolated from a carbapenem resistant A. pittii clinical isolate, which showed
reduced catalytic efficiency against the carbapenems due to a Gly222Val amino acid
replacement. This mutation probably caused a misorientation of carbapenems to gain access to
the active center of the OXA-enzyme.
Key words: oxacillinase, CHDL, active site, kinetic analysis, XerC/XerD-like.
94
INTRODUCTION
Acinetobacter pittii (formerly Acinetobacter genomic species 3) is a member of the Acinetobacter
calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex that includes three other species: A. baumannii,
A. calcoaceticus and Acinetobacter nosocomialis (formerly Acinetobacter genomic species
13TU).1 The use of molecular methods2,3 for correct identification of the Acinetobacter species
has shown that A. pittii (and A. nosocomialis) is commonly isolated from clinical specimens and
may be associated with hospital outbreaks.4-6 A. pittii seems to be ecologically diverse as it was
found in food, soil, and in healthy and clinically ill individuals, being able to produce serious
infections.7-9 A. pittii usually remains susceptible to the majority of antimicrobial agents used in
the clinical practice.10 However, carbapenem-resistant A. pittii isolates harboring oxacillinase
genes have been reported.11,12
Oxacillinases are a group of β-lactamases with heterogeneous structural and biochemical
properties.13 The carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamases (CHDLs) are mainly found in A.
baumannii and are included in four clusters: the intrinsic chromosomally OXA-51-like and the
acquired OXA-23-like, OXA-24-like and OXA-58-like. The corresponding genes can be either
chromosome or plasmid encoded.13,14 The OXA-24 cluster comprises of six described variants:
OXA-24 (identical to OXA-40), OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139 (accession number
AM991978) and OXA-160. 12,15-18 The amino acid sequences of OXA-143 and OXA-182 enzymes
present a high identity with OXA-24, and should be included as members of the cluster OXA-24,
instead of the new clusters proposed.8,19 Whereas the blaOXA-23 and blaOXA-58 genes are commonly
surrounded by insertion sequences (IS) that enhance their expression, the genes belonging to the
OXA-24 cluster are not associated with these structures.13,20 In the latter case it seems that
XerC/XerD recombination sites are key structures associated with its spreading, although this
event has not been clearly demonstrated.8,21 Overall, it is clear that these enzymes are by
themselves able to cause resistance to carbapenems.13,14,22 Eventually, the acquired-CHDLs can
95
be transferred from A. baumannii to other non-baumannii species, compromising the therapeutic
options to treat the infections caused by these pathogens.23,24
The aim of this study was to characterize a novel OXA-24 variant (OXA-207) in a carbapenemresistant A. pittii isolate from Spain.
96
Materials and Methods
Bacterial strains.
A. pittii HUMV-1588 is a carbapenems-resistant clinical strain isolated in April 2008 from a
bronchial aspirate of a patient admitted to the Medical Intensive Care Unit in the Hospital
Marqués de Valdecilla, a tertiary teaching hospital located in Santander, Northern Spain. The
isolate was firstly identified as Acinetobacter baumannii/A. haemolyticus by the automated
system MicroScan Walk-Away (Siemens Healthcare Diagnostic Inc., West Sacramento, CA). A.
baylyi ADP1 was used as a host of the different recombinant plasmids. E. coli BL21 was used for
carbapenemase gene expression. Bacteria were grown at 37 ºC in Luria-Bertani medium,
supplemented with the appropriate antibiotics.
Identification of Acinetobacter species.
Species identification of HUMV-1588 strain was performed by two methodologies: (I) amplified
ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) method, using the enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI
and MspI;3 and (II) sequencing analysis of partial regions of RNA polymerase β subunit (rpoB)
gene [zone 1 (350 bp, between positions 2,900 and 3,250) and zone 2 (450 bp, between
positions 3,250 and 3,700)], as previously published.2,25
Antimicrobial susceptibility testing.
MICs of ampicillin, ampicillin/sulbactam, amoxycillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam,
cefoxitin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem, amikacin,
gentamicin, tobramycin, tetracycline, minocycline, doxycycline, levofloxacin, ciprofloxacin,
chloramphenicol, tigecycline, colistin and trimethoprim-sulfamethoxazole were determined by
Etest strips, according to manufacturer’s (bio-Mérieux, Marcy l’Étoile, France) recommendations.
Results for tigecycline were interpreted according to the US Food and Drug Administration (FDA)
97
breakpoints for Enterobacteriaceae (susceptible, ≤2 mg/ml; intermediate, 4 mg/ml; resistant, >8
mg/ml), and for the other antimicrobial agents tested the Clinical Laboratory Standard Institute
(CLSI) breakpoints were considered.26 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia
coli ATCC 25922 were used as quality control strains.
PCR assays for molecular characterization of β-lactamase genes associated with
carbapenem resistance.
Genomic DNA from A. pittii HUMV-1588 was extracted with InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA), according to manufacturer’s recommendations. As screening,
multiplex-PCR assays were performed to investigate the presence of CHDLs (blaOXA-23-like, blaOXA24-like,
blaOXA-51-like, blaOXA-58-like) and metallo-β-lactamase (blaIMP-like, blaVIM-like, blaSPM-1, blaGIM-1 and
blaSIM-1)
encoding
genes
as
previously
reported.27,28
207.A:5’AYTTCGBATAAYSSCCATTATGTTAAATTAAAAGA’3
Primers
and
Pre-OXAPre-OXA-
207.B:5’ATTTCGYATAASGYGTATTATGTTAATTTTAGAAA’3 amplifying the entire blaOXA-24-like
genes and surrounding regions (amplicon size of 967 bp), including its flanking region composed
of XerC/XerD-like recombination sites, were designed according to previously reported
sequences.17,21 PCR conditions were as follows: 95º C for 5 min, followed by 35 cycles of 95 ºC
for 30 s, 45 ºC for 30 s and 72 ºC for 2 min, followed by 72 ºC for 7 min. PCR products were
analyzed on a 1% (w/v) agarose gel stained with ethidium bromide. PCR products were purified
by using a High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).
Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen Inc. (Seoul, South Korea).
Cloning and characterization of the new OXA-207.
The blaOXA-24 and the blaOXA-207 were amplified in parallel by PCR with the primers OXA24/207Fow-XbaI
5´-CCCTCTAGAATGAAAAAATTTATACTTCC-3ánd
OXA24/207-Rev-NcoI
5´-
98
CCCCCATGGTTAAATGATTCCAAGATTTTC-3´. The purified amplicons were cloned between
XbaI and NcoI restriction sites in pET-RA plasmid harboring a rifampicin resistance gene
[GenBank: HM219006]. The constructions were used to transform A. baylyii ADP1 cells by
electroporation (25 µF, 200 Ω, 2.5 kV), with a Gene Pulser II (BioRad, Richmond, CA).
Transformants were selected on LB plates supplemented with 50 mg/L of ampicillin and 50 mg/L
of rifampicin. All constructions were confirmed by sequencing both strands, by standard
procedures. MICs for ampicillin, imipenem and meropenem were determined by broth
microdilution for the A. pittii HUMV-1588 and A. baylyii ADP1 strains, as well as for the A. baylyii
ADP1 transformants, according to the CLSI guidelines.26,29
Antibiotic and other chemicals.
Ampicillin and oxacillin were obtained from Sigma (St Louis, MO, USA). Imipenem was from
Merck (Whitehouse Station, NJ), and meropenem from AstraZeneca (London, United Kingdom).
Nitrocefin was obtained from Oxoid (Basingstoke, Hants, UK). The antibiotic molar extinction
coefficients in the spectrophotometric assays were 1050, 258, 9000, 6500 M-1 cm-1, respectively.
The wavelengths used for measurements were 235 nm for ampicillin, 260 nm for oxacillin, 300
nm for imipenem and meropenem and 495 nm for nitrocefin.
Purification of the carbapenemase.
To purify OXA-207, the corresponding gene was cloned into the pGEX-6P-1 vector with BamHI
and EcoRI restriction sites to produce translational fusions with the glutathione S-transferase
(GST) gene. The primers used for amplification of the gene lacking the signal peptide are
OXA24/207-pepBamHI 5´-AAGGATCCTCTATTAAAACTAAATCTGAAG-3´ and OXA24/207RevEcoRI 5´-AAAGAATTCTTAAATGATTCCAAGATTTTC-3´. The OXA-207 and the OXA-24
were purified to homogeneity with the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia Biotech,
99
Europe GmbH), in accordance with the manufacturer’s instructions. The mature purified protein,
lacking the GST fusion protein, appeared on SDS-PAGE gels as a band of 30.99 kDa (≥ 95%
purity) (data not shown). The concentrations of the purified proteins were determined by a protein
assay (Bio-Rad, Richmond, CA).
Determination of kinetic parameters.
The proteins OXA-207 and OXA-24 were subjected to further biochemical studies with ampicillin,
oxacillin, imipenem and meropenem. Biochemical studies (Kcat/Km ratio) were carried out at 25º C
in a Nicolet Evolution 300 spectrophotometer (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA)
and the data obtained were analyzed with Vision Pro software (Thermo Electron Corporation). Km
values were calculated as Ki values in competitive assays with nitrocefin as the substrate. The
Kcat values were obtained under zero-order conditions ([S] > Km). The tests were repeated three
times in PBS with 20 mg/L BSA.
Nucleotide sequence accession numbers.
The complete nucleotide sequences of blaOXA-207 and partial sequence of rpoB gene from A. pittii
HUMV-1588 strain were deposited in the GenBank nucleotide database under accession
numbers JQ838185 and JQ838184, respectively.
100
RESULTS
Molecular taxonomic identification and antimicrobial susceptibility.
The carbapenem-resistant HUMV-1588 isolate was identified as A. pittii by ARDRA, showing a
profile 21313. Sequencing analysis of both zones of rpoB gene, confirmed this result. HUMV1588 A. pittii was resistant to amoxicillin (MIC, > 256 mg/L), ampicillin (MIC, > 256 mg/L),
cefoxitin (MIC, > 256 mg/L), chloramphenicol (MIC, > 256 mg/L), ciprofloxacin (MIC, 16 mg/L),
imipenem (MIC, 32 mg/L), meropenem (MIC, 32 mg/L), aztreonam (MIC, >256 mg/L) and
piperacillin-tazobactam (MIC, > 256/4 mg/L); intermediate to cefepime (MIC, 16 mg/L); and
susceptible to ampicillin-sulbactam (MIC, 8/16 mg/L), ceftazidime (MIC, 2 mg/L), cefotaxime
(MIC, 4 mg/L), gentamicin (MIC, 0.5 mg/L), tobramycin (MIC, 0.06 mg/L), amikacin (MIC, 2 mg/L),
levofloxacin (MIC, 2 mg/L), tetracycline (MIC, 2 mg/L), doxycycline (MIC, 0.25 mg/L), minocycline
(0.125 mg/L), tigecycline (0.125 mg/L), colistin (MIC, 0.25 mg/L) and trimethoprimsulfamethoxazole (MIC, 0.06 mg/L).
Identification of the blaOXA-207 gene.
A. pittii HUMV-1588 lacks a chromosomal-encoded blaOXA-51-like gene and any of the investigated
metallo-β-lactamase-encoding genes. However, this isolate carried a CHDL blaOXA-24-like gene.
Sequencing of a 967-bp amplicon showed the presence of an open reading frame of 828-bp
which encoded a product predicted to have 99.0% amino acid identity with OXA-24 β-lactamase.
The HUMV-1588 harbored a new variant of the CHDL OXA-24 cluster, designated OXA-207. This
new enzyme had a G→T mutation at nucleotide 665, causing a unique Gly222Val change.
A comparison of the predicted amino acid sequences of OXA-207 with those of the OXA-24
variants, as well as with the two related enzymes, OXA-143 and OXA-182, is shown in Figure 1.
The OXA-24 cluster comprises of seven different variants that present a high identity (99.0%)
between them, diverging from the OXA-24 from one [OXA-26 (Ser257Thr), OXA-72 (Gly224Asp),
101
OXA-139 (Asn87Ile), OXA-160 (Pro257Ser) and OXA-207 (Gly222Val)] to two [OXA-25
(Lys202Glu and Ser268Leu)] amino acids. These CHDLs differ from OXA-182 and OXA-143
enzymes in 30 (89.0% of identity) to 34 (87% of identity) amino acids, respectively, with the latter
two oxacillinases differing between them in 19 amino acids (93.0% of identity). The three
conserved motifs (STKF, FGN and KSG) responsible for the formation of the active site of the
oxacillinase group are identical between the OXA-24-like, OXA-143 and OXA-182 enzymes. The
Gly222Val substitution present in OXA-207 is near to the third conserved motif KSG of this βlactamase and adjacent to Met-223, which has been defined as a key residue in defining the
tunnel-like entrance of carbapenems to the active site of the enzyme. The partial sequences of
the genetic context of blaOXA-207 gene revealed, as previously described in this group of genes,
the presence of the site-specific recombination XerC-XerD-like binding sites flanking the
oxacillinase gene.
Antibiotic susceptibility testing.
The MICs (mg/L) of ampicillin, imipenem and meropenem for A. pittii HUMV-1588 clinical isolate,
the A. baylyi ADP1 clones harboring the pET-RA plasmid harboring the blaOXA-207 and blaOXA-24WT
and the recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone are listed in Table 1. The MICs of
imipenem and meropenem for A. baylyi ADP1 expressing the blaOXA-207 gene were increased by
7-fold, similar to those obtained by the A. baylyi ADP1 expressing the blaOXA-24WT and A. pittii
HUMV-1588. Although the MICs of ampicillin are increased by 7-fold and 8-fold in the recipient
clones harboring the blaOXA-207 and blaOXA-24WT, respectively, the results obtained for the A. pittii
HUMV-1588 were 3-fold higher.
102
Biochemical studies.
Ampicillin, oxacillin, imipenem and meropenem were selected for kinetic studies and the kinetic
parameters obtained for OXA-24 and OXA-207 are shown in Table 2. Kinetic parameters (Table
2) corroborate MICs values. The Kcat/Km values for ampicillin for OXA-24 and OXA-207 are
similar, differing for an increase in the Km for OXA-207. However, the OXA-207 shows high rates
of hydrolysis for oxacillin (low Km) comparing with the OXA-24 (high Km). The Kcat/Km for OXA-207
was 8,934.7 compared with 48,626 for OXA-24. Although both enzymes showed high affinity for
imipenem and meropenem (low Km), OXA-24 hydrolyzes carbapenems better than OXA-207,
since OXA-24 show higher Kcat values than OXA-207. The catalytic efficiencies (Kcat/Km) of OXA24 for meropenem and imipenem were 2 and 3 times higher, respectively, than those of OXA-207
(Table 2).
103
Discussion
The difficulties in identification of more than 34 species and genomic species of Acinetobacter
described until now, explain the limited clinical information about these microorganisms.1 The use
of molecular methods for a correct identification of Acinetobacter non-baumannii species has
contributed to the understanding of the epidemiology and the real impact of these species as a
cause of human infections.10,12,19,24,30-32 Recently, molecular epidemiology studies have shown
that the frequency of A. pittii or A. nosocomialis may be even greater than A. baumannii.10
To date OXA-24 β-lactamase was reported in Europe,33-38 Asia-Pacific24 and USA.39-41 Most
OXA-24 variants have been described in specific strains isolated in Spain (OXA-25 and OXA207), Belgium (OXA-26), Italy (OXA-139) and USA (OXA-160).15,18 OXA-72 was first described in
an A. pittii isolate from China in 2007,12 and has subsequently been reported in Europe23,31,42-46
and Taiwan.43 Two other CHDL enzymes related to the OXA-24 cluster have been described in
Brazil (OXA-143) and in South Korea (OXA-182).19 Recent studies have shown that OXA-143 is
the second most important CHDL found in Brazilian A. baumannii isolates and OXA-182 is an
emerging CHDL in South Korea.19,48,49
D’Andrea and colleagues revealed that the blaOXA-24 gene was flanked by conserved inverted
repeats homologous to XerC/XerD binding sites that are associated with DNA mobilization in
Acinetobacter plasmids.21 In another study, Merino and colleagues reported an A. calcoaceticus
clinical isolate carrying the blaOXA-24 during a multidrug-resistant A. baumannii clonal outbreak in a
hospital in Spain.50 Both plasmids harboring the blaOXA-24 gene from the A. calcoaceticus and A.
baumannii strains demonstrated the presence of XerC/XerD recombination binding sites.50 The
same structures were also found flanking the blaOXA-72 and blaOXA-160.51 Our results corroborate
these findings, demonstrating that OXA-207 is also flanked by XerC/XerD-like recombination
binding sites. Although no information about the genetic context of OXA-25, OXA-26, OXA-139 or
104
OXA-182 is available, it would be possible that all these CHDLs are mobilized by a similar
mechanism.
More recently, Rumbo and colleagues demonstrated that clinical isolates of A. baumannii may
release outer membrane vesicles as a mechanism of horizontal plasmid harboring the blaOXA-24
gene transfer to A. baumannii ATCC 17978, increasing the possibilities of CHDL gene transfer
between Acinetobacter spp. clinical isolates.51 The capacity of dissemination of the OXA-24, was
exemplified in a study conducted by Sevillano and colleagues that reported the presence of
blaOXA-24 gene in P. aeruginosa carried by a plasmid also found in A. baumannii from a hospital in
northern Spain.52 Other studies described transmission of genes coding for CHDL and metallo-βlactamase from A. baumannii to other Acinetobacter species in different regions.12,23,24,31,37 In A.
pittii, the CHDLs described until now were OXA-58 in Germany and OXA-72 in China.11,12
Although OXA-24 is the most disseminated CHDL in A. baumannii clinical isolates in Spain,16,17
this is the first report of an OXA-24 variant in a non-baumannii species in the same country. The
presence of the same XerC/XerD structure flanking the novel OXA-207 found in A. pittii HUMV1588, as well as in the OXA-24-producing A. baumannii clones identified in our hospital during
the last 5 years (data not shown, manuscript in preparation), emphasize a possible gene transfer
from A. baumannii to A. pittii. The A. pittii HUMV-1588 was resistant to penicillins, monobactams
and carbapenems, but remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. OXA-207, as
observed for the other CHDLs, did not significantly hydrolyze expanded-spectrum
cephalosporins.8,13,22
The unique Gly222Val mutation was near the KSG conserved motif of the active site of the OXA207 and adjacent to the key residue Met-223, which is very important from a structural point of
view for the biochemical properties of OXA-24. An analysis of the crystal structure of OXA-24
showed that the specificity to carbapenems in this CHDL is determined by a hydrophobic barrier
that is established through the specific arrangement of a pair of amino acid residues Tyr-112 and
105
Met-223 side chains, which define a tunnel across the active site of this β-lactamase.22 The
orientation of both residues delimits the access to the catalytic binding-site, positioning
appropriately the carbapenem for an optimal recognition.22 The presence of this “tunnel” on the
OXA-24 enzyme alters drastically the conformation of the distal pyrrolidine/sulfonamide group of
the carbapenems, that will interfere in the capacity to hydrolyze these antimicrobial agents better
than the others oxacillinases.53 Based on the analysis of two mutants (Tyr112Ala and Met223Ala),
it was possible to conclude that the residue Tyr-112 are important to confer high MICs of
imipenem and meropenem, instead of the residue Met-223. Interesting the Met-223 residue is
exactly next to the Gly222Val mutation observed in the novel OXA-207 variant. The results for the
OXA-207 (Gly222Val) were similar to those obtained by the Met223Ala previously. A reduction in
the catalytic efficiency against the carbapenems and a noticeably increased in specificity for
oxacillin were observed by both mutations [Gly222Val (OXA-207) and Met223Ala]. This data can
justify the strong hydrolysis (high Kcat/Km ratio) of oxacillin observed by OXA-207 β-lactamase
compared with the OXA-24 WT. However, the Kcat/Km ratio for imipenem and meropenem
observed by the OXA-207 were not lower than those described by the previous study by the in
vitro double mutant OXA-24 (Tyr112Ala + Met223Ala). Maybe the alterations in the tunnel-like
entrance caused by the Gly222Val (OXA-207) were not sufficient to avoid the recognition of
carbapenem molecule by the active site of the β-lactamase. Although OXA-207 hydrolyzed
weakly the carbapenems, this β-lactamase significantly contributes to resistance to imipenem and
meropenem in the A. pittii HUMV-1588 clinical isolate.
In conclusion, we have identified for the first time a carbapenem-resistant A. pittii clinical isolate
harboring the novel OXA-207 enzyme (an OXA-24 variant) in Spain. Our findings suggest that the
unique mutation present in the OXA-207 changed its catalytic activity against the β-lactams. The
emergence of the OXA-207 carbapenemase in an A. pittii clinical isolate is a concern, since the
106
possibility of its dissemination will drastically change the treatment of infections caused by this
pathogen.
107
ACKNOWLEDGMENTS AND FUNDING
This work was partially supported by Instituto de Salud Carlos III, Spanish Network for Research
in Infectious Diseases (REIPI, RD06/0008) and Fondo de Investigación Sanitaria (PI080209 and
PS09/00687). We are grateful to the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), which gave a PDEE grant to R.C. (protocol 4149/08-4).
We gratefully acknowledge the assistance of Sophia Mooney in the preparation of the
manuscript.
TRANSPARENCY DECLARATIONS
We have no conflicts of interest to report.
108
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115
Table 1. MICs determined by broth microdilution for OXA-207-producing clinical isolate A. pittii
HUMV-1588, recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone, clone A. baylyi ADP1
harboring the plasmid pETRA with blaOXA-24, and clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid
pETRA with blaOXA-207 are shown.
Antimicrobial
A. pittii
A. baylyi +
A. baylyi +
Agents
(blaOXA-207)
pETRA+blaOXA-24
pETRA+blaOXA-207
Ampicillin
4096
1024
512
4
Imipenem
32
32
16
0.125
Meropenem
32
32
16
0.125
A. baylyi
116
Table 2. Kinetic parameters of purified β-lactamases OXA-24 and OXA-207a.
OXA-24
Antimicrobial
Agent
OXA-207
Kcat (s-1)
Km (µM)
Kcat/Km (mM1s-1)c
2,882.8
337.5
(±6.7)
150.9 (±15.4)
2,236.6
403.4
(±127.8)
48.6
383.3
(±28.5)
42.9 (±8.3)
8,934.7
1.96
(±0.41)
0.60
(±0.10)
3,266.7
0.41
(±0.01)
0.37 (±0.07)
1,108.1
0.165
(±0.004)
0.017
(±0.001)
9,705.9
0.043
(±0.002)
0.008
(±0.001)
5,375.0
Kcat (s-1)
Km (µM)
Kcat/Km
(mM-1s-1)c
Ampicillin
258.3
(±29.1)
89.6
(±38.0)
Oxacillin
19.6 (±0.8)
Imipenem
Meropenem
aData
are the means (±SD) of three independent experiments.
117
Figure 1. Alignment of the amino acid sequences of the OXA-24 and its variants (OXA-25, OXA26, OXA-72, OXA-139, OXA-143, OXA-160, OXA-182 and OXA-207). Analysis was performed
using the CLUSTAL W multiple sequence alignment program. All sequences were obtained
according with the accession numbers provided by β-Lactamase Classification and Amino Acid
Sequences website (http://www.lahey.org/Studies/). Conserved motifs are boxed. Points
represent conserved amino acids. Arrow indicates the Gly222Val substitution in the predicted
amino acid sequence of 207.
118
Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North
of Spain
Rodrigo Cayô1*, Maria Eliecer Cano1, Jorge Calvo1 and Luis Martínez-Martínez1,2.
Short running title: Emerging Acinetobacter Species among Clinical Isolates.
1Service
of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander, Spain;
2Department
of Molecular Biology, School of Medicine, University of Cantabria, Santander, Spain.
[email protected].
119
ABSTRACT
Eighty six no repetitive clinical isolates, representative of each Rep-PCR pattern, identified by
MicroScan-WalkAway® as A. calcoaceticus-baumannii complex collected during 2004-2008
period in a tertiary teaching hospital, had their identification confirmed by ARDRA. Only 44.2% of
isolates was confirmed to be A. baumannii harboring 12 different blaOXA-51-like genes. Eight
different non-baumannii species were also identified and A. pittii (41.8%) was the most frequent
among them. All carbapenem-resistant A. baumannii isolates carried the blaOXA-24/40 or blaOXA-51like-ISAba1 genes. The blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenemsusceptible A. pittii clone. Emerging Acinetobacter species have been identified in our hospital
and their actual incidence could be underestimated by using only automated identification
systems.
120
Acinetobacter species have emerged as important opportunistic pathogens responsible for a
variety of severe nosocomial infections, especially the four closely related and phenotipically
similar species included in the Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.1-4 Although, A.
baumannii is the most prevalent and resistant species of this group, the real incidence of the
other members can be underestimated, because the identification at the species level using
phenotypic methods is complex and problematic,2 and automated systems have shown
unsatisfactory results to discriminate these microorganisms.3 In this way, a great variety of
molecular methods have been proposed to attempt to correctly identify the Acinetobacter
species.4-6 However, many of these methodologies are not applicable in the clinical microbiology
routine. This study was designed to evaluate the diversity of Acinetobacter species and to
characterize the production of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDLs) among
these isolates during a 5-year period in a tertiary university hospital in northern Spain. This work
was presented in part as a poster presentation at the 21th European Congress of Clinical
Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID in Milan, 2011.
During the period of 2004 to 2008, a total of 603 clinical isolates identified previously as A.
calcoaceticus-baumannii complex by MicroScan-WalkAway® (Siemens Healthcare Diagnostic
Inc., West Sacramento, CA) in a tertiary teaching hospital, with 900-beds, localized in the north of
Spain, were selected. The clonal relationships of the A. calcoaceticus-baumannii complex
isolates
were
determined
by
Rep-PCR
using
the
primers
pairs
REP-1
(5´-
IIIGCGCCGICATCAGGC-3´) and REP-2 (5´-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3´), as described
previously7 and the amplified fragments were separated on a 1.5% (w/v) agarose gel for 240 min.
Rep-PCR gels were analyzed by BioNumerics program version 5.0 (Applied Maths, Kortrijk,
Belgium). In all images, the definition of bands was performed automatically by the program and
then checked individually by visual comparison. The similarity coefficient used was the Dice
coefficient. 8 The dendrogram was constructed using the algorithm UPGMA phylogenetic analysis
121
(unweighted Pair-Groups Method using arithmetic Averages).9 The values used for optimization
and tolerance for all of the isolates were 1.0 and 2.0%, respectively. The Rep-PCR results
showed 98 different patterns (Figure 1). However, a single representative isolate of 12/98 RepPCR patterns were not viable or contaminated. For this reason, one isolate of each remainder
patterns (n=86) was chosen for the further analysis. The detection of CHDL-encoding genes was
performed by multiplex PCR, as previously published10 and confirmed by sequencing. The
presence of the blaOXA-51-like gene was considered as predictor for A. baumannii. To confirm the
identification at species level for all clinical isolates was carried out by amplified rRNA gene
restriction analysis (ARDRA), as previously described.6
Surprisingly, only 38/86 (44.2%) of the isolates were positive for blaOXA-51-like gene and, as
expected, these isolates were identified as A. baumannii, showing three different ARDRA profiles
(Table 1). Among the 38 A. baumannii clones, a total of 12 blaOXA-51-like genes were found: blaOXA64,
blaOXA-65, blaOXA-66, blaOXA-67, blaOXA-68, blaOXA-69, blaOXA-70, blaOXA-71, blaOXA-94, blaOXA-98, blaOXA-
106
and blaOXA-117. These results are in accordance with a previous study conducted by Héritier et
al. who also showed that the blaOXA-51-like are, in generally, closely related with the clonal pattern
of the A. baumannii isolate.11 A great diversity of Acinetobacter species has been founded among
the blaOXA-51-like-negative isolates. Interestingly, 41.8% (n=36) of the isolates were identified as A.
pittii (ARDRA profile 21213), being the second most frequently Acinetobacter spp. in our hospital
(Table 1). Epidemiological studies have done a correct identification of the isolates belonging to
the A. calcoaceticus-baumannii complex. These findings shows that, although A. baumannii is the
most prevalent and important specie, the frequency of isolation of A. pittii and A. nosocomialis
may be equal or even superior to A. baumannii,12-14 depending of the hospital or geographic
region. These two species can even be capable of causing outbreaks.15-16
All carbapenem resistant A. baumannii isolates harbored the blaOXA-24/40 or the blaOXA-51-likeISAba1. In opposite, the carbapenem-susceptible isolates did not show the ISAbA1 upstream to
122
blaOXA-51-like gene. Previously studies have shown that the OXA-24/40 is the most important and
disseminated CHDL in Spain,17 indeed this enzyme are endemic to the Iberian Peninsula.18
Interestingly, the blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenem-susceptible
A. pittii clone in the present study. Marti et al. reported the presence of OXA-58-ISAba3 isolated
from an A. pittii isolate showing high resistance levels to imipenem (MIC > 32 mg/mL) in Spain.19
However, the authors explain that production of OXA-58 alone is not sufficient to cause elevated
MICs for imipenem, which requires the contribution of other resistance mechanisms, such as
porins loss and active efflux.19 In another study, it was reported the presence of OXA-23 and
OXA-58 A. radioresistens and A. bereziniae carbapenem-susceptible isolates, respectively.19
Evaluating the genetic background of the OXA-58, the authors found the same results obtained
by Marti et al. in A. pittii and explain that ISAba1, ISAba2 and IS18 works as better promoters
than ISAba3, which could explain the susceptibility to carbapenems observed in A. bereziniae
isolate19 and, probably, in A. pittii isolates of our study. The authors conclude, remembering that
Acinetobacter spp. isolates susceptible to carbapenems, but producers CHDLs, act as reservoirs
of resistance genes, since they could not be identified by routine methods, which generally
assess samples resistant.
Other seven different species were also identified. A common ARDRA profile 42123 for A.
bereziniae and A. guillouiae was obtained for three isolates (Table 1), and an additional restriction
enzyme BsmaI was necessary to further differentiate both species. A restriction pattern 1 was
observed for BsmaI enzyme, identifying the isolates as A. bereziniae. A restriction enzyme BfaI
was also used to discriminate the ARDRA profile 14122 observed for two isolates and an ARDRA
restriction pattern 1+2 was obtained, identifying both isolates as A. genomic species 13BJ. Two
rarely species, A. phenon 3 (ARDRA profile 14143) and A. phenon 5 (ARDRA profile 25113),
were identified, more associated to respiratory tract infection. The other three species were
123
identified as A. genomic species 16, A. calcoaceticus and A. nosocomialis. None of these species
were found carrying any CHDL gene.
In summary, the prevalence of A. pittii is higher in our institution, been the second most frequent
specie. Emerging Acinetobacter species have been identified in our hospital and their actual
incidence could be underestimated by using only automated identification systems.
124
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127
Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0%S>0.0%) [0.0%-100.0%]
10 0
80
60
rep-PCR
40
20
0
rep-PCR
REP-PCRPATTERN
LXI
LXIV
LI
XIV
LXXIV
VIII
XIX
LV
XXIII
LX
V
XVII
II
LXXXIII
XII
XXVII
XLVIII
XXIV
XXV
LXXII
XI
XIII
IV
XXXIII
LXII
I
XV
X
LXXXIV
III
XLVI
LII
LVII
LIX
LXVI
LXX
XX
LXXV
LIII
LXVII
LIV
LXVIII
XCII
VI
XXI
XLV
XLVII
LXXVI
XLII
XLIII
XXX
XXXV
XXXII
XXVIII
XXXIV
LXXXV
XC
XCV
XXXVI
XXII
LXXVII
LXXVIII
LXXIX
XCI
LXXXVIII
XCIV
XCIX
XXXVII
L
XLIV
LXXI
VII
IX
LXXXI
XVI
XLI
XCVIII
XVIII
XXXI
XXXIX
LXV
LXXXVII
XCVI
LXXXVI
LXXXIX
XXVI
LXXX
XCVII
XL
LXXIII
Figure 1 - Dendrogram of the 98 different Rep-PCR patterns obtained between the 603 A.
calcoaceticus-baumannii complex isolates during the period of 2004 to 2008.
128
Table 1 - ARDRA profile, source of infection and CHDL content according to Acinetobacter species.a
Body site infection
No. of isolates (%
Species
CHDLs content
ARDRA profile
of total)
BSI
LRTI SSTI UTI Other
blaOXA-23-like
blaOXA-24/40-like
blaOXA-51-like
blaOXA-58-like
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
1
(-)
(-)
(-)
(-)
2
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
11121 (n=20)
A. baumannii
38 (44.2)
11123 (n=15)
4
10
17
7
6
8
12
6
1
2
11121+3 (n=3)
36 (41.8)
21213
A. bereziniae
3 (3.5)
42123
A. genomic species 13BJ
2 (2.3)
421231+2
A. phenon 3
2 (2.3)
14143
A. phenon 5
2 (2.3)
25113
A. calcoaceticus
1 (1.2)
22113
A. nosocomialis
1 (1.2)
21113
A. genomic species 16
1 (1.2)
12142
A. pittii
Total
86
1
1
4
1
1
1
1
11
23
32
15
5
128
a. Abreviations: BSI - bloodstream infections, LRTI - lower respiratory tract infections, SSTI - skin and soft tissue infections, UTI - urinary tract infections.
b. ARDRA profiles according with restriction enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI, MspI. To differentiate among isolates with the same ARDRA profile, a further
restriction analysis was made with enzymes BfaI and BsmI.
129
A. nosocomialis
1%
A. genomic
Acinetobacter phenon species 13BJ
A. genomic
5
2%
species 16
2%
Acinetobacter
1%
A. bereziniae
phenon 3
4%
3%
A. calcoaceticus
1%
A. baumannii
44%
A. pittii 42%
Figure 2 - Distribution of the 86 Acinetobacter spp. isolates showing different Rep-PCR patterns
according to ARDRA method.
130
Acinetobacter
phenon 5
n= 2
Acinetobacter
phenon 3
n=2
A.
calcoaceticus
n=1
A. nosocomialis
n=1
Acinetobacter
genomic species
13BJ
A.
n=2
bereziniae
n=9
Acinetobacter
genomic species 16
n=1
A. pittii
n=70
A. baumannii
n=515
Figure 3 - Distribution of the 603 Acinetobacter spp. isolates in the period of 2004 to 2008.
131
Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute
Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation
Rodrigo Cayô1*, Lucrecia Yañez San Segundo2,3, Inmaculada Concepción Pérez del Molino
Bernal1, Celia García de la Fuente1, Maria Aranzazu Bermúdez Rodríguez2,3, Jorge Calvo1 and
Luis Martínez-Martínez1,4.
Short running title: Acinetobacter junii in a Haematopoietic Cell Transplanted Patient.
1Service
of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - HUMV, Avda. de Valdecilla,
s/n, 39008, Santander, Spain;
2Service
of Haematology, University Hospital Marqués de Valdecilla - HUMV, Avda. de Valdecilla,
s/n, 39008, Santander, Spain;
3Medicine
and Psychiatry Department, School of Medicine, University of Cantabria, Avda. Herrera
Oria, s/n, 39011, Santander, Spain.
4Molecular
Biology Department, School of Medicine, University of Cantabria, Avda. Herrera Oria,
s/n, 39011, Santander, Spain.
*Corresponding author. Current Address: Servicio de Microbiología, Hospital Universitario
Marqués de Valdecilla, Avda. de Valdecilla, s/n, Pabellón 20, Planta 2, 39008. Tel.: +34 942
202580. Fax.: +34 942 203462. E-mail: [email protected].
132
ABSTRACT
Acinetobacter junii is a rare human pathogen associated with bacteraemia in neonates and
paediatric oncology patients. We present a case of A. junii causing bacteraemia in an adult
transplanted patient with leukaemia. The correct identification of Acinetobacter species can
highlight the clinical significance of the different species of this genus.
133
INTRODUCTION
Acinetobacter junii (genomic species 5) is a rare human pathogen, being particularly associated
with outbreaks of septicaemia in neonates and paediatric oncology patients (Bernards et al.,
1997; de Beufort et al., 1999; Kappstein et al., 2000). Rare cases of meningitis (Chang et al.,
2000), peritonitis (Borràs et al., 2007), ocular infection (Prashanth et al., 2000), and septicaemia
in adult oncology patient (Linde et al., 2002) caused by A. junii have also been described.
Although Acinetobacter baumannii is the most important and prevalent species involved in
nosocomial infections (Bergogne-Berezin & Towner, 1996), the real incidence and the roles of the
other members of genus Acinetobacter as human pathogens can be masked, since reliable
phenotypical identification is time consuming and labor intensive (Gerner-Smidt et al., 1991). The
precise identification of Acinetobacter species requires the application of molecular methods
(Vaneechoutte et al., 1995; La Scola et al., 2006). Unfortunately, the latter approach is not
generally applicable in clinical microbiology practice, which makes the delineation of
Acinetobacter species often problematic and difficult. In this way, we present the first case of
bacteraemia caused by A. junii in a patient with acute leukaemia treated with allogenic
haematopoietic cell transplantation (HCT).
134
CASE REPORT
A 43-year-old female diagnosed of acute lymphoblastic leukaemia type B in 2004, finished her
chemotherapy treatment in June 2006. In February 2009, the patient presented a late relapse
with bone marrow and central nervous system involvement. After achieving a second complete
remission, the patient was treated with an HCT from a mismatched unrelated donor. In the first
month after the HCT, the patient developed acute cutaneous graft-versus-host disease grade 2
(GVHD), resolved after treatment with prednisone (1 mg/kg/day). The patient was discharged with
a good status performance. On day +36 after HCT, the patient was readmitted because of fever
without neutropenia. Empirical therapy, initially with piperacillin/tazobactam (4/0.5 g/8h iv) and
oral levofloxacin (500 mg/24h) and later with meropenem (1 g/8h), teicoplanin (10 mg/Kg/24h)
and oral posaconazole (200 mg/8h) was unsuccessful. Treatment with intravenous cotrimoxazole (TMP 20 mg/Kg/24h and SMX 100 mg/kg/24h divided in four doses) was added
because of a suspected toxoplasmosis that was not confirmed by investigating of Toxoplasma
DNA in blood by PCR. The patient developed pancytopenia, laboratory signs of thrombotic
thrombocytopenic purpura (TTP) and clinical features of GVHD progression. Prednisone was
increased to 2 mg/Kg/day and finally fever disappeared.
On day +63 after HCT, the patient presented a new episode of fever (39.5ºC). In this moment, the
patient presented 2.700/mm3 leucocytes with 40% of neutrophils, haemoglobin 7.8 g/dL and
platelets count of 3.000/mm3 and she was receiving piperacillin/tazobactam (4/0.5 g/8h iv). Three
sets of blood cultures were drawn in a 30 minutes period. In the first two blood cultures, the
isolates appeared as Gram-negative, strictly aerobic, non-fermenting, non-motile, catalasepositive, oxidase-negative coccobacillus, with the times to detection of 24.6 h and 25.3 h
(BACTEC 9240 Blood Culture System, Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks,
Md.). No growth was observed in the third set of blood culture.
135
The isolate was identified as Acinetobacter lwoffii by MicroScan Walk-Away® (Siemens
Healthcare Diagnostic Inc., West Sacramento, CA), with 98.7% of presumptive identification. To
confirm the species identification, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis - ARDRA
(Vaneechoutte et al., 1995), was performed using firstly the enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI,
MspI. An ARDRA profile 12123 compatible with both A. junii (genomic species 5) and unnamed
genomic species 17 was obtained. To differentiate between these two options, a further
restriction analysis was made with the enzyme BfaI. A restriction pattern 3 was obtained,
confirming the isolate identification as A. junii. Antibiotic susceptibility was determined by Etest
strips (AB Biodisk, Solna, Sweden), according to the manufacturer’s recommendations.
According to CLSI breakpoints (CLSI, 2010), the isolate was susceptible to piperacillintazobactam (MIC, ≤ 0.015 µg/ml), imipenem (MIC, 0.125 µg/ml), meropenem (MIC, 0.125
µg/ml), trimethoprim-sulfamethoxazole (MIC, 0.25 µg/ml), minocycline (0.25 µg/ml), ampicillinsulbactam (0.50 µg/ml), cefepime (MIC, 1 µg/ml), doxycycline (MIC, 1 µg/ml), gentamicin (MIC, 1
µg/ml), amikacin (MIC, 2 µg/ml), ceftazidime (MIC, 2 µg/ml), tetracycline (4 µg/ml) and
levofloxacin (MIC, 2 µg/ml), and resistant to ciprofloxacin (MIC, 4 µg/ml). In addition, the
following antimicrobial agents (for which breakpoints from the CLSI are not available) were also
tested: cephalothin (MIC, 1 µg/ml), tigecycline (MIC, 1 µg/ml), amoxicillin-clavulanate (2 µg/ml),
aztreonam (MIC, 4 µg/ml), chloramphenicol (MIC, 4 µg/ml), cefoxitin (MIC, 8 µg/ml), ampicillin
(MIC, 128 µg/ml). No subsequent A. junii strain was isolated from the patient.
After the susceptibility testing results were obtained, therapy with piperacillin/tazobactam (4/0.5
g/8h iv) was maintained. The central venous catheter, without any signs of local infection, was
removed two days after obtaining the blood cultures. No further complications due to A. junii
infection were observed in the course of 8 days of treatment with piperacillin/tazobactam. A
resolution of the signs and symptoms was observed, especially after the catheter removal, and
clearance of infection was confirmed by the subsequent blood cultures realized in the next two
136
weeks. The patient died one month later because of an unfavorable evolution of GVHD,
associated with TTP and cytomegalovirus infection
137
DISCUSSION
Although the immediate source of the infection could not be identified in this case, as the
removed central catheter was not sent for microbiological culture, the significant improvement
observed in the clinical course of the infection after catheter withdrawal, probably indicates that
this device was associated with the episode of bacteraemia, which could justify the isolation of
this pathogen, even with appropriate antibiotic therapy. Seifert and colleagues (Seifert et al.,
1997) showed that human skin appears to be a natural habitat of some Acinetobacter species,
especially A. lwoffii, A. johnsonii and A. genoespecies 3. The others species founded, including A.
junii, were described as colonizers only in hospitalized patients. They observed that these
species have also been recovered from blood cultures of patients with catheter-related
bacteraemia. Interesting, A. baumannii and A. genoespecies 13TU were rarely founded on
human skin.
A few reports of nosocomial outbreaks caused by A. junii have been described (de Beufort et al.,
1999; Kappstein et al., 2000). Kappstein et al. (2000) reported an outbreak of bacteraemia in
paediatric oncology patients in whom aerators may act as reservoir for this pathogen. They also
described that the water system was contaminated with A. junii and recommended that for highrisk areas, aerators should be avoided. In another study, de Beaufort et al. (1999) described six
cases of sepsis in a neonatal unit, and concluded that intravenous fat emulsion was implicated as
a possible source of the infection. However, community-acquired infections associated with A.
junii have also been reported (Chang et al., 2000; Prashanth et al., 2000, Borràs et al., 2007),
showing the potential of this opportunistic pathogen to cause infection in humans.
A previous study evaluating the clinical characteristics of patients with A. junii infections, reported
that this pathogen affected mainly patients who have had prior antimicrobial therapy, invasive
procedures, or malignancy (Hung et al., 2009). The study also showed that infections caused by
this pathogen were primarily bacteraemia and the isolates remained susceptible to the majority of
138
the antimicrobial agents tested. These high rates of bacteraemia observed, are probably
associated with the fact that, in general, the group of patients susceptible to acquired infection by
A. junii show serious underlying diseases and therefore need invasive procedures, which act as
reservoirs and a port of entry for the infection, as previously described. Higgins and colleagues
(Higgins et al., 2001) have tested rare non-fermenting Gram-negative bacteria, including A. junii
isolates, against different antibiotics and biocides, and concluded that despite being susceptible
to certain antimicrobial agents in vitro, some isolates were still able to cause bacteraemia after
antibiotic therapy. Our case is in accordance with this observation, as the patient was treated as
empirical therapy with piperacillin/tazobactam, and subsequently developed a bloodstream
infection caused by an organism susceptible to this antimicrobial agent. However, it should be
considered that at the moment of the episode of bacteraemia, the patient was receiving
corticosteroid therapy.
Although A. junii is capable of causing serious infections, they are generally, non-fatal because
the microorganism is commonly susceptible to antimicrobial agents (Bernards et al., 1997).
However, Peleg et al. (2006) have identified a carbapenem-resistant A. junii blood culture isolate
producing OXA-58 and IMP-4. In another study, Marquè et al. (2005) described the spread of the
plasmid-mediated OXA-58 in Acinetobacter spp. clinical isolates from southern Europe, including
an A. junii isolate carrying a 150-kb plasmid harbouring OXA-23 and OXA-58. The acquisition of
resistant genes, typically associated with A. baumannii, by A. junii clinical isolates is a concern,
since the therapeutic options to treat these infections become limited. A retrospective study
described by van de Broek et al. (2009) demonstrated in a university hospital, under endemic
conditions, the importance of others species of Acinetobacter non-baumannii as a cause of
nosocomial infection. The frequency of Acinetobacter genomic species 3 was the same obtained
by A. baumannii. Surprising, A. lwoffii represent 11% of the 359 strains evaluated in the study.
139
Between the 20 different species identified, A. ursingii, A. johnsonii and A. junii were also
frequent, presenting, 13, 13 and 12 isolates, respectively.
Although the therapy is guided primarily by the susceptibility pattern of the isolate and not by the
species identification, special attention should be given to the correct identification of
Acinetobacter non-baumannii species that will contribute to a better understanding of the
epidemiology and the real clinical impact of these species as a cause of infections in humans.
The majority of the reports describing infections caused by A. junii, used as confirmatory
identification test a molecular method, especially the sequence of the 16S rRNA gene (Seifert et
al., 1997; Linde et al., 2002; Borràs et al., 2007; Hung et al., 2009), showing the importance of
molecular methods in the correct identification of the species included in the genus Acinetobacter.
140
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142
Artigos Científicos - Brasil
Comment Letter
Low Prevalence of blaOXA-143 in Private Hospitals in Brazil
We read with great interest C. S. Antonio et al.’s letter describing the high prevalence of
Acinetobacter baumannii carrying blaOXA-143 in Brazilian hospitals (1). Recently, we carried out a
similar study, and although the blaOXA-143 gene was identified, its frequency was lower than that
reported by Antonio et al. (1).
During 2008, a total of 803 Gram-negative bacillus isolates, 1 isolate per patient, were collected
from 17 private hospitals located in eight cities from four distinct geographic Brazilian regions.
Among them, 91 (11.3%) were A. baumannii isolates that were recovered mainly from the
respiratory tract (70.3%) and bloodstream (24.2%). Susceptibility testing was performed by CLSI
broth microdilution (3). The detection of metallo-β-lactamase (MβL) and carbapenem-hydrolyzing
class D β-lactamase (CHDL)-encoding genes was performed by multiplex PCR (5,7,9) and
confirmed by sequencing. The presence of the insertion sequence ISAba1 upstream of the
CHDL-encoding genes was also investigated. Genetic relatedness among CHDL-producing A.
baumannii isolates, including the first OXA-23-producing A. baumannii clone isolated in Brazil (4),
was evaluated by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).
A total of 83/91 (91.2%) isolates were resistant to carbapenems. We also observed low rates of
susceptibility to amikacin (18.7%), ceftazidime (12.1%), cefepime (8.8%), piperacillintazobactam
(3.3%), and ciprofloxacin (3.3%). In contrast, most A. baumannii isolates were susceptible to
polymyxin B (MIC90, 1 µg/ml; 97.8% of the isolates were susceptible).
MβL-encoding genes were not identified in our study, as was also reported by Antonio et al. (1).
However, we identified the blaOXA-23 gene in carbapenem-resistant isolates more frequently than
in the former study (83.5% versus 41.7%). The blaOXA-23 gene was found in all carbapenemresistant isolates from the cities of Belo Horizonte, Blumenau, Curitiba, and São Luís, followed by
143
Rio de Janeiro (93.7%), Porto Alegre (80.0%), and São Paulo (69.0%). These results are in
accordance with previous local reports (2, 4, 6) that emphasize that this gene is widespread in
our country. The ISAba1 element was positioned upstream of blaOXA-23 in all isolates, whereas no
insertion sequence was observed upstream of blaOXA-51. Although A. baumannii carrying blaOXA-58
and blaOXA-72 had recently been described in Brazil (1, 9), no isolates carrying these variants were
found in our study.
Nine distinct PFGE clones were identified among the 76 OXA-23-producing A. baumannii
isolates. The predominance of a single clone (clone A [36.8% of the isolates]) was observed in
isolates collected from six distinct Brazilian cities. This clone exhibited a PFGE profile similar to
that of the first Brazilian clone producer of OXA-23 (4). A. baumannii belonging to clones B
(17.1%) and D (9.2%) were also identified in isolates collected from distinct cities, while other
genotypes were identified in specific locations.
While Antonio et al. (1). reported a high prevalence of the blaOXA-143 gene (58.3%), we found that
only 7 of 83 (8.4%) A. baumannii isolates carried this gene. These isolates were collected from a
few hospitals located in the cities of São Paulo (n = 6) and Rio de Janeiro (n = 1). In both studies,
the majority of OXA-143-producing A. baumannii isolates were recovered from cities located in
São Paulo State. However, while Antonio et al. observed that 70% (21/30) of the isolates from
this region carried the blaOXA-143 gene, in the present study, we identified this resistance
determinant in only 20.7% (6/29) of isolates collected from São Paulo. Moreover, we have
observed the predominance of a single PFGE clone among the seven OXA-143-producing A.
baumannii isolates, which contrasts with results obtained by Antonio et al., in which 7 distinct
enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence (ERIC) PCR clones harbored the
blaOXA-143 gene. Nevertheless, in their study, the high prevalence of OXA-143-producing isolates
could also be partially justified by the intrahospital spread of a single clone, which corresponded
to 57.1% of all OXA-143-producing isolates (1). The high prevalence of blaOXA-23 found in our
144
study may also be justified by intra- and interhospital spread of endemic clones. The results of
these two studies show that the prevalence of CHDLs may vary according to the disseminated
clone in a specific hospital or region and emphasize the importance of appropriate adherence to
infection control measures. Thus, wide national surveillance studies are necessary to analyze the
real prevalence of CHDLs in Brazilian hospitals.
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Jéssica S. Werneck*
Renata C. Picão
Raquel Girardello
Rodrigo Cayô
Vitor Marguti
Laboratório ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, São Paulo, Brazil.
Líbera Dalla-Costa
Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brazil.
146
Ana C. Gales
Laboratório ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, São Paulo, Brazil.
*Phone/Fax: 55 (11) 55764748
E-mail: [email protected]
147
Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in a Brazilian
Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil.
Rodrigo Cayô1, Cecília Godoy Carvalhaes1, Raquel Girardello1, Adryella de Paula Ferreira Luz1,
André Mario Doi1, Antonia Maria de Oliveira Machado2, Antonio Carlos Campos Pignatari1, Ana
C. Gales1.
Short running title: Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in
Brazil.
1Laboratório
Especial de Microbiologia Clínica - LEMC & Laboratório ALERTA, Discipline of
Infectology, Department of Medicine, Federal University of São Paulo - UNIFESP, São Paulo,
Brazil.
2Laboratório
Central, Hospital São Paulo - HSP, Federal University of São Paulo - UNIFESP, São
Paulo, Brazil.
*Corresponding author. Current Address: Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC,
Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, São Paulo - SP, Brazil. Tel/Fax.: +55 11 50812965.
E-mail: [email protected].
148
ABSTRACT
The carbapenem resistance rates in Brazilian Acinetobacter baumannii isolates is extremely
higher, and are associated with the production of two major carbapenemases, OXA-23 and OXA143. The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a
collection of Acinetobacter spp. isolates collected during an 18 year-period in a Brazilian hospital.
A 215 non-duplicate isolates showing high carbapenem resistance rates were analyzed from
1993 to 2010. A. baumannii was responsible for 96.3% of the isolates. The blaOXA-23 gene was
detected in 36.7% (79/215) of the isolates, followed by blaOXA-143 (n=49, 22.7%), blaIMP-1 (n=24,
11.2%), blaIMP-10 (n=3, 1.4%) and blaOXA-72 (n=2, 0.9%). The first A. baumannii isolate carrying the
blaOXA-143 gene was identified in 1995, seven years before the introduction of blaOXA-23 in 2002
and its widespread in the following 8 years of the study. We described for the first time the
presence of IMP-1 in A. pittii and A. bereziniae, and OXA-58 in A. genomic species “Close to
13TU”. The OXA-143 is an ancient enzyme. The dynamic of carbapenemase production is
complex and varied drastically according to time
.
149
Acinetobacter baumannii is a multidrug-resistant opportunistic pathogen associated with a variety
of nosocomial infections and responsible for outbreaks worldwide (1). Its ability to acquire
antimicrobial resistance and to survive under different environmental and nutritional conditions
makes this pathogen extremely successful (2). Carbapenems are considered to be the most
active antimicrobial agents against A. baumannii (3). However, carbapenem resistance is rising
and it is mainly associated with the acquired carbapenem-hydrolyzing class D-lactamases
(CHDLs) in A. baumannii (4). In Brazil, the carbapenem resistance rates range from 56% to 73%
among A. baumannii isolates (5,6) and vary considerably according to the geographic region.
Because of the elevated carbapenems resistance rates, polymyxins have been widely used as
the last therapeutic options to treat the A. baumannii (7). The mechanisms of carbapenem
resistance found in these isolates are mostly related to the production of CHDL OXA-23, indeed
the most prevalent and disseminated carbapenemase around the country (8,9), production of
metallo-β-lactamase (MβLs) IMP-1 (10) and, very sporadicall, other CHDLs like OXA-72 and
OXA-58 (11,12,13). Although OXA-143 has been recently described in a Brazilian isolates
collected in 2004 (14), studies have shown that the prevalence of this enzyme is higher in public
hospitals from the Brazilian southeast region (11,15). The aim of this study was to evaluate the
temporal dynamic of carbapenemases in a collection of Acinetobacter spp. clinical isolates
collected during an 18 year-period in a tertiary teaching hospital located in São Paulo, Brazil. This
work was presented in part as a poster presentation at the 51th Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC in Chicago, 2011.
A total of 215 non-duplicate Acinetobacter spp. clinical isolates showing high carbapenem
resistance rates were studied. These isolates were collected from different body sites of patients
hospitalized at a 600-bed hospital located in São Paulo city from January of 1993 to December of
2010. In general, it was included one isolate per month. Phenotypic identification of the isolates
was performed by MicroScan-WalkAway® automated system (Siemens Healthcare Diagnostic
150
Inc., West Sacramento, CA) or Phoenix® automated microbiology system (BD Diagnostic
Systems, Sparks, MD). Presumptive identification of the isolates as A. baumannii was done by
amplifying the complete open reading frame of blaOXA-51-like gene, which is considered
chromosomally intrinsic to this species (4), using primers pairs OXA-69A and OXA-69B (Table 1).
Both primers were also used to detect the presence of ISAba1 upstream of the OXA-51 variants
(16). Identification was confirmed at species level by sequencing analysis of partial regions of
RNA
polymerase
β
subunit
(rpoB)
gene
using
primers
pairs
Ac969F
(5’-
TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3’) and Ac1598R (5’-CGBGCRTGCATYTTGTCRT-3’), as previously
published (17). The clonal relationship of the 215 Acinetobacter spp. isolates was determined by
Rep-PCR using the primer pairs REP-1 (5´-IIIGCGCCGICATCAGGC-3´) and REP-2 (5ÁCGTCTTATCAGGCCTAC-3´), as described previously (18). The amplified fragments were
separated on a 1.5% (w/v) agarose gels for 240 min. For identification of carbapenemase
encoding genes and insertion sequence ISAba1, the specific primers as shown in Table 1 were
used. Nucleotide sequencing to confirm the enzyme gene types was performed using ABI Prism
3500 Series (Applied Biosystems, Warrington, UK).
Among the 215 carbapenem-resistant Acinetobacter spp. isolates recovered during the 18-year
period of study, A. baumannii was the most frequent species (96.3%) identified in this collection.
Other three species, Acinetobacter genomic species “Close to 13TU” (n=2) and A. pittii (formerly
A. genomic species 3; n=1), included in the A. calcoaceticus-baumannii complex, and A.
bereziniae (formerly A. genomic species 10; n=1) were also identified. Although all A. baumannii
isolates carried the chromosomally encoded blaOXA-51-like gene, none of other three non-baumannii
species harbored this CHDL, including the closest related species, A. pittii and A. genomic
species “Close to 13TU”. For a long time, the gene encoding CHDL OXA-51-like was considered
exclusive to the A. baumannii chromosome (4) and, because of this, its detection has been widely
used as an indirect method for A. baumannii identification (19). However, a report describing the
151
occurrence of plasmids carrying the genetic structure ISAba1-blaOXA-51-like, firstly disseminated
among A. baumannii isolates in Taiwan (20) and, later, detected in Acinetobacter nosocomialis
(formerly Acinetobacter genomic species 13TU) and Acinetobacter genomic species “Close to
13TU”isolates (21,22), indicated that detection of blaOXA-51 like could not be used for identification
purposes.
As expected, the OXA-23 was the most prevalent carbapenemase founded in 36.7% of A.
baumannii isolates (Table 2), followed by OXA-143 (22.7%) and IMP-1 (11.2%). Our results are in
contrast to those reported recently in 2000-bed teaching hospital in São Paulo city (23). In this
study, Mostachio and colleagues described a high prevalence of OXA-143 (76%) compared with
18% of OXA-23. In the same study, the authors reported only five isolates carrying the MβL IMP1 (23). Another study evaluating different Brazilian hospitals also reported a high prevalence of
OXA-143 (58.3%), but showed a prevalence of OXA-23 (41.7%) superior to that reported by
Mostachio and colleagues (11,23). In our study, the OXA-23-producing A. baumannii isolates
were grouped under 19 different Rep-PCR patterns in accordance with a previous study that
reported the polyclonal character of A. baumannii OXA-23-producers from distinct Brazilian
geographic regions (15). Only two A. baumannii isolates, were found harboring the blaOXA-72. This
results also agrees with previously studies that also showed a rare prevalence of this CHDL in
our country (11,13). Interesting, blaOXA-143 seems to be more ancient CHDL encoding gene. It was
initially found in an A. baumannii isolated in the year 1995 (Table 2), almost eight years before
the introduction of OXA-23-producing A. baumannii clones in the same institution, and fourteen
years before its first description in 2004 (14). However, the isolates carrying the blaOXA-23 seems
to be more adapted to the nosocomial environment, since a faster widespread dissemination of
this CHDL in our institution was observed in the next nine years after its introduction in 2002. The
blaOXA-143 was found concomitantly in an IMP-1-producing- and in six OXA-23-producing-A.
baumannii isolates. Two major clones of OXA-143-producing A. baumannii were observed in two
152
distinct periods, between 1995 and 1998 (n=10 isolates) and 2004 and 2010 (n=29 isolates),
respectively. Almost 70% of the OXA-143-producing isolated in the period of study belonged to
both clones. Previous studies showed that IMP-1 was the most frequent A. baumannii
carbapenemase found in our institution, located in a class 1 integron called In86 (24), which was
also described in Klebsiella pneumoniae isolates in São Paulo (25). In this study, we found two
isolates of A. pittii and A. bereziniae carrying the blaIMP-1 gene in 2001 and 2007, respectively,
suggesting the high ability of In86 mobilization.
In August 2000, three clonal A. baumannii isolates carrying the MβL IMP-10 were detected.
These isolates probably were involved in a small hospital outbreak. To our knowledge this is the
first report of IMP-10-producing A. baumannii in Brasil. The most ancient carbapenemase
encoding gene found in our study was blaOXA-58. Although OXA-58 has been previously reported
in Brazilian A. baumannii isolates (11), in the present study blaOXA-58 was found to be carried by
two A. genomic species “Close to 13TU” belonging to the same clone, isolated in 1993 and 1997,
respectively. The blaOXA-58 was first described in a French A. baumannii isolated, in 2003. (26) It
has also been reported in other Acinetobacter species, especially in A. pittii isolated from Spain
(27). To the best of our knowledge, both OXA-58 isolates reported in the present study are
probably the most ancient reported isolates carrying this CHDL encoding gene worldwide. We
also observed an earlier dissemination of the blaOXA-143 gene in A. baumannii. This study shows
how dynamic and complex was the carbapenemase production among Acinetobacter spp.
overtime in our setting. In addition, it pints out for the necessity of further studies to understand
the evolution of this carbapenemase encoding genes among Acinetobacter spp.
.
153
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resistance to imipenem in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents
158
Table 1 - Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the carbapenemase coding genes.
Β-lactamases
Class A β-lactamase
KPC-like
GES-like
Primer
Nucleotide Sequence (5'-3')
Usage
Reference
TCGCTAAACTCGAACAGG
TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC
TCACGCACTATTACTGGC
TATTTGTCCGTGCTCAGG
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
28
28
29
29
IMP.F
IMP.R
Intl.F
qac.R
VIM.F
VIM.R
SPM-1.F
SPM-1.R
GIM-1.F
GIM-1.R
SIM-1.F
SIM-1.R
NDM-1.F
NDM-1.R
CCAAACYACTASGTTATC
GAATAGRRTGGCTTAAYTCTC
GCCTGTTCGGTTCGTAAGCT
CGGATGTTGCGATTACTTCG
AATGCGCAGCACCAGGATAG
GTTTGGTCGCATATCGCAAC
CCTTTTCCGCGACCTTGATC
CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG
CGGAACGACCATTTGAATGG
TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC
TGGCCTGTTCCCATGTGAG
GTACAAGGGATTCGGCATCG
CTGGGTCGAGGTCAGGATAG
GGCGTTAGATTGGCTTACACC
Amplification/sequencing
Sequencing
Sequencing
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
30
30
31
31
30
30
30
30
30
30
30
30
This study
This study
OXA-23.F
OXA-23.R
ISAba1.F
OXA-24.F
ATTTCTGACCGCATTTCCAT
GATCGGATTGGAGAACCAGA
GTCAGTTGCACTTGGTCG
AGTTGAGCGAAAAGGGGATT
Amplification
Amplification
Amplification
Amplification
32
32
KPC F
KPC.R
GES. F
GES. R
Class B β-lactamase
IMP-like
VIM-like
SPM-1
GIM-1
SIM-1
NDM-1
Class D β-lactamase
OXA-23-like
OXA-24-like
32
159
OXA-51-like
OXA-58-like
OXA-143
OXA-48
OXA-24.R
Pre-OXA-24.F
Pre-OXA-24.R
OXA-51.F
OXA-51.R
OXA-69.F
OXA-69.R
OXA-58.F
OXA-58.R
OXA-58-1TOT
OXA-58-2TOT
Pre-OXA-143.F
Pre-OXA-143.R
OXA-48.F
OXA-48.R
GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA
AYTTCGBATAAYSSCCATTATGTTAAATTAAAAGA
ATTTCGYATAASGYGTATTATGTTAATTTTAGAAA
TGGATTGCACTTCATCTTGG
TAATGCTTTGATCGGCCTTG
CTAATAATTGATCTACTCAAG
CCAGTGGATGGATGGATAGATTATC
CCCCTCTGCGCTCTACATAC
AAGTATTGGGGCTTGTGCTG
ATGAAATTATTAAAAATATTG
TTATAAATAATGAAAAACACC
TTGGAAAATTATATAATCCC
AGTTAACTTTCAATAATTG
TTGGTGGCATCGATTATCGG
GAGCACTTCTTTTGTGATGGC
Amplification
Sequencing
Sequencing
Amplification
Amplification
Sequencing
Sequencing
Amplification
Amplification
Sequencing
Sequencing
Amplification
Amplification
32
This study
This study
32
32
16
16
32
32
27
27
14
14
33
33
160
Table 2 - Frequency of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates in a Brazilian teaching hospital during an 18-year period.
Species
(rpoB)
Year of isolationa
Nº of isolates (%)b
blaOXA-51
A. baumannii
1994-2002, 2004-2005
43 (20%)
blaOXA-51 + blaOXA-23
A. baumannii
2002-2003, 2005-2010
79 (36.7%)
A. baumannii
1995-1998, 2004-2010
49 (22.7%)
A. baumannii
2008, 2009
2 (0.9%)
blaOXA-51+ blaOXA-23 + blaOXA-143
A. baumannii
2007-2010
6 (2.8%)
blaOXA-51 + blaIMP-1
A. baumannii
1996, 1999-2001, 2003-2006, 2010
24 (11.2%)
blaOXA-51 + blaIMP-1 + blaOXA-143
A. baumannii
1997
1 (0.5)
blaOXA-51 + blaIMP-10
A. baumannii
2000
3 (1.4%)
blaIMP-1
A. pittii
2001
1 (0.5%)
blaIMP-1
A. bereziniae
2007
1 (0.5%)
Carbapenemase encoding genes content
A. genomic species
1993, 1997
“Close to 13TU”
a. Years in bold represent when the first isolate carrying the respective carbapenemase encoding gene firstly detected.
blaOXA-58
2 (0.9%)
b. Four isolates could not be identified by the sequencing analysis of the rpoB gene and were not included in the table.
161
Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil: a
case report
Bárbara Gionco1*, Jacinta S. Pelayo1, Emerson J. Venancio2, Rodrigo Cayô3, Ana C. Gales3,
Floristher E. Carrara-Marroni4.
1Department
2Department
of Microbiology, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil.
of Science Pathological, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná,
Brazil.
3Laboratório
ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo, São
Paulo, São Paulo, Brazil.
4Department
of Pathology, Clinical and Toxicological Analysis, Hospital Universitário de Londrina,
Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil.
Keywords: carbapenems, oxa-type beta-lactamase, polymyxin B, drug resistance
*Corresponding author. Current Address: Universidade Estadual de Londrina. Rodovia Celso
Garcia Cid, Pr 445, Km 380. CEP 86051-980, Londrina, Paraná, Brasil. Tel: +55 43 33715726; email: [email protected]
162
Sir,
In Brazil, the resistance rates to carbapenem range from 25% to 45% among A. baumannii
isolates.1 The mechanisms of carbapenem resistance among these isolates are mainly
associated with the production of two major carbapenem-hydrolysing class D carbapenemases
(CHDL), OXA-23 and OXA-143.2,3 To date, OXA-143 is the single representative of this recently
reported subgroup of CHDL. In contrast to the OXA-23 subgroup, which is widely disseminated in
the Brazilian territory, OXA-143 has been only detected in A. baumannii isolated from hospitals
located in São Paulo and Rio de Janeiro states so far.2-5 Analysis of the genetic environment of
blaOXA-143 revealed that it was bracketed by two copies of the same replicase gene. It suggests
that a homologous recombination process probably took part in the blaOXA-143 acquisition.4 This
study reports the occurrence of OXA-231, a novel variant of OXA-143, in an A. baumannii clinical
isolate (Ac-141 strain) recovered from a tertiary teaching hospital located in Southern Brazil.
In October 2007, a 72-year-old woman was admitted at the emergency room of the Hospital
Universitário de Londrina (HU), a teaching hospital located in the city of Londrina, state of
Paraná, Brazil. The patient presented history of diabetes, hypertension and had previously been
submitted to a transtibial amputation due an infected diabetic foot, at the HU, 25 days ago. On the
day of admission, the patient presented fever, dyspnea and was diagnosed with pneumonia.
Empirical therapy with cefepime [2 g, intravenously (iv), twice daily] and vancomycin [1.5 g, iv,
once a day] was started. Five days after hospitalization, the patient got febrile and showed
signals and symptoms of urinary tract infection. An ESBL-producing Klebsiella pneumoniae
susceptible only to imipenem and amikacin was isolated from urine. Therapy with imipenem [500
mg, iv, four times a day] was initiated. Six days after imipenem administration, the patient
remained febrile and developed signals of sepsis. A carbapenem-resistant A. baumannii isolate
(Ac-141 strain) was recovered from the urine culture and antimicrobial therapy was replaced by
polymyxin B [500.000 UI, iv, three-times a day] that was continued for ten days. The patient
163
showed clinical improvement and was discharged after 15 days of hospitalization. The next
urinary cultures were negative indicating that microbiological cure as achieved.
The Ac-141 strain was initially identified as Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex by
MicroScan-WalkAway automated system (Siemens Healthcare Diagnostic). The sequencing
analysis of partial regions of RNA polymerase β subunit (rpoB) gene [zone 1 (350 bp, between
positions 2,900 and 3,250) and zone 2 (450 bp, between positions 3,250 and 3,700)], as
previously published,6 confirmed the identification at species level of the Ac-141 strain as A.
baumannii. The partial sequence of rpoB gene obtained was deposited in the GenBank under
accession number JQ676953. The minimal inhibitory concentrations (MIC) for ceftazidime,
imipenem, meropenem, ampicillin-sulbactam and polymyxin B were confirmed by agar dilution
method, according to the recommendations of the Clinical and Laboratory Institute (CLSI).7
According to susceptibility tests results, the Ac-141 strain was resistant to ampicillin/sulbactam
(MIC, >128/64 mg/L), ceftazidime (MIC, >128 mg/L), cefepime (MIC, >16 mg/L), imipenem (MIC,
64 mg/L), meropenem (MIC, 64 mg/L), trimethoprim/sulfamethoxazole (MIC, >2/38 mg/L),
amikacin (MIC, >4 mg/L), ciprofloxacin (MIC, >4 mg/L), levofloxacin (MIC, >4 mg/L), gentamicin
(MIC, >8 mg/L) but susceptible only to polymyxin B (MIC, 1 mg/L). Ac-141 strain also showed low
tigecycline MIC (1 mg/L).
PCR targeting genes encoding CHDLs, metallo-β-lactamases (MβL) and KPC, were carried out
as previously described.4,8,9 The PCR results showed that the Ac-141 strain carried the blaOXA-51
and blaOXA-143 genes. A subsequent PCR targeting both blaOXA-51 and the insertion sequence
ISAba1 yielded a positive result. The ISAba1 upstream the blaOXA-51 is associated with the
overproduction of this CHDL and contributed to increase the MICs of carbapenems against A.
baumannii, which may result in high level of carbapenem resistance when other mechanisms are
also present. DNA sequencing of the entire sequence of the blaOXA-143-like gene, using the pair
primers previously published,4 identified a single mutation at nucleotide 671 that led to a unique
164
amino acid substitution of a Aspartic acid for Alanine at position 230, according to the DBL
numbering system.4 This new OXA-143 variant was named OXA-231 and its nucleotide
sequence has been deposited in the GeneBank under the accession number JQ676953.
Interesting, the Asp230Ala mutation was near the KSG (positions 216 to 218) conserved motif of
the active site of the OXA-231 and adjacent to the key residue Methionine, which is very
important from a structural point of view for the biochemical properties of OXA-24/40, a close
related CHDL (88% of identity with OXA-143).4,10 A study conducted by Santillana et al. showed
that a in vitro mutation in this residue caused a reduction in the catalytic efficiency of the OXA24/40 against the carbapenens and a noticeably increased in specificity for oxacillin.10 Thus, the
effect of the substitution Asp230Ala can be unpredictable in structure of the OXA-231.
Plasmid extract of the Ac-141 strain was obtained by the Kieser method11 followed by
electrophoresis and subsequent Southern blot and hybridization with a blaOXA-231-specific probe
using the Dig DNA Labelling and Detection kit (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany).
The results showed that the blaOXA-231 gene was located on a plasmid of ~140 kb. Although it
could not be possible to sequence all genetic environment of blaOXA-231 gene, the partial flanking
sequences obtained until now (data not show) is similar to that described for blaOXA-143 gene.4
In our hospital, 75% of the A. baumannii isolates are resistant to carbapenems. The production of
OXA-23 has been the main mechanism of carbapenem resistance found in these isolates. For
instance, from August 2006 to August 2011, blaOXA-23 was detected in 68% of A. baumannii
isolates that belonged to multiple clones (unpublished data). To our knowledge, this is the first
description of OXA-143 cluster in an A. baumannii strain isolated in our hospital and in southern
Brazil, and coincidently it is a novel variant of this cluster. Curiously, no additional OXA-143 or
OXA-231 have been detected among the carbapenem-resistant A. baumannii isolates (n=125)
during the 5-year period of study in our hospital.
165
The detection of OXA-231 in Brazil is a cause of great concern and shows the potential of these
new CHDL spread to other Brazilian regions. Although, only a single case involving OXA-231 was
reported, continuous surveillance studies are of paramount importance to prevent its further
dissemination. Lastly, we would like to emphasize the clinical and microbiological efficacy of
polymyxin B in eradicating the infection caused by AC-141 strain. The clinical success probably
was achieved because the urinary tract was the source of infection. Unfortunately, a distinct
outcome could have observed if the respiratory tract was infected. In this manner, novel
therapeutic agents are extremely necessary for treatment of multi-drug resistant Gram-negative
bacilli.
166
1
Funding
2
Not to declare.
3
4
Transparency declarations
5
A. C. G. has received research funding and/or consultation fees from Janssen-Cilag,
6
Wyeth/Pfizer, Novartis and Sanofi-Aventis. Other authors have nothing to declare.
167
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168
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Escherichia coli. Plasmid 1984; 12:19-36.
169
Discussão
5 - Discussão
Estudos recentes de vigilância no Brasil e na Espanha demonstraram que A. baumannii
é um dos principais patógenos causadores de infecções nosocomiais graves, e nos permitem
traçar o cenário desse patógeno nos dois países (Asensio et al., 2008; Marra et al., 2011; Gales
et al., 2012). No estudo conduzido por Asensio e colaboradores (2008), que avaliou 1.168
amostras clínicas de A. baumannii isoladas de 246 hospitais espanhóis durante sete anos (19992005), mostrou uma taxa de infecção por este micro-organismo de 3/1.000 pacientes
hospitalizados. As infecções mais frequentes foram as do trato respiratório (41%), do sítio
cirúrgico (14,8%), do trato urinário (12,7%), de pele e partes moles (11,5%) e de corrente
sanguínea (9,6%) (Asensio et al., 2008). Os mesmos autores relataram que 34,5% dos isolados
de A. baumannii na Espanha eram resistentes aos carbapenens, estas taxas eram ainda
superiores (43,8%) em pacientes internados em UTI (Asensio et al., 2008). Talvez o dado mais
impressionante no estudo espanhol, seja a taxa de infecções consideradas comunitárias (14%),
ainda que os próprios autores tenham inferido que esse valor poderia ter sido superestimado,
uma vez que o critério amplamente utilizado para classificação de uma infecção como
comunitária (até 48 horas após a internação) pode ser falho (Asensio et al., 2008).
Ainda assim, as taxas de resistência aos carbapenens na Espanha são inferiores
àquelas observadas no Brasil, onde os dados do Programa SENTRY descrito por Gales e
colaboradores (2012) relataram a preocupante taxa de 73% de resistência entre as 355 amostras
de Acinetobacter spp. isoladas no período de 2008 a 2010 (Gales et al., 2012). Já no estudo
Brazilian SCOPE (“Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance”),
conduzido por Marra e colaboradores (2011), onde foram avaliados somente isolados de
corrente sanguínea adquiridas no ambiente hospitalar em 16 hospitais brasileiros, mostraram
taxas de resistência inferiores, em torno de 56%, porém ainda superiores aos dados espanhóis
170
Discussão
(Marra et al., 2011). A diferença observada no perfil de sensibilidade aos carbapenens entre os
isolados de Acinetobacter spp. do programa SENTRY e do projeto Brazillian SCOPE é esperada,
já que o SENTRY inclui também isolados do trato respiratório, onde geralmente as taxas de
resistência aos carbapenens em bacilos Gram negativos não-fermentadores são sabidamente
maiores (Friedland et al., 2003; Asensio et al., 2008). Embora as causas para tal acontecimento
ainda sejam desconhecidas, acredita-se que um maior inoculo e um maior uso de procedimentos
invasivos, principalmente em pacientes internados em UTIs, aliado a uma maior propensão para
seleção de isolados resistentes observados nesse sítio de infecção, justifique, em parte, essa
característica fenotípica entre os isolados de Acinetobacter spp. recuperados desse sítio
corpóreo ou do trato respiratório (Asensio et al., 2008).
Os dados do SENTRY na América Latina ainda apontam Acinetobacter spp. como o
sexto patógeno mais frequente em ICS (7,2%), o terceiro em infecções do trato respiratório baixo
(17,7%) e o sexto em infecções de pele e partes moles (9,9%) (Gales et al., 2012). Além disso,
Acinetobacter spp. foi o quarto patógeno Gram negativo mais frequente nos centros médicos
avaliados pelo programa na América Latina (n=845, 14,8%), ficando atrás somente de E. coli, P.
aeruginosa e K. pneumoniae (Gales et al., 2012). De maneira similar, os resultados obtidos pelo
projeto Brazilian SCOPE demonstrou que Acinetobacter spp. é o quarto agente infeccioso
causador de ICS no Brasil (12,5%), sendo o segundo patógeno mais frequentemente isolado de
ICS em pacientes internados em UTI (Marra et al., 2011). No mesmo estudo, foram também
observadas altas taxas de mortalidade associada a ICS por Acinetobacter spp. em pacientes
internados em UTI (65,2%), principalmente quando comparada as demais unidades hospitalares
(39,6%). Essa maior predileção dos isolados de Acinetobacter spp. por pacientes de UTI também
foi observada pelo estudo de Asensio e colaboradores (2008) na Espanha, onde, inclusive, os
isolados apresentaram as maiores taxas de resistência aos carbapenens comparada às demais
171
Discussão
unidades hospitalares, principalmente nas amostras isoladas de ICS (63,3%) e do trato
respiratório (48%).
O estudo Espanhol observou também que as taxas de resistência aos carbapenens
variaram consideravelmente entre as “comunidades autónomas” (Asensio et al., 2008), o
equivalente a estados no Brasil. Dentre as “comunidades autónomas” que apresentaram as
maiores taxas de resistência (> 40%), encontra-se a “Comunidad de Cantabria”, localizada no
norte do país, e onde se localiza o HUMV, onde parte da presente tese foi desenvolvida. Dados
recentes da União Européia, também demonstram diferenças drásticas no perfil de sensibilidade
aos carbapenens entre os isolados de A. baumannii nos diferentes países que compõe o bloco
(Kempf & Rolain, 2012). O estudo observou, de um modo geral, um aumento das taxas de
resistência a esses antimicrobianos entre os países do sul quando comparado aos países do
norte europeu, variando de 4% (Suécia), 8% (Alemanha) e 10-20% (França) a 55%, 60% e 85%
na Inglaterra, Itália e Grécia, respectivamente (Kempf & Rolain, 2012). Nesse estudo, a Espanha
apresentou 45% de resistência aos carbapenens. No Brasil, um estudo avaliando a
epidemiologia molecular de 206 isolados de A. baumannii causadores de ICS do projeto Brazilian
SCOPE, observou diferenças quanto ao perfil de sensibilidade aos carbapenens nas diferentes
regiões geográficas brasileiras (dados não publicados*). As regiões nordeste e centro-oeste
apresentaram as maiores taxas de resistência (> 69%), seguida pelas regiões sudestes (> 60%)
e nordeste (50%). A região sul apresentou as menores taxas de resistência, com apenas 29%
dos isolados resistentes (dados não publicados*).
Algumas considerações precisam ser feitas ao se comparar as taxas de resistência aos
carbapenens entre Brasil e Espanha. Primeiramente o Brasil apresenta uma área territorial de
proporções continentais, quase 17 vezes o território da Espanha, com uma população estimada
em 192 milhões de habitantes frente aos 46 milhões de espanhóis. As dimensões observadas
em nosso país dificultam a implementação de políticas de vigilância efetivas de modo que
172
* Dissertação de Mestrado - Adryella de Paula Ferreira Luz (Disciplina de Infectologia - UNIFESP), 2010.
Discussão
possamos ter dados realmente representativos do perfil de resistência aos antimicrobianos em
todos os estados da federação. As dificuldades encontradas não esbarram apenas na questão
geográfica, mas principalmente na imensa desigualdade socioeconômica que assolam o nosso
país, permitindo que as melhores condições de assistência à saúde fiquem quase que exclusivas
nas regiões mais ricas e desenvolvidas (sul e sudeste). Obviamente, aliado a isso contamos com
deficiências no sistema público de saúde. Enquanto que na Espanha, todos os hospitais estão
interligados por uma única e eficiente rede de vigilância de resistência antimicrobiana, a REIPI
(“Red Española de Investigación en Patología Infecciosa”), coordenado pelo ministério da saúde
daquele país, e apresente um sistema público abrangente e de boa qualidade, ainda que muito
caro, permite uma melhor padronização e igualdade na implementação de medidas de controle
de infecções hospitalares e um controle rígido do uso de antimicrobianos, o que contribui para as
menores taxas de resistência. Apesar disso, as taxas de resistência observadas na Espanha,
assim com nos demais países mediterrâneos, como Itália e Grécia, são extremamente
superiores aos observados nos países nórdicos (Kempf & Rolain, 2012).
Rossi (2011) faz uma reflexão muito oportuna a respeito do uso de antimicrobianos,
quando descreve os desafios da resistência bacteriana no Brasil. Nesse estudo, a autora
evidencia o uso indiscriminado de antimicrobianos como um fator crítico na seleção da
resistência em nosso país, lembrando que até pouco tempo a população tinha livre acesso aos
antimicrobianos, levando a prática muito comum de automedicação. Além disso, reforça a ideia
de que outros fatores como o uso de dosagem inadequada, má aderência no tratamento e o uso
inapropriado de agentes antimicrobianos também podem desempenhar um papel igualmente
importante.
Se as taxas de resistências aos carbapenens entre isolados de Acinetobacter spp. do
Brasil e da Espanha são tão diferentes (Asensio et al., 2008; Marra et al., 2011; Gales et al.,
2012), variando inclusive dentro de cada país (Asensio et al., 2008; Luz, 2011), os mecanismos
173
Discussão
de resistência prevalentes nesses isolados são ainda mais diversos. Duas CHDLs resumem os
principais mecanismos de resistência nos dois países, a OXA-24/40 na Espanha (Bou et al.,
2000) e a OXA-23 no Brasil (Dalla-Costa et al., 2003). Partindo dessas duas CHDLs darei início
a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em isolados de Acinetobacter spp. no Brasil e na
Espanha, que objetivou a presente tese e a partir de agora servirá de elo que unirá todos os sete
artigos aqui apresentados.
Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens descritos em isolados clínicos de
A. baumannii, a produção de β-lactamases, particularmente as CHDLs, é o mais importante e
bem estudado (Poirel et al., 2010). A impermeabilidade de membrana externa associada com a
perda ou diminuição da expressão das porinas CarO (29 kDa) (Mussi et al., 2005), 33-36 kDa
(Tomás et al., 2005) e a OprD-like (43 kDa) (Dupont et al., 2005) é outro mecanismo descrito em
A. baumannii associado a resistência aos carbapenens. Acredita-se que o tamanho pequeno e o
número de porinas em A. baumannii seja o responsável pela resistência intrínseca aos
antimicrobianos observada neste patógeno (Vila et al., 2007). Embora vários sistemas de efluxo
tenham sido descritos em A. baumannii, o sistema AdeABC é o mais importante e estudado (Chu
et al., 2006; Huang et al., 2008), a relação da hiperexpressão desses sistemas na resistência aos
β-lactâmicos ainda é pouco compreendida (Marchand et al., 2004; Hu et al., 2007).
Assim como ocorre com outros bacilos Gram negativos, raros foram os estudos que
estudaram o papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos, principalmente aos carbapenens,
em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003;
Russo et al., 2009; Yun et al., 2011). Ainda assim, a maioria desses estudos foi realizada com
cepas mutantes laboratoriais sem nenhum mecanismo de resistência adicional e expostas a
diferentes β-lactâmicos. Embora os resultados mostrassem uma reorganização das PBPs frente
à pressão seletiva com os β-lactâmicos, esses estudos não representam a realidade, uma vez
que isolados clínicos de A. baumannii tendem a ser multirresistentes, apresentando
174
Discussão
conjuntamente diferentes mecanismos de resistência, principalmente produção de β-lactamases
e alteração de porinas, o que diminuiria drasticamente a pressão seletiva desses antimicrobianos
in vivo sobre as PBPs. Sendo assim, ainda que in vitro os β-lactâmicos exerçam uma pressão
seletiva sobre as PBPs, in vivo isso se repetiria, mesmo com tantos mecanismos de resistência
atuando em etapas anteriores à ligação desses antimicrobianos às PBPs? Dessa maneira,
decidimos por estudar os diferentes genes de PBPs em isolados clínicos de A. baumannii de três
grandes centros hospitalares na Espanha, durante meu estágio de doutorado sanduíche no
HUMV.
Neste estudo descrevemos e classificamos os genes codificadores de PBPs em A.
baumannii, e avaliamos o papel das mutações encontradas nesses genes na resistência aos βlactâmicos em isolados clínicos da Espanha (artigo científico 1). A partir da análise dos
genomas sequenciados de A. baumannii foram encontrados sete PBPs (PPB1a, PBP1b, PBP2,
PBP3, PBP5/6, PBP6b e PBP7/8) e uma MGT (MtgA) (Cayô et al., 2011a). Dessa maneira, A.
baumannii apresenta quatro HMM-PBPs, sendo duas transpeptidases/transglicosilases de classe
A, PBP1a e PBP1b, responsáveis pela síntese da parede celular, e duas transpeptidases de
classe B, PBP2 (subclasse B2) e PBP3 (subclasse B3) (Cayô et al., 2011a). As PBPs da
subclasse B2 tem função de elongação da parede celular e as PBPs da subclasse B3 está
relacionada a divisão celular (Den Blaauwen et al., 2003; Piette et al., 2004; Sauvage et al.,
2008). Foram também encontradas três LMM-PBPs, sendo essas as D-Ala-D-Alacarboxipeptidases PBP5/6 e PBP6b, e a endopeptidase PBP7/8. Por último, foi também
encontrado uma transglicosilase monofuncional chamada MtgA (Cayô et al., 2011a).
No mesmo estudo, 26 isolados clínicos de A. baumannii sensíveis e resistentes aos
carbapenens, tiveram os sete genes codificadores das PBPs, além da MGT, sequenciados.
Quando comparadas as mutações das PBPs dos isolados clínicos com os 11 genomas de A.
baumannii previamente sequenciados, foi constatado que os genes das PBPs são altamente
175
Discussão
conservados, mesmo quando comparado ao genoma da ATCC 17978, cepa isolada no início da
década de 50, anterior ao desenvolvimento e uso da maioria dos β-lactâmicos na prática clínica
(Baumann, 1968). A maioria das mutações encontradas na sequencia de nucleotídeos foi
silenciosa e geralmente ocorria sempre nas mesmas regiões, indicando a presença de “hotspot
mutations” nos genes codificadores das PBPs. As poucas mutações pontuais encontradas na
sequência de aminoácidos não puderam ser associadas com a resistência aos β-lactâmicos,
uma vez que as mesmas foram encontradas tanto em cepas sensíveis como nas resistentes
(Cayô et al., 2011a). Ao que tudo indica, essas mutações estão mais associadas ao perfil clonal
das cepas de A. baumannii do que diretamente com a resistência aos antimicrobianos (Cayô et
al., 2011a). Nós também relatamos em dois isolados resistentes aos carbapenens e que
pertenciam ao clone mais disseminado nos últimos cinco anos no HUMV, a inativação do gene
dacD, codificador da PBP6b, devido à presença de uma IS (Cayô et al., 2011a), semelhante à
ISAba125, que havia sido previamente reportada como presente no gene que codificava a porina
CarO (Mussi et al., 2005).
Embora não tenha sido avaliado nesse estudo o impacto da inativação da PBP6b em A.
baumannii, Ghosh e colaboradores (2008) avaliaram mutantes de E. coli apresentando a deleção
de uma ou de todas as LMM-PBPs, e demonstraram que tais deleções não afetaram
substancialmente a divisão ou o alongamento da célula bacteriana. Apesar disso, um estudo
conduzido por Russo e colaboradores (2009) demonstrou in vitro, usando diferentes modelos de
infecção, que a PBP7/8 contribui para a sobrevivência de A. baumannii frente a atividade
bactericida mediada pelo sistema complemento. Naquele estudo, um mutante de A. baumannii
apresentando uma inserção de um transposon no gene pbpG que codifica a PBP7/8 foi morto
pelas células do sistema imune em modelos in vitro de ascites e também apresentava uma
diminuição da sua sobrevida nos modelos animais de infecção de pele e partes moles e de
pneumonia, quando comparado com os mesmos modelos infectados com a cepa do tipo
176
Discussão
selvagem. Os autores também observaram por microscopia eletrônica de transmissão que os
isolados que não expressavam a PBP7/8 apresentavam uma forma cocobacilar aberrante,
demonstrando um provável papel crítico na modulação da morfologia celular em A. baumannii.
Baseado nos seis trabalhos que enfocaram o estudo das PBPs em A. baumannii
publicados até o momento (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al.,
2007; Russo et al., 2009; Cayô et al., 2011b, Yun et al., 2011), incluindo o presente trabalho, é
possível inferir que: (i) a indução com β-lactâmicos leva a uma reorganização das PBPs, e a
resistência in vitro a esses antimicrobianos; (ii) a relativa atividade do sulbactam frente a
isolados multirresistentes de A. baumannii pode ser explicada, em parte, pela sua maior
afinidade pelas PBPs desse micro-organismos comparado aos demais inibidores; (iii)
provavelmente eventos pós-transcricionais ou de expressão gênica tenham maior impacto e
importância na alteração das PBPs do que propriamente mutações nos genes codificadores das
PBPs; (iv) o papel das PBPs pode transcender a resistência aos β-lactâmicos, demonstrando
ser um possível fator de virulência e evasão do sistema imunológico e (v) a resistência aos
carbapenens pode ser multifatorial e complexa, envolvendo tanto a indução da expressão de βlactamases, sistemas de efluxo e PBPs e a diminuição da expressão de proteínas de membrana
externa.
Ainda que a produção de CHDLs seja o mecanismo mais prevalente em A. baumannii,
essas enzimas hidrolisam fracamente os carbapenens e não apresentam atividade frente às
cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010). Além disso, a grande maioria dos genes
codificadores das CHDLs necessitam da presença de IS, conferindo um promotor forte, para
aumentar a sua expressão (Poirel et al., 2010). Tais observações somente aumentam a
importância de outros mecanismos adjuvantes na elevação das CIMs, não somente para os
carbapenens, como também para os demais β-lactâmicos. Outro dado importante a ser
enfatizado é que, de algum modo, ao longo da sua escala evolutiva, A. baumannii desenvolveu,
177
Discussão
uma maneira única de manter diferentes “cópias” de IS em seu genoma de modo a mobilizá-la
quando necessário, reorganizando, dessa maneira, a expressão de diferentes genes conforme a
sua necessidade e com menor custo energético (Vallenet et al., 2008). A presença de varias
cópias ao longo dos genomas de A. baumannii sequenciados comprova a importância dessas IS
para sua sobrevivência. A associação de tais estruturas com as PBPs ainda carece ser
elucidado, conforme relatado no gene dacD (PBP6b) nos isolados espanhóis (Cayô et al.,
2011a).
Para o estudo das PBPs, inicialmente selecionamos aleatoriamente 16 isolados
sensíveis ou resistentes aos carbapenens, e que fossem representativos dos clones majoritários
e minoritários mais importantes da coleção de aproximadamente 603 amostras do complexo A.
calcoaceticus-baumannii do HUMV, coletadas entre os anos de 2004 a 2008. Essas amostram
haviam sido previamente identificadas pelo sistema automatizado MicroScan Walk-Away®
(Siemens Healthcare Diagnostics, West Sacramento, CA) e caracterizadas quanto ao perfil
clonal por Rep-PCR. Os oligonucleotídeos para os genes das PBPs foram desenhados
baseados nos genomas de A. baumannii conhecidos na época. As cepas de referência RUH134
e RUH875 de A. baumannii foram utilizadas para padronização das reações de PCR. Entretanto,
no momento de testar os oligonucletídeos para os 16 isolados clínicos selecionados, cinco
desses não apresentavam amplificação para alguns dos genes de PBPs de A. baumannii. A
partir dessa observação, inferimos que talvez esses isolados pudessem não ser A. baumannii,
mas uma das outras três espécies que compõe o complexo A. calcoaceticus-baumannii. Sendo
assim, duas metodologias para a confirmação da identificação das espécies do gênero
Acinetobacter foram padronizadas, sendo essas o ARDRA (Vaneechoutte et al., 1995) e,
posteriormente, o sequenciamento do gene rpoB (La Scola et al., 2006; Gundi et al., 2009).
Inicialmente os cinco isolados de Acinetobacter spp. foram negativos para o gene blaOXA51-like,
que na época ainda era utilizado para a identificação presuntiva de A. baumannii (Chen et
178
Discussão
al., 2010; Lee et al., 2012). Dessa forma, já sabíamos que tais isolados não pertenciam à
espécie A. baumannii, justificando o motivo da não amplificação para alguns dos genes de PBPs
estudados. Os cinco isolados foram então identificados por ARDRA como sendo A. pittii (quatro
isolados) e A. haemolyticus (um isolado). A identificação foi posteriormente confirmada pelo
sequenciamento do gene rpoB. Ao repicar esses isolados em ágar sangue observamos a
presença de hemólise para o isolado identificado como sendo A. haemolyticus, que embora essa
característica não seja exclusiva dessa espécie, serve de exclusão de uma cepa com sendo A.
calcoaceticus-baumannii, uma vez que as quatro espécies que compõe o complexo não são
hemolíticas. Como um dos isolados de A. pittii (HUMV-1588) era positivo para o gene blaOXA-24/40like,
decidimos então sequenciar, uma vez que ainda não havia sido descrito na Espanha outra
espécie de Acinetobacter spp. que não A. baumannii carreando a CHDL OXA-24/40.
Surpreendentemente, o resultado do sequenciamento demonstrou que o isolado de A. pittii
carreava uma nova variante do cluster OXA-24/40, sendo nomeada OXA-207, o que acabou
dando origem ao artigo seguinte (artigo científico 02).
Diferente do que ocorre no Brasil, onde há um predomínio da OXA-23, fato este que será
melhor abordado na segunda parte desta discussão, na Espanha a principal carbapenemase é a
OXA-24/40 (Acosta et al., 2011). Inicialmente descrita em um surto ocorrido 1997 no Hospital
Ramón y Cajal em Madrid (Bou et al., 2000), essa CHDL é endêmica na península Ibérica
(Lopez-Otsoa et al., 2003; Grosso et al., 2011b), sendo também descrita nos Estados Unidos
(Lolans et al., 2006; Tian et al., 2011). O sucesso da OXA-24/40 nessa região geográfica se
deve, principalmente, pela disseminação de um clone epidêmico MDR que tem sido descrito em
Portugal desde 1995 (Da Silva et al., 2004). Apenas casos esporádicos foram relatados na
França e Itália (Héritier et al., 2003; D'Andrea et al., 2009), já que as CHDLs mais prevalentes
nesses dois países são a OXA-23 e a OXA-58, o mesmo ocorrendo com os demais países da
179
Discussão
União Europeia (Kempf & Rolain, 2012), com exceção da Croácia, que apresenta a OXA-72
(Goic-Barisic et al., 2011).
Até o momento foram descritas seis variantes, sendo essas: OXA-25, OXA-26, OXA-72,
OXA-139, OXA-160 e OXA-207 (Afzal-Shah et al., 2001; Wang et al., 2007; Tian et al., 2011).
Somente a OXA-72 tem sido descrita em diferentes partes do mundo (Poirel et al., 2010),
diferente das demais variantes que são restritas a determinados locais (Tian et al., 2011), ou a
um único relato (Afzal-Shah et al., 2001). Dois novos clusters apresentando uma alta identidade
de sequência com a OXA-24/40 foram propostos, sendo esses a OXA-143 no Brasil e a OXA182 na Coréia do Sul (Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010), podendo, inclusive, ser
consideradas, por alguns autores, como variantes do cluster OXA24/40. Talvez a maior diferença
entre essas três enzimas, seja o contexto genético. Nenhumas dessas enzimas foi relacionada à
IS (Poirel et al., 2010), como ocorre com as demais CHDLs de A. baumannii, o que demonstra
que essas enzimas sejam as mais potentes de todas as CHDLs. Foi descrito que as enzimas do
cluster OXA-24/40 se mobilizam por um sistema de recombinação XerC/XerD que facilita a sua
disseminação por diferentes espécies de Acinetobacter (Merino et al., 2010) e que, a princípio
não seria o mesmo modo de mobilização da OXA-143 e da OXA-182 (Higgins et al., 2009; Kim et
al., 2010). A capacidade de mobilização dos genes codificadores das variantes do cluster OXA24/40, justifica o fato de já terem sido descritos relatos de A. junii (Fernández-Cuenca et al.,
2012) e A. pittii (Montealegre et al., 2012) carreando a OXA-72, como também A. calcoaceticus
(Merino et al., 2010) e A. haemolyticus (Grosso et al., 2011b) carreando a OXA-24/40. Além
disso, Sevillano e colaboradores (2009) descreveram a produção de OXA24/40 em um isolado
de P. aeruginosa no norte da Espanha e que carreava o mesmo plasmídeo verificado nos
isolados de A. baumannii, mostrando a capacidade de transmissão horizontal desse
determinante de resistência (Sevillano et al., 2011).
180
Discussão
Assim como em toda a Espanha, a OXA-24/40 é a CHDL mais prevalente em isolados
de A. baumannii do HUMV. Sendo assim, a transmissão dessa CHDL de A. baumannii para A.
pittii era algo factível. Tanto o gene blaOXA-24/40, presente nos clones de A. baumannii encontrados
no HUMV, como o gene blaOXA-207, isolado de A. pittii, apresentavam o mesmo contexto genético,
demonstrando a passagem do gene de resistência de uma espécie para a outra. Entretanto, o
gene blaOXA-207 encontrado em A. pittii apresentava uma mutação que alterou o sítio catalítico da
enzima aumentando a sua afinidade por oxacilina e diminuindo, por outro lado, sua afinidade
pelos carbapenens. Ainda assim, os estudos de cinética demonstraram que o efeito dessa
mutação não foi o mesmo observado in vitro por Santillana e colaboradores (2007). Dessa forma,
a produção de OXA-207 possui um importante papel na resistência aos carbapenens na cepa
HUMV-1588. Dentre as variantes do cluster OXA-24/40, a OXA-207 é a primeira que realmente
apresenta alteração na sua capacidade hidrolítica. A questão ainda desconhecida é por que e
em que condições o gene da OXA-24/40 sofreu a mutação, tornando-se uma nova variante.
Higgins e colaboradores (2010b) comprovaram in vivo a reversão da OXA-164, nova variante do
cluster OXA-58, novamente em uma OXA-58 após tratamento com meropenem combinado com
amicacina, ciprofloxacina e cotrimoxazol.
Entre os 16 isolados identificados pelo MicroScan Walk-Away® como complexo A.
calcoaceticus-baumannii e selecionados para o estudo das PBPs, quatro foram identificados
como sendo A. pittii. A partir dessa constatação surgiu a ideia de avaliar a real prevalência das
demais espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii no HUMV nos últimos
cinco anos (artigo científico 03). Os resultados obtidos mostraram uma grande diversidade de
espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter spp. causando infecções em humanos. Talvez o
dado mais importante seja a alta prevalência de A. pittii no HUMV, sendo responsável por 41,8%
(36/86) dos padrões de Rep-PCR avaliados no estudo. A prevalência de A. pittii foi similar a de
A. baumannii (44,8%; 38/86), quando avaliado somente os padrões de Rep-PCR. Outro
181
Discussão
resultado interessante foi a presença de OXA-58 em um clone de A. pittii sensível aos
carbapenenens no HUMV. Martí e colaboradores (2008b) relatam, pela primeira vez, a presença
de OXA-58 em um isolado de A. pittii apresentando altos níveis de resistência a imipenem (CIM
> 32 µg/mL) na Catalunha. Os autores comparam o contexto genético desse isolado ao de uma
cepa de A. baumannii também produtora de OXA-58 e isolada no mesmo hospital. Eles
verificaram que o gene blaOXA-58 estava localizado em plasmídeos diferentes em ambos isolados,
porém flanqueado por duas copias da ISAba3. Os autores concluem que a produção isolada de
OXA-58 não é suficiente para causar as CIMs elevadas para imipenem, sendo necessária a
contribuição de outros mecanismos de resistência, como a perda de porinas e efluxo ativo.
Embora o mesmo grupo de pesquisa também tenha relatado a presença de OXA-58 em um
isolado de A. phenon 6/ct13TU (Martí et al., 2008a), não foi verificada a presença dessa CHDL
nos isolados identificados como A. phenon 6 em nosso estudo. Boo e Crowley (2009) relataram
a presença de OXA-23 e OXA-58 em isolados sensíveis de A. radioresistens e A. bereziniae,
respectivamente. Avaliando o contexto genético da OXA-58, os autores encontraram os mesmos
resultados obtidos por Martí e colaboradores (2008b) em A. pittii e explicam que a ISAba1,
ISAba2 e IS18 funcionariam como melhores promotores do que a ISAba3, o que justificaria a
sensibilidade verificada no isolado de A. bereziniae (Boo & Crowley, 2009) e, provavelmente, no
isolados de A. pittii sensíveis do HUMV. Os autores finalizam, lembrando que isolados de
Acinetobacter spp. sensíveis aos carbapenens, porém produtores de CHDLs, funcionariam como
reservatórios de genes de resistência, já que poderiam não ser identificados pelos métodos
rotineiros que, geralmente, avaliam amostras resistentes (Boo & Crowley, 2009).
Embora a análise por padrão de Rep-PCR permita inferir que A. pittii seja tão frequente
como A. baumannii como agente causador de infecção no HUMV, quando se extrapola os dados
para os demais de isolados por padrão de Rep-PCR, A. baumannii é o mais prevalente, sendo
responsável por 85% dos isolados (515/603). Tal resultado já era esperado, uma vez que A.
182
Discussão
baumannii se dissemina clonalmente no ambiente hospitalar, causando surtos de grandes
proporções, além de geralmente apresentar um fenótipo MDR, o que favorece a sua
permanência como microbiota da pele de pacientes, permitindo a transmissão cruzada entre
pacientes ou, mais frequentemente, de profissional de saúde para paciente. Resultado oposto foi
observado para a maioria dos isolados de A. pittii e das outras sete espécies/genoespécies
também identificadas no estudo, já que foram geralmente multissensíveis, o que impede, muitas
vezes, que tais micro-organismos sejam capazes de causar surtos. Como já era de se esperar, a
maioria dos isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HUMV eram produtores
de OXA-24/40. Nos demais clones resistentes e não produtores de OXA-24/40 foi observada a
presença de OXA-51 associado a ISAba1. Uma alta variabilidade quanto as CHDLs
cromossômicas pertencentes ao cluster OXA-51 foi verificada entre os isolados de A. baumannii.
Pelo menos 12 tipos diferentes de OXA-51 foram identificados, além de outras nove novas
variantes aguardando nomeclatura específica.
Turton e colaboradores (2010) analisando a incidência das espécies de Acinetobacter
spp. no Reino Unido, relata A. baumannii como sendo a espécie mais prevalente, com 78% dos
isolados analisados, seguido por A. lwoffii/A. genoespécie 9 (8%), A. ursingii (4%). A. pittii, a
segunda espécie mais frequente em nosso estudo, foi reponsável por somente 1,7% dos
isolados juntamente com A. johnsonii no estudo britânico, o qual ainda relata diferenças nos
perfis de sensibilidade aos antimicrobianos entre as espécies, sendo A. lwoffii e A. schindleri
espécies multissensíveis e A. pittii, A. nosocomialis, A. bereziniae e A. gyllenbergii resistentes a,
pelo menos, oito antimicrobianos diferentes. Em outro estudo de van den Broek e colaboradores
(2009) realizado na Holanda, que avaliou prospectivamente as espécies de Acinetobacter spp.
durante oito anos, foi observada uma menor prevalência de A. baumannii (27%), quando
comparados a estudos similares (Turton et al., 2010). Entretanto, A. pittii foi tão prevalente
quanto A. baumannii, com 26% dos isolados, seguido por A. lwoffii (11%), A. ursingii (4%), A.
183
Discussão
johnsonii e A. junii (3%). Esses autores relataram também que 37% dos isolados de A.
baumannii foram multissensíveis aos antimicrobianos.
Com a padronização das metodologias de ARDRA e o sequenciamento do gene rpoB,
comecei a auxiliar na identificação das espécies dos isolados clínicos provenientes da rotina
laboratorial. Em uma dessas identificações, tivemos um caso de um paciente com um quadro de
leucemia linfoblástica aguda com histórico recente de transplante de medula óssea, não
aparentado (artigo científico 04). O paciente apresentou um pico febril, sendo isolado da
hemocultura um coco-bacilo Gram negativo não fermentador identificado inicialmente como A.
lwoffii. A identificação realizada pelo ARDRA confirmou a identificação desse isolado como
pertencente à espécie A. junii. Consta na literatura diversos relatos descrevendo uma predileção
desse micro-organismo por pacientes oncológicos e neonatos (Bernards et al., 1997).
Geralmente as cepas são sensíveis à maioria dos antimicrobianos utilizados na clínica e por isso
o transcurso clínico é quase sempre favorável. Ainda que a terapia seja guiada, principalmente,
pelo antibiograma apresentado pelo isolado, do que pela identificação da espécie, atenção
especial deve ser dada para uma correta identificação das diferentes espécies de Acinetobacter
não-baumannii. Dessa maneira, as informações obtidas permitirão uma melhor compreensão da
epidemiologia e a importância dessas espécies como patógenos humanos.
No Brasil, três trabalhos foram os pioneiros na caracterização molecular dos
mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados de Acinetobacter spp., os quais
relataram pela primeira vez a produção de OXA-23 e IMP-1 no Brasil (Costa et al., 2000; DallaCosta et al., 2003; Gales et al., 2003). O estudo de Costa e colaboradores (2000) foi primeiro
estudo em se avaliar os mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados sensíveis e
resistentes pertecentes ao um surto ocorrido no Hospital das Clínicas de São Paulo. Neste
estudo os autores observaram a alteração de uma porina de 31-36 kDa em um isolados
resistente a imipenem. Além disso, eles detectaram uma β-lactamase com PI de 7,4 em todos os
184
Discussão
isolados, provavelmente a OXA-51, descrita somente cinco anos depois (Brown et al., 2005), e
mais duas β-lactamases, somente nos isolados resistentes, com PIs de 5,9 e 6,7,
correspondentes a TEM-1 e a OXA-23. Dalla-costa e colaboradores (2003) descreveram um
surto em dois hospitais em Curitiba causado por oito cepas de A. baumannii resistentes aos
carbapenens isoladas em 1999. Todas as cepas apresentavam o mesmo padrão de PFGE e
carreavam uma CHDL, ainda desconhecida em nosso país, a OXA-23, após 14 anos desde a
sua descrição na Escócia em 1985. O surto causado por essas cepas estavam associados a
uma alta mortalidade (62,5%), mesmo dois dos cinco pacientes terem sido tratados com
polimixina B. Esse estudo chamou a atenção da comunidade científica nacional para aquela que,
posteriormente, seria a carbapenemase mais frequente no Brasil. No mesmo ano, Gales e
colaboradores (2003) descreveram pela primeira vez no Brasil uma cepa de A. baumannii
produtora da MβL IMP-like isolada em 2000 no Hospital São Paulo. Embora nesse isolado não
tivesse sido avaliada a produção de CHDLs, os resultados do gel de ponto isoelétrico (PI)
apontaram somente a presença de duas enzimas com PIs de 5,4 e 8,6, que correspondem,
provavelmente, a TEM-1 e IMP-like, respectivamente (Gales et al., 2003).
Em 2005, um estudo do Programa SENTRY avaliando a disseminação e a diversidade
de MβL na América Latina, relatou a presença de IMP-1 em sete isolados de Acinetobacter spp.
no Hospital São Paulo, não sendo encontrado nos demais centros médicos brasileiros
participantes (Sader et al., 2005). Além disso, o estudo também relata um isolado de P.
fluorescens também produtor de IMP-1, demonstrando a capacidade de disseminação desse
determinante de resistência, mesmo entre espécies diferentes. No ano seguinte, Tognim e
colaboradores (2006) relatam que a MβL, descrita em 2003, se tratava da variante IMP-1 e que
esta estava disseminada nos isolados de Acinetobacter spp. do Hospital São Paulo. Os autores
também descrevem a presença de dois ribogrupos distintos principais, 52-1 e 60-7, sendo o
primeiro ribogrupo encontrado entre 1994-1998, composto principalmente por isolados não
185
Discussão
produtores de MβL, e o segundo ripogrupo encontrado entre 1999-2001 e composto por isolados
produtores de IMP-1. Como ambos os ribogrupos apresentavam uma alta similaridade (85%), os
autores concluíram que o segundo ribogrupo (60-7) seria um subclone do ribogrupo 52-1, tendo
adquirido o gene da IMP-1. A partir dos resultados obtidos pelos três estudos é possível inferir
que as carbapenemases presentes nos isolados de A. baumannii em Curitiba e em São Paulo
não eram as mesmas até o ano 2001.
Um ano após o estudo de Tognim e colaboradores (2006), um novo estudo do programa
SENTRY, estudando sete cepas de Acinetobacter spp. e uma cepa de P. putida produtoras de
IMP-1 isoladas entre 2001-2002 no Hospital São Paulo, descreveu o contexto genético dessa
MβL (Mendes et al., 2007). Dessa forma, ficou definido que o gene blaIMP-1 estava inserido em
um integron de classe 1 chamado In86, e que este estava localizado tanto no cromossoma como
em plasmídeos nas cepas de Acinetobacter spp., sendo a maioria não relacionadas clonalmente.
O In86 apresentava mais dois genes cassetes, além do gene blaIMP-1, sendo ambos, aac(6’)-31 e
o aadA1, codificadores de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (Mendes et al., 2007).
Até o momento, o gene blaIMP-1 somente foi descrito no estado de São Paulo, demonstrando ser
um problema restrito, principalmente, nos hospitais na região metropolitana da capital. Além
disso, a mobilização e disseminação do gene blaIMP-1 é exclusivamente relacionada ao In86, já
que esse mesmo integron foi também descrito em cepas de enterobactérias produtoras de IMP-1
em diferentes hospitais da cidade de São Paulo (Lincopan et al., 2005; Lincopan et al., 2006;
Penteado et al., 2009).
Após seis anos desde o primeiro relato de OXA-23 no Brasil, dois estudos avaliando
cepas de A. baumannii isoladas entre 2006 e 2007, relatam a disseminação dessa CHDL no Rio
de Janeiro (Carvalho et al., 2009) e em Porto Alegre (Martins et al., 2009). Esses dois estudos
foram importantes, pois foram os primeiros a demonstrar que a OXA-23 era a carbapenemase
mais frequente e disseminada em isolados de A. baumannii no Brasil, que a IMP-1 era um
186
Discussão
problema restrito ao estado de São Paulo e que diferente do que foi observado em Curitiba,
esses isolados não apresentavam o mesmo perfil clonal (Dalla-Costa et al., 2003; Carvalho et al.,
2009; Martins et al., 2009).
Em 2010, um estudo avaliando a evolução temporal de isolados de A. baumannii
resistentes aos carbapenens em Curitiba, demonstrou que o clone produtor de OXA-23,
inicialmente descrito em 1999, persistiu até 2004 sendo, então, substituído por outros dois clones
prevalentes (Schimith Bier et al., 2010), corroborando com os resultados obtidos no Rio de
Janeiro e em Porto Alegre (Carvalho et al., 2009; Martins et al., 2009). O estudo também relatou
uma alta taxa de mortalidade (45,2%) verificada nas infecções causada pelos isolados
produtores de OXA-23 e que tais infecções eram principalmente pneumonias relacionada à
ventilação mecânica. Resultados similares foram obtidos por Carneiro e colaboradores (2010)
em um estudo realizado na cidade de Londrina, onde foram verificadas um alta prevalência de
pneumonias relacionadas à ventilação mecânica por isolados de A. baumannii produtores de
OXA-23 com altas taxas de mortalidade (52,9%). Furtado e colaboradores (2011) também
encontraram altas taxas de mortalidade (61,9%), sendo superiores aquelas apresentadas pelos
dois estudos anteriores. Uma característica comum a esses três estudos é o fenótipo MDR
apresentados pelos diferentes clones brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23, sendo
geralmente sensíveis somente à tigeciclina e à polimixina B (Carneiro et al., 2010; Schimith Bier
et al., 2010; Furtado et al., 2011). Uma característica importante verificada nesses isolados foi
que mesmo nos casos em que a terapia foi considerada adequada (geralmente polimixina B), a
taxa de mortalidade permaneceu elevada (Schimith Bier et al., 2010; Furtado et al., 2011).
Ferreira e colaboradores (2011) relataram a presença de OXA-23 em isolados de A.
baumannii recuperados de águas residuais de três hospitais localizados em Porto Alegre,
demonstrando o papel do esgoto hospitalar na perpetuação de patógenos e genes de resistência
aos antimicrobianos no meio ambiente, que poderiam funcionar como possíveis reservatórios
187
Discussão
naturais (Ferreira et al., 2011). Já Martins e colaboradores (2011) relatam um interessante caso
de infecção grave após transplante de pulmão, cujo doador estava colonizado com A. baumannii
produtor de OXA-23. O receptor foi a óbito 60 dias pós-transplante e tal episodio reforça o
diagnóstico precoce de colonização por A. baumannii em doadores de órgãos, o que poderá
implicar na aceitação ou rejeição do órgão e no ajuste da terapia profilática. Recentemente, um
estudo realizado no Rio de Janeiro, mostrou que 70% dos isolados produtores de OXA-23
naquela cidade estão relacionados a uma das três linhagens de A. baumannii MDR mais
prevalentes em todo o mundo, o EU-II (Grosso et al., 2011a).
Durante muitos anos a resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii no
Brasil ficou vinculada exclusivamente a produção de IMP-1 e, principalmente, da OXA-23, como
mostrado nos estudos anteriores. Entretanto, esse cenário se modificou por completo com a
descrição em 2009, por um grupo alemão, de uma nova CHDL encontrada em um isolado
brasileiro, a então desconhecida OXA-143 (Higgins et al., 2009). Em 2011, três importantes
trabalhos mostraram que a dinâmica da resistência aos carbapenens no Brasil era muito mais
diversa do que imaginávamos (Antonio et al., 2011; Figueiredo et al., 2011; Werneck et al.,
2011a). Em maio daquele ano, Figueiredo e colaboradores (2011) descreveram no Rio de
Janeiro o primeiro relato no Brasil da produção de OXA-58 em uma cepa de A. baumannii
isolada em 2005. Logo em seguida Werneck e colaboradores (2011a) publicam o primeiro caso
brasileiro da produção de OXA-72 em A. baumannii isolado, em 2007, na cidade de São Paulo.
Finalmente, quase que concomitantemente, Antonio e colaboradores (2011) nos revelam que a
então desconhecida OXA-143 era altamente prevalente nos isolados de A. baumannii no estado
de São Paulo em detrimento à OXA-23. Nesse estudo também foram encontrados dois isolados
de A. baumannii produtores de OXA-72 e um único isolado produtor de OXA-58, e mais
surpreendentemente três isolados carreando ao mesmo tempo a OXA-23 e a OXA-143.
188
Discussão
Baseado no estudo de Antonio e colaboradores (2011), publicamos uma carta resposta
(artigo científico 5) enfatizando que a alta prevalência verificada no estudo anterior era uma
realidade dos hospitais públicos de São Paulo, o mesmo não sendo verificado nos hospitais
privados da mesma cidade (Werneck et al., 2011b). Além disso, verificamos que a OXA-143,
embora presente na região sudeste, não foi encontrada nos isolados de A. baumannii das
demais regiões do país, sendo a OXA-23 a mais prevalente e disseminada CHDL no Brasil
(Werneck et al., 2011b). Embora diferentes perfis clonais tenham sido observados entre os
isolados produtores de OXA-23, o clone mais frequente encontrado no Brasil ainda continuava
sendo o primeiro clone descrito em 2003 (Dalla-Costa et al., 2003). Dados do projeto SCOPE
(dados não publicados*), avaliando 16 hospitais públicos e privados brasileiros, confirmou os
resultados anteriores, demonstrando que a OXA-143 realmente está restrita a região sudeste.
Além disso, um estudo de Clemente e colaboradores (2011), relata que a OXA-143 é prevalente
em Belo Horizonte, e ainda que aquele seria o primeiro surto causado por isolados de A.
baumannii produtores de OXA-143, apresentando altas taxas de mortalidade semelhantes
aquelas causadas por infecções por produtores de OXA-23.
Com o advento da OXA-143, novas dúvidas começaram a surgir a respeito de quando
essa CHDL teria entrado no Hospital São Paulo, já que os dados locais mostravam uma
prevalência maior do que esperado (dados não publicados*). Além disso, o conhecimento que
tínhamos sobre a epidemiologia molecular da resistência aos carbapenens no Hospital São
Paulo era a prevalência de IMP-1 na década de 90 (Gales et al., 2003; Sader et al., 2005;
Tognim et al., 2006; Mendes et al., 2007) e a inserção da OXA-23 na década seguinte, com a
entrada do clone oriundo de Curitiba (Gales et al., 2008). Sendo assim, idealizamos um estudo
com o objetivo de avaliar a dinâmica temporal da produção de carbapenemases em cepas de
Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens durante os últimos 18 anos no Hospital São
Paulo (artigo científico 6). A diversidade de carbapenemases e de clones encontrados e o
189
* Dissertação de Mestrado - Adryella de Paula Ferreira Luz (Disciplina de Infectologia - UNIFESP), 2010.
Discussão
modo como eles se distribuíram ao longo dos 18 anos do estudo, impressiona pelo incrível
dinamismo.
Embora, a maioria dos isolados resistentes aos carbapenens (96,7%) tenha sido
identificada como sendo A. baumannii, outras espécies de Acinetobacter spp. também foram
observadas, entre elas, A. pittii, A. nosocomialis e A. bereziniae. A MβL IMP-1 foi detectada em
dois períodos distintos, entre 1995 e 1998 e entre 2004 a 2010. Até 2002, essa MβL foi a
carbapenemase mais importante nos isolados de A. baumannii no Hospital São Paulo, como
mostrado em estudos anteriores (Gales et al., 2003; Sader et al., 2005; Tognim et al., 2006;
Mendes et al., 2007). A grande capacidade de mobilização do gene blaIMP-1 entre diferentes
espécies já foi extensivamente descrita na literatura (Lincopan et al., 2005; Lincopan et al., 2006;
Penteado et al., 2009). Em nosso estudo foram encontrados isolados de A. pittii e A. bereziniae
produtores de IMP-1. A transmissão de genes de resistência de A. baumannii para as demais
espécies do gênero compromete drasticamente as opções terapêuticas das infecções causadas
por esses micro-organismos, uma vez que geralmente eles apresentariam, naturalmente,
sensibilidade à maioria dos antimicrobianos. Além da IMP-1, foi detectada, pela primeira vez no
Brasil, a produção de IMP-10 em A. baumannii. Todas as três cepas produtores dessa MβL
foram isoladas em agosto de 2000, apresentando dois padrões de Rep-PCR. Possivelmente,
uma disseminação desses genes tenha ocorrido durante esse período no hospital.
Ao que tudo indica, a OXA-23 foi introduzida no Hospital São Paulo em 2002, oriundo do
clone de Curitiba (Dalla-Costa et al., 2003) e manteve-se presente no hospital nos oito anos
seguintes do estudo. O dado mais surpreendente foi que a OXA-143 foi isolada pela primeira vez
no Hospital São Paulo em 1995, oito anos antes da inserção da OXA-23 nesse hospital e 14
anos antes da sua primeira descrição em 2009 (Higgins et al., 2009). As CHDLs OXA-23 e OXA143 foram identificadas concomitantemente em seis isolados de A. baumannii (2,8%), como
descrito previamente (Antonio et al., 2011), a maioria entre os anos 2008 e 2009. A produção de
190
Discussão
OXA-143 e IMP-1 em uma mesma cepa de A. baumannii foi observada em 1997. Dois isolados
de A. baumannii, coletados em 2008 e 2009, carreavam a OXA-72. Apesar disso, sabe-se que
essa CHDL é anterior a esse período, já que Werneck e colaboradores (2011a) já haviam
descrito a presença dessa CHDL no Hospital São Paulo em um isolado de 2007.
A OXA-58 foi a primeira CHDL encontrada no Hospital São Paulo em 1993 e um
segundo isolado apresentando o mesmo padrão de Rep-PCR foi isolado quatro anos depois. A
detecção de tal enzima não seria nada original, já que a produção dessa CHDL já havia sido
descrita previamente em isolados brasileiros de A. baumannii (Antonio et al., 2011; de Figueiredo
et al., 2011), se não fosse pelo fato de que ambos os isolados serem A. “Close to 13TU”. O
primeiro relato de OXA-58 ocorreu em 2003 (Poirel et al., 2005), quase 10 anos após o primeiro
isolado encontrado no Hospital São Paulo. Como esperado, a CHDL mais prevalente foi a OXA23, sendo detectada em 39,5% (n=85) dos isolados, seguido pela OXA-143 (n = 57, 26,5%),
IMP-1 (n = 27, 12,5%), IMP-10 (n=3, 1,4%), OXA-72 (n = 2, 0,9%) e OXA-58 (n = 2, 0,9%).
Obviamente, a frequência dessas carbapenemases está associada à disseminação de clones
resistentes e as taxas de resitência poderiam ser menores caso houvesse uma maior aderência
às políticas de controle de infecção hospitalar.
Até 2011, nenhum isolado de A. baumannii produtor de OXA-143 havia sido descrito fora
da região sudeste, nem mesmo nos estados fronteiriços (Dalla-Costa et al., 2003; Schimith Bier
et al., 2010). Entretanto, analisando cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens
isolados nos últimos seis anos no Hospital Universitário de Londrina, encontramos um único
isolado que produzia uma enzima que apresentava uma mutação pontual (Asp230Ala) próximo
ao motivo conservado KSG da OXA-143 (artigo científico 7), sendo posteriormente chamada
OXA-231 (Gionco et al., 2012), sendo a primeira variante do cluster OXA-143. Posteriormente,
nenhum outro isolado foi encontrado carreando essa nova variante de OXA-143 no HU de
Londrina, ou em outro Hopital no estado do Paraná.
191
Discussão
Ao final dessa tese reflito sobre a busca em entender a dinâmica da resistência aos βlactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Acredito
que a diversidade e a complexidade com que encontramos, descobrimos apenas a ponta do
icebergue, pois são tantas as perguntas ainda a serem respondidas. Talvez a dinâmica não é
para ser entendida, mas para ser estudada continuamente, pois contínua é a capacidade do
gênero Acinetobacter em adaptar-se as condições adversas e competitivas que ditam o meio
ambiente e o ambiente nosocomial, o que a torna fascinante. Martinus W. Beijerinck disse uma
vez que “Felizes são aqueles que agora começam”, talvez se referindo aos grandes passos
dados por pesquisadores como ele, permitindo que as gerações futuras, como a minha,
pudessem trilhar seus próprios caminhos.
192
Conclusões
6 - Conclusões
As mutações observadas nos sete genes de PBPs em isolados clínicos espanhóis estão
mais relacionadas ao perfil clonal da cepa do que com a resistência aos β-lactâmicos em
A. baumannii;
Uma nova variante de CHDL pertencente ao cluster OXA-24/40 (OXA-207) foi descrita
em um isolado de A. pittii resistente aos carbapenens no norte da Espanha. A mutação
apresentada no gene blaOXA-207 alterou o sítio catalítico da β-lactamase, aumentando sua
afinidade por oxacilina e diminuindo sua atividade de carbapenemase;
Embora A. baumannii seja a espécie pertecente ao gênero Acinetobacter mais
prevalente e resistente encontrado nos últimos cinco anos no HUMV, A. pittii foi
identificado como a segunda espécie mais frequente como patógeno humano;
Todos os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HUMV carreavam os
genes blaOXA-24/40 ou blaOXA-51-like-ISAba1, demonstrando serem as duas CHDLs
codificadas por esses genes os meios mais efetivos de aquisição de resistência aos βlactâmicos nesses micro-organismos;
Diferentes espécies de Acinetobacter spp., foram encontradas causando infecções nos
últimos cinco anos no HUMV, sendo erroneamente identificadas como sendo
pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii pelo sistema automatizado
MicroScan-WalkAway®;
193
Conclusões
Um isolado de A. junii foi identificado causando ICS em um paciente transplantado de
medula óssea com leucemia linfoblástica aguda, enfatizando a predileção desse microorganismo por esse tipo de paciente;
A CHDL OXA-143 somente foi encontrada em hospitais do estado de São Paulo e
raramente no Rio de Janeiro, demonstrando ainda ser um problema isolado,
principalmente em hospitais públicos da região Sudeste;
A OXA-143 demonstrou ser uma CHDL mais antiga do que se esperava, sendo
identificada em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HSP oito anos
antes do que os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Entretanto a
disseminação dos isolados apresentando o gene blaOXA-143 ocorre de maneira mais lenta
do que aqueles que apresentam o gene blaOXA-23, tendo esses maior sucesso ecológico;
O gene blaOXA-23 entrou no HSP provavelmente somente a partir de 2002, com a inserção
do clone identificado inicialmente em Curitiba, sendo a CHDL mais prevalente no HSP
desde então. Além disso, mostrou-se altamente prevalente e disseminada entre os
isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens nas diferentes regiões
geográficas brasileiras;
Assim como verificado no HUMV, o gene blaOXA-58 foi encontrado em isolados de
Acinetobacter não-baumannii (A. genomic species “Close to 13TU”), sendo a CHDL mais
antiga encontrada no HSP,
194
Conclusões
Pela primeira vez no Brasil foi identificado a carbapenemase IMP-10 em isolados de A.
baumannii, em um pequeno surto ocorrido em agosto de 2000 no HSP;
A IMP-1 ainda é uma importante carbapenemase em isolados de A. baumannii no HSP,
sendo restrita aos hospitais da cidade de São Paulo. Além disso, esse carbapenemase
apresenta uma alta capacidade de se disseminar sendo encontrada em outras espécies
de Acinetobacter não-baumannii;
A primeira variante de OXA-143 (OXA-231) foi descrita na cidade Londrina em um
isolado de A. baumannii, demonstrando a emergência desse cluster de CHDL nas
demais regiões geográficas brasileiras;
195
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7 - Referências Bibliográficas
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