Efeito da Inibição da Ativação do NF-KB sobre o - PPGBAIP
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Efeito da Inibição da Ativação do NF-KB sobre o - PPGBAIP
1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO Plasmodium berghei MICHELLI ERICA SOUZA FERREIRA Belém-PA 2014 2 MICHELLI ERICA SOUZA FERREIRA EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO Plasmodium berghei Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Biologia de Infecciosos e Parasitários. Orientador: Sandro Percário Belém-PA 2014 Agentes 1 MICHELLI ERICA SOUZA FERREIRA EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO Plasmodium berghei Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário Lab. de Pesquisa em Estresse Oxidativo, ICB-UFPA Banca examinadora: Prof. Dr. Jose Luiz Fernandes Vieira Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA Profa Dra. Maria Fâni Dolabela Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA Profa. Livre-Docente Dorotéia Rossi Silva Souza Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto/FAMERP Prof. Dr. Evonnildo Costa Goncalves Instituto de Ciências Biológicas/ ICB-UFPA Belém, 10 de fevereiro de 2014 2 EPÍGRAFE “A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais notável” (Galileu Galilei). “A Ciência sem Religião é manca, a Religião sem a Ciência é cega” (Albert Einstein). “Entendo por razão, não a faculdade de raciocinar, que pode ser bem ou mal utilizada, mas o encadeamento das verdades que só pode produzir verdades, e uma verdade não pode ser contrária a outra.”(Leibniz) 3 DEDICATÓRIA Ao meu pai Pedro Rosildo e minha mãe Marizete por quem tenho amor, respeito, admiração, pessoas especiais que são minha fonte de dedicação, inspiração, grande exemplo de determinação, de caráter, de coragem e de vida. Ao meu noivo Manoel Soares, amigo, companheiro e grande incentivador, alguém por quem tenho profunda admiração, respeito e amor. Aos meus irmão Marcelle e Michel que foram sempre companheiros e amigos em minha vida profissional e pessoal. 4 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por iluminar meus caminhos traçados. Ao meu orientador Sandro Percário, minha fonte de inspiração e sabedoria, que me orientou e ensinou de forma paciente e clara como fazer pesquisa e desempenhar o papel de docente. Ao meu pai, minha mãe e meus irmãos que sempre incentivaram e acreditaram em minha atuação profissional. Ao meu meu noivo que com muito carinho e paciência acompanhou e incentivou minha jornada acadêmica. Aos amigos do Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo (LAPEO), que formam uma grande equipe e sempre estão prontos a ajudar uns aos outros. Em especial, agradeço a Paula Laurindo, Ana Carolina Musa, Danilo Moreira, Marcela Figueira, Amanda Vasconcelos, Rafael Quadros, Lângela, João, Aline e a todos os estagiários que dedicaram seu tempo na realização dos procedimentos experimentais desse trabalho. Ao Laboratório de Neurociências da UFPA por ter fornecido a cepa de Plasmodium berghei. Ao Programa de Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários e seus docentes pela inestimável contribuição científica. Ao Instituto Evandro Chagas (IEC) pelo fornecimento dos animais de experimentação. Ao Biotério UFPA, especialmente ao Sr. Amarildo e seus companheiros de trabalho pela ajuda com os camundongos, pela amizade e carinho com que sempre me recebeu. A todos os animais que precisaram sofrer eutanásia para a execução desse trabalho científico. Ao CNPQ pelo apoio financeiro por meio da bolsa e pelo incentivo a pesquisa. 5 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS 10 LISTA DE QUADROS E TABELAS 13 ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 15 RESUMO 17 ABSTRACT 18 1. INTRODUÇÃO 19 2. MALÁRIA 23 2.1. EPIDEMIOLOGIA 23 2.2. BIOLOGIA DO PARASITA 25 2.3. PATOGENIA 27 2.4. MALÁRIA GRAVE 29 2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL 33 3. ESTRESSE OXIDATIVO 34 3.1. ESTRESSE OXIDATIVO E MECANISMOS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 36 4. MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO 38 5. FATOR NUCLEAR-KAPPA B 40 5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO (ERON) NA ATIVAÇÃO DO NF-KB 43 5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB 45 5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES 47 6. MALÁRIA E O NF-KB 48 7. ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFEÍCO-CAPE 50 8. OBJETIVOS 52 6 8.1. GERAL 52 8.2. ESPECÍFICOS 52 9. MATERIAL E MÉTODOS 53 9.1. GRUPOS DE ANIMAIS 53 9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS 54 9.3. PESQUISA DO PARASITO NO SANGUE 55 9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS 56 9.5. INIBIÇÃO DO NF-KB 56 9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE 56 9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) 56 9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 58 9.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS) 60 9.8. AVALIAÇÃO DA HEMATOENCEFÁLICA PERMEABILIDADE DA BARREIRA 61 9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA 62 10. RESULTADOS 64 10.1. PARASITEMIA 64 10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS 68 10.3. DOSAGENS PULMONARES 70 10.3.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ 70 10.3.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 74 10.3.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 78 10.3.4. Estudo de Correlação para Amostras Pulmonares 82 10.3.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) versus Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) 82 7 10.3.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 83 10.3.4.3. Substâncias Parasitemia e 84 10.3.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e Parasitemia 85 10.3.4.5. Capacidade Parasitemia 86 Reativas ao Antioxidante Ácido Tiobarbitúrico Equivalente ao Trolox (TBARS) (TEAC) e 10.4. DOSAGEM ENCEFÁLICAS 87 10.4.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ 87 10.4.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 92 10.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 95 10.4.4. Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas 99 10.4.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) versus Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) 99 10.4.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 100 10.4.4.3. Substâncias Parasitemia e 101 10.4.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e Parasitemia 102 10.4.4.5. Capacidade Parasitemia 103 Reativas ao Antioxidante Ácido Tiobarbitúrico Equivalente ao Trolox (TBARS) (TEAC) e 10.4.5. Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica 104 11. DISCUSSÃO 106 11.1. ACHADOS PULMONARES 107 11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS 109 12. CONSIDERAÇÕES FINAIS 114 13. CONCLUSÕES 115 14. REFERÊNCIAS 116 8 15. ANEXO 130 16. APÊNDICES 131 APÊNDICE 1- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 1 dia de infecção 131 APÊNDICE 2- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 1 dia de infecção 132 APÊNDICE 3- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 1 dia de infecção 133 APÊNDICE 4- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 1 dia de infecção 134 APÊNDICE 5- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 5 dia de infecção. 135 APÊNDICE 6- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 5 dia de infecção. 136 APÊNDICE 7- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 5 dia de infecção. 137 APÊNDICE 8- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 5 dia de infecção. 138 APÊNDICE 9- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 10 dia de infecção. 139 APÊNDICE 10- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 10 dia de infecção. 140 APÊNDICE 11- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 10 dia de infecção. 141 APÊNDICE 12- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 10 dia de infecção. 142 APÊNDICE 13- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 15 dia de infecção. 143 APÊNDICE 14- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 15 dia de infecção. 144 APÊNDICE 15- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 15 dia de infecção. 145 APÊNDICE 16- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 15 dia de infecção. 146 9 APÊNDICE 17- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 20 dia de infecção. 147 APÊNDICE 17- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 20 dia de infecção. 148 APÊNDICE 19- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 20 dia de infecção. 149 APÊNDICE 20- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 20 dia de infecção. 150 APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos dias de análise. 151 APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos dias de análise. 152 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro. 23 Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária. 24 Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados no 25 Brasil em 2010. Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem e no mosquito 27 Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal 35 e no patológico. Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre 44 organelas. Figura 7- Regulação redox do NF-kB. 47 Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE). 50 Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao 58 Trolox através da redução do radical ABTS+ Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 60 através da redução do DPPH. Figura 11- Curva padrão de Malondialdeido (MDA). 61 Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%. 62 Figura 13- Progressão temporal da parasitemia dos camundongos 64 infectados com o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A (vermelho), e dos tratados com o CAPE, grupo B (roxo). Figura 14- Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. 68 A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 15- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos 70 pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos 74 pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). 11 Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 78 (TBARS) nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido 82 Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 19- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido 83 Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 20- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido 84 Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da 85 Redução do Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao 86 Trolox (TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em 87 encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em 91 encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium 12 berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 25- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 95 (TBARS) nos encéfalos dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido 99 Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 27- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido 100 Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Figura 28- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido 101 Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da 102 Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao 103 Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da 105 solução azul de evans 2% nos dias de eutanásia. 13 LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma 55 estimativa inicial da parasitemia. Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC 57 Quadro 3-Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH 59 Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias 61 Tabela 1- Valores de parasitemia dos camundongos infectados em 65 função do tempo de infecção Tabela 2- Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos 66 de camundongos para cada grupo isoladamente Tabela 3- Valores de p referentes às correlações entre as parasitemias dos grupos de camundongos A e B 67 Tabela 4- Percentual de sobrevida de todos os grupos de 69 camundongos de experimentação do presente trabalho Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 71 nos pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção Tabela 6- Valores de p das correlações das capacidade antioxidante 72 equivalente ao trolox através da redução do radical ABTS+ nos pulmões entre os subgrupos de camundongos pertencentes aos grupos A, B, C e D. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Tabela 7- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões entre os grupos de camundongos 73 Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do 75 DPPH nos pulmões de cada grupo de camundongos Tabela 9- Valores de p das comparações para a capacidade 76 antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões, entre os subgrupos de camundongos Tabela 10- Valores de p das comparações para a capacidade 77 antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões entre os grupos de camundongos Tabela 11- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido 79 Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos em função do 14 tempo de infecção Tabela 12- Valores de p referente à correlação das Substâncias 80 Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os subgrupos de camundongos pertencentes aos grupos A, B, C e D. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis). Tabela 13- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas 81 ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os grupos de camundongos Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 88 nos encéfalos de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção Tabela 15- Valores de p das comparações para a capacidade 89 antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos Tabela 16- Valores de p das comparações para a capacidade 90 antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de camundongos Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do 92 DPPH nos encéfalos de cada grupo de camundongos Tabela 18- Valores de p das comparações para a capacidade 93 antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos Tabela 19- Valores de p das comparações para a capacidade 94 antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os grupos de camundongos Tabela 20- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido 96 Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção Tabela 21- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas 97 ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos Tabela 22- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os grupos de camundongos 98 15 ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ABTS ATP BAFFR BCR BHE BKL BTK CAPE CAT CDC cNOS COX DATASUS DNA DPPH ELISA ERK ERON ERN ERO Fe FT G-CSF GM-CSF GSH GSH-Px GSH-Rd H2O2 HI HIV HO-2 ICAM-1 IEC IKB IKK IFN IL iNOS K2S2O4 KH2PO4 MC MCF-7 MDA MEKK MP MS NAC 2,2 AZINO BIS (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico sal ácido diamônio) Adenosina trifosfato Fator de ativação de células B Receptor de células B Barreira Hematoencefálica Quinase linfóide B Tirosina quinase de Bruton Ácido caféico éster fenetil Catalase Center for Disease Control Óxido nítrico sintase constitutiva Ciclooxigenase Sistema de dados do Sistema Único de Saúde Ácido desoxiribonucleico 2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil Ensaio imunoenzimático Quinase regulatória extracelular Espécies Reativas do Oxigênio e do Nitrogênio Espécies Reativas do Nitrogênio Espécies Reativas do Oxigênio Ferro Fator de transcrição Fator de crescimento celular de granulócitos Fator de crescimento celular de granulócitos e macrófagos Glutationa reduzida Glutationa peroxidase Glutationa redutase Peróxido de hidrogênio Hemácias infectadas Vírus da imunodeficiência humana Hidroperoxila Moléculas de adesão intracelular 1 Instituto Evandro Chagas Inibidor kappa B IKB Kinase Interferon Interleucina Óxido nítrico sintase induzível Persulfato de potássio fosfato monobásico de potássio Malária cerebral Células tumorais de glândulas mamárias de humanos Malondialdeido MEK quinase Malaria pulmonar Ministério da Saúde N-acetil cisteína 16 NADPH NEMO NF-kB NIK NO NOS O2 O2OH. OMS ONOOP90RSK PGE2 PKB PKC PKR PMA Q1 Q3 RE RHD RI RL RNA SARA SIRT-1 SOD SYK TCR TEAC TLR TNF TNFR TPL2 TRAF Trolox UFPA UV WHO Fosfato de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo reduzida Modulador essencial NF-kB Fator Nuclear-Kappa B Iindutor de quinase NF-kB Óxido Nítrico Óxido nítrico sintase Oxigênio Molecular Radical Superóxido Radical Hidroxil Organização Mundial de Saúde Peróxinitrito Proteína 90 ribossomal S6 quinase Protaglandina E2 Preoteína quinase B Proteína quinase C Preoteína quinase R Forbol miristrato-13 acetato Primeiro quartil Terceiro quartil Retículo endoplasmático Domínio homólogo Rel Radiação ionizante Radicais livres Ácido riboxinucléico Síndrome da Angústia Respiratória Aguda Sirtuína 1 Superóxido dismutase Tirosina quinase do baço Receptor de células T Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox Receptor Toll-like Fator de Necrose Tumoral Receptor para TNF Progressão do tumor lócus 2 quinase Fatores associados ao TNFR Ácido 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico Universidade Federal do Pará Ultra violeta World Health Organization 17 RESUMO O estresse oxidativo é um desequilíbrio redox que já foi identificado com importante papel na patogenia da malária, com destaque nas formas graves da doença como no acometimento cerebral e no pulmonar. Em meio a doença e o estresse oxidativo uma partícula envolvida em vários processos fisiopatológicos é o fator de transcrição NF-kB, responsável pela transcrição de uma série de partículas que podem estar envolvidas no agravamento da doença. Utilizando modelo experimental murino infectado pelo Plasmodium berghei, realizou-se a avaliação da capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica e permeabilidade da barreira hematocerebral. Ao promover a inibição do NF-kB constatou-se a diminuição da parasitemia dos camundongos no 15º e 20º dias após a infecção sem promover alteração na sobrevida. No tecido pulmonar poucas substâncias foram reativas ao ácido tiobarbitúrico no primeiro dia de análise e ocorreu o aumento da capacidade antioxidante a curto e longo prazo. No tecido encefálico o aumento da peroxidação lipídica ocorreu a longo prazo e a capacidade antioxidante aumentou de forma semelhante ao ocorrido no pulmão, além do prolongamento da manutenção da barreira hematoencefáfica com o uso do inibibor do NF-kB. Dessa forma concluímos que este fator de transcrição assim como o estresse oxidativo podem contribuir com o agravamento da malária. Palavras-chave: malária, NF-kB, CAPE, estresse oxidativo, antioxidantes 18 ABSTRACT The oxidative stress is a redox imbalance that has been identified in some research with an important role in malaria pathogenesis, especially in the severe form of the disease, as in brain and lung malaria. In the middle of the disease and oxidative stress a particle involved in several pathophysiological processes is the transcription factor NF-kB, responsible for the transcription of a number of particles that may be involved in the aggravation of the disease. Using an experimental mice model infected with Plasmodium berghei, evaluation of total antioxidant capacity, lipid peroxidation and disruption of blood-brain barrier was carried out. The promotion of of NF-kB inhibition was found to decrease in parasitemia of mice at 15th and 20th days post infection without changes in the survival rate. In lung tissue just a slight increase in thiobarbituric acid thiobarbituric reactive substances was found on the first day of analysis and there was both short and long term increase of antioxidant defenses. In brain tissue a long term lipid peroxidation increase was found and antioxidant activity increased similarly to what happened in the lung, in addition to prolonging the maintenance of the blood-brain barrier with the use of NFkB inhibitor. Thus we conclude that NF-kB, as well as oxidative stress, may contribute to the worsening of malaria. Keywords: malaria, NFkB, CAPE, oxidative stress, antioxidants 19 1. INTRODUÇÃO A malária é uma doença endêmica, febril, transmitida pelo mosquito do gênero Anopheles, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero Plasmodium, que atinge mais de 100 países, 3,4 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco (CDC, 2010b). É classificada como a quinta causa de morte por doença infecciosa no mundo, na África é a segunda maior causa de morte, depois do HIV (vírus da imunodeficiência humana), sendo que a maioria dessas ocorre em crianças de até cinco anos de idade (Saraiva et al., 2009; WHO, 2009a). Em 2008 foram registrado 243 milhões de casos de malária em todo o mundo (WHO, 2009a). Nas Américas ocorreram 572.000 registros, sendo o Plamodium vivax responsável pela maioria, 77% (WHO, 2009b). No Brasil, durante o período de 2009, foram notificados 306.908 casos, com predominância nas seguintes regiões: Pará, Amazonas, Rondônia, Roraima, Amapá, Acre e Tocantins (DATASUS, 2008; MS, 2009). Medidas de controle implantadas no ano de 2006 resultaram na redução de 43% de sua ocorrência até 2008. A doença ocorre em regiões que favoreçam o desenvolvimento do mosquito e do parasito, áreas rurais e nas periferias urbanas, associando-se à deficiência na atenção básica à saúde em locais endêmicos (Ferreira, 2008; MS, 2009; WHO, 2009b). Apesar da diminuição do número de notificação da malária nos últimos anos, a doença ainda apresenta elevado risco de incidência e transmissão. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Brasil, Colômbia, Costa Rica e Peru, são regiões que apresentaram flutuações nos registros da doença durante o período de 2000 a 2008 (WHO, 2009a). Para controle da malária são utilizadas as seguintes intervenções: gestão dos pacientes (diagnóstico e tratamento); prevenção da infecção através do controle do vetor (uso de mosquiteiro e inseticidas) e da doença (administração de antimaláricos). As últimas representam os alicerces para o controle e diminuição dos gastos em saúde pública, pois são meios de prevenir casos graves e conseqüente óbito, bem como eliminar as fontes de infecção para os mosquitos, contribuindo assim, para a redução da transmissão (WHO, 2009a). Mesmo diante de todo esse mecanismo de controle, o combate eficaz da doença pode ser prejudicado, como se pode observar através do aparecimento de cepas resistente a alguns antimaláricos em pacientes tratados com quinina, 20 cloroquina e artemisina (Walker et al., 2000; Baird, 2004). Estudos realizados por Muñoz et al. (2006) sugerem resistência também à primaquina. A ausência de conhecimento sobre o mecanismo completo de ação do parasita no organismo humano dificulta a ação efetiva de antimaláricos, assim como o controle dos sinais e sintomas característicos da malária, ressaltando as suas formas severas, pulmonar e cerebral, que podem levar a morte de pacientes acometidos pela doença causada pelo Plasmodium falciparum (Charoenpan et al., 1990; Newton et al., 1997; Coban et al., 2006). Recentemente, diversos pesquisadores vêm estudando o envolvimento de agentes oxidantes alterando o equilíbrio redox em processos fisiopatológicos, como já foi descrito em pacientes asmáticos, em portadores de ateroscleróticas, hipoxia ou câncer (Gutierrez et al., 2010). Nesse sentido, muitos discutem o envolvimento dos radicais livres, através do estresse oxidativo, na patogenia da malária (Pablón et al., 2002; Huber et al., 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al., 2004; Wilmanski et al., 2005; Kumar et al., 2005; Jaramillo et al., 2005; Sohail et al., 2007). Sabe-se que o processo infeccioso desta doença promove alterações na produção de interleucina (IL)-12, IL-6, fator de necrose tumoral α (TNF- α) e IL-10, e que de acordo com Wilmanski et al. (2005) as citocinas apresentam papel importante no estímulo redox celular. Outro achado envolvendo ação oxidativa é a peroxidação lipídica ocorrida em eritrócitos infectados e não infectados (OmodeoSalé et al., 2003). Fator importante no que diz respeito ao balanço redox no organismo humano é a relação parasita-hospedeiro, onde a intensidade da patogenicidade, caso haja desequilíbrio deste balanço, vai depender das concentrações locais das espécies pró e antioxidantes, culminando com a produção de radicais lives e, consequentemente levando ao estresse oxidativo, quando a ação antioxidante é deficiente, através da inibição de sua atividade, ou por meio da produção de radicais em quantidade superior a capacidade antioxidante com o intuito de debelar a infecção (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007). Os radicais, como espécies reativas do oxigênio (ERO), do nitrogênio (ERN), entre outras, podem ser produzida tanto pelo parasito como pelo hospedeiro humano (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007). Além do uso de 21 antimaláricos, como a primaquina, os quais parecem atuar através de mecanismo oxidativo (Vale et al., 2009). O organismo humano possui diversas fontes de espécies reativas, tais como as mitocôndrias, peroxissomas, citoplasma e membrana de células, retículo endoplasmático, fagócito, lisossoma e através da catálise por metais de transição, como o ferro e cobre (Ferreira & Matsubara, 1997). As ERO, radicais superóxido (O2-) e hidroperoxila (HO-2) são produzidas a partir do metabolismo do oxigênio molecular (O2). Segundo pesquisadores, tal produção é catalisada na presença de metais, como o ferro (Fe), através das reações de Fenton e de Haber-Weiss. Na malária o referido metal se torna disponível durante o estágio eritrocítico do plasmódio, no qual o parasita realiza a proteólise da hemoglobina obtendo nutrientes necessários para o seu metabolismo, ocasionando a liberação de grande quantidade de grupos heme e moléculas de Fe (Ferreira & Matsubara, 1997; Kumar et al., 2005; Lyaweh & Onigbinde, 2009; Circu & Aw, 2010) Outro radical livre que parece estar envolvido na doença é o óxido nítrico, NO (Pablón et al., 2002; Huber et al. 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al. 2004, Pino et al., 2005). Este gás é produzido com a finalidade de ação citotóxica e citostática contra microoganismos, parasitas e células tumorais, que geralmente vem acompanhada de grande produção de ERO. Citocinas e/ou endotoxinas estimulam a enzima NO sintase induzível (i-NOS), que sintetiza NO a partir da oxidação da L-arginina (Pfeilschifter et al., 2003; Shirley, 2005). Na malária, entretanto seu papel ainda é controverso, alguns pesquisadores afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma conseqüência da produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas (Favre et al., 1997), enquanto outros defendem que a malária cerebral decorra de uma baixa biodisponibilidade deste gás (Gramaglia et al., 2006). Este gás em associação ao O2 ou O2-, origina poderosos oxidantes, N2O3 e peróxinitrito (ONOO-), este último, na presença de íon hidrogênio origina o radical hidroxila (OH.; Pfeilschifter et al., 2003; Shirley, 2005). Outro componente que pode está envolvido na sinalização e expressão de genes sensíveis a regulação redox da doença é o fator nuclear de transcrição kappa B (NF-kB), o qual de acordo com Kriete & Mayo (2009) atua diante de 22 agentes infecciosos, ambientais, ativando genes pertencentes ao processo inflamatórios e está envolvido no estresse, porém este mecanismo ainda não foi ainda esclarecido. O NF-kB encontra-se no citoplasma associado ao inibidor IKB, que diante de sinalizações, como através de citocinas (IL-1 e TNF- α), grupo heme livre, espécies reativas de oxigênio, NOS e moléculas de adesão, sofre fosforilação por ação da IKB kinase (IKK) e proteólise, liberando, portanto o NF-kB, que migra para o núcleo e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de genes que podem estar relacionado a defesa ou agravamento da doença (Arruda et al., 2004; Salminen et al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Miller et al., 2010). Considerando-se a elevada incidência de malária na região amazônica, a produção de agentes oxidantes tanto pelo hospedeiro humano quanto pelo parasito, e a ausência de conhecimento com relação aos mecanismos precisos da regulação redox da transcrição gênica, se faz necessários estudos quantitativos e qualitativos dos agentes oxidantes, capacidade antioxidante e o papel do fator transcriptacional NF-kB na malária. 23 2. MALÁRIA 2.1. EPIDEMIOLOGIA É uma doença endêmica, característica das áreas tropicais e subtropicais do mundo, que apresenta como fatores determinantes para ocorrência a presença do parasita, do mosquito (vetor) e do homem. Soma-se a estas as condições climáticas regionais, principalmente as chuvas, que formam criadouros para o inseto transmissor e a temperatura, cujos valores entre 20-30ºC, favorecem o seu crescimento e o desenvolvimento do parasita no mosquito, exercendo assim, importantes influências na distribuição geográfica da doença (Andrade, 2005; Neves et al., 2007). Em 2009 foram identificados 306.908 casos, com predominância na região Norte, na qual os estados mais atingidos foram os seguintes: Amazonas, Amapá, Rondônia, Acre e Pará, porém este demonstrou aumento (Figura 1) de aproximadamente 44% com relação a 2008 (MS, 2009). Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro. Fonte: MS, 2009. 24 Em 2010 foram registrados casos de malária em 106 países do mundo (Figura 2), a maioria destes no Continente Africano, em seguida no Sudeste Asiático, região oriental do Mediterrâneo e Continente Americano (WHO, 2011a). Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária. Fonte: Adaptado de WHO, 2011a. Nesse período no Brasil foram registrados 334.681 pacientes com malária, destes 84,75% foram acometidos pelo P. vivax e 15,25% pelo P. falciparum (Figura 3), com 5451 casos de internação e 75 mortes causadas pela presença da doença (WHO, 2011a). No Brasil a distribuição da doença está associada à atividade exercida pela população exposta, sendo frequente nos garimpeiros e trabalhadores envolvidos nos projetos agropecuários e de colonização. Nas periferias das grandes cidades como Belém e Manaus as más condições de habitação propiciam a ocorrência dos focos epidêmicos (DATASUS, 2008). 25 Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados no Brasil em 2010. Fonte: WHO, 2011a. De acordo com dados do World Malaria Report 2011, no período de 2000 a 2010 houve uma redução significativa de casos de malária na maioria dos países do continente americano. No entanto, alguns desses como o Haiti apresentaram aumento, acreditando-se que este resultado seja devido a não implementação de métodos de controle da doença, prevenção e tratamentos, adequados (WHO, 2011b). Em 2011 foram notificados no Brasil 267.045 casos da doença (WHO, 2013). Mas recentemente, em 2012, foi estimado a ocorrência de 207 milhões de casos da malária distribuidas no mundo com em torno de 627 mil mortes. Nesse ano a estimativa no continente americano foi de 800,000 casos, sendo 0,1% ocasionando como consequência o óbito do paciente infectado, principalmente crianças abaixo de 5 anos de idade (WHO, 2013). 2.2. BIOLOGIA DO PARASITA A doença é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium, um organismo unicelular que apresenta como hospedeiro intermediário o homem e definitivo o mosquito, pertencente à ordem dos dípteros, família Culicidae, gênero Anopheles, sendo a espécie Anopheles darlingi, a que se destaca na transmissão (Vale et al., 2005; MS, 2005). 26 Há quatro espécies de plasmódios de maior prevalência que podem infectar o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale e o Plasmodium malarie. O primeiro é responsável pela febre terçã maligna, o segundo e o terceiro pela terçã benigna e o ultimo pela quartã cosmopolita (CDC, 2010a). Destas, somente P. vivax e P. ovale são capazes de causar múltiplas recaídas da malária após semanas ou meses da primeira infecção, característica que se associa a presença da forma latente do protozoário no fígado (Deen et al., 2008). O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos letais. Seu crescimento é favorecido em temperatura de 25°C, pois provocam o encurtamento do ciclo, com esquizogonia em até 10 dias, aumentando assim a possibilidade de transmissão. O período de incubação desta espécie varia de 9 a 14 dias, entretanto, climas temperados e subtropicais provocam o prolongamento deste período em algumas cepas (Andrade, 2005; CDC, 2010a). O ciclo assexuado ocorre no homem (Figura 4), e se inicia durante o repasto sanguíneo, quando o mosquito infectado inocula os esporozoitos no organismo humano, os quais migram para o fígado onde realizam o ciclo exo-eritrocítico. Nas células hepáticas, os protozoários sofrem diferenciação e passam para a forma arredondada de criptozoítos, em seguida se multiplicam e se diferenciam em cerca de 40.000 merozoítos (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; CDC, 2010c). Com a ruptura dos esquizontes hepáticos, os merozoitos migram para a corrente sanguínea, onde iniciam o ciclo eritrocitário, degradam a hemoglobina para a obtenção de aminoácido e síntese proteíca, através das enzimas produzidas no vacúolo digestivo. A seguir, passam à forma amebóide intracelular de trofozoítos, os quais evoluem até merozoítos, que irão infectar novos eritrócitos. Neste momento, ocorre a diferenciação dos gametócitos que migram para a periferia do organismo humano (Vale et al., 2005; CDC, 2010c). Ao realizar a picada, o mosquito fêmea ingere os gametócitos juntamente com o sangue humano, que ao alcançarem o estômago, realizam o ciclo sexuado (esporogônia), no qual o microgameta se une ao macrogameta formando o zigoto, que se torna móvel e alongado (oocineto) e invade o epitélio gástrico, originando o oocisto, que sofre ruptura e libera numerosos esporozoítos, os quais migram para as glândulas salivares do inseto, que durante o repasto serão inoculados no ser 27 humano, dando início a um novo ciclo do plasmódio (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; CDC, 2010c). Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem no mosquito. Fonte: Adaptado do CDC, 2010c. 2.3. PATOGENIA A malária pode ocorrer de forma assintomática ou com sinais e sintomas clássicos, como febre, sudorese, cefaléia e dores musculares. A gravidade depende da espécie de plasmódio presente e do estado imunológico do hospedeiro. Outros sinais e sintomas podem ocorrer, tais como mal estar geral, fadiga, mialgia, artralgia, dor abdominal, náuseas, vômito e diarréia. Também podem ocorrer hepatoesplenomegalia, hipoglicemia e anemia (Bernan, 2004; MS, 2008; CDC, 2010c). 28 A fisiopatologia está relacionada ao ciclo do parasito no organismo, mais precisamente à ruptura dos eritrócitos ao final da esquizogonia, quando ocorre a liberação na corrente sanguínea de parasitas e pirógenos, resultando na patologia e alterações orgânicas características da malária (Barsoum, 2000; Andrade, 2005; CDC, 2010c). Nesse processo, acredita-se que os fatores determinantes são: -A destruição dos eritrócitos (Barsoum, 2000); -Toxicidade resultante da liberação de citocinas (Urquhart, 1994); -Sequestro de eritrócitos parasitados na rede capilar (Barsoum, 2000); -Lesão capilar por deposição de imunocomplexos (Mibei et al., 2005). Um fator interessante acerca da destruição de eritrócitos é que a mesma não está relacionada à presença do parasita no interior do eritrócito, pois foi identificado que mesmo células que não contenham plasmódios também são alteradas no indivíduo com a doença (Omodeo-Salé et al., 2003). Quanto ao segundo fator citado, tem se observado que na doença aguda ocorre o estímulo de células imunocompetentes com consequente liberação de citocinas, estas que são moléculas protéicas essenciais para a comunicação intercelular. Como já foi constatado, o pigmento malárico hemozoína estimulando macrófagos e a interleucina 1 (IL-1), esta é capaz de alterar o equilíbrio do hipotálamo, provocando elevação da temperatura, a qual possui duração característica de acordo com cada espécie (Urquhart, 1994; Barsoum, 2000; Olivier et al., 2014). No P. falciparum os acessos febris são repetidos em intervalos de 36 ou 48 horas, tal fato pode ocorrer devido sua ação em eritrócitos de qualquer idade; o P. vivax e o P. ovale com intervalos de 48 h e invadem células jovens, enquanto que o P. malariae em intervalos de 72 h, atuando em eritrócitos velhos (Barsoum, 2000; Malagón, 2005). Além da produção do pigmento, ocorre a indução da liberação de fator de necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6 e IL-8 em fagócitos e provavelmente em células endoteliais. Outras citocinas parecem está envolvidas na inibição da gliconeogênese, com efeitos principalmente sobre a placenta, conferindo assim a gravidade da doença durante a gestação. Essas moléculas proteicas também já 29 foram identificadas provocando o aumento na produção de óxido nítrico pelos leucócitos, músculo liso, microglia e endotélio vascular, radical livre que parece está envolvido na complicação da malária grave e o coma (Clarck et al., 2004). Com relação ao sequestro de eritrócitos tem se observado que este efeito ocorre devido às alterações provocadas na superfície das células vermelhas infectadas, ocasionando o fenômeno de citoaderência mediado por proteínas expressas na superfície das células, formando protuberâncias ou knobs. Esse fenômeno e formação de rosetas ocorrem principalmente em vênulas de órgão vitais como cérebro, fígado e rins, trazendo consequências graves como a obstrução da microcirculação, redução do fluxo de oxigênio e acidose láctica, resultando assim nas seguintes complicações: malária cerebral, insuficiência renal e hepatite (Clarck et al., 2004; Rug et al., 2006). Outra alteração observada é a presença de imunocomplexos na patogenicidade da doença, como se observou em pesquisa realizada em crianças infectadas pelo P. falciparum e se identificou a presença desses complexos na malária grave associada a anemia ou a complicação cerebral (Mibei et al., 2005). A inibição de certos neurônios do hipotálamo anterior tem sido descrita, com consequente vasoconstrição periférica, originando a sensação de frio (Andrade, 2005; CDC, 2010c). 2.4. MALÁRIA GRAVE A malária grave ou complicada ocorre quando há o agravamento da doença causada por falha em algum órgão ou anormalidade sanguínea ou metabólica, como na malária cerebral, na pulmonar (MP), na hemólise severa, hemglobinúria, coagulação anormal, baixa pressão arterial, hipoglicemia, hiperparasitemia e insuficiência renal aguda (CDC, 2010d). Essa forma da doença é ocasionada pelo P. falciparum, porém tem crescido o número de casos da forma grave da doença provocada pelo P. vivax, além do P. Knowlesi (Cox-Singh et al., 2008; WHO, 2012a). Geralmente a complicação ocorre após 3-7 dias iniciado a febre, mesmo diante de tratamento e eliminação total do parasita (Trampuz et al., 2003; WHO, 2012a). 30 O diagnóstico é realizado pela identificação das formas assexuadas do parasita no esfregaço sanguíneo e a presença das seguintes características clínicas e laboratoriais, que podem ocorrer de forma isolada ou em combinação com outros sinais e sintomas assinalados na doença (WHO, 2012a; WHO, 2012b): Características Clínicas: -Alterações na consciência ou coma irreversível (escala de coma Glasgow >11 para adultos e aplica-se para crianças escala de coma Blantyre >3). Além dessas alterações o paciente em coma pode apresentar hemorragia em sua retina; -Abatimento físico, psíquico e fraqueza generalizada; -Mais de 2 convulsões em 24h; -Dificuldade respiratória; -Colapso respiratório, pressão sistólica baixa (<70mmHg em adultos e <50mmHg em crianças); -Icterícia; -Hemorragia; -Edema pulmonar. Características Laboratoriais: -Hipoglicemia (<40mg/dL); -Acidose metabólica (bicarbonato plasmático<15mmol/dL); -Hemoglobinúria; -Hiperparasitemia (>20%); -Hiperlactatemia (<5mmol/L); -Lesão renal aguda (creatinina<264µmol/L); -Anemia normocítica severa (hemoglobina>5g/dL e hematócrito < 15% em adultos e <20% em crianças). 31 Crianças, gestantes no segundo ou terceiro mês de gestação, pessoas de área não endêmica, submetidas à esplenectomia ou imunodeprimidas possuem grande risco de desenvolver a forma grave da doença quando o parasita se instala no organismo das mesmas (WHO, 2012b). Os antimaláricos de escolha no combate aos parasitas na malária complicada são: artemeter, artesunado ou quinina. Medicamentos que devem ser administrados de forma isolada imediatamente por via parenteral após cálculo da dose de acordo com o peso (WHO, 2012b). Com relação a malária cerebral (MC), ela pode atingir cerca de 0,01 a 16% dos pacientes com P. falciparum e promover de 10 a 50% de letalidade dos mesmos (Braga et al., 2004; Alves et al., 2007). Crianças com essa forma da doença possuem dificuldade de se alimentar, apresentam febre que variam de 37,5ºC a 41ºC, vômito e tosse são comuns, ocasionalmente podem desenvolver diarréia. Esses são sinais geralmente gerados anteriores ao coma, o qual persiste por mais de 30 min após a convulsão. Esta antes ou depois do coma está assosiado à morbidade e sequelas da doença (WHO, 2012b). Essa faixa etária quando em coma profundo apresenta reflexos e movimentos anormais dos olhos. Além dessas caracteristicas clínicas também se observa uma respiração profunda, mãos e pés frios ou pulso fraco. Cinco a 30% das crianças que sobrevivem a MC têm alguma sequela neurológica (WHO, 2012b). Em adultos com essa forma grave da doença comumente são observados convulsões, alterações na retina, fechamento fixo da mandíbula, bruxismo e hepatomegalia. Porém pode ocorrer também disfunção motora com a presença de membros superiores e inferiores esticados, rigidez leve da nuca, formação de becinho que pode ser evidenciado com o toque nos lábios, raramente o edema de papila é identificado (WHO, 2012b). Em qualquer faixa etária devem ser excluídas outras causas de alterações neurológicas que acontecem na malária, como hipoglicemia e acidentes vasculares, ou por outras doenças como meningite bacteriana e encefalite viral (WHO, 2012b; Rodrigues et al., 2013). 32 O mecanismo de ação patogênica na MC ainda não foi totalmente elucidado, acredita-se em duas teorias. A primeira baseia-se no fenômeno de citoaderência de eritrócitos infectados e não-infectados na microvalulatura cerebral impedindo o fluxo sanguíneo e consequente impedindo a condução de nutrientes e oxigênio para as células cerebrais (Berendt et al., 1994). A segunda é fundamentada na resposta exceciva do sistema imunológico através da liberação de citocinas pelas células Th1 (Clark & Rockett, 1994). Ambas as teorias têm sido demonstradas de grande importância, chegandose assim a uma terceira hipótese da ação comcomitante das duas na gênese da doença (Van de Heyde et al., 2006). Já a malária pulmonar possui uma incidência de 3 a 10% dos casos de complicações da doença e letalidade em torno de 70% (Boulos et al., 1993). Essa complicação da doença apresenta como caracteristica clínica em crianças o desconforto respiratório caracterizado pela respiração profunda com retração da parede torácica inferior, sintoma que quando ausente deve-se suspeitar de acidose metabólica (WHO, 2012b). Outra alteração observada ao nível dos pulmões é o edema pulmonar devido ao aumento na permeabilidade capilar pulmonar que geralmente ocorre depois de dias de tratamento em pacientes com melhora do quadro da doença e sem parasitas na periferia do organismo, é caracterizado pelo aumento da frequência respiratória e diminuição da pressão parcial de O2. Essa complicação da doença pode evoluir para a síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) devido ao sequestro de eritrócitos parasitados no pulmão e liberação de citocinas, que pode levar o indivíduo acometido pela doença a morte (WHO, 2012a; WHO, 2012b). Acredita-se que a patogênese da malária pulmonar seja predominantemente devido à resposta inflamatória após o tratamento, já que o aparecimento desta forma grave da doença ocorre após cerca de 5 dias iniciado a adiministração de medicamentos e ausência de parasitas periféricos no paciente (WHO, 2000). Porém, Maguire et al. (2005) acreditam que a lesão pulmonar ocorra devido a uma ação contínua sobre o pulmão progredindo de uma fase subclínica da doença com obstrução de vasos sanguíneos pulmonares devido ao fenômeno de 33 citoaderêcia que persiste, promovendo alteração e disfunção da membrana alvéolo-pulmonar, modificações que permanecem mesmo com depuração parasitária devido ao tratamento, e assim promove o agravamento na malária pulmonar com o desenvolvimento da SARA. 2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL Roedores como CBA/CAJ, C57BL/6, Swiss e DBA-2 têm sido utilizados como modelo experimental da malária grave humana ocasionada pelo P. falciparum, quando os camundongos são infectados pelo Plamodium berghei ANKA, sendo os três primeiros como modelo da MC e os dois últimos em modelos de desordem pulmonar na malária experimental (Epiphanio et al., 2010; Oakley et al., 2011; Nacer et. al., 2012). Em pesquisa realizada por Nacer et al. (2012) observou-se que os camundongos Swiss e CBA/CAJ fêmeas com 3 semanas de idade (jovens) infectados com 106 hemácias parasitadas por P. berghei ANKA desenvolveram os sinais neurológicos da doença e 50% de parasitemia em torno do 5º ou 6º dia após infecção, chegando ao óbito com valor maior que 60% da mesma. Nos exames histopatológicos desses camundongos foram identificadas as clássicas marcações da malária cerebral, petéquias, hemorragia e poucos leucócitos. Além da presença de células sanguíneas infectadas impedindo o fluxo sanguíneo normal na microvasculatura cerebral, levando a alteração do endotélio e quebra da barreira hematoencefálica, essas são modificações semelhantes às observadas em humanos. Camundongos Swiss fêmea com 6-18 semanas de idade infectados com 105 -106 hemácias parasitadas pelo P. berghei via i.p. utilizados por Franke-Fayard et al. (2005) apresentaram os sinais da MC entre o 5º e 10º dia após infecção e identificaram o CD36 como um importante provável mediador associado ao seqüestro de esquizontes no pulmão desses roedores. Epiphanio et al. (2010) demonstraram que os camundongos DBA-2 são excelentes modelos experimentais da desordem respiratória humana ocasionada na malária grave, pois ao serem infectado pela P. berghei ANKA observaram que após 6 dias de infecção via i.p. (106-107 hemácia parasitas) que esse tipo de 34 camundongo desenvolveu dispnéia, obstrução das vias aéreas, hipoxemia, hemorragia pulmonar e edema. Características não observadas nos experimentos realizados no C57BL/6, o qual é muito utilizado como modelo de MC. Estudos recentes demonstraram o efeito da suplementação com antioxidantes sobre ambas as formas grave da doença em camundongos Swiss machos infectados P. berghei ANKA via i.p., 107 hemácia parasitas (Warwick et al., 2013). Assim como esses pesquisadores, Desowitz & Barnwell (1980) utilizaram esses tipos de roedores (fêmeas) em seus experimentos para testar a ação do efeito de vacina indutora da imunidade contra a malária. Através desses dados de modelos experimentais observou-se que os mesmos são amplamente utilizados como uma ferramenta para desvendar o mecanismo de ação do parasita e assim desenvolver drogas ou vacinas para o combate eficaz contra a malária. 3. ESTRESSE OXIDATIVO 3.1. ESTRESSE OXIDATIVO E OS ANTIOXIDANTE NO ORGANISMO MECANISMOS DE DEFESA Os radicais livres são átomos ou moléculas que apresentam número ímpar de elétrons na última camada eletrônica, devido a um processo de oxirredução, logo, apresentam-se instáveis e altamente reativos, com a capacidade de captar um elétron para obter estabilidade. Como exemplo desses há o radical O2- e o NO, assim como radical hidroxila, hidroperoxila e peroxinitrito. O peróxido de hidrogênio (H2O2) apesar de não possuir elétrons desemparelhados é considerado agente oxidante devido produzir OH● (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007). Tais moléculas instáveis podem ser obtidas durante os processos metabólicos normais, sendo que, o organismo humano apresenta as seguintes fontes endógenas dessas, a membrana celular, através da síntese de prostaglandinas, lipoxigenase e o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADPH); o citoplasma através da xantina oxidase, hemoglobina, riboflavina, catecolaminas, metais de transição (Ferro e Cobre); retículo endoplasmático e lisossomas através do citocromo P450 e enzimas hidrolíticas; mitocôndria no transporte de elétrons da cadeia respiratória e peroxissoma por 35 meio de oxidases e flavoproteínas. Outra fonte de ERO são os fagócitos que atuam como primeiro mecanismo de defesa contra microrganismos, os quais estão envolvidos na resposta não específica e na reação inflamatória. Enquanto que são como fontes exógenas os raios ultravioleta (UV), outras radiações ionizantes, quimioterápicos e xenobióticos, além de outras (Ferreira & Matsubara, 1997; Chaves et al., 2000; Vasconcelos et al., 2007; Wells et al., 2009). As ERO e ERN no organismo estão envolvidas em processo de produção de energia, regulação do crescimento, sinalização intercelular e síntese de diversas substâncias. No entanto, quando a quantidade de radicais excede a capacidade antioxidante do organismo, originam o estado de estresse oxidativo (Figura 5), no qual a agressão celular se torna eminente, esta pode ocorrer através de danos ao ácido nucléico, proteínas, lipídeos e carboidratos. Dessa forma encontra-se relacionada a várias patologias, tais como, câncer, hipóxia, artrite, doenças do coração, choque hemorrágico, patologias semelhantes à doença vascular, inflamatória e desordens neurológicas, assim como no envelhecimento celular, podendo causar o agravamento destas (Ferreira & Matsubara, 1997; Barreiros et al., 2006; Vasconcelos et al., 2007; Gutierrez et al., 2010). Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal e no patológico. Fonte: Adaptado de Ma et al., 2010. 36 Durante a produção normal de oxiradicais o organismo responde através da ação de defesas antioxidantes, as quais podem ser divididas em enzimáticas e não enzimáticas, o primeiro grupo é composto de superóxido-dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-peroxidase (GSH-Px) e glutationa-redutase (GSH-Rd), e no segundo a vitamina A, C e E, bilirrubina, proteínas quelantes como a albumina, ferritina e ceruloplasmina, dentre outros (Aguiar et al., 2006; Vasconcelos et al., 2007; Bartosz, 2009). A SOD é uma enzima que realiza a dismutação do radical superóxido a H2O2 e O2. Existem três tipos desta enzima no organismo humano: SOD-cobre-zinco (SOD-Zi/Cu) no citosol, SOD-manganês (SOD-Mn) na mitocôndria e a SOD extracelular (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009; Ma, 2010). Já a CAT catalisa a redução do peróxido a água e oxigênio, assim como a GSH-Px, a qual requer a presença de glutationa, esta que em seguida se torna oxidada e será reduzida através do NADPH em reação catalisada pela GSH-Rd (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009). A vitamina C encontra-se no organismo na forma de ascorbato e atua na redução de metais como o Fe e Cu. A vitamina E atua doando elétrons a radicais hidroxilas impedindo, portanto, a peroxidação lipídica. No entanto, o -caroteno é o principal carotenoide fonte de vitamina A, que age na redução em baixas concentrações de oxigênio (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009). Com relação à bilirrubina, é um pigmento formado a partir da degradação da hemoglobina em processos oxidativos (Vasconcelos et al., 2007; Aguiar et al., 2006). 4. MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO Diversos pesquisadores vêm observando o envolvimento de alterações redox na malária, através da produção de radicais livres (RL) pelo hospedeiro humano com atividade antiplasmódica, com a finalidade de debelar a doença, assim como a existência de defesas antioxidantes pelo Plasmodiun sp. (Barsoum, 2000; Fritsche et al., 2001; Omodeo-Salé et al., 2003; Jaramilo et al., 2005; Wilmanski et al., 2005, Yeo et al., 2009). Tais espécies reativas também são produzidas por antimaláricos como a primaquina e derivados da artemisina, promovendo a oxidação de células, ação que pode está envolvida na terapêutica 37 do medicamento (Bolchoz et al., 2002; Ittarat, 2003; Vale et al., 2009; Ferreira et al., 2011). De acordo com Fritsche et al. (2001) os radicais livres como o NO, O2. e OONO- são as principais moléculas responsáveis pela ação tóxica de macrófagos estimulados por citocinas contra o parasita. Estudo realizado por Greve et al. (1999) já fornecia dados que sugeriam tal importância dos RL gerados em granulócitos como primeira linha de resposta imunológica e defesa contra P. falciparum. Esta ideia é compartilhada por Boutlis et al. (2003), já que acredita que o aumento desses RL contribui para a tolerância da doença em adultos assintomáticos de áreas endêmicas. Além deste, estudos recentes demonstram o envolvimento do estresse oxidativo na parede do miocárdio assim como no aumento da pressão pulmonar em crianças com malária severa, devido à hemólise intravascular e diminuição na produção de NO com consequente efeito cardiopulmonar (Janka et al., 2010). Tal produção de RL ocorre em grande quantidade durante o ciclo eritrocitário, o qual inicia com a invasão dos merozoítos hepáticos nos eritrócitos, em seguida ocorre formação de esquizontes em forma de roseta e posterior ruptura das hemácias, com a liberação dos merozoítos sanguíneos e toxinas maláricas, as quais induzem a liberação de citocinas que vão atuar em outras células como as endoteliais, além dos antígenos que estimulam o linfócito T, que secretam interfern gama (IFN-γ) e outras citocinas, induzindo a produção destas em outras células, como os monócitos (Miller et al., 1994). Neste ciclo ocorre a degradação da hemoglobina no vacúolo digestivo do parasita para a obtenção de aminoácidos da globina, este evento resulta na produção de metemoglobina, ânions superóxidos e peróxidos, com ação oxidante em lipídios e proteínas. Ambas as reações são catalisadas na presença de um metal de transição, como o ferro do grupo heme (Mashima et al., 2002; Schwarzer et al., 2003) Estudos realizados por Potter et al. (2005) demonstraram a produção de RL pelo parasita, pois utilizou camundongos knockout para o gene da enzima NADPH oxidase, importante para a produção de espécies reativas do oxigênio e do nitrogênio (ERON) em fagócitos, o que impediu a progressão da parasitemia para todas as espécies de Plasmodium testadas (P. yoelii, P. chabaudi K562, P. berguei ANKA, P. berguei K173 e P. Vinckei vinckei) quando comparado com animais 38 normais para a referida enzima. Os autores sugeriram que o aumento dos RLs esteja associado ao parasita e não a explosão respiratória de fagócitos. Das et al. (1990) identificaram tal ação através de estudo em pacientes com malária, nos quais se constatou altos níveis do marcador de peroxidação lipídica, malondialdeído, quando comparados ao controle, sendo que a deficiência de ribovlavina, vitamina importante na conversão GSH-oxidada para a forma reduzida, favorece a hemólise e oxidação de lipídios contribuindo com o aumento do número de parasitas, ocasionando agravamento da doença. Omodeo-Salé et al. (2003) relataram que tal ação oxidante nos lipídeos ocorre nos eritrócitos infectados assim como nos não infectados, acelerando a senescência das células vermelhas. Outro fator importante encontrado com relação à produção de radical livre é a síntese de óxido nítrico. Esta molécula derivada do nitrogênio é sintetizada a partir da ação enzimática da NOS sobre o aminoácido L-arginina, produzindo NO e citrulina. Isoformas desta enzima já foram identificadas e classificadas em duas categorias, a forma constitutiva (cNOS) e a induzível (iNOS), esta é produzida em macrófagos e outras células ativadas por citocinas com função de promover a morte de patógenos (Dusse et al., 2003; Vasconcelos et al., 2007). No entanto, seu papel ainda é controverso, pois alguns pesquisadores afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma consequência da produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas, enquanto outros defendem que a MC decorra de uma baixa biodisponibilidade deste gás (Maneerat et al., 2000; Gramaglia et al., 2006; Cabrales et al., 2011). A síntese dessa molécula também foi identificado em mosquito Anopheles infectado com P. falciparum (Akman-Anderson et al., 2007) Corroborando a primeira hipótese da ação do NO, Cabrales et al. (2011) através de análise microscópica cerebral de camundongos infectados com P. berghei recebendo suplementação de NO, concluíram que esta protege os camundongos contra a MC, melhorando a microcirculação no cérebro e diminui a patologia vascular. Maneerat et al. (2000) em pesquisa realizada com pacientes tailandeses adultos com MC detectou a enzima iNOS através da marcação imonohistoquímica em neurônios, astrócitos, microglias e células endoteliais, sendo que esta foi intensa nos macrófagos próximos aos anéis hemorrágicos. Adicionalmente, apresentou associação positiva entre a expressão de iNOS e alterações 39 histopatológicas, sugerindo que essa enzima possa contribuir para o desenvolvimento da MC, com a evolução do quadro do paciente para coma, convulsões e morte. Divergindo dessa hipótese, Gramaglia et al. (2006) demonstraram em estudo realizado em camundongos iNOS ou eNOS knockout infectados com Plasmodium berghei ANKA, que estes não diferem quanto a parasitemia e mortalidade quando comparados ao controle, sugerindo que o NO não influencia na parasitemia, porém quando submeteu os animais infectados a três doses diárias de um doador de NO observou que eles passaram a ter um tempo de vida maior e proteção contra MC, concluindo que a produção diminuída do agente oxidante contribui para a ocorrência da MC experimental. Semelhante achado foi observado em estudos realizados por Astey et al. (1996) em crianças africanas com malária, nestas são percebidos baixos níveis de nitratos e nitritos na MC e a concentração urinária e a plasmática das moléculas foram identificadas inversamente proporcionais a severidade da doença. De acordo com Yeo et al. (2009) e Omodeo-Salé et al. (2010) a diminuição das concentrações de NO na malária pode está relacionada ao grupo prostético heme livre oriundo da hemólise provocada pelo plasmódio. O primeiro grupo de pesquisadores referente a esta teoria demonstrou através de estudos realizados em pacientes com MC que a hemólise está relacionada com aumento da severidade da doença e diminuição na biodisponibilidade de NO, com consequente aumento da parasitemia e ativação endotelial. Omodeo-Salé et al. (2010) identificaram significante impedimento no transporte de L-arginina de forma dose-dependente em eritrócitos tratadas com heme livre, o que contribui para a produção reduzida de NO na malária severa. Fritsche et al. (2001) são mais específicos em suas pesquisas, através das quais demonstram que o Fe tem um papel importante no metabolismo da iNOS, pois na cocultura de macrófagos e eritrócitos de camundongos infectados com P. falciparum e prévio tratamento da mesma com Fe, observou que após estimulação dessa com citocinas ocorreu diminuição dos níveis de NO e aumento da parasitemia, enquanto que a mesma cultura diante de um quelador de metais proporcionou aumento de NO e diminuição da parasitemia, concluindo que a adição de um quelador na terapia contra a malária aumentaria a disponibilidade de NO e morte do parasita. 40 Além do NO, outras espécies reativas podem ser produzidas por células vasculares, através de enzimas como as ciclooxigenase (COX), as quais já foram identificadas na malária. De acordo com Ball et al. (2004) as isoformas COX-1 e COX-2 foram expressas no cérebro de camundongos com e sem MC, sendo que os que foram tratados com celocoxibe, inibidor da COX-2 e, consequentemente, da produção de prostaglandina E2 (PGE2), apresentaram os sinais da MC precoce, sugerindo que a COX-2 possui efeito protetor na malária experimental. Estudos realizados por Perkins et al. (2005) atribuem mais precisamente a ação protetora contra MC à PGE2, através de estudos realizados em crianças infectadas e assintomáticas de áreas endêmicas, as quais possuíam altos níveis dessa prostaglandina, enquanto que as crianças que manifestaram a MC apresentaram baixos níveis da mesma. Semelhante achado foi obtido por Xiao et al. (1999), além de que diante da ação da aspirina, ocorreu aumento de leucotrieno e rápida ocorrência de MC, supondo que este eicosanóine provoque o detrimento desta forma grave da doença. 5. FATOR NUCLEAR-KAPPA B O NF-kB é um fator transcricional (FT) descoberto devido a sua interação com a cadeia leve de imunoglobulinas, sendo seus primeiros experimentos realizados em células B, por isso tal denominação, como um FT se liga ao DNA e regula a expressão de genes (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002). Este FT está presente em organismos eucariontes, é considerado um dos principais reguladores que atua diante de agentes infecciosos, estresse celular, mecanismo de sobrevivência em infecções agudas, regulando genes envolvidos na resposta inflamatória e imunológica (Kriete & Mayo, 2009). Esse fator nuclear é composto por duas subfamílias, NF-kB e Rel, ambas com a porção N-terminal de 300 aminoácidos conservada, denominada domínio homólogo Rel (RHD), região de ligação ao DNA, dimerização e interação com os membros da família do inibidor Kappa B, IKB (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002; Gilmore, 2006). A primeira subfamília possui os seguintes membros, p105 (NF-kB1) e p100 (NF-kB2) e a segunda o cRel, p65 (Rel A) e Rel B. As proteínas NF-kB se tornam ativas através dos seus respectivos encurtamento, p105 a p50 e p100 a p52, porém em geral, de forma isolada não são ativadores de transcrição, por isso 41 formam homodímeros ou heterodímeros com a família Rel, p50/p65, p50/c-rel, p65/p65 e p65/c-rel entre outros (Gilmore, 2006). De acordo com O’Dea & Hoffmann (2010) são quinze os possíveis dímeros formados, proporcionando uma diversidade combinatória que contribui para a regulação de diferentes genes. Além desta diversidade pode ocorrer diferentes associações entre os dímeros e os Inibidores kappa B, como exemplo o p65:p50 que pode se ligar a quatro tipo de inibidores, os quais são ativados em resposta a um estímulo específico (O’Dea & Hofmann, 2010). Porém, algumas de suas combinações atuam inativando ou reprimindo expressões gênicas, como os homodímeros p50/p50 e a p52/p52, efeito que pode ser devido à falta do domínio C-terminal de transativação, responsável por ativação do gene sensível ao NF-kB (Ghosh et al., 1998). Os dímeros são formados pela união da porção C-terminal, porém tanto esta porção como a N-terminal se ligam a uma sequência consenso contendo 9 ou 10 pares de base do DNA (sítio KB), a qual possui uma grande quantidade de variações de base (5’-GGGRNWYYCC-3’; R por A ou G; N, qualquer nucleotídeo; W, A ou T; Y, C ou T). Sendo que o dímero mais frequente é o heterodímero formado pela p50 associado a p65, o qual se encontra inativo através do IkB (Kretz-Remy et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Gilmore, 2006). O inibidor assim como o FT possui uma família de proteínas, composta por proteínas clássicas, IkBα, IkBβ e IkBε, e proteínas não clássicas, IkBγ e IkBδ, estas são proteínas de alto peso molecular e por isso denominadas “IkBsome” . Ambas as classes possuem em comum a presença repetida da proteína “ankyrin”, responsável pela interação entre proteínas (Ghosh et al., 1998; Salminen et al., 2008; O’Dea & Hofmann, 2010). O IkBα se liga predominantemente ao dímero p50:RelA enquanto que o segundo ao p50:cRel, o IkBε somente ao homo e heterodímero p65 e cRel (Ghosh et al., 1998). Diante de um estímulo o IkB quinase (IkK), IKKα e/ou IKKβ, provoca a fosforilação do IkB e induz a proteólise, liberando portanto o fator nuclear, que se transloca para o núcleo e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de genes (Kumar et al., 2004; Salminen et al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Ma, 2010; Miller et al., 2010). 42 Tal proteólise envolve o processo de ubiquinação e ação do proteossoma 26, pois a proteína ubiquitina irá marcar a proteína indesejada, IKB fosforilada, para que ela seja degradada pelo proteossoma, este processo também está envolvido no encurtamento das p100 e p105, através da degradação da porção C-terminal, evento que pode ser responsável pelo direcionamento da via de ativação, canônica ou não canônica (Kretz-Remy et al., 1996; Hay et al., 1999; O’Dea & Hofmann, 2010). Os principais caminhos de ativação do fator ocorrem através da via canônica e a não canônica, ambos caracterizados pela presença da IkK, porém a primeira ocorre através da ativação do receptor para TNF (TNFR), Interleucina 1, receptor Toll-like (TLR), os de células B (BCR) e os de células T (TCR), e é realizada através do modulador essencial NF-kB (NEMO) associado a uma das formas de quinase, que irá fosforilar as proteínas IkB clássicas ou IkBγ associadas ao NF-kB, ativando a transcrição de genes, entre os quais estão os que expressão IkBα, IkBε, p105, p100, cRel e RelB (Hayden & Gosh, 2004; Gilmore, 2006; Yates & Górecki, 2006; O’Dea & Hoffmann, 2010). Quando essa via utiliza o TNFR, IL-1 ou TLR promove a ação de quinases e modificação dos membros de fatores associados ao TNFR (TRAF). No entanto quando essa via usa o BCR ou o TCR, a ativação do NF-KB ocorre por meio de uma cascata de fosforilação envolvendo a quinase linfóide B (BKL), tirosina quinase do baço (SYK), tirosina quinase de Bruton (BTK), família de quinase-src p56-lck (Lck) e p59-fyn (Fyn) e cadeia de proteína quinase associada ao ξ (ZAP70), todas levam a ativação da proteína quinase C-β (PKC-β) e PKC-θ, resultando na ativação do FT kappa B (Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006). Por outro lado, a segunda via é ativada por meio do receptor da linfotoxina-β (LT- βR), do fator de ativação de células B (BAFFR) e o de ativação do NF-KB (RANK; Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006). Ao serem ativados os receptores dessa via conseqüentemente ocorre a ação da TRAF subseqüente atuação do indutor de quinase NF-kB (NIK), o qual fosforila dois resíduos de serina do complexo formado por 2 IkKα, consequentemente este realiza a fosforilação da p100 associado à RelB, formando o complexo p52:RelB que migra para o núcleo e, entre outras expressões, provoca o aumento da p52 a partir da produção de p100 (Gilmore, 2006; Yates & Górecki, 2006; O’Dea & Hoffmann, 2010). 43 Porém, uma atípica via também já foi descrita, a qual ocorre através de “ativadores atípicos”, como EROS, raios UV, metais e as isquemias (Hayden & Gosh, 2004; Janssens & Tschopp, 2006; Yates & Górecki, 2006). De acordo com O’Dea & Hofmann (2010) a regulação do sistema de sinalização NF-kB ocorre em duas escalas, uma ocorre a síntese de proteínas NFkB e formação de dímeros, outra através da regulação da atividade dos dímeros via degradação do IkB e resíntese do mesmo. Agonistas deste fator nuclear incluem a IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, moléculas do complexo de histocompatibilidade em resposta imune, ERON, grupo heme livre, radiação ultravioleta, lipopolissacarídeos bacterianos, proteínas de transativação viral, RNA (ácido ribonucleotídeo) de dupla fita, esfingomielina, ionóforo de cálcio e células de adesão. A expressão deste TF tem sido observada em tecidos de camundongos, músculo cardíaco, cérebro, órgãos linfóides, e mucosa gástrica, pulmão, fígado, cartilagem e artérias coronarianas, tanto de humanos como de animais (Barchowsky et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Arruda et al., 2004; Kriete & Mayo, 2009; Kim et al., 2010). Várias quinases que atuam nessa fosforilação já foram identificadas, como a NIK, a proteína quinase R (PKR), a proteína 90 ribossomal S6 quinase (p90RSK), as MEKs kinase (MEKK) 1, 2 e 3, a proteína quinase B (PKB ou Akt) e progressão do tumor locus 2 quinase, TPL2 (Bowie & O’Nell, 2000; Salminen et al., 2008; Ma, 2010). Algumas das classes de genes induzidos pelo FT são os que expressam citocinas como o TNF (α ou β), IFN (β ou γ) e IL, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas imunoreguladoras, moléculas de adesão celular, proteínas de resposta à fase aguda, genes sensíveis ao estresse, SOD-Mn, receptores de superfície celular, reguladores de apoptose viral, fatores de transcrição, fatores que controlam o crescimento, enzimas entre outros (Guo et al., 2003; Kumar et al., 2004). 5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO (ERON) NA ATIVAÇÃO DO NF-KB. Um caminho diferente de ativação do NF-kB durante a infecção aguda envolvendo ERON foi descrito por Kriete & Mayo (2009), através do qual prepõem a comunicação cruzada entre duas organelas, retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria, provocando tal ativação. Pois, durante a infecção viral ocorre síntese 44 de muitas proteínas no RE, processo que demanda elevada energia, sendo esta obtida através do efluxo de cálcio realizado pelo RE para o recrutamento da mitocôndria, que absorve o metal e fornece ATP (adenosina trifosfato), através da cadeia de transporte de elétrons, a qual além de energia tem como produto ERON (Figura 6). Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre organelas. Fonte: Kriete & Mayo, 2009. O aumento na síntese protéica pode ter como consequência uma overdose de Ca++ e ERON, as quais ativam o FT que, para proteger as organelas da ação oxidativa, pode ativar genes que expressam enzimas antioxidantes. Logo, o cálcio pode ser importante segundo mensageiro envolvido na produção de ERON e ativação do FT (Kriete & Mayo, 2009). Tal aumento nos níveis do Ca++ e ativação do FT foi observado em estudo realizado por Berchtold et al. (2007), os quais sugeriram que os agentes genotóxicos como a camptotecina e etoposide, inibidores da topoisomerase I e II, aumentam a quantidade de cálcio intracelular, provocando a formação do complexo composto por NEMO, Ran-GTP e receptor nuclear de exportação, que ativam o fator. 45 Semelhante achado com relação à elevação dos níveis do Ca++ foi observado diante da ação genotóxica da radiação ionizante (RI) produzindo ERON (Todd & Mikkelsen, 1994; Mikkelsen & Wardman, 2003). De acordo com O’Dea et al. (2008), tal agente genotóxico pode ativar o FT por duas vias, uma em que o estresse ativa a IKK, que fosforila o IKB acoplado ao FT, este agora livre migra para o núcleo, enquanto que a outra via ocorreria através da diminuição da síntese de IKBα, através da fosforilação do fator de iniciação eucariótica-2α (eIf-2α) provocada pela RI, diminuindo portanto o IKBα livre e o acoplado ao FT. 5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB As ERON são componentes vitais para o mecanismo de sinalização celular via oxigênio e nitrogênio, desempenham a expressão de genes envolvidos na produção de energia, transferência de O2, diferenciação celular e combate ao próprio RL através de estímulo da produção de antioxidantes. Entre o sinal via O2 e a expressão de genes um dos principais fatores de transcrição sensível às alterações do estado redox o NF-kB (Haddad, 2002; Martindale & Holbrook, 2002; Borowski, 2006; Bubici et al., 2006). Ainda não se tem o exato conhecimento de como tais espécies reativas regulam o fator nuclear. Sabe se que a natureza do estímulo e o tipo de célula podem influenciar na ação de ERON sobre o fator (Bubici et al., 2006). Diversos pesquisadores vêm demonstrando a ação de antioxidantes, como a L-cisteína, GSH, Mn-SOD, a N-acetil-L-cisteína (NAC), vitamina C, a E, o αtocoferol entre outros, na inibição do fator nuclear (Mihm et al., 1991; Staal et al., 1993; Suzucki & Packer, 1993; Cho et al., 1998; Islam et al., 1998; Manna et al., 1998; Sen et al., 1996). A ação inibitória já foi identificada sobre o estímulo do fator através do TNF-α, LPS, IL-1β, forbol miristato-13 acetato (PMA), cicloheximida e H2O2 (Bubici et al., 2006). A inibição pode ocorrer em vários níveis da cascata de sinalização do TF: no citoplasma bloqueando a estimulação do fator, interferindo em alguma das fases de ativação (fosforilação, ubiquitinação ou proteólise), ou no núcleo impedindo a ativação da transcrição (Droger et al., 1994; Bubici et al., 2006; O’Dea et al., 2008). Já foram demonstrados que os antioxidantes podem atuar através de três formas, inibindo a fosforilação, a degradação do IKB ou ligação do TF ao DNA. Cho 46 et al. (1998) demonstraram que a glutationa inibiu a ativação do NF-kB impedindo a fosforilação e degradação do IKBα em células endoteliais de camundongos. Enquanto que, Schubert et al. (2002) identificaram em pesquisa realizada em células endoteliais bovina a inibição da ativação de transcrição utilizando a NAC (N-acetil cisteína), porém sem provocar a fosforilação ou a degradação do IKBα. Semelhante achado foi observado por Natarajan et al. (1996) que, através da análise do éster fenetil do ácido caféico (CAPE), o qual possui estrutura semelhante ao flavonóide, relataram que o CAPE atua impedindo a ligação do TF ao DNA, ação atribuída ao agente redutor ditiotreitol, uma vez que o estado redox do núcleo é importante para ativação da transcrição via NF-kB. De acordo com Bowie & O’Nell (2000) o estado redox celular pode influenciar na atividade do NF-kB através de 4 formas: (1) H2O2 ativando diretamente o TF; (2) ativação através de estímulos como IL-1 ou TNF aumentando o estresse oxidativo intracelular; (3) antioxidantes inibindo o estresse estimulado; (4) enzimas oxidantes e antioxidantes modulando o estado redox na célula. No entanto, para O’Dea et al. (2008) a regulação do NF-kB pelo estresse pode ocorrer através das seguintes maneiras: (1) degradação do IkB livres ou IkB acoplada ao NF-kB; (2) inibindo a resíntese do IkB; (3) através da IKK induzindo a degradação do IKB e migração do NFkB para o núcleo. Contudo, Droger et al. (1994) observou que a regulação do TF pode ocorrer em duas condições: No citoplasma o estado oxidativo favorece a ativação e translocação do TF para o núcleo, caso tal condição estiver presente no núcleo desfavorece ligação do fator ao DNA, entretanto nesta localização o estado reduzido favorece tal ligação. A partir destes conceitos pode ser observado que o estado redox pode atuar em vários níveis da cascata de sinalização do FT NF-KB como consta na figura 7. 47 Figura 7- Regulação redox do NF-kB. 5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES Diversos estudos vem demonstrado citocinas e endotoxinas induzindo a produção de NO via sinalização NF-kB (Bereta et al., 1995; Gilad et al., 1998; Katsuyama et al., 1998; Lee et al., 2009). Além deste agente oxidante outros são produzidos pela enzima COX-2, que possui mesma via de síntese (Li et al., 2007; Chiu & Lin, 2008). No entanto, antioxidantes como a MnSOD também podem ser produzidos pela sinalização envolvendo o fator de transcrição (Borrás et al., 2006). Estudos realizados por Chiu & Lin (2008) revelaram o efeito provocado pelo alcalóide esteroidal denominado tomatodino, que inibiu a expressão da enzima 48 responsável pela síntese de NO a iNOS e COX-2 induzida por LPS em macrófagos murino, suprimindo a fosforilação do IkB-α e ativação do TF. Através desse achado se ressaltou a importância desta via de sinalização para estudo de quimioterápicos com ação anti-inflamatória. A ação inibitória da expressão da iNOS via NFkB, foi observada em pesquisa realizada com a melatonina, neuro-hormônio produzido pela glândula pineal que estimula o sono e possui função antioxidante diante de radicais hidroxilas e peroxinitritos, em células semelhantes às anteriormente citadas sob estímulo da mesma endotoxina (Gilad et al., 1998). Lee et al. (2009) identificaram que a inibição da expressão do NO pode ser provocada também pelo resveratrol, que ativa a Sirtuína 1 (SIRT-1), esta promove a desacetilação do NF-kB, prevenindo a citotoxidade provocada por citocinas e consequente produção de NO. Adicionalmente, Bereta et al. (1995) demonstraram que glicosídios cardíacos inibidores da enzima Na+/K+ ATPase estimulam a expressão de iNOS em células endoteliais de cérebro murino através do dímero NF-kB.Este dímero está envolvido na expressão da iNOS mRNA em células do músculo liso diante do estímulo da IL1β (Katsuyama et al., 1998). No entanto, Borrás et al. (2006) em seus experimentos observaram o envolvimento do FT e produção de antioxidante, através da atividade da genisteína, isoflavona da soja, classificada como fonte alternativa na reposição hormonal através da ligação ao receptor-β do estrogênio, pois possui ação antioxidante através da indução da expressão da enzima MnSOD em células tumorais de glândulas mamárias de humanos (MCF-7) através do TF. A partir destes dados é possível observar o envolvimento da via de sinalização NF-kB na expressão de agentes oxidantes e antioxidantes. 6. MALÁRIA E O NFKB Durante o processo patológico o sistema imunológico monta uma rede de defesa, através de sinalizações que comunicam o estado de lesão e infecção. Uma maneira de induzir tal sistema é através de mensageiros como citocinas, algumas induzem a proliferação e diferenciação de células específicas, como a IL-2 em linfócitos T, GM-CSF em macrófagos e G-CSF em granulócitos. Outras induzem a 49 resposta de fase aguda, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, diante de infecções virais e ainda outras induzem a produção de anticorpo a partir de linfócito B, sendo que o TF comum na produção de todas essas diferentes moléculas é o NF-kB (Ghosh et al., 1998). Neste contexto, alguns pesquisadores vêm demonstrando o envolvimento deste TF na malária, principalmente as subunidades p50 e p65 envolvidas na expressão de quimiocinas, citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão e NOS, em diferentes tipos de células (Jaramillo et al., 2003; Jaramillo et al., 2005; Tripathi et al., 2006; Torgler et al., 2008; Tripathi et al., 2009). Alguns resultados de estudos realizados em macrófagos de camundongos sugerem que a hemozoina, em ação sinérgica com o IFN-γ, induza a expressão de iNOS e produção de NO via fosforilação da quinase regulatória extracelular (ERK1/2) e ativação do NF-kB. A expressão de quimiocinas nessas células pode ocorrer tanto pela fosforilação da ERK1/2 como pela produção de estresse oxidativo celular, ativando o TF que realiza a transcrição de genes (Jaramillo et al., 2003; Jaramillo et al., 2005). Estudos em hepatócitos de camundongos indicam que a ativação do fator nuclear pode ocorrer devido a ruptura destas células que é provocada pelos esporozoitos, liberando fatores citosólicos que se ligam a receptores Toll/IL-1, que recrutam proteínas adaptadoras, como a MyD88, com consequente ativação do IKK, o qual fosforila o IKB-α, liberado o NF-KB que ativa a expressão de iNOS e produção de NO nas células hepática, provocando a redução da infecção das células (Torgler et al., 2008). No entanto, estudos realizados por Delic et al. (2010) em camundongos knockout para o aminoácido taurina e infectados pelo P. chaboud, observaram que o aminoácido é importante na proteção contra a infecção do parasita, já que, na ausência da taurina se identificou o aumento da parasitemia e expressão hepática da IL1-, TNF-, iNOS, NF-kB e receptor de vitamina D, moléculas que podem está envolvidas na patogênese da doença. Outras pesquisas demonstram que células endoteliais do cérebro humano quando expostas aos eritrócitos infectados com P. falciparum induzem a expressão de moléculas de adesão intracelular 1 (ICAM-1) via NF-kB, molécula que pode contribuir com o sequestro de células na malária cerebral (Tripathi et al., 2006). Em modelo experimental semelhante se identificou a expressão de quimiocinas, 50 CCL20, CXCL1, CXCL2 e citocinas IL-6 e IL-12 através do fator de transcrição, as quais se encontram elevadas no endotélio cerebral exposto aos eritrócitos contendo o plasmódio (Tripathi et al., 2009). 7. ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFÉICO-CAPE O éster fenetil do ácido cafeico-CAPE (Figura 8) possui estrutura relacionada ao ácido 3,4-dihidroxicinâmico, é um componente semelhante aos flavonoides e com diversas propriedades biológicas, entre as quais estão: antioxidante (Ozguner et al., 2005a), anti-inflamatória (Michaluart et al., 1999), anticarcinogênico (Cheen et al., 2001), antiviral e imunomodulador (Grunberger et al., 1988). Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE). Fonte: Natarajan et al.,1996. Além dessas diversas atividades, este composto é considerado como um potente inibidor específico do Fator nuclear kappa B (Natarajan et al., 1996). O qual pode ser ativado por citocinas inflamatória, produtos bacteriano, estresse oxidativo, mitógenos e luz ultravioleta (Lu et al, 2004; Ghosh et al., 1998; Kriete & Mayo, 2009; Kim et al., 2010; Grilli et al., 1993). Estudos em histiócitos humano realizados por Natarajan et al. (1996) demonstraram que a ativação do NF-kB estimulada por agentes inflamatórios como TNF e éster de forbol, além da ceramida, peróxido de hidrogênio e ácido ocadáico, foi bloqueada pelo uso do CAPE de forma dose-tempo dependente e específica. Já que, ao utilizar o CAPE diante de outros fatores de transcrição (AP-1, Oct-1 e TIFIID) não se observou tal ação. Outro efeito importante já relatado do Inibidor foi sua ação em camundongos pré-tratados com CAPE 1mg/kg via i.p., pois inibiu a ação inflamatória induzida pelo 51 LPS, assim como a ativação do NF-KB, infiltração das células pulmonares, hemorragia na medula renal e diminuição da metaloproteínase-9 (Jung et al., 2008). Acredita-se que este inibidor específico seja um composto que atue sobre grupos sulfidrilas do FT kappa B, pois ao utilizar o agente redutor L-1-tosilamido-2feniletil-clorometilcetona se observou a reversão da ação bloqueadora, inibindo assim a translocação da subunidade p65 para o núcleo, sem possuir qualquer efeito sobre o inibidor IKBα (Natarajan et al., 1996). Com relação à ação antioxidante do inibidor, foi demonstrado seu feito protetor diante do estresse oxidativo provocado no miocárdio. Pois, pesquisas em roedores realizadas por Ozgumer et al. (2005b) demonstraram que a radiação do telefone (900HZ) promove o aumento de NO e MDA, além de diminuir a atividade da SOD, CAT e GSH-Px no coração, alterações que foram revertidas pela administração do CAPE (10µM/mL/Kg, i.p.), prevenindo assim o danos oxidativos no tecido. A mesma concentração do CAPE foi utilizada em estudos realizados por Pekmez et al. (2010). No qual observou que ratos expostos à fumaça apresentaram as seguintes alterações bioquímicas: elevação do ácido úrico sérico, nitrogênio da urina e do sangue, SOD, GSH-Px, NO e MDA renal, além de mudanças histopatológicas dos rins. Essas alterações foram prevenidas através da administração i.p. do CAPE. Este composto além de ação protetora sobre o dano oxidativo provocado no miocárdio (Ozgumer et al., 2005b) e no rim (Pekmez et al, 2010), previne a isquemia-hipóxica neonatal em cérebro murino tratado com CAPE, nos quais se observou a inibição da caspase1 e a 3, iNOS, produção de NO, neurotoxidade e morte de neurônios (Wei et al, 2004). Essa espécie reativa do nitrogênio também foi inibida pelo CAPE em estudo recente realizado por Abduljawad et al. (2013), pois ao tratar com o inibidor em dias alternados os camundongos com diabetes constataram a inibição do NO, IL-1β, IFN-γ, além da diminuição da glicose. Outro fator analisado nessa pesquisa foi o efeito anti-angiogênico que foi identificado pela diminuição da metaloproteinase-9, angiopoietina e níveis de endostatina. Shen et al. (2008) identificaram em estudos in vitro utilizando células endoteliais que a deficiência de zinco promove o aumento da ligação do FT ao 52 DNA e expressão de COX-2, esta foi inibida através do uso do CAPE. Logo, observa-se que o CAPE é um importante inibidor do fator nuclear kappa B com ação antioxidante. 8. OBJETIVOS 8.1. GERAL Verificar o efeito da inibição da ativação do NF-kB sobre as alterações oxidativas e da capacidade antioxidante na malária experimental cerebral e pulmonar causada pelo P. berghei. 8.2. ESPECÍFICOS Verificar a parasitemia dos camundongos infectados com P. berghei, controles e naqueles que são inibidos à ativação do NF-kB; Avaliar o efeito da inibição da síntese do NF-kB sobre a ação oxidativa dos lipídios no pulmão e cérebro de camundongos com alterações da malária; Verificar a defesa antioxidante no cérebro e pulmão de infectados com P. berghei; Avaliar possíveis correlações entre a oxidação de lipídios e a atividade antioxidante diante do efeito da inibição do NF-kB no cérebro e pulmão de infectados com P. berghei; Analisar o efeito da inibição do NFkB sobre a permeabilidade da barreira hematoencefálica. Avaliar a ação oxidativa e a capacidade antioxidante sobre a permeabilidade da barreira hematoencefálica. 53 9. MATERIAL E MÉTODOS 9.1. GRUPOS DE ANIMAIS Foram utilizados 275 camundongos machos da raça Swiss com 10 semanas de idade (adultos), procedentes do Biotério do Instituto Evandro Chagas (IEC) Belém/PA. Os animais foram mantidos em gaiolas no Biotério do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará (UFPA), à temperatura ambiente (25 ± 3°C) com ciclo claro/escuro de 12 horas, tratados com alimentação e água “ad libitum”. Vinte e cinco foram usados para a passagem da cepa e o restante dividido randomicamente em 4 grupos, como segue: Grupos A: No qual os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados com meio de diluição do NF-KB. Os animais do Grupo A foram subdivididos em subgrupos I-V; com n = 15 cada: Os animais do subgrupo I foram submetidos à eutanásia após 24h da infecção; Os animais do subgrupo II foram submetidos à eutanásia após 5 dias da infecção; Os animais do subgrupo III foram submetidos à eutanásia após 10 dias da infecção; Os animais do subgrupo IV foram submetidos à eutanásia após 15 dias da infecção; Os animais do subgrupo V foram submetidos à eutanásia após 20 dias da infecção; Grupos B: Neste grupo os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados com o inibidor da ativação do NF-kB. Os animais do Grupo B foram subdivididos em subgrupos VI-X com n = 15 cada: Os animais do subgrupo VI foram submetidos à eutanásia após 24h da infecção; Os animais do subgrupo VII foram submetidos à eutanásia após 5 dias da infecção; Os animais do subgrupo VIII foram submetidos à eutanásia após 10 dias da infecção; Os animais do subgrupo IX foram submetidos à eutanásia após 15 dias da infecção; Os animais do subgrupo X foram submetidos à eutanásia após 20 dias da infecção; Grupos C: Neste grupo os animais foram tratados apenas com o inibidor da ativação do NF-kB. 54 Os animais do Grupo C foram subdivididos em subgrupos XI-XV com n = 15 cada: Os animais do subgrupo XI foram submetidos à eutanásia após 24h de inoculação do inibidor; Os animais do subgrupo XII foram submetidos à eutanásia após 5 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIII foram submetidos à eutanásia após 10 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIV foram submetidos à eutanásia após 15 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XV foram submetidos à eutanásia após 20 dias da inoculação; Grupos D: Correspondem aos animais controles negativos (sham), os quais foram submetidos à mesma ambientação e procedimentos técnicos realizados no grupo A e B, com exceção da inoculação pelo protozoário e inibição do NF-kB, apenas com inoculação de hemácias não infectadas. Esse grupo foi subdividido em 5 subgrupos (XVI-XX) com n = 10 cada, submetidos à eutanásia nos mesmos tempos dos animais dos subgrupos A, B e C. Foram utilizados 5 camundongos de cada subgrupo (24h, 5, 10, 15 e 10 dias) pertencente ao grupo A, B, C e D para a análise da permeabilidade hematocerebral. Exceto para os que tiveram o número reduzido dos camundongos devido à infecção, nos quais se utilizou 1/4 do valor total de camundongos sobreviventes. O uso dos animais foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa Animal-UFPA, onde se obteve o seguinte registro 125-13 (Anexo) 9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS Inicialmente foi feita a inoculação intraperitoneal de hemácias infectadas (HI) pelo Plasmodium berghei ANKA fornecida pelo Laboratório de Neurociências da UFPA em camundongos Balb-c. Posteriormente ao atingirem uma parasitemia em torno de 10% foi feita a coleta de sangue e infecção de 106 HI nos camundongos Swiss em estudo de acordo com procedimentos descrito adiante (Percário, 1994; Scardoeli et al., 1996). Após 10 dias de infecção do camundongo Balb-c foi feita a determinação do percentual de hemácias parasitadas (vide tópico 9.3 Determinação da Parasitemia) para verificar se está ideal (5-15% de HI) para o preparo do inóculo dos camundongos a serem estudados. Observou-se a faixa ideal, em seguida realizase o corte transversal da ponta da cauda do animal e coleta de duas gotas de 55 sangue em tubo de ensaio contendo 2 mL de citrato de sódio 3,8%. Desta solução são retirados 20 µL para a contagem de hemácias total na câmara de neubauer em cinco quadrantes do quadrante mediano maior da câmara em microscópio óptico (Olympus, CX2) num aumento de 400 vezes. O valor total desta contagem deve ser multiplicado pelo fator de correção (fc = 50.000), assim o valor obtido reflete a quantidade de hemácias em 1 ml da solução. E por fim realiza-se o ajuste da solução para que a mesma tenha 1x106 HI através de sua diluição no meio RPMI 1640 (Sigma Aldrich, Cat # R5886) e soro bovino fetal (Invitrogen, Cat # 12657029) com base no número de camundongos a serem infectados e sua massa corporal (Peters, 1965; 1967). 9.3. PESQUISA DO PARASITA NO SANGUE A contagem de hemácias infectadas pelo P. berghei nos camundongos foi realizado em amostras sanguíneas obtidas dos animais por punção da veia caudal no dia de eutanásia (1, 5, 10, 15 e 20 dias de infecção), para preparação de esfregaço sanguíneo em lâmina para microscópio, depois de seco em temperatura ambiente o esfregaço foi fixação com metanol (Dinâmica, Cat # 1230) por 2 min e corado com o reagente de Gyemsa (Merk, Cat #1092041022) por 10min. Posteriormente foi feita a lavagem da lâmina corada em água corrente. Após a secagem dessa lâmina efetuou-se a contagem de HP em microscópio óptico (Olympus, CX2) com aumento de 100X utilizando o óleo de imersão de acordo com o quadro 1 abaixo. Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma estimativa inicial da parasitemia % de Parasitemia Nº de Hemácias a serem contadas 0 10.000 <6 5.000 6-10 2.000 11 a 20 1.000 >20 300 Nº=número; %=percentual 56 9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS Depois da retirado dos pulmões e encéfalo do animal, ambos os órgãos foram lavados com solução fisiológica 0,9% e secos (NaCl; CAAL, Cat # 16825; mais H2O destilada). O lado direito do pulmão e do cérebro foram submetido à disrupção e preparação do homogeneizado de tecido. Este foi realizado da seguinte forma, se acrescenta inicialmente a cada órgão separadamente a solução salina fosfato PBS na proporção de 1:10 (massa:massa) e realiza-se cortes nos mesmo com uma tesoura, em seguida são processados no disrruptor de células ultra-sônico (UNIQUE). Durante este processo os recipientes contendo as amostras são colocados em um béquer com gelo para evitar que o calor gerado no processo danifique as amostras. 9.5. INIBIÇÃO DO NFKB Para a inibição do fator nuclear kappa B foi utilizado o éster fenetil do ácido caféico (CAPE, Calbiochem, Cat # 211200), componente ativo isolado da própolis de colmeias de abelhas solúvel em etanol (50 mg/mL, Dinâmica, Cat # 1336). Inicialmente o inibidor foi preparado em etanol 100% e posteriormente a solução de inoculação em PBS na concentração de 1 mg/Kg peso do camundongo, obtendo assim uma solução final de 7,04% de etanol em PBS. Foi realizado 5 dias de pré-tratamento e tratamento dos camundongos até o dia da eutanásia em dias alternados através de injeção i.p. de 200 µL ± 40 g de peso do camundongo (Jung et al., 2008; Abduljawad et al. 2013). 9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE 9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) A capacidade antioxidante foi determinada no homogeneizado de cada órgão pelo método TEAC baseado no radical cátion ABTS+ produzido pela reação entre o 2,2.-azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-diamônio (ABTS; Sigma, Cat # A1888 ) com persulfato de potássio (K2S2O8; Sigma, Cat # P5592), ambos preparados em PBS. Esse radical é um cromóforo de coloração verde/azul, com absorbância máxima nos comprimentos de onda 645, 734 e 815 nm em Espectrofotômetro (Biospectro, SP-22) UV-visível (Re,1999). 57 O cromóforo é reduzido e perde a sua coloração tempo-dependente da concentração de antioxidantes e duração da reação, mudança mensurada por espectrofotometria a 734 nm durante um determinado intervalo de tempo. Assim, a extensão da descoloração equivalente a inibição do radical cátion ABTS+ é determinada como a atividade antioxidante total da amostra, sendo então calculada a sua relação com a reatividade do Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma, Cat # 23881-3) como padrão (Re,1999). Este foi utilizado para o preparo de uma solução 2,5 mM, a partir do qual preparou-se diluições sucessiva de acordo com o quadro 2 e se obteve a curva padrão (Figura 9), desta se obteve a seguinte equação da reta TEAC=(ABS0,0235)/0,4905, onde ABS é igual a absorbância, sob as mesmas condições, através do qual são fornecidos resultados finais expressos em milimolar por litro (mM/L), método adaptado de Re (1999). Para as amostras não quantificadas no dia da dosagem dos pontos da curva, fez-se a correção utilizando fator de correção dosando-se apenas um ponto da curva. Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC Tubo Padrão de Trolox 2,5mM PBS (µl) Concentração de Trolox (mM) (µl) A 5000 0 2,5 B 4000 1000 2,0 C 3000 2000 1,5 D 2000 3000 1,0 E 1000 4000 0,5 F 0 5000 0 58 Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox através da redução do radical ABTS+ 9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH O método é baseado na redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), que apresenta coloração violeta e absorção em torno de 515-517nm em Espectrofotômetro UV-visível (Biospectro, SP-22). Pois, a atividade antioxidante (AAO) de substâncias contidas na amostra é medida através da interação de antioxidantes da mesma com o DPPH, resultando na formação irreversível do produto hidrogenado (hidrazina) que é incolor. Assim, a extensão da inibição e conseqüente descoloramento do DPPH é determinado como a capacidade antioxidante da amostra, a qual é calculada em comparação com a reatividade do antioxidante Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma, Cat # 23881-3) como padrão (Blois, 1958). Para o ensaio foi utilizado o homogeneizado de cada órgão de acordo com o método adaptado de Blois (1958), no qual foi preparada uma solução de DPPH a 0,1 mM em etanol (Dinâmica, Cat # 1336). Em cada tubo foi colocado 950 µL da solução DPPH 0,1 mM, 50µL da amostra para completar um volume final de 1mL. Após um período de 30 minutos em banho-maria a 37°C, foram feitas as leituras das absorbâncias em 517 nm. Os valores de absorbâncias obtidos foram subtraídos da absorbância inicial do DPPH. 59 As concentrações foram obtidas a partir da equação da reta da curva padrão (Figura 10) do Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma, Cat # 23881-3) realizadas com a concentrações contidas no quadro 3, nas mesmas condições das amostras e os resultado obtidos foram multiplicados pelo fator de diluição 10. Os Resultados finais são expressos em milimolar por litro (mM/L). Quadro 3- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH Tubo Solução de Trabalho de Trolox (µl) PBS (µl) Concentração Final (mM de Trolox) A 0 1000 0 (BRANCO) B 50 950 0,125 C 100 900 0,250 D 150 850 0,375 E 200 800 0,500 F 250 750 0,625 G 300 700 0,750 60 Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente ao trolox através da redução do DPPH. 9.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS) O lipídio sofre ação oxidativa denominada peroxidação lipídica que é avaliada através da dosagem do Malondialdeído (MDA), este que reage com duas moléculas do ácido tiobarbitúrico (TBA, Sigma, Cat # T5500), em pH baixo (2,5), o qual foi aferido no pHmetro digital (Hanna) e temperatura elevada, para formar o complexo TBA-MDA-TBA, de cor rósea e absorção máxima em 535 nm (Khon & Livesedge, 1944). O procedimento técnico foi realizado de acordo com fundamentos de Kornn & Livesedge (1944), adaptados por Percário et al. (1994), método que consiste no preparo inicial do fosfato monobásico de potássio (KH2PO4 75 mM, Synth, Cat # 35210) em água acidificada até o pH 2,5. Esta solução é utilizada na preparação do (TBA 10 nM). Adiciona-se 250 l de amostra à 500 l da solução de ácido tiobarbitúrico 10 nM. Em seguida leva-se ao banho-maria (95ºC x 60 min); após a incubação deixa-se esfriar a temperatura ambiente; adiciona-se 2,0 ml de álcool nbutílico (Dinâmica, Cat # 1171), homogeneiza-se bem em vórtex e posteriormente submete-se a centrifugação a 2500 rpm por 15 min; coleta-se 1,0 ml do sobrenadante para leitura espectrofotométrica a 535 nm. Ultilizou-se como padrão a solução padrão do MDA (1,1,3,3, tetrahidroxipropano; Sigma, Cat # T9889) nas concentrações do quadro 4 abaixo, 61 através das quais se obteve as absorbâncias para a contrução da curva padrão (Figura 11). Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias. Solução de MDA (nM/mL) ABS (média) 7,5 0,137 15 0,247 30 0,515 60 0,974 100 1,637 Figura 11- Curva padrão de Malondialdeído (MDA). 9.8. AVALIAÇÃO DA HEMATOECENCEFÁLICA PERMEABILIDADE DA BARREIRA A permeabilidade da barreira hematoencefálica foi avaliada de acordo com procedimentos técnicos descritos por Herbas et al. (2010) com modificações, através do qual se pode visualizar a impregnação do corante azul de Evan (2%, Dinâmica, Cat # 1186) no tecido cerebral. 62 Pois, o corante se liga a proteína albumina, proteína plasmática, e durante o extravasamento sanguíneo dos vasos se a barreira endotelial não estiver preservada o complexo corante-proteína migra para o tecido, corando o mesmo em azul coloração perceptível ao olho nu (Gehlen et al., 2004). Esse corante foi preparado em PBS com pH = 7.2 nos referidos dias de eutanásia de cada grupo. O volume de injeção da solução foi calculado de acordo com o peso do camundongo (4 mL/kg peso). Após 20 min da anestesia injetou-se na veia lateral da cauda a solução corante; 1h depois da circulação da solução corante no organismo do camundongo (Figura 12) realizou-se a anestesia do mesmo. Posterior a 20 min foi feita a eutanásia por exaguinação e dissecação do cérebro para a visualização da impregnação do Azul de Evans no mesmo a olho nu (Herbas et al., 2010). Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%. 9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos foram tabulados em planilhas elaboradas para este estudo no programa Microsoft Office Excel 2013. Inicialmente foi realizada a determinação dos valores discrepantes de cada parâmetro com base nos quartis (Outliers), o qual utiliza em seu cálculo o intervalo interquartil determinado pela diferença entre o terceiro quartil (Q3) e o primeiro quartil (Q1), chamado de dj. 63 Considera-se todo valor menor que Q1- 3/2 dj ou maior que Q3+ 3/2 dj, como sendo discrepante ou outliers. Para testar a normalidade e a homocedasticidade das variáveis foram aplicados o Kolmogorov-Smirnov e Teste de Levene. Quando as médias das amostras foram identificadas normais foi efetuado a comparação das mesmas pela aplicação dos teste paramétrico, Análise de Variância (ANOVA) e na ausência de nulidade entre a diferença das médias entre as variáveis dos grupos estudados foi aplicado o teste de Tukey. Quando detectada a diferença estatisticamente significante entre os pontos da mediana aplicou-se o teste de Dunn´s. Já para as amostras que não apresentaram normalidade foi aplicado o teste não-paramétrico Kruskal Wallis. Além desses, foi empregada a correlação de pearson na estimativa das correlações entre os diversos resultados obtidos no estudo. Foram atribuídas intensidades de correlação, sendo até 0,30 (r < 0,30) uma fraca correlação, entre 0,31 e 0,70 (0,31 < r < 0,70) moderada correlação e entre 0,71 e 1,00 (0,71 < r < 1,00) uma forte correlação, o sinal de positivo (+) ou negativo (-), do valor da correlação indica se a relação entre as variáveis é diretamente proporcional ou inversamente proporcional, respectivamente. Para aplicação dos testes estatísticos ANOVA Dois Fatores e Kruskal Wallis foi utilizado o programa SigmaStat versão 3.5 e para o cálculo de correlações o SPSS versão 17.0. O nível de significância aceito nas análises foi de 5% (p 0,05). 64 10. RESULTADOS 10.1. PARASITEMIA Na figura 13 pode ser observado a progressão da parasitemia dos camundongos infectados e tratados com etanol 7,04% e dos que além do parasita foram tratados com o inibidor. As médias dos percentuais da parasitemia estão dispostos na tabela 1. Em ambos os grupos infectados (A e o B) ocorreu aumento exponencial da parasitemia (p< 0,001). Com diferença significativa entre os dois grupos no 15º (p= 0,02) e 20º (p< 0,001) dias após a infecção. Figura 13 - Progressão temporal da parasitemia dos camundongos infectados com o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A (vermelho), e dos tratados com o CAPE, grupo B (roxo). 65 Tabela 1 - Valores de parasitemia dos camundongos infectados em função do tempo de infecção. PARASITEMIA (%) Grupos N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 15 0,07 ±0,87 15 1,27 ±0,52 13 2,01 ±0,40 5 12,32 ±4,1 3 45,95 ±28,58 B 15 0,10 ±0,15 15 1,38 ±0,95 12 2,61 ±0,77 5 1,94 ±0,78 4 18,24 ±12,09 A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. N = Número de animais por grupo de dias. Nas análises entre os subgrupos pertencentes aos grupos A e B observou-se os seguintes valores de p nas correlações (Tabela 2): 66 Tabela 2 - Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos de camundongos infectados para cada grupo isoladamente Grupos A B Comparação P* 20º vs. 1º < 0,001 20º vs. 5º < 0,001 20º vs. 10º < 0,001 20º vs. 15º < 0,001 15º vs. 1º 0,004 15º vs. 5º 0,021 15º vs. 10º 0,045* 10º vs. 1º 0,913 10º vs. 5º 0,997 5º vs. 1º 0,989 20º vs. 1º < 0,001 20º vs. 5º < 0,001 20º vs. 10º < 0,001 20º vs. 15º < 0,001 15º vs. 1º 1,84 15º vs. 5º 0,831 15º vs. 10º 0,987 10º vs. 1º 0,999 10º vs. 5º 1,000 5º vs. 1º 0,987 A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. vs. = versus. * Obtido por teste de Tukey 67 Na análise das parasitemias entre os grupos A e B foi identificado apenas correlação significativa após 15º e 20º de infecção (Tabela 3). Tabela 3- Valores de p* referentes às correlações entre as parasitemias dos grupos de camundongos A e B P* Comparação 1d A vs. B 0,991 5d 10d 15d 20d 0,967 0,828 0,02* <0,001 A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. d = dias após infecção. *= obtido por teste de Tukey. vs.= versus. 68 10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS A sobrevida (%) de todos os grupos de camundongos é demonstrada na figura 14. Os valores percentuais obtidos estão dispostos na tabela 4. Figura 14 - Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 69 Tabela 4 - Percentual de sobrevida de todos os grupos de camundongos de experimentação do presente trabalho SOBREVIDA (%) DIAS N A N B N C N D 0 75 100,00 75 100,00 75 100,00 50 100,00 1 75 100,00 75 100,00 75 100,00 50 100,00 2 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00 3 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00 4 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00 5 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00 6 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00 7 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00 8 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00 9 43 95,55 38 84,44 45 100,00 30 100,00 10 40 88,89 34 75,55 45 100,00 30 100,00 11 21 70,00 16 53,33 30 100,00 20 100,00 12 19 63,33 14 46,66 30 100,00 20 100,00 13 17 56,67 11 36,66 30 100,00 20 100,00 14 13 43,33 10 33,33 30 100,00 20 100,00 15 11 36,66 10 33,33 30 100,00 20 100,00 16 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00 17 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00 18 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00 19 3 20,00 5 33,33 15 100,00 10 100,00 20 3 20,00 4 26,66 15 100,00 10 100,00 (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 70 10.3. DOSAGENS PULMONARES 10.3.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ Na figura 15 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões dos grupos de estudo nos dias de eutanásia. Os valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 5 e os de p referentes às correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 6 e entre grupos na tabela 7. Figura 15 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 71 Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) nos pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção TEAC PULMÃO (mM/L) GRUPOS N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 10 1,01 ±0,25 10 0,94 ±0,12 10 0,94 ±0,03 3 0,70 ±0,35 2 1,298 ±0,001 B 10 1,12 ±0,24 10 1,20 ±0,17 10 0,89 ±0,17 3 0,86 ±0,10 2 2,00 ±0,11 C 10 1.24 ±0,08 10 1,12 ±0,02 10 0,84 ±0,10 10 0,89 ±0,23 10 0,91 ±0,07 D 10 0,84 ±0,38 10 0,86 ±0,03 10 0,67 ±0,07 10 0,68 ±0,07 10 0,56 ±0,06 Valores expressos como média±desvio-padrão. A= grupo de animais tratados com etanol 7,04% e infectados com Plasmodium berghei; B= grupo tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C= animais tratados com CAPE e não infectado com P. berghei; D= grupo Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 72 Tabela 6- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões, dentro dos subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º 0,667 0,959 0,002 0,125 20º vs. 5º 0,127 1,000 0,204 0.096 20º vs. 10º 0,189 O,113 0,938 0,909 20º vs. 15º 0,006 0,176 0,995 0,918 15º vs. 1º 0,013 0,251 < 0,001 0,731 15º vs. 5º 0,285 0,056 0,088 0,670 15º vs. 10º 0,452 1,000 0,994 1,000 10 vs. 1º 0,590 0,114 < 0,001 0,634 10º vs. 5º 1,000 0,009* 0,041 0,563 5º vs. 1º 0,377 0,880 0,719 1,000 * obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 73 Tabela 7- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões, entre os grupos de camundongos P* Comparação 1d 5d 10 d 15 d 20 d A vs. B 0,996 0,019 0,976 0,701 0,953 A vs. C 0,288 0,255 0,848 0,449 0,052 A vs. D 0,068 0,845 0,186 0,999 < 0,001 B vs. C 0,436 0,876 0,969 0,999 0,099 B vs. D 0,048 0,007 0,249 0,613 < 0,001 C vs. D < 0,001 0,090 0,403 0,349 0,006 *= obtido por teste de Tukey. vs.= versus. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 74 10.3.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na figura 16. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 8 e os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 9 e entre os grupos na tabela 10. Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 75 Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões de cada grupo de camundongos DPPH PULMÃO (mM/L) GRUPOS N 1dia N 5dias A 10 3,58 ±0,26 10 3,42 ±0,77 B 10 3,23 ±1,09 10 C 10 5,11 ±0,87 D 10 2,14 ±2,03 N 10dias N 15dias N 20dias 10 3,91 ±1,79 3 2,36 ±0,86 2 6,24 ±0,35 4,30 ±0,87 10 3,60 ±1,023 3 4,14 ±0,86 2 4,14 ±2,13 10 4,62 ±0,55 10 3,88 ±1,01 10 3,37 ±1,40 10 4,64 ±0,99 10 3,545 ±1,24 10 2,49 ±0,24 10 4,80 ±1,08 10 3,79 ±0,94 Valores expressos como média ± desvio-padrão. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 76 Tabela 9- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões, entre os subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º 0,021* 0,705 0,866 0,146 20º vs. 5º 0,009* 1,000 1,000 0,999 20º vs. 10º 0,067 0,947 0,537 0,741 20º vs. 15º 0,001* 1,000 0,101 0,471 15º vs. 1º 0,463 0,711 0,007* 0,004* 15º vs. 5º 0,557 0,999 0,116 0,350 15º vs. 10º 0,252 0,949 0,905 0,060 10º vs. 1º 0,983 0,961 0,100 0,805 10º vs. 5º 0,906 0,673 0,575 0,863 5º vs. 1º 0,998 0,199 0,839 0,234 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 77 Tabela 10- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões entre os grupos de camundongos P* Comparação 1d 5d 10d 15d 20d A vs. B 0,911 0,269 0,953 0,183 0,148 A vs. C 0,024 0,068 1,000 0,410 0,228 A vs. D 0,102 0,997 0,397 0,016 0,029 B vs. C 0,001 0,910 0,950 0,769 0,892 B vs. D 0,267 0,583 0,671 0,757 0,946 C vs. D <0,001 0,272 0,343 0,132 0,389 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 78 10.3.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico A figura 17 mostra a concentração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico nos pulmões dos grupos de camundongos ao longo dos dias de infecção. Os valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão dispostos na tabela 11 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de cada grupo estão contidos na tabela 12 e entre os grupos na tabela 13. Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 79 Tabela 11- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos, em função do tempo de infecção TBARS PULMÃO (nM/mL) GRUPOS N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 10 36,27 ±14,6 10 13,40 ±5,19 10 26,55 ±13,3 3 26,41 ±5,45 2 12,40 ±2,43 B 10 12,27 ±5,71 10 11,37 ±5,16 10 13,32 ±13,35 3 28,16 ±3,27 2 8,291 ±1,67 C 10 10,62 ±4,80 10 10,57±5, 44 10 25,65 ±17,72 10 25,56 ±19,85 10 19,48 ±8,18 D 10 42,21± 12,3 10 27,18 ±6,03 10 25,3 ±11,97 10 25,3 12,81 10 24,43 ±10,31 ± *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 80 Tabela 12- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º 0,037 0,981 0,399 0,101 20º vs. 5º 1,000 0,992 0,367 1,000 20º vs. 10º 0,509 1,000 0,735 1,000 20º vs. 15º 0,063 0,158 0,727 0,568 15º vs. 1º 0,625 0,173 0,024 0,004 15º vs. 5º 0,360 0,125 0,018 0,497 15º vs. 10º 1,000 0,08 1,000 0,497 10º vs. 1º 0,459 0,953 0,028 0,132 10º vs. 5º 0,183 0,979 0,022 1,000 5º vs. 1º <0,001 1,000 1,000 0,199 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 81 Tabela 13- Valores de p das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os grupos de camundongos P* Comparação 1d 5d 10d 15d 20d A vs. B <0,001 0,976 0,035 0,997 0,974 A vs. C <0,001 0,939 0,999 0,999 0,830 A vs. D 0,782 0,214 0,988 0,403 0,533 B vs. C 0,988 0,998 0,019 0,982 0,396 B vs. D <0,001 0,104 0,056 0,296 0,168 C vs. D <0,001 0,078 1,000 0,270 0,838 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 82 10.3.4. Estudo de para Amostras Pulmonares 10.3.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) versus Os gráficos de correlação entre TBARS e TEAC das amostras pulmonares dos grupos de estudos são demonstrados na figura 18. Esta contém a análise comparativa da correlação em cada grupo. Entre todos os grupos (r=-3148; p=0,0003) e no grupo C (r= -0,6780; p< 0,0001) foram identificadas correlações moderadas. Enquanto que os grupos A (r = -0,0139; p= 0,9429), B (r=-0,0932; p= 0,6180) , ou D (r=-0,2053; p=0,3471) não apresentaram correlação. r=-0,3148 p=0,0003 Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 83 10.3.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH A figura 19 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas amostras pulmonares dos grupos de estudos. Não foi observada nenhuma correlação nos grupos analisados. r=-0,1599 p=0,0737 Figura 19- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 84 10.3.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Parasitemia A figura 20 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras pulmonares e parasitemia dos grupos de camundongos infectados pelo P. berghei. Os gráficos apresentam a análise comparativa da correlação em cada grupo. Como pode ser observado, não houve correlação entre os parâmetros analisados. r=-0,1453 p=0,2765 Figura 20- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 85 10.3.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e Parasitemia A figura 21 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras pulmonares e Parasitemia dos camundongos. O gráfico apresenta a análise comparativa da correlação em cada grupo. Foi identificada uma correlação moderada (r= 0,3339; p= 0,104) na análise comparativa dos grupos A e B, assim como na análise apenas do grupo A (r= 0,4607 p= 0,0136) e ausência de correlação no grupo B (r= 0,1049 p= 0,5811). Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 86 10.3.4.5. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) e Parasitemia Na figura 22 consta os gráficos de correlação de TEAC nas amostras pulmonares e Parasitemia dos camundongos. Após análise foi identificado ausência de correlação pra todos os grupos (r= 0,1072; p= 4229), grupo A (r= 0,1931; p= 0,3343) e o B (r= 0,0272; p=0,8842). r=0,1072 p=0,4229 Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 87 10.4. DOSAGENS ENCEFÁLICAS 10.4.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ Na figura 23 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos dos grupos de estudo nos dias de eutanásia. Os valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 14 e os de p referentes às correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 15 e entre grupos na tabela 16. Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 88 Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção TEAC ENCÉFALO (mM/L) GRUPOS N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 10 0,772 ±0,10 10 0,588 ±0,07 10 0,530 ±0,11 3 0,555 ±0,14 2 0,699 ±0,16 B 10 0,811 ±0,10 10 0,578 ±0,03 10 0,573 ±0,12 3 0,671 ±0,11 2 0,761 ±0,17 C 10 0,947 ±0,23 10 0,705 ±0,13 10 0,584 ±0,08 10 0,527 ±0,06 10 0,769 ±0,16 D 10 0,293 ±0,08 10 0,417 ±0,02 10 0,408 ±0,06 10 0,376 ±0,14 10 0,499 ±0,02 (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 89 Tabela 15- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º 0,948 0,975 0,018 0,118 20º vs. 5º 0,794 0,210 0,816 0,926 20º vs. 10º 0,481 0,198 0,017 0,826 20º vs. 15º 0,728 0,912 <0,001 0,605 15º vs. 1º 0,085 0,472 <0,001 0,837 15º vs. 5º 0,995 0,810 0,028 0,978 15º vs. 10º 0,999 0,785 0,870 0,995 10º vs. 1º 0,004 0,002 <0,001 0,605 10º vs. 5º 0,899 1,000 0,263 1,000 5º vs. 1º 0,018 0,002* <0,001 0,526 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 90 Tabela 16- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de camundongos P* Comparação A B C D A vs. B 0,915 0,999 0,919 0,676 0,952 A vs. C 0,018 0,192 0,846 0,987 0,893 A vs. D <0,001 0,141 0,397 0,224 0,271 B vs. C 0,098 0,155 0,998 0,324 1,000 B vs. D <0,001 0,193 0,109 0,01 0,04 C vs. D <0,001 0,002 0,068 0,153 0,003 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 91 10.4.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na figura 24. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 17 e os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 18 e entre grupos na tabela 19. Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 92 Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos de cada grupo de camundongos. DPPH ENCÉFALO (mM/L) GRUPOS N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 10 1,89 ±0,37 10 0,83 ±0,26 10 0,91 ±0,27 3 1,85 ±0,67 2 1,67 ±0,35 B 10 1,30 ±0,29 10 0,94 ±0,37 10 2,00 ±0,85 3 1,69 ±0,73 2 2,94 ±0,70 C 10 2,08 ±0,20 10 1,86 ±0,39 10 2,04 ±0,70 10 1,84 ±0,58 10 2,17 ±0,67 D 10 0,98 ±0,22 10 1,26 ±0,37 10 2,09 ±0,45 10 1,59 ±0,32 10 1,43 ±0,31 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 93 Tabela 18- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º 0,984 <0,001 0,997 0,645 20º vs. 5º 0,190 <0,001 0,633 0,981 20º vs. 10º 0,330 0,049 0,979 0,232 20º vs. 15º 0,994 0,019 0,407 0,950 15º vs. 1º 1,000 0,765 0,768 0,276 15º vs. 5º 0,019* 0,157 0,998 0,719 15º vs. 10º 0,061 0,892 0,798 0,726 10º vs. 1º 0,002* 0,046 1,000 0,01 10º vs. 5º 0,998 <0,001 0,935 0,069 5º vs. 1º <0,001 0,521 0,906 0,915 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 94 Tabela 19- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os grupos de camundongos P* Comparação 1d 5d 10d 15d 20d A vs. B 0,059 0,967 <0,001* 0,976 0,028* A vs. C 0,853 <0,001* <0,001* 0,997 0,570 A vs. D 0,014* 0,400 <0,001* 0,964 0,938 B vs. C 0,017* <0,001* 0,999 0,989 0,083 B vs. D 0,701 0,642 0,990 1,000 <0,001* C vs. D 0,004* 0,125 0,998 0,979 0,039* *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 95 10.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico A figura 25 demonstra a concentração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico nos encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de análise. Os valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão dispostos na tabela 20 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de cada grupo estão contidos na tabela 21 e entre os grupos na tabela 22. Figura 25- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 96 Tabela 20- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção TBARS ENCÉFALO (nM/mL) GRUPOS N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias A 10 78,68 ±20,7 10 68,14 ±6,73 10 44,65 ±23,1 3 66,58 ±20,01 2 30,40 ±0,30 B 10 80,39 ±9,21 10 71,40 ±6.05 10 54,92 ±14,48 3 66,50 ±5,01 2 29,16 ±8,83 C 10 92,78 ±20,4 10 71,54 ±6,44 10 60,11 ±19,80 10 78,33 ±5,99 10 70,55 ±10,55 D 10 57,48 ±23,3 10 61,76 ±8,15 10 48,85 ±16,78 10 26,67 ±10,64 10 39,29 ±5,52 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 97 Tabela 21- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos P* Comparação A B C D 20º vs. 1º <0,001 <0,001 0,011 0,345 20º vs. 5º 0,011 <0,001 1,000 0,195 20º vs. 10º 0,735 0,076 0,552 0,865 20º vs. 15º 0,054 0,018 0,827 0,737 15º vs. 1º 0,716 0,624 0,267 0,018 15º vs. 5º 1,000 0,986 0,897 0,008 15º vs. 10º 0,216 0,766 0,103 0,163 10º vs. 1º <0,001 0,006 <0,001 0,882 10º vs. 5º 0,029 0,128 0,492 0,679 5º vs. 1º 0,549 0,691 0,022 0,992 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 98 Tabela 22- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os grupos de camundongos P* Comparação 1d 5d 10d 15d 20d A vs. B 0,995 0,965 0,562 1,000 1,000 A vs. C 0,140 0,966 0,190 0,648 0,003 A vs. D 0,045 0,891 0,964 0,003 0,883 B vs. C 0,285 1,000 0,883 0,643 <0,001 B vs. D 0,034 0,680 0,885 0,003 0,800 C vs. D <0,001 0,693 0,511 <0,001 0,003 *= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus. 99 10.4.4. Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas 10.4.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) versus Os gráficos de correlação de TBARS e TEAC das amostras encefálicas dos grupos de estudos estão demonstrados na figura 26. Esta contém a análise comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada correlação moderada na entre todos os grupos (r=-0,564; p= 0,0001), grupo B (r= 0,405; p= 0,0262) e C (r= 0,551; p= 0,0002). E ausência de correlação nos grupo A (r=-0,432; p= 0,215) e grupo D (r=-0,032; p= 0,8920). r=0,564 p<0,0001 Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 100 10.4.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH A figura 27 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas amostras encefálicas dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada ausência de correlação entre todos os grupos e na análise do grupo A, enquanto que o grupo B (r= 0,23; p= 0,031) apresentou correlação moderada, e o C (r= 0,23; p= 0,031) e o D (r= 0,18; p= 0,002) fraca. Figura 27- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). 101 10.4.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Parasitemia A figura 28 mostra os gráficos de correlação de TBARS de amostras encefálicas e parasitemia dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise comparativa da correlação em cada grupo. Observou-se que na comparação entre grupos (r=-0,4202; p= 0,0001) e no grupo A (r= 0,4048; p= 0,0293) há uma correlação moderada. O grupo B (r=-0,756; p<0,0001) possui uma forte correlação para os parâmetros analisados. r=-0,4202 p=0.0001 Figura 28- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 102 10.4.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e Parasitemia Os gráficos de correlação do DPPH e Parasitemia das amostras encefálicas dos grupos de estudos são demonstrados na figura 29. Esta contém a análise comparativa da correlação em cada grupo. Identificou-se após a análise que há correlação moderada para todos os grupos infectados (r= 0,3947; p= 0,002) e de forma isolada, o grupo A (r= 0,4491; P= 0,0112) e o B (r= 0,5302; p= 0,037). r=0,3947 p=0,002 Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 103 10.4.4.5. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) e Parasitemia A figura 30 mostra os gráficos de correlação da parasitemia e TEAC nas amostras encefálicas dos grupos de estudos. Os gráficos apresentam a análise comparativa da correlação em cada grupo. Não foi identificado correlação na análise entre os grupos e de forma isolada. r=-0,0166 p=0,8975 Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei. 104 10.4.5. Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica Na figura 31 estão presentes as fotos dos encéfalos demonstrando o comportamento da barreira hematoencefálica (BHE) nos grupos de estudos. Os grupos que apresentaram quebra da barreira através da impregnação da solução de azul de evans foram os grupos parasitados A após 10 dias de infecção e o B no 15º dia após de ser infectado. Os camundongos do grupo A de 20 dias não resistiram à injeção e/ou circulação da solução corante. 105 Grupo A A24h A5 dias A10 dias A15 dias Grupo B B24h B5 dias B10 dias B15 dias B20 dias C15 dias C20 dias Grupo C C24h C5 dias C10 dias Grupo D D24h D5 dias D10 dias D15 dias D20 dias Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da solução azul de evans 2% nos dias de eutanásia. 106 11. DISCUSSÃO Para avaliar o efeito do NF-kB sobre o estresse oxidativo gerado durante a malária cerebral e pulmonar experimental causada pelo P. berghei no presente trabalho foi utilizado o CAPE, inibidor específico do NF-kB, de acordo com procedimentos descritos no tópico de material e métodos. No decorrer da coleta das amostras foi feita a anotação dos óbitos para posterior análise da sobrevida. Enquanto que nos dias de eutanásia foram determinadas as parasitemias dos camundongos e avaliado a quebra da barreira hematoencefálica de todos os grupos. Em seguida para analisar o papel do estresse oxidativo no modelo proposto utilizou-se métodos que quantificam a peroxidação lipídica (TBARS), a capacidade antioxidante por meio da redução do radical ABTS+ (TEAC) e capacidade antioxidante através da redução do radical DPPH. Tais dados foram comparados entre si. A partir dos resultados obtidos observou-se que os grupos A e B, infectados, apresentaram um comportamento semelhante até o 10º dia após infecção. Porém, no 15º (p= 0,02) e 20º (p< 0,001) dia ocorreu uma diminuição significativa da parasitemia no grupo em que foi feito a inibição do NF-kB em comparação ao grupo A. Sugere-se que o fator de transcrição pode estar envolvido na reprodução do parasita no organismo murino. Pesquisas realizadas em cultura de células indicam que o NF-kB atua estimulando a produção de moléculas inflamatórias e de adesão na malária cerebral, sendo assim a presente pesquisa corrobora com o envolvimento do fator de transcrição, porém atuando na proliferação do parasita (Tripathi et al. 2006; 2009). No que tange a sobrevida, observou-se diferença percentual acentuada entre os grupos A e B a partir 10º dia de infecção, indicando que o CAPE antecipou a diminuição da sobrevida dos camundongos, comportamento que não se manteve ao longo do período após a infecção, já que no último dia de análise a diferença entre ambos foi de 6,66%. Resultados diferentes foram obtidos por Nacer et al. (2012), em semelhante experimento os camundongos eram levados ao óbito no quinto dia após infecção. 107 A discussão advinda dos resultados da sobrevida e a diminuição da parasitemia provocada pela a inibição do NF-kB corroboram com achados de Maguire et al. (2005), que observaram em pacientes com malária a presença da oclusão de vasos pulmonares devido ao sequestro de células vermelhas e brancas que promovem o impedimento da função da barreira alvéolo-pulmonar, desenvolvendo assim as complicações pulmonares após iniciado o tratamento e clearence parasitário. Dessa forma sugere-se que a complicação da doença não ocorra devido ao aumento efetivo do número de parasitas do organismo, e sim outros mecanismos de ação desencadeados pela presença do Plasmodium. Ao ser analisado o início de óbito no presente experimento foi identificado o mesmo para os grupos A e B, a partir do nono dia após infecção com parasitemia em torno de 45%, resultados que diferem de estudos realizados por Nacer et al. (2012), que fizeram experimentos utilizando mesmo tipo de camundongo infectado por P. berghei e morreram no quinto dia após infecção, porém com quase o dobro da quantidade de parasitas (80%). 11.1. ACHADOS PULMONARES No que diz respeito aos achados pulmonares, observou-se entre os subgrupos de cada grupo que os valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões que o grupo A apresentaramu uma diminuição no 15º dia (p= 0,013), seguido de um aumento no 20º dia (p= 0,006). Sugere-se a alteração inicial seja devido a presença do parasita estimulando o sistema imune a produzir radicais livres para combater o patógeno, consumindo a defesa antioxidante, seguido de um estímulo tardio na produção da defesa antioxidante (van de Crommenacker et al., 2012). Diante da inibição do NF-kB e a infecção pelo parasita, a capacidade antioxidante apresentou diminuição apenas do 5º para o 10º dia (p= 0,009), mantendo o estado redox nos outros dias analisados. Entretanto, na ausência do NF-kB, a diminuição da capacidade foi progressiva a partir do 5º dia (p= 0,041) indicando que o fator de transcrição pode estar envolvido na codificação de enzimas antioxidantes, como já citado por Kumar et al. (2004). Esses resultados diferem dos achados no grupo D, em que não foi observada alteração da capacidade antioxidante, indicando que a inoculação de 108 hemácias não promove alteração da ação antioxidante do organismo murino. Os dados dos grupos sugerem que a presença do parasita, do inibidor e do meio etanólico de diluição do fator promovem alterações na capacidade antioxidante. Esta quando analisada entre grupos foi identificado comportamento semelhante com relação aos grupos infectados (A e B) em relação ao grupo D (< 0,001) após 20 dias de infecção, ratificando a alteração redox na presença do parasita com níveis mais elevados de defesa com a inibição do NF-kB e infecção pelo Plasmodium (1,999 mM/L). No que diz respeito ao outro método de avaliação da capacidade antioxidante através da redução do radical DPPH, observou-se valores maiores da atividade antioxidante em longo prazo no grupo A após 20 dias de infecção (Tabela 6), resultado semelhante ao encontrado no uso do TEAC, corroborando com a ideia de indução de defesa antioxidante na presença do parasita de forma tardia. Já os grupos tratados com inibidor do NF-kB tiveram alteração da ação contra radicais após 15 dias de infecção de forma contrária, no C teve diminuição da capacidade antioxidante (p= 0,007), e no D a aumento (p= 0,004), indicando que o inibidor promova a diminuição da produção de defesa contra os radicais, resultado semelhante ao obtido no uso ABTS+, com antecipação da diminuição da atividade antioxidante no 10º dia, permanecendo o raciocínio de inibição da codificação de moléculas antioxidantes (Kumar et al., 2004). No grupo D ocorreu aumento da defesa antioxidante após 15 dias, sugerindo-se a presença de estresse oxidativos induzida pela inoculação de hemácias. O método utilizando o radical ABTS+ pareceu mais sensível com capacidade de detectar pequenas quantidades (0,0564 mM/mL) e adequado para a análise da atividade antioxidante dos diferentes grupos de estudo, já que através do mesmo pode se ter uma inferência mais racional dos resultados. Após 24h de experimento e análise utilizando o DPPH no grupo contendo só inibidor teve capacidade antioxidante mais elevada que os outros grupos em estudo, infere-se dessa forma que o tempo de tratamento não é suficiente para efetiva inibição do NF-kB. A referida elevação foi identificada no grupo A após 15 dias, sugerindo que o parasita possa induzir o estresse oxidativos e demanda de 109 defesa para o combate do mesmo, e após 20 dias de infecção o consumo das moléculas antioxidantes, diferente dos achados com o método utilizando o ABTS+, neste só foi identificado elevação no 20º dia, nos dois grupos infectados. Com relação à peroxidação lipídica, observou-se que ocorre diminuição da mesma após 5 (p > 0,001) e 20 (p= 0,037) dia de infecção nos camundongos infectados pelo P. berghei e tratados com o meio de diluição do NF-kB. Após 5 dias de infecção na presença apenas do inibidor os níveis de lipídios oxidados aumentaram (p< 0,05) sugerindo novamente que a inibição do NF-kB está relacionada com a expressão de antioxidante e consequente aumento da disponibilidade de radicais sobre ação nos lipídios. A inoculação de hemácias promoveu uma diminuição da peroxidação lipídica após 15 dias de inoculação da mesma (p= 0,004), sem alterações nos outros dias analisados. Acredita-se que essa diminuição seja devido à adaptação posterior às hemácias acrescidas no organismo do camundongo diminuindo assim a quantidade de lipídios oxidados. Na análise da oxidação de lipídeos do tecido pulmonar entre grupos observou-se que ocorreu uma inibição aguda da ação oxidativa (p > 0,001) nos grupos tratados com inibidor (Figura 17), indicando que o inibidor pode atuar impedindo a ação oxidativa promovida pela presença do parasita ou da hemácia. Na análise entre TBARS e TEAC foi observada correlação moderada negativa para todos os grupos (r = -0,3148; p< 0,003) e no Grupo C (r = -0,6780; p< 0,001), sugerindo-se assim que na inibição do NF-kB no organismo murino sem agente infeccioso a tendência de ocorrer um aumento da capacidade antioxidante promovendo assim a diminuição dos radicais endógenos, por isso a correlação é negativa. Na análise entre TBARS e DPPH não foi observada correlação significativa nos grupos infectados, assim como na comparação da peroxidação com a parasitemia. Já na correlação DPPH e parasitemia identificou-se correlação moderada entre os grupos A e B (r = 0,3339; p= 0,104) e na análise apenas do grupo A (r = 0,4607 p= 0,0136). Esses resultados sugerem uma tendência da elevação da 110 parasitemia promover maior produção de antioxidantes, comportamento também encontrado na análise isolada do grupo A, já que teve a referida correlação. Diferente da análise do método utilizando ABTS+, em que não houve correlação com a parasitemia. 11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS Nas análises do TEAC em cada grupo observou-se que a capacidade antioxidante teve diferença significativa nos grupos A e B, pois em ambos foi observado diminuição após 5 e 10 dias de infecção com relação ao primeiro dia. Sugerindo que na presença do parasita promova a diminuição da defesa antioxidante nos referidos períodos. No grupo C a diminuição foi semelhante aos grupos anteriores e se estendeu ao 15º e seguinte aumento no 20º dia após infecção. Alterações que ocorrem nesse grupo provavelmente devido à solução de etanol a 7,04% (Tabela 15). Os subgrupos do grupo D tiveram semelhante comportamento nas amostras encefálicas e nas pulmonares, ou seja, sem alteração da capacidade antioxidante através da redução do radical ABTS+. Indicando que a presença de hemácias não promove alteração da capacidade antioxidante ao longo da progressão da doença. Na análise da referida capacidade antioxidante entre grupos foi identificado que após 24h da infecção os grupos A e B (p= 0,915) apresentaram comportamento semelhante, ou seja, níveis elevados de TEAC devido à presença do parasita e/ou inibidor CAPE. Houve significância estatística entre os grupos A e C (p= 0,018) e entre A e D (p< 0,001), refletindo a diferença aguda da doença no grupo A com níveis de TEAC maiores que os do grupo de D e menores que o C, as alterações indicam que a presença do parasita induzir a capacidade em níveis menores de quando foi usado o inibidor de forma isolada no camundongo. Além desses resultados também foi constatado que valores significantemente elevados entre os grupos B (p< 0,001) e C (p< 0,001), em comparação ao D. Ou seja, a inibição do NF-kB após 1 dia de infecção promove elevação da capacidade antioxidante a níveis maiores que a capacidade de camundongos contendo o inoculo de hemácias. 111 Após 5 dias de infecção entre o grupo C e D (p= 0,002) ocorreu um aumento níveis de TEAC que pode ter sido ocasionado pela presença do inibidor. Este raciocínio também de aplica após 15 dias de infecção, porém na presença concomitante do parasita (B vs. D; p= 0,01). No 20º dia de análise observou-se que os dois grupos contendo o inibidor (B e C) tiveram elevadas concentrações de TEAC (p< 0,05) em comparação ao grupo inoculado com hemácia (D), assim esses resultados sugerem que a ausência da ação do NF-kB promova um aumento na capacidade antioxidante de forma aguda e tardia. No uso do outro método de capacidade antioxidante através da redução do DPPH observou-se que na análise dos subgrupos pertencentes ao grupo A ocorreu diminuição da defesa contra os radicais após dez dias de infecção. Resultados que diferem na análise entre 5º e 15º dias (p< 0,001) para o mesmo grupo, em que se identificou um aumento. Sugere-se que o aumento ocorra devido à ação oxidativa provocada pelo parasita em longo prazo induzindo a produção endógena de antioxidantes. Já o grupo B desenvolveu uma ação acentuada da capacidade antioxidante após 10 e 20 dias de infecção com relação aos outros dias de análise, esta que pode ter sido ocasionada devido à inibição do FT (Tabela 18). Já o aumento dessa capacidade foi identificado após 10 dias de injeção da solução de hemácias no grupo D (p= 0,01). Na avaliação entre grupos foi observado após 24h de infecção níveis semelhantes de redução do radical DPPH nos grupos A e C (p= 0,059), e elevados em comparação ao grupo D (Tabela 19). Elevação também observada no grupo tratado apenas com o inibidor em relação ao B. Dessa forma credita-se que os níveis elevados seja devido à ação etanólica em ambos os grupos e que a presença do parasita produzindo produz radicais que diminuem a disponibilidade de moléculas antioxidante. Este efeito também parece ter ocorrido no quinto dia após infecção quando comparamos os grupos contendo parasita com o que foi tratado apenas com o inibidor (p< 0,001). No dia seguinte de análise os grupos contendo inibidor e o D tiveram comportamento semelhante com níveis elevados de defesa antioxidante (p< 0,001). Os achados indicam que o NF-kB apesar de promover a codificação de 112 moléculas antioxidantes não é a principal via de produção das mesmas, porém é um fator de transcrição que se inibido diminui o comprometimento na malária. O uso crônico do inibidor promoveu aumento da atividade antioxidante na presença do parasita, assim como o uso do inibidor isolado em comparação ao grupo inoculado com hemácias (p< 0,001). Os grupos parasitados tiveram um comportamento diferente, quando na presença apenas do parasita observou-se maiores níveis de capacidade antioxidante (p< 0,028). Identificou-se com esses dados que o NF-kB pode ser uma via parcial da produção de antioxidantes. No que diz respeito à ação oxidativa sobre os lipídios encefálicos, identificou-se diferença significante entre os subgrupos do grupo A nas correlações seguintes: 1º e 20º dia (p< 0,001) após infecção, 5º e 20º dia (p= 0,011), 1º e 10º dia (p< 0,001) e 5º e 10º (p= 0,029). Todas as comparações refletem em uma diminuição da peroxidação lipídica que possa ter sido ocorrida devido o aumento da produção de antioxidante frente à presença do parasita no organismo dos camundongos. Comportamento semelhante foi observado no grupo B, porém com ausência de correlação entre 5º e 10º (p= 0,128), e presença entre 15º e 20º dia (p= 0,018), reforçando a suposição feita anteriormente. Essa mesma diminuição foi observadas nos grupos C e D em determinados períodos de infecção (Tabela 21). Essas reduções da peroxidação foram também notadas na análise entre grupos em diferentes períodos (Tabela 22). Resaltando que o grupo com hemácias teve as menores quantidades de peroxidação no primeiro dia após infecção se mantendo também no 15º dia de análise. Diferente do identificado no 20º dia, em que a peroxidação promovida pelo parasita parece ter sido neutralizada, já que os grupos infectados tiveram os menores níveis de MDA, assim como o grupo controle inoculado com hemácias. Diante da correlação dos parâmetros analisados foi observada correlação moderada positiva entre TBARS e TEAC para todos os grupos, B e no C. Dessa forma foi observado que na presença de lipídio oxidado deve haver produção de antioxidantes no tecido cerebral impedindo o dano oxidativo (Figura 26), principalmente na presença do inibidor. 113 Comportamento também observado na correlação entre peroxidação lipídica e a capacidade antioxidante através da redução do radical ABTS+, porém de forma moderada (r = 0,4339 e p= 0,0165) na presença do parasita e sem ação do NF-kB e fraca (r = 0,3092 e p= 0,0410) quando tratado apenas do o inibidor. Diferentes resultados foram encontrados na análise da parasitemia em comparação ao TBARS, pois ocorreu uma diminuição da peroxidação lipídica com o aumento da quantidade de parasitas. Esta relação foi fraca para os grupos infectados e de forma isolada no A, enquanto que no B foi forte, indicando que o inibidor promove a diminuição da ação oxidativa promovida pelo parasita. Em comparação ao DPPH, a parasitemia demonstrou correlação moderada em todas as análises realizadas. Sugerindo que no aumento da parasitemia ocorre o estímulo da capacidade antioxidante independente da presença do inibidor (Figura 20). Observou-se com relação à quebra da barreira hematoencefálica que a mesma ocorreu de forma mais precoce no 10º dia de infecção no grupo A infectado e sem tratamento com o inibidor, pois na presença do mesmo a quebra foi observada após 15 dias da infecção do camundongo e tratamento com o CAPE. Achados semelhantes aos observados por Baptista et al. (2010) que ao tratarem camundongos com pirimetamina observou a impregnação do tecido cerebral em torno do 13º ou 15º dia após infecção. No dia em que houve a quebra da barreira hematoencefálica no grupo A foi constado uma baixa concentração de defesa antioxidante utilizando o radical DPPH em comparação ao grupo com inibidor e infetado com P. berghei (p< 0,001). Sugerindo que o NF-kB não é a principal via de estimulação de defesa antioxidante e que este fator de transcrição pode está envolvido na codificação de outras moléculas envolvidas no agravamento da doença. No grupo B de 15 dias de infecção observou-se que a defesa utilizando o + ABTS se manteve em comparação ao grupo D (p= 0,01). Dessa forma, apesar de baixa em comparação ao início da análise acredita-se que a capacidade antioxidante pode ter contribuído no grupo B para o prolongamento da integridade 114 da barreira hematoencefálica, porém não suficiente para o impedimento total da disrupção da BHE. No que tange a ação oxidativa dos lipídios observou-se diminuição da peroxidação lipídica ao longo do período de análise nos grupos infectado. Com destaque para o primeiro dia, dessa forma essa ação oxidativa de lipídio parece fazer parte do processo inicial da doença, com níveis igualmente elevados nos grupos A (p= 0,045) e B (p= 0,034) em comparação ao D. Sugerindo que o inibidor não seja efetivo contra a ação oxidativa de lipídio, no entanto pode atuar no combate de outras formas de dano oxidativos, como a ação sobre DNA, carboidratos e proteínas (Ma et. al., 2010). Diferentes dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico encontradas no presente projeto, Omodeo-Salé et al. (2003) identificaram elevadas concentrações de peroxidação lipídica em células humanas infectadas pelo Plasmódio. 12. CONSIDERAÇÕES FINAIS Apesar das diferenças estatísticas encontradas não podemos afirmar que a inibição do fator de transcrição NF-kB ocorreu de forma efetiva. Esta análise será posteriormente realizada por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA) realizado para determinação da atividade do FT, através do “NF-kB Pathway Activation InstantOne™ ELISA” (eBiociensce®), projetado para determinar a proteína NFkB p65 (Ser536), IkB (Ser32/36), e Ikk (Ser176/180) em homogenado celular. 115 13. CONCLUSÕES Os achados referentes à parasitemia apontam que diante da inibição do fator de transcrição kappa B ocorre uma diminuição da parasitemia a partir do 10º dia de infecção dos camundongos sem alterar a sobrevida. A avaliação da inibição do NF-KB para os achados pulmonares apontaram para a inibição da ação oxidativa sobre os lipídios após 24h, diferente dos achados encefálicos em que tal inibição ocorreu em longo prazo. Os achados pulmonares apontam para uma ação aguda e em longo prazo da inibição do NF-kB promovendo aumento da capacidade antioxidante. Comportamento semelhante aos achados encefálicos. A inibição do NF-kB aumenta a capacidade antioxidante e diminui a ação oxidativa sobre lipídio nas amostras encefálicas. A avaliação da inibição do NF-kB demonstrou um efeito tardio da quebra da barreira hematoencefálica diante do impedimento da ação do NF-kB. A capacidade antioxidante prolonga a integridade da barreira hematoencefálica, mas sem ação efetiva contra a peroxidação de lipídeos. 116 14. REFERÊNCIAS ABDULJAWAD, S.H.; EL-REFAEI, M.F.; EL-NASHAR, N.N. Protective and antiangiopathy effects of caffeic acid phenethyl ester against induced 2 type 1 diabetes in vivo. International Immunopharmacology. p.1-7, 2013. AGUIAR, C. R.; FALCÃO, M. C.; RAMOS, J. L. A. Estresse Oxidativo no recémnascido: a bilirrubina como antioxidante. Revista Paulista de Pediatria, v. 24, n.4, p. 363-366, 2006. AKMAN-ANDERSON, L.; OLIVIER, M.; LUCKHART, S. Induction of Nitric Oxide Synthase and Activation of Signaling Proteins in Anopheles Mosquitoes by the Malaria Pigment, Hemozoin. Infection and Immunity Journal, v.75, n.8, p.4012–4019, 2007. ALVES, A.; MARTINS, A.; ADOLPHSSON, S.; BOCKORNY, B.; CARLETI, G.; CABRAL, G.; SOUZA, A.C.P.; VIANNA, A. Malária Grave Importada. Relato de Caso. 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Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,924 0,672 0,855 0,437* 0,798 0,572 0,803 0,758 0,773 0,790 0,772 0,101 0,758 0,803 0,045 0,067 0,690 0,871 Pulmão 1,189 1,016 0,819 1,104 0,655 1,344 1,049 1,394 0,977 1,410 1,096 0,247 0,987 1,305 0,318 0,477 0,510 1,782 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 2,458 1,307 1,864 1,514 2,322 1,643 2,043 1,629 1,764 2,208 3,373 3,316 3,488 3,831 1,064 4,596* 3,330 3,795 2,458 3,953 44,50 43,37 88,37 88,56 68,87 77,06 90,75 94,50 105,56 85,25 37,31 16,06 41,37 21,87 57,12 26,18 53,18 34,81 22,06 52,75 1,875 0,374 1,632 2,167 0,534 0,801 0,830 2,968 3,584 0,268 3,352 3,813 0,461 0,691 2,660 4,505 78,68 20,72 70,92 90,20 19,28 28,92 42,00 119,12 36,27 14,68 23,09 49,90 26,81 40,21 -17,12 90,12 132 APÊNDICE 2- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 1 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,792 0,839 0,864 0,810 0,832 0,904 0,986 0,358* 0,921 † 0,811 0,180 0,810 0,904 0,093 0,140 0,670 1,045 DPPH MDA Cérebro Pulmão Pulmão 0,977 1,061 0,607 1,425 1,333 1,197 1,295 1,145 0,995 † Cérebro 1,364 1,450 0,813 1,149 1,214 1,650 1,686 1,428 0,935 † Pulmão 3,581 3,223 2,058 2,680 3,652 2,866 1,514 4,703 4,761 † 76,43 67,93 72,75 76,81 77,31 86,37 93,12 34,37* 92,43 † 8,06 8,12 2,31 12,25 13,25 12,75 13,31 20,93 19,31 † 1,115 0,244 0,995 1,295 0,299 0,449 0,545 1,744 1,299 0,298 1,149 1,450 0,300 0,450 0,699 1,900 3,226 1,093 2,680 3,652 0,972 1,458 1,221 5,111 80,39 9,21 75,51 87,89 12,37 18,56 56,95 106,45 12,25 5,71 8,12 13,31 5,18 7,78 0,34 21,09 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta 133 APÊNDICE 3- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 1 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,853 1,251 0,739 1,191 0,871 1,366 0,775 1,232 1,102 1,344 1,129 1,230 0,912 1,089 1,123 1,179 1,369 1,235 0,596 1,314 0,947 0,230 0,794 1,118 0,323 0,485 0,309 1,604 1,243 0,082 1,201 1,298 0,097 0,146 1,054 1,445 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 1,836 0,549* 0,356* 1,893 2,215 3,209* 2,322 3,280* 1,965 2,251 2,080 0,206 1,911 2,242 0,330 0,496 1,415 2,738 66,87 69,75 63,87 104,68 105,18 104,00 83,43 111,43 121,93 96,68 92,78 20,43 73,17 105,06 31,89 47,83 25,33 152,89 4,131 5,933 6,362 5,283 5,061 5,898 4,067 5,411 5,204 3,760 5,111 0,873 4,364 5,776 1,412 2,118 2,245 7,895 14,31 6,18 10,56 18,56 6,18 16,31 4,31 10,25 ND 8,93 10,62 4,88 6,1875 14,31 8,12 12,18 -6 26,50 134 APÊNDICE 4- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 1 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,221 0,942 0,204 0,533 0,278 1,460 0,352 0,752 0,4005 0,533 0,292 0,085 0,221 0,352 0,130 0,196 0,025 0,548 0,844 0,384 0,533 0,942 0,408 0,612 -0,078 1,554 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão 1,149 0,685 0,928 1,149 1,686* 1,614 0,327 5,419 2,622 0,692 MDA Cérebro Pulmão ND 46,18 85,56 33,25 24,75 53,56 59,43 30,00 71,50 52,06 0,978 0,221 0,867 1,149 0,282 0,423 0,443 1,573 2,135 2,039 0,692 2,622 1,930 2,896 -2,203 5,519 57,48 23,38 46,18 71,50 25,31 37,96 8,21 109,46 42,21 12,31 32,43 52,43 20,00 30,00 2,43 82,43 135 APÊNDICE 5- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 5 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,625 ND 0,633 0,853 0,510 0,850 0,721 1,001 0,655 1,093 0,577 1,059 0,553 1,057 0,608 0,970 0,480 0,717 0,518 0,880 0,588 0,074 0,526 0,631 0,104 0,157 0,369 0,788 0,942 0,124 0,853 1,057 0,203 0,305 0,548 1,362 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 2,015* 0,420 1,035 0,799 0,670 1,056 1,278 0,556 0,892 0,727 3,009 2,823 3,552 2,622 4,525 3,852 4,339 3,709 2,058 3,738 96,68* 75,06 70,81 69,75 74,31 30,37* 64,56 64,68 54,50 71,43 17,18 ND 17,00 21,31 13,25 11,56 16,00 12,00 4,06 8,25 0,826 0,268 0,670 1,035 0,364 0,547 0,123 1,582 3,423 0,779 2,869 3,824 0,954 1,431 1,437 5,256 68,14 6,73 64,65 72,15 7,50 11,25 53,40 83,40 13,40 5,19 11,56 17,00 5,43 8,15 3,40 25,15 136 APÊNDICE 6- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 5 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,518 0,565 0,618 0,605 0,588 0,623 0,442* 0,546 0,554 0,590 0,578 0,035 0,554 0,605 0,051 0,076 0,477 0,682 DPPH MDA Cérebro Pulmão Pulmão 1,057 1.197 1,459 1,096 1,265 1,456 1,032 1,007 1,051 1,330 Cérebro Pulmão 1,049 1,049 1,629 0,663 1,121 1,064 0,885 1,764* 0,642 0,306 3,638 4,425 4,274 4,153 3,738 3,481 5,247 4,639 4,739 4,625 68,25 74,31 75,18 61,81 63,06 79,37 66,87 73,18 74,18 77,75 7,00 10,93 7,18 10,12 14,87 13,87 6,37 13,37 23,00 7,00 1,195 0,174 1,052 1,313 0,261 0,391 0,661 1,705 0,934 0,373 0,663 1,064 0,400 0,600 0,062 1,664 4,296 0,555 3,842 4,636 0,793 1,190 2,651 5,826 71,40 6,05 67,21 74,96 7,75 11,62 55,59 86,59 11,37 5,16 7,04 13,75 6,70 10,05 -3,00 23,80 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos 137 APÊNDICE 7- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 5 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,629 1,092 0,978 ND 0,534 0,985* 0,623 1,117 0,712 ND 0,673 1,125 0,667 1,101 1,024* 1,135 0,804 1,359* 0,727 1,169 0,705 0,127 0,629 0,727 0,098 0,147 0,482 0,874 1,123 0,027 1,105 1,132 0,027 0,040 1,064 1,173 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH MDA Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão 2,444 2,301 2,000 1,385 1,300 1,979 1,478 2,108 1,986 1,593 4,160 3,674 4,532 4,589 5,554 4,432 4,632 4,217 5,240 5,118 100,12* 76,87 98,06* 79,50 74,18 68,93 65,87 66,00 62,75 78,25 5,25 6,75 19,37 7,12 6,75 8,43 14,43 20,06 10,18 7,37 1,857 0,394 1,507 2,081 0,573 0,860 0,646 2,942 4,615 0,559 4,271 4,997 0,725 1,088 3,182 6,085 71,54 6,44 65,96 77,21 11,25 16,87 49,09 94,09 10,57 5,44 6,84 13,37 6,53 9,79 -2,95 23,17 138 APÊNDICE 8- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 5 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,449 0,386 0,420 0,541 0,445 0,417 0,029 0,403 0,433 0,029 0,044 0,359 0,477 Pulmão 0,922 1,366 0,544 0,852 0,603 0,857 0,326 0,603 0,922 0,319 0,478 0,124 1,400 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 0,942 1,793 0,992 1,521 1,042 4,553 5,111 2,301 3,288 2,494 24,5* 51,31 61,12 71,06 63,56 29,68 27,93 16,81 29,06 32,43* 1,258 0,378 0,992 1,521 0,529 0,793 0,198 2,315 3,549 1,243 2,494 4,553 2,059 3,089 -0,594 7,643 61,76 8,15 58,67 65,43 6,76 10,14 48,52 75,58 25,87 6,08 25,15 29,21 4,06 6,09 19,06 35,31 139 APÊNDICE 9- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 10 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,476 0,440 † 0,380 † 0,615 0,607 0,380 † † 0,529 0,111 0,449 0,613 0,163 0,245 0,204 0,859 Pulmão 1,118* 0,897 † 0,942 † 0,952 0,951 0,812* † † 0,936 0,026 0,931 0,951 0,019 0,029 0,901 0,981 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 0,677 0,971 † 0,613 † 1,307 1,135 0,763 † † 6,520 3,516 † 1,822 † 5,504 3,616 2,458 † † 29,68 14,00 † 82,12 † 39,62 53,06 49,43 † † 17,12 33,43 † ND † 42,56 30,43 9,18 † † 0,911 0,274 0,699 1,094 0,395 0,592 0,106 1,687 3,906 1,792 2,723 5,032 2,309 3,464 -0,741 8,497 44,65 23,18 32,17 52,15 19,98 29,97 2,19 82,13 26,55 13,31 17,12 33,43 16,31 24,46 -7,34 57,90 140 APÊNDICE 10- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 10 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,556 0,561 0,436 0,686 † 0,751 0,696 † 0,448 0,451 0,573 0,125 0,450 0,688 0,238 0,357 0,092 1,046 Pulmão 0,979 0,289* 0,966 1,083 † 0,918 0,961 † 0,746 0,560 0,887 0,175 0,832 0,972 0,140 0,210 0,621 1,183 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 0,870 ND 3,202 2,816 † 2,444 1,714 † 1,207 1,721 4,096 ND 4,553 4,732 † 3,953 3,288 † 2,086 2,444 52,00 40,93 55,56 67,50 † 63,68 36,50 † 44,25 78,93 3,56 ND ND 39,81* † 6,12 7,37 † 12,25 10,81 1,996 0,853 1,460 2,630 1,169 1,753 -0,292 4,383 3,593 1,023 2,866 4,324 1,458 2,188 0,677 6,513 54,92 14,48 43,42 64,64 21,21 31,82 11,59 96,46 8,02 3,52 6,12 10,81 4,68 7,03 -0,90 17,84 141 APÊNDICE 11- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 10 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,621 0,922 0,445 0,655 0,440 0,915 0,630 0,931 † † 0,534 0,776 0,630 0,713 0,636 0,878 0,687 0,925 0,626 0,888 0,584 0,089 0,534 0,636 0,102 0,154 0,379 0,791 0,845 0,103 0,776 0,922 0,146 0,219 0,557 1,142 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 1,600 1,164 1,907 2,701 † 2,479 1,085 3,109 1,721 2,544 3,867 2,715 5,140 3,087 † 3,702 4,289 2,344 4,811 4,997 36,31 37,75 61,43 75,93 † 66,68 69,37 78,12 31,68 83,75 9,43 41,81 37,31 8,68 † 5,87 52,06 7,87 30,31 37,50 2,035 0,708 1,600 2,544 0,943 1,415 0,184 3,960 3,883 1,015 3,087 4,811 1,723 2,585 0,502 7,396 60,11 19,80 37,75 75,93 38,18 57,28 -19,53 133,21 25,65 17,72 8,68 37,50 28,81 43,21 -34,53 80,71 142 APÊNDICE 12- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 10 dia de infecção. TEAC Animal 1 2 3 4 5 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ Cérebro 0,407 0,375 0,323 0,476 0,459 Pulmão 0,677 0,607 0,631 0,767 0,444* 0,408 0,062 0,375 0,459 0,084 0,126 0,248 0,585 0,671 0,070 0,625 0,700 0,074 0,111 0,514 0,811 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 2,501 1,407 1,922 2,472 2,122 2,522 2,801 2,222 4,467* 2,401 64,56 29,12 32,25 58,06 60,25 42,75 16,31 14,87 20,06 32,50 2,085 0,450 1,922 2,472 0,550 0,825 1,096 3,298 2,487 0,243 2,356 2,592 0,235 0,353 2,002 2,946 48,85 16,78 32,25 60,25 28 42 -9,75 102,25 25,30 11,97 16,31 32,50 16,18 24,28 -7,96 56,78 143 APÊNDICE 13- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 15 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão † † † † † † † † † † 0,724 1,064 † † 0,479 0,361 † † 0,460 0,671 0,554 0,147 0,470 0,602 0,131 0,197 0,272 0,800 0,698 0,352 0,516 0,867 0,351 0,527 -0,011 1,394 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão † † † † † † † † † † MDA Cérebro Pulmão † † † † † † † † † † 2,222 † 2,265 † 1,071 2,766 † 1,357 † 2,944 89,50 † 57,68 † 52,56 20,12 † 29,31 † 29,81 1,853 0,677 1,646 2,243 0,597 0,895 0,751 3,139 2,356 0,869 2,061 2,855 0,793 1,190 0,870 4,046 66,58 20,01 55,12 73,59 18,46 27,70 27,42 101,29 26,41 5,45 24,71 29,56 4,84 7,26 17,45 36,82 144 APÊNDICE 14- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 15 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro † † 0,765 0,546 0,703 † † † † † 0,671 0,112 0,625 0,734 0,109 0,164 0,460 0,898 Pulmão † † 0,765 0,977 0,843 † † † † † 0,862 0,107 0,804 0,910 0,106 0,159 0,645 1,070 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão † † † † MDA Cérebro † † Pulmão † † 0,842 2,208 2,008 † † † † † 3,180 4,875 4,346 † † † † † 71,06 67,31 61,12 † † † † † 30,62 24,12 29,75 † † † † † 1,686 0,737 1,425 2,108 0,682 1,024 0,400 3,132 4,134 0,867 3,763 4,610 0,847 1,271 2,492 5,882 66,50 5,01 64,21 69,18 4,96 7,45 56,76 76,64 28,16 3,52 26,93 30,18 3,25 4,87 22,06 35,06 145 APÊNDICE 15- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 15 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão 0,349* 0,519 0,532 0,557 0,570 0,850 0,440 0,807 0,513 0,688 0,639 1,072 0,457 1,120 0,497 1,003 0,547 1,114 0,541 1,064 0,526 0,059 0,497 0,547 0,049 0,074 0,423 0,622 0,879 0,230 0,718 1,070 0,352 0,528 0,189 1,599 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 0,756 2,158 2,229 2,429 1,478 1,993 2,308 2,179 1,936 0,928 1,471 3,066 1,214 4,239 ND 4,861 4,496 3,609 4,897 2,465 37,12* 73,18 78,81 89,43 75,12 83,12 58,62* 74,12 74,50 101,81* 51,75 44,12 37,25 48,62 38,06 7,31 7,68 7,31 7,31 6,18 1,839 0,587 1,593 2,217 0,623 0,935 0,657 3,153 3,369 1,405 2,465 4,496 2,030 3,046 -0,580 7,542 78,33 5,99 74,31 80,96 6,65 9,98 64,32 90,95 25,56 19,85 7,31 42,60 35,29 52,94 -45,63 95,55 146 APÊNDICE 16- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 15 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,149 0,321 0,411 0,537 0,460 0,376 0,148 0,321 0,460 0,139 0,209 0,112 0,669 Pulmão 0,705 0,734 1,110* ND 0,592 0,677 0,075 0,648 0,719 0,070 0,106 0,542 0,826 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 1,264 1,764 2,036 1,292 1,600 4,196 5,590 5,826 ND 3,581 19,68 29,18 85,81* 40,62 17,18 27,87* 14,12 11,81 ND 12,50 1,591 0,325 1,292 1,764 0,471 0,707 0,584 2,472 4,798 1,084 4,042 5,649 1,607 2,410 1,631 8,060 26,67 10,64 19,06 32,04 12,98 19,47 -0,41 51,52 12,81 1,18 12,15 13,31 1,15 1,73 10,42 15,04 147 APÊNDICE 17- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 20 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro Pulmão † † † † † † † † † † 0,813 1,285 † † 0,568 1,291 † † † † 0,699 0,161 0,642 0,756 0,114 0,171 0,471 0,927 1,288 0,004 1,286 1,289 0,003 0,004 1,282 1,294 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada †= Animal falecido antes do dia da coleta DPPH Cérebro Pulmão † † † † † † † † † † MDA Cérebro † † † † † Pulmão † † † † † 1,586 † 1,757 † † 5,983 ND 6,484 † † 30,25 † 29,81 † † 14,12 † 10,68 † † 1,671 0,121 1,629 1,714 0,085 0,128 1,500 1,843 6,234 0,353 6,109 6,359 0,250 0,375 5,733 6,734 30,03 0,30 29,92 30,14 0,21 0,32 29,59 30,46 12,40 2,43 11,54 13,26 1,71 2,57 8,96 15,84 148 APÊNDICE 18- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 20 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,568 † † † † 0,085 † † 0,801 0,911 0,760 0,174 0,685 0,856 0,171 0,257 0,428 1,113 DPPH Pulmão 1,071 † † † † ND † † 1,261 1,266 Cérebro ND † † † † 1,199 0,111 1,166 1,264 0,097 0,146 1,019 1,411 2,944 0,704 2,701 3,348 0,647 0,970 1,730 4,319 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada †= Animal falecido antes do dia da coleta 3,431 3,266 † ND 2,136 Pulmão 5,612 † † † † ND † † 5,118 1,693 4,141 2,134 3,406 5,365 1,959 2,939 0,466 8,304 MDA Cérebro Pulmão 34,93 6,37 † † † † † † † † 19,00 ND † † † † 33,56 9,06 ND 9,43 29,16 8,83 26,28 34,25 7,96 11,95 14,32 46,20 8,29 1,67 7,71 9,25 1,53 2,29 5,42 11,54 149 APÊNDICE 19- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 20 dia de infecção. TEAC Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ Cérebro 0,482 0,620 0,761 0,750 0,838 0,968 0,885 0,960 0,848 0,574 Pulmão 0,847 1,290* 0,894 0,850 0,900 0,906 1,014 0,841 0,929 1,032 0,768 0,164 0,652 0,876 0,223 0,335 0,317 1,211 0,913 0,069 0,850 0,929 0,078 0,118 0,731 1,047 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 1,621 1,764 1,807 2,065 2,780 3,595* 1,879 2,501 2,379 1,257 5,161 6,620 3,688 3,903 4,131 4,053 3,695 5,040 5,840 4,303 77,50 72,75 64,62 64,31 73,43 79,75 82,31 ND 72,75 47,56 43,68* 26,00 20,62 37,06 9,37 16,81 19,81 18,18 12,06 15,43 2,165 0,673 1,775 2,471 0,695 1,043 0,732 3,514 4,643 0,991 3,940 5,131 1,190 1,785 2,154 6,917 70,55 10,55 64,62 77,50 12,87 19,31 45,31 96,81 19,48 8,18 15,43 20,62 5,18 7,78 7,65 28,40 150 APÊNDICE 20- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 20 dia de infecção. Animal 1 2 3 4 5 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ TEAC Cérebro 0,571 0,624 0,474 0,622* 0,525 0,498 0,025 0,484 0,515 0,031 0,046 0,437 0,562 Pulmão DPPH Cérebro Pulmão MDA Cérebro Pulmão 0,571 0,624 0,474 0,622 0,525 1,528 1,149 1,135 1,893 1,457 3,974 4,811 2,708 4,303 2,751 36,37 33,50 41,25 46,06 76,18* 20,75 40,43 28,68 16,75 15,56 0,563 0,064 0,526 0,622 0,096 0,144 0,381 0,766 1,433 0,312 1,149 1,528 0,379 0,568 0,581 2,097 3,709 0,942 2,751 4,303 1,551 2,327 0,424 6,631 39,29 5,52 35,65 42,45 6,79 10,19 25,46 52,64 24,43 10,31 16,75 28,68 11,93 17,90 -1,15 46,59 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos 151 APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos dias de análise. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ 24h 0,143 0,172 0 0,146 0 0 0 0,178 0 0 ND 0 0,182 0 0,19 0,072214286 0,087376 0 0,1655 0,1655 0,24825 -0,24825 0,41375 5 dias 0,657 ND ND 1,778 1,86 ND 1,217 0,781 ND 1,48 2,09 0,594 ND 0,985 1,237 1,2679 0,524892 0,832 1,7035 0,8715 1,30725 -0,47525 3,01075 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta PARASITEMIA (%) 10 dias 15 dias † 15,5 1,78 15 1,837 13 † † 2,117 7,6 2,089 † 2,49 † † † 3,833* 6,7 1,543 † 1,66 † † † 1,821 † ND † 2,791 16,13 2,1961 12,32166667 0,690747 4,150568 1,79025 8,95 2,39675 15,375 0,6065 6,425 0,90975 9,6375 0,8805 -0,6875 3,3065 25,0125 20 dias 7,76 † † † † 40,408 † 69,212 † † † † † † 66,451 45,95775 28,58089 32,246 67,14125 34,89525 52,34288 -20,0969 119,4841 152 APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos dias de análise. Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Média DP Q1 Q3 DJ 2/3DJ Q1-3/2DJ Q3+3/2DJ 24h 0 0,541 0,264 0,137 0 0,098 0 0 0 0,152 0 0,181 0 0 0,488* 0,124066667 0,180054 0 0,1665 0,1665 0,24975 -0,24975 0,41625 5 dias 0,094 0,371 0,627 ND 8,309* ND 6,903* 2,3 2,787 1,255 2,414 1,151 ND ND 1,45 2,514636364 2,675074 0,889 2,6005 1,7115 2,56725 -1,67825 5,16775 DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta PARASITEMIA (%) 10 dias 15 dias 2,66 † 2,91 † 4,34* 0,99 3,12 2,4 ND 1,64 2,34 † ND † ND † 3,93 † 2,56 † ND † ND † 1,29 2,74 2,05 † ND ND 2,8 1,9425 0,928332 0,784023 2,34 1,4775 3,12 2,485 0,78 1,0075 1,17 1,51125 1,17 -0,03375 4,29 3,99625 20 dias 25,232 † † † † † 0,13 23,32 † † † † † † 24,266 18,236375 12,09779 17,52188 24,5075 6,985625 10,47844 7,043438 34,98594