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THOMAS GABRIEL MIKLOS “CONCENTRAÇÃO CONTAGEM DE SÉRICA FOLÍCULOS DO HORMÔNIO ANTRAIS ANTI-MÜLLERIANO COMO MARCADORES E DA RESPOSTA À ESTIMULAÇÃO OVARIANA CONTROLADA EM MULHERES COM INDICAÇÃO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO” Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Medicina. São Paulo 2012 THOMAS GABRIEL MIKLOS “CONCENTRAÇÃO CONTAGEM DE SÉRICA FOLÍCULOS DO HORMÔNIO ANTRAIS ANTI-MÜLLERIANO COMO MARCADORES E DA RESPOSTA À ESTIMULAÇÃO OVARIANA CONTROLADA EM MULHERES COM INDICAÇÃO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO” Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Medicina. Área de Concentração: Tocoginecologia Orientador: Prof. Dr. Nilson Donadio Co-orientador: Prof. Dr Mário Cavagna São Paulo 2012 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Miklos, Thomas Gabriel Concentração sérica do hormônio anti-Mülleriano e contagem de folículos antrais como marcadores da resposta à estimulação ovariana controlada em mulheres com indicação de fertilização in vitro./ Thomas Gabriel Miklos. São Paulo, 2012. Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Medicina (Tocoginecologia). Área de Concentração: Tocoginecologia Orientador: Nilson Donadio Co-Orientador: Mário Cavagna 1. Hormônio anti-Mülleriano 2. Inibinas 3. Hormônio folículo estimulante 4. Folículo ovariano 5. Indução da ovulação 6. Fertilização in vitro BC-FCMSCSP/09-12 Dedico este trabalho: Ao Prof Dr Nilson Donadio Além de Mestre, professor e orientador, um amigo que não poupou esforços em passar toda a sua sabedoria e experiência profissional e de vida à um discípulo, talvez o último, tratando-me como um filho que nunca teve. Ao meu Pai da Medicina Reprodutiva uma eterna gratidão. Obrigado! Ao meu Pai, Janos MIiklos ( in memoriam ) A palavra Pai é pouco para expressar tudo aquilo o que você foi para mim, um amigo das horas boas e más, um conselheiro, professor, ou um apenas ...Pai. Tudo o que sou hoje, é fruto desta relação tão íntima que formalmente durou até a sua partida, porém eterna e acredito que continua viva até hoje. Este trabalho é uma forma de manifestar minha gratidão ao seu esforço em preparar o filho para a vida, com muita seriedade, honestidade e garra. Obrigado Pai! A minha Mãe, Gabriella Com amor e paciência soube transmitir os ensinamentos que deram sustentação para seguir sozinho o caminho do nosso destino. Este trabalho representa a sua vitóra, a nossa vitória. Obrigado Mãe À minha esposa Ana Beatriz, Este trabalho só foi possível de ser realizado através da participação direta e indireta da pessoa que compartilhou cada momento da construção desta tese. Agradeço pelo estímulo, amor, paciência, sabedoria e dedicação. Obrigado, Bia Aos meus filhos, João Victor e Juliana Vocês são a maior motivação para o meu crescimento pessoal e profissional Meu desafio é ser para vocês, o que meu Pai foi para mim. Obrigado, Filhos AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao Prof. Dr. José Mendes Aldrighi, Diretor do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, uma referência na pesquisa, profissional sempre preocupado em incentivar o espírito acadêmico e científico em cada um de nós. Ao Prof.Dr. Nilson Donadio, Ex- Chefe da Clínica de Reprodução Humana e Infertilidade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, pelos primeiros passos no universo da medicina reprodutiva, acolhendo-me como um filho ou discípulo próximo, transmitindo seus ensinamentos, sempre priorizando a prática e o espírito científico, um exemplo de dinamismo onde o tempo parece não alcançar. Ao Prof. Dr. Mário Cavagna, Diretor da Divisão de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo exemplo pessoal, profissional, acadêmico e científico, abrindo as portas do serviço acima, permitindo que este trabalho fosse realizado. Ao Prof..Dr.Tsutomu Aoki, Chefe da Clínica de Reprodução Humana e Infertilidade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo pela amizade, exemplo profissional e pessoal, incentivo e oportunidade de chegar a este marco inesquecível da minha vida profissional. Ao Prof. Dr. Artur Dzik, Diretor do Núcleo de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, presidente da Sociedade Brasileira de Reprodução Humana (Biênio 2011-2012) pelo exemplo pessoal, profissional, acadêmico e científico, abrindo as portas do serviço acima, permitindo que este trabalho fosse realizado. Ao Dr Ricardo Manoel de Oliveira, Diretor da RDO – Diagnósticos Médicos, pela amizade, exemplo científico e apoio, sem o qual este trabalho não poderia ser realizado. Ao Prof. Dr. Gilberto da Costa Freitas, médico do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pela amizade, apoio e incentivo profissional e científico. À Profa. Dra. Nilka F. Donadio, médica do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pela amizade, apoio e paciência na correção da tese além do incentivo profissional e científico. Ao Prof. Dr. José Júlio de Azevedo Tedesco, ilustre e saudoso mestre que deixou marcas sempre vivas de profissionalismo, dedicação e ensinamentos de vida. Ao Prof. Dr. Sebastião Piato, pela sua dedicação, experiência e ensinamentos transmitidos ao longo destes anos. Ao Dr. Luiz Eduardo T. Albuquerque, pela amizade, apoio e incentivo profissional e científico. A Tiago Credencio Sales, biomédico, supervisor do laboratório de análises clínicas da RDO – Diagnósticos Médicos, pelas análises laboratoriais permitindo que este trabalho fosse realizado. A Cristiane Tenório Mussato, biomédica, analista do laboratório de análises clínicas da RDO – Diagnósticos Médicos, pelas análises laboratoriais permitindo que este trabalho fosse realizado. Aos Drs: Andrea M Sales, Fabíola Cesconeto, Ivaldo Baratella, Jonathas Borges Soares, Keila Patrícia Veludo, Lais Cristina Yasbeck, Marcelo Vieira, Renata Maria Scarabichi, Valéria da Silva, Vlamir Arcas, Yaron Hameiry médicos do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo apoio e auxílio nas atividades diárias, permitindo que este trabalho fosse realizado. Aos Drs: Ana Claudia Moura Trigo, Bruno Alex Cruz Maciel, Layza Ricco Merizio, Maria do Carmo Eserian, Maria Paula Barbedo Silveira, Georges B Kabouk, Miucha P Rios de Oliveira, Roberto Affonso Guimarães Justen, Samara Laham, Claudia Pacheco de Angelo, Fernanda Gutilla Gonçalves, James Kageyama Coelho, Juliana Miorin, Matheus S Medeiros e Thiago de Area Leão Brito, médicos estagiários do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo apoio e auxílio nas atividades diárias, permitindo que este trabalho fosse realizado. A Agnes Mayumi, Carolina Bueno Gomes, Christina Rumi Morishima, Juliana Andrietta, Thamara Braga Barrozo dos Santos e Maria de Lourdes dos Santos, biomédicas do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo apoio e auxílio laboratorial, permitindo que este trabalho fosse realizado. A Alzira Marques da Silva, Leonor Rosa Nery, Lindaura Alves da Silva, Niceia Ferreira dos Santos, Rosangela Oliveira Forni, Sueli do Espírito Santo e Tania Santos Santana, enfermeiras do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo apoio e auxílio nas atividades diárias, permitindo que este trabalho fosse realizado. A Graziela Buccini Bilestky e Tatiana G Santana de Medina, escriturárias do Serviço de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher - Hospital Pérola Byington, pelo apoio e auxílio administrativo, permitindo que este trabalho fosse realizado. Ao Sr. Daniel Gomes, secretário da Pós-Graduação pela dedicação a mim dispensado. Ao Sr Euro de Barros C Júnior, pela paciência e análises estatísticas. A Sra Marisa Coukier, professora de Português, na correção do texto deste trabalho. Aos Pacientes que participaram deste trabalho, pela confiança a que nos foi cedida e por tudo o que representam. A Santa Casa de Misericórdia, pela oportunidade manter acesa a chama do espírito acadêmico e científico. ABREVIATURAS AMH – Anti-Mülerian Hormone - hormônio anti-Mülleriano ART – Assisted Reproduction Technics - Técnicas de Reprodução Assistida BC - Beckman Coulter BHCG – Hormônio gonadotrófico coriônico – fração Beta BR – boa respondedora CDC - Center for Disease Control CFA – contagem de folículos antrais CFM – Conselho Federal de Medicina DSL – Diagnostic Systems Laboratories E2 – Estradiol EFORT – Exogenous FSH Ovarian Reserve ELISA – Enzime Linked Immunosorbent Assay - Ensaio de Imunoadsorção EOC – Estimulação Ovariana Controlada ESHRE - Europian Society of Human Reproduction and Embryology FDA – Food and Drug Administration FIV – Fertilização “in vitro” FSH – Hormônio Folículo Estimulante GAST – GnRH Agonist Stimulation Test GnRH-a – Análogo Agonista do Hormônio Liberador das Gonadotrofinas HCG – Gonadotrofina Coriônica Humana HMG – Gonadotrofina de Mulher Menopausada ICMART - International Committe for Monitoring Assisted Reproductive Technology ICSI – Injeção Intracitoplasmática de espermatozóides IMC – Índice de massa corpórea ISCA – Infertilidade sem causa aparente Kg – quilograma L – Litro LA – Acetato de Leuprolida LH = Hormônio luteinizante Ligado à Enzima mcg – micrograma mg – miligrama MIF – Müllerian Inhibiting Factor MIS – Müllerian Inhibiting Substance mL - mililitro MR = má respondedora ng – nanograma NR – normorrespondedora OMS – Organização Mundial da Saúde pg – picograma pmol – picomol PR – pobre respondedora REDE – Red Latinoamericana de Reproducción Assistida ROC – Receiver Operating Characteristc SHO – síndrome do hiperestímulo ovariano SSP – Statistical Package for Social Sciences TGF – Transforming Growth Factor UI – Unidade Internacional USGTV – ultrassonografia transvaginal SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO....................................................................................... 1 2. OBJETIVO..............................................................................................24 3. CASUÍSTICA E MÉTODO......................................................................26 3.1 – Casuística.......................................................................................27 3.2 – Método ...........................................................................................27 3.3 – Provas hormonais ..........................................................................29 3.4 - Avaliação ecográfica .....................................................................30 3.5 – Método estatístico..........................................................................31 4. RESULTADOS.......................................................................................32 5. DISCUSSÃO...........................................................................................43 6. CONCLUSÃO.........................................................................................56 7. ANEXOS.................................................................................................58 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................68 FONTES CONSULTADAS.....................................................................76 RESUMO.................................................................................................78 ABSTRACT.............................................................................................80 LISTAS e APÊNDICES...........................................................................82 1 – INTRODUÇÃO 2 Em 2010, aos 85 anos de idade o ilustre pesquisador britânico professor Robert Geoffrey Edwards, foi consagrado com o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia por seus estudos na medicina reprodutiva em particular a fertilização in vitro (FIV). Robert Edwards e o médico Patrick Steptoe após 15 anos de trabalho juntos, foram recompensados com o nascimento de Louise Joy Brown em julho de 1978 em Oldham, Inglaterra, obtida pela FIV com captação de oócitos via laparoscópica em um ciclo natural. No Brasil, destacaram-se Milton Nakamura com o primeiro nascimento de um bebê por da FIV na América Latina, em 1984, Ana Paula Caldeira no estado do Paraná. Simultaneamente Nilson Donadio relatou em congressos médicos que havia obtido o nascimento de um bebê, alguns meses antes, tendo sido mantido em sigilo em decorrência de imposição ética da Congregação da Santa Casa de São Paulo (Amaral, 2009; Pereira, 2011). A infertilidade afeta 15% a 20% dos casais na idade reprodutiva. Nas últimas décadas tem havido uma tendência de diminuição das taxas de fertilidade em função do aumento da idade das mulheres atribuída principalmente à educação e à participação no mercado de trabalho, priorizando o sucesso e realização profissional em detrimento da maternidade. O desejo de gestação surge por volta dos 35 anos, idade que coincide com o começo da diminuição da taxa de gestação. 3 Segundo o International Committe for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART), entidade internacional que monitora os resultados dos tratamentos em reprodução assistida de 54 países em suas 1709 clínicas, analisando os resultados no ano de 2003, num total de 439 632 ciclos observaram que 34,1% foram em pacientes entre 35 anos e 39 anos e 14,6% acima de 40 anos ou seja, 48,7% ocorreram em mulheres acima dos 35anos (Nygren et al.,2011). Nos Estados Unidos, no ano de 2009, segundo dados da Center for Disease Control (CDC) em sua divisão para a saúde reprodutiva, fornecidos pelas 441 clínicas, foram realizados 101 090 ciclos de alta complexidade, sendo 58 706 em pacientes acima de 35 anos de idade. Conforme publicação da Red Latinoamericana de Reproducción Asistida em 2008 nos seus 140 centros de 11 países, num total de 25 898 procedimentos de FIV e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), 56,7% foram em pacientes acima de 35 anos. No ano de 2000 este percentual era de 49,1%. Faddy et al.(1992) apresentaram a hipótese de que a mulher entraria na menopausa com 1000 folículos, isso ocorreria aproximadamente aos 51 anos de idade. Sugeriram que 13 anos antes da idade da menopausa, a mulher apresentaria 25000 folículos, idade que marca o ponto crítico do início da queda do número de folículos ou seja, o aumento acelerado da atresia folicular seguido portanto da queda da fertilidade, que na média corresponderia a uma idade de 37,5 anos a 38 anos 4 Entre as pacientes que se submetem à FIV existem aquelas que respondem de forma inadequada à estimulação ovariana controlada (EOC) resultando em baixa produção de folículos e consequentemente de oócitos e embriões, comprometendo assim o sucesso da FIV. Essas pacientes passaram a ser chamadas de pobres respondedoras (PR) ou más respondedoras (MR). Segundo a literatura a incidência de PR oscila entre 5% a 18% (Scott et al.,1996; Schoolcraft et al.,1997; Moreno et al.,1998; Franco Jr et al.,2000). Pacientes PR quando submetidas à FIV, apresentam taxas cumulativas de gestação de 7%, 13% e 23% para o primeiro, segundo e terceiro ciclo respectivamente. Entretanto pacientes normorrespondedoras (NR) apresentam taxas cumulativas de gestação de 39%, 58% e 70% para o primeiro, segundo e terceiro ciclo de FIV respectivamente (Ferrareti et al.,2000). Para entender melhor a influência da idade nos resultados de FIV, foram analisados 9644 ciclos de EOC em pacientes em programação de FIV entre janeiro de 1993 e dezembro de 2001. Estas mulheres foram divididas em dois grupos: acima de 37 anos e abaixo ou igual a 37 anos. Cada grupo foi subdividido em mais dois subgrupos: mulheres com mais de cinco oócitos captados e outro com menos de cinco oócitos captados. Concluíram que jovens PR apresentavam a mesma taxa de gestação que NR de idade mais avançada, e que PR jovens apresentavam melhores resultados do que PR de idade avançada. Estes resultados devem-se ao fato de que a pouca idade protege ou diminui o número de aneuploidias e abortamentos, melhorando as taxas de implantação e gestação. Essas pacientes jovens PR apresentavam um prognóstico mais favorável frente à EOC, onde apesar 5 de responderem com menos oócitos, estes eram de melhor qualidade (De Sutter et al.,2003). Logo como apontado acima, a idade das pacientes é um importante fator de influência no sucesso do tratamento de infertilidade. Mais importante do que a idade cronológica é a idade biológica dos ovários, refletindo a reserva folicular. Desta forma fica claro o impacto tanto em números absolutos como relativos da incidência de PR no universo da medicina reprodutiva, bem como a influência da idade da mulher no sucesso do FIV. Surge assim a necessidade de identificar as pacientes PR antes de iniciar um procedimento de alta complexidade, custo elevado, invasivo, sujeito a repetições, além dos riscos inerentes às técnicas de reprodução laboratorialmente assistida, e com resultado pouco satisfatório, estabelecendo-se testes para a avaliação da reserva ovariana. Dispomos de vários testes para avaliação da reserva ovariana, sendo os principais: 1. Testes estáticos 1.1 Hormônio anti-Mülleriano (AMH) 1.2 Hormônio folículo estimulante (FSH) 1.3 Estradiol (E2) 1.4 Inibina B 6 2. Testes dinâmicos 2.1 Teste do Citrato de Clomifeno ( Challenge Teste de Navot ) 2.2 Teste de estimulação do GnRH-a ( GnRH Agonist Stimulation Test – GAST) 2.3 Teste de estimulação com FSH ( Exogenous FSH Ovarian Reserve Test – EFORT) 3. Exames de imagens 3.1 Contagem de folículos antrais (CFA) 3.2 Volume ovariano Estudos de Muasher et al.(1988) mostraram a associação do FSH basal com a diminuição das taxas de gestação. Segundo Scott et al.(1989) as taxas de gestação são mais altas em mulheres com FSH basal 15 UI/L e inferiores a 5% naquelas com FSH basal 25UI/L. Segundo o I Consenso Brasileiro de Indução de Ovulação em Reprodução Assistida, o FSH baixo (15 UI/L), moderado (15 a 24,9 UI/L) e elevado (25 UI/L) estariam associados a decrescentes taxas de gestação, 17%, 9,3%, e 3,6% respectivamente (Franco Jr et al.,2000). No II Consenso Brasileiro de Indução da Ovulação, os autores relacionaram os valores basais de FHS > 10 UI/L, estradiol plasmático >80 pg/mL e Inibina B < 45 pg/mL, como preditores de baixa resposta ovariana (Tognotti et al.,2008). 7 Com o objetivo de entender o FSH como preditor de PR e falha de gestação após FIV, foi realizado um estudo de meta-análise. Pesquisaram-se artigos que correlacionavam FSH basal a PR e/ou gestação pós FIV. No total de 843 artigos apenas 11 correlacionavam FSH basal e PR e 18 com gestação pós FIV. Este estudo concluiu que a concentração de FSH basal é um marcador relativo para estimar PR e inadequado para estimar falha de gestação. Alteração na concentração de FSH basal é apenas um sinal e não um diagnóstico definitivo de diminuição da reserva ovariana (Bancsi et al.,2003). A concentração sérica de E2 no terceiro dia do ciclo menstrual seria um método complementar para avaliar a reserva ovariana. Licciardi et al.(1995) correlacionaram a elevação dos níveis de E2 sérico à diminuição das taxas de gestação. Valores de E2 abaixo de 30pg/mL promoveram uma taxa de gestação de 23% e implantação de 13,9%; E2 entre 30pg/mL e 75pg/mL associado à taxa de gestação de 18,5% e implantação de 12,4%, e E2 acima de 75 pg/mL à taxa de gestação de 10,2% e implantação de 6,3%. Estradiol basal acima de 80 pg/mL apresentaria altas taxas de cancelamento do ciclo e menores taxas de gestação, independentemente dos valores de FSH basal. No I Consenso Brasileiro de Indução da Ovulação em Reprodução Assistida, níveis de E2 50 pg/mL foram associados ao baixo prognóstico de gestação (Franco Jr et al.,2000). A inibina B é produzida diretamente pelas células da granulosa dos folículos antrais enquanto que a inibina A é secretada pelo folículo pré-ovulatório e corpo lúteo. Com o aumento da idade temos um menor número de folículos antrais, portanto baixa concentração de inibina B, o que leva a um aumento de 8 FSH (Nahás et al.,2002). Segundo Seifer et al.(1997) níveis basais de inibina B menores que 45pg/mL, apresentavam altas concentrações de FSH, baixas taxas de gestação e resposta inadequada à indução da ovulação. Os autores Dzik et al.(2000) propuseram um teste dinâmico para a avaliação da reserva ovariana, correlacionando os valores de inibina B à estimulação de FSH exógeno. Selecionaram pacientes com média de idade de 34 anos e sem doenças ovarianas que promovessem distúrbios da fertilidade. Foram dosados FSH, E2 e inibina B no 3º dia do ciclo menstrual. As pacientes receberam 300UI de FSH com nova amostra de sangue 24 horas após, e avaliou-se a variação destas dosagens. Foi realizado o protocolo longo com EOC com 225 UI a 300 UI de hMG e 10 000UI de hCG quando pelo menos dois folículos atingissem o diâmetro de 18 mm, seguindo-se a aspiração folicular de oócitos e a transferência de embriões de forma convencional. Foram selecionadas 32 pacientes, das quais 19 foram denominadas boas respondedoras (BR) e 13 como MR. A média da variação da inibina B no grupo BR e MR foi respectivamente 202,7 pg/mL e 49,01 pg/mL. As pacientes BR tiveram como média de inibina B pré e pós-estímulo respectivamente 121,01pg/mL e 323,71 pg/mL. De forma semelhante os resultados das MR foram respectivamente 70,6 pg/mL e 119,62 pg/mL, concordantes com os trabalhos de Seifer et al.(1999). Após este estudo, os autores sugeriram alterar o valor de corte de inibina B utilizado como fator prognóstico para técnica de reprodução assistida (ART), de 45pg/mL para 70pg/mL. Os autores concluíram que a variação de inibina B em 24 horas frente ao teste de estímulo ovariano com FSH 9 é superior à dosagem de FSH basal, inibina B basal, E2 basal e portanto mais adequado no screening de pacientes MR. O teste do citrato do clomifeno foi desenhado por Navot et al.(1987) como método de screening para avaliação da reserva ovariana em mulheres acima dos 35 anos com FSH normal; descrito originalmente para avaliar índices de gestação espontânea. Consiste na administração de 100 mg/dia de citrato de clomifeno do quinto ao nono dia do ciclo com avaliação do FSH no terceiro e décimo dia do ciclo. Quando a soma dos valores de FSH do terceiro e décimo dia fossem maiores a 26 mUI/mL, o teste seria considerado alterado (Franco et al.,1999). Posteriormente este teste também foi utilizado para avaliação da reserva ovariana em pacientes a serem submetidas à ART, confirmando a sua validade. O teste foi definido como anormal quando a soma dos valores de FSH do terceiro e décimo dia fossem superiores a 26 mUI/mL, com taxa de gestação neste grupo próximo a zero (Loumaye et al.,1990). Os autores Tanbo et al.(1992) demonstraram maior eficiência do teste do clomifeno para avaliação da reserva ovariana do que o FSH basal. Encontraram valor preditivo do teste do clomifeno de 85% para cancelamento do ciclo por má resposta ovariana e 100% para a não ocorrência de gestação. Numa população infértil, Scott et al.(1993) observaram que a incidência do teste do clomifeno anormal foi < 3% em mulheres abaixo de 30 anos; 7% em mulheres entre 30 anos e 34 anos; 10% entre 35 anos e 39 anos e 26% em acima de 40 anos. 10 Franco et al.(2002) realizaram o teste do clomifeno em 26 pacientes com idade superior a 30 anos com quadro de infertilidade a pelo menos um ano. Posteriormente foram submetidas à EOC para FIV. O teste apresentou sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo de 50%,100%,100% e 81,8% respectivamente. Considerando-se a dosagem única de FSH no terceiro dia com valores >10 UI/mL, para predizer a má resposta ovariana, a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo foi de 87, 100, 100 e 94,7% respectivamente. Este trabalho mostrou que a sensibilidade do teste do clomifeno foi inferior que a dosagem do FSH basal, mesmo assim apresenta boa sensibilidade e especificidade para avaliação da reserva ovariana. O teste de estimulação do GnRH-a ( GnRH Agonist Stimulation Test – GAST) utiliza o efeito flare-up do GnRH-a, ou seja a hiperestimulação de gonadotrofina endógena a partir da ligação do agonista do GnRH ao seu respectivo receptor hipotalâmico. Consequentemente há a estimulação folicular e produção de E2. O teste consiste na administração de acetato de Leuprolide (LA), um análogo agonista do GnRH (GnRH-a), na dose de 1 mg por dia no segundo, terceiro e quarto dia do ciclo, com dosagens de E2 nesses dias. De forma semelhante Padilla et al.(1996) propuseram o Teste do Leuprolide (Lupron Test) em que se corrige a dose do análogo conforme o peso da paciente, dose de 0,75 mg de LA para aquelas com peso < 75 kg e 1,0mg para pacientes com peso > 75 kg. A análise da curva de E2 define quatro padrões de resposta, como tentativa de predizer o número de oócitos e taxa de gestação em ART. No padrão A temos um aumento imediato dos níveis de E2 com pico no quarto dia do ciclo. O padrão B apresenta uma demora no aumento dos níveis de E2 com pico no sexto dia do ciclo. Ambos os padrões apresentaram 11 boa taxa de gestação e reserva folicular. No padrão C observaram um crescimento lento e persistente do E2 associado a uma baixa taxa de gestação O padrão D não apresentava crescimento de E2 isto é, ausência do efeito flare-up. Este padrão apresentava baixas taxas de gestação e altas taxas de cancelamento do ciclo. As PR apresentavam um padrão dos tipo C e D (Padilla et al.,1996). Testes com resultados normais apresentaram uma taxa de cancelamento da EOC de 2% contra 87% para testes alterados. Os autores sugerem que todas as pacientes a serem submetidas à FIV deveriam realizar o teste acima e não apenas aquelas com história familiar de menopausa precoce (Ferraretti et al.,2000). O teste de estimulação com FSH ( Exogenous FSH Ovarian Reserve Test – EFORT) proposto por Fanchin et al.(1994) consiste na mensuração das concentrações basais de FSH e E2, seguida da administração de no mínimo 300 UI de FSH e nova avaliação hormonal após 24 horas da aplicação da gonadotrofina. Definiu-se como exame normal quando após 24 horas obteve-se um aumento de FSH < 11 mUI/mL e E2 > 30 pg/mL. O teste alterado foi associado em 81% dos casos em uma média de 2 oócitos captados contra 12 oócitos em 90% das pacientes com teste normal. O volume ovariano é um marcador ecográfico para avaliação da reserva ovariana. Os autores Lass et al.(1997) avaliaram o volume ovariano basal em pacientes que seriam submetidas à EOC para FIV. Encontraram volume médio de 6,3 cm3. Essas pacientes foram separadas em dois grupos: com volume menor e outro maior ou igual que 3 cm3. As pacientes com volume ovariano menor que 3 12 cm3 apresentaram pior resposta à EOC com uma taxa de cancelamento de ciclo maior que 50%, porém as taxas de gestação e fertilização não demonstraram alterações estatisticamente significativas quando comparadas ao outro grupo. Pesquisadores brasileiros também avaliaram o volume ovariano em pacientes a serem submetidas à FIV, encontrando resultados semelhantes aos de Lass et al.(1997). A taxa de cancelamento e número de folículos recrutados naquelas com volume ovariano < 3 cm3 foi de 52% e 4,66 0,7 folículos respectivamente. Em pacientes com volume ovariano 3 cm3 a taxa de cancelamento foi de 21% e o número de folículos recrutados de 9,5 0,3 folículos (Amaral et al.,2002). A literatura tem mostrado a importância do papel do hormônio antiMülleriano (AMH) como fator prognóstico da reserva ovariana em pacientes submetidas a FIV. O AMH é também chamado de MIS (Müllerian Inhibiting Substance ) ou ainda MIF ( Müllerian Inhibiting Factor). Descoberto desde 1940, o AMH é uma glicoproteína monomérica de 560 aminoácidos, codificada por um gen localizado no braço curto do cromossomo 19, peptídeo este pertencente à grande família TGF-B (Transforming Growth Factor). Sua ação é bem conhecida no processo de diferenciação sexual masculina, quando ainda na vida fetal, sob o controle do gene sry localizado no cromossomo Y, é secretado pelas células de Sertoli. Promovem a regressão do Ducto de Müller e consequentemente estruturas derivadas desta: o útero, trompas e terço proximal da vagina. Durante a diferenciação sexual feminina o AMH não é expresso no ovário. O AMH é expresso pela primeira vez nas células da granulosa quando do recrutamento 13 dos folículos primordiais para primários, intraútero, a partir da 36 semana de gestação (Lindenman et al.,1997; Gruijters et al.,2003; Weenen et al.,2004; Oppelt et al.,2005; Visser et al.,2005). A partir da puberdade observa-se um aumento importante dos níveis séricos do AMH, permanecendo estável até a sua diminuição devido à exaustão do patrimônio folicular chegando a ser indetectável na menopausa (La Marca et al.,2006). Por meio do estudo da imuno-histoquímica da histologia do tecido ovariano de mulheres ooforectomizadas, usando marcador específico para AMH, observou-se inicialmente a expressão do AMH em folículos primários, porém mais fortemente identificadas nas células da granulosa de folículos pré-antrais e folículos antrais pequenos de até 4 mm de diâmetro. Nos folículos de 6mm a 8 mm a expressão do AMH diminuía tornando-se indetectável nos folículos maiores ou iguais a 10mm ou em folículos atrésicos. Este trabalho observou portanto a presença do AMH em folículos FSH - dependentes permitindo novos estudos do papel do AMH no processo de recrutamento folicular (Weenen et al.,2004). Para melhor entender a função do AMH na foliculogênese, analisou-se folículos de camundongo em cultura na presença de FSH e associação de FSH com AMH. Quando adicionado AMH exógeno observou-se que havia inibição do crescimento dos folículos pré-antrais. Os mesmos autores estudando agora folículos de camundongos recém nascidos em cultura com e sem AMH, concluíram que o AMH é um potente inibidor do recrutamento de folículos 14 primordiais; observaram que a cultura com AMH apresentou 40% menos folículos em crescimento quando comparado ao grupo controle (Durlinger et al.,2002). O AMH diminuiria a sensibilidade destes folículos ao FSH, reduzindo a proliferação das células da granulosa, a expressão da aromatase e o número de receptores de LH. O AMH possibilitaria controlar o número de folículos préantrais grandes e folículos antrais pequenos que continuam a crescer até alcançarem o estágio pré-ovulatório. O AMH teria como função modular a seleção e crescimento folicular bem como proteger o patrimônio folicular (Durlinger et al.,2002). Para avaliar a variação intracíclica do AMH, La Marca et al.(2006) estudaram os níveis séricos de AMH de 20 pacientes e observaram que estes se mantinham quase constantes durante o ciclo menstrual, assim os autores concluíram que sua variabilidade intracíclica não era estatisticamente significante. Para avaliar as alterações das dosagens hormonais entre ciclos menstruais ou a sua reprodutibilidade, Fanchin et al.(2005) estudaram 47 mulheres inférteis com idade de 33(25-40) anos em programação de ART. Foram avaliados os níveis séricos de AMH, Inibina B, FSH e E2 de amostras de sangue periféricos colhidos no terceiro dia do ciclo de três ciclos menstruais consecutivos assim como a contagem do número de folículos antrais. A duração média dos ciclos foi de 28(25-34) dias. Os valores de AMH no primeiro, segundo e terceiro ciclos foram de 0,93 (0,24-6,40)ng/mL, 0,95 (0,24-7,08)ng/mL, e 0,81 (0,245,11)ng/mL respectivamente. As diferenças longitudinais das dosagens de AMH, Inibina B, FSH, E2 e a contagem do número de folículos antrais não foram 15 estatisticamente significantes. Os autores verificaram que o AMH apresentava maior reprodutibilidade intercíclica do que os outros hormônios. Os estudos mostram a possibilidade de se obter amostras do AMH para avaliação da reserva ovariana, em qualquer dia do ciclo, uma vez que a variação dos níveis séricos intraciclo e interciclo não é estatisticamente significante. Os pesquisadores De Vet et al.(2002) estudaram em 41 pacientes normo-ovuladoras, com idade entre 20 anos e 35 anos os níveis de AMH em duas amostras, com intervalo entre elas de 2,6 ± 1,7 anos. Observaram uma diminuição da média do AMH de 2,1mcg/L para 1,3 mcg/L, resultado estatisticamente significante. As alterações de FSH, inibina B, E2 e o número de folículos antrais não foram estatisticamente significantes. Observaram também uma forte correlação direta entre o AMH e o número de folículos antrais. Concluíram que o AMH poderia ser usado como novo marcador do envelhecimento ovariano. Correlacionando os marcadores de reserva ovariana Fanchin et al.(2003) avaliaram os valores de AMH, Inibina B, E2, FSH, LH, número de folículos antrais e volume ovariano, todos obtidos no terceiro dia do ciclo em 75 pacientes em programação de FIV. A média de idade foi de 34(25-40) anos. Obtiveram como valores médios de AMH, Inibina B, E2, FSH, LH, número de folículos antrais e volume ovariano respectivamente 1,39 (0,24 – 6,40) ng/mL, 90(16-182) pg/mL, 31(15-111) pg/mL, 7,0(2,9-19,3)mUI/mL, 4,7(1,2-11,7) mUI/mL, 12(1-35) folículos e 6( 4,4-8,0) cm³. Os autores encontraram uma forte relação entre o AMH com o 16 número de folículos antrais e volume ovariano. O FSH e a Inibina B apresentaram menor correlação ao número de folículos antrais quando se compara ao AMH. A mensuração sérica do AMH é realizada pelo teste ELISA sendo disponível no mercado dois kits distintos, Diagnostic Systems Laboratories (DSL),Inc,Texas,USA e o immunotech-Beckman (BC),Marseille,France. Os autores Broer et al.(2009) em um estudo de meta-análise observaram que vários autores como Ficicioglu et al.(2006), Nelson et al.(2009) e La Marca et al.(2010) utilizavam o kit Diagnostic Systems Laboratories,Inc,Texas,USA. Outros pesquisadores como De Vet et al.(2002), Van Rooij et al.(2002), Fanchin et al.(2003), Hazout et al.(2004), Eldar-Geva et al.(2005) e La Marca et al.(2004,2006) utilizaram o kit immunotech-Beckman,Marseille,France. A apresentação dos resultados também é heterogênea, sendo a maioria em ng/mL, poucos em mcg/L e alguns em pmol/L como os estudos de Penãrrubia et al.(2005), e Eldar –Geva et al.(2005) Para conversão de unidades, 1 ng/mL corresponde a 7,14 pmol/L de AMH segundo o manual de uso da Immunotech AMH/MIS enzyme immunoassay (Immunotecth – Beckman Coulter, Inc, Marseille, France). Os primeiros autores a publicar a comparação dos valores dos dois testes de ELISA disponíveis comercialmente foram Hehenkamp et al.(2006). Encontraram uma alta correlação entre os valores de AMH em ambos os 17 ensaios. Esta diferença deve-se ao fato de utilizar preparados diferentes de anticorpos monoclonais humanos para AMH. Ambos os testes apresentam alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade para serem usados na prática clínica. Os mesmos resultados foram encontrados por Lee et al. (2011) quando comparam ambos os kits para AMH. Estes autores, a partir de uma equação de regressão correlacionaram os valores de AMH entre os kits acima pela equação: BC = 1,102 x DSL – 0,042 Recentemente as empresas DSL e Immunotech foram adquiridas pela Beckman Coulter, restando apena um único kit no mercado (Al-Qahtani et al., 2006). Uma vez que o AMH é produzido por folículos pré-antrais e folículos antrais, principalmente os pequenos, estes últimos por sua cavidade antral que contém o líquido folicular, permitem-nos sua visualização à ultrassonografia transvaginal (USGTV). A forte correlação entre CFA e o AMH deve-se provavelmente porque a CFA é a expressão anatômica de uma variável bioquímica e hormonal, o AMH, assim suas variações seguem de forma semelhante quando comparadas à outros marcadores da reserva ovariana. Para demonstrar esta correlação, Hansen et al.(2011) avaliaram a concentração sérica de AMH, Inibina B, FSH, E2 e à CFA com contagem de folículos primordiais de 42 mulheres entre 26 anos e 52 anos, submetidas à ooforectomia por motivos ginecológicos vários. Os autores 18 encontraram uma forte correlação entre CFA e AMH com a contagem de folículos primordiais histologicamente avaliada bem como as suas alterações com a idade. A primeira publicação a correlacionar CFA e o prognóstico de resultado de FIV foi realizado por Ruess et al.(1996), trabalho este selecionado em um estudo de meta-análise de Hendriks et al.(2005), pesquisando CFA como preditor da resposta ovariana e gestação pós FIV. No trabalho de Rosen et al.(2011) analisando a CFA de 881 mulheres inférteis, os autores observaram que a CFA diminuía com o aumento da idade, estava associada com a infertilidade e que esta era menor em pacientes inférteis quando comparada ao grupo controle, 10 versus 14 folículos. Estudando a CFA como marcador dos resultados de FIV, Frattarelli et al.(2003) encontraram uma relação direta entre a CFA e o volume ovariano, número de folículos, número de oócitos maduros, números de embriões, LH basal e pico de E2. O aumento da CFA apresentou-se inversamente proporcional ao número de ampolas de gonadotrofinas, dias de estímulo, idade da paciente e FSH basal. Associaram um aumento significativo ao cancelamento de ciclos de FIV (41% vs. 6,4%) e diminuição nas taxas de gestação (23,5% vs.57,6%) em pacientes com CFA basal menor que quatro quando comparado ao grupo controle. Surge na literatura um questionamento em relação ao tamanho ou diâmetro do folículo antral que deve ser considerado para avaliação da reserva ovariana. Temos o trabalho de Grynberg et al.(2010) que estudaram o FSH, 19 Inibina B e a CFA no terceiro dia do ciclo de 192 pacientes em programação de ART. Os autores encontraram uma correlação entre o FSH e Inibina B e a CFA, sendo esta correlação maior em folículos ≤ 7mm, sugerindo a importância de valorizar o tamanho dos folículos antrais. Com a finalidade de entender o comportamento do tamanho dos folículos durante a CFA como marcador da reserva ovariana, Haadsma et at.(2007) analisaram as concentrações séricas de FSH e Inibina B, volume ovariano, CFA e o teste do Citrato de Clomifeno numa população de 474 mulheres inférteis. A CFA foi dicotomizada em folículos menores (2mm a 6mm) e maiores (7mm a 10mm). Os autores observaram que a CFA dos folículos menores diminuíam com a idade enquanto as maiores mantinham-se constantes. Encontraram uma forte correlação entre a CFA menores com o FSH, Inibina B e o teste do Citrato de Clomifeno, enquanto a CFA maiores correlacionam-se, apenas à Inibina B e ao volume ovariano. Os autores sugerem que a CFA dos folículos menores esteja relacionada com a reserva ovariana funcional. Em relação a avaliação ecográfica da CFA, segundo a literatura, a variação interobservador não é estatisticamente significante. Jayaprakasan et al.(2007) estudando a CFA de 2mm a 10mm de diâmetro ao exame ultrassonográfico de 41 pacientes em investigação da infertilidade, de três investigadores com graus diferentes de experiência, encontraram que a variação na CFA interobservador não era estatisticamente significante. Os mesmos resultados foram encontrados por Scheffer et al. (2002) ao estudarem a variação 20 interobservador da CFA de 37 mulheres submetidas ao exame ecográfico para investigação da infertilidade realizada por 2 investigadores independentes. Muitos trabalhos da literatura não exibem em sua metodologia a forma como é medido o folículo antral. Pesquisadores brasileiros Souza et al.(2008) estudando 51 pacientes em programação de FIV, utilizaram a medida do maior diâmetro de cada folículo entre 2 a 10mm em predizer o padrão de resposta frente à EOC com antagonista com GnRH. Mais recentemente Broekmans et al. (2010) estabeleceram a melhor padronização técnica para mensurar o folículo antral. Os autores recomendam que o exame ecográfico seja realizado em pacientes com ciclo menstrual regular e sem patologias que possam comprometer a CFA tais como endometriomas e cirurgia ovariana prévia, entre o segundo e quarto dia de um ciclo espontâneo. O uso de ultrassom 2D com transdutor transvaginal de no mínimo 7MHz são o suficiente para a mensuração do folículo antral. Devem ser medidos folículos antrais entre 2mm a 10 mm de diâmetro. Inicialmente é preciso identificar ambos os ovário e realizar a medição do diâmetro interno de cada folículo em dois planos, calculando-se posteriormente a sua média. O somatório de todos os folículos medidos de ambos os ovários constitui a CFA. Em virtude de inúmeros exames e formas de avaliação da reserva ovariana a fim de identificar pacientes de risco para PR, surge na literatura a falta de uma definição oficial ou mais aceita para PR. Ao longo dos anos surgiram várias propostas para se definir PR, assim Garcia et al.(1983) definiram pela primeira vez PR as pacientes com E2 < 300 pg/mL pós estimulação ovariana 21 com hMG. Seguiram-se Scott, Navott et al.(1994) que consideraram PR aquelas com E2 < 500 pg/mL e ≤ 3 folículos maturos. Para Dor et al.(1995) pacientes com níveis séricos de E2 < 500 pg/mL no dia da aplicação do hCG, com menos de 4 folículos maiores de 14 mm de diâmetro e menos de 3 oócitos captados, foram chamadas de PR. Busacca et al.(1996) definiram PR pacientes com valores séricos de E2 < 150 a 300 pg/mL por folículo, quando submetidas à EOC com doses maiores a 300 UI de FSH por pelo menos 15 dias. Para os autores Bilder et al.(1997) definiram PR pacientes com E2 inferiores a 1000 pg/mL e menos de 5 oócitos captados frente à EOC com pelo menos 300UI de FSH; para Surrey et al.(2000) utilizaram-se da combinação de vários fatores para definir PR, consideraram: 2 a 5 folículos maturos, 100 a 660 pg/mL de E2, 3 a 6 oócitos captados, FSH basal entre 6,5 a 15 mUI/mL e falha do teste de estímulo com GnRH-a. Durante muitos anos a literatura aceitou melhor os estudos de Bancsi et al.(2002) que definiram PR as mulheres com menos de três folículos ou menos de 4 oócitos captados ou ainda ausência de folículos frente à EOC. Mais recentemente Ferraretti et al.(2011), membros do grupo de interesse especial da ESHRE (Europian Society of Human Reproduction and Embryology) após reunião no período de 19 a 20 de março de 2010 em Bologna, estabeleceram o consenso na definição de pobre respondedora de estimulação ovariana para FIV. Inicialmente estabeleceram que o termo mais adequado para referir-se às pacientes que respondem de forma inadequada à EOC para FIV, seria pobre respondedora e não má respondedora ou baixa respondedora. A 22 definição de PR baseia-se em fatores de risco para PR, ciclos anteriores e testes da reserva ovariana, assim se define PR quando 2 dos 3 critérios a seguir estão presentes: 1 – Idade da paciente ≥ 40 anos ou qualquer fator de risco para pobre respondedora. 2 – FIV anterior com ≤ 3 oócitos recuperados em protocolo convencional 3 - Teste da reserva ovariana alterada - CFA < 5-7 folículos - AMH , 0,5 – 1,1 ng/mL Pacientes na ausência de idade avançada e teste da reserva ovariana alterada serão definidas como PR se tiverem em dois ciclos poucos oócitos recuperados quando em esquema de máxima estimulação com FSH. Clinicamente, pacientes PR mantêm-se PR em 62,4% das vezes, em um segundo ciclo. Portanto aproximadamente em um terço dos casos, pacientes inicialmente PR podem apresentar resposta ovariana adequada em ciclo subsequente (Ferraretti et al., 2011). O AMH pode também definir estratégias de EOC em paciente em programação de FIV, assim Nelson et al.(2009), estudaram 538 pacientes de dois centros distintos submetidas à EOC, com protocolos individualizados segundo a classificação definida pela concentração sérica do AMH. Assim pacientes com AMH < 1 pmol/L (grupo1) portanto possíveis PR com resposta insignificante foram tratadas com antagonistas do GnRH e 375UI diárias de FSH. Pacientes com AMH entre ≥1 e < 5 pmol/L (grupo2), possíveis PR com reposta reduzida, 23 receberam análogo agonista do GnRH e 375UI diárias de FSH e no outro centro antagonista do GnRH e 300 UI de FSH. Pacientes com AMH ≥ 5 e < 15 pmol/L (grupo3), portanto NR receberam antagonista do GnRH e 225 UI de FSH. Finalmente o último grupo com AMH ≥ 15 pmol/L (grupo4), foi tratado com antagonista do GnRH e 150UI de FSH. Pacientes do grupo 1 tiveram 60% dos ciclos cancelados e ausência de gestação. As taxas de gestação por ciclo para o grupo 2 nos centros 1 e 2, foram respectivamente 8,1% e14,7%; para o grupo 3 as taxas foram de 23,2% e 32,9%. Para o grupo 4 as taxas de gestação foram de 31,8% e 63,6% para os centros 1 e 2 respectivamente. Em ambos os trabalhos os autores concluíram que o AMH pode identificar os extremos da resposta ovariana frente à EOC para FIV, ou seja, PR e hiper-respondedoras, e consequentemente auxiliar na estratégia e individualização do protocolo a ser utilizado, otimizando resultados, reduzindo taxas de cancelamento de ciclos e a ocorrência da síndrome do hiperestímulo ovariano (SHO). 24 2 – OBJETIVO 25 O presente estudo tem os seguintes objetivos: 1 - Correlacionar a concentração sérica do hormônio anti-Mülleriano e a contagem de folículos antrais como marcadores de pobre resposta a estímulo ovariano controlado com gonadotrofina exógena em FIV. 2 - Definir entre os marcadores estudados, o melhor em predizer pobre resposta ovariana. . - 26 3- CASUÍSTICA E MÉTODO 27 3.1- CASUÍSTICA Após aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição Santa Casa de São Paulo e Hospital Pérola Byington foram selecionadas 220 mulheres do setor de Reprodução Humana do Centro de Referência em Saúde da Mulher – Hospital Pérola Byington com idade entre 25 e 43 anos e indicação de FIV, no período de Fevereiro de 2009 a Março de 2011. Destas, foram excluídas 88 pacientes que não atendiam aos critérios de inclusão. Foram incluídas as pacientes que assinaram o termo de consentimento informado, segundo normas da Organização Mundial da Saúde (OMS) e Conselho Federal de Medicina (CFM). Foram excluídas àquelas submetidas a cirurgias ovarianas de qualquer natureza, agenesia ovariana, portadoras da Síndrome dos Ovários Policísticos, falência ovariana prematura, ausência de ciclos menstruais espontâneos, uso de medicamentos indutoras da ovulação por período menor a três meses, portadoras de sorologias positivas HIV1e2, HTLV1e 2, Hepatite B, Hepatite C e Sífilis e FSH basal > 12UI/L. 3.2 MÉTODO O modelo de investigação científica foi um estudo primário, analítico, longitudinal e observacional (Hochman et al.,2005). 28 Todas as mulheres foram submetidas entre o 3° e o 5° dia do ciclo à coleta de sangue periférico para posterior avaliação hormonal e a exame ecográfico para a CFA. Conforme protocolo do serviço, na fase lútea média do mesmo ciclo, entre o 17° e 23° dia, estas receberam 1,875 mg de análogo agonista do GnRH, o acetato de Leuprolida de depósito. Depois de estabelecido o bloqueio do eixo hopotálamo-hipófise-ovariano, confirmado por avaliação ultrasonográfica, foi iniciada a EOC com gonadotrofina exógena. Mulheres com idade inferior a 35 anos receberam 150 UI de FSH recombinante, Alfafolitrofina, aquelas com idade entre 35 anos e abaixo de 40 anos, 225 UI. Pacientes com idade igual ou superior a 40 anos receberam 150 UI de Gonadotrofina Menopáusica Humana (HMG). Foram realizados os controles ecográficos antes e periodicamente durante o estímulo. Quando obtido pelo menos um folículo com diâmetro médio de 18mm, foram administradas 5000UI de Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) a fim de promover a maturação folicular final. A aspiração folicular ocorreu entre 34 horas e 36 horas após a administração do hCG, via endovaginal guiada por ecografia utilizando-se agulha própria de 16G, com anestesia geral venosa. A transferência de embriões ocorreu aproximadamente 72 horas após a punção. Para o suporte da fase lútea administraram-se 600 mg diários de progesterona micronizada. Transcorridos 14 a 15 dias, o diagnóstico gestacional foi realizado pela avaliação do BHCG plasmático. 29 As pacientes foram classificadas em dois grupos: pobres respondedoras (PR) e normorrespondedoras (NR), sendo consideradas PR aquelas que apresentaram 3 ou menos oócitos recuperados nas aspiração folicular. Pacientes com 4 ou mais oócitos recuperados foram classificadas como NR. Esta classificação é concordante com os critérios da ESHRE de Bologna em definir PR. 3.3 –PROVAS HORMONAIS Foram colhidas 10 mL de sangue periférico por punção venosa utilizando tubos BD-Vacutainer com gel separador, entre o terceiro e o quinto dia do ciclo de um ciclo espontâneo. O material colhido foi centrifugado a uma força centrífuga de 1200 g por dez minutos, sendo o soro armazenado a uma temperatura de menos 20° C. Todas as amostras congeladas foram descongeladas e os hormônios, dosados numa única análise. As dosagens eletroquimoluminescência de FSH foram automatizada, realizadas utilizando-se pelo ensaios método da de Roche Diagnostics Gmbh,D-68298 Mannheim. Os limites de detecção inferior ou sensibilidade analítica para o FSH foi de 0,100 mUI /mL. As dosagens de Inibina B foram realizadas pelo método de ELISA utilizando-se o kit Inhibin B Gen II ELISA ( Beckman Coulter, Inc, CA, USA). A sensibilidade deste ensaio foi de 7 pg/mL. 30 As dosagens de AMH foram realizadas pelo método de ELISA utilizandose o kit Immunotech AMH/MIS enzyme immunoassay ( Immunotecth – Beckman Coulter, Inc, Marseille, France). A sensibilidade deste ensaio foi de 0,14 ng/mL. As dosagens hormonais foram realizadas no laboratório da RDO – Diagnósticos Médicos, São Paulo , SP. Os coeficientes de variação de todos os ensaios acima referidos foram inferiores a 5%. Em nosso estudo utilizamos a segunda geração de kits para o AMH, e o único disponível no mercado, a Immunotech AMH/MIS enzyme immunoassay (Immunotecth – Beckman Coulter, Inc, Marseille, France), kit este fabricado após a junção das empresas acima. 3.4 –AVALIAÇÃO ECOGRÁFICA As pacientes foram submetidas ao exame ultrassonográfico por médicos especialistas em reprodução humana assistida e treinados à exames ecográficos na área de infertilidade. Foi utilizado o aparelho GE Logiq Book XP (GE Healthcare – Product Features), com transdutor endocavitário de 7,0 MHz de frequência. O folículo antral foi determinado medindo-se o maior diâmetro do antro entre 2mm e 10mm, caracterizado pela imagem ovalada ou circular hipoecogênica presente nos ovários. O somatório do número de folículos antrais de ambos os ovários passou a ser chamado de Contagem de Folículos Antrais. Esses também foram classificados em CFA menores ou seja, aqueles com o 31 somatório de folículos antrais menores que 6mm e CFA maiores, com o somatório de folículos antrais iguais ou maiores que 6mm de diâmetro. 3.5- MÉTODO ESTATÍSTICO As análises estatísticas foram realizadas no programa SSP (Statistical Package for Social Sciences) na versão 19.0, com a aplicação do Teste de Mann-Whitney para a comparação entre os grupos PR e NR. O ponto de corte do AMH, Inibina B, FSH, CFA menores, CFA maiores e CFA totais para predizer PR foi definido com a aplicação da análise da curva ROC, bem como para identificar o melhor marcador para este fim. Consideraram-se estatisticamente significativos valores de p inferiores a 0,05. 32 4 – RESULTADOS 33 Foram analisadas as dosagens hormonais de FSH, Inibina B e AMH de cento e trinta e duas mulheres portadoras de subfertilidade por fator feminino e/ou masculino, que foram submetidas à fertilização in vitro clássica ou ICSI após EOC com gonadotrofina. Estas pacientes foram classificadas em PR e NR conforme o número de oócitos recuperados na aspiração folicular. Das 132 pacientes 53 (40,1%) eram PR e 79 (59,9%) NR. A tabela 1 correlaciona a idade nos grupos PR e NR. TABELA 1: Relação das idades das pacientes nos grupos PR e NR Pacientes / Idade ( anos) ≤35 > 35 PR 10(18,9%) 43(81,1%) NR 44(55,7%) 35(44,3%) Total 54(40,9%) 78(59,1%) PR – pobre respondedora NR – normorrespondedora A esterilidade primária esteve presente em 91 (68,9%) das pacientes e 41 (31,1%) apresentaram esterilidade secundária. A tabela 2 expressa os fatores de infertilidade e suas respectivas frequências. TABELA 2 : Fatores de infertilidade Fator Endometriose ISCA Fator tuboperitoneal masculino Total Frequência 15 13 Percentual (%) 11,4 9,8 40 30,3 64 132 48,5 100,0 As características clínicas e as análises laboratoriais e ecográficas de cada paciente encontram-se no anexo 1. A tabela 3 apresenta a descrição das 34 variáveis: idade, tempo de infertilidade, peso, altura, IMC, dias de estímulo, dose total de gonadotrofina, CFA menores, maiores e totais, número de oócitos recuperados, concentração de AMH, Inibina B e FSH, para o grupo estudado. TABELA 3. Média, desvio-padrão, mínimo e máximo das variáveis: Idade, tempo de infertilidade, peso, altura, IMC, dias de estímulo, dose total de gonadotrofina, CFA menores, maiores e totais, folículos no dia do hCG , concentração de AMH, Inibina B e FSH. Variável idade (anos) Tempo Inf (anos) Peso (kg) Altura (m) IMC (kg/m2) Dias de estímulo total de unidades (UI) CFA < 6 mm CFA ≥ 6mm CFA total número de oócitos recuperados AMH (ng/mL) Inibina B (ng/mL) FSH (UI/L) n Desvio- Percenti Percentil 50 Percenti padrão l 25 (Mediana) l 75 43,00 36,09 4,09 33,00 36,00 39,00 13,00 5,85 1,95 5,00 5,00 7,00 102,00 66,24 10,67 59,00 66,00 72,00 1,80 1,62 0,07 1,58 1,63 1,67 43,10 25,42 4,24 22,78 25,40 27,08 13,00 9,93 0,96 9,00 10,00 10,00 2925,00 1817,05 410,54 1500,00 1650,00 2250,00 18,00 5,44 4,09 2,00 4,00 7,00 17,00 3,69 2,83 2,00 3,00 4,00 28,00 9,12 4,90 5,00 8,00 13,00 17,00 5,49 3,67 3,00 5,00 7,00 15,00 1,73 2,03 0,57 1,11 2,02 191,30 58,78 30,19 36,43 59,30 78,48 22,31 8,01 3,59 5,47 7,11 9,76 Mínimo Máximo Média 132 25,00 132 2,00 132 40,00 132 1,40 132 16,60 132 8,00 132 1200,00 132 0,00 132 0,00 132 2,00 132 1,00 132 0,08 132 3,70 132 1,51 A figura 1 ilustra a mediana e os percentis 25% e 75% dos valores de FSH nos grupos PR e NR. Os valores dos percentis 25,50 e 75 de FSH foram respectivamente 5,75 UI/L, 9,68 UI/L e 12,66 UI/L para as PR e 5,26 UI/I, 6,66 UI/L e 7,87 UI/L respectivamente para as NR. 35 FIGURA 1. Mediana e percentis 25% e 75% de FSH nos grupos PR e NR. As figuras 2 e 3 ilustram a mediana e os percentis 25% e 75% dos valores de Inibina B e AMH nos grupos PR e NR respectivamente. Os valores dos percentis 25,50 e 75 da Inibina B foram respectivamente 20,13 ng/mL, 44,20 ng/mL e 62,38 ng/mL para as PR e 51,10 ng/mL, 71,10 ng/mL e 82,00 ng/mL respectivamente para as NR. Os valores dos percentis 25,50 e 75 do AMH foram respectivamente 0,28 ng/mL, 0,43 ng/mL e 0,73 ng/mL para as PR e 1,17 ng/mL, 1,70 ng/mL e 3,22 ng/mL respectivamente para as NR. 36 FIGURA 2. Mediana e percentis 25% e 75% de Inibina B nos grupos PR e NR. FIGURA 3. Mediana e percentis 25% e 75% de AMH nos grupos PR e NR. 37 As figuras 4, 5 e 6 ilustram a mediana e os percentis 25% e 75% da CFA menores, CFA maiores e CF totais nos grupos PR e NR respectivamente. Os valores dos percentis 25,50 e 75 da CFA menores foram respectivamente 2, 2 e 3 folículos para as PR e 4,6 e 10 folículos respectivamente para as NR. FIGURA 4. Mediana e percentis 25% e 75% da CFA menores nos grupos PR e NR. Os valores dos percentis 25,50 e 75 da CFA maiores foram respectivamente 2, 3 e 3 folículos para as PR e 2,4 e 6 folículos respectivamente para as NR. 38 FIGURA 5. Mediana e percentis 25% e 75% da CFA maiores nos grupos PR e NR. Os valores dos percentis 25,50 e 75 da CFA totais foram respectivamente 4, 5 e 7 folículos para as PR e 8,11 e 14 folículos respectivamente para as NR. FIGURA 6. Mediana e percentis 25% e 75% da CFA totais nos grupos PR e NR. 39 A correlação entre as variáveis para avaliar a resposta ovariana em pacientes submetidas à EOC bem como as outras variáveis mensuradas para os grupos PR e NR, aplicando-se o Teste de Mann-Whitney encontram-se na tabela 4. Esta mesma tabela apresenta a descrição das variáveis: idade, tempo de infertilidade, peso, altura, IMC, dias de estímulo, dose total de gonadotrofina, CFA menores, maiores e totais, número de oócitos recuperados, concentração de AMH, Inibina B e FSH, para o grupo PR e NR. . TABELA 4 . Correlação entre as variáveis idade, AMH,Inibina B, FSH,CFA menores, maiores e totais, tempo de infertilidade, IMC, dias de estímulo e total de gonadotrofina para o grupo PR e NR. Variável Grupo PR idade (anos) NR Total PR Tempo Inf NR (anos) Total PR Peso (kg) NR Total PR Altura (m) NR Total PR IMC (kg/m2) NR Total PR Dias de NR estímulo Total PR total de NR unidades (UI) Total PR CFA < 6 mm NR Total Desviopadrão 53 38,49 3,14 79 34,48 3,88 132 36,09 4,09 53 6,00 1,84 79 5,75 2,03 132 5,85 1,95 53 65,36 11,13 79 66,84 10,37 132 66,24 10,67 53 1,62 0,06 79 1,62 0,07 132 1,62 0,07 53 24,82 3,74 79 25,82 4,52 132 25,42 4,24 53 9,94 0,97 79 9,92 0,96 132 9,93 0,96 53 1797,17 389,70 79 1830,38 425,88 132 1817,05 410,54 53 2,60 1,70 79 7,34 4,13 132 5,44 4,09 n Média Mínimo Máximo 30,00 25,00 25,00 3,00 2,00 2,00 40,00 43,00 40,00 1,45 1,40 1,40 16,60 18,30 16,60 8,00 8,00 8,00 1200,00 1200,00 1200,00 0,00 0,00 0,00 43,00 43,00 43,00 13,00 13,00 13,00 102,00 97,00 102,00 1,72 1,80 1,80 35,30 43,10 43,10 12,00 13,00 13,00 2475,00 2925,00 2925,00 9,00 18,00 18,00 Percentil Percentil 50 25 (Mediana) 36,50 39,00 32,00 35,00 33,00 36,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 58,50 66,00 61,00 67,00 59,00 66,00 1,58 1,63 1,58 1,63 1,58 1,63 22,20 25,40 23,00 25,40 22,78 25,40 9,00 10,00 9,00 10,00 9,00 10,00 1500,00 1650,00 1500,00 1650,00 1500,00 1650,00 2,00 2,00 4,00 6,00 2,00 4,00 Percentil Significância 75 (p) 41,00 < 0,001 37,00 39,00 7,00 0,287 7,00 7,00 71,50 0,515 72,00 72,00 1,67 0,541 1,66 1,67 26,90 0,426 27,70 27,08 11,00 0,620 10,00 10,00 2250,00 0,900 2250,00 2250,00 3,00 < 0,001 10,00 7,00 40 Variável Grupo PR CFA ≥ 6mm NR Total PR CFA total NR Total PR número de oócitos NR recuperados Total PR AMH (ng/mL) NR Total PR Inibina B NR (ng/mL) Total PR FSH (UI/L) NR Total n Média 53 79 132 53 79 132 53 79 132 53 79 132 53 79 132 53 79 132 2,55 4,46 3,69 5,15 11,78 9,12 2,26 7,66 5,49 0,56 2,52 1,73 43,44 69,07 58,78 9,81 6,81 8,01 DesvioPercentil Percentil 50 Percentil Significância Mínimo Máximo padrão 25 (Mediana) 75 (p) 1,22 0,00 6,00 2,00 3,00 3,00 < 0,001 3,32 0,00 17,00 2,00 4,00 6,00 2,83 0,00 17,00 2,00 3,00 4,00 1,91 2,00 10,00 4,00 5,00 7,00 < 0,001 4,48 5,00 28,00 8,00 11,00 14,00 4,90 2,00 28,00 5,00 8,00 13,00 0,86 1,00 3,00 1,00 3,00 3,00 < 0,001 3,20 4,00 17,00 5,00 7,00 9,00 3,67 1,00 17,00 3,00 5,00 7,00 0,49 0,08 3,41 0,28 0,43 0,73 < 0,001 2,28 0,49 15,00 1,17 1,70 3,22 2,03 0,08 15,00 0,57 1,11 2,02 25,13 3,70 97,00 20,13 44,20 62,38 < 0,001 29,03 11,80 191,30 51,10 71,10 82,00 30,19 3,70 191,30 36,43 59,30 78,48 4,57 2,90 22,31 5,75 9,68 12,66 < 0,001 2,03 1,51 11,95 5,26 6,66 7,87 3,59 1,51 22,31 5,47 7,11 9,76 * valor de p< 0,05 – há diferença estatística entre as variáveis PR – pobre respondedora NR – normorrespondedora Uma vez que os dados estatísticos apresentam que as variações dos marcadores para a resposta à EOC nos grupos PR e NR foram estatisticamente significantes, utilizou-se a análise da curva ROC para estabelecer um valor de corte para o FSH, Inibina B , AMH, CFA menores, CFA maiores e CFA totais em predizer PR. A análise da curva ROC é expressa na tabela 5, apresentando o valor de corte das variáveis AMH, Inibina B, FSH, CFA totais, menores e maiores em identificar PR bem como sua respectiva sensibilidade, especificidade, eficiência e produto. 41 Tabela 5. Valor de corte, sensibilidade, especificidade, eficiência e produto das variáveis AMH, Inibina B, FSH, CFA totais, menores e maiores Variável AMH(ng/mL) CFA totais CFA menores CFA maiores FSH (UI/L) Valor de corte 0,970 8,000 5,000 4,000 9,185 Inibina B (pg/mL) 68,550 Sensibilidade 0,886 0,848 0,734 0,582 0,547 0,532 Especificidade 0,925 0,925 0,925 0,849 0,886 0,868 Eficiência 0,906 0,887 0,830 0,716 0,715 0,700 Produto 0,820 0,784 0,679 0,494 0,485 0,462 A figura 7 ilustra a curva ROC para as variáveis AMH, Inibina B, CFA menores, CFA maiores e CFA totais. Figura 7. Curva ROC para as variáveis AMH, Inibina B, CFA menores, CFA maiores e CFA totais. 42 A partir da curva ROC identificamos que o melhor teste para predizer PR é o AMH seguido pela CFA total e CFA menores, paras os valores de corte 0,97 ng/mL , 8 e 5 folículos respectivamente. 43 5 – DISCUSSÃO 44 Neste trabalho optamos por utilizar o termo pobre respondedora bem como o número de três ou menos oócitos recuperados na aspiração folicular em definir PR para adequarmos ao referido consenso da ESHRE realizado em Bologna que conceitua PR. Em nossa casuística 53 (40,1%) das pacientes eram PR e 79 (59,9%), NR. A incidência de PR é alta provavelmente por tratar-se de um serviço de referência em reprodução humana de caráter público, concentrando pacientes com maior risco para PR. O IMC para o grupo estudado foi de 25,42 ± 4,24 Kg/m2 sendo que não houve uma diferença estatisticamente significante entre os grupos PR e NR, (p=0,426), com valores de 24,82 ± 3,74 Kg/m2 vs 25,82 ± 4,52 Kg/m2 respectivamente. A idade média do grupo foi de 36,09 ± 4,09 anos. Para o grupo PR a idade média foi de 38,49 3,14 anos e 34,48 3,88 para as NR, sendo esta diferença estatisticamente significante (p< 0,001). Observamos que 81,17% das pacientes PR apresentavam idade > 35 anos contra 44,3% para o grupo NR, mostrando a importância da idade como fator de risco para pobre respondedora. Os autores Ferraretti et al.(2000) e De Sutter et al.(2003) demonstraram a influência da idade na resposta ovariana, onde pacientes com idade acima de 36 e 38 anos apresentavam maior redução no número de folículos e portanto maior risco para PR. La Marca et al.(2006) encontraram a média de idade de 38,2 ± 45 3,55 anos para o grupo PR e 35,5 ± 2,93 anos para NR, quando estudou a resposta à EOC em pacientes submetidas à FIV. Em relação ao dias de estímulo de gonadotrofina, a diferença não foi estatisticamente significante (p=0,620) entre os grupos PR e NR, que foram respectivamente de 9,94 0,97 dias e 9,92 0,92 dias. Esta diferença não significativa em relação aos dias de estímulo também foram observados por Bancsi et al.(2002), ao estudarem a resposta ovariana em pacientes de FIV, encontraram 13,6 ± 3,2 dias de EOC para as PR e 12,9 ± 2,9 dias para as NR. Ebner et a.l(2006) em estudo semelhante encontraram 9,6 ± 1,8 dias de EOC para as PR e 9,7 ± 1,7 dias para as NR, já La Marca et al.(2006), 12,3 ± 2,3 dias para as PR e 11,9 ± 1,27 dias paras as NR. Al-Azemi et al.(2011) encontraram 9 ± 2 dias para PR e 10 ± 2 dias para NR. Por outro lado Bussaca et al.(1996) e Karande et al.(1997) encontraram diferenças nos dias de EOC. Talvez esta diferença não tenha sido significativa pelo fato de se utilizar um protocolo fixo. O serviço tem como rotina o protocolo fixo, aquele que mantém constante a dose diária de gonadotrofina, não ajustando-a conforme a resposta individual da paciente. A dose total de gonadotrofina administrada foi de 1797 389,70 UI para as PR e 1830,38 425,88 UI para as NR. Não encontramos uma diferença estatística entre estes grupos (p=0,900). Bancsi et al.(2002) estudando a resposta à EOC em pacientes submetidas a FIV encontrou o número de ampolas de gonadotrofina de 25,4 ± 9,7 para NR e 29,7 ± 10,8 para PR com uma diferença não estatisticamente significante (p=0,022). Al-Azemi et al.(2011) 46 encontraram 2027 ± 631 UI para PR e 2016 ± 814 UI para NR (p=0,310). Por outro lado La Marca et al.(2006) em um estudo semelhante encontraram 4243 ± 1018 UI de gonadotrofina para PR e 2982 ± 864 UI para NR (p < 0,001). Essas discordâncias poderiam ser explicadas pelo eventual crescimento folicular não homogênio, antecipando a administração do hCG ou ainda o uso de um protocolo fixo. As concentrações séricas basais de FSH para os grupos PR e NR foram de 9,81 4,57 UI/L e 6,81 2,03 UI/L respectivamente, com uma diferença estatisticamente significante (p<0,001). Estas diferenças também foram encontradas nos estudos de Dzik et al. (2000), Van Rooil et al. (2002), Bancsi et al.(2002) e Ebner et al.(2006); e discordantes dos autores Peñarrubia et al.(2005) e Eldar-Geva et al.(2005). Apesar da dosagem do FSH ser um dos métodos mais tradicionais para avaliar a reserva ovariana, a literatura é controversa em relação ao FSH em predizer a resposta ovariana bem como seus valores de corte (Bancsi et al.,2003). Portanto há a necessidade em associar outro método estático, dinâmico ou ultrassonográfico para melhor predizer a resposta ovariana frente à EOC. Chama a atenção que a média de FSH para o grupo PR seja considerada normal pela maioria dos autores; portanto, esta avaliação deve ser interpretada de forma cautelosa. Os autores Almong et al.(2011) em um estudo multicêntrico avaliando marcadores da reserva ovariana de 2770 mulheres inférteis, objetivando elaborar um normograma do AMH, encontraram valores de FSH 7,4 (6-9,4) UI/L para mulheres entre 34 anos e 38 anos e 7,9 (6,2-10,6) UI/L para aquelas acima de 39 anos. Neste estudo mesmo pacientes PR não apresentaram valores de FSH muito altos porque o serviço acadêmico deste 47 trabalho impõe como critério de exclusão FSH > 12 UI/L. Mesmo assim foram encontrados valores de FSH acima do citado anteriormente porque pacientes PR podem apresentar uma grande variabilidade do FSH, a medida na admissão do serviço contra o FSH basal no ciclo em que se realizou a FIV. Um fator importante ao se utilizar o FSH basal como screening para PR é a variação destes valores em diferentes ciclos menstruais. Os autores Scott et al.(1996) estudando a variabilidade interciclica do FSH, concluíram que pacientes com grande variabilidade do FSH basal, mesmo dentro da faixa de normalidade, apresentavam diminuição do número de oócitos e baixa taxa de gestação, indicando uma menor reserva ovariana. Em nosso estudo esta diferença também foi encontrada, pacientes PR com FSH inicialmente normais apresentarem FSH elevados em ciclos seguintes. A Inibina B, uma vez sintetizada pelas células da granulosa, passou a refletir a massa celular ativa dessas células, tornando-se um marcador endógeno direto, sensível e precoce da reserva ovariana. Os valores de Inibina B encontrados nos grupos PR e NR foram respectivamente 43,44 ± 25,13 pg\mL e 69,07 ± 29,03 pg/mL, havendo uma diferença estatisticamente significante entre esse 2 grupos (p< 0,001). As diferenças estatísticas por nós encontradas também foram observadas por Dzik et al.(2000), ao estudarem a resposta ovariana em pacientes submetidas a FIV, obtiveram valores de Inibina B de 121,01 ± 46,31 pg/mL para NR e 70,60 ± 63,37UI/ mL para PR. Van Rooij et al.(2002),em semelhante estudo encontrou valores de Inibina B de 73 ng/L (0155) para PR e 115 ng/L (29-304) para NR. Bancsi et al.(2002) e Eldar-Gevar et 48 al.(2005) encontraram valores semelhantes com diferenças também estatisticamente significantes. As concentrações séricas de AMH para as PR e NR foram respectivamente 0, 56 ± 0,49 (ng/mL) e 2,52 ± 2,28 (ng/mL). Encontramos uma diferença estatisticamente significativa entre esses grupos (p<0,001). A diferença dos valores de AMH nos grupos PR e NR também foram encontradas por outros autores assim, La Marca et al.(2007) analisaram os valores de AMH de 48 pacientes em programação de FIV, obtida pela coleta de sangue periférico de um ciclo espontâneo. Estas mulheres foram submetidas à EOC sendo classificadas em PR, NR, BR e hiper-respondedoras. As dosagens de AMH para cada grupo foi respectivamente de 0,947 2 ng/mL, 5,98 3,2 ng/mL e 6,87 3,15 ng/mL. Os autores estimariam que valores de corte para AMH de 0,5ng/mL apresentaria uma sensibilidade de 85% e especificidade de 82,3% em predizer PR; para o valor de AMH de 0,75ng/mL a sensibilidade e especificidade seriam de 80% e 93% respectivamente. Em nosso estudo o valor de corte para o AMH em predizer PR para uma sensibilidade de 88,6% e sensibilidade de 92,5% foi de 0,97 ng/ mL Observamos que a literatura apresenta valores diferentes do AMH como preditor de PR em pacientes em programação de FIV, assim em um estudo piloto nacional, Miklos et al.(2008) analisaram os marcadores de resposta ovariana à EOC em pacientes em programação de FIV e encontraram valores de AMH paras PR e NR de 1,21 ng/mL e 2,50 ng/mL respectivamente e o valor de 1,85 ng/ mL de AMH em predizer PR para uma sensibilidade e especificidade ambas de 0,75. No atual estudo os valores encontrados foram divergentes daqueles 49 acima mencionados, talvez pelo fato do trabalho de 2007 ser um estudo piloto com uma pequena casuística, 24 pacientes, contra 132 pacientes do presente estudo. Porém ambos os estudos mostraram o AMH como um bom marcador em predizer PR. Resultados similares foram encontrados por Al-Azemi et al.(2011) ao estudarem marcadores da reserva ovariana em predizer recuperação de oócitos pós EOC em FIV. Pacientes PR apresentaram valores de AMH de 1,39 ± 2,22 ng/mL contra 2,81 ± 2,09 ng/mL para as NR. Por meio da curva ROC observouse que o melhor marcador em predizer PR foi o AMH seguido pelo FSH e Inibina B. Com a finalidade de entender o papel do AMH como preditor da resposta ovariana em FIV e comparando-o com a CFA, foi realizado um estudo de metaanálise, avaliando-se 17 estudos referindo-se ao AMH e 17 com CFA. Os valores de corte para o AMH em predizer PR variaram de 0,1 a 1,66 ng/mL, de 0,1mcg/L a 1,6 mcg/L e 4,9 a 18 pmol/L ou seja, de 0,68 a 2,52 ng/mL fazendose a conversão de pmol/L para ng/mL. Para os valores mencionados a sensibilidade e especificidade variaram de 0,19 a 0,91 e 0,55 a 1,00 respectivamente. Os autores concluíram por meio da curva ROC que o AMH e a CFA apresentavam a mesma acurácia em predizer PR porém pobres em predizer ausência de gestação (Broer et al., 2009). Merece destaque o estudo de La Marca et al. (2010) que analisaram o AMH como marcador em ART, realizaram uma estudo de meta-análise, 50 selecionando 20 trabalhos totalizando uma casuística de 2392 pacientes. Os valores de corte do AMH em predizer PR variaram de 0,1 a 1,66 ng/mL, de 0,3 a 1,4 mcg/L e 4,9 a 14 pmol/L ou seja, de 0,68 a 1,96 ng/mL fazendo-se a conversão de pmol/L para ng/mL. Para os valores mencionados, a sensibilidade e a especificidade variaram de 0,44 a 1,00 e 0,41 a 1,00 respectivamente. Os dois últimos trabalhos de meta-análise supra-citados mostram o importante papel do AMH em predizer PR apesar de não haver um consenso no valor de corte do AMH até então, na época da realização destes trabalhos. Temos em 2011 a publicação do consenso da ESHRE, de Bologna estabelecendo de forma oficial o valor de corte do AMH em predizer PR, cujos nossos resultados, 0,97 ng/mL é concordante com a publicação da ESHRE. Os autores Almong et al.(2011) construíram um normograma para o AMH a partir da concentração sérica basal deste hormônio em 2770 pacientes inférteis sem SOP de 15 centros acadêmicos de reprodução da Europa e América do Norte. Aplicando-se nossos valores de AMH neste normograma, encontramos que PR (AMH de 0,56 ng/mL) encontram-se entre o percentil 10 (AMH de 0,30 ng/mL) e 25 (AMH de 0,70 ng/mL). Pacientes NR (AMH de 2,52 ng/mL) encontram-se entre o percentil 50 (AMH de 1,83 ng/mL) e 75 (AMH de 3,33 ng/mL). Nelson et al.(2011) também elaboraram um normograma para o AMH, analisando 4590 pacientes entre 25 anos e 45 anos. Aplicando-se o normograma para a nossa casuística, as pacientes PR e NR também estariam entre percentil 10 a 25 e 50 a 75 respectivamente, respeitando suas faixas de idade. 51 Em nosso estudo, a avaliação ecográfica para a CFA encontrou para todo o grupo uma média de 9,12 ± 4,90 folículos, sendo 5,15 ± 1,91 folículos para as PR e 11,78 ± 4,48 folículos para as NR. A diferença da CFA para os grupos em estudo foi estatisticamente significante (p<0,001). Os autores La Marca et al.(2011) construíram um normograma para a CFA, analisando 362 mulheres com menos de 50 anos de idade, com ciclos menstruais regulares, ambos os ovários presentes e livres de patologia endócrina, hiperandrogenismo entre outras. Aplicando-se o normograma para nossa casuística, as pacientes PR (5,15 folículos) estariam entre o percentil 5 (2,9 folículos) e o percentil 25 (5,5 folículos). As pacientes NR (11,78 folículos) encontram-se entre o percentil 50 (9,4 folículos) e o percentil 75 (12,8 folículos), respeitando as suas respectivas faixas de idade. Almong et at.(2011) também elaboraram um normograma para a CFA por avaliação ecográfica de 1866 pacientes sem SOP. Aplicando-se o normograma para a nossa casuística, as pacientes PR (5,15 folículos) estariam entre o percentil 10 (3,9 folículos) e o percentil 25 ( 6,3 folículos) enquanto que as NR (11,78 folículos) entre o percentil 50 (10,9 folículos) e o percentil 75 (14,2 folículos). Com o objetivo de entender a CFA como preditor de PR em pacientes em programação de FIV, foi realizado um estudo de meta-análise selecionando-se 11 importantes trabalhos, totalizando 1760 ciclos de FIV. Dos trabalhos selecionados, 2 consideraram folículos antrais entre 2mm e 5mm e 1 entre 2mm e 6 mm. Os valores de corte para CFA variaram de 3 a 10 folículos. Os autores concluíram que CFA é superior ao FSH em predizer PR (Hendriks et al.,2005). 52 Da mesma forma Rosen et al.(2011) compararam a CFA e o FSH de um grupo de 881 pacientes inférteis sem causa aparente com idade entre 25 anos e 45 anos com o seu grupo controle constituído por 771 mulheres férteis. Encontraram que a média da CFA foi de 10 para o primeiro grupo contra 14, diferença estatisticamente significante, porém a concentração de FSH foi de 6,9 vs 6,4. Estratificando as idades em 4 grupos, observaram que a média da CFA para o grupo inférteis e seu controle foi de 16 vs 20 para pacientes entre 25 anos e 30 anos. Pacientes entre 31 anos e 35 anos a CFA foi de 11 vs 15 e 9 vs 12 para àquelas entre 36 anos e 40 anos. Às com idade entre 41 anos e 45 anos apresentaram 7,5 folículos para o grupo infértil contra 7 para seu grupo controle. As diferenças encontradas entre a 3 primeiras faixas de idade foram estatisticamente significativas. Os autores concluíram que a CFA é menor em pacientes inférteis e que esta diminui com a idade. Assim a CFA poder um ser um poderoso instrumento para avaliar o potencial de fertilidade das mulheres. A primeira publicação correlacionando a estratificação da CFA ao AMH foi realizada por Jayaprakasan et al.(2010). Num total de 113 pacientes em programação de FIV, estas foram previamente submetidas ao exame ecográfico com ultrassom 3D, bem como dosagens de FSH, E2, Inibina B e AMH. A partir de um programa de computador do aparelho de ultrassonografia, identifica-se cada folículo, calculando-se seu diâmetro e volume. A CFA foi estratificada em coortes conforme o diâmetro dos folículos, de 1mm em 1mm, desde < 2mm até a última coorte de folículos > 9mm a 10mm. Os autores encontraram uma forte relação da CFA de folículos menores ou seja até 6mm de diâmetro com a 53 concentração sérica de AMH e o número de oócitos maturos recuperados. Folículos maiores ou seja, > 6 mm a 10 mm apresentaram uma fraca relação com a concentração de AMH. Segundo os autores, estes achados sustentam a hipótese que a coorte de folículos antrais menores representa a reserva ovariana funcional quantitativa. Observaram que 71,5% da CFA eram formadas por folículos entre 2 mm a 6 mm, portanto sugerem que esta coorte seja mais apropriada para representar a CFA. Verificaram que as coortes de folículos entre 2 mm a 5mm, 2 mm a 8mm e 2 mm a 10mm apresentavam similar desempenho em predizer PR, independentemente do diâmetro do folículo antral. Uma vez que pela fisiologia há maior expressão de AMH nos folículos pré-antrais e antrais pequenos, até 4mm a 5 mm de diâmetro e considerando que em folículos acima de 6mm a expressão do AMH encontra-se diminuída, segundo Weenen et al.(2004), optamos em classificar a CFA em maiores para o somatório de folículos antrais ≥ 6mm e CFA menores para folículos antrais < 6mm dos grupos em estudo. Encontramos que a CFA menores em pacientes PR e NR apresentavam respectivamente 2,60 ± 1,70 e 7,34 ± 4,13 folículos. Para a CFA maiores os valores encontrados para o grupo PR e NR foram respectivamente 2,55 ± 1,22 e 4,46 ± 3,32 folículos. As diferenças encontradas para a CFA menores e maiores nos grupos PR e BR foram estatisticamente significante (p<0,001). Os pesquisadores brasileiros Souza et al.(2008), estudaram a CFA basal de 51 pacientes com idade ≤ 37 anos em programação de FIV e correlacionaramnos aos resultados obtidos. Observaram uma correlação estatisticamente 54 significante entre a CFA e o número de oócitos captados. Dicotomizaram a CFA em CFA ≥ 6 folículos e CFA < 6 folículos. Os autores encontraram que pacientes com CFA ≥ 6 folículos o número de oócitos captados foi de 11,5 ± 4,8 folículos e aquelas com CFA < 6 folículos o número de oócitos foi de 5,4 ± 5,0 (p= 0,0001). Em nossa metodologia a mensuração do folículo antral foi realizada medindo-se o maior diâmetro do antro ao invés do diâmetro médio. Para folículos circulares ambos os métodos se equivalem porém se aplicarmos o diâmetro médio para folículos de forma elíptica encontraremos que a sua média é menor que o maior diâmetro, assim a população da CFA menores tende a aumentar em detrimento da diminuição da CFA maiores, tornando mais relevante a CFA menores. Na mudança de metodologia em se mensurar o folículo antral, a CFA total não se altera. Neste estudo os achados são concordantes com os trabalhos de Jayaprakasan et al.(2010). Em nosso estudo foi realizada a análise da curva ROC para os marcadores da reserva ovariana e observamos que os melhores em predizer PR em ordem decrescente foram AMH, CFA totais, CFA menores, CFA maiores, Inibina B e FSH. Os três últimos marcadores apresentam eficiência e produto muito semelhantes e próximos. À semelhança do AMH, a CFA pode nos auxiliar na prática clínica em predizer a resposta ovariana, estimar o risco de cancelamento de ciclo, selecionar e otimizar protocolos de indução bem como selecionar pacientes candidatas à FIV (Styer et al., 2011). 55 Analisando a associação de marcadores da reserva ovariana em predizer PR em pacientes em programação de FIV, Verhagens et al.(2008) realizaram um estudo de meta-análise, selecionando 11 trabalhos. Analisaram a associação de marcadores da reserva ovariana em predizer PR, em várias combinações. Os autores concluíram que a CFA é o marcador de primeira escolha para avaliar a diminuição da reserva ovariana. Observamos que as melhores associações de marcadores da reserva ovariana em predizer PR são aquelas com contêm o AMH e/ou CFA. Em nosso estudo fica evidente a relevância do AMH e a CFA, identificando-os como os melhores marcadores da reserva ovariana, cujo valor de corte definido neste trabalho está de acordo com o consenso da ESHRE em Bologna. Por meio de um exame não invasivo e barato, a USGTV, encontramos na CFA menores, juntamente à CFA total, um importante marcador em predizer PR. A CFA menores passa a ser uma opção na avaliação da reserva ovariana podendo sensibilizar a CFA total. Esta pesquisa pode ser completada pelo AMH e/ou FSH. A partir do atual e recente consenso da ESHRE de Bologna em definir PR, novos estudos de marcadores da resposta ovariana poderão ser realizados de forma que possam ser comparáveis, melhorando e tornando mais confiáveis suas informações e marcadores. 56 6 – CONCLUSÃO 57 Conclusão: 1 – O hormônio anti-Mülleriano e a contagem de folículos antrais encontram-se diminuídos em pacientes com pobre resposta ovariana submetidas à FIV, cujos os valores de corte para identificar este grupo de pacientes foi de 0,97 ng/mL e 8 folículos respectivamente, segundo critérios selecionados. 2 – Por meio da metodologia aplicada neste estudo identificou-se a dosagem basal do hormônio anti-Mülleriano como o melhor marcador para predizer pobre resposta ovariana, seguido pela contagem de folículos antrais. 58 7 – ANEXOS 59 Anexo 1. N° NOME idade (anos) Infertilidade Tempo Inf (anos) Fator Peso (Kg) Altura (m) IMC Kg/m2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 ALL SMC MAS MAS JGA MAGS VAA APN LFS CRJM RACM LSRL GC VLF GBC ALL SV EMAS LSS SCS IS EDB IIPS AMM ASP EOP RPNF MM MACM VRO EAS RASS EFS 35 42 35 39 38 35 38 31 42 41 41 41 30 40 35 38 41 37 40 39 40 39 37 40 39 39 41 42 38 42 39 38 39 1 2 1 2 1 1 2 1 2 1 1 2 2 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 5 9 6 8 6 7 6 5 4 3 7 5 5 10 6 6 5 5 6 5 6 6 5 5 6 5 8 8 5 5 7 5 6 MASC FTP EDT FTP MASC MASC EDT MASC MASC FTP EDT FTP FTP FTP FTP MASC MASC MASC MASC MASC FTP FTP MASC ESCA MASC MASC ESCA MASC MASC EDT MASC MASC MASC 50 68 55 40 66 88 57 63 66 71 75 74 75 40 60 51 75 72 47 59 59 77 65 59 78 69 67 71 71 69 73 71 69 1,67 1,50 1,65 1,55 1,68 1,60 1,50 1,70 1,61 1,62 1,67 1,66 1,62 1,50 1,59 1,67 1,68 1,68 1,56 1,67 1,54 1,69 1,59 1,61 1,70 1,60 1,69 1,66 1,69 1,57 1,69 1,66 1,54 17,9 30,2 20,2 16,6 23,3 34,3 25,3 21,8 25,46 27,0 26,9 26,8 28,5 17,7 23,7 18,2 26,5 25,5 19,3 21,1 24,8 26,9 25,7 22,7 26,9 26,9 23,4 25,7 24,8 28,0 25,5 25,7 29,1 34 LHC 34 1 5 MASC 69 1,58 27,6 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 LAC DFDL SCS LRS SPSO SP MPRP AACO TCAGA RDC MSCA MNC CABD HHML ACS MCM 40 38 36 40 42 38 42 40 41 34 36 42 41 42 36 33 1 1 1 2 1 1 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 6 4 5 11 5 6 7 13 5 5 5 4 8 5 5 3 MASC FTP EDT FTP MASC MASC FTP ESCA FTP FTP MASC MASC EDT EDT MASC MASC 83 58 60 65 102 69 57 77 49 66 56 67 58 64 58 60 1,72 1,60 1,67 1,60 1,70 1,56 1,50 1,65 1,45 1,53 1,66 1,65 1,63 1,58 1,60 1,66 28,0 22,6 21,5 25,4 35,3 28,3 25,3 28,3 23,3 28,2 20,3 24,6 21,8 25,6 22,6 21,7 60 N° 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 10 101 102 103 NOME idade (anos) SPS 31 FDO 40 AFM 43 JMP 38 SK 30 LGDL 31 RAM 35 ECCB 37 LCLD 28 RCC 39 JCSS 28 AAR 29 MMS 31 ACPO 26 MLSM 37 IJP 37 CSRS 33 SMLS 33 MAPN 33 ACOM 32 VCBCG 36 FRC 36 TCM 38 QPS 39 EAG 32 ASP 36 SEM 34 EAAA 36 CZLCB 40 EGSP 31 MAS 39 BFASC 36 SLS 39 GCB 36 TS 34 FAT 33 IAF 29 ECPM 34 CJN 32 RZAL 32 KAS 31 FTG 35 LMM 42 HMSS 42 PPM 31 CSS 26 LMC 34 MAZF 30 GS 38 STA 33 VCS 35 JHP 36 MCBF 42 Infertilidade 1 1 2 1 2 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 2 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 1 2 2 Tempo Inf (anos) 5 8 7 6 4 4 5 6 4 3 5 4 3 3 7 6 6 5 7 4 7 10 7 5 13 2 6 5 7 8 5 12 6 3 3 5 9 3 5 6 8 5 5 10 5 5 6 4 8 5 6 7 8 Fator MASC EDT ESCA MASC ESCA MASC MASC MASC FTP EDT MASC MASC MASC FTP EDT FTP ESCA FTP FTP ESCA MASC MASC MASC MASC MASC FTP MASC FTP FTP MASC FTP FTP FTP MASC MASC MASC MASC FTP MASC EDT FTP ESCA MASC FTP MASC MASC FTP EDT FTP ESCA MASC FTP FTP Peso (Kg) 60 61 75 67 69 58 64 69 72 65 70 73 63 69 70 52 63 74 72 57 70 70 78 86 79 57 53 55 56 56 70 78 46 61 59 69 63 71 64 67 59 72 83 66 69 66 84 65 58 65 72 68 71 Altura (m) 1,66 1,58 1,68 1,59 1,71 1,63 1,67 1,68 1,63 1,58 1,63 1,66 1,59 1,71 1,58 1,57 1,58 1,40 1,61 1,55 1,63 1,65 1,70 1,64 1,67 1,71 1,57 1,58 1,64 1,62 1,70 1,64 1,46 1,55 1,55 1,60 1,61 1,68 1,60 1,65 1,62 1,63 1,68 1,59 1,65 1,63 1,66 1,70 1,54 1,68 1,60 1,62 1,65 IMC Kg/m2 21,7 24,4 26,5 26,5 23,6 21,8 23,0 24,4 27,1 26,1 26,3 26,5 25,0 23,6 28,1 21,1 25,2 37,7 27,7 23,7 26,3 25,7 27,0 32,0 28,3 19,5 21,5 22,0 20,8 21,3 24,2 29,0 21,6 25,4 24,5 26,7 24,3 25,1 25,0 24,6 22,5 27,1 29,4 26,1 25,3 24,8 30,5 22,5 24,4 23,0 28,1 25,9 26,1 61 N° NOME idade (anos) Infertilidade Tempo Inf (anos) Fator Peso (Kg) Altura (m) IMC Kg/m2 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 SMC PHNS DMB KLF ALKM PMFO AMM KF IMG IXP EFS AGS MSCA EMO ADPG AHT RA ESA LBR TCAB RMP RMSR SCS MSZ SPP DVN CSS JOS RCO 38 35 35 35 30 33 34 38 37 34 39 25 36 35 36 32 35 37 30 43 36 37 29 37 36 29 32 38 39 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 5 5 5 4 5 9 5 6 6 5 6 4 5 5 4 5 7 7 4 8 5 5 5 5 6 5 5 6 11 FTP EDT ESCA EDT MASC MASC MASC MASC ESCA FTP ESCA MASC FTP MASC ESCA MASC FTP FTP MASC FTP FTP MASC MASC EDT MASC MASC FTP MASC MASC 73 97 61 73 75 65 63 72 65 63 48 58 86 75 62 63 46 84 97 43 71 64 51 71 56 68 54 78 65 1,67 1,50 1,63 1,58 1,63 1,64 1,63 1,60 1,59 1,65 1,48 1,64 1,66 1,62 1,56 1,64 1,52 1,80 1,50 1,53 1,60 1,48 1,64 1,65 1,68 1,53 1,52 1,70 1,72 26,1 43,1 23,0 29,2 28,2 24,1 38,6 28,1 25,7 23,1 22,0 21,5 31,2 28,5 25,4 23,4 20,0 26,0 43,1 18,3 27,7 29,2 19,0 26,0 19,8 29,0 23,3 27,0 22,0 62 N° NOME Gonadotrofina dose (UI) Dias de estímulo (dias) total de unidades (UI) CFA < 6 mm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 ALL SMC MAS MAS JGA MAGS VAA APN LFS CRJM RACM LSRL GC VLF GBC ALL SV EMAS LSS SCS IS EDB IIPS AMM ASP EOP RPNF MM MACM VRO EAS RASS EFS FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG HMG HMG HMG FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec HMG FSH-rec HMG FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec HMG HMG FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec 150 150 225 225 225 225 225 150 150 150 150 150 150 150 225 225 150 225 150 225 150 225 225 150 225 225 150 150 225 150 225 225 225 9 10 10 9 10 11 10 10 10 11 11 10 9 9 9 9 10 11 11 10 9 11 10 10 9 10 11 10 10 10 10 10 9 1350 1500 2250 2025 2250 2475 2250 1500 1500 1650 1650 1500 1350 1350 2025 2025 1500 2475 1650 2250 1350 2475 2250 1500 2025 2250 1650 1500 2250 1500 2250 2250 2025 2 2 3 1 1 4 4 9 2 4 1 1 1 3 2 2 4 6 2 3 3 2 2 4 3 0 7 3 3 2 1 1 0 34 LHC FSH-rec 150 9 1350 3 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 LAC DFDL SCS LRS SPSO SP MPRP AACO TCAGA RDC MSCA MNC CABD HHML ACS MCM HMG FSH-rec FSH-rec HMG HMG FSH-rec HMG HMG HMG FSH-rec FSH-rec HMG HMG HMG FSH-rec FSH-rec 150 225 225 150 150 225 150 150 150 150 225 150 150 150 225 150 11 11 11 12 12 8 10 12 8 8 9 11 10 10 9 10 1650 2475 2475 1800 1800 1800 1500 1800 1200 1200 2025 1650 1500 1500 2025 1500 3 1 2 1 2 2 3 2 4 3 2 0 4 4 6 2 63 N° NOME Gonadotrofina dose (UI) 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 10 101 102 103 SPS FDO AFM JMP SK LGDL RAM ECCB LCLD RCC JCSS AAR MMS ACPO MLSM IJP CSRS SMLS MAPN ACOM VCBCG FRC TCM QPS EAG ASP SEM EAAA CZLCB EGSP MAS BFASC SLS GCB TS FAT IAF ECPM CJN RZAL KAS FTG LMM HMSS PPM CSS LMC MAZF GS STA VCS JHP MCBF 150 150 150 225 150 150 225 225 150 225 150 150 150 150 225 225 150 150 150 150 225 225 225 225 150 225 150 225 150 150 225 225 150 225 150 150 150 150 150 150 150 225 150 150 150 150 150 150 225 150 225 225 150 FSH-rec HMG HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG Dias de estímulo (dias) 9 9 10 9 9 10 10 10 9 10 9 9 10 10 10 10 12 11 13 10 10 9 11 12 10 10 10 9 10 10 9 11 9 9 10 9 10 9 10 10 10 9 10 10 9 10 12 9 10 10 10 10 10 total de unidades (UI) 1350 1350 1500 2025 1350 1500 2250 2250 1350 2250 1350 1350 1500 1500 2250 2250 1800 1650 1950 1500 2250 2025 2475 2700 1500 2250 1500 2025 1500 1500 2025 2475 1350 2025 1500 1350 1500 1350 1500 1500 1500 2025 1500 1500 1350 1500 1800 1350 2250 1500 2250 2250 1500 CFA < 6 mm 2 2 2 8 11 7 8 9 12 5 7 8 10 16 3 12 7 5 11 7 8 5 6 4 14 13 5 0 6 11 4 5 5 18 4 13 3 13 9 2 3 4 14 6 13 8 6 10 5 9 4 10 3 64 N° NOME Gonadotrofina dose (UI) Dias de estímulo (dias) total de unidades (UI) CFA < 6 mm 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 SMC PHNS DMB KLF ALKM PMFO AMM KF IMG IXP EFS AGS MSCA EMO ADPG AHT RA ESA LBR TCAB RMP RMSR SCS MSZ SPP DVN CSS JOS RCO FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec HMG FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec FSH-rec 225 225 150 225 150 150 150 225 225 150 225 150 225 225 225 150 225 225 150 150 225 225 150 225 225 150 150 225 225 10 9 9 10 9 10 9 9 10 9 12 8 10 11 10 9 10 11 11 11 13 10 11 9 9 10 9 10 9 2250 2025 1350 2250 1350 1500 1350 2025 2250 1350 2700 1200 2250 2475 2250 1350 2250 2475 1650 1650 2925 2250 1650 2025 2025 1500 1350 2250 2025 12 2 14 18 0 7 5 6 7 10 4 5 5 10 4 3 3 4 6 4 5 6 7 18 4 9 6 2 5 65 N° NOME CFA ≥6mm CFA total N° de oócitos recuperados AMH ng/mL Inibina B ng/ mL FSH UI/L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 ALL SMC MAS MAS JGA MAGS VAA APN LFS CRJM RACM LSRL GC VLF GBC ALL SV EMAS LSS SCS IS EDB IIPS AMM ASP EOP RPNF MM MACM VRO EAS RASS EFS 3 3 3 1 2 3 3 1 3 3 1 2 3 2 6 2 3 2 2 1 1 1 3 2 2 6 2 1 0 3 2 2 3 5 7 6 2 3 7 7 10 5 7 2 2 4 5 7 4 7 8 4 4 4 3 5 6 5 6 9 4 3 5 3 3 3 3 3 3 1 2 3 3 2 3 3 1 3 3 1 3 3 2 3 3 3 2 1 1 2 2 3 3 2 2 2 1 1 1 1,04 0,76 0,59 0,3 0,66 0,36 0,13 0,93 0,59 0,87 0,08 0,64 0,43 0,31 0,35 0,2 0,52 0,4 0,25 0,4 0,22 0,11 0,29 0,45 0,38 1,27 0,92 0,27 0,17 0,23 0,6 0,96 0,31 79,8 49,8 46,7 68,3 19,3 9,1 78,5 94,5 39,1 57,9 8,9 49,5 97 14,2 78 22,1 54,1 52,1 91,9 32,8 64 10,2 20,1 17,8 8,6 59,4 59,2 39,1 25,9 55,4 26,66 66,03 17,98 8,23 9,24 11,21 4,49 5,57 7,53 11,42 6,30 15,26 10,80 14,87 12,29 6,81 18,24 9,77 13,91 12,06 12,56 11,27 22,31 8,02 2,90 17,39 6,25 5,91 4,86 15,69 15,55 5,25 13,67 4,51 13,1 5,16 34 LHC 3 6 3 0,37 26,04 4,10 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 LAC DFDL SCS LRS SPSO SP MPRP AACO TCAGA RDC MSCA MNC CABD HHML ACS MCM 2 3 1 4 0 2 4 4 3 4 4 4 3 3 3 3 5 4 3 5 2 4 7 6 7 7 6 4 7 7 9 5 1 3 1 1 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 1,05 0,78 0,35 0,57 0,08 0,21 0,85 0,3 0,26 0,58 0,57 0,35 0,55 0,12 0,58 0,91 49,6 40,3 78,43 42,47 5,27 48,05 20,15 3,72 15,19 65,34 8,06 29,14 65,41 32,55 52,1 65,5 4,44 6,50 9,68 11,76 3,26 5,94 9,36 12,52 9,76 12,38 4,55 14,36 11,16 12,75 5,69 8,78 66 N° NOME CFA ≥6mm CFA total N° de oócitos recuperados AMH ng/mL Inibina B ng/ mL FSH UI/L 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 10 101 102 103 SPS FDO AFM JMP SK LGDL RAM ECCB LCLD RCC JCSS AAR MMS ACPO MLSM IJP CSRS SMLS MAPN ACOM VCBCG FRC TCM QPS EAG ASP SEM EAAA CZLCB EGSP MAS BFASC SLS GCB TS FAT IAF ECPM CJN RZAL KAS FTG LMM HMSS PPM CSS LMC MAZF GS STA VCS JHP MCBF 3 3 2 6 5 7 2 2 1 1 17 14 3 1 5 1 1 3 6 0 3 4 8 2 5 0 4 6 9 2 6 1 4 2 4 1 2 1 2 14 3 5 2 1 0 2 4 5 8 3 9 3 4 5 5 4 14 16 14 10 11 13 6 24 22 13 17 8 13 8 8 17 7 11 9 14 6 19 13 9 6 15 13 10 6 9 20 8 14 5 14 11 16 6 9 16 7 13 10 10 15 13 12 13 13 7 1 1 1 6 9 10 6 5 7 5 6 14 11 11 5 11 10 5 15 9 6 4 5 6 12 15 5 6 11 9 5 6 6 15 5 16 5 13 7 15 5 7 9 6 5 5 8 7 7 5 7 6 4 3,41 0,86 0,7 3,22 1,58 1,69 1,47 3,73 7,09 1,34 8,48 6,53 1,41 1,78 3,67 4,41 1,15 1,65 7 1,15 2,59 1,7 0,94 1,72 1,23 4,17 2,69 1,02 2,41 1,26 1,13 1,18 2,22 2,43 1,81 3,94 1,5 2,45 1,23 2,68 0,67 1,01 1,87 0,7 0,92 1,12 1,1 1,17 3,81 15 2,18 1,41 1,53 44,2 60,76 36,3 101,99 97,34 106,02 54,56 101,61 71,92 77,5 80,91 191,27 61,69 85,25 59,7 71,1 82,3 32,8 31,5 87,9 61 121,9 73,2 72,1 109,5 36,8 62,7 75,2 84,3 60,5 84,6 13,7 82 95,8 67,1 58,4 68,8 39,4 52,1 64,8 76,7 80 29 45,2 45,2 80 45,7 106,4 79,8 45,5 82 55,6 78,5 5,81 5,14 19,56 7,20 7,16 7,62 7,55 4,95 7,87 6,58 6,98 6,86 6,40 7,29 7,52 5,78 8,22 3,06 1,51 4,32 6,17 5,31 5,44 5,01 5,05 11,1 4,66 5,91 6,75 5,54 6,22 4,29 6,42 7,31 9,89 5,15 11,74 5,58 8,35 7,21 9,76 7,73 6,05 11,31 7,06 8,6 5,72 7,15 4,84 5,71 6,03 5,24 11,95 67 N° NOME CFA ≥6mm 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 SMC PHNS DMB KLF ALKM PMFO AMM KF IMG IXP EFS AGS MSCA EMO ADPG AHT RA ESA LBR TCAB RMP RMSR SCS MSZ SPP DVN CSS JOS RCO 4 6 3 4 13 1 6 4 9 3 4 4 4 2 3 4 2 6 5 4 4 5 8 10 4 5 6 8 7 CFA total N° de oócitos recuperados 16 8 17 22 13 8 11 10 15 13 8 9 9 12 7 7 5 10 11 8 9 11 15 28 8 14 12 10 12 12 5 6 8 9 11 6 5 9 7 6 5 5 7 9 4 4 6 7 4 5 8 7 17 6 7 8 7 7 AMH ng/mL Inibina B ng/ mL FSH UI/L 2,43 1,77 1,06 4,3 7,13 3,4 1,37 1,03 7,43 2,87 0,53 1,89 0,86 2 3,29 0,98 0,72 1,62 1,2 0,82 1,41 1,52 5,68 4,21 1,18 2,6 2,02 0,49 3,25 40,6 115,6 29,5 25,9 103,9 80 80,3 73,4 74,2 51,1 55,4 62,2 27,59 34,41 51,15 69,13 11,78 119,66 75,95 35,03 58,25 31,31 55,8 121,21 75,33 60,45 71,92 40,3 96,1 8,90 7,05 7,60 5,86 4,99 7,37 10,29 7,45 9,74 6,66 3,73 4,55 8,13 9,13 6,59 5,70 5,10 6,56 4,40 8,85 10,97 6,78 5,08 4,31 8,56 8,81 5,26 7,87 4,51 68 8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69 Al-Azemi M, Killick SR, Duffy S, Pye C, Refaat B, Hill N, et al. 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Tufano Douglas, Michaelis – Guia Prático da Nova Ortografia, Ed Melhoramentos 78 RESUMO 79 “Concentração sérica do hormônio anti-Mülleriano e contagem de folículos antrais como marcadores da resposta à estimulação ovariana controlada em mulheres com indicação de Fertilização In Vitro” O hormônio anti-Mülleriano (AMH) e a contagem do número de folículos antrais (CFA) recentemente tem sido propostos como marcadores da resposta ovariana frente ao estímulo ovariano controlado em pacientes visando à Fertilização In Vitro (FIV). O AMH é produzido pelas células da granulosa dos folículos pré-antrais e antrais pequenos, assim a CFA é a expressão anatômica de um marcador bioquímico, o AMH. Objetivo: Avaliar o AMH e a CFA como marcadores da resposta folicular em pacientes que serão submetidas à indução da ovulação para FIV.Casuística e método: Foram selecionadas 132 pacientes de um centro de reprodução humana de um serviço acadêmico com indicação de FIV. Analisaram-se as concentrações séricas de AMH, Inibina B e FSH e CFA totais, CFA menores (2mm a < 6mm) e CFA maiores (6mm a 10mm) no terceiro dia do ciclo. Estas pacientes foram submetidas ao protocolo longo de indução da ovulação sendo posteriormente classificadas em pobres respondedoras (PR) e normorrespondedoras (NR), com base no número de oócitos recuperados na aspiaração folicular. Resultados: Observou-se que as alterações de AMH, Inibina B, FSH, CFA totais, CFA menores e maiores nos grupos PR e NR foram estatisticamente significantes. Encontraram-se os valores de corte de AMH, Inibina B, FSH e CFA totais, menores e maiores de 0,97 ng/mL, 68,55 ng/mL, 9,185 UI/L e 8, 5 e 4 folículos, respectivamente, em predizer PR. Conclusões: Por meio da curva ROC, o AMH seguido pela CFA totais e a CFA menores parecem ser os melhores marcadores em predizer PR em pacientes submetidas à FIV. 80 ABSTRACT 81 “Serum concentrations of anti-Müllerian hormone and antral follicle count as markers of the response to ovarian stimulation in women with indication for In-Vitro Fertilization.” The Anti-Müllerian hormone (AMH) and the antral follicle count (AFC) have recently been proposed as markers of ovarian response to controlled ovarian stimulation in patients seeking In-Vitro Fertilization (IVF). The AMH is produced by the granulosa cells of the small pre-antral and antral cells, thus AFC is the anatomical expression of a biochemical marker, AMH. Objective: To assess AMH and AFC as markers of follicular response in patients who are to undergo ovulation induction for IVF. Cases and method: One hundred and thirty-two patients with indications for IVF were selected from a human reproduction center of an academic service. Serum concentrations were analyzed of AMH, Inhibin B, FSH, and total AFC, as well as the counts of smaller antral follicles [AF] (2 to <6 mm) and larger AF (6 to 10 mm) on the third day of the cycle. These patients were submitted to the long ovulation induction protocol and were later classified as poor responders (PR) and normal responders (NR), based on the number of oocytes retrieved. Results: Alterations of AMH, Inhibin B, FSH, total AFC, and counts of smaller and larger AF noted in groups PR and NR were statistically significant and their cut-off values in predicting PR were 0.97 ng/mL, 68,55 ng/mL, 9.185 UI/L, and 8, 5, and 4 follicules, respectively. Conclusions: Using the ROC curve, the AMH followed by total AFC and smaller AF count seemed to be the better markers in predicting PR for patients submitted to IVF. 82 LISTAS E APÊNDICES 83 APÊNDICE – 1 A força centrífuga é definida pela fórmula abaixo e expressa em unidades de gravidade ( g ). g = (1,118 x 10-5 ) R S 2 R = raio S= velocidade Exemplo: Centrífuga com comprimento do braço de 12 cm ( R ) a uma velocidade S ) 3000 RPM (Rotação Por Minuto) g = ( 1,118 x 10-5 ) 12 x (3000)2 g = 1207 84 85 86 87