CLART EnteroBac Portugues V1 June 2011

CLART EnteroBac
DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS ENTÉRICAS
CAUSADORAS DE DIARREIA
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
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CLART e CLART-Strip são marcas registadas de GENOMICA
Para mais informações e questões, não hesite em visitar www.genomica.es
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Espanha
Tel: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
www.GENOMICA.es
Versão 1
Junho de 2011
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ÍNDICE:
1. GLOSSÁRIO DE TERMOS
2. DESCRIÇÃO
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DO KIT
3.1. Reagentes de extração, purificação e amplificação
3.2. Reagentes de visualização
3.3. Outros componentes
4. MATERIAL ADICIONAL
4.1. Reagentes e material
4.2. Equipamento
5. PROCEDIMENTOS E RECOMENDAÇÕES DE MANIPULAÇÃO
5.1. Recomendações gerais
5.2. Precauções para a extração
5.3. Precauções para a visualização
6. AMOSTRAS: AMOSTRAS FECAIS
7. PROTOCOLOS DE TRABALHO
7.1. Extração automática do ADN de microrganismos presentes em
amostras fecais
7.2. Reação de amplificação
7.3. Visualização do produto amplificado
8. LEITURA DE RESULTADOS
9. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
11. BIBLIOGRAFIA
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1. GLOSSÁRIO DE TERMOS
Consultar Instruções de Utilização
Prazo de validade
Dispositivo para diagnóstico in vitro
Lote
25ºC
Conservar à temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC e 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre -30 ºC e -18 ºC
- 30ºC
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2. DESCRIÇÃO
CLARTEnteroBac deteta a presença das seguintes bactérias entéricas causadoras de
diarreia:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Salmonella spp. (todas as espécies descritas)
Shigella spp. (S. dysenteriae, S. Sonnei, S. boydii e S. flexneri)
Yersinia enterocolítica
Yersinia spp. (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolítica)
Campylobacter spp. (C. lari, C. laridis, C. upsaliensis, C. jejuni, C. coli)
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli
Escherichia coli enteropatogénica EPEC: (E. coli enterohemorrágica, E. coli
enteroinvasiva, E. coli enterotoxigénica e E. coli enteropatogénica)
Clostridium difficile B
Aeromonas spp, produtores de aerolisina
A deteção dos diferentes microrganismos é conseguida através da amplificação por PCR
de uma codificação específica de regiões para as enterotoxinas e fatores de virulência
para os microrganismos incluídos no kit e para genes constitutivos de Salmonella spp. e
Campylobacter spp.
A amplificação foi realizada em dois tipos diferentes de tubos de PCR. Os tubos de “Mix
1” são brancos e permitem a amplificação e subsequente deteção de Shigella spp,
Yersinia enterocolítica, Yersinia spp., Campylobacter coli, Campylobacter jejuni,
Escherichia coli EPEC, Clostridium difficile B e Aeromonas produtoras de aerolisina. Os
tubos de “Mix 2” são verdes e contém tudo o que é necessário para a amplificação e
deteção de Salmonella spp. e Campylobacter spp.
A plataforma baseia-se numa micro matriz de baixa densidade, fixa na base de uma tira
de 8 poços (CLART® Strip-CS) (Figura 1), proporcionando um meio muito eficiente e fácil
de usar o sistema. Esta tecnologia permite a deteção simultânea de múltiplos marcadores
moleculares para uso diagnóstico, ao mesmo tempo que proporciona os controlos
necessários para assegurar a fiabilidade dos resultados. Além disso, este sistema
simplifica consideravelmente os processos de hibridização e visualização, quando
comparado com os sistemas clássicos de micro matriz.
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®
Figura 1: Plataformas CLART em forma de tira de 8 poços (CS).
A hibridização do produto de PCR amplificado é detetada pela criação de um precipitado
insolúvel nos locais de micro matriz, onde os produtos amplificados foram recolhidos por
sondas. Este facto é conseguido utilizando oligonucleotídeos marcados com biotina. Os
produtos de amplificação biotinilados hibridizam-se nas suas sondas específicas, ligadas
à superfície de micro matriz, e imobilizam-se. Estes produtos biotinilados imobilizados são
reconhecidos pela estreptavidina de um conjugado de estreptavidina-peroxidase,
proporcionando assim atividade de peroxidase aos produtos hibridizados. Posteriormente,
a atividade de peroxidase metabolizará a o-dianisidina e produzirá um produto insolúvel
que se precipitará nos locais onde ocorreu a hibridização (Figura 2).
Matriz de sondas
Marcação
Biotina
Hibridização
Conjugação
Conjugado
do catalisador
Reação de revelação
Substrato
precipitado
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Figura 2: Diagrama do método de visualização. As sondas, imobilizadas sobre a superfície, captam os seus produtos
amplificados complementares marcados com biotina. Com a ajuda da biotina, o conjugado liga-se, neste caso, à
estreptavidina-HRP (HorseRadish Peroxidase = Peroxidase de Armorácia). Devido à ação da HRP, o substrato de odianisidina produz uma precipitação no local de hibridização.
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DO KIT
CLART EnteroBac Kit contém reagentes suficientes para a extração e análise de ADN
de 48 amostras clínicas. Estes reagentes estão acondicionados em duas caixas distintas,
dependendo da temperatura a que devem ser conservados. Todos os reagentes
fornecidos são estáveis nas condições adequadas até ao prazo de validade indicado.
3.1. Tubos de amplificação
Os tubos de amplificação contêm 45 µl de mistura de reação. Estão prontos a serem
utilizados e devem ser conservados a -20ºC. Só o número necessário de tubos deve ser
descongelado sobre gelo quando forem precisos, enquanto os restantes devem ser
mantidos a –20ºC.
No kit, estão incluídos dois tubos de amplificação diferentes:
-
Mix 1: Tubo branco. Amplificação de Shigella spp, Yersinia spp., Campylobacter
coli, Campylobacter jejuni, Escherichia coli EPEC, Clostridium difficile e
Aeromonas produtoras de aerolisina. Neste “mix”, estão incluídos um controlo de
amplificação interno e um controlo de extração.
-
Mix 2: Tubo verde. Amplificação de Salmonella spp. e Campylobacter spp. Está
incluído um controlo de amplificação interno diferente do controlo interno do Mix 1.
- CE ADN (controlo de extração). Controlo de extração de ADN humano genómico.
Nota: o kit inclui uma tira adesiva indicadora de temperatura. Se aparecer uma luz
vermelha na janela de visualização da tira indicadora de temperatura, o kit não deve
ser utilizado porque a temperatura de conservação pode ter sido ultrapassada.
3.2. Reagentes de visualização
ADVERTÊNCIA: Após a receção, as micro matrizes devem ser conservadas à
temperatura ambiente.
•
•
Micro matrizes: Tiras de poços CS (incluindo as sondas específicas). Estas são
entregues num envelope selado. Após a abertura, o envelope deve ser fechado
e conservado a temperatura ambiente, protegido da luz.
RE (Revelador). Conservar a 4ºC.
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•
•
•
•
•
SH (Solução de hibridização). Conservar a 4ºC.
DC (Solvente do conjugado). Conservar a 4ºC.
CJ (Conjugado). Conservar a 4ºC. Centrifugar ligeiramente antes de utilizar.
TL (tampão de lavagem). Conservar a 4ºC.
Suporte e tampa para a tira de 8 poços.
3.3. Outros componentes
- CAR (Clinical Array Reader): o que permite a leitura e interpretação automática
até 12 CS, ou seja, um total de 96 amostras. Esta plataforma é fabricada
exclusivamente para a GENOMICA, para só ser utilizada com os seus kits.
- Adaptador do suporte para colocar sobre a bandeja do CAR, de modo a encaixar
a placa de microtitulação antes da leitura.
- Software: É específico para CLART EnteroBac, desenhado e validado por
GENOMICA. Instalado e pronto a utilizar.
CAR
(Clinical Array Reader)
Figura 3: Leitor CAR.
4. MATERIAL ADICIONAL
4.1. Reagentes e material
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•
•
•
•
•
•
•
Água destilada
Luvas descartáveis
Deslocamento positivo ou pontas de pipeta com filtro
Recipiente com gelo picado
Tubos Eppendorf esterilizados (1,5 ml)
Suportes para tubos de 1,5 ml
Suportes para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
5.2. Equipamentos
•
•
•
•
•
•
•
Microcentrífuga
Termociclador
Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1.000 µl) para utilização no
laboratório de extração.
Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, 20-200 µl e 200-1.000 µl) para utilização no
laboratório de visualização.
Termoblocos (a 37°C, 55°C e 100ºC) com um agitador ajustável e compatível com
os tubos Eppendorf.
Vórtex
Sistema a vácuo
5. PROCEDIMENTOS E RECOMENDAÇÕES DE MANIPULAÇÃO
Muito importante: ler cuidadosamente esta secção antes de iniciar qualquer
trabalho.
5.1. Recomendações gerais
1. O procedimento deve ser realizado em duas áreas separadas fisicamente. Isto
evitará a contaminação de amostras com os produtos anteriormente amplificados. Cada
área deve ter os seus próprios materiais de trabalho identificados (pipetas, pontas, tubos,
suportes, luvas, etc.) que nunca devem sair da respetiva área.
•
•
Área Pré-PCR: as amostras são preparadas e o ADN é extraído. Manipulações
das amostras fecais deve ser feito dentro da cabina de segurança.
Área Pós-PCR: os produtos são amplificados e, depois, visualizados. O material
desta área nunca deve entrar em contacto com o material da área pré-PCR.
DEPOIS DE TRABALHAR NA ÁREA PÓS-PCR, NÃO RETORNE À ÁREA PRÉPCR.
2. Use sempre luvas. Recomenda-se a troca frequente de luvas, embora seja obrigatório
trocá-las antes de começar a trabalhar em cada uma das áreas supramencionadas.
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Devem ser utilizadas luvas novas para a preparação dos tubos de amplificação e sempre
que se adicionar ADN aos tubos.
3. Limpe as áreas de trabalho (bancadas de laboratório, coberturas, grelhas, pipetas,
termociclador) cuidadosamente com desinfetante diluído a 10% após o processamento
de cada lote de amostra; é obrigatório desinfetar todas as áreas de trabalho para evitar
contaminações.
4. Utilize sempre pontas de pipetas com filtro ou pipetas de deslocamento positivo para
evitar contaminações.
5. Utilize materiais de laboratórios esterilizados (em autoclave) e descartáveis.
6. Nunca misture reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que pertençam ao mesmo
lote.
7. Feche imediatamente os tubos dos reagentes depois da utilização, para evitar a
contaminação.
8. Elimine as pontas das micropipetas depois da utilização.
9. Mantenha sempre os tubos afastados uns dos outros durante a manipulação com
especial cuidado, durante as fases de extração.
10. A GENOMICA não assume qualquer responsabilidade em relação aos resultados
obtidos sem seguir as instruções contidas neste manual.
5.2. Precauções para a extração
Muitos dos microrganismos no kit CLART® EnteroBac fazem parte da flora normal do trato
digestivo humano, pelo que é preciso ser extremamente cuidadoso aquando do
processamento da amostra clínica.
• Use sempre luvas.
• Calce as luvas, tendo o cuidado para os dedos só tocarem nas extremidades.
• Limpe as superfícies de trabalho com lixívia diluída a 10%.
• Ligue o fluxo laminar e a luz UV, pelo menos, 20 minutos antes da extração.
• A preparação das amostras antes da extração deve ser feita dentro da cabina.
5.3. Precauções para a visualização
1. Evite que a ponta da pipeta ou o sistema a vácuo toque no fundo do tubo onde se
encontra a micro matriz.
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2. Recomenda-se a adição de todas as soluções sobre a parede local da CS nunca
diretamente sobre o fundo.
3. Só se deve adicionar a solução de hibridização imediatamente antes de adicionar os
produtos de PCR.
4. Aquando da utilização da CS, ficará um ligeiro volume residual para evitar a secagem
da matriz.
5. Após a incubação com o conjugado, é muito importante lavar cuidadosamente a CS
para evitar que qualquer conjugado remanescente reaja com o revelador.
6. Evite bolhas sobre a superfície da micro matriz, quando adicionar as diferentes
soluções.
7. Mantenha a base da CS limpa para evitar a possível interferência, aquando da leitura
dos resultados.
8. Quando visualizar a imagem no leitor, confirme o aparecimento de marcadores de
posição e que não há bolhas ou manchas a interferir na leitura. Se necessário, limpe a
base do tubo com papel de celulose ou tape suavemente o tubo com o dedo.
6. AMOSTRAS: AMOSTRAS FECAIS
O kit CLART EnteroBac foi concebido e validado para ser utilizado em amostras fecais(1).
A GENOMICA não se responsabiliza pelos resultados quando se utilizarem outras
amostras.
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1. Extração Automática de ADN
1. Preparação da amostra antes da extração (realizada fora do equipamento).
Recomendado para todos os equipamentos automáticos.
• Transfira 1 g de amostra fecal e ressuspenda em 2 ml de solução salina
(cloreto de sódio a 0,9%). Centrifugue durante 2 minutos a 1.500 rpm.
Nota: As manipulações das amostras fecais devem ser feitas na cobertura
de segurança.
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•
Retire o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml esterilizado e elimine o
agregado.
•
Centrifugue a 13.000 rpm durante 5 minutos, para concentrar o agregado
bacteriano.
• Elimine o sobrenadante e ressuspenda em 1,5 ml de solução salina (cloreto
de sódio a 0,9%). Ressuspenda vigorosamente.
• Transfira 275 µl para um novo tubo. Adicione 25 µl de CE ADN (controlo de
extração).
• Transfira a mistura para o extrator.
2. Lise interna e extração de ADN num equipamento de extrator automático. Siga o guia
de utilizador do computador. O volume de eluição selecionado é 110 µl. Este volume pode
variar dependendo da instrumentação do extrator automático utilizado. Se o aparelho tiver
vários programas de lavagem, selecione a opção mais abrangente (como por exemplo,
protocolo específico B no Nuclisens easyMAG da bioMérieux).
3. Depois da extração, retire 110 µl do ADN eluído com a micro pipeta e introduza-os nos
tubos Eppendorf de 1,5 ml. Utilize 5 µl em cada tubo de amplificação e conserve o resto a
-20°C.
O rendimento mínimo estimado da extração de ADN necessário para a amplificação bemsucedida é 5 ng/µ
µl.
7.2. Reação de amplificação
Recomendações específicas para a amplificação:
• Trabalhe na área de pré-PCR, utilize sempre a cobertura e siga as
recomendações descritas em 5.1.
• Adicione o ADN aos tubos de amplificação sempre sob cobertura. Durante
o processo, mantenha os tubos separados no gelo.
1. Descongele um tubo de reação Mix 1 e Mix 2 para cada amostra e mantenhaos no gelo. Não utilize temperaturas superiores a 37ºC para descongelar.
2. Centrifugue os tubos de reação numa microcentrífuga, de modo a que todo o
líquido vá para o fundo (se não houver adaptadores disponíveis para segurar nos
tubos de reação, estes podem ser colocados em tubos maiores sem tampas).
3. Adicione 5 µl do ADN extraído de cada amostra aos tubos “Mix 1” e “Mix 2” e
ressuspenda várias vezes com uma micro pipeta. Deixe os tubos no gelo.
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5. Programe o termociclador da seguinte forma:
1 ciclo
45 ciclos
95ºC 5 minutos
95ºC 30 segundos
53ºC 30 segundos
72ºC 1 minuto
1 ciclo
72ºC 10 minutos
4ºC (mantido) até à recolha dos tubos (opcional)
6. Inicie o programa e coloque os tubos Mix 1 e Mix 2 no termociclador quando o
bloco estiver acima dos 90ºC. Isto minimiza quaisquer amplificações não específicas
devido à hibridização que ocorre abaixo da temperatura de reação. O processo de
amplificação dura cerca de 3 horas e meia, embora este tempo possa variar
dependendo do termociclador utilizado.
7.3. Protocolo de Visualização para CLART® Strip (CS)
Recomendações específicas antes de iniciar o processo de visualização:
O PROTOCOLO DESCRITO ABAIXO DEVE SER REALIZADO NA ÁREA PÓS-PCR.
NUNCA LEVE O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA PRÉ-PCR.
1. No início do ensaio:
• Ligue o Leitor CAR (Clinical Arrays Reader) para permitir a autocalibração do
aparelho.
• Introduza a identificação das amostras. É importante ter o equipamento já
preparado para ler as amostras no fim do ensaio, de modo a que estas fiquem
expostas a um tempo de revelação excessivo.
2. Ligue o termomisturador a uma temperatura de 56ºC, pelo menos 30 minutos
antes de iniciar o processo de hibridização.
3. Conserve a SH (Solução de Hibridização) à temperatura ambiente.
4. Prepare a solução de lavagem antes de cada ensaio. Não utilize soluções
anteriores ou quaisquer restos de outros ensaios.
5. Antes de iniciar o programa de desnaturação, lave o termociclador com lixívia
diluída a 10%. Durante o processo de desnaturação, coloque os tubos de
amplificação separados no termociclador. A desnaturação não deve ultrapassar
os 10 minutos.
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6. Não é necessário utilizar pontas com filtro durante o processo de visualização,
exceto quando se adiciona produtos amplificados a cada poço. No entanto,
deve ser utilizada uma ponta diferente para cada amostra e para cada reagente.
Esta precaução também se deve aplicar ao tampão TL.
7. Os pentes de 8 pontas utilizados com as bombas de aspiração devem ser
eliminados após a utilização ou descontaminados com uma solução de lixívia
diluída a 10% após cada ensaio. Certifique-se de que a bomba de vácuo
funciona corretamente e não deixa resíduos de líquido nos poços.
8. Todos os tampões devem ser aspirados cuidadosamente dos poços sem tocar
no fundo.
VISUALIZAÇÃO
1. Desnaturação: utilize o termociclador para desnaturar as amostras.
Regule o programa para 15 minutos, a 95º C. Coloque os produtos amplificados
no termociclador e incube durante 10 minutos, a 95º C. Passados 10 minutos,
retire os tubos do termociclador (ainda a 95oC) e coloque-os imediatamente no
gelo.
2. Prepare a solução TL diluída:
Para 8 poços (uma tira), adicione o seguinte:
•
1 ml de solução TL + 9 ml de água destilada. Isto constituirá os 10 ml
de solução TL necessária para uma tira.
3. Pré-lavagem da CS:
Adicione 200 µl de solução TL diluída a cada matriz e ressuspenda 10 a 15
vezes com a pipeta. Elimine a solução TL diluída usando uma pipeta ou, de
preferência, um sistema a vácuo.
Este passo é necessário para lavar as CSs já embaladas, antes de adicionar a
amostra. A CS não deve conter resíduos da solução de lavagem. Em
circunstância alguma, deve deixar-se que as CSs sequem durante um longo
período.
4. Hibridização: A solução de hibridização (SH) deve ser aquecida a 56°C de modo
a dissolver os sais cristalizados. Adicione 100 µl de tampão SH (evitando o
aparecimento de espuma) + 5 µl de produto desnaturado do tubo Mix 1 e do
tubo Mix 2 a cada poço. Misture adequadamente com a pipeta evitando tocar na
matriz e incube a tira, coberta por uma tampa de plástico transparente, no
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termomisturador durante 30 minutos, a 56°C, com uma centrifugação de 550
rpm.
Para obter resultados corretos, os produtos amplificados dos tubos Mix 1 e
Mix 2 devem ser visualizados na mesma matriz.
Retire as CSs e elimine a solução SH usando uma pipeta ou um sistema a vácuo.
Programe o bloco de aquecimento para 30°C e deixe-o a funcionar para que
possa ser utilizado mais tarde no passo 6. Pode retirar a tampa do bloco de
aquecimento para o deixar arrefecer mais depressa.
5. Lavagem dupla: use pontas diferentes para cada poço em ambas as lavagens.
Lave duas vezes a CS com 200 µl de solução TL diluída em cada poço,
misturando 10 a 15 vezes com a pipeta. Elimine a solução TL diluída usando
uma pipeta ou um sistema a vácuo, deixando um volume remanescente. No
caso do bloco de aquecimento não ter atingido uma temperatura de 30°C
quando chegar a este passo, deixe as CSs cheias com solução TL diluída até o
bloco de aquecimento chegar à temperatura necessária.
6. Bloqueio e conjugado: Prepare a solução CJ diluída 15 minutos antes de o
tempo de hibridização acabar e mantenha-a no gelo até à sua utilização.
Recomenda-se a centrifugação do tampão CJ durante 10 segundos antes da
utilização.
Prepare o tampão CJ diluído: Para uma tira (8 poços), adicione o seguinte:
•
•
1 ml de tampão DC
9 µl de tampão CJ
No vórtex, agitar durante breves instantes a solução CJ diluída.
Retirar o tampão TL diluído sem secar a matriz e adicione 100 µl de tampão CJ
diluído para cada poço. Incube a 30°C, a 550 rpm, durante 15 minutos
exatamente no termomisturador.
Após esta incubação, pegue na tira e remova imediatamente o tampão CJ diluído
com a bomba.
(Regule o termomisturador para 25°C e sem centrifug ação para o passo 8. Retire
a tampa para acelerar o arrefecimento).
7. Tripla Lavagem: Adicione de imediato 200 µl de solução TL diluída por poço.
Misture bem 10 a 15 vezes com a pipeta e retire o tampão TL diluído com a
bomba sem deixar secar a matriz. Repita esta lavagem duas vezes e deixe a CS
com 200 µl de tampão TL a RT durante 5-10 minutos ou até o termomisturador
atingir os 25°C.
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É muito importante que o tampão CJ diluído seja completamente lavado.
Qualquer resíduo de tampão pode reagir com o tampão RE produzindo um sinal
não específico.
8. Relevar com tampão RE: retire o tampão TL diluído sem deixar secar a matriz e
adicione 100 µl de tampão RE por poço. Incube a 25°C no termomisturador
durante 10 minutos sem agitação.
Atenção! É muito importante utilizar o termomisturador sem agitação
neste passo.
9. Retire o tampão RE com a bomba. A matriz deve ser seca, nesta altura.
10. Leitor CAR (Clinical Array Reader): De modo a analisar as amostras, um
adaptador especial deve ser colocado sobre a bandeja do CAR. Depois, coloque a
placa normalmente na bandeja e o CAR procederá à análise automática das
matrizes.
8. LEITURA DE RESULTADOS
O processamento dos dados obtidos em cada análise é completamente automático. O
equipamento de leitura/análise fornecerá um relatório com os resultados.
No ecrã, aparecerá uma tabela com três colunas. A coluna da esquerda mostra o grupo
microbiano propício a ser detetado, a coluna central apresentará um resultado positivo ou
negativo para cada grupo microbiano e a coluna da direita mostrará se os controlos da
amplificação e da extração de ADN foram realizados em conformidade.
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Um dos principais inconvenientes da amplificação genómica é a utilização de amostras de
ADN de fraca qualidade (fragmentos de ADN demasiado curtos, degradação do ADN ou
perda do ADN durante a extração) ou a presença de inibidores da polimerase do ADN
(como por exemplo, a hemoglobina, resíduos de cera parafina, sais, etc.) nas amostras a
analisar, interferindo assim na amplificação genómica e resultando em falsos negativos.
No entanto, CLART EnteroBac elimina os falsos negativos através da utilização de
controlos internos nos mesmos tubos (Mix 1 e Mix 2) em que a amostra é analisada e são
amplificados ao mesmo tempo que o ADN microbiano.
No tubo Mix 1 existem oligonucleotídeos específicos que amplificam o controlo de
extração (CE ADN), que é adicionado à amostra antes da extração. A presença na matriz
de ADN genómico indica que o processo de extração foi adequado, eliminando assim
resultados negativos falsos devido a erros na extração.
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Para obter resultados corretos, a amostra tem de ser amplificada nos tubos Mix 1 e
Mix 2, e os produtos amplificados devem ser visualizados na mesma matriz.
Em cada conjunto de análise, deve ser incluído um controlo de extração negativo para
confirmar que as amostras não foram contaminadas durante a extração, amplificação e
visualização, dando assim origem a um falso positivo.
Cada tubo contém as seguintes bases de amplificação:
Mix 1:
• Duas bases que amplifiquem um controlo de extração
•
Duas bases que amplifiquem um plasmídeo modificado, incluído no tubo de
amplificação e usado como um controlo para a amplificação da reação PCR.
• Oligonucleotídeos específicos do alvo, concebidos para detetar agentes
patogénicos microbianos.
Mix 2:
• Duas bases que amplifiquem um plasmídeo modificado, incluído no tubo de
amplificação e usado como um controlo para a amplificação da reação PCR. Este
plasmídeo é diferente do incluído no tubo Mix 1.
•
Oligonucleotídeos específicos do alvo,
patogénicos microbianos.
concebidos para
detetar agentes
O tubo de reação foi concebido para favorecer a amplificação de microrganismos,
comparativamente aos outros dois controlos. Entre estes dois controlos, a amplificação do
ADN genómico será realizada de preferência, comparando o controlo da reação de
amplificação.
A razão para este design é:
O controlo genómico do ADN só seria essencial para confirmar um resultado negativo,
uma vez que confirma que a extração do ADN da amostra fecal foi realizada com
sucesso.
O controlo PCR só seria essencial quando não se encontrar amplificação no tubo porque
ajudará a distinguir entre um PCR inibido e uma amostra onde não há ADN.
Em certas condições (como por exemplo, elevada concentração de ADN microbiano),
pode ocorrer uma amplificação negativa dos dois controlos, ou de algum deles, exibindo
uma leitura: SEM SINAL.
Há duas possibilidades que podem levar a um resultado não válido:
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•
Extração não válida: A amplificação do alvo microbiano e/ou a amplificação da
extração e controlos de amplificação podem ser prejudicadas devido à
presença de inibidores de amplificação ou devido a um erro mecânico durante
a extração. O processo terá de ser repetido na totalidade.
•
Amplificação não válida: A presença microbiana num tubo e a ausência de
amplificação no outro indica um procedimento de extração válido, mas indica a
presença de um problema durante a amplificação. A amplificação com ambos
os tubos tem de ser repetida.
Há três possibilidades que podem levar a um resultado inconclusivo:
• Nos casos em que as réplicas de uma sonda da matriz sejam muito diferentes
umas das outras.
• Nas infeções múltiplas com mais de 3 bactérias.
• Quando a intensidade do sinal da absorção não normalizada se encontra no
limite de deteção da técnica, cuja amplitude é determinada pelo software para
cada tipo de microrganismo.
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
10.1. Conhecidas fontes de interferência
Certas substâncias podem interferir com o kit CLART EnteroBac. São principalmente
substâncias que inibem a mistura enzimática e, por conseguinte, inibem a reação de
amplificação. Os fatores mais comuns são os seguintes:
•
Utilização de amostra inadequadas. A análise de qualquer tipo de
amostras clínicas diferentes das especificadas no manual do kit CLART
EnteroBac, assim como a recolha incorreta de amostras, pode originar um
resultado de análise inconclusivo ou inválido, devido à falta de amplificação, em
consequência da falta de amostra ou de reação inibida.
•
A conservação inadequada de amostras pode influenciar o resultado da
análise. Se as amostras estão sujeitas a condições que podem resultar na
degradação do ADN, o resultado da análise pode levar a um falso negativo.
10.2. Especificações técnicas:
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Parâmetros analíticos:
• Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica dos microrganismos
apresentados no kit(2) foi determinada através da amplificação de uma série
de diluições de ADN de plasmídeos recombinantes com o produto
fragmentado de amplificação específico (incluindo a parte complementar da
sonda específica de deteção) para cada microrganismo. O passo de
visualização foi realizado em CLART® Strips, obtendo os mesmos resultados
agora resumidos na seguinte Tabela 1.
Microrganismo
Nº de cópias do plasmídeo
para a reação PCR
Yersinia enterocolítica
Escherichia coli (enteropatogénica)
100
Campylobacter jejuni
Shigella
Salmonella
Clostridium difficile
1000
Campylobacter coli
Aeromonas aerolisina +
Tabela 1. Número de cópias de plasmídeo recombinante necessário para obter 100% de
sensibilidade na deteção de cada um dos microrganismos.
• Especificidade analítica. Foram realizadas experiências de especificidade com 8
plasmídeos recombinantes(2), mostrando que não há uma deteção não específica de
outros microrganismos. Por conseguinte, é considerado que a técnica analítica
atinge uma especificidade de 100%.
Parâmetros de diagnóstico
Para determinar os parâmetros diagnósticos do kit CLART® EnteroBac, foram realizados
estudos comparativos com a caracterização da cultura fecal(1, 2).
Estas comparações foram feitas em colaboração com dois hospitais espanhóis e um
hospital português.
•
•
Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Germans Trías i Pujol,
Badalona, Barcelona.
Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Ramon y Cajal, Madrid.
19
Foi processado um total de 334 amostras de amostras fecais. A seguinte tabela ilustra
os dados de sensibilidade diagnóstica e especificidade para as espécies microbianas
detetadas no kit CLART® EnteroBac.
Os resultados de CLART® EnteroBac foram comparados com os resultados da técnica
de referência (cultura fecal + caracterização). Em caso de discrepâncias, os resultados
da sequenciação foram considerados como resultados válidos. Nesses casos
específicos, onde esta informação não estava disponível, as discrepâncias foram
avaliadas por uma Nested-PCR e posterior sequenciação do ADN.
N = 334
Campylobacter
Sensib Especificid
ilidade
ade
PPV
NPV
90,0
100,0
100,0 94,0
Salmonella
83,2
99,0
98,3
Clostridium difficile
83,0
100,0
100,0 97,7
Escherichia coli enteropatogénica
100,0
100,0
100,0 100,0
Shigella
94.4
100,0
100,0 99,7
89,4
®
Tabela 2. Sensibilidade e especificidade diagnóstica de CLART EnteroBac para cada
microrganismo. PPV: valor previsto positivo. NPV: valor previsto negativo.
•
Nesta validação, foram processadas 15 amostras de Aeromonas spp., nenhuma
delas positiva para a toxina aerolisina (alvo neste kit), pelo que os parâmetros
diagnósticos para este microrganismo não foram determinados.
•
Devido à baixa prevalência de Yersinia nas amostras utilizadas nesta validação, só
foram processadas 5 amostras com este microrganismo, não sendo suficiente
para calcular parâmetros diagnósticos fiáveis.
Especificidade diagnóstica.
A técnica também foi validada com culturas fecais negativas e com amostras fecais
com presença de microrganismos não sujeitos à identificação por CLART®EnteroBac, e
os resultados não revelaram reatividade cruzada, chegando a uma especificidade
diagnóstica mínima de 99%.
Reprodutibilidade e repetibilidade diagnóstica
Os dados obtidos são os seguintes:
•
Reprodutibilidade: 91,8 % (n=49 amostras)
20
•
Repetibilidade: 97,2 % (n= 48 amostras)
As amostras foram processadas desde o passo da extração.
Deteção de infeções múltiplas
Os resultados de CLART®EnteroBac mostram a presença de infeções múltiplas (duas
ou mais microrganismos) em 15,9% das amostras fecais analisadas contra 2,4% das
infeções múltiplas detetadas nas amostras fecais por caracterização da cultura,
sustentando a maior sensibilidade de CLART®EnteroBac para deteção de infeções
múltiplas versus os métodos clássicos de identificação da cultura.
21
BIBLIOGRAFIA
1. Alvarez, M., Buesa, J., Castillo. J. and J. Vila. ”Microbiologic diagnostic of enteric
diseases”. 2007. 2nd Ed. (24). Eds. Cercenado E. and R. Cantón. Proceedings in
clinical microbiology. Spanish Society of CIinical Microbiology (SEIMC).
2. Manjón, N., Moscoso, J., Margolles, Y., García, M., Morosini, M. I., Salazar, O.,
Cospedal R., Cantón, R., and M. L. Villahermosa. 2011. “Design and optimization of
microarray based in vitro assay, for the rapid identification of bacterial pathogens
responsible of infectious diarrhea”. 2011. Infectious diseases and Clínical
Microbiology. Vol 29, 33-34. 15th Congress of the Spanish Society of Clinical
Microbiology (SEIMC). Malaga, Spain. June 1st-4th 2011.
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