RTSG07-190 - Biometrix

Transcrição

Rev. 04 – Out/2013
RTSG07-190
Philadelphia P190 Q – PCR Alert Kit
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O kit PHILADELPHIA P190 Q-PCR Alert Kit, pronto para uso, é utilizado para
identificar o cDNA da translocação BCR-ABL, t(9;22), cromossomo Philadelphia, variante P190
(BCR-ABL P190) e na dosagem quantitativa do cDNA de BCR-ABL P190 normalizado em relação
ao cDNA do gene ABL no produto da reação de transcrição reversa, obtido a partir do RNA
extraído de amostras de sangue periférico, medula óssea e suspensões de leucócitos.
A identificação e a dosagem do cDNA de BCR-ABL P190 através de um teste de
amplificação podem ser empregadas para a verificação e monitoramento da presença desse
rearranjo nos casos de leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML) e
leucemia linfoblástica aguda (ALL).
PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO
O kit fornece AmpliMIX P190 uma mistura de oligonucleotídeos primer-específico para
BCR-ABL P190 e AmpliMIX ABL uma mistura de oligonucleotídeos primer-específico para ABL
para amplificação tipo Real Time (Tempo Real) em uma solução estabilizada.
O procedimento consiste de duas reações de amplificação em Tempo Real em dois
diferentes pocinhos de microplaca em um equipamento com um termostato programável fornecido
com sistema óptico de detecção fluorescente (RT-PCR = termociclador em Tempo Real).
Uma reação de amplificação específica para uma região variante P190 do mRNA do
rearranjo BCR-ABL, é realizada no primeiro pocinho, uma reação de amplificação específica
para a região ABL do mRNA (controle interno da amostra e sistema de referência) utilizando o
cDNA produto da reação de transcrição reversa do RNA extraído das amostras sendo testadas
é feito no segundo pocinho. Em cada reação de amplificação a sonda específica marcada com
fluoróforo FAM é ativada quando hibridizada com o produto específico da reação de
amplificação. A emissão fluorescente aumenta com o aumento do produto específico da
reação de amplificação e é medida e registrada pelo aparelho.
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A partir do momento que a sonda TaqMan® for ligada à parte específica do gabarito de
DNA, depois da desnaturação (alta temperatura) e resfriamento da reação, os primers se
anelam ao DNA. A Taq Polimerase, então, adiciona nucleotídeos e remove a sonda TaqMan®
do DNA gabarito. Isso separa o quencher do repórter e permite ao repórter emitir sua energia.
Isso é, então, quantificado usando um computador. Quanto mais ocorrer a desnaturação e
anelamento, mais oportunidades a TaqMan® terá de se ligar e, em contra partida, mais luz
emitida será detectada.
O corante do repórter é liberado da dupla
fita de DNA criada pela Taq Polimerase. Longe do
corante quencher, a luz emitida do corante
repórter dye em estado excitado pode, agora, ser
observada.
O processamento dos dados torna possível
determinar a presença e título de BCR-ABL P190
cDNA na amostra inicial quando comparada ao
cDNA ABL referencial.
A padronização do sistema foi realizada
nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM série 7000.
COMPONENTES FORNECIDOS
Componente
Philadelphia P190
Q-PCR Alert
AmpliMIX
- RTSG07-190-M
ABL Q-PCR Alert
AmpliMIX
- RTSG07-190-M
Philadelphia P190 QPCR Alert
AmpliPROBE
- RTSG07-190-P
ABL Q-PCR Alert
AmpliPROBE
- RTSG07-190-P
Q-PCR Alert
AmpliMASTER
- RTS000
Descrição
Quantidade
Composição
Mistura de primers de
oligonucleotídeos
2 x 110 µL
Oligonucleotídeos,
TRIS (base e cloridrato),
Glicerol, Triton X-100
Mistura de primers de
oligonucleotídeos
2 x 110 µL
Mistura de sondas
fluorescentes
marcadas com FAM /
TAMRA
Mistura de sondas
fluorescentes
marcadas com FAM /
TAMRA
Mistura de reagentes
optimizados
Microplaca com
96 pocinhos de 0,2 mL
Lâmina adesiva vedante
2 x 110 µL
2 x 110 µL
4 x 340 µL
Oligonucleotídeos,
Glicerol, Triton X-100
Oligonucleotídeos
fluorescentes, TRIS (base e
cloridrato), Glicerol,
Triton X-100
Oligonucleotídeos
fluorescentes, TRIS (base e
cloridrato), Glicerol,
Triton X-100
Glicerol, MgCl2,
Desoriboxinucleotídeos
trifosfatos, ROX, UracilN-glicosilase,
Taq DNA polimerase hot
start
3
Plástico PP
3
Plástico e cola
2
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MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Equipamentos:
- Capela de fluxo laminar.
- Agitador tipo Vórtex.
- Microcentrífuga de mesa (12.000 - 14.000 RPM).
- Micropipetas simples, volume variável.
- Real Time ABI PRISM 7000, completo com microcomputador.
Material de Consumo:
- EPI
- Ponteiras com filtro
- Água ultrapura
- Tubos de microcentrifugação (1,5 mL a 2,0 mL)
Amostras:
- DNA extraído por metodologia definida pelo usuário, seguindo as normas e padrões de
amostras exigidos na descrição abaixo.
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO
Componente
Philadelphia P190 Q-PCR Alert
AmpliMIX
Philadelphia P190 Q-PCR Alert
AmpliPROBE
Q-PCR Alert AmpliMASTER
Microplaca para amplificação
Lâmina adesiva para amplificação
Referência
modelo
Quantidade
Estocagem
RTSG07-190-M
4 x 110 µL
-20°C
RTSG07-190-P
4 x 110 µL
-20°C
4 x 340 µL
+ 2° / +8°C
3
Temp. Ambiente
3
Temp. Ambiente
RTS000
PRECAUÇÕES
Este kit é reservado para uso exclusivo em diagnóstico in vitro.
Manuseio: ao manusear o kit e as amostras, utilizar EPI adequado ao tipo de
laboratório onde os testes serão realizados, devido à natureza da amostra – material biológico
humano. Tratar como potencialmente infeccioso.
Não beber ou comer na área de trabalho.
A área de trabalho deve ser um ambiente limpo e com ventilação adequada. Trabalhar
dentro de capela de exaustão / fluxo laminar.
Não manusear o kit sem luvas.
Advertências e precauções gerais
Manipular e eliminar todas as amostras biológicas, reagentes e materiais usados como
se fossem agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas. Evitar a
formação de aerossol durante o procedimento – evite respingar material ao redor da área de
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trabalho ou fora dela. O material que está em contato com as amostras biológicas deve ser
tratado com Hipoclorito de sódio a 3 % pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em
autoclave a 121°C durante uma hora antes de ser eliminado. O material descartável
combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser
neutralizados antes da eliminação.
Não pipetar nenhuma solução com a boca .
Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes.
Eliminar reagentes e resíduos conforme as normas vigentes.
Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste.
Respeitar as instruções fornecidas no kit durante a execução do teste.
Respeitar a data de validade do kit.
Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante.
Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes.
Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes.
Advertências e precauções para a biologia molecular
Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a
amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para evitar o
risco de resultados incorretos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucleicos
das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação.
É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reações de
amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e
pós-PCR). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das
reações de amplificação.
É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de
biologia molecular.
As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras
devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras
diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as
amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo
deslocamento positivo ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem
ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.
Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes
necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única
vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente
para aquela área de trabalho. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar
ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de
DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA.
Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a
dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas
para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua
área de trabalho.
Advertências e precauções específicas para os componentes
Os produtos AmpliMIX, AmpliPROBE, AmpliSTANDARD, AmpliMASTER, apresentam as
seguintes advertências (S):
S 23-25. Não respirar vapores/aerossol. Evitar o contato com os olhos.
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Observações importantes:
• Os tubos que contêm o AmpliMIX e o AmpliPROBE são descartáveis e, portanto, devem
ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reação.
• Os tubos que contêm o AmpliSTANDARD® não podem ser congelados e descongelados
•
por mais de 8 vezes. Ciclos sucessivos de congelamento / descongelamento podem
causar perda no título.
Os tubos que contêm o AmpliMASTER® não podem ser congelados e descongelados por
mais de 1 vez. Ciclos sucessivos de congelamento / descongelamento podem causar
uma perda na eficiência da amplificação.
CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA
A amostra deve ser tratada como potencialmente infecciosa.
Amostras
O RNA deverá ser extraído de amostras de sangue periférico, medula óssea e
suspensões de leucócitos.
O material usado com este kit deve ser constituído pelo produto da reação de
transcrição reversa (cDNA) obtido do RNA extraído das amostras biológicas.
O sistema de transcrição reversa do RNA deve utilizar primers separados ao acaso para
disparar a reação de polimerização.
Quando se empregam amostras biológicas celulares, por exemplo, sangue total,
aconselha-se verificar a quantidade de RNA total extraído que é introduzida na reação de
transcrição reversa, para evitar o aparecimento de produtos específicos e possíveis
fenômenos de inibição na seguinte reação de amplificação.
A concentração final máxima do RNA total na reação de transcrição reversa deveria ser
de aproximadamente 40 ng/µL. Por exemplo, a quantidade máxima de RNA total que pode ser
introduzida em uma reação de transcrição reversa com volume final de 25 µL é de
aproximadamente 1 µg.
O sistema de extração do RNA da amostra inicial deve fornecer RNA adequado ao uso
em reações de transcrição reversa e amplificação.
Aconselha-se aliquotar amostras para sua conservação congelada de modo a não
submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos.
PROCESSO DE MEDIÇÃO
Preparo da etapa de amplificação real time – área de pós-PCR:
Antes de iniciar, consultar o manual do equipamento e:
- verificar se que o termociclador para real time esteja em grau de excitar os
fluoróforos das sondas empregadas e de misturar a emissão;
- programar a posição na microplaca das reações, o tipo de fluorescência para medir e o
tipo de reação (amostra, controle negativo de amplificação, standard a quantidade
reconhecida). Compilar a planilha anexada ao final destas instruções de uso
transcrevendo estas informações. A planilha deverá ser seguida com atenção durante a
transferência da mistura de reação e das amostras para os pocinhos ;
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Nota: para a determinação do título do cDNA na amostra de partida é necessário preparar
uma série de reações com o DNA standard em quantidade reconhecida (105 cópias, 104 cópias,
103 cópias, 102 cópias) para obter a Curva standard para BCR-ABL P190 e uma série de reações
com o DNA standard à quantidade reconhecida (105 cópias, 104 cópias, 103 cópias, 102 cópias)
para obter a Curva standard para ABL.
Ilustra-se a seguir, a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 11
amostras:
Significado:
P190 A1 a
P190 A11
P190 CN
Amostras a serem analisadas
para BCR-ABL P190
Controle negativo de
amplificação para BCR-ABL
P190
ABL A1 a
ABL A11
Amostras para analisar para
ABL
ABL CN
Controle negativo de
amplificação para ABL
2
P190 10
2
Standard 10 cópias para BCRABL P190
3
4
ABL 10
2
2
Standard 10 cópias para ABL
3
P190 10
ABL 10
3
3
4
P190 10
ABL 10
4
4
5
5
5
Standard 10 cópias para BCRP190 10
ABL 10
ABL P190
- programar no termociclador os parâmetros do ciclo térmico. Para equipamento
5
TM
Applied Biosystems ABI PRISM
da série 7000 escolher a opção «9600 emulation».
Ciclo térmico de amplificação
Fase
Temperaturas
Tempos
Descontaminação
50°C
2 min.
Desnaturação inicial
95°C
10 min.
95°C
15 seg.
60°C
1 min.
45 ciclos
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Preparação da amplificação:
Antes de iniciar, é necessário:
- retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Centrifugar os tubos por
5 segundos para obter no fundo todo o conteúdo. Mantê-lo em gelo;
- retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX P190 e de AmpliMIX ABL necessários para a
sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reações.
Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o conteúdo. Mantê-lo em
gelo;
- retirar e descongelar um número de tubos de AmpliPROBE P190 igual ao dos tubos de
AmpliMIX P190 e um número de tubos de AmpliPROBE ABL igual ao dos tubos de
AmpliMIX ABL. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o
conteúdo. Mantê-lo em gelo;
- retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX P190.
Escrever com tinta indelével "P190” e a data na etiqueta dos tubos. Centrifugar os
tubos por 5 segundos para obter no fundo todo o conteúdo. Mantê-lo em gelo;
- retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX ABL.
Escrever com tinta indelével "ABL" e a data na etiqueta dos tubos. Centrifugar os tubos
por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo. Mantê-lo em gelo;
- retirar e descongelar os tubos de AmpliSTANDARD P190 e de AmpliSTANDARD ABL
necessários. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo.
Mantê-lo em gelo;
- se necessário, cortar a microplaca para separar a parte que será utilizada na sessão
prestando atenção em manipular com luvas sem pó e de não causar danos aos poços.
1. Transferir 100 µL de AmpliMIX P190 no tubo de AmpliMASTER com a escrita “P190”.
Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µL na mix.
2. Transferir 100 µL de AmpliPROBE P190 no tubo de AmpliMASTER com a escrita “P190”.
Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µL na mix.
3. Misturar em o vórtex a baixa velocidade por 5 segundos, evitando produzir espuma.
4. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo.
5. Repetir o procedimento do ponto 1 ao ponto 4 com o reagente AmpliMIX ABL, o tubo
de AmpliMASTER com a escrita "ABL" e o reagente AmpliPROBE ABL.
6. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µL da mistura de reação
"P190” assim obtida nos poços da microplaca como estabelecido anteriormente na
Planilha de leitura montada anteriormente.
7. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µL da mistura de reação "ABL"
assim obtida nos poços da microplaca como estabelecido anteriormente na Planilha de
Leitura montada anteriormente.
Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reação, conservar o volume restante em ambiente
escuro a -20°C por um máximo de um mês no tubo "P190” e no tubo “ABL” Congelar e
descongelar a mistura de reação SOMENTE UMA VEZ.
8. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 5µL de cDNA da primeira
amostra nos correspondentes poços “P190” e “ABL” da microplaca como estabelecido
anteriormente no Plano de trabalho, proceder igualmente com todos os outros cDNA.
9. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 5µL de Água bidestilada estéril
(não fornecida no kit) nos poços “P190” e “ABL” da microplaca do controle negativo
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de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho.
10. Transferir, depositando cuidadosamente no fundo, 5uL do Padrão P190-ABL Q-PCR 102
cópias nos dois poços “P190” e nos dois poços “ABL” da microplaca de amplificação,
como previamente estabelecido no procedimento da planilha (worksheet) e deste
modo para os outros padrões P190-ABL Q-PCR (103, 104, 105 cópias).
11. Fechar cuidadosamente a microplaca com a lâmina adesiva.
12. Transferir a microplaca no termociclador para real time e iniciar o ciclo térmico de
amplificação.
CALIBRAÇÃO DO PROCESSO
Para este tipo de ensaio e metodologia não existe procedimento de calibração para o
processo de medição.
CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS
Análise Qualitativa dos resultados
Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para o P190 (FAM) nas
reações de amplificação do P190 e pela sonda específica para ABL (FAM) nas reações de
amplificação ABL precisam ser analisadas pelo software do instrumento.
Antes de analisar, é necessário:
- Manualmente, ajustar a faixa de cálculo do nível de fluorescência de fundo (Baseline) do
ciclo 6 ao ciclo 15*;
- *Obs.: No caso de uma amostra positiva com alto título de P190 ou ABL, a fluorescência
FAM da sonda específica para o P190 ou ABL pode começar a crescer antes do 15° ciclo.
Neste caso a faixa de cálculo da “baseline” precisa ser ajustada do ciclo 6 ao ciclo em que
a fluorescência FAM começa a crescer.
- Manualmente, ajustar o Threshold (valor limiar) da fluorescência emitida pela sonda
específica para P190 (fluorescência FAM) para 0.2;
- Manualmente, ajustar o Threshold (valor limiar) da fluorescência emitida pela sonda
específica para ABL (fluorescência FAM) para 0.2;
Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas nas reações de amplificação e os
valores de Threshold da fluorescência são usados para determinar o ciclo Threshold (cT), o ciclo térmico
no qual o valor de fluorescência do Threshold é alcançado.
Nas reações do Standard 105, o valor de cT é usado para validar a sessão de
amplificação como mostrado nas tabelas a seguir:
Reação do Standard 105
Resultado do teste
Amplificação / Detecção
P190 (FAM)
cT ≤ 25
POSITIVO
CORRETO
5
Reação do Standard 10
Resultado do teste
ABL (FAM)
cT ≤ 25
POSITIVO
CORRETO
8
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Se o resultado da reação de amplificação do Standard 105 é Indeterminado ou com cT > 25, isso
significa que o DNA alvo não foi detectado. Problemas ocorreram durante a fase de amplificação ou
detecção (volumes da mistura de reação incorretos, degradação da sonda, degradação do padrão,
dispensação incorreta dos padrões, incorreto ajuste de posicionamento, ajuste incorreto do
termociclador) que podem ter levado a resultados errados. A sessão está inválida e precisa ser repetida
a partir da fase de amplificação.
Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para P190 e ABL nas
reações de amplificação do Controle Negativo e os valores de Threshold são usados para
validar a amplificação e detecção como mostrado na seguinte tabela:
Reação dos Controles Negativo
Resultado do Teste
P190 (FAM) e ABL (FAM)
cT Indeterminado
NEGATIVO
CORRETO
Se o resultado da reação de amplificação do Controle Negativo é diferente de cT
indeterminado, isso significa que o DNA alvo foi detectado na reação de amplificação através
da determinação do ciclo de Threshold (cT), no qual o valor de Threshold da fluorescência foi
alcançado. Problemas ocorreram durante a fase de amplificação (contaminação) o qual
podem ter acarretado resultados incorretos e falsos positivos. A sessão é inválida e precisa ser
repetida da fase de amplificação.
Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas para P190 e ABL nas
reações de amplificação de cada amostra e o valor de cT são usados para detectar a presença
de DNA alvo e para validar a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção.
NOTA: verificar através do software se o cT está sendo determinado por um rápido e regular aumento
do valor de fluorescência, e não por um pico isolado ou aumento do sinal de fundo.
Este produto está em condições de detectar um mínimo de 10 cópias de cDNA P190 por reação
de amplificação (verificar dados em Características de Desempenho).
Os resultados de cada amostra são usados para detectar o P190, conforme mostrado na
tabela seguinte:
Reação da amostra
Adequação da Resultado do
cDNA P190
amostra
teste
P190 (FAM)
ABL (FAM)
cT Indeterminado
cT Determinado
cT > 29 ou
Indeterminado
Inadequada
cT ≤ 29
Adequada
cT> 29 ou
Indeterminado
Adequada *
cT ≤ 29
Adequada
Inválido
-
Válido,
negativo
Válido,
positivo
Válido,
positivo
NÃO
DETECTADO
PRESENTE
PRESENTE
Se o resultado da reação de amplificação da amostra é cT Indeterminado para cDNA
P190 e cT>29 ou Indeterminado para cDNA ABL, isso significa que cDNA ABL não foi
detectado de modo eficiente. Neste caso, problemas ocorreram durante a fase de
amplificação (amplificação inválida ou ineficiente) ou na fase de transcrição reversa
(transcrição reversa ineficiente ou inválida) ou na fase de extração (ausência de DNA ou
presença de inibidores) os quais podem ter causado resultados incorretos e falsos negativos. A
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amostra não é adequada, o ensaio é inválido e precisa ser repetido começando pela extração
de uma nova amostra.
Se o resultado da reação de amplificação das amostras é cT Indeterminado para cDNA P190
e cT≤29 para cDNA ABL, isso significa que cDNA P190 não foi detectado no cDNA obtido da amostra,
mas não é possível excluir a presença de cDNA P190 em título menor que o limite de detecção do
produto (verificar parágrafo que trata de Características de Desempenho). Neste caso o resultado
seria um falso negativo.
Os resultados obtidos neste ensaio precisam ser interpretados levando-se em consideração
todos os dados clínicos e outros testes de laboratório feitos no paciente.
*OBS.: quando cDNA P190 foi detectado na reação de amplificação da amostra, mas a
amplificação do cDNA ABL mostra cT>29 ou indeterminado, isso significa que a amostra está
ainda adequada em termos de qualidade e o resultado positivo do ensaio é válido. Neste caso,
entretanto, não é possível usar os dados para as análises quantitativas dos resultados.
Análise Quantitativa dos resultados
Depois de realizado o procedimento de análise qualitativa dos resultados é possível
executar a análise quantitativa dos resultados de amostras positivas.
Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para P190 e ABL nas
reações de amplificação dos Padrões Q-PCR são usados para calcular as duas Curvas Padrões
da sessão de amplificação e para validar a amplificação e detecção como mostrado na tabela
seguinte:
P190 (FAM) e ABL (FAM)
Faixa aceitável
Curva Padrão
Coeficiente de Correlação (R2)
0,990 ≤ R2 ≤ 1,000
CORRETO
Se o coeficiente de correlação (R2) não está dentro dos limites significa que problemas
ocorreram durante a fase de amplificação ou detecção (preparo incorreto da mistura de
reação, dispensação incorreta da mistura de reação ou dos padrões, degradação da sonda ou
padrão, posicionamento incorreto dos padrões, ajuste incorreto do termociclador) o que pode
ter levado a resultados incorretos. A sessão é inválida e precisa ser repetida a partir da fase
de amplificação.
Os valores de fluorescência emitidos pela sonda específica para P190 nas reações de
amplificação de cada amostra e a Curva padrão P190 da sessão de amplificação são usados
para calcular a Quantidade (Quantity) de DNA alvo presente nas reações de amplificação das
amostras.
Este produto está em condições de medir de 1.000.000 a 10 cópias de cDNA P190 por
reação de amplificação (verificar dados no parágrafo de Característica de Desempenho)
conforme mostrado na tabela a seguir:
Resultado da amostra - P190 (FAM)
Quantity > 1 x 10
6
1 x 10¹ ≤ Quantity ≤ 1 x 10
Quantity < 1 x 10¹
cDNA de P190 por reação
MAIS QUE 1.000.000 DE CÓPIAS
6
= Quantity
MENOS QUE 10 CÓPIAS
Este produto está em condições de medir de 1.000.000 a 100 cópias de ABL cDNA por
reação simples de amplificação (verificar Características de Desempenho); entretanto para os
propósitos de medição quantitativa, o intervalo útil é de 1.000.000 a 1000 cópias
10
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(correspondendo a um cT de cerca de 29), como mostrado na tabela abaixo:
Resultado da amostra - ABL (FAM)
cDNA de ABL por reação
Quantity > 1 x 10
6
MAIOR QUE 1.000.000 DE CÓPIAS
~ 1 x 103 ≤ Quantity ≤ 1 x 10
Quantity < ~ 1 x 10
3
6
= Quantity
MENOR QUE 1.000 CÓPIAS (AMOSTRA
INADEQUADA)
Análises de Repetições
Quando este produto é usado para medição de P190, os resultados (Quantity) das
reações de amplificação nas amostras são usados para calcular o número de cópias de cDNA
de P190 normalizados ao total de cópias de cDNA de ABL (% P190) disponíveis na amostra
inicial, de acordo com a fórmula:
Quantity de cDNA de P190
% P190 = ------------------------------------------ x 100
Quantity de cDNA de ABL
Antes de calcular % P190 é necessário analisar os dados obtidos nas duas amostras
repetidas. A tabela seguinte mostra diferentes casos que podem ocorrer em uma sessão de
amplificação e a aproximação recomendada para estimar os dados que precisam ser
interpretados considerando todos os outros dados clínicos e testes de laboratórios com
relação ao paciente:
Quantidade
Adequação da
Quantidade de
Amostra
cDNA P190
de cDNA de
Amostra
cDNA de P190
ABL
Quantidade
1ª Repetição
Adequada
PRESENTE
Quantidade média
média de
de cDNA P190
2ª Repetição
Adequada
PRESENTE
cDNA ABL
1ª Repetição
Adequada
2ª Repetição
Adequado
NÃO DETECTADO
1ª Repetição
Adequada
PRESENTE (<10 cópias)
2ª Repetição
Adequada
NÃO DETECTADO
1ª Repetição
Adequada
PRESENTE (>10 cópias)
2ª Repetição
Adequada
NÃO DETECTADO
1ª Repetição
Inadequada
2ª Repetição
Adequada
1ª Repetição
Inadequada
2ª Repetição
Inadequada
0
Quantidade
média de
cDNA de ABL
Quantidade de
cDNA P190, se
presente
Quantidade
média de
cDNA ABL
NÃO DETECTADO
Retestar a Amostra
PRESENTE OU NÃO
DETECTADO
PRESENTE OU NÃO
DETECTADO
Retestar a Amostra
PRESENTE OU NÃO
DETECTADO
PRESENTE OU NÃO
DETECTADO
Retestar a Amostra
11
Rev. 04 – Out/2013
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
Com este produto, usar somente cDNA obtido por transcrição reversa de RNA extraído
das seguintes amostras humanas: sangue periférico coletado em EDTA, sangue de medula
óssea coletado em EDTA, suspensões de linfomonócitos e suspensões de leucócitos.
A RT-PCR é um processo dinâmico que requer altas condições de controle para garantir
amplificação discriminatória. O procedimento (Instruções de Uso) deve ser seguido
rigorosamente.
A amostra de DNA extraída fornece um molde para um processo de amplificação
específico e, desta forma, a concentração e a pureza devem estar dentro dos valores
especificados no produto.
Todos os instrumentos (máquina RT-PCR, pipetas, centrífuga) devem ser calibrados de
acordo com as recomendações do fabricante.
Não utilizar com este produto o cDNA extraído das amostras heparinizadas: A heparina
inibe a reação de amplificação dos ácidos nucleicos e causa resultados inválidos.
Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenômenos de inibição por parte
dos medicamentos antivirais, quimioterápicos ou imunossupressores.
Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta, transporte,
conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorretos, é necessário
portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções
fornecidas com os produtos para a extração dos ácidos nucleicos.
O método de amplificação Real Time dos ácidos nucleicos utilizados neste produto, por
causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito à contaminação por parte das
amostras clínicas positivas para o DNA de PHILADELPHIA P190 , dos controles positivos e dos
mesmos produtos da reação de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos
positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes
fenômenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e
seguindo atentamente as instruções fornecidas nestas Instruções de Uso.
Este produto requer pessoal instruído para as manipulações de amostras biológicas que
podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes classificados como perigosos para evitar
incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas.
Este produto requer roupa de trabalho (EPI) e área de trabalho adequadas à
manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de reagentes
classificados como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves
para o usuário ou outras pessoas.
Este produto requer pessoal instruído para o procedimento de biologia molecular,
como a extração, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos para evitar resultados
incorretos.
Este produto requer uma área separada para a extração/preparação das reações de
amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação para evitar
resultados falsos positivos- áreas de pré e pós-PCR.
Este produto requer o uso de roupas de trabalho (EPI) e instrumentos destinados à
extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de
amplificação para evitar resultados falsos positivos.
Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de PHILADELPHIA
P190 não está detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA
de PHILADELPHIA P190 esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do
produto, neste caso o resultado será um falso negativo.
12
Rev. 04 – Out/2013
Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este
produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de
laboratório relativos ao paciente.
Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter
resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco residual
não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco residual em situações
particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões incorretas com
consequências graves para o paciente.
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
Controle de Qualidade
É aconselhável validar o procedimento completo de análise de cada extração,
transcrição e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva.
Controles de Amplificação
É necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reação de
controle negativo e uma reação de controle positivo já seja para BCR-ABL P190 como para
ABL.
Para o controle negativo utilizar água bidestilada estéril (não fornecida no kit) para
acrescentar à reação no lugar do cDNA extraído da amostra.
Para o controle positivo utilizar o cDNA obtido de uma amostra positiva já testada ou o
kit «Q - PHILADELPHIA AmpliSTANDARD P190 » já seja para BCR-ABL P190 como para ABL.
Notas específicas para reação de Transcrição Reversa:
O kit <<RT – kit plus>> é um sistema de transcrição reversa de RNA, o qual utiliza
primers selecionados ao acaso (random primers) para desencadear a reação de polimerização
e requer a adição de 10 µL de RNA extraído para alcançar um volume final de 25 µL.
A quantidade ótima de RNA total a ser liberado dentro de uma reação de transcrição
reversa com um volume final de 25 µL é de aproximadamente 1 µg.
VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS,
EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS
Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Sensibilidade Analítica: Limite de Detecção para P190
A Sensibilidade analítica para P190 para este teste permite identificação de
aproximadamente 10 moléculas de DNA alvo em 5 µL de cDNA extraído adicionado á reação
de amplificação.
Em termos de limite de detecção, a sensibilidade analítica para P190 do ensaio foi
testado usando DNA de plasmídeo contendo o produto amplificado cuja concentração inicial
13
Rev. 04 – Out/2013
foi medida através de espectrofotômetro. O DNA do plasmídeo foi diluído a um título de 10
cópias/5 µL e foi usado em 50 repetições para a amplificação com nossos produtos.
Os resultados finais estão resumidos na tabela a seguir:
Amostras
N
Positivos
Negativos
10 cópias DNA plasmídeo
50
50
0
Sensibilidade Analítica: Faixa de Medição Linear para P190
Em termos de faixa de medição linear, a sensibilidade analítica para P190 deste ensaio
permite a determinação de um título entre 1.000.000 e 10 moléculas de DNA alvo em 5uL de
cDNA extraído adicionado à reação de amplificação.
Em termos de Faixa de Medição Linear, a sensibilidade analítica para P190 do teste foi
determinada utilizando um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a seguinte) de
DNA plasmídico, contendo o produto de amplificação P190, cuja concentração inicial foi
7
medida através de espectrofotômetro. Os pontos do painel de 10 moléculas por reações de
1
10 moléculas por reação foram usadas em 9 repetições para a amplificação com os nossos
produtos.
A análise dos dados obtidos, realizada via regressão linear, demostrou que o teste
apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação
linear) maior que 0,99.
6
O limite superior da Faixa de Medição Linear para P190, foi fixado a 10 moléculas/5
µL, dentro do logaritmo do valor de concentração mais alto do padrão de amplificação
5
AmpliSTANDARD (10 moléculas / 5 µL).
O limite inferior da Faixa de Medição Linear para P190, foi fixado a 10 moléculas/5 µL,
dentro do logaritmo do valor de concentração mais baixo do padrão de amplificação
2
AmpliSTANDARD (10 moléculas/5 µL).
Os resultados finais estão resumidos na tabela seguinte:
Faixa de Medição Linear
Limite superior
1.000.000 cópias cDNA de P190/reação
Limite inferior
10 cópias cDNA de P190/reação
Sensibilidade analítica para P190: Precisão
O estudo da precisão do teste para P190, entendida como variabilidade dos resultados
obtidos em diferentes repetições de uma amostra com a mesma concentração analisadas em
uma única sessão, permitiu determinar um Coeficiente de Variação (CV %) de 24,9% na Faixa
6
de Medição Linear de 10 moléculas/5 µL a 10 moléculas/ µL.
Sensibilidade analítica: Exatidão
O estudo da exatidão do teste para P190, entendida como a diferença entre os
resultados médios obtidos em uma única sessão com diferentes repetições de uma amostra à
mesma concentração e o valor teórico da concentração das amostras, permitiu determinar
6
uma inexatidão percentual média de 9,9% na faixa linear 10
moléculas/5 µL.
moléculas/5 µL de 10
14
Rev. 04 – Out/2013
Sensibilidade Analítica: Faixa de Medição Linear para ABL
Em termos de faixa de medição linear, a sensibilidade analítica para ABL deste ensaio
permite a determinação de um título entre 1.000.000 e 10 moléculas de DNA alvo em 5 µL de
cDNA extraído adicionado à reação de amplificação.
Em termos de Faixa de Medição Linear, a sensibilidade analítica do teste foi
determinada utilizando um painel de diluições (1 log10 entre uma diluição e a seguinte) de
DNA plasmídico, contendo o produto de amplificação ABL, cuja concentração inicial foi
7
medida através de espectrofotômetro. Os pontos do painel de 10 moléculas por reações de
1
10 moléculas por reação foram usadas em 9 repetições para a amplificação com os nossos
produtos.
A análise dos dados obtidos, realizada via regressão linear, demostrou que o teste
apresenta uma resposta linear para todos os pontos do painel (coeficiente de correlação
linear) maior que 0,99.
6
O limite superior da Faixa de Medição Linear para ABL, foi fixado a 10 moléculas/5
µL, dentro do logaritmo do valor de concentração mais alto do padrão de amplificação
5
AmpliSTANDARD (10 moléculas / 5 µL).
O limite inferior da Faixa de Medição Linear para P190, foi fixado a 10 moléculas/5 µL
correspondendo a um cT de 29, visto que este valor representa o mínimo valor útil para esta
medição quantitativa.
Os resultados finais estão resumidos na tabela seguinte:
Faixa de Medição Linear
Limite superior
1.000.000 cópias cDNA de ABL/reação
Limite inferior
~1000 cópias cDNA de ABL/reação
Sensibilidade analítica para ABL: Precisão
O estudo da precisão do teste para ABL, entendida como variabilidade dos resultados
obtidos em diferentes repetições de uma amostra com a mesma concentração analisadas em
uma única sessão, permitiu determinar um Coeficiente de Variação (CV %) de 11,5% na Faixa
6
de Medição Linear de 10 moléculas/5 µL a 100 moléculas/5 µL.
Sensibilidade analítica: Exatidão
O estudo da exatidão do teste para ABL, entendida como a diferença entre os
resultados médios obtidos em uma única sessão com diferentes repetições de uma amostra à
mesma concentração e o valor teórico da concentração das amostras, permitiu determinar
6
uma inexatidão percentual média de 11,8% na faixa linear 10 moléculas/5 µL de 100
moléculas/5 µL.
Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção e quantificação em polimorfismos
A sensibilidade diagnóstica do teste, que é a eficiência de detecção e quantificação
em polimorfismos, foi avaliada pela comparação de sequências com banco de dados de
nucleotídicos.
O teste de alinhamento das regiões selecionadas para a hibridização do
oligonucleotídeo no primer AmpliMIX (P190 e ABL) e da sonda fluorescente AmpliPROBE (P190
e ABL) com as sequências disponíveis no banco de dados de genes humanos BCR e ABL
demonstrou sua conservação e a ausência de mutações significativas.
15
Rev. 04 – Out/2013
Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas
A sensibilidade diagnóstica do teste, confirmando amostras clínicas positivas, foi
testada analisando um painel de amostras positivas que eram positivas para P190 e eram
maiores que 90%.
A sensibilidade diagnóstica foi avaliada utilizando um material de referência de 20
amostras positivas para P190 testadas através de amplificação real-time por um laboratório
externo. Cada amostra foi usada para realizar o procedimento das análises, transcrição
reversa e amplificação com nossos produtos.
Os resultados finais estão mostrados na tabela abaixo:
Amostras
N
Negativos
Positivos
Amostras positivas para P190
20
2
18
As duas amostras esperadas positivas foram negativas com nossos produtos e com o
sistema de amplificação Real-Time de um laboratório externo. Isso está de acordo com os
dados clínicos uma vez que as amostras pertencem a pacientes com remissão molecular
principal.
Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes
A especificidade analítica do teste, que é a reação cruzada com outros marcadores
interferentes, foi avaliada pela comparação de sequência com bancos de dados nucleotídicos.
O teste de alinhamento das regiões selecionadas para a hibridação do nucleotídeo no
primer AmpliMIX (P190 e ABL) e da sonda fluorescente AmpliPROBE (P190 e ABL) com as
sequências disponibilizadas no banco de dados das regiões genômicas humanas diferentes dos
genes humanos BCR e ABL mostraram conservação e ausência de homologia significante.
Especificidade diagnóstica: amostras negativas
A especificidade diagnóstica do teste, confirmando amostras clínicas negativas, foi
testada analisando um painel de amostras negativas que foram positivas para P190 e foi maior
que 94.7%.
A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando um material de referência com 20
amostras testadas negativas para P190 através de amplificação por Real-Time por um
laboratório externo. Cada amostra foi usada para realizar o procedimento completo de
análises, transcrição reversa e amplificação, com os nossos produtos.
Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte:
Amostras
N
Negativos
Positivos
Amostras negativas para P190
20
19
0
Uma amostra foi inválida.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GABERT J., et al. (2003) Leukemia 17: 2318 - 2357
BEILLARD E., et al. (2003) Leukemia 17: 2474 - 2486
16
Rev. 04 – Out/2013
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A.
C.so Torino, 89/d - 10090 Buttigliera Alta (TO) - Itália
REGISTRO ANVISA
RTSG07-190-M: 80298490103
RTSG07-190-P: 80298490035
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
Aprovação:
29/01/2014
X
Maurício Cichon
Laboratório
Assinado por: Maurício Cichon
17
Rev. 04 – Out/2013
STDG07-190
Philadelphia P190 Q – PCR Standard
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O produto «Philadelphia P190 Q – PCR Standard» é destinado ao uso como um controle positivo e
como padrão de quantidade conhecida de DNA para obter uma curva padrão em ensaios de amplificação
quantitativa de ácidos nucleicos para a detecção do cDNA da translocação BCR-ABL , cromossomo
Philadelphia, variante P190 e a relevante medição normalizada para o cDNA do gene ABL.
Este produto deve ser usado com os produtos «Q - PCR Alert AmpliMASTER», « Philadelphia P190 Q
- PCR Alert AmpliMIX» e « Philadelphia P190 BKV Q - PCR Alert AmpliPROBE» da Nanogen Advanced
Diagnostics S.P.A.
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
O produto Q - PCR Standard inclui quatro soluções de plasmídeos estabilizadas com titulação
conhecida contendo a sequência requerida, divididas em dois tubos de alíquotas prontas para uso.
Cada tubo de teste contém 50 µL de solução, suficiente para oito reações.
O plasmídeo contém uma região do cDNA que se origina do reordenamento BCR-ABL, variante P190,
a qual é amplificada pela reação P190 e o controle de reação ABL. A detecção do DNA alvo durante a
reação de amplificação em tempo real confirma a habilidade de identificar a presença do cDNA P190 e
ABL e permite o cálculo da curva padrão.
O kit possibilita a execução de 4 sessões de análise separadas (cada sessão envolve duas
reações P190 e duas reações ABL com cada Q - PCR Standard).
* A concentração do padrão foi determinada por espectrofotômetro, pela medição da
absorbância da preparação de DNA de plasmídeo.
MATERIAIS FORNECIDOS
Componente
Philadelphia
P190 Q - PCR
5
Standard 10
Philadelphia
P190 Q - PCR
4
Standard 10
Philadelphia
P190 Q - PCR
3
Standard 10
Philadelphia
P190 Q - PCR
2
Standard 10
Descrição
Quantidade
Composição
Solução de plasmídeo
em tubo com tampa
vermelha
2 x 50 µL
Plasmídeo, TRIS base, TRIS
cloridrato, EDTA, RNA total
de levedura
em tubo com tampa azul
2 x 50 µL
de levedura
em tubo com tampa
verde
2 x 50 µL
de levedura
2 x 50 µL
de levedura
em tubo com tampa
amarela
18
Rev. 04 – Out/2013
• Armazenar a -20°C ou inferior.
- Fluxo laminar.
- Luvas descartáveis sem talco.
- Agitador vórtex.
- Microcentrífuga de bancada (12.000 – 14.000 RPM).
- Micropipetas estéreis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo (0,5-10 µL, 2-20 µL,
5-50 µL, 50-200 µL, 200-1000 µL).
- Água bidestilada estéril.
- Real Time ABI PRISM 7000, completo com computador.
ACESSÓRIOS
Os reagentes otimizados para amplificação, os primers (oligonucleotídeos) e os
reagentes de detecção (sondas fluorescentes) não estão inclusas neste produto. Para
realizar estes passos analíticos, os produtos a seguir são recomendados:
• «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (RTS000), combinação de reagentes otimizados,
microplacas e adesivos para PCR em tempo real e determinação alélica; total de 96
reações.
• « Philadelphia P190 Q - PCR Alert AmpliMIX» (RTSG07-190-M), primers
oligonucleotídeos para PCR em tempo real do cDNA do P190 e do ABL; o produto
fornece 24 determinações duplicatas para cDNA P190 e 24 determinações duplicatas
para cDNA ABL.
• « Philadelphia P190 Q - PCR Alert AmpliPROBE» (RTSG07-190-P), sondas
fluorescentes para PCR em tempo real do cDNA do P190 e do ABL; o produto fornece
24 determinações duplicatas para cDNA P190 e 24 determinações duplicatas para
cDNA ABL.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Este produto é exclusivamente para uso in vitro.
Manusear e descartar todas as amostras biológicas como potencialmente
infecciosas. Evitar o contato direto com amostras biológicas. Evitar respingos. Os
materiais que entram em contato com amostras biológicas devem ser tratados com
hipoclorito de sódio 3% por, no mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121°C por uma
hora antes de serem descartados.
Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos.
Evitar contato direto com reagentes. Evitar respingos. Os resíduos devem ser tratados
e descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos contendo ácidos
ou bases devem ser neutralizados antes do descarte. Usar jaleco, luvas e óculos de
proteção.
Nunca pipetar soluções com a boca.
Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos dentro da área de trabalho.
19
Rev. 04 – Out/2013
Lavar as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.
Descartar as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de segurança. Ler
as instruções de uso antes de utilizar o produto. Seguir as instruções.
Não usar produtos após o prazo de validade estabelecido.
Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante.
Não misturar reagentes de diferentes lotes.
Não utilizar reagentes de outros fabricantes.
Advertências e precauções de biologia molecular
amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para prevenir
o risco de resultados incorretos, em particular devido à degradação dos ácidos nucleicos das
amostras ou devido à contaminação das amostras por produtos de amplificação.
biologia molecular. Nunca transferir materiais da área de amplificação/detecção para a área
de extração/preparação de reações.
As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras
deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem
Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários
para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas
utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este propósito. As
pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As
ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e
RNA.
área de trabalho.
Advertências e precauções para componentes específicos
Os tubos contendo Q - PCR Standard podem ser congelados e descongelados por no
máximo 8 vezes. Um número maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode
causar uma redução do título.
Q - PCR Standard apresenta as seguintes advertências (S):
S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos.
20
Rev. 04 – Out/2013
PROCEDIMENTO
O produto « Philadelphia P190 Q - PCR Standard» deve ser usado com a mistura de
reação obtida com os produtos «Q - PCR Alert AmpliMASTER», « Philadelphia P190 Q - PCR
Alert AmpliMIX» e « Philadelphia P190 Q - PCR Alert AmpliPROBE».
O Q - PCR Standard está pronto para o uso, portanto deve ser usado adicionando 5 µL
diretamente na mistura de reação do P190 e do ABL.
O procedimento completo envolve a preparação e execução de reação de
amplificação em tempo real em diferentes poços de uma microplaca com
termociclador com sistema óptico de detecção de fluorescência. É descrito em
detalhes nas instruções de uso do produto « Philadelphia P190 Q - PCR Alert AmpliMIX»,
bem como informações sobre as características de desempenho e limitações do
procedimento.
NOTA.: Q - PCR Standard pode ser congelado e descongelado por no máximo 8 vezes. Um
número maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode causar uma redução do
título.
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
CNPJ: 06.145.976/0001-39
REGISTRO ANVISA
80298490055
21
Rev. 04 – Out/2013
CRQ/PR: 09302336
Aprovação:
29/01/2014
X
Maurício Cichon
Laboratório
22
Rev. 04 – Out/2013
CTRG07
Philadelphia – Controle Positivo
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O produto «Philadelphia – Controle Positivo » é destinado ao uso como um
controle positivo em ensaios qualitativos de amplificação de ácidos nucleicos para a
detecção do cDNA da translocação BCR-ABL , cromossomo Philadelphia, variantes P190,
P210 e P230 com o produto «Philadelphia Oligomix Alert kit» da Nanogen Advanced
Diagnostics S.P.A.
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
O produto Controle Positivo fornece uma solução estabilizada de plasmídeos contendo a
sequência requerida, dividida em dois tubos de alíquotas prontas para uso. Cada tubo de teste
contém 65 µL de solução, suficiente para 12 sessões.
Os plasmídeos contêm a região amplificada das translocações BCR-ABL, variantes P190
P210, e a região amplificada do gene controle ABL. A detecção do DNA alvo durante a reação
de amplificação confirma a habilidade de identificar a presença do cDNA da translocação BCRABL e do gene controle ABL.
O kit possibilita a execução de 25 reações de amplificação usando 5 µL por reação.
MATERIAIS FORNECIDOS
Componente
Descrição
Quantidade
P210
Controle Positivo
Solução de
plasmídeo
2 x 65 µL
P 190
Controle Positivo
Solução de
plasmídeo
2 x 65 µL
ABL
Controle Positivo
Solução de
plasmídeo
2 x 65 µL
•
Composição
de levedura
de levedura
de levedura
Armazenar a -20°C ou inferior.
23
Rev. 04 – Out/2013
- Fluxo laminar.
- Luvas descartáveis sem talco.
- Microcentrífuga de bancada (12.000 – 14.000 RPM).
- Micropipetas estéreis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo (0,5-10 µL, 2-20 µL,
5-50 µL, 50-200 µL).
- Água bidestilada estéril.
- Real Time ABI PRISM 7000, completo com computador.
ACESSÓRIOS
Os reagentes para amplificação e detecção do DNA não estão inclusas neste produto.
Para realizar estes passos analíticos, os produtos a seguir são recomendados
O produto «Philadelphia Oligomix Alert kit» (BANG07-02 / 05), kit de PCR nested
para o cDNA da translocação BCR-ABL, cromossomo Philadelphia, variantes P190, P210 e
P230 no produto de reação da transcrição reversa obtido da extração de RNA de amostras
biológicas; total de 25 reações.
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Este produto é exclusivamente para uso in vitro.
Manusear e descartar todas as amostras biológicas como potencialmente infecciosas.
Evitar o contato direto com amostras biológicas. Evitar respingos. Os materiais que entram
em contato com amostras biológicas devem ser tratados com hipoclorito de sódio 3% por, no
mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121°C por uma hora antes de serem descartados.
Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos.
Evitar contato direto com reagentes. Evitar respingos. Os resíduos devem ser tratados e
descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos contendo ácidos ou bases
devem ser neutralizados antes do descarte.
Usar jaleco, luvas e óculos de proteção.
Nunca pipetar soluções com a boca.
Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos dentro da área de trabalho.
Lavar as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.
Descartar as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de segurança.
Ler as instruções de uso antes de utilizar o produto. Seguir as instruções.
Não usar produtos após o prazo de validade estabelecido.
Não utilizar reagentes de outros fabricantes.
Advertências e precauções de biologia molecular
24
Rev. 04 – Out/2013
amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para prevenir
o risco de resultados incorretos, em particular devido à degradação dos ácidos nucleicos das
amostras ou devido à contaminação das amostras por produtos de amplificação.
biologia molecular. Nunca transferir materiais da área de amplificação/detecção para a área
de extração/preparação de reações.
As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras
deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem
Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes
necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única
vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a
este propósito. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo, ou usar ponteiras com
barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e
RNAse, sem a presença de DNA e RNA.
área de trabalho.
Advertências e precauções para componentes específicos
Os tubos contendo Controle Positivo podem ser congelados e descongelados por no
máximo 12 vezes. Um número maior de ciclos de congelamento e descongelamento pode
causar uma redução do título.
O Controle Positivo apresenta as seguintes advertências (S):
S 23-25 Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos.
PROCEDIMENTO
O produto « Philadelphia - Controle Positivo » deve ser usado com o produto
«Philadelphia Oligomix Alert kit».
O Controle Positivo está pronto para o uso, portanto deve ser usado adicionando 5 µL
diretamente na mistura de reação.
O procedimento completo envolve preparação e execução de reação de
amplificação com termociclador com sistema óptico de detecção de fluorescência. É
descrito em detalhes nas instruções de uso do produto «Philadelphia Oligomix Alert
kit», bem como informações sobre as características de desempenho e limitações do
procedimento.
NOTA: O Controle Positivo pode ser congelado e descongelado por no máximo 12 vezes.
25
Rev. 04 – Out/2013
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
CNPJ: 06.145.976/0001-39
REGISTRO ANVISA
80298490087
CRQ/PR: 09302336
Aprovação:
29/01/2014
X
Maurício Cichon
Laboratório
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B
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RTSG07-190 - Biometrix

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