INNO-LiPA HBV DR v2 - Biometrix

Rev. 01 – Jun/2013
INNO-LiPA HBV DR v2
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O INNO-LiPA HBV DR v2 é um ensaio de sondas em linha de hibridização reversa in vitro, para
utilização em amostras de soro ou plasma humano. A utilização do INNO-LiPA HBV DR v2
permite a detecção simultânea do tipo selvagem, mutações ou polimorfismos nos códons 80,
173, 180, 181, 204 e 236 do gene da polimerase do HBV.
PRINCÍPIO DO TESTE
O vírus da hepatite B (HBV) é um vírus de DNA de cadeia parcialmente dupla que se reproduz
através de um RNA intermediário.
O primeiro passo do procedimento consiste no isolamento do DNA viral da amostra. O DNA
purificado é amplificado em um ciclo de PCR com iniciadores para PCR biotinilados.
Os iniciadores utilizados neste teste amplificam parte (domínios A a F) do gene da polimerase
do HBV. As duas cadeias da hélice de DNA são separadas através de um processo de
aquecimento (desnaturação) para expor o alvo aos iniciadores.
Estes iniciadores oligonucleotídicos são complementares às regiões conservadas que
flanqueiam a região alvo. Por isso, após arrefecimento para uma determinada temperatura,
estes iniciadores ligam-se à sequência alvo (emparelhamento a 55°C). A uma temperatura
elevada, na presença de dNTP, a polimerase de DNA termostável ampliará os iniciadores
emparelhados ao longo do molde alvo (extensão). Produz-se uma cópia exata da sequência do
molde após um ciclo de desnaturação, anelamento e extensão. O processo é repetido durante
50 ciclos, produzindo uma sequência alvo amplificada múltiplas vezes com 867 bp.
Depois da amplificação, o material de DNA biotinilado produzido a partir do gene da polimerase
do HBV é hibridizado com as sondas oligonucleotídicas específicas imobilizadas como linhas
paralelas em tiras. Depois da hibridização, o ADN não ligado é lavado da tira. A estreptavidina
marcada com fosfatase alcalina é adicionada e liga-se a quaisquer híbridos com biotina
formados anteriormente.
A incubação com o cromógeno BCIP/NBT produz um precipitado púrpura/castanho.
A tira de INNO-LiPA HBV DR v2 contém uma linha de marcação azul, 2 linhas de controle e 32
linhas de sondas paralelas.
A linha de controle do conjugado é um controle da reação da revelação de cor e a linha de
controle de amplificação contém as sondas HBV universais para verificar a presença de
material genômico de HBV amplificado.
REAGENTES
Descrição, preparo para utilização e condições recomendadas de conservação
OBSERVAÇÃO: Os reagentes de amplificação e de LiPA devem ser armazenados à temperatura
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correta após a recepção: os reagentes de amplificação na área de pré-amplificação e os
reagentes LiPA na área de pós-amplificação.
-
-
-
Se armazenados entre 2 - 8°C, os reagentes, abertos ou fechados, permanecem estáveis
até à data de validade. Não utilize os reagentes além da data de validade.
Para evitar a contaminação, recomendamos que divida os reagentes de amplificação em
alíquotas após a primeira utilização.
Não guarde reagentes junto de qualquer fonte de contaminação com DNA,
especialmente junto de produtos de amplificação. Utilize tubos e pontas de pipetas (de
preferência, resistentes a aerossóis) descartáveis.
Todos os reagentes devem ser levados à temperatura ambiente (20 - 25°C)
aproximadamente 30 minutos antes da utilização e deverão ser recolocados
imediatamente no refrigerador após o uso. Agite brevemente em vórtex e centrifugue
brevemente os reagentes descongelados antes de abrir as suas embalagens.
Feche os frascos imediatamente após a utilização.
Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou
deterioração.
Recomendamos que guarde o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade de
enrolamento das tiras antes da utilização.
REAGENTES FORNECIDOS
COMPONENTE
QUANTIDADE
DESCRIÇÃO
Reagentes de Amplificação
Mistura de
iniciadores
1 x 0,04 mL
Contém iniciadores biotinilados com 0,05% de NaN3 como
conservante.
Reagentes LiPA
Tiras
1 x 20
Solução de
desnaturação
1 x 1 mL
Solução de
hibridização
1 x 80 mL
Solução para
lavagem
rigorosa
1 x 200 mL
Conjugado 100x
1 x 0,8 mL
Diluente do
conjugado
1 x 80 mL
Substrato BCIP/NBT
100x
1 x 0,8 mL
Solução de
lavagem 5x
1 x 80 mL
1 tubo de plástico com tiras INNO-LiPA HBV DR v2 com uma
linha de marcação azul.
Solução alcalina contendo EDTA.
CUIDADO: Feche o frasco com a solução de desnaturação
imediatamente após o uso; a exposição prolongada da
solução ao ar leva a uma rápida deterioração.
Contém tampão SSC com detergentes e conservantes. A solução
de hibridização deve ser pré-aquecida até atingir uma
temperatura de, pelo menos, 37°C e não pode exceder 49°C.
Contém tampão SSC com detergentes e conservantes. A solução
de lavagem rigorosa deve ser pré-aquecida até atingir uma
temperatura de, pelo menos, 37°C e não pode exceder 49°C.
Estreptavidina marcada com fosfatase alcalina em tampão Tris,
com estabilizadores proteicos e 0,01% de MIT/0,098% de CAA
como conservante, a diluir a 1/100 em diluente do conjugado
antes de utilizar. Prepare 2 mL de solução de trabalho do
conjugado por cada cavidade teste + 2 mL em excesso. Para
Auto-LiPA, prepare mais 10 mL. A solução de trabalho do
conjugado permanece estável durante 24 horas em temperatura
ambiente (20 - 25°C), se armazenada em um local escuro.
Tampão fosfato com NaCl, Triton®, estabilizadores proteicos
e 0,01% de MIT/0,1% de CAA como conservante.
5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato e 4-nitro azul de tetrazólio em
dimetilformamida, a diluir a 1/100 em tampão de substrato
antes de utilizar. Prepare 2 mL de solução de trabalho do
substrato por cada cavidade teste + 2 mL em excesso. Para
Auto-LiPA, prepare mais 10 mL. A solução de trabalho do
substrato permanece estável durante 24 horas à temperatura
ambiente (20 - 25°C), se armazenada em um local escuro.
Tampão fosfato com NaCl, Triton®, e 0,01% de MIT/0,48% de
CAA como conservante. A diluir a 1/5 (1 parte + 4 partes) em
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água destilada ou desionizada antes de utilizar. Prepare 8 mL de
solução de trabalho de lavagem por cada cavidade teste + 10
mL em excesso. Para Auto-LiPA, prepare 12 mL de Solução de
trabalho Rinse por teste a realizar, mais 20 mL em excesso. A
solução de lavagem de trabalho permanece estável durante 2
semanas a uma temperatura de 2 - 8°C.
Placas de
incubação
3
Com 8 cavidades cada.
Cartão de leitura
1
Para a identificação de sondas positivas.
Folha de relatório
de dados
2
Para guardar tiras processadas.
MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
-
Luvas descartáveis.
Pontas de pipetas livres de DNA/Dnase (preferencialmente, resistentes a aerossóis)
descartáveis.
Microtubos livres de DNA/DNAse.
Suportes para microtubos.
Centrífuga de microtubos.
Pipetas ajustáveis para fornecer 1 - 20 µL, 20 - 200 µL e 200 - 1000 µL.
Água destilada e esterilizada em autoclave.
Amplificação
Para a amplificação, recomenda-se a utilização da polimerase de DNA Qiagen HotStarTaq (N.º
da categoria: 203203) e 10x tampão PCR (N.º da categoria: 203203).
- Equipamento e termociclador de DNA.
- dNTPs (25 mM).
- Tampão Qiagen 10x PCR (com Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2, pH 8,7).
- Polimerase de DNA Qiagen HotStarTaq.
LiPA
-
Aspirador.
Termômetro calibrado.
Pinças.
Provetas graduadas (10, 25, 50 e 100 mL).
Cronómetro (2 horas ± 1 minuto).
Agitador Vórtex ou equivalente.
Banho-maria com plataforma agitadora (80 rpm; tampa inclinada, temperatura ajustável
para um mínimo de 49°C ± 0,5°C).
Agitador orbital (160 rpm) ou oscilador (50 rpm).
Materiais opcionais:
- Multipipetas de dispensação (Multipipetas, Eppendorf ou equivalente).
- Equipamento para automatização de etapas de processamento de tiras ( Auto-LiPA ou
Auto-LiPA 48). Para mais informações, contate o distribuidor.
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SEGURANÇA E AMBIENTE
Tóxico! (T) R61-20/21-36, S53-9-20-23-36/37/39-45-60
Contém N,N-dimetilformamida: SUBS BCIP/NBT 100x.
Irritante! (Xi) R43, S23-24-37-60
Contém 2-cloroacetamida: HYBRIDIZ SOLN, STRIN WASH SOLN, RINSE SOLN 5x, SUBS
BUF, CONJ DIL.
Corrosiva! (C) R34, S20-23-26-36/37/39-45-60
Contém hidróxido de sódio: DENAT SOLN.
R34
R20/21
R36
R43
R61
S9
S20
S23
S24
S26
S36/37/39
S37
S45
S53
S60
-
-



Provoca queimaduras.
Nocivo por inalação e em contato com a pele.
Irritante para os olhos.
Pode causar sensibilização por contato com a pele.
Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendência.
Manter o recipiente em um local bem ventilado.
Não comer nem beber durante a utilização.
Não inalar vapor/aerossol.
Evitar o contato com a pele.
Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e
consultar um especialista.
Usar vestuário de proteção, luvas e equipamento protetor para os olhos/face
adequados.
Usar luvas adequadas.
Em caso de acidente ou indisposição, consulte um médico de imediato (mostre o
rótulo sempre que possível).
Evitar a exposição - obter instruções específicas antes da utilização.
Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos.
As amostras devem ser sempre manipuladas como potencialmente infecciosas. Deste
modo, todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser considerados
como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados como tal. Este teste
só deve ser efetuado por técnicos com formação adequada.
Todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser eliminados em
conformidade com os procedimentos de segurança estabelecidos.
Autoclavagem durante 15 minutos a 121°C no mínimo.
Incinere o material descartável.
Misture os resíduos líquidos com hipoclorito de sódio para que a concentração final seja
de ± 1% de hipoclorito de sódio. Deixar repousar durante a noite antes de eliminar os
resíduos.
CUIDADO: Neutralize o líquido residual que contenha ácido antes de adicionar o hipoclorito de
sódio.
-
É necessário usar equipamento de proteção pessoal: luvas e óculos de segurança
quando manipular agentes perigosos ou infecciosos.
Os resíduos devem ser manipulados de acordo com as diretivas de eliminação de
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resíduos da instituição. Deve cumprir todos os regulamentos ambientais, federais, locais
e nacionais.
Manipulação de amostras
O DNA pode ser extraído do plasma ou soro humano.
Preparo e armazenamento de amostras de plasma:
-
Colete o sangue em tubos esterilizados com EDTA. Não utilize heparina como um
anticoagulante.
Separe o plasma das células de acordo com as instruções do fabricante.
Guarde o plasma a uma temperatura igual ou inferior a -70°C. Descongele apenas para
utilização. Preparo e armazenamento de amostras de soro:
Colete o sangue em tubos esterilizados sem anticoagulante ou em tubos de separação
de soro.
Deixe o sangue coagular em temperatura ambiente, centrifugue e separe o soro das
células de acordo com as instruções do fabricante.
Guarde o soro a uma temperatura igual ou inferior a -70°C. Descongele apenas para
utilização. O DNA extraído de amostras positivas HBV deve ser utilizado imediatamente
ou congelado a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. Evite ciclos repetidos de
congelamento/descongelamento. A seguir, pode gerar material amplificado do gene pol
do HBV dos domínios A a F. Utilize 10 µL de produto amplificado para o procedimento
LiPA.
OBSERVAÇÕES E PRECAUÇÕES
-
-
-
-
Exclusivamente para uso profissional.
Todos os tubos e pontas de pipetas utilizados no processo de amplificação devem ser
livres de DNA/DNAse. É recomendada a utilização de pontas aerossol-resistentes. Utilize
apenas materiais de laboratório descartáveis.
Utilize uma ponta de pipeta nova por cada amostra aliquotada.
Não misture reagentes de kits diferentes, exceto se os componentes tiverem códigos de
lote idênticos.
Para evitar a contaminação da PCR, maximize a separação das etapas pré e pósamplificação. Não coloque as amostras, o equipamento ou os reagentes na área onde
executou a etapa anterior. Se for necessário voltar a uma área de trabalho anterior,
realize as etapas de descontaminação adequadas.
Utilize pinças para manipular as tiras e use luvas descartáveis. Não pegue as tiras com
as mãos.
Utilize apenas lápis para escrever nas tiras. Os reagentes do ensaio podem remover a
tinta das tiras.
Para obter resultados precisos, utilize um banho-maria para os passos de lavagem e
hibridização, e verifique se a temperatura é 49°C ± 0,5°C. Não utilize um agitador de ar
quente. Utilize um termômetro calibrado para fazer um controle de temperatura
rigoroso. Feche sempre a tampa do banho-maria para manter a temperatura. Se a
temperatura for muito baixa, o ensaio pode produzir resultados falsos positivos; se a
temperatura for muito elevada, pode produzir sinais fracos ou resultados falsos
negativos. Utilize um banho-maria com agitação de tampa inclinada para um controle de
temperatura ótimo.
O movimento gerado pela agitação do banho-maria durante a hibridização e na lavagem
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-
-
rigorosa pelo agitador orbital ou oscilador durante a revelação da cor é crítico. Ajuste a
velocidade destes instrumentos cuidadosamente para maximizar o movimento dos
reagentes na tira sem respingar as soluções entre as cavidades do trabalho.
Evite respingar a placa com o banho-maria. Ajuste o nível de água no banho-maria para
que fique entre um terço e metade da altura da placa. Evite o deslizamento da placa,
imobilizando-o com pesos.
Não deixe que as tiras sequem entre passos.
Deixe ficar cada tira na mesma cavidade durante o procedimento.
Aspire o líquido de uma cavidade com uma pipeta (esta pode ser instalada em um
aspirador por vácuo).
PROCEDIMENTO DE TESTE DE AMPLIFICAÇÃO
Para a extração de DNA, recomenda-se a utilização do Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit (N.º
da categoria: 51104). Consulte o protocolo e siga as instruções para a utilização do método de
extração. Quando utilizar outros métodos de extração disponíveis no mercado, o método
utilizado deve ser validado no laboratório.
Protocolo de amplificação
O protocolo que se segue foi concebido para amplificação ótima com - Polimerase Qiagen®
HotStarTaq® (5 U/µL).
-
Tampão Qiagen® 10x PCR (com Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2, pH 8,7).
Tubos PCR MicroAmp® (tubos finos de 0,2 mL; Applied Biosystems N.º da categoria:
N8010540).
GeneAmp® PCR system PE-9700 thermal cycler (Applied Biosystems N.º da categoria:
N8050200).
Este protocolo pode ser utilizado para a maioria dos tipos de termocicladores comerciais; no
entanto, estes podem requerer modificações fornecidas pelo fabricante do termociclador.
Tome as precauções necessárias que se seguem para evitar uma amplificação não específica,
que pode afetar os resultados:
-
Descongele os componentes enumerados em seguida e coloque-os em gelo.
Efetue todos passos de pipetagem em gelo de uma forma rápida.
1. Determine o número de tubos a preparar (N) com a seguinte fórmula: N = Número de
amostras + 1 Controle negativo para extração + 1 Controle negativo para PCR + 1 Controle
positivo + 1 extra.
2. Utilize ponteiras de pipetas resistentes a aerossol para preparar uma mistura principal em
um tubo de microcentrífuga livre de DNA/DNAse.
3. Prepare uma mistura principal com:
(N x 22,2 µL) Água destilada esterilizada por autoclavagem + (N x 5,0 µL) Tampão Qiagen 10x
PCR
+ (N x 0,4 µL) Mistura dNTP (25 mM) + (N x 1,0 µL) Mistura de iniciadores
+ (N x 1,0 µL)
25 mM MgCl2
+ (N x 0,4 µL)
Polimerase de DNA Qiagen HotStarTaq 5 U/µL
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4. Misture por vórtex brevemente e distribua 30 µL desta mistura principal para tubos de
amplificação esterilizados em autoclavagem (N-1).
5. Pipete 20 µL de ADN purificado (amostras) ou 20 µL de água destilada (sem DNA) para o
Controle negativo nos tubos apropriados:
OBSERVAÇÃO: Misture e centrifugue brevemente a mistura para concentrar o líquido no fundo
dos tubos.
6. Coloque as amostras no bloco térmico calibrado (consulte as instruções fornecidas pelo
fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificação concebido para a amplificação
INNO-LiPA HBV DR v2. Perfil da amplificação INNO-LiPA HBV DR v2 para um termociclador PE9700:
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
1.
Desnaturação
95°C
15 min
2.
Desnaturação
94°C
30 seg.
3.
Emparelhamento dos
iniciadores
55°C
30 seg.
4.
Extensão dos iniciadores
72°C
40 seg
5.
Alongamento
72°C
10 min
6.
Resfriar a 4°C
OBS.
repetir ciclo
passo 2 - 4
50 vezes
6. Depois do processo de amplificação, utilize as amostras imediatamente com a tira do teste
INNO-LiPA HBV DR v2 ou guarde-as a uma temperatura de -15/-25°C.
7. Após este processo, verifique a amplificação analisando 5 µL do produto amplificado em gel
de agarose a 2% ou guarde a uma temperatura de -15/-25°C.
NOTA: Não armazene os produtos de amplificação de DNA junto de reagentes de amplificação
ou de DNA extraído.
RESULTADOS DA AMPLIFICAÇÃO
Visualização
-
A presença de produtos amplificados pode ser verificada com um gel de agarose a 2%.
Coloque 5 µL de produto amplificado em cada ranhura.
O produto amplificado deve aparecer como uma banda com um comprimento de 867 bp.
Controle de qualidade
-
Inclua pelo menos um branco para extração.
Inclua pelo menos um controle positivo e um controle negativo para cada amplificação.
Assim como com qualquer outro novo procedimento de laboratório, até se ter alcançado
um grau de confiança mais elevado quanto à execução correta do procedimento deve
ser considerada a inclusão de controles positivos e negativos adicionais. Se for desejável
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-
a inclusão de um controle positivo adicional, utilize uma amostra positiva HBV
conhecida.
Se obtiver uma banda positiva no gel para o controle negativo para extração, deve
rejeitar a série de ensaio e repetir o procedimento desde a extração.
PROCEDIMENTO PARA TESTE MANUAL LiPA
Desnaturação das amostras
CUIDADO: Utilize um termômetro calibrado para verificar se a temperatura do banho-maria
agitado está em 49°C ± 0,5°C, e ajuste a temperatura, se for necessário, antes de adicionar
uma placa de amostras.
1. Equilibre um banho-maria agitado a 49°C ± 0,5°C.
2. Coloque a solução de hibridização e a solução de lavagem rigorosa em um banho-maria com
uma temperatura entre 37°C e 49°C para dissolver todos os cristais. Certifique-se de que o
banho-maria não excede 49°C ± 0,5°C. Agite a garrafa para misturar antes de utilizar.
3. Remova uma tira do tubo para cada amostra com as pinças. Escreva um número de
identificação com um lápis por cima da linha de marcação azul da tira. Inclua sempre uma tira
para o controle negativo da etapa de extração, uma tira para o controle negativo da etapa PCR
e uma tira para o controle negativo da etapa LiPA (não adicione qualquer amostra à solução de
desnaturação para esta tira).
NOTA:
 Não coloque as tiras nas cavidades até ao passo 2 da Hibridização das amostras.
4. Coloque uma cavidade para cada amostra/tira na placa
5. Adicione 10 µL de solução de desnaturação no canto superior de cada cavidade.
NOTA:
 Feche o frasco com a solução de desnaturação imediatamente a seguir a cada utilização.
A exposição prolongada ao ar provoca a deterioração da solução.
6. Adicione 10 µL de amostra ou controle negativo à solução de desnaturação em cada
cavidade. Misture cuidadosamente com a pipeta.
7. Deixe ficar a desnaturação durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Hibridização das amostras
1. Adicione cuidadosamente 2 mL de solução de hibridização em cada cavidade, tendo cuidado
para não contaminar as outras cavidades. Agite a cavidade para misturar os reagentes.
2. Coloque imediatamente uma tira com a linha de marcação virada para cima em uma
cavidade.
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NOTA:
 Use luvas descartáveis e pinças quando manusear as tiras.
3. Certifique-se de que a tira está completamente submersa na solução. Não cubra as
cavidades com selantes de microplacas para evitar a contaminação cruzada.
4. Coloque a placa no banho-maria com agitação a 49°C ± 0,5°C e imobilize a placa entre dois
pesos pesados. Defina o movimento do banho-maria para cerca de 80 rpm, feche a tampa e
incube a placa durante 60 minutos. Certifique-se de que cada tira permanece completamente
submersa e flutua livremente.
5. Quando a incubação da hibridização terminar, remova a placa do banho-maria.
Lavagem das tiras
CUIDADO: Segure a placa em um ângulo baixo para que o líquido se acumule em uma
extremidade da cavidade, por cima da linha de marcação da tira, para fácil remoção. Não
danifique a superfície da tira. Evite respingar ou transferir soluções entre cavidades.
1. Aspire a solução da cavidade com uma pipeta, de preferência ligada a um aspirador por
vácuo.
2. Adicione 2 mL de solução de lavagem rigorosa em cada cavidade e agite a placa durante 1
minuto a 20 - 25°C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade.
NOTA:
 Uma multipipeta é útil para distribuir a solução de lavagem rigorosa.
3. Repita a lavagem através da adição de 2 mL de solução de lavagem rigorosa em cada
cavidade e da agitação da placa durante 1 minuto a 20 - 25°C para lavar a tira. Aspire a solução
de cada cavidade.
4. Adicione 2 mL de solução de lavagem rigorosa em cada cavidade, coloque a placa no banhomaria agitado a 49°C ± 0,5°C e imobilize a placa entre dois pesos pesados. Defina o
movimento do banho-maria para cerca de 80 rpm, feche a tampa e incube a placa durante 30
minutos.
5. Prepare a solução de lavagem e a solução do conjugado (Ver Reagentes).
Revelação da cor
CUIDADO: Segure a placa em um ângulo baixo para que o líquido se acumule em uma
extremidade da cavidade, por cima da linha de marcação da tira, para fácil remoção. Não
danifique a superfície da tira. Evite respingar ou transferir soluções entre cavidades.
1. Aspire a solução da cavidade com uma pipeta.
2. Adicione 2 mL da solução de lavagem em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto à
temperatura ambiente para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. Repita este passo
uma vez.
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3. Adicione 2 mL da solução do conjugado em cada cavidade, coloque a placa em um agitador
(orbital a 160 rpm ou oscilador a 50 rpm) a 20 - 25°C e incube durante 30 minutos.
NOTA:
 Prepare a solução do substrato cerca de 10 minutos antes do fim da incubação do
conjugado (Ver Reagentes).
4. Quando a incubação terminar, remova a placa do agitador e aspire a solução de cada
cavidade com uma pipeta.
5. Adicione 2 mL da solução de lavagem em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto a
20 - 25°C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade. Repita este passo uma vez.
6. Adicione 2 mL de tampão de substrato em cada cavidade e agite a placa durante 1 minuto a
20 - 25°C para lavar a tira. Aspire a solução de cada cavidade.
7. Adicione 2 mL da solução do substrato em cada cavidade, coloque no agitador a 20 - 25°C e
incube durante 30 minutos.
8. Quando a incubação terminar, pare a revelação da cor através da lavagem das tiras: remova
a placa do agitador, aspire a solução de cada cavidade e, em seguida, adicione 2 mL de água
destilada em cada cavidade e coloque a placa no agitador durante, pelo menos, 3 minutos a 20
- 25°C. Repita este passo uma vez.
9. Remova cada tira da cavidade e coloque a tira com a linha de marcação virada para cima
em papel absorvente
com as pinças.
10.Seque as tiras completamente antes de ler os resultados. Armazene em lugar escuro as tiras
secas e processadas.
PROCEDIMENTO PARA TESTE AUTOMATIZADO LiPA: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48
O procedimento de teste LiPA é muito apropriado para as etapas de automatização. O Auto-LiPA
e o Auto-LiPA 48 são sistemas autônomos com aquecimento, refrigeração, aspiração e
pipetagem automatizados. Os instrumentos foram concebidos para efetuar todas as etapas de
hibridização, lavagem rigorosa e revelação da cor. Para mais informações e protocolos
específicos para o Auto-LiPA e o Auto-LiPA 48, contacte a Biometrix.
RESULTADOS DE LiPA
Leitura
A figura 1 (ver página 20) mostra as posições das diferentes sondas oligonucleotídicas na tira
INNO-LiPA HBV DR v2. Uma linha é considerada positiva quando no final do teste aparecer uma
faixa de cor púrpura/castanho.
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Rev. 01 – Jun/2013
Fig. 1: Localização da linha de marcação azul, da linha de controle do conjugado (Controle de conj.), da linha de controle
da amplificação (Controle de amp.) e das 32 linhas de sonda na tira INNO-LiPA HBV DR v2.
Controle de qualidade
-
-
-
A linha superior azul é a linha de marcação. Esta linha permite orientar corretamente a
tira.
A primeira linha positiva (Linha 1) deve estar alinhada com a linha "Controle de conj." no
cartão de leitura de plástico. Esta linha controla a adição do conjugado reativo e da
solução de substrato durante o processo de detecção. Esta linha deve estar sempre
positiva e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas
durante a mesma série de testes.
A segunda linha positiva ("Controle de amp." no cartão de leitura) controla a adição de
material amplificado para hibridização. Se o HBV estiver presente na amostra e tiver
ocorrido a amplificação e o processamento de amostras corretos, o produto amplificado
alvo hibridiza para esta linha de "Controle de amp.".
As tiras de controle negativo devem estar em branco, exceto para a linha de controle de
conjugado. Isto confirma que não houve contaminação durante a execução do ensaio.
Interpretação dos resultados
Linha Posição do codon Aminoácido
Polimerase
Polimerase
3
80
Leu
4
80
Leu
5
80
Val
6
80
Ile
7
80
Ile
8
173
Val
9
173
Gli
10
173
Leu
11
180/181
Leu/Ala
12
13
14
15
16
17
18
19
20
180/181
180/181
180/181
180/181
180/181
180/181
204
204
204
Leu/Tri
Leu/Tri
Leu/Val
Met/Ala
Met/Tri
Met/Val
Met
Met
Val
Tipo selvagem/Mutante
Polimerase
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Mutante
Mutante
Mutante
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Mutante
Tipo selvagem/Tipo
selvagem
Tipo selvagem/Mutante
Tipo selvagem/Mutante
Tipo selvagem/Mutante
Mutante/Tipo selvagem
Mutante/Mutante
Mutante/Mutante
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Mutante
11
Rev. 01 – Jun/2013
Linha
Posição do códon Aminoácido
Polimerase
Polimerase
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
204
204
204
204
204
236
236
236
236
236
236
236
236
236
Val
Ile
Ile
Ile
Sor
Asn
Asn
Asn
Asn
Asn
Tri
Tri
Tri
Tri
Tipo selvagem/Mutante
Polimerase
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Tipo selvagem
Mutante
Mutante
Mutante
Mutante
LIMITES DO PROCEDIMENTO
-
-
A utilização deste kit deve ser limitada a pessoal com formação em técnicas de
hibridização, amplificação e extração de ácido nucleico do HBV.
Boas práticas de laboratório e aplicação atenta do procedimento prescrito permite
realizar a amplificação específica com êxito.
Tendo em conta a elevada carga viral ocasional das amostras infectadas com HBV, deve
ter muito cuidado para evitar a contaminação.
A inibição da polimerase (por ex. heparina, hemoglobina) pode ser motivo para a falha
completa do ensaio.
O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio pode ter um efeito inibidor sobre a
amplificação.
Um polimorfismo raro que ocorra nas proximidades ou em um códon específico pode
provocar a ausência de hibridização em todas as sondas presentes na tira INNO-LiPA
HBV DR v2 desse códon específico. Neste caso, o ensaio não fornece quaisquer
informações no códon em causa: considera-se que esse códon produziu um resultado
indeterminado. No entanto, os restantes códons podem ser lidos de forma
independente.
Os resultados com fraca reação em todas as linhas são observados ocasionalmente e
produzem um resultado indeterminado. Deve voltar a amplificar ou extrair amostras
com este padrão.
DESEMPENHO DO TESTE
O desempenho do teste INNO-LiPA HBV DRv2 foi avaliado a nível interno e externo em dois
centros, em 239 amostras de soro de 232 pacientes infectados pelo HBV. A carga viral era
conhecida em 232 amostras. Duzentas e dezanove amostras apresentavam uma carga viral
acima das 1000 cópias / mL, enquanto que 13 amostras apresentavam uma carga viral abaixo
de 1000 cópias / mL (intervalo de 173-978 cópias / mL). Aproximadamente 76% das amostras
foram colhidas quando o paciente estava em tratamento.
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Rev. 01 – Jun/2013
Sensibilidade
Resultados positivos, como indicado por uma linha de controle positivo de amplificação foram
obtidos em 231 dos 239 espécimes após a amplificação inicial, resultando em uma
sensibilidade inicial de 96,65% (231/239 IC 95% [93,54%, 98,29%]). Uma nova extração e/ou
amplificação das 8 amostras não amplificadas foi bem-sucedida para todas as 8 amostras,
resultando em uma sensibilidade de 100% (239/239 IC 95% [98,42%, 100,00%]), após a
repetição do teste.
Precisão
Entre as 239 amostras clínicas testadas no INNO-LiPA HBV DR v2, foram observados 15
resultados indeterminados em um total de 1.434 resultados de códons (1,05%).
A precisão do INNO-LiPA HBV DRv2 foi avaliada pela comparação com dados de
sequenciamento das regiões códon relevante. A tabela a seguir fornece uma visão geral dos
resultados.
Tabela 1: Comparação INNO-LiPA HBV DRv2 com a sequenciamento
Codons
Mistura na Diferentes
Concordâncias Mistura no LIPA
Resultados
Discordâncias
disponíveis
sequência misturas
Códon
com o
não no
indeterminados
com o
para
não no com ambas
sequenciamento sequenciamento
no LiPA
sequenciamento
comparação
LIPA
as técnicas
80
230*
198
55
0
0
0
3
173
237*
207
20
1
0
6
3
180
239
175
62
1
0
1
0
181
239
216
19
2
1
1
0
204
239
169
56
2
8
2
2
236
239
228
6
0
0
5
0
Total
1423
1193
218
6
9
15
8
(*)
sequência não disponível
Para 1411 (99,16%) dos 1.423 códons com sequência disponível, o LiPA deu a mesma
informação (83,84%) ou mais aminoácidos (15,32%) quando comparado com o
sequenciamento. Um resultado completamente diferente de aminoácidos foi obtida em 8
codons (0,6%) em 7 amostras. Para 5 das 7 amostras, o sequenciamento posterior do material
amplificado, que foi testado na tira, confirmou o resultado LiPA.
Especificidade clínica
Cem amostras de DNA extraído de amostras de soro de indivíduos HBV negativos, foram
testadas internamente em um lote de INNO-LiPA HBV DR v2 tiras.
Todas as 100 amostras negativas HBV deram um resultado LiPA negativo, resultando em uma
especificidade clínica de 100% (100/100 IC 95% [96,4%, 100%]).
Intervalo de aplicação
O intervalo de aplicação foi testado em uma única amostra clínica com genótipo A de tipo
selvagem. A amostra foi diluída para produzir um painel de diluição de oito membros com um
intervalo de carga viral de 1250 a 10 cópias/mL. O painel foi testado oito vezes ao todo, em
dias diferentes, por dois operadores diferentes. Cada membro do painel foi extraído,
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Rev. 01 – Jun/2013
amplificado e testado em um lote de validação do INNO-LiPA HBV DR v2 através do Auto-LiPA. A
utilização de uma análise por meio de sondas, permitiu determinar que o limite inferior do
intervalo de aplicação do INNO-LiPA HBV DR v2 para esta amostra de genótipo A é de 990
cópias/mL (95%CI [454 cópias/mL; 6327 cópias/mL]).
Precisão
Foram amplificadas sete amostras de DNA através da utilização de 3 lotes de iniciadores
diferentes. Os 3 produtos amplificados por amostra foram testados em duplicado em 3 lotes
diferentes de INNO-LiPA HBV DR v2 em uma série de ensaios. Foi obtida uma concordância de
100% (126/126) ao nível do codon.
Limitação
As amostras com os genótipos B e C com uma linha 26 positiva (236N) podem, de forma muito
ocasional e irregular, mostrar uma reação muito fraca na linha 31 (236T). Em casos muito raros,
as amostras do genótipo H podem reagir positivo falso com as linhas 12 e 22.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
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INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
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Tel.: +32-9 329 13 29
REGISTRO ANVISA
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RESPONSÁVEL TÉCNICA
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CRQ/PR: 09302336
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