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1.1. Principais Grupos de Microrganismos
Archae
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E BIOQUÍMICA DO SOLO
PROFESSORA: Adriana Silva Lima
MÉTODOS
Sulfolobus acidocaldarius
Acidianus infernus
PROCARIOTOS
Bactérias
Spirochaeta stenostrepta
Thiocapsa roseopersicina
Rhodomicrobium vannielii
Desulfuromonas acetoxidans
Chloroflexus auranticus
Rhodospirillum rubrum
Azospirillum sp
CIANOBACTÉRIAS
ACTINOMICETOS
Nocardia sp
Streptomyces sp
Azolla simbiose com Anabaena
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Eucariotos
ALGAS
Polyssiphonia sp - Rhodophyta
Euglena sp. - Euglenophyta
Frankia sp.
Isthmix sp. - Diatomácea
PROTOZOÁRIOS
FUNGOS
Ciliado
Flagelado
Ameba
Paramecium sp
Dunaliella sp.
Basidiomyceto – Amanita sp
Amoeba sp
“SLIME MOLDS” OU BOLORES GOSMENTOS
LEVEDURAS
Dictyostelium sp
Saccharomyces cerevisiae
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MICORRIZAS
MICORRIZAS ARBUSCULARES
Ectomicorrizas
LIQUENS
Vírus
Bacteriófago T4
Vírus do Mosaíco
Atualmente
Microscópios
1.2. IMPORTÂNCIA
Alimentos
Agricultura
Fixação Biológia de N2
Ciclagem de nutrientes
Conservação de alimentos
Alimentos fermentados
Aditivos
Doenças
Identificação de novas doenças
Tratamento e cura
Prevenção de doenças
Energia/ Ambiente
Técnicas Biologia Molecular
Biotecnologia
Biocombustíveis (metano e etanol)
Organismos geneticamente
modificados
Biorremediação
Produção de fármacos
Terapia genética de doenças
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Antártida
Sierra Nevada
Califórnia
Alga verde
Chlamydomonas nivalis
Área rica em enxofre
Park Nacional de
Yellowstone
Área rica em
ferro
Thermus aquaticus
Sulfolobus sp.
5. Métodos de avaliação da biota do solo
5.1 Avaliações Diretas
Observa os organismos como ocorre em seu habitat ou os avalia
após um método de coleta simples:
a) Avaliação da nodulação por rizóbio em leguminosa
b) Galhas formadas por nematóides
c) Presença de fungos ectomocorrízicos (alter~ções morfológicas
das raízes, ficam espessas e curtas)
d) Biomassa e densidade de macrofauna – usa área delimitada (25
x 25), coleta manual, contagem, pesagem
e) Número e formas de esporos e hifas
f) Raízes colonizadas por fungos micorrízicos (clareadas e
Figura 13. Atividade microbiana, através da respiração edáfica (mg CO2.m-2.h1), amostradas quinzenalmente durante período experimental
observadas em microscópio)
1.3. AMOSTRAGEM
5.2 Avaliações Semidiretas
Tipo
Amostras de solo são submetidas a algum tratamento
(corantes fluorescentes, antígenos específicos, radioatividade
para detectar seqüência de DNA ou RNA
Pertubadas
Não pertubadas
Tratamento Estatístico
Caracterização do Sítio
5.3 Avaliações Indiretas
Caracterização Química e Física do Solo
Armazenamento
a) Cultivo e avaliação da ocorrência, densidade e diversidade de
microrganismos em meios nutritivos
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1.5. ASSEPSIA
Filtragem
Ultra Violeta
Autoclave
Filtro com
poro de 5µm
Bactérias
retidas no
filtro
Transferência Asséptica
2. ATIVIDADE BIOLÓGICA
2.1. Respiração
2.1. Respiração
O2
2.2. ATP
2.3. Produção de Calor
CO2
2.4. Atividades Enzimáticas
Cromatografia gasosa
Eletrorrespirômetro
Titulação ou Condutividade elétrica
Cromatografia gasosa
Espectroscopia de infravermelho
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2.2. ATP
C
2.4. ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Desidrogenase
TTC (trifeniltetrazole chloride)
TPF (trifenil formazan)
INT (2p-iodofenil-3pnitrofenil5feniltetrazoliumchloride)
(iodonitrotetrazolium chloride)
INF
Colorímetro
Nitrogenase
HPLC - Cromatografia líquida de alta pressão
Acetileno
Bioluminescência – D-luciferina
etileno
Cromatografia gasosa
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N
Métodos isotópicos
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3. DENSIDADE/ DIVERSIDADE
3.1. Avaliações diretas
Avaliação da nodulação por rizóbio em
leguminosas
Avaliação da nodulação por rizóbio em
leguminosas
Biomassa e densidade
Observações Microscópicas
Observações
3.2. AVALIAÇÕES SEMI-DIRETAS
Observações
Células ou componentes celulares
tratados com corantes fluorescentes
Células ou componentes celulares tratados
com corantes fluorescentes
Sondas genéticas
Métodos de extração
Contraste de Fase
Epifluorescência
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Fotomicrografia Laser Confocal
3.3. AVALIAÇÕES INDIRETAS
Cultivo em meios nutritivos
Biomassa Microbiana
Biomarcadores ou Moléculas Assinatura
Solo
Células bacterianas
3.3.1 CULTIVO E AVALIAÇÃO
Cultivo Meios Nutritivos
DA DENSIDADE EM
Sólido
MEIO NUTRITIVOS
Diluição
Métodos de contagem em meio de cultura
Contagem Direta
Bradyrhizobium sp
Derxia sp
Semi -Sólido
Número Mais Provável
Meio Líquido
DILUIÇÃO PARA CONTAGEM
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3.3.2. BIOMASSA
Fumigação - incubação
Fumigação - extração
3.3.3. BIOMARCADORES
ASSINATURA
OU
MOLÉCULAS
Ergosterol
Ácidos Murâmicos e Diaminopimélicos
Quitina
Glucosamina
DNA e RNA
Proteínas
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
DO SOLO
DE
DNA
PCR
Hibridação DNA-DNA
Amostras
Sondas marcadoras
Reação em cadeia da polimerase - PCR
Polimorfismo em comprimento de fragmentos
obtidos por restrição enzimática - RFLP
Gel
16S RNA
PCR
Fita de DNA
5’
3’
Temperatura
PROTEÍNA
3’
Temperatura
5’
Centrifugação a
12.000 rpm/10
min.
Lavagem
com
NAPBS
Aplicação no gel
de poliacrilamida,
eletroforese
Extração e adição do tampão +
SDS (20%) e Mercaptoetanol
Crescimento
em meio de
cultura TY
Revelação dos padrões
30µL de
amostra
DNA polimerase
Primers
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Método de
cultura
contagem
em meio de
Figura 15. Colônias de bactérias (a) e fungos (b) do solo da área experimental
Figura 14. Método de diluição sucessivas para contagem de fungos e bactérias
b) Biomassa microbiana (BM)
Parte da matéria orgânica constituída
organismos vivos
Fumigação-incubação (Jenkinson et al, 1976)
Fumigação-extração (Vance et al., 1987)
pelos
Figura 17. Quantificação da biomassa microbiana do solo (BMS) pelo método
da fumigação-extração
c) Biomarcadores
Figura 16. Quantificação da biomassa microbiana do solo (BMS) pelo método
da fumigação-incubação
d) Isolamento e identificação de DNA do solo
6. Atividade biológica
6. 1 Respiração
mais antigo parâmetro para quantificar
a atividade microbiana
6.2 ATP
determinação é feita após extração por vários
métodos e análise
6.3 Produção de calor utiliza um microcalorímetro que
detecta mudanças de até 10-6°C (microwatts)
6.4 Atividade enzimática --> envolve sempre incubação do
solo em condições adequadas de temperatura e
umidade. Com destaque as duas enzimas:
a)
Desidrogenase – só ocorre em células vivas
b)
Nitrogenase – enzima responsável pela fixação do N2
Figura 18. Medição da respiração edáfica no campo segundo metodologia de
Gissi (1978)
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7. Qualidade do solo
“ Capacidade de um solo de funcionar nos limites de
ecossistema, para sustentar a produtividade biológica,
manter a qualidade ambiental e promover a saúde
vegetal e animal” (Parkin, 1994)
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