Clique para visualizar o trabalho completo.

Transcrição

ELIETE AGUIAR DE MIRANDA FRIGATTO
Evolução Temporal das Concentrações Inibitórias Mínimas para os Glicopeptídeos entre Isolados
Clínicos de Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
São Paulo
2013
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Disciplina de Infectologia - Universidade Federal de São Paulo
- UNIFESP.
Co-orientadoras: Profa. Dra. Antonia Maria Oliveira Machado
e Dra. Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy Carvalhaes
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP, processo 2009/15986-3) e da Sanofi-Aventis
(Projeto FAP - 1428-09).
São Paulo
2013
ii
FRIGATTO, Eliete Aguiar de Miranda
Evolução Temporal das Concentrações Inibitórias Mínimas para os Glicopeptídeos entre
Isolados Clínicos de Staphylococcus aureus Resistentes à Oxacilina. Eliete Aguiar de
Miranda Frigatto - São Paulo, 2013 - xxii, 113f.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Temporal Evaluation of the Glycopeptideos MICs Among ORSA
Clinical Isolates in Brazil.
1. Staphylococcus aureus, 2. ORSA, 3. Creep de Vancomicina e Teicoplanina, 4.
SCCmec.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Alvaro Nagib Atallah
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros
São Paulo
2013
iv
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do
Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Titulares:
Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka
Professora Doutora do Departamento de Análises Clínicas e Toxicologia da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo - USP.
Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Médica-coordenadora do Setor
de Microbiologia do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein - HIAE.
Dra. Adriana Macêdo Dell'Aquila
Médica Infectologista e Pesquisadora da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de
São Paulo - UNIFESP e responsável pelo controle de infecções osteoarticulares do
Departamento de Ortopedia e Traumatologia da UNIFESP.
Suplentes:
Profa. Dra. Luci Correa
Médica Pesquisadora da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP e Médica Infectologista da Unidade de Controle de Infecção do Hospital Israelita Albert
Einstein - HIAE.
v
“Sonhar mais um sonho impossível,
Lutar, quando a regra é ceder,
vencer o inimigo invencível...
e assim, seja lá como for,
Vai ter fim a eterna aflição
E o mundo verá uma flor
Brotar do impossível chão”
“D. Quixote” (Miguel de Cervantes)
vi
Dedico esta tese a Deus, pelo dom divino da vida e por suas constantes bênçãos. Também
dedico aos meus amados pais, David e Celeste, meus maiores exemplos de sabedoria,
dedicação e perseverança. Pelo amor incondicional dispensado durante todos os momentos de
minha vida. Por ensinar que a vida é simplesmente amar e que sempre no final tudo dará certo!
vii
Ao meu amado esposo, amigo e companheiro de todas as horas, Roberto, pela sua paciência,
pelo seu apoio e por prescindir de valiosos momentos do nosso convívio diário em prol da
realização deste trabalho e, o mais importante, pelo seu amor.
Aos meus queridos irmãos David, Célia, Celina e Celeste, por estarem sempre ao meu lado,
por respeitarem e compreenderem a minha ausência, principalmente neste momento tão
delicado de nossas vidas. O apoio nesta caminhada me ajudou a construir o que sou e a
concretizar esse sonho.
Aos meus sobrinhos, Raphael, Raphaella e Maria Olívia que são presença constante em minha
vida e que me proporcionam muitas alegrias.
À minha querida afilhada Cristhianne, pelo seu carinho e amor. Com certeza você é a filha que
eu não tive, obrigada por você existir.
Às queridas Fernanda e Cleusa, cuidadoras amáveis dos meus pais. Durante a realização deste
estudo, tive que me ausentar em um momento tão delicado e difícil na vida dos meus pais.
Entretanto estive tranquila, pois sabia que eles estavam sendo protegidos por vocês duas. Muito
obrigado por tudo.
viii
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profa. Dra. Ana Cristina Gales pela amizade e carinho. Pelo seu exemplo
inigualável de profissionalismo, ética e sabedoria. Meus agradecimentos, não só pela orientação
neste estudo, mas pela paciência a mim direcionada e pelo privilégio de tê-la como minha
orientadora. Espero um dia poder retribuir tudo o que fez por mim.
À minha co-orientadora Prof. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado, meu respeito e
admiração pelos valiosos ensinamentos durante o convívio diário no Laboratório Central.
Agradeço a orientação para o aprimoramento deste trabalho e principalmente por insistir na
realização deste sonho. Eu me sinto honrada de fazer parte da sua equipe.
À minha co-orientadora Dra Cecilia Carvalhaes, a quem eu tive o prazer de conhecer ainda na
residência e tê-la como verdadeira amiga. Minha competente mestra, mentora, companheira e o
melhor e mais incansável Anjo da Guarda que Deus poderia ter colocado em meu caminho. A
você, Doutora, meus respeitos, admiração e toda a minha gratidão! Ao Marcelo Carvalhaes
meu sincero agradecimento por compreender e aceitar a ausência da Dra. Cecilia do convívio
diário com a família, para gentilmente compartilhar esse momento de minha vida.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari agradeço pelas informações enriquecedoras
para desenvolvimento deste trabalho e pelos seus valiosos ensinamentos que muito ajudaram na
concretização final desta tese.
ix
À Dra. Soraya S Andrade, que tão poucas oportunidades tive de convivência, mas o suficiente
para admirá-la pelo seu profissionalismo e exemplo de caráter. Agradeço por ter sido a
idealizadora deste projeto, que, com certeza, ajudou a realizar o meu sonho.
Ao Dr. André Doi, meu amigo de todos os momentos, principalmente os mais difíceis. A sua
dedicada presença sempre me conforta e sua alegria contagia onde quer que você esteja.
À secretaria do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, Rosana Capecce, pela
amizade, carinho e pelo apoio nos momentos que mais precisei.
A todos os amigos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC por terem
viabilizado os procedimentos de tipagem molecular. Meu muito obrigada, em especial, à
Fernanda Marques, que sempre muito solicita e pronta para as devidas explicações. Aos
amigos Vinícius Gomes e Marcus Vinícius, desculpem por todo o trabalho; à Roberta Cabral,
Rafaela Sittolin e Thaís Ávila pelo auxílio nos dendrogramas. Sei que passamos momentos
difíceis, mas os resultados compensaram por todas as dificuldades encontradas.
À Fernanda Inoue meu agradecimento pela fundamental contribuição nos procedimentos do
SCCmec. Suas informações e interpretações foram sempre muito valiosas.
À querida Alinne Guimarães que me encanta com o seu jeito especial e meigo de ser. Muito
obrigada, principalmente, pelas suas palavras no momento certo que me ajudavam a não
desanimar e parar no caminho.
x
À Jussimara Monteiro pela sua amizade, competência e profissionalismo, os quais me
ajudaram a esclarecer minhas dúvidas. Seus esclarecimentos foram fundamentais para
finalização deste trabalho.
A toda equipe do Laboratório Central, em especial, aos queridos amigos Ademir Medeiros,
Clarice Matsumoto, Cynthea Carolina, Erivan Tavares, Fernando Pereira, Flávia Palomo,
Márcia Pozo, Mirela Baretta, Regina Côrrea, Sandra Bonifácio, Katiane Santin, Vivian Mota,
Viviane Amaral do Setor de Microbiologia, pelo convívio diário, paciência, amizade e por
entenderem pelas vezes que tive que me ausentar para desenvolver este trabalho.
Às queridas amigas Euza Alves e Tânia, por todo o carinho e apoio que sempre me deram.
Às amigas Laíde Santos e Júlia Souza que tanto contribuíram para a preparação dos meios de
cultura utilizados neste estudo. Meus sinceros agradecimentos.
Ao meu amigo Thomas Chagas Neto, pela sua amizade, incentivo, pelos conselhos e por me
mostrar à vida de uma maneira muito diferente a que eu estava acostumada a ver. Que Deus o
abençoe sempre.
À querida amiga Agda Braga, que devido a minha ausência teve, brilhantemente, que dar
continuidade ao meu trabalho no Laboratório Central. Você, com certeza, faz parte deste meu
momento.
À amiga Bruna Nonato, com quem tive o prazer de conviver durante todo o período deste
estudo e que muito me ajudou na elaboração da parte prática. Pelo carinho, paciência e conforto
xi
nos momentos mais difíceis deste trabalho. Sua alegria contagiante, sempre presente,
certamente ajudou a driblar, e muito, os grandes desafios que encontrei.
À Maria Inês Nonato, pela sua amizade e pela palavra amiga nos momentos mais difíceis que
passei com meus pais, cunhado e esposo. Estes momentos passaram, mas a sua amizade vai
ficar para sempre. Agradeço as orações que muito me ajudaram a enfrentar o dia-dia e que
colaboraram para a finalização deste trabalho. Com a sua fé, com certeza, você me mostrou que
o dia seguinte pode ser melhor.
À Odimara Paes, minha querida amiga, obrigada pela amizade sincera, pelo convívio e pela
força. Para mim você é muito especial.
Ao grupo do Laboratório Alerta que me receberam com tanto carinho e sempre muito solícitos.
Meu eterno agradecimento a todos, principalmente à querida Raquel que tanto me auxiliou nos
difíceis cálculos das várias concentrações necessárias para a realização da microdiluição em
caldo. Agradeço pela paciência com que conduziu este trabalho, que sem a sua ajuda, com
certeza, o caminho teria sido muito mais árduo. Jamais esquecerei o que aprendi e vivenciei
neste laboratório. Tenho orgulho de fazer parte de um grupo tão especial.
E finalmente, ao querido e amável supervisor do Laboratório Alerta, Rodrigo Cayô, o que
escrever de alguém que por si só já irradia luz própria e ajuda a iluminar o caminho de todos que
por aqui passam. Muito obrigada, por toda ajuda e que foi fundamental para a finalização deste
trabalho.
xii
Sumário
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................... XIV
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................................ XVI
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. XVIII
RESUMO ................................................................................................................................... XXI
ABSTRACT............................................................................................................................... XXII
1 - INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 1
1.1 - Agente Etiológico .............................................................................................................. 1
1.1.1 - Identificação de S. aureus.......................................................................................... 2
1.2 - Epidemiologia das Infecções causadas por S. aureus ...................................................... 3
1.3 - Mecanismo de Resistência aos β-lactâmicos .................................................................... 4
1.3.1 - Resistência à Penicilina ............................................................................................. 4
1.3.2 - Resistência à Oxacilina .............................................................................................. 7
1.3.3 - Resistência aos Glicopeptídeos ............................................................................... 17
1.3.3.1 - Implicação Clínica da Resistência aos Glicopeptídeos......................................22
1.3.3.2 - Evolução Temporal das CIMs de Vancomicina.................................................23
1.4 - Disseminação de Clones ORSA ...................................................................................... 27
2 - OBJETIVOS ........................................................................................................................... 33
2.1 - Objetivo Principal............................................................................................................. 33
2.2 - Objetivos Secundários..................................................................................................... 33
3 - MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 34
3.1 - Amostras Bacterianas ..................................................................................................... 34
3.2 - Confirmação da Identificação Bacteriana ........................................................................ 34
3.3 - PCR-multiplex para a Detecção do Gene mecA e Tipagem do SCCmec ....................... 35
3.3.1 - Extração do DNA genômico ..................................................................................... 36
3.3.2 - Reação de Amplificação .......................................................................................... 37
3.3.3 - Eletroforese.............................................................................................................. 37
3.4 - Análise do DNA Cromossômico por Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE............... 38
3.5 - Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos ................................................................. 41
3.5.1 - Microdiluição em Caldo ............................................................................................ 41
3.5.2 - Etest® ....................................................................................................................... 44
3.6 - Análise Estatística ........................................................................................................... 44
4 - RESULTADOS ....................................................................................................................... 46
4.1 - Distribuição das Amostras de ORSA ............................................................................... 46
4.2 - Resultados da Caracterização Genética das Amostras .................................................. 46
4.2.1 - Identificação da Espécie .......................................................................................... 46
4.2.2 - Detecção e Caracterização do SCCmec .................................................................. 47
4.2.3 - Perfis genotípicos dos tipos de SCCmec ................................................................. 49
4.3 - Avaliação da Sensibilidade aos Glicopeptídeos .............................................................. 56
4.3.1 - Vancomicina ............................................................................................................ 56
4.3.2 - Teicoplanina ............................................................................................................. 63
4.3.3 - Evolução temporal da CIM dos glicopeptídeos de amostras relacionadas ao CEB . 70
5 - DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 77
6 - CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 88
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 90
xiii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI - Brain Heart Infusion
BMD - Broth microdilution
BSAC - British Society for Antimicrobial Chemotherapy
CA-ORSA - Staphylococcus resistente à oxacilina adquirido na comunidade
ccr - Cassete chromosome recombinase
CDC - Center for Diseases Control and Prevention
CEB - Clone endêmico brasileiro
CIM - Concentração inibitória mínima
CLSI - Clinical and Laboratory Standard Institute
DNA - Ácido desoxirribonucléico
EUA - Estados Unidos da América
GISA - Glicopeptide Intermediate Staphylococcus aureus
HA-ORSA - Staphylococcus resistente à oxacilina hospitalar
HCL - Ácido clorídrico
ICS - Infecção de corrente sanguínea
IgG - Imunoglobulina G
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
MH - Mueller-Hinton
MLSB - Macrolídeos, às lincosaminas e às estreptograminas B
MRSA - Staphylococcus resistente à meticilina
NCBI - National Center for Biotechnology
NNIS - National Nosocomical Infections Surveillance
NY/J - Clone Nova Iorque/Japão
ORF - Open reading frames
xiv
ORSA - Staphylococcus resistentes à oxacilina
OSPC - Clone Oceania/Pacífico Sudoeste
OSSA - Staphylococcus sensível à oxacilina
PBP - Proteína ligadora de penicilina
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis
PVL - Leucocidina Panton-Valentine
rRNA - RNA ribossômico
SCCmec - Staphylococcal Cassette Chromosome mec
SCCHg - Operon de resistência ao mercúrio
UFC - Unidades formadoras de colônias
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
URSS - União das Repúblicas Socialistas Soviéticas
UTI - Unidades de terapia intensiva
VISA - Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus
VRE - Vancomycin resistant Enterococcus
VRSA - Vancomycin resistant Staphylococcus aureus
xv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 01 - Identificação dos diferentes tipos de SCCmec descritos em S. aureus até o momento..... 12
Tabela 02 - Estudos avaliando a evolução temporal da CIM de vancomicina....................................... 25
Tabela 03 - Estudos avaliando a evolução temporal da CIM de teicoplanina….………………….......... 27
Tabela 04 - Regiões alvo, cepas controles e número de acesso GenBank........................................... 35
Tabela 05 - Sequência dos primers utilizados na PCR multiplex para determinação dos tipos de
SCCmec.................................................................................................................................................. 36
Tabela 06 - Cepas controles de S. aureus utilizadas nas reações de PCR para a tipagem do
SCCmec ......................……………………………................................................................................... 40
.
Tabela 07 - Seleção de ORSA isolados de hemoculturas entre os anos 2002 e 2009.......................... 46
Tabela 08 - Caracterização dos cassetes cromossômicos SCCmec dos isolados de ORSA................ 48
Tabela 09 - Distribuição das CIMs para vancomicina por microdiluição em caldo entre os isolados
ORSA avaliados neste estudo................................................................................................................ 57
Tabela 10 - Distribuição das CIMs para vancomicina pelo método E-test dos isolados ORSA
avaliados neste estudo........................................................................................................................... 58
Tabela 11 - Distribuição das CIMs para teicoplanina por microdiluição em caldo entre os isolados
ORSA avaliados neste estudo................................................................................................................ 63
Tabela 12 - Distribuição das CIMs para teicoplanina pelo método Etest® dos isolados ORSA
avaliados neste estudo........................................................................................................................... 64
xvi
Tabela 13 - Valores das CIM50 e CIM90 para teicoplanina dos isolados de ORSA de acordo com o
período do estudo pelas diferentes metodologias.................................................................................. 66
Tabela 14 - Distribuição das médias das CIMs de vancomicina de acordo com a tipagem molecular
de SCCmec dos isolados ORSA avaliados............................................................................................ 69
Tabela 15 - Distribuição das médias das CIMs de teicoplanina de acordo com a tipagem molecular
de SCCmec dos isolados ORSA avaliados............................................................................................ 69
Tabela 16 - Distribuição de ORSA com similaridade acima de 80% com o CEB.................................. 70
Tabela 17 - Análise estatística das CIMs de vancomicina por microdiluição em caldo de acordo com
o padrão de PFGE dos isolados ORSA avaliados.................................................................................. 75
Tabela 18 - Análise estatística das CIMs de teicoplanina por microdiluição em caldo de acordo com
o padrão de PFGE dos isolados ORSA avaliados.................................................................................. 76
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 01 - Evolução temporal da resistência aos antimicrobianos em isolados de S. aureus..........
06
Figura 02 - Ilustração do cassete cromossômico encontrado na cepa de OSSA N315 (pré-ORSA)..
09
Figura 03 - Estrutura do SCCmec.......................................................................................................
10
Figura 04 - Ilustração dos tipos de SCCmec.......................................................................................
14
Figura 05 - Mecanismo de ação dos glicopeptídeos na parede celular bacteriana (acima) e
mecanismo de resistência de S. aureus aos glicopeptídeos (abaixo)................……………..…..........
22
Figura 06A - Concentrações de vancomicina na placa de microdiluição. Cada linha representa uma
amostra e cada coluna uma concentração do antibiótico de 0,06 a 0,469 µg/mL................................. 42
.
Figura 06B - Concentrações de vancomicina de 0,5 a 1,375 µg/mL na placa de microdiluição. Cada
linha representa uma amostra e cada coluna uma concentração do antimicrobiano............................ 42
Figura 06C - Concentrações de vancomicina 1,5 a 64 µg/mL na placa de microdiluição. Cada linha
representa uma amostra e cada coluna uma concentração do antimicrobiano......……………............. 43
Figura 07 - Gel de agarose mostrando a amplificação correspondende ao fragmento específico do
gene nuc (117 Kb) nos isolados clínicos de ORSA.......................................................................……. 47
Figura 08 - Gel de agarose com a amplificação dos fragmentos específicos do gene mecA e
caracterização do SCCmec pela técnica de Zhang e colaboradores (2005) nos isolados clínicos de
ORSA.............................................................................................................................................……. 48
Figura 09 - Distribuição da frequência de SCCmec dos isolados de ORSA de acordo com o ano de
isolamento......................................................................................................................................……. 49
xviii
Figura 10 - Perfil de bandas de amostras ORSA carreadoras do SCCmec III pela técnica de
eletroforese em campo pulsado.....................................................................................................……. 50
Figura 11 - Gráfico da frequência de isolados ORSA relacionados aos principais clones epidêmicos
conhecidos encontrados neste estudo..........................................................................................……. 51
Figura 12 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec I, utilizando o coeficiente
de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o método UPGMA.. 52
Figura 13 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec II, utilizando o coeficiente
de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o método UPGMA.. 53
Figura 14 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec IV, utilizando o coeficiente
de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), Tolerância de 1,5% e o método UPGMA. 54
Figura 15 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec V em comparação às
cepas padrão utilizadas neste estudo (coeficiente de similaridade de Dice de 80%, representado
pela linha vertical pontilhada, tolerância de 1,5% e o método UPGMA)................................................ 55
Figura 16 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec III, utilizando 80% de
coeficiente de similaridade de Dice (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o método
UPGMA.................................................................................................................................................. 56
Figura 17 - Escatergrama utilizado valores ajustados para diluições log2 dos resultados das CIMs
para vancomicina obtidas por microdiluição em caldo e Etest® entre os isolados ORSA
avaliados................................................................................................................................................ 59
Figura 18 - Aumento dos valores de CIM50 e CIM90 para vancomicina dos isolados de ORSA entre
os períodos do estudo: P1 (2002-2005) e P2 (2006-2009), * p < 0,0001.............................................. 60
Figura 19 - Representação gráfica da mediana e quartis das CIMs para vancomicina dos isolados
de S. aureus distribuídas por ano de estudo determinadas pela metodologia de microdiluição em
caldo (p < 0,05)...................................................................................................................................... 61
xix
de S. aureus distribuídas por ano de estudo determinadas pela metodologia de Etest® (p =
0,051)..................................................................................................................................................... 62
Figura 21 - Escattergrama utilizado valores ajustados para diluições log2 dos resultados das CIMs
para teicoplanina obtidas por microdiluição em caldo e Etest® entre os isolados ORSA
avaliados................................................................................................................................................ 65
Figura 22 - Representação gráfica da mediana e quartis das CIMs para teicoplanina dos isolados
de S. aureus distribuídas por ano de estudo determinadas pela metodologia de microdiluição em
caldo (p = 0,512).................................................................................................................................... 67
de S. aureus distribuídas por ano de estudo determinadas pela metodologia de Etest® (p =
0,214)..................................................................................................................................................... 68
de ORSA relacionados ao CEB, distribuídos por ano de estudo determinadas pela metodologia de
microdiluição em caldo (p = 0,021)........................................................................................................ 71
Etest® (p = 0,807)................................................................................................................................... 72
microdiluição em caldo (p = 0,816)........................................................................................................ 73
Etest® (p = 0,111)................................................................................................................................... 74
xx
RESUMO
Introdução: A vancomicina é a primeira opção terapêutica para o tratamento de infecções
causadas por S. aureus resistentes à oxacilina (ORSA). Entretanto, sua utilização na prática
clínica está em questionamento. Modificações nas CIMs para vancomicina ao longo do tempo e
falências no tratamento têm sido reportadas para isolados considerados sensíveis à
vancomicina. Material e Métodos: Este estudo avaliou a modificação das CIMs de isolados de
ORSA para vancomicina e teicoplanina em um período de oito anos utilizando acréscimos
mínimos nas concentrações do glicopeptídeo por microdiluição em caldo. Os resultados obtidos
por BMD foram comparados aqueles do Etest®. Adicionalmente, a análise genotípica, assim
como a distribuição de SCCmec, foram analisadas por PFGE e PCR-multiplex, respectivamente.
Resultados: Duzentos isolados de ORSA, igualmente distribuídos entre os períodos P1 (2002 a
2005) e P2 (2006 a 2009), foram estudados. No P1, os isolados de ORSA exibiram CIM50 e
CIM90 para vancomicina de 0,625 µg/mL e 0,813 µg/mL, respectivamente. O SCCmec III (84%),
na sua maioria relacionado ao CEB (77%), foi o mais prevalente tipo de SCCmec. Em contraste,
no P2, um aumento na CIM50 (0,75 µg/mL) e CIM90 (1,5 µg/mL) foi observada e associada ao
declínio da frequência do SCCmec III (33%) e emergência dos SCCmec I e II (23% e 33%,
respectivamente, p< 0.05). No P2, o clone de ORSA mais prevalente foi relacionado ao clone
NY/J (22%). Não houve diferença estatisticamente significativa nas CIM50 e CIM90 entre os
períodos estudados. As taxas de concordância geral entre a BMD e o E-test (±1 diluição
logarítmica de diferença) para vancomicina e teicoplanina foram de 89% e 73%,
respectivamente. Conclusão: A variação temporal nas CIMs para vancomicina notada nos
isolados de ORSA provenientes de infecções de corrente sanguínea parece estar associada a
uma substituição gradual do CEB, predominantemente pelo clone NY/J (SCCmec II), que
reconhecidamente apresenta valores mais elevados de CIM para vancomicina.
xxi
ABSTRACT
Background: Vancomycin remains the cornerstone for treatment of oxacillin-resistant
Staphylococcus aureus (ORSA) infections. However, the vancomycin role has been questioned
since shifts in the VAN MICs over time and therapeutic failures have been reported for isolates
still categorized as vancomycin susceptible. Methods: This study evaluated the trend of
vancomycin and teicoplanin MICs against bloodstream ORSA isolates in an 8-year-period by
using precise incremental broth microdilution. Broth microdilution results were compared to those
of Etest®. Additionally, the genotypic pattern and SCCmec distribution were analyzed by PFGE
and multiplex PCR, respectively. Results: Two hundred ORSA isolates, equally distributed
between two periods, Period 1 (P1; from 2002 to 2005) and Period 2 (P2; from 2006 to 2009),
were studied. In the P1, ORSA isolates exhibited vancomycin MIC50 and MIC90 of 0.625µg/mL
and 0.813µg/mL, respectively. The SCCmec type III (84%), mainly related to the BEC (77%), was
the most prevalent SCCmec type. In contrast, in the P2, an increase in the vancomycin MIC50
(0.75 µg/mL) and MIC90 (1.0 µg/mL) was observed and associated with a decline in the frequency
of SCCmec type III (33%) and emergence of SCCmec types I and II (23% and 33%, respectively,
p< 0.05). In the P2, the most prevalent clone of ORSA isolates was genetically related to the
NY/J clone (22%). No statistically significant difference on teicoplanin MIC50 and MIC90 was
noticed between both periods. The essential agreement rates between broth microdilution and
Etest® (±1-log2 dilution difference) for vancomycin and teicoplanin were 89% and 73%,
respectively. Conclusion: A shift on vancomycin MICs over time among Brazilian bloodstream
ORSA isolates seems to be associated with a gradually replacement of BEC, predominantly, by
the NY/J clone harboring SCCmec II, which is known to present higher vancomycin MIC values.
xxii
INTRODUÇÃO
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Agente Etiológico
Alexandre Ogston e Louis Pasteur, em 1880, descreveram bactérias isoladas de
secreções de furúnculos, que, posteriormente foram denomidadas por Ogston como gênero
Staphylococcus (Kloos, 1997). Esse gênero foi agrupado na família Micrococacceae que inclui,
além de Staphylococcus, mais três gêneros: Micrococcus, Stomatococcus e Planococcus. Em
2005, foi proposta uma nova família para os Staphylococcus spp., família Staphylococcaceae,
porém, apenas em 2010 essa classificação foi aprovada pelo Bergeys Manual (Schleifer & Bell,
2010).
O gênero Staphylococcus é composto por 40 espécies, 17 das quais podem ser isoladas
de amostras biológicas humanas. Staphylococcus aureus subesp. aureus é o patógeno mais
importante entre os estafilococos (Cohen, 1986; Kloss, 1997). Essas bactérias estão
amplamente distribuídas na natureza e podem ser isoladas de ambientes ou como habitantes
comensais de pele, mucosas e outros sítios corpóreos dos seres humanos e animais (Cohen,
1986; Kloss, 1997).
Esses micro-organismos são cocos Gram positivos, medindo de 0,5 a 1,5 µm de
diâmetro, imóveis, não formadores de esporos e geralmente produtores de catalase.
Apresentam-se aos pares, tétrades ou cadeias curtas, ou ainda em aglomerados irregulares de
cachos de uva (“Staphylé” em grego significa cacho de uva e “aureus” em latim significa
dourado) (Kloss & Bannerman, 1994). Macroscopicamente, suas colônias em meio sólido
apresentam 1 a 3 mm de diâmetro, após 24 horas de incubação a 35ºC, ou de 3 a 8 mm após 72
horas de incubação. As colônias de S. aureus após 24 horas de incubação, podem ter pigmento
amarelo ou amarelo-alaranjado, enquanto outras espécies podem produzir colônias
esbranquiçadas ou acinzentadas, lisa, côncavas e com a borda contínua. Alguns isolados podem
apresentar uma difusa zona de β-hemólise ao redor das colônias que pode ser evidenciada após
1
INTRODUÇÃO
a incubação prolongada. São anaeróbios facultativos, com metabolismo oxidativo e fermentativo,
utilizando carboidrato e aminoácidos como fonte de energia (Kloss, 1997; Waldvogel, 2000;
Koneman et al., 2001).
1.1.1 - Identificação de S. aureus
A identificação laboratorial basea-se na pesquisa de fatores de virulência, como as
enzimas catalase, coagulase e DNAse; além da proteína A e a capacidade de fermentar o
manitol, entre outros (Cohen, 1986). Os membros da família Staphylococcaceae diferenciam-se
da família Streptococcaceae pela prova da catalase, sendo os primeiro positivos para esse teste.
Embora raros, existem relatos na literatura de S. aureus catalase negativos relacionados a
processos infecciosos (Crawford et al., 1994). O S. aureus pode ser identificado pela prova da
coagulase, pois a maioria das cepas possui uma coagulase unida ou “fator de agregação” na
superfície da parede celular. Esse fator reage diretamente com o fibrinogênio presente no
plasma e produz uma rápida aglutinação das células bacterianas. Outro procedimento alternativo
para a realização da prova da coagulase é a aglutinação com látex, onde são utilizadas
partículas de látex recobertas com imunoglobulina G (IgG) e fibrinogênio que se liga na proteína
A e ao fator de aglutinação, na superfície da célula bacteriana (Cohen, 1986).
Provas adicionais incluem a prova da desoxirribonuclease (com azul de toluidina O ou
com HCL 1N) e fermentação do manitol. Após a semeadura e incubação das colônias de S.
aureus em meio de ácido desoxirribonucléico (DNA) com o corante azul-de-toluidiuna O, o meio
em torno da colônia bacteriana torna-se de azul intenso a rosa, indicando hidrólise do DNA.
Quando utilizado o meio de DNA sem o corante, a revelação da hidrólise é feita com HCL 1N,
onde se observa a formação de um halo transparente ao redor do crescimento bacteriano.
A propriedade do S. aureus em fermentar o manitol é utilizada para detecção desse
micro-organismo em alguns espécimes clínicos. Devido à alta concentração de sais no meio de
2
INTRODUÇÃO
ágar sais-manitol, o crescimento de outros micro-organismos é inibido, isolando de modo
seletivo, estafilococos. A detecção de S. aureus pode ser verificada pela presença de um halo
amarelo ao redor das colônias, indicando a produção de ácido a partir do manitol.
Ocasionalmente, isolados de S. aureus geram resultados equivocados nos testes de
coagulase ou outros testes bioquímicos e a confirmação da identificação se faz necessária por
um método alternativo. Os testes moleculares, visando à detecção de alvos específicos da
espécie de S. aureus permitem uma rápida identificação dessa espécie. A maioria dos testes
moleculares está baseada na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os alvos mais
frequentemente empregados para a identificação espécie-específica de S. aureus compreendem
os genes que codificam as proteínas nuclease (nuc), coagulase (coa), proteína A (spa), ou ainda
os genes femA e femB (que codificam as proteínas, respectivamente, FemA e FemB, envolvidas
na síntese da parede de peptidioglicano), além da região codificadora do 16S rRNA (Stapleton &
Taylor, 2002; Brown et al., 2005; Hübscher et al., 2007).
1.2 - Epidemiologia das Infecções causadas por S. aureus
Passado mais de um século da descrição de Ogston, em 1880, S. aureus continua sendo
um dos patógenos mais importantes na prática médica. Esse micro-organismo é considerado um
dos principais agentes etiológicos nas infecções relacionadas à assistência à saúde,
acometendo, principalmente, pacientes submetidos aos procedimentos invasivos e internação
prolongada (Kloss & Bannerman, 1994; Shaberg et al., 1997; Lowy, 1998). Devido a sua
admirável capacidade de adaptação ao meio ambiente e à pele, às mucosas e às glândulas de
seres humanos e animais é capaz de causar desde infecções superficiais, disseminadas a
processos toxigênicos diversos, como intoxicação alimentar, síndrome do choque tóxico e
síndrome da pele escaldada (Lowy, 1998; de Almeida Filho & Nader Filho, 2000; Bures et al.,
2000; Huang et al., 2002; Pedro & Branchini, 2002).
3
INTRODUÇÃO
S. aureus é um persistente membro da microbiota humana, apresentando taxas de
colonização de 25 a 50%, sendo que, as maiores taxas são encontradas entre algumas
populações específicas como: usuário de drogas endovenosas, portadores de diabetes insulinodependente, indivíduos apresentando enfermidades dermatológicas, portadores do vírus da
imunodeficiência adquirida, em pacientes com uso de cateteres venosos de longa permanência e
em trabalhadores da área da saúde. A colonização pode ser transitória ou persistente e se
prolongar por longos períodos (Peacock et al., 2001). Algumas infecções por S. aureus são
agudas e podem disseminar para diferentes tecidos e provocar focos metastáticos. Episódios
mais graves, como bacteremia, pneumonia necrotizante, osteomielite, endocardite, miocardite,
pericardite e meningite, também podem ocorrer (Lowy, 2003; Moran & Mount, 2003).
Esse patógeno apresenta grande facilidade em se disseminar nos ambientes intra e interhospitalares, em parte devido à facilidade dessa bactéria em sobreviver no meio ambiente e à
frequente colonização de profissionais da saúde e material inanimado (Pedro & Branchini, 1997;
Waldvogel, 2000; Sader et al., 2001). Pacientes ou profissionais de saúde colonizados por S.
aureus são responsáveis pela introdução e disseminação desse patógeno no ambiente
hospitalar. Recentemente, Piechowicz e colaboradores (2012) descreveram um surto de
impetigo bolhoso em uma maternidade, causado por S. aureus relacionados geneticamente com
dois isolados recuperados de profissionais da saúde do mesmo setor. No Brasil, os estudos
mostram uma prevalência em torno de 25-45% de profissionais de saúde colonizados por S.
aureus (Santos, 1999; Busato et al., 2006; da Silva et al., 2012).
Atualmente a prevalência de infecções por esse patógeno tem sido relatada por diversos
estudos de vigilância epidemiológica. Segundo dados do SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program, S. aureus foi o patógeno isolado com maior frequência de infecções de corrente
sanguínea, trato respiratório, pele e tecidos moles na América Latina, América do Norte e
Europa, no período compreendido entre 1998 a 2004 (Moet et al., 2007). No Brasil, estudos de
4
INTRODUÇÃO
vigilância, como o Brazillian SCOPE e o SENTRY, demostraram que S. aureus foi o agente
etiológico mais frequentemente isolado tanto de infecções de corrente sanguínea como de
infecções nosocomiais no geral, entre os anos 2005 e 2010 (Gales et al., 2009; Marra et al.,
2011).
1.3. Mecanismo de Resistência aos β-lactâmicos
1.3.1. Resistência à Penicilina
A emergência de resistência aos antimicrobianos em patógenos, particularmente Gram
positivos, é um importante fator de morbi-mortalidade de pacientes hospitalizados (Sola et al.,
2002; Lowy, 2003). A mortalidade dos pacientes com bacteremia por S. aureus na era préantibótica excedia 80%, sendo que, mais de 70% desses indivíduos desenvolviam infecções
disseminadas. Os antibióticos β-lactâmicos produzem um efeito bactericida pela inibição das
enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese do peptídeoglicano, principal
componente da parede celular das bactérias Gram positivas. A resistência aos antibióticos βlactâmicos apresentada pelos estafilococos deve-se principalmente a dois mecanismos. O
primeiro mecanismo é a produção de uma enzima β-lactamase, que hidroliza o anel β-lactâmico,
inativando o antimicrobiano (Brumfitt & Hamilton-Miller, 1989). Essas enzimas, porém, mostram
pouca atividade contra as penicilinas semisintéticas, como a meticilina, a oxacilina e a nafcilina.
O segundo mecanismo está associado à alteração do sítio de ação do antibiótico β-lactâmico
pela produção de uma proteína ligadora de penicilina (PBP) modificada, a PBP2a (também
denominada PBP2’), que está ausente nos Staphylococcus spp. sensíveis à oxacilina (Hackbarth
et al., 1989).
Após 1940, com a disponibilidade da penicilina para o tratamento das infecções por S.
aureus, a mortalidade causada por esse patógeno caiu consideravelmente. Porém, dois anos
mais tarde, esse micro-organismo adquiriu mecanismos de resistência a essa droga (Skinner &
5
INTRODUÇÃO
Keefer, 1941; Rossi & Andreazzi, 2005), dessa forma, em 1942, Rammelkamp & Maxon
descrevem o primeiro caso de resistência à penicilina de isolado de S. aureus, proveniente de
pacientes hospitalizados, como demonstrado na Figura 01.
Figura 01 - Evolução temporal da resistência aos antimicrobianos em isolados de S. aureus.
Adaptada do artigo de Chamber & DeLeo (2009).
A prevalência de amostras resistentes à penicilina, devido à produção de penicilinases,
aumentou progressivamente devido, em parte, à ampla utilização desse antimicrobiano no
ambiente hospitalar e comunitário e à disseminação dessas cepas por pacientes colonizados. No
final da década de 50, foram isoladas amostras de S. aureus resistentes não somente à
penicilina como também à eritromicina, à estreptomicina e à tetraciclina. No final da década de
60, mais de 80% dos isolados de S. aureus, provenientes do ambiente hospitalar ou da
6
INTRODUÇÃO
comunidade, apresentavam resistência à penicilina. Atualmente mais de 90% dos isolados de S.
aureus produzem penicilinases (Poston, 1966; Jessen et al., 1969; Lowy, 2003).
1.3.2 - Resistência à Oxacilina
Em 1960, a meticilina foi lançada no mercado como alternativa terapêutica para cepas
produtoras de penicilinase, uma vez que essa droga não sofre ação dessa enzima. Porém, já em
1961, surge o primeiro relato S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), proveniente de um
hospital britânico (Jevons, 1961); esse relato foi logo seguido de descrições de surtos
relacionados a clones de MRSA na Europa e nos Estados Unidos da América (EUA) (Barrett et
al., 1968; Jessen et al., 1969). Logo, observaram tratar-se de outro mecanismo de resistência,
uma vez que não havia inativação do antimicrobiano (Chambers & Deleo, 2009). A identificação
do determinante de resistência gene mecA ocorreu somente 20 anos após o primeiro relato de
resistência à meticilina.
A meticilina e a oxacilina são antimicrobianos similares, sendo que ORSA (S. aureus
resistentes à oxacilina) é a designação mais aceita atualmente, já que à meticilina não está mais
disponível comercialmente (Korn et al., 2001). Dados do National Nosocomical Infections
Surveillance (NNIS) e do Center for Diseases Control and Prevention (CDC), mostram que,
desde 1999, a proporção de ORSA ultrapassa 50% entre os pacientes em UT nos EUA. Porém,
em estudo recente do CDC, encorajadores resultados foram publicados, os quais mostraram que
no período de 2005 a 2008 houve um decréscimo nas taxas de incidência de infecções invasivas
por ORSA de 9,4% ao ano, especialmente no subgrupo de infecção de corrente sanguínea (de
11,2% ao ano) (Kallen et al., 2010). Entretanto, no Brasil, os índices de cepas ORSA ainda são
bastante elevados e variam de 30-40%, alcançando seus maiores índices em cepas de S.
aureus isoladas de pacientes internados em unidades de terapia intensiva (Gales et al., 2009;
Marra et al., 2011).
7
INTRODUÇÃO
Com o advento da resistência à oxacilina, vários estudos buscaram correlacionar os
fatores de risco associados à aquisição de ORSA no ambiente hospitalar. Entre esses fatores, os
principais descritos são: histórico de hospitalização, realização de procedimentos cirúrgicos,
admissão em unidades de terapia intensiva (UTI), uso de dispositivos invasivos, contato com
indivíduos colonizados ou infectados com ORSA, assim como a pressão seletiva por uso prévio
de determinados antimicrobianos (Tacconelli, et al., 2008; Fukuta et al., 2012).
Os primeiros relatos de S. aureus resistentes à oxacilina adquiridos na comunidade (CAORSA) estavam associados a populações específicas, entre os quais: homem que mantém
relação sexual com homens, presidiários, crianças atendidas em centros de saúde, recrutas
militares e esportistas profissionais (Saravolatz et al., 1982; Kluytmans-Vandenbergh et al.,
2006). Em muitos locais, isolados de CA-ORSA foram introduzidos no ambiente hospitalar,
substituindo o clássico clone ORSA hospitalar (HA-ORSA) (Turnidge et al., 2000, Carleton et al.,
2004). Os estudos que avaliaram os riscos para aquisição do CA-ORSA são limitados. Os
pacientes geralmente são mais novos que aqueles que adquiriram HA-ORSA e foram
previamente expostos a agentes antimicrobianos (Naimi et al., 2003; Baggett et al., 2003).
A resistência à oxacilina em S. aureus é frequentemente decorrente da aquisição de um
gene de resistência denominado mecA e consequente alteração do sítio de ação dos βlactâmicos, devido à produção de uma PBP alterada, denominada PBP2a ou PBP2’, uma
proteína de 78 kDa (Brumfitt & Hamilton-Miller, 1989; Chambers, 1997). Essa PBP é capaz de
substituir a função das demais PBPs da bactéria, permitindo a reação de transpeptidação;
porém, possui baixa afinidade pelos compostos β-lactâmicos. Consequentemente, a resistência
à oxacilina em S. aureus confere resistência a todos os β-lactâmicos, inclusive às cefalosporinas
(Tomasz et al., 1989; CLSI, 2006).
O gene mecA faz parte de um elemento genético móvel encontrado na maioria dos
isolados de ORSA designado Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), integrado
8
INTRODUÇÃO
ao cromossomo do S. aureus (Katayama et al., 2000; Hiramatsu et al., 2002;). O SCCmec tem
importância fundamental na transmissão da resistência e na epidemiologia desses isolados (Ito
et al., 2003; Oliveira et al., 2006; Kondo et al., 2007). Estudo de Ito e colaboradores (1999)
descreveu integralmente o elemento SCCmec, ainda conhecido como DNA mec, na cepa N315
que era sensível à oxacilina (OSSA) e foi nomeada como pré-ORSA (Figura 02). Essa cepa
apesar de apresentar o gene mecA, era sensível à oxacilina. A explicação desse fato é que a
expressão do gene mecA estava fortemente reprimida na cepa N315 pelo produto de um gene
regulador denominado mecl (Ito et al., 1998; Ito et al., 1999).
Figura 02 - Ilustração do cassete cromossômico encontrado na cepa de OSSA N315 (préORSA) (Disponível em http://www.staphylococcus.net).
Com a evolução das técnicas de clonagem e sequenciamento, toda a região do
cromossomo em torno do gene Meca, em poucos anos, foi analisada. Portanto, o SCCmec é
composto pelo complexo do gene mec, que codifica resistência à oxacilina e o complexo do gene
ccr (do inglês cassete chromosome recombinase), que codifica recombinases responsáveis pela
sua mobilidade. Além disso, uma região denominada J (derivada do termo inglês junkyard)
9
INTRODUÇÃO
compõe o restante do material genético do complexo SCCmec. As regiões junkyard
compreendem três partes: J1 (a região entre ccr e flanqueando a região cromossômica), J2 (a
região entre o mecI e ccr) e J3 (a região entre o orfX e o gene mec) (Figura 03).
Figura 03. Estrutura do SCCmec. Disponível em: http://www.staphylococcus.net.
As regiões J não são necessariamente idênticas entre SCCmec do mesmo tipo,
portanto, podem se constituir em alvos para a subtipagem dos elementos SCCmec em estudos
epidemiológicos. As diferenças de nucleotídeos na região J1 e/ou a presença de inserção de
plasmídeos e transposons, que na sua maioria codificam outros determinantes de resistência
integrados às regiões J2 e J3, podem ser úteis na caracterização dos elementos SCCmec.
Entretanto, a importância das regiões J, em termos funcionais, ainda permanece como objeto de
estudo (Katayama et al., 2000; Katayama et al., 2001; Ito et al., 2007). Cinco classes principais
do complexo do gene mec foram identificadas com o uso de primers específicos através da
técnica de PCR utilizando o DNA cromossômico, de várias espécies de estafilococos resistentes
à oxacilina, como alvo. As classes desse complexo, são nomeadas de A a E, que divergem entre
10
INTRODUÇÃO
si de acordo com a presença de determinadas sequências de inserção (sequências de DNA
envolvidas com a mobilização de informação genética de função similar aos plasmídeos)
(Katayama et al., 2001). O complexo mec contém os genes reguladores da expressão do gene
mecA, que são o mecl e mecR1, localizados na região posterior ao promotor do gene mecA. O
gene mecI codifica uma proteína que se liga ao DNA e reprime a transcrição do gene mecA,
enquanto que o gene mecR1 codifica uma proteína que promove a transcrição do gene mecA na
presença de β-lactâmicos (Sharma et al., 1998).
A outra região gênica que é comum a todos SCCmec é o complexo do gene ccr
(cassette chromossome recombinase) que é composto pelos genes ccrA, ccrB e ccrC envolvidos
por ORFs (fases abertas de leitura, do inglês open reading frames) localizadas no complexo
SCCmec, responsáveis pela codificação de polipeptídeos que têm como função a excisão e
integração do SCCmec no cromossomo estafilocócico (Katayama et al., 2000; IWG-SCC, 2009).
Esses genes são designados de ccrA1 e ccrB, ccrA2 e ccrB2, ccrA3 e ccrB3, ccrC, ccrA4 e
ccrB4, ccrA1 e ccrB6, e, ccrA1 e ccrB3 (Ito et al., 2004; IWG-SCC, 2009, Li et al., 2011; GarcíaÁlvarez et al., 2011), como demonstrado na Tabela 01. Experimentos demonstram que os genes
das recombinases codificados no elemento SCCmec, ccrA e ccrB são suficientes para transferir
o elemento de um plasmídeo para um cromossomo em um sítio específico e com orientação
específica. No entanto, o mecanismo exato da transferência do SCCmec na natureza ainda é
desconhecido (Robinson et al., 2003). Embora a origem do SCCmec permaneça desconhecida,
uma das hipóteses seria que o cassete poderia provir do S. sciuri que albergou o ancestral da
PBP2a, uma vez que uma PBP foi encontrada no mesmo e demonstrou ter 87,8% de
similaridade com a sequência dos aminoácidos da PBP2a (Wu et al., 2001).
11
INTRODUÇÃO
Tabela 01. Identificação dos diferentes tipos de SCCmec descritos em S. aureus até o momento.
SCCmec
Complexodo gene ccr (alotipo)
Complexo do gene mec
I
1 (A1B1)
B
II
2 (A2B2)
A
III
3 (A3B3)
A
IV
2 (A2B2)
B
V
5 (C)
C2
VI
4 (A4B4)
B
VII
5 (C)
C1
VIII
4 (A4B4)
A
IX
1 (A1B1)
C2
X
7 (A1B6)
C1
XI
8 (A1B3)
E
Atualmente, são conhecidos 11 diferentes tipos de SCCmec, classificados em tipos
(SCCmec I a XI) e subtipos (subtipos IVa, IVA, IVb, IVc, IVd, IVE, IVg, IVh, IVi e IVj). Essa
nomenclatura foi proposta quando realizada a descrição dos três primeiros elementos por Ito e
colaboradores (2001). Porém uma nova proposta contendo informações adicionais, baseadas no
tipo de ccr e classe de mec presente, foi estabelecida para nomear os novos elementos SCCmec
(IWG-SCC, 2009). Dessa maneira, os tipos de SCCmec devem ser designados por números
romanos de acordo com a ordem em que foram reportados, seguidos pelo complexo do gene ccr
e do gene mec juntos dentro de um parêntesis (Tabela 01).
Os elementos SCCmec I, II, III e VI estão mais associados a infecções causadas por
estafilococos de origem nosocomial, enquanto que os tipos IV e V são encontrados com maior
frequência em estafilococos de infecções comunitárias (Hisata et al., 2005; Kondo et al., 2007).
12
INTRODUÇÃO
O tipo VII foi encontrado em cepas comunitárias isolados na Suécia (Higuchi et al., 2008), assim
como o SCCmec VIII no Canadá (Zhang et al., 2009). Os tipos mais recentemente descritos de
SCCmec (IX, X e XI), foram inicialmente identificados em isolados de S. aureus de animais. Os
tipos de SCCmec são definidos por meio da combinação do complexo ccr e seu alotipo e a
classe do gene mecA (Tabela 01) (IWG-SCC, 2009). O tipo I (34 Kb) foi identificado na primeira
cepa de ORSA isolada em 1961, no Reino Unido (cepa NCTC 104442). O SCCmec I promove
resistência somente aos β-lactâmicos (Figura 04).
13
INTRODUÇÃO
Figura 04 - Ilustração dos tipos de SCCmec. Adaptado de International Working Group on the
Classiﬁcation of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC, 2009); Li e
colaboradores (2011) e Shore e colaboradores (2011).
14
INTRODUÇÃO
Os dois maiores elementos SCCmec II e III possuem elementos de transposição e
genes codificadores de resistência aos antimicrobianos não β-lactâmicos. Esses elementos
contém mais cópias das sequências de repetição IS431 e do transposon Tn544 (Ito et al., 2001;
Katayama et al., 2001), como mostrado na Figura 4. O SCCmec II (52Kb) foi identificado na cepa
N315, pré-ORSA, isolada no Japão em 1982. É o segundo maior elemento gênico e possui, a
jusante do complexo mec, uma cópia do transposon Tn554, onde está inserido o gene spc que
codifica a resistência à espectinomicina e o gene ermA que codifica a resistência aos
macrolídeos, às lincosaminas e às estreptograminasB (MLSB). À direita do complexo mec está
integrada uma cópia do plasmídeo pBU110 com os genes que codificam a resistência para
canamicina e tobramicina (aadD) e para bleomicina (ble), um anticarcinogênico. Shore e
colaboradores (2005) identificaram seis variantes do SCCmec II.
O SCCmec III (66 Kb), identificado em uma cepa ORSA isolada, em 1985, na Nova
Zelândia, é o maior elemento genético, mais complexo e que carreia o maior número de genes
de resistência. O SCCmec III contém um plasmídeo pequeno, a montante do gene mecA, o
pT181, que carreia o gene tetK o qual codifica uma proteína que promove o efluxo da tetraciclina
(Oliveira et al., 2002). O SCCmec III é subdividido em IIIa e IIIb, o SCCmec tipo IIIa difere pela
ausência do pT181 e seus elementos IS431. O SCCmec IIIb não apresenta integradas cópias de
Tn554, pT181 e do operon mer com suas sequências de inserção associadas (Oliveira et al.,
2002; Ito et al., 2003). Em 2006, foi descrita uma variante do SCCmec III que, na realidade, era
composta de 2 elementos SCC pequenos, SCCmercury e o SCCmec III (3A). O elemento
SCCmercury (SCCHg) carrega o operon de resistência ao mercúrio pode ser distinguido do
SCCmec III pelo complexo do gene mec classe A e do complexo do gene ccr3 (Chongtrakool et
al., 2006), como mostrado anteriormente na Figura 04.
O SCCmec IV (20 a 24 Kb) foi identificado de um isolado ORSA adquirido na
comunidade, geneticamente relacionado ao Clone Pediátrico. Vidal e colaboradores (2009)
15
INTRODUÇÃO
sugerem que o SCCmec IV tem um baixo custo metabólico para transferência, pois carrega
recombinases e os genes que regulam a expressão do mecA. O SCCmec IV tem uma nova
combinação do complexo mec e do complexo ccr2, muito menor que os outros SCCmec
descritos anteriormente. Ambos SCCmec I e IV têm o complexo mec com a sequência de
inserção IS1272 inserida no mesmo ponto de junção, isso sugere que a recombinação ocorreu
entre SCCmec I e outras sequências para gerar o SCCmec IV, porém o complexo ccr tem maior
identidade com o complexo ccr2 característico do SCCmec II (Ma et al., 2002).
O SCCmec V (28 Kb) foi isolado na Austrália da cepa WIS [WBG8318] de um ORSA
comunitário (Ito et al., 2004). O SCCmec V não possui outro gene de resistência, além do gene
mecA, porém já foram descritos ORSA multirrersistentes carreando esse tipo de elemento
genético (O’Brien et al., 2005). O SCCmec V codifica um gene de uma nova recombinase,
responsável por sua mobilidade, a ccrC, mas com uma única cópia do gene, diferente dos outros
tipos de SCCmec que têm duas recombinases (Ito et al., 2004). Boyle-Vavra e colaboradores
(2005) descreveram um novo subtipo de SCCmec V designado como SCCmec Vt, contendo uma
nova variante de ccrC (ccrC2). Esses mesmos autores também detectaram um novo SCCmec
que contém todas as características do SCCmec IV e também a ccrC.
O SCCmec VI foi inicialmente descrito por Oliveira e colaboradores (2001a) como
SCCmec IV, encontrado na cepa de S. aureus HDE28, posteriormente, revisado pelo mesmo
grupo, que o reclassificou em SCCmec VI (4B) (Oliveira et al., 2006). O SCCmec VI, é um
elemento menor, porém identificado em cepas nosocomiais. Sua estrutura se resume ao
complexo ccrAB2 e ao complexo mec tipo B. Esse elemento foi predominante nos hospitais de
Portugal, porém ainda é pouco descrito em outras localidades (Oliveira et al., 2006; Kondo et al.,
2007).
O SCCmec VII foi inicialmente encontrado em uma cepa de ORSA adquirida na
comunidade em Taiwan (Higuchi et al., 2008). Os complexos dos genes mec (C2b) e ccrC2
16
INTRODUÇÃO
presentes nesse tipo de SCCmec apresenta grande similaridade, com algumas inserções e
substituição ao SCCmec V, provavelmente originando-se de sequências de eventos de
recombinações e inserções (Higuchi et al., 2008).
O SCCmec VIII foi descrito por Zhang e colaboradores (2009) em uma cepa de S.
aureus isolada no Canadá. Esse tipo de SCCmec é um elemento que contém uma combinação
única de mec classe A e complexos tipo 4 do gene ccr. Estudos de recombinação homóloga
sugerem evidências da transferência horizontal de elementos SCCmec entre espécies de
Staphylococcus spp. para a formação de novos tipos de SCCmec, que no caso do SCCmec VIII
é quase idêntico ao elemento similar encontrado em S. epidermidis (Zhang et al., 2009).
Um estudo conduzido por Li e colaboradores (2011), encontrou dois novos tipos de
SCCmec, os tipos IX e X, em isolados de ORSA de pessoas participantes de uma conferência
internacional sobre veterinária de porcos na Alemanha em 2006. Mais recentemente, uma nova
variedade de mecA foi identificada em S. aureus isolados de animais e humanos em diversos
países da Europa. Esse novo subtipo foi inicialmente designado como mecALGA251 (GarcíaÁlvarez et al., 2011), mas foi renomeado mecC, por ter apenas 70% de similaridade de
nucleotídeos com o gene mecA. O gene mecC está presente em um complexo classe E do gene
mec e esse está localizado em um então designado SCCmec XI, que também expressa
recombinases (gene ccrA1B3) e resistência ao arsênio (Li et al., 2011; Vestergaard et al., 2012).
Devido a sua baixa similaridade com gene mecA, testes específicos para detecção desse gene
podem não detectar isolados de ORSA que apresentam o gene mecC (García-Álvarez et al.,
2011).
1.3.3 - Resistência aos Glicopeptídeos
O glicopeptídeo vancomicina foi introduzido clinicamente em 1958 para o tratamento de
infecções causadas por bactérias Gram positivas. Devido ao aumento da prevalência de
17
INTRODUÇÃO
infecções causadas por isolados de ORSA (Ena et al., 1993), a utilização desse agente
aumentou significativamente nos últimos anos, permanecendo como a principal opção
terapêutica no tratamento de infecções por esses isolados multirresistentes (Tenover et al.,
2001). Para exercer sua ação, os glicopeptídeos se ligam ao terminal D-alanil-D-alanina da
molécula de peptídeoglicano. Esses antimicrobianos podem se ligar a dois alvos principais, na
célula bacteriana de S. aureus. O primeiro sítio de ligação se constitui nos resíduos de D-alanilD-alanina já integrados à camada de peptídeoglicano na parede celular, ou nas cadeias em
formação de peptídeoglicano. O segundo sítio de ligação deses compostos são os precursores
de peptídeoglicano que se encontram na membrana citoplasmática bacteriana, os monômeros
de mureína (Biavasco et al., 2000).
Em 1986, Wilson e colaboradores (1986) identificaram o primeiro isolado clínico de S.
haemolyticus com sensibilidade diminuída para teicoplanina, cuja concentração inibitória mínima
(CIM) era de 8 µg/mL, em uma unidade de cirurgia cardíaca que utilizava rotineiramente esse
antimicrobiano para profilaxia. Em 1996, ocorreu no Japão o primeiro isolado clínico de S. aureus
apresentando sensibilidade diminuída aos glicopeptídeos em uma criança de quatro meses de
idade. A criança estava em uso de vancomicina para o tratamento de uma infecção do sítio
cirúrgico causada por ORSA. O isolado de ORSA recuperado da secreção purulenta
apresentava sensibilidade reduzida para vancomicina (CIM = 8 µg/mL). Esse patógeno foi
denominado VISA - Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus ou GISA - Glicopeptide
Intermediate Staphylococcus aureus (Hiramatsu et al., 1997).
Na Europa, o primeiro relato de VISA ocorreu na França e apesar da cepa ter sido
isolada de um paciente, em 1995, somente veio ao conhecimento da comunidade científica em
1998. A paciente estava recebendo vancomicina e amicacina para o tratamento de uma infecção
por ORSA relacionada a um cateter venoso central que apresentou CIM de 2 µg/mL para
vancomicina. Após 10 dias sem resposta clínica satisfatória, o antimicrobiano foi trocado por
18
INTRODUÇÃO
teicoplanina. Foi coletada uma amostra de uma hemocultura nos dois primeiros dias de uso de
teicoplanina, sendo isolado um ORSA com sensibilidade reduzida à vancomicina (CIM = 8
µg/mL) e teicoplanina (CIM = 16 µg/mL). A terapia antimicrobiana foi então substituída para
quinupristin/dalfopristin com sucesso terapêutico (Ploy et al., 1998). As duas amostras de S.
aureus (ORSA e VISA) foram comparadas através da análise do DNA cromossômico por
eletroforese em campo elétrico variável (PFGE) e se mostraram idênticas, sugerindo que a
amostra VISA fora, provavelmente, selecionada da comunidade de ORSA sensível à
vancomicina.
O primeiro caso de VISA nos EUA foi identificado em 1997, em um paciente com
insuficiência renal crônica que apresentava uma infecção causada por uma cepa ORSA cuja CIM
de vancomicina era de 8 µg/mL (Smith et al., 1999). Esses primeiros relatos de infecção por
VISA foram logo seguidos pela identificação dos isolados com sensibilidade diminuída aos
glicopeptídeos em várias outras partes do mundo, como no Reino Unido, Alemanha, Grécia,
Hong Kong, Tailândia, Austria e Polônia (Fitch & Johnson, 1998; Bierbaum et al., 1999;
Kantzanou et al., 1999; Wong et al., 2000; Trakulsomboon et al., 2001; Ward et al., 2001;
Krzyszton-Russjan et al., 2002).
Na América Latina, o programa de vigilância antimicrobiana SENTRY, analisando quase
2.000 isolados clíncos de S. aureus provenientes da Argentina, Brasil, Chile, Colômbia, México e
Uruguai (Diekema et al., 2001), no período entre 1997 e 1999, não detectou nenhum isolado com
sensibilidade reduzida à vancomicina. Entretanto, o primeiro relato de VISA no Brasil foi
reportado em um estudo realizado com 140 amostras de ORSA, isoladas de pacientes expostos
à vancomicina, entre 1998 e 1999, onde cinco dessas apresentaram CIM para vancomicina de 8
µg/mL. O PFGE caracterizou esses isolados como pertencentes ao clone endêmico brasileiro
(CEB). Esses isolados foram negativos para os genes vanA, vanB e vanC por PCR, mostrando
tratar-se de um mecanismo de resistência diferente (Oliveira et al., 2001b). Em 2002, um outro
19
INTRODUÇÃO
relato de VISA, foi descrito em um centro médico brasileiro (Andrade-Baiocchi et al., 2003). A
paciente apresentava um quadro compatível com endocardite infecciosa por ORSA, refratário ao
tratamento com altas doses de vancomicina. Sucessivos isolados de ORSA foram recuperados
com CIM para vancomicina de 8 µg/mL. A emergência do VISA está relacionada à extensa
exposição à vancomicina por um período de tratamento de 25 dias até 18 semanas (CDC, 2000).
Apesar do número crescente de infecções causadas por VISA, nenhum isolado de S.
aureus apresentando alto grau de resistência à vancomicina (CIM ≥ 32 µg/mL) havia sido
identificado até 2001. Entretanto, em junho de 2002, um isolado de S. aureus apresentando CIM
˃ 128 µg/mL para vancomicina foi detectado em Michigan, nos EUA, em um paciente de 40
anos com diabetes e insuficiência renal crônica e portador de um Enterococcus faecalis
resistente à vancomicina (VRE). A presença do gene vanA, nesse isolado de S. aureus sugere
que a resistência a vancomicina pode ter sido adquirida através da troca de material genético
com a cepa VRE. Esse novo fenótipo de resistência foi denominado VRSA - Vancomycin
Resistant Staphylococcus aureus (Chang et al., 2003). Outro caso de VRSA foi reportado no
mesmo ano, também nos EUA, proveniente de um paciente apresentando lesão cutânea
infectada por S. aureus (CDC, 2004). Subsequentemente, diversos relatos foram realizados,
porém restritos a locais como EUA, India e Irã (CDC, 2004; Weigel et al., 2007; Saha et al., 2008;
Aligholi et al., 2008; Dezfulian et al., 2012; Azimian et al., 2012). Em comum, esses casos
possuíam alto grau de resistência à vancomicina (32-1.024 µg/mL), porém, enquanto alguns
isolados apresentavam sensibilidade a outras classes de antimicrobianos por disco difusão,
outros eram resistentes a todos, exceto minociclina e gentamicina (Chang et al., 2003; CDC,
2004; Azimian et al., 2012). De forma interessante e preocupante, o isolado VRSA reportado por
Azimian e colaboradores (2012) pertence ao ST1283, o qual difere em apenas uma única
mutação do ST239 contendo o CEB. Curiosamente, três isolados de VRSA com CIM para
vancomicina de 16-64 µg/mL foram negativos para detecção de vanA/vanB, sugerindo um
20
INTRODUÇÃO
mecanismo alternativo de resistência a vancomicina, como descrito por Cui e colaboradores
(2000), o intenso espessamento da parede celular.
A resistência aos glicopeptídeos em S. aureus pode se expressar através de dois
fenótipos distintos VISA e VRSA. Os isolados de VISA apresentam baixo grau de resistência a
vancomicina, com CIMs variando de 8 a 16 µg/mL. O segundo fenótipo de resistência, VRSA,
está relacionado ao alto grau de resistência à vancomicina, com CIM ˃32 µg/mL (Chang et al.,
2003; Tenover et al., 2004). O mecanismo de resistência aos glicopeptídeos em S. aureus foi
extensamente estudado no primeiro isolado clínico VISA, identificado no Japão por Hiramatsu,
denominado Mu50 (Hiramatsu et al., 1997; Hanaki et al., 1999). Algumas propriedades
identificadas nesse isolado não foram encontradas em cepas sensíveis à vancomicina, sugerindo
que os isolados VISA apresentam características especificas de crescimento e multiplicação
bacteriana (Figura 05). Dentre as características mais importantes, destacam-se (i) um aumento
da produção de monômeros de mureína, precursores do peptideoglicano; (ii) maior quantidade
de resíduos livres de D-alanil-D-alanina ou debris da parede bacteriana liberados para o meio
extra-celular; (iii) elevada atividade autolítica e; (iv) aumento da produção e expressão de
PBP2a. Essas caracteristicas traduzem-se em maior atividade da parede celular, que aumenta
sua espessura, integrando mais precursores do peptideoglicano e dificultando a penetração aos
glicopeptídeos (Hanaki et al., 1998). Não foi descrito, até o momento, um gene específico,
relacionado a essa resistência. Esse mecanismo de resistência ainda não foi totalmente
elucidado, mas estudos sugerem que esse fenômeno pode ser mediado pelo acúmulo de
material ou por alterações na parede celular. Apesar da classificação de resistência como
intermediária, essas cepas não respondem clinicamente ao tratamento com vancomicina e
teicoplanina.
21
INTRODUÇÃO
Figura 05 - Mecanismo de ação dos glicopeptídeos na parede celular bacteriana (acima) e
mecanismo de resistência de S. aureus aos glicopeptídeos (abaixo). Adaptado de Sieradzki
e colaboradores (1997).
Diferentemente dos isolados VISA, a resistência à vancomicina em VRSA não está
relacionada a alterações na parede bacteriana. Esses isolados apresentam resistência completa
à vancomicina, decorrente da substituição do peptídeo final do terminal D-alanil-D-alanina, que
passa a D-alanil-D-lactato. Esse novo peptídeo possui reduzida afinidade pela vancomicina, sem
prejuízo da síntese da parede bacteriana. O mecanismo aparente desse fenótipo de resistência
está relacionado à aquisição por conjugação, pelo S. aureus, de plasmídio carreador do gene
vanA, proveniente do E. faecalis (Chang et al., 2003; Weigel et al., 2003).
1.3.3.1 - Implicação Clínica da Resistência aos Glicopeptídeos
Vários estudos epidemiológicos foram realizados a fim de esclarecer se a elevação das
CIMs para vancomicina se relacionavam a um pior desfecho clínico. A maioria desses estudos é
22
INTRODUÇÃO
retrospectivo e conduzido em centros únicos, focando principalmente as infecções de corrente
sanguínea (ICS) por isolados de ORSA. Os casos de falha terapêutica foram relatados quando a
vancomicina foi utilizada para tratamento de infecções por ORSA, cujas amostras eram sensíveis
a esse agente, porém com CIMs mais elevadas (1,0 a 2,0 µg/mL) (Moise-Broder et al., 2004a;
Sakoulas et al., 2004; Hidayat et al., 2006, Soriano et al., 2008; Lodise et al., 2008a; van Hal et
al., 2012). Inúmeras séries de casos demonstraram que a CIM de vancomicina elavada estaria
relacionada a um desfecho clínico desfavorável e modificações nos pontos de corte foram
sugeridas (Price et al., 2009).
Diante, dessas evidências, os pontos de corte de sensibilidade para vancomicina foram
recentemente redefinidos, sendo consideradas como sensíveis, aquelas amostras com CIM ≤
2,0 µg/mL e, resistentes, aquelas amostras com CIM ≥ 16 µg/mL (CLSI, 2009). Embora VISA ou
VRSA já tenham sido identificados, esses casos são raramente descritos em isolados clínicos de
ORSA, principalmente em hospitais brasileiros (Tenover et al., 2001; Andrade-Baiocchi et al.,
2003).
1.3.3.2 - Evolução Temporal das CIMs de Vancomicina
A elevação temporal das CIMs de determinado antimicrobiano em uma população
selvagem bacteriana é denominada creep. O inverso, ou seja, a diminuição dessas CIMs ao
longo do tempo, é denominado reverse creep. Essa elevação ou diminuição das CIMs pode
ocorrer sem, necessariamente, haver mudança da categoria de sensibilidade à vancomicina, ou
seja, essas amostras podem não passar a ser resistentes à vancomicina. Portanto, não há uma
associação direta entre a elevação das CIMs à vancomicina na população sensível e o
surgimento de amostras VISA ou VRSA (Sader et al., 2009).
Wang e colaboradores (2006) observaram, nos EUA, um aumento estatisticamente
significativo da proporção de isolados de S. aureus com CIMs ≥ 1 µg/mL para vancomicina, no
23
INTRODUÇÃO
ano de 2004, em comparação ao período de 2000-2003. Mais de 6.000 amostras foram testadas,
utilizando a metodologia de microdiluição em caldo para predizer a sensibilidade à vancomicina.
Steinkraus e colaboradores (2007) reportaram, também nos EUA, aumento nos valores das
CIMs para vancomicina entre ORSA de um hospital terciário nos anos de 2001 a 2005. Esse
aumento deveu-se principalmente à maior frequência de isolados bacterianos com CIMs ≥ 1
µg/mL nos últimos anos do estudo. Esses autores utilizaram a metodologia de Etest® para
predizer a sensibilidade à vancomicina. Porém, em estudo envolvendo nove centros médicos dos
EUA, Sader e colaboradores (2008) encontraram resultados distintos a esses. Foi avaliada a
sensibilidade à vancomicina de 1.800 amostras de ORSA de ICS, coletadas de 2002 a 2006, por
meio da metodologia de microdiluição. A presença de creep pôde ser detectada em apenas três
centros. Esses autores relatam que a presença de creep na verdade era uma “falsa percepção”,
já que essa era consequente à disseminação de clones específicos de ORSA com CIM para
vancomicina > 1 µg/mL, como, o USA100, ou Nova Iorque/Japão (NY/J). Da mesma forma,
utilizando a metodologia de Etest® em 287 isolados de ORSA em duas cidades da Alemanha,
Kehrmann e colaboradores (2011) observaram um aumento na média geométrica da CIM para
vancomicina apenas em uma das cidades estudadas.
O programa SENTRY analisou as variações de CIMs para vancomicina e teicoplanina,
pela técnica de microdiluição em caldo, de uma coleção de mais de 41.000 isolados clínicos de
Staphylococcous spp., em um período de seis anos, entre 1998 e 2003 (Jones et al., 2006). A
distribuição de CIM para os dois glicopeptídeos se manteve estável entre S. aureus, indicando
ausência de creep nessa população bacteriana. Na América Latina, dados do programa
SENTRY mostraram a ocorrência de um reverse creep, com aumento do número de isolados de
S. aureus com CIMs ≤ 0,5 µg/mL para vancomicina, entre dois períodos avaliados, 1999-2002 e
2003-2006. A metodologia de microdiluição em caldo foi empregada na avaliação da
sensibilidade à vancomicina nos dois períodos do estudo (Alós et al., 2008; Picão et al., 2008).
24
INTRODUÇÃO
Entretanto, esse estudo não estratificou a amostragem por país e não realizou testes
moleculares nos isolados clínicos de ORSA para confirmação da presença do gene mecA ou do
tipo do SCCmec. Além disso, também não foi realizada a tipagem molecular dessas cepas.
Em um estudo realizado na Espanha não houve detecção do creep para vancomicina
por microdiluição em caldo entre mais de 3.000 amostras clínicas de S. aureus sensíveis e
resistentes à oxacilina, isoladas em um período de cinco anos (2002-2006). Os autores atribuem
os achados desse estudo ao baixo consumo de vancomicina na instituição. Achados
contraditórios foram observados, dependendo da metodologia utilizada para se determinar a
CIM. Mason e colaboradores (2009), assim como Pitz e colaboradores (2011), observaram a
presença de creep para vancomicina, quando a técnica de Etest® foi empregada, mas, na
mesma coleção de S. aureus, essa tendência não foi observada quando utilizada outras
metodologias, como microdiluição em caldo (Mason et al., 2009), e os métodos automatizados,
sensitire e microscan (Pitz et al., 2011). Dessa forma, as tendências nas variações de CIMs à
vancomicina em S. aureus podem ser causadas pela utilização de diferentes metodologias para
determinação da CIM. A Tabela 2 descreve os estudos que avaliaram as tendências da CIM de
vancomicina no decorrer dos anos.
Tabela 02 - Estudos avaliando a evolução temporal da CIM de vancomicina.
Estudo
Desenho do Estudo
Período
Métodologia
Achados
Wang et al.,
2006
N= 6.003
Único centro, EUA
ORSA e OSSA
2000-2004
BMD
Vanco CIM = 1 µg/mL (19,9% em 2001
para 70,4% em 2004; p < 0,01)
Steinkraus et
al., 2007
N= 662
Único centro, EUA
ORSA, ICS
Sader et al.,
2008
Jones et al.,
2006
Picão et al.,
N= 1.800
9 centros, EUA
ORSA, ICS
Multicêntrico
ORSA
América Latina
CIM = 0.5 µg/mL (46% em 2001 para 5%
em 2005)
Vanco CIM = 1 µg/mL (16% em 2001
para 69% em 2005; p < 0,01)
3 centros apresentaram aumento na
média geométrica da CIM de vanco e 3
centros diminuição.
2001-2005
Etest®
2002-2006
BMD
1998-2003
BMD
Não observou alteração significativa
1999-2006
BMD
Aumento no número de isolados com CIM
25
INTRODUÇÃO
2008
≤ 0,5 µg/mL
Alós et al.,
2008
N= 3000
M
ORSA e OSSA
Espanha
Mason et al.,
2009
N=165
ORSA e OSSA
Unidade pediátrica
Ho et al., 2010
N=247, ORSA, ICS
Multicêntrico
China
2002-2006
BMD
Não observou alteração significativa
2001-2008
BMD e Etes®t
BMD - não houve alteração significativa
Etest® - aumento de isolados com CIM de
1 para 1,5 µg/mL (inicio em 2004, p <
0,001) e de 1,5 para 2 µg/mL (p = 0,04)
Período 1:
1997-99
Período 2: 2004
Período 3:
2006-08
Etest®
Vanco CIM = 1 µg/mL (10,4% no P1,
21,6% no P2 e 38,3% no P3, ; p < 0,001)
Pitz et al., 2011
N= 167, ORSA, ICS
Único centro, EUA
2000-2008
Sensititre
Microscan
Etest®
Sensititre e Microscan não mostraram
alteração.
Etest mostrou aumento não linear na
moda da CIM de vancomicina (p < 0,01)
Kehrmann et
al., 2011
N= 287 ORSA, ICS
Multicêntrico, 2 cidades
Alemanha
2004-2009
Etest®
Cidade A: aumento da média geométrica
da CIM de vancomicina (p < 0,05)
Cidade B: alteração não signficativa
No isolamento: Etest mostrou um
aumento na CIM de vanco (p = 0,012),
mas não após estocagem por nenhum
método empregado.
Edwards et al.,
2012
N=208, ORSA, ICS
Único centro, Reino Unido
2006-2010
-No isolamento:
Etest®
-Após
estocagem: Vitek
2, BMD e Etest
Yeh et al.,
2012
N= 140
Único centro, Taiwan
2001
2005
2009
Etest®
Aumento da média geométrica da CIM de
vancomicina entre 2001 - 2009 (p < 0,01)
e entre 2005 -2009 (p < 0,001).
Reynolds et al.,
2012
N= 271 ORSA, ICS
Multicêntrico
Reino Unido e Irlanda
2001-2007
BSAC diluição
em ágar
Discreta diminuição (0,027 diluições por
ano; p=0,006)
BMD - microdiluição em caldo, BSAC - British Society for Antimicrobial Chemotherapy.
Os únicos estudos na literatura que avaliaram a evolução das CIMs para teicoplanina em
isolados de S. aureus não observaram modificações significatvas (Jones et al., 2006, Reynolds
et al., 2012; Tascini et al.,2012). Apenas Ahlstrand e colaboradores (2011) observaram um
aumento no número de cepas com o fenótipo de heterorresistência aos glicopeptídeos entre
isolados de S. epidermidis e S. haemolythicus (Tabela 03). Nota-se que nenhum dos estudos
verificou se existia variações das CIMs para glicopeptídeos entre isolados do CEB, o clone
hospitalar mais prevalente no território brasileiro. Portanto, não se sabe se o fenômeno de creep
pode ocorrer nesse clone específico. Há dúvidas também se os dados de creep para
26
INTRODUÇÃO
vancomicina podem ser extrapolados para outros glicopeptídeos em uso no Brasil, como a
teicoplanina.
Tabela 03 - Estudos avaliando a evolução temporal da CIM de teicoplanina.
Referência
Desenho
Período
Achados
Reynolds et al., 2012
271 isolados de
MRSA
2001-2007
Diluição em ágar BSAC
Não observou tendência
Tascini et al., 2012
91 isolados de S.
aureus
2007-2010
Etest
1980-2009
Etest
Não observou tendência nas CIMs
para teicoplanina, porém aumento
no número de isolados hGISA
1998-2003
BMD
Ahlstrand et al., 2011
Jones et al., 2006
SCoN
> 35.000 isolados
de MRSA
Multicêntrico
BMD - microdiluição em caldo, BSAC - British Society for Antimicrobial Chemotherapy.
1.4 - Disseminação de Clones ORSA
Cinco linhagens principais de ORSA foram descritas inicialmente, denominadas de
“clones epidêmicos”, pela habilidade de se disseminar através de distintas regiões geográficas. A
classificação desses clones reflete a região na qual eles foram inicialmente identificados, ou
indicam alguma propriedade epidemiológica característica de determinada linhagem. Esses
clones foram classificados como ibérico, CEB, húngaro, NY/J e pediátrico epidêmico (Oliveira et
al., 2002). Além dos clones internacionais epidêmicos, outras linhagens genotípicas tem sido
descritas localmente (Nimmo et al., 2000; Aires de Sousa et al., 2000). Nos EUA, de acordo com
CDC, esses clones receberam denominações específicas: USA100 (clone NY/J), USA200 (EORSA-16), USA500 (clone ibérico) e USA800 (clone pediátrico) (McDougal et al., 2003). Nesse
estudo norte-americano, o CEB não foi reclassificado, devido à baixa prevalência do mesmo
entre as amostras isoladas localmente.
27
INTRODUÇÃO
Alguns desses clones internacionais possuem também características fenotípicas em
relação ao seu perfil de sensibilidade a antimicrobianos. Uma coleção de amostras dessas cinco
linhagens foi testada in vitro para diversos antimicrobianos não β-lactâmicos, tais como
clindamicina, eritromicina, espectinomicina, gentamicina, tetraciclina e sulfametoxazoltrimetoprima. À exceção do clone pediátrico, as demais linhagens apresentaram-se resistentes à
maioria dos agentes testados. Os clones ibérico, húngaro e NY/J foram sensíveis somente a
sulfametoxazol-trimetoprima, enquanto o clone brasileiro apresentou sensibilidade somente à
espectinomicina. O clone pediátrico, por sua vez, apresentou resistência somente à gentamicina,
e, em algumas amostras, à eritromicina (Oliveira et al., 2002).
O clone ibérico foi descrito inicialmente na Espanha, em 1989, sendo relacionado a um
surto epidêmico em um hospital em Barcelona (Dominguez et al., 1994). Atualmente, esse clone
está disseminado em vários países da Europa e nos EUA (Roberts et al., 1998; Sanches et al.,
1995; Sá-Leão et al., 1999). A partir de 1993, o clone ibérico foi sendo paulatinamente
substituído em vários hospitais da Espanha e de Portugal, por outras linhagens clonais, incluindo
representantes do CEB (Amorim et al., 2002) e clones ORSA, fenotipicamente menos resistentes
(Cuevas et al., 2007; Vindel et al., 2006). Além de encontrar-se amplamente disseminado em
hospitais da Hungria, o clone Húngaro foi recentemente identificado em Taiwan (Aires et al.,
2003).
O clone NY/J foi considerado o clone de ORSA predominante em hospitais da região
metropolitana de Nova Iorque e algumas regiões adjacentes, além de ter sido identificado
também em um hospital em Tókio no Japão (de Lencastre et al., 1996). Esse clone foi
documentado infectando pacientes no México e Hungria, substituindo novas linhagens locais ou
internacionais de ORSA previamente dominantes (Conceição et al., 2007; Velazquez-Meza et al.,
2004). Atualmente, esse clone multirresistente é considerado predominante nos casos de
infecções associadas à assistência à saúde nos EUA. A maioria das amostras de VISA e VRSA
28
INTRODUÇÃO
descritas até o momento nos EUA apresentam o mesmo perfil genotípico desse clone endêmico.
No Brasil, Cabloco e colaboradores (2012), recentemente, descreveram a presença do clone
NY/J (12% dos 99 ORSA estudados) em dois hospitais do Rio de Janeiro.
O CEB foi descrito inicialmente no Brasil em 1993, na cidade de São Paulo (Sader et al.,
1993; Sader et al., 1994) e, posteriormente, por Teixeira e colaboradores (1995) em outros
estados brasileiros. Esse clone encontra-se amplamente disseminado por várias regiões do
mundo, incluindo países da América Latina (Argentina, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai) e
Europa (República Tcheca e Portugal) (Aires de Souza et al., 2001; Gomes et al., 2001). No
Brasil, esse clone de ORSA pôde ser identificado em diferentes hospitais da região norte até o
sul do país, frequentemente associado a surtos epidêmicos (Santos et al., 1996; Oliveira et al.,
2001b). Na década de 90, o mesmo representava 77% de todas as amostras ORSA isoladas de
vários sítios de infecção, coletadas em São Paulo, Rio de Janeiro, Niterói, Porto Alegre e
Manaus (Sader et al., 1994; Teixeira et al., 1995). É possível observar que ao longo dos anos, foi
relatado um aumento progressivo de isolados pertencentes ao CEB, a saber: Oliveira e
colaboradores (2001b) relataram 80,3% em amostras de ORSA coletadas entre 1995 e 1997,
provenientes de 19 cidades no país. Enquanto que, estudo realizado por Aires de Souza e
colaboradores (2001) evidenciaram taxas ainda maiores, cerca de 97% do CEB em amostas
isoladas de seis hospitais de São Paulo e em um hospital do Rio de Janeiro. Essa
predominância do CEB, no Brasil, foi corroborada por relatos adicionais, com alta frequência do
mesmo em vários hospitais brasileiros (Oliveira et al., 2001b; Aires de Sousa et al., 2001; Vivoni
et al., 2006).
No hospital São Paulo, pertencente à UNIFESP, durante os períodos de 1991 a 1992 e
de 1995 a 1996, foi observado que 86% dos isolados de ORSA coletados de hemoculturas de
pacientes hospitalizados pertenciam ao CEB (Conterno, 1999). Taxa semelhante (87%) foi
verificada por um em estudo realizado com isolados de ORSA no período de janeiro 2002 a
29
INTRODUÇÃO
dezembro de 2005 nessa mesma instituição (Inoue et al., 2008). Entretanto, a partir de 2007,
Paschoal (2010), reportou que somente 47% das amostras de ORSA isoladas de ICS nessa
instituição pertenciam ao clone epidêmico brasileiro. Esse resultado demonstrou uma possível
mudança no perfil epidemiológico de ORSA incluindo a introdução de novos tipos de clones
como o pediátrico e o NY/J e, consequentemente, a redução do CEB.
Em hospitais de diversas localidades do mundo, isolados de ORSA relacionados ao CEB
tornaram-se predominantes entre os isolados de ORSA, como na Argentina, Espanha e
Republica Tcheca, ou ainda permanecem na quase totalidade dos isolados nosocomiais, como
na República da Georgia (pertencente à antiga URSS). Modificações na epidemiologia dos
clones de ORSA são descritos em todo mundo, na República Tcheca o CEB foi, recentemente,
substituído por outro clone local, também multirresistente (Melter et al., 2003). Em Portugal, a
frequência desse clone entre isolados clínicos de ORSA, em pacientes hospitalizados, declinou
de 69% do período de 1996 a 2000 para apenas 12% no período de 2003 a 2005 (Amorim et al.,
2007). Na Argentina, a substituição do CEB pelo clone Cordoba/Chile iniciou-se em 1999, e esse
tornou-se predominante em 2001. O mesmo ocorreu na Espanha, onde o predomínio dos clones
CEB e NY/J foi gradativamente substituído pelo E-ORSA-16 (SCCmec II) (Sola, et al., 2006;
Potel et al., 2007).
Após seu isolamento em uma instituição pediátrica, em 1992, em Portugal, por isso
denominado clone pediátrico epidêmico, já foi reportado em quase todos os países do mundo
(Roberts et al., 1998; Sá-Leão et al., 1999; Gomes et al., 2001; DeLeo et al., 2010).
Surpreendentemente, o padrão de resistência de quase metade das amostras de ORSA de um
dos hospitais pediátricos portugueses era limitado aos β-lactâmicos, sendo a maioria das
amostras sensíveis aos antimicrobianos de outras classes, como, clindamicina, ciprofloxacina,
eritromicina, tetraciclina, e sulfametoxazol-trimetoprima. Verificou-se que várias amostras
isoladas na Argentina (1994-1998), Colômbia (1996), Nova Iorque (1988-1991) e Polônia (1990-
30
INTRODUÇÃO
1996), quando comparadas aos perfis moleculares armazenados em um banco de dados
internacional, possuíam genótipos idênticos entre si e às amostras do clone pediátrico (Oliveira
et al., 2002; Sá-Leão et al., 1999). Os representantes clonais dessas quatro regiões foram
recuperados, predominantemente, de crianças, assim como descrito em Portugal.
No Brasil, a presença de ORSA SCCmec IV de origem hospitalar foi notada quando um
aumento na proporção de isolados de ORSA, que apresentavam sensibilidade aos
antimicrobianos não-β-lactâmicos, foi observado a partir de 2004 (de Trindade et al., 2005; de
Miranda et al., 2007). Esse perfil de sensibilidade também foi descrito em isolados relacionados
ao clone pediátrico colonizando indivíduos nas cidades do Rio de Janeiro (Melo et al., 2004) e
Recife (de Miranda et al., 2007).
Entretanto, isolados clínicos classificados como CA-ORSA foram detectados em
pacientes provenientes da comunidade, muitos dos quais não exibiam histórico de hospitalização
recente. Esses isolados foram recuperados de diversos sítios de infecção ou colonização,
frequentemente associados a surtos esporádicos em populações específicas, tais como,
crianças, pacientes imunossuprimidos, indivíduos encarcerados e participantes de esportes
coletivos (Kluytmans-Vandenbergh et al., 2006). CA-ORSA tornou-se, nos últimos anos, de
grande importância por conter o gene de virulência que codifica a leucocidina Panton-Valentine
(PVL), capaz de provocar choque séptico e necrose na pele, tecido celular subcutâneo e
pulmonar (Boyle-Vavra & Daum, 2007; Carvalho et al., 2010).
Alguns dos primeiros casos de infecções por CA-ORSA ocorreram em populações
indígenas na Austrália Ocidental na década de 1990 (Udo et al., 1993; O’Brien et al., 2005).
Essas cepas foram distinguíveis de clones contemporâneos (isto é, os genótipos) que circulam
em hospitais australianos por seus padrões de PFGE e sensibilidade à maioria dos
antimicrobianos β-lactâmicos, sugerindo que elas eram descendentes de linhagens hospitalares
ou cepas comunitárias que tinham adquirido o mecA por transferência horizontal de genes. Nos
31
INTRODUÇÃO
EUA, os primeiros casos bem documentados de infecção de ORSA que eram verdadeiramente
associados à comunidade ocorreram em crianças saudáveis entre 1997 e 1999, descritos pelo
CDC. Essas crianças, não tinham fatores de risco para ORSA e todas tiveram infecção
fulminante rapidamente, sugerindo que essas cepas CA-ORSA eram especialmente virulentas.
Amostras de CA-MRSA são frequentemente sensíveis a vários antimicrobianos não βlactâmicos. Essa observação é consistente com a ausência de outros genes de resistência, à
exceção do mecA, no complexo genômico SCCmec de representantes dos tipos IV e V. Por
outro lado, algumas linhagens de CA-ORSA podem apresentar resistência a alguns compostos
não β-lactâmicos, pela presença de determinantes de resistência inseridos fora do SCCmec IV e
V (Yamamoto et al., 2010; Mediavilla et al., 2012).
Surtos e epidemias de CA-ORSA, atualmente, ocorrem em todo o mundo e com uma
epidemiologia semelhante. Embora surgiram clones específicos, eles variam de acordo com a
localização geográfica. Os genótipos de isolados de CA-ORSA indicam que não estão
intimamente relacionados com clones hospitalares e essas cepas comunitárias são sensíveis a
numerosos antibióticos para as quais as cepas hospitalares são rotineiramente resistentes. No
Brasil, os primeiros relatos de infecções por CA-ORSA ocorreram no Rio Grande do Sul entre os
anos 2002 e 2003 (Ribeiro et al., 2005). Os isolados foram caracterizados como carreadores do
SCCmec IV e produtores de PVL e enterotoxina, além de relacionarem-se com o clone
Oceania/Pacífico Sudoeste (OSPC). Outros relatos se seguiram, todos relacionados à infecções
graves associadas, inicialmente, à infecção de pele e partes moles (Fortes et al., 2008;
Rozenbaum et al., 2009; Gelatti et al., 2009; Razera et al., 2009). Reinert e colaboradores (2008)
relatou três isolados de ORSA SCCmec IVc, produtores de PVL, isolados entre 1995 e 1999,
sugerindo a presença do SCCmec IV, no Brasil, há mais de uma década.
32
OBJETIVOS
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo Principal
Determinar a variação das CIMs de vancomicina e teicoplanina durante um período de
oito anos em isolados clínicos de S. aureus resistentes à oxacilina provenientes de ICS
de pacientes do Hospital São Paulo.
2.2 - Objetivos Secundários
Comparar as técnicas de microdiluição em caldo e Etest® na determinação das CIMs
para os glicopeptídeos entre os isolados ORSA;
Avaliar a dinâmica temporal dos clones epidêmicos de ORSA e o complexo SCCmec
presente nesses isolados;
Correlacionar a variação da CIM para vancomicina e teicoplanina em isolados ORSA de
acordo com os respectivos clones encontrados;
33
MATERIAL E MÉTODOS
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Amostras Bacterianas
O cálculo de amostragem para este projeto levou em consideração o estudo realizado
por Steinkraus e colaboradores (2007). Esses autores detectaram creep para vancomicina
obtendo um aumento na média geométrica das CIMs de 0,32 µg/mL em cinco anos de estudo:
de 0,62 µg/mL (2001) para 0,94 µg/mL (2005). Com isso, através do cálculo de diferenças entre
as médias, o número de isolados de ORSA necessários para se detectar diferenças em oito anos
de estudo seriam de 200 amostras no total, ou seja, aproximadamente 25 por ano. Os isolados
clínicos de ORSA foram selecionados de maneira que o número de amostras fosse dividido
igualmente entre os dois períodos: Período 1 (P1) de 2002 a 2005 e Período 2 (P2) de 2006 a
2009.
Os isolados clínicos de ORSA, inicialmente identificados pelo sistema Phoenix® (BD
diagnostics), foram selecionados aleatoriamente entre janeiro de 2002 a dezembro de 2009, de
pacientes com diagnóstico de ICS hospitalizados no Hospital São Paulo (hospital universitário,
público e terciário com mais de 600 leitos), pertencente ao complexo UNIFESP. Apenas um
isolado por paciente foi considerado para o estudo. As amostras foram obtidas do banco de
microrganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, da Universidade
Federal de São Paulo - UNIFESP, onde se encontravam armazenadas.
3.2 - Confirmação da Identificação Bacteriana
A confirmação da identificação dos isolados de ORSA, selecionados para o presente
estudo, foi realizada pela técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase) para a detecção do
gene nuc, específico da espécie S. aureus. Os primers foram desenhados utilizando-se o
software Primer3 (nuc - R1: 5` GCCACGTCCATATTTATCAG 3`) e (nuc - F1: 5`
34
MATERIAL E MÉTODOS
TATGGTCCTGAAGCAAGTG 3`), a partir da cepa ORSA 252 (sequência de DNA obtida pelo
número de acesso GenBank NC_002952) e, posteriormente, encaminhados para síntese (IDT Integrated DNA Tecnologies Inc., Coralville, EUA).
3.3 - PCR-multiplex para a Detecção do Gene mecA e Tipagem do SCCmec
A tipagem do SCCmec e detecção do gene mecA foi realizada utilizando a metodologia
de PCR-multiplex, conforme o protocolo desenvolvido por Zhang e colaboradores (2005). O
protocolo detecta o gene mecA e os SCCmec tipos I a V, incluindo os quatro subtipos de
SCCmec tipo IV (IVa, IVb, IVc, e IVd), utilizando apenas 9 loci, selecionados com base em
sequências do SCCmec descritas previamente e disponíveis no banco de dados GenBank (NCBI
- National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index) (Ito
et al., 1999; Ito et al., 2001). As respectivas regiões alvo, cepas e números de acesso do
GenBank no qual esse protocolo foi delineado estão na Tabela 04.
Tabela 04 - Regiões alvo, cepas controles e número de acesso GenBank para
determinação do SCCmec.
SCCmec
Região
Cepa
Número de acesso
GenBank
Tipo I
ORF E008
NCTC 10442
AB033763
Tipo II
kdpE
N315
D86934
Tipo III
ORF CZ049
85/2082
AB37671
Tipo IVa
ORF CQ002
CA05
AB063172
Tipo IVb
ORF CM001
8/6-3P
AB063173
Tipo IVc
ORF CR002
MR108
AB096217
Tipo IVd
ORF CG001
JCSC4469
AB0967677
Tipo V
ORF V011
JCSC3624
AB12121
35
MATERIAL E MÉTODOS
Para a detecção do gene mecA, foi utilizada a cepa NCTC8325 (número de acesso
GenBank X52593). As sequências dos primers utilizados nas reações de PCR-multiplex para a
determinação dos tipos de SCCmec estão descritos na Tabela 05.
Tabela 05 - Sequência dos primers utilizados na PCR multiplex para determinação dos tipos de
SCCmec, segundo Zhang e colaboradores (2005).
Primer
Sequência de oligonucleotídeos
Tamanho
(5´- 3´)
amplicon (pb)
Tipo I–F
GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG
Tipo I–R
GTTCTCTCATAGTATGACGTCC
Tipo II–F
CGTTGAAGATGATGAAGCG
Tipo II–R
CGAAATCAATGGTTAATGGACC
Tipo III–F
CCATATTGTGTACGATGCG
Tipo III–R
CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG
Tipo IVa–F
GCCTTATTCGAAGAAACCG
Tipo IVa–R
CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG
Tipo IVb–F
TCTGGAATTACTTCAGCTGC
Tipo IVb–R
AAACAATATTGCTCTCCCTC
Tipo IVc-F
ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC
Tipo IVc–R
TTGGTATGAGGTATTGCTGG
Tipo IVd–F
CTCAAAATACGGACCCCAATACA
Tipo IVd–R
TGCTCCAGTAATTGCTAAAG
Tipo V-F
GAACATTGTTACTTAAATGAGCG
Tipo V–R
TGAAAGTTGTACCCTTGACACC
mecA147-F
GTGAAGATATACCAAGTGATT
mecA147-R
ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT
Especificidade
613
SCCmec I
398
SCCmec II
280
SCCmec III
776
SCCmec IVa
493
SCCmec IVb
200
SCCmec Ivc
881
SCCmec Ivd
325
SCCmec V
147
mec A
3.3.1 - Extração do DNA genômico
Para a extração do DNA genômico foi utilizado a metodologia de extração por fervura,
segundo Zhang e colaboradores (2005). Para isso, de uma a cinco colônias bacterianas,
36
MATERIAL E MÉTODOS
cultivadas em placa de ágar Columbia (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) acrescido de 5% de
sangue de carneiro, foram suspensas em 50 µL de água destilada estéril contido em tubo
eppendorf. Os tubos foram aquecidos a 99ºC em banho-maria, durante 10 minutos. Após essa
etapa, os tubos foram submetidos à centrifugação durante 3 minutos a 13.000 rpm. Uma alíquota
de 40 µL do sobrenadante foi estocado em freezer e utilizado posteriormente 2 µL dessa para a
reação de PCR (volume final de 25 µL).
3.3.2 - Reação de Amplificação
A reação de amplificação foi realizada nas seguintes condições: 12,5 µL de mastermix
para multiplex (Qiagen, Valencia, CA, EUA), um total de 7,7 µL de primers, 2,8 µL de água
estéril deionizada e 2 µL do sobrenadante da extração de DNA. A reação de amplificação foi
realizada no termociclador MasterCycler gradient (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), utilizando
o seguinte programa: 5 min a 94ºC, seguido por 10 ciclos de 45s a 94ºC, 45s a 65ºC e 1,5 min a
72ºC e outros 25 ciclos de 45s a 94ºC, 45s a 55ºC e 1,5 min a 72ºC. O programa termina com
uma extensão adicional de 10 min a 72ºC. Os tubos foram mantidos a 20ºC até o momento da
eletroforese (Zhang et al., 2005).
3.3.3 - Eletroforese
Após a reação de amplificação, foi acrescido 4 µL de loading buffer em cada tubo e os
produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% (contendo brometo
de etídio) em tampão TBE 0,5X por 40 min a 120V. Como padrão de peso molecular foi utilizado
um marcador de 100 bp (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). Os fragmentos de DNA foram
visualizados e fotografados sob transiluminação ultravioleta. Como controles positivos para os
diferentes tipos de SCCmec foram utilizadas as seguintes cepas de ORSA: NCTC 10422
(SCCmec I), N315 (SCCmec II), 85/2082 (SCCmec III), JCSC 1968/CA05 (SCCmec IVa),
37
MATERIAL E MÉTODOS
JCSC1978/8/6-3P (SCCmec IVb), MR 108 (SCCmec IVc), JCSC 4469 (SCCmec IVd) e JCSC
3624/WIS [WBG8318] (SCCmec V) (Ito et al., 2001; Ito et al., 2004; Ma et al., 2002; Okuma et
al., 2002). As cepas controle foram gentilmente cedidas pelo Prof. Keiichi Hiramatsu e Profª
Teruyo Ito, do Departamento de Bacteriologia, Universidade de Juntendo - Tóquio, Japão, e Prof.
Robert S. Daum, Universidade de Chicago, Departamento de Pediatria, Chicago, Illinois. Como
controle negativo, utilizou-se água destilada deionizada estéril.
3.4 - Análise do DNA Cromossômico por Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE
A análise do DNA cromossômico dos isolados de ORSA foi realizada, segundo protocolo
estabelecido pelo CDC, por McDougal e colaboradores (2003), para tipagem molecular de S.
aureus, utilizando a técnica de PFGE, no qual o cromossomo bacteriano foi digerido com a
enzima de restrição SmaI. Uma colônia do isolado teste foi inoculada em 5 mL de caldo BHI
(Brain Heart Infusion) e incubada a 35-37ºC por 24 horas. As concentrações das suspensões
celulares foram ajustadas com solução salina até atingir uma leitura de turbidez de 1,1 a 1,3. Um
volume de 200 µL da suspensão de células ajustadas foi transferido para um tubo de
microcentrífuga de peso conhecido, centrifugado a 12.000 X g por aproximadamente 2 a 4 min e
o sobrenadante aspirado. Os tubos foram novamente pesados com a finalidade de se determinar
o peso do centrifugado (células). Dez microlitros da suspensão bacteriana foi transferida para um
novo tubo, ao qual foi adicionado 300 µL de tampão EC (Tris 6 mM, ph 7,5; NaCL 1M; EDTA
0,01M; Brij-58 0,5%; Sarcosil 0,5% e Deoxicolato de sódio 0,2%), 15 µL de lisostafina e,
posteriormente, 340 µL de agarose 2% (UltrapureTM Low Melting Point Agarose, Invitrogen) para
a formação dos blocos de gel. Esses blocos de gel foram incubados por um período mínimo de
quatro horas em solução EC a 37ºC. A seguir, os blocos de gel foram lavados várias vezes em
solução tampão Tris-EDTA e armazenados nessa solução a 4ºC, até serem submetidos à
digestão enzimática e posterior eletroforese.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Os blocos de agarose foram cortados em três partes iguais e armazenados em tampão
de restrição 1x por 30 min. O tampão de restrição das amostras foi removido e o DNA das
amostras foi digerido com 3 µL da enzima SmaI (Promega R6125, 10U/µL) em 200 µL do
tampão de restrição 1x, com incubação a 25ºC por duas a três horas. A eletroforese foi realizada
em gel de agarose a 1% no sistema CHEF-DRII (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Os
fragmentos de restrição resultantes foram colocados no aparelho de eletroforese com corrente
alternando de 5 a 40 segundos a 6 V/cm e temperatura de 14ºC durante 21 horas em gel de
agarose a 1%. Os géis foram corados com brometo de etídio (1,5 µg/mL) por 1 hora, descorados
em água bidestilada por mais 45 min, e fotografados sob luz ultravioleta com filme FUJI FTI-500
e capturados com o programa LISCAP Image Capture Software com o aparelho ImageMaster®
(Amersham Pharmacia Biotech AB, CA, EUA). As fotos foram digitalizadas e salvas como
arquivo TIF para análise posterior. Como padrão de peso molecular, foi utilizado o Lambda DNA
Ladder (New England Biolabs, EUA) na primeira e última coluna de cada gel. Além do peso
molecular, foi incluída a cepa de referência S. aureus NCTC 8325, posicionada entre as
amostras clínicas, em todos os géis de PFGE. A amostra NCTC 8325 foi gentilmente cedida pela
Prof. Hermínia de Lencastre, Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Oeiras, Portugal
(número de acesso GenBank CP000253).
Amostras de ORSA representantes de clones mundiais ou locais foram também
incluídas nos experimentos: NCTC 10422 (SCCmec I), A1721/HU25 (CEB, SCCmec III), BK2464
(NY/J, SCCmec II), HDE288 (Clone Pediátrico/USA800, SCCmec IVa). Todos os controles foram
gentilmente cedidos pelo Profº. Keiichi Hiramatsu e Profª. Teruyo Ito, do Departamento de
Bacteriologia, Universidade de Juntendo - Tóquio, Japão; Profº. Robert S. Daum, Universidade
de Chicago, Departamento de Pediatria, Chicago, Illinois; Profª. Hermínia de Lencastre, Instituto
de Tecnologia Química e Biológica, Oeiras, Portuga; Profª. Agnes Figueiredo, Instituto de
39
MATERIAL E MÉTODOS
Microbiologia Profº. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil. A Tabela 06 sumariza todas as cepas controle utilizadas no presente estudo.
Tabela 06 - Cepas controles de S. aureus utilizadas nas reações de PCR para a tipagem do
SCCmec.
Número da Amostra
Clone
SCCmec
NCTC8325
-
-
NCTC10442
-
SCCmec I
N315
-
SCCmec II
NCTC85/2082
-
SCCmec III
JCSC1968
-
SCCmec IVa
JCSC1978
-
SCCmec IVb
MR108
-
SCCmec IVc
JCSC4469
-
SCCmec IVd
WIS
WBG8318
SCCmec V
A1721
Clone Epidêmico Brasileiro
SCCmec III
BK2464
New York - Japan - USA 100
SCCmec II
HU25
Clone Epidêmico Brasileiro
SCCmec III
HDE 288
Clone Pediátrico - USA800
SCCmec VI
Os géis foram analisados pelo programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths,
Kortrijk, Belgium) como imagens preto e branco invertidas de 8 bits. Para cada imagem foi
realizada a análise espectral para determinar o tamanho do disco a ser utilizado na extração do
plano de fundo da imagem, pela técnica de rolamento de disco. As cepas de referência S. aureus
NCTC 8325 de cada gel foram normatizadas entre si. Após digestão com a enzima SmaI, essa
cepa produz 13 bandas visivelmente definidas, distribuídas entre 674 kb e 36 kb. A cepa NCTC
8325 é considerada padrão internacional de referência para normalização dos fragmentos
cromossomais de amostras de S. aureus submetidas ao PFGE. O processo de normalização é
40
MATERIAL E MÉTODOS
etapa essencial e obrigatória para corrigir as distorções intra e inter-géis que podem ocorrer na
técnica de PFGE. Bandas de amostras clínicas situadas acima da maior banda da NCTC (674
kb) não foram incluídas para análise, pois essas bandas não foram normalizadas. Da mesma
maneira, bandas abaixo de 36 kb foram excluídas da análise pela menor resolução e
impossibilidade de normalização das mesmas (Murchan et al., 2003).
A definição de bandas foi realizada automaticamente em todas as imagens pelo
programa e depois conferida por comparação visual. O coeficiente de similaridade utilizado foi o
coeficiente de Dice baseado na presença e posição de bandas. O dendrograma foi construído
utilizando o algoritmo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method using
arithmetic averages). Esse algoritmo realiza as análises através de agrupamentos por médias
não ponderadas. Os valores de otimização e tolerância utilizados para o conjunto de isolados
foram de 0,8 e 1,8%, respectivamente. Um coeficiente de similaridade acima de 90% foi
selecionado para definir cada cluster de isolados (McDougal et al., 2003).
3.5 - Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos
3.5.1 - Microdiluição em Caldo
As CIMs de vancomicina e teicoplanina foram determinadas pela metodologia de
microdiluição em caldo, segundo as recomendações do Clinical and Laboratory Standard
Institute (CLSI, 2012a). Os sais de antimicrobiano foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO,
USA).
Uma solução mãe contendo 1.280 µg/mL de cada antimicrobiano foi preparada em água
ultrapura e diluída 1:10 em caldo Mueller-Hinton - MH (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) para
obtenção da concentração máxima de 128 µg/mL. A partir dessa solução, foram realizadas
diluições seriadas até a obtenção da concentração de 0,125 µg/mL. Para verificar a existência de
uma tendência no aumento das CIMs, diluições com intervalos menores foram utilizadas na
41
MATERIAL E MÉTODOS
microdiluição. Para isso, soluções mãe de 120 µg/mL, 100 µg/mL, 75 µg/mL, 65 µg/mL, 55
µg/mL e 45 µg/mL foram preparadas e diluídas conforme descrito acima até a obtenção de 36
diluições, que variaram entre 0,06 e 128 µg/mL e distribuídas em três placas. Dentre as diluições
de 0,25 e 2 µg/mL, foram empregados pequenos acréscimos, oito para cada passo de diluição
log2. As soluções mãe de cada antimicrobiano foram armazenadas em freezer a -70ºC para
utilização posterior, se necessária. Cem microlitros de cada diluição de antimicrobiano foi
dispensado nas placas de microdiluição, conforme Figuras 6A, 6B e 6C com auxílio de uma
pipeta multicanal. As placas foram armazenadas em freezer a -70ºC até sua utilização.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
B
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
C
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
D
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
E
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
F
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
G
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
H
0,06
0,094
0,125
0,188
0,25
0,281
0,313
0,344
0,375
0,406
0,438
0,469
Figura 6A - Concentrações de vancomicina na placa de microdiluição. Cada linha representa
uma amostra e cada coluna uma concentração do antibiótico de 0,06 a 0,469 µg/mL.
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
B
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
C
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
D
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
E
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
F
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
G
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
H
0,5
0,563
0,625
0,688
0,75
0,813
0,875
0,938
1
1,125
1,25
1,375
Figura 6B - Concentrações de vancomicina de 0,5 a 1,375 µg/mL na placa de microdiluição.
Cada linha representa uma amostra e cada coluna uma concentração do antimicrobiano.
42
MATERIAL E MÉTODOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
B
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
C
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
D
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
E
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
F
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
G
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
H
1,5
1,625
1,75
1,875
2
2,5
3
4
8
16
32
64
Figura 6C - Concentrações de vancomicina 1,5 a 64 µg/mL na placa de microdiluição. Cada
linha representa uma amostra e cada coluna uma concentração do antimicrobiano.
Após o crescimento em placas de ágar sangue por 18 horas, com auxílio de uma alça de
semeadura, 3 a 5 colônias isoladas de S. aureus foram transferidas para tubos contendo 5 mL
de caldo MH (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), para obtenção de uma concentração bacteriana
em torno de 1,5 x108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL correspondente a 0,5 da escala
de McFarland. Trinta e dois microlitros dessa solução foi diluída em 968 µL de caldo MH,
reduzindo a concentração celular para 5x106 UFC/mL. Novamente, 500 µL dessa solução foi
adicionado a 4,5 mL de caldo MH obtendo uma concentração final de 5x105 UFC/mL. Cem
microlitros do inóculo bacteriano foi dispensado na placa de microdiluição. Dessa forma, tanto o
inóculo bacteriano, quanto a concentração dos antimicrobianos foram diluídos pela metade. A
seguir, as placas foram incubadas entre 35ºC e 37ºC, em aerobiose por 24 horas. A CIM foi
definida como a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano.
Foram utilizadas, como controles de qualidade as cepas ATCC 29213 de S. aureus, ATCC
29212 de E. faecalis. As amostras foram classificadas como sensíveis, intermediárias ou
resistentes, seguindo os critérios de sensibilidade estabelecidos pelo CLSI para métodos
quantitativos (CLSI, 2012).
43
MATERIAL E MÉTODOS
3.5.2 - Etest®
A avaliação da sensibilidade à vancomicina e à teicoplanina também foi realizada pela
metodologia Etest®, de acordo com as instruções do fabricante (bioMérieux, Marcy l’Étóile,
França). Foi preparada uma suspensão bacteriana, com turbidez correspondente a 0,5 da escala
de McFarland, de cada amostra e semeada em uma placa de MH ágar (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra). Após um intervalo de 15 min, as fitas de Etest®, foram dispensadas na superfície do
ágar. As placas foram incubadas por 18 a 20 horas para teicoplanina e 24 horas para
vancomicina, em temperatura de 35ºC. Conforme instruções do fabricante, a CIM foi
determinada como sendo a concentração da intersecção entre a fita de Etest® e a zona elíptica
de inibição de crescimento bacteriano. As amostras foram classificadas como sensíveis,
intermediárias ou resistentes, seguindo os critérios de sensibilidade estabelecidos pelo CLSI
(CLSI, 2012) para métodos quantitativos. O controle de qualidade foi realizado com as cepas
ATCC 29213 de S. aureus e ATCC 29212 E. faecalis.
3.6 - Análise Estatística
A análise dos dados foi realizada utilizando o software IBM SPSS Statistics 17.0 (IBM
Corporation, New York, USA). A média da CIM e o intervalo da CIM, a CIM50 e CIM90 foram
calculados para cada antimicrobiano. A análise da tendência central das CIMs, de acordo com o
ano de estudo, foi realizada através da comparação entre as médias de múltiplos grupos usando
o teste T3 de Dunnet (One-Way Anova, Post Hoc Multiple Comparisons). Os dados foram
analisados considerando-se cada ano do estudo individualmente e, também, através da análise
por períodos, sendo denominado de Período 1 aquele compreendendo os 4 primeiros anos do
estudo (P1; 2002-2005) e Período 2 aquele compreendendo os 4 últimos anos do estudo (P2;
2006-2009). As variações temporais nas CIMs para vancomicina e teicoplanina foram analisadas
pela distribuição de acordo com o ano de isolamento, metodologia testada, tipo de SCCmec e
44
MATERIAL E MÉTODOS
padrão de genotipagem encontrados. As tendências foram estudadas através de testes de
correlação (Pearson x2), sendo a significância estatística considerada em associações com
valores de p ≤ 0,05.
45
RESULTADOS
4 - RESULTADOS
4.1 - Distribuição das Amostras de ORSA
A distribuição de isolados de ORSA selecionados para o estudo está descrita na Tabela
07. Pode-se observar que não houve variação no número de isolados ORSA entre os anos do
estudo.
Tabela 07 - Seleção de ORSA isolados de hemoculturas entre os anos 2002 e 2009.
Período 1
Ano
2002
N (%)
24 (12)
2003
Período 2
2004
26 (13) 25 (12,5)
2005
2006
2007
25 (12,5)
25 (12,5)
24 (12)
2008
2009
26 (13) 25 (12,5)
4.2 - Resultados da Caracterização Genética das Amostras
4.2.1 - Identificação da Espécie
Todas as amostras inicialmente identificadas pelo sistema Phoenix como S. aureus
tiveram sua identificação confirmada por meio da detecção do gene nuc por PCR, como
demonstrado na Figura 07.
46
RESULTADOS
Figura 07 - Gel de agarose mostrando a amplificação correspondende ao fragmento específico
do gene nuc (117 Kb) nos isolados clínicos de ORSA. PM - peso molecular; C - controle
negativo, S. epidermidis ATCC 14990; C + - controle positivo S. aureus ATCC 33591, colunas 1
a 9 - amostras de S. aureus. Coluna 1 - amostra A10283; Coluna 2 - amostra A10404; Coluna 3
- A10405; Coluna 4 - amostra A10497; Coluna 5 - amostra 10561; Coluna 6 - amostra A11103;
Coluna 7 - amostra A11241; Coluna 8 - amostra 11347; Coluna 9 - amostra A11520.
4.2.2 - Detecção e Caracterização do SCCmec
O gene mecA foi detectado por PCR em todas as amostras ORSA avaliadas neste
estudo (Figura 08). Os resultados da PCR multiplex para determinação do SCCmec, pela
metodologia de Zhang e colaboradores (2005), mostraram que a maioria das amostras carreava
o SCCmec III (58,5%), seguido do SCCmec II (17,5%), SCCmec I (13,5%) e SCCmec IV (9,5%).
Apenas 2 (1,0%) isolados carreavam o SCCmec V (Tabela 08).
47
RESULTADOS
Figura 08 - Gel de agarose com a amplificação dos fragmentos específicos do gene mecA e
caracterização do SCCmec pela técnica de Zhang e colaboradores (2005) nos isolados clínicos
de ORSA. Colunas 1, 10 e 21 - peso molecular (100 pb; Sigma Aldrich). Colunas 2-9 - controles
SCCmec I: cepa NCTC 10442, SCCmec II: cepa N315, SCCmec III: cepa 85/2082, SCCmec IVa:
cepa CA05, SCCmec IVb: cepa 8/6-3P, SCCmec IVc: cepa MR108, SCCmec IVd: cepa
JCSC4469 e SCCmec V: cepa JCSC3624, respectivamente. Coluna 11 - amostra A27942
SCCmec IVa; Colunas 12 e 19 - amostras A10404 e A10405 SCCmec III; Colunas 13-17 amostras A13596, A19992, A26675, A26933 e A27305 SCCmec II; Coluna 18 - amostra A15450
SCCmec I. Coluna 20 - controle negativo da reação, S. epidermidis (MSSE) ATCC 14990.
Tabela 08 - Caracterização dos cassetes cromossômicos SCCmec dos isolados de ORSA.
SCCmec
N
Frequência (%)
I
II
III
IV
V
Total
27
35
117
19
2
200
13,5
17,5
58,5
9,5
1,0
100,0
Analisando-se a caracterização do SCCmec dos isolados distribuídos anualmente,
observa-se que nos anos de 2002 e 2003, havia um total predomínio do SCCmec III. Porém, a
partir de 2004, a introdução de outros tipos de SCCmec foi documentada, excentuando-se os
48
RESULTADOS
SCCmec I, II e IV. Após essaa data, observa-se
observa uma progressão decrescente de isolados de S.
aureus carreadores do SCCmec
mec III, em decorrência do aumento dos isolados que carreavam os
SCCmec II e I, principalmente. Apesar de um aumento inicial durante os anos de 2004 e 2005, o
SCCmec IV declinou sua frequência entre os isolados de ORSA até o ano de 2009.
2009 Apenas dois
isolados de ORSA carreadores do SCCmec V foram detectados, nos anos de 2006 e 2009,
como mostra a Figura 099 abaixo.
SCCmec I
SCCmec II
SCCmec III
SCCmec IV
SCCmec V
14%
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
SCC
dos isolados de ORSA, de acordo com o ano
Figura 09 - Distribuição da frequência de SCCmec
de isolamento.
4.2.3 - Perfis genotípicos
enotípicos dos tipos de SCCmec
SCC
A determinação da relação genética pela técnica de PFGE, utilizando coeficiente de Dice
de 80% de similaridade, demonstrou a presença de seis principais clusters. A Figura 10
exemplifica um dos perfis de bandas de isolados de ORSA encontrados neste estudo. Todos os
isolados da Figura 10 carreavam o SCCmec
SCC
III, sendo alguns relacionados geneticamente à
cepa HU25 correspondente ao clone endêmico brasileiro (A10283, A10404, A10405, A10497 e
A10561), e outros não relacionados à cepa HU25, porém, também
bém carreadores do SCCmec
SCC
III.
49
RESULTADOS
Figura 10 - Perfil de bandas de amostras ORSA carreadoras do SCCmec III pela técnica de
eletroforese em campo pulsado. Colunas 1 e 19 - marcador de peso molecular 48,5 kb (Lambda
ladder); Colunas 2, 7, 12, e 18 - cepa padrão de S. aureus NCTC 8325; Isolados de ORSA com
mais de 80% de similaridade com a cepa do clone epidêmico brasileiro HU25: Coluna 3 A10283, Coluna 5 - A10404, Coluna 6 - A10405, Coluna 11- A10497 e Coluna 14 - A10561
carreadoras do SCCmec III. Isolados de ORSA com perfil distinto da cepa HU25: Coluna 4 A11610, Coluna 8 - A12061, Coluna 9 - A13127, Coluna 10 - A14179, Coluna 13 - A17931,
Coluna 15 - A24145, Coluna 16 - A27069 e Coluna - 17 - A27123.
O CEB foi o mais frequente, agrupando 48% dos isolados. Entretanto, a prevalência do
CEB foi progressivamente reduzida com o passar dos anos (p < 0,05) e não foi detectado entre
os ORSA isolados em 2009. A diminuição da representatividade desse clone na amostragem foi
acompanhada pelo aumento de dois outros clones, o Nova Iorque/Japão (NY/J) e um clone, K
50
RESULTADOS
SCCmec I, não relacionado aos controles testados neste estudo, como mostra a Figura 11
abaixo.
K
CEB
NY/JP
14%
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
Figura 11 - Gráfico da frequência de isolados ORSA relacionados aos principais clones
epidêmicos conhecidos, encontrados neste estudo. CEB - amostras com mais de 80% de
similaridade com o clone endêmico brasileiro; NY/J - amostras com mais de 80% de similaridade
com o clone Nova Iorque/Japão; K - amostras com mais de 80% de similaridade entre si, porém
não relacionadas a nenhum clone testado.
As Figuras 12 a 15 mostram a análise dos clusters das amostras contendo SCCmec I, II,
IV e V, respectivamente. Entre as 27 amostras de ORSA SCCmec I, 10 clones foram
encontrados com predominância de dois deles, detectados a partir de 2007, sendo que um
desses clones agrupou 27% dos isolados de ORSA SCCmec I, porém sem relação com nenhum
clone conhecido testado (Figura 12). Na Figura 7, observa-se uma grande variedade de clones,
porém, dois deles, os clone V e o X, foram os mais frequentes, agrupando 28,6% e 22,9% das
51
RESULTADOS
amostras SCCmec II, respectivamente. As amostras do clone V apresentaram similaridade maior
que 80% à cepa BK2464, representante do clone NY/J. Esse clone, assim como o clone X, foi
detectado somente a partir de 2007.
Figura 12 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec I, utilizando o
coeficiente de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o
método UPGMA. As colunas à direita do dendrograma correspondem à identificação da amostra
e ano de isolamento.
52
RESULTADOS
Figura 13 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec II, utilizando o
coeficiente de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o
Uma diversidade menor de clones foi encontrada nos isolados ORSA SCCmec IV, com
63% dos isolados agrupados em um único clone que exibia similaridade superior a 80% com a
cepa HDE 288, representante do clone pediátrico (Figura 14). Neste estudo, o clone pediátrico
foi observado em 2004 e 2005, em quatro isolados em cada ano, porém em 2006 apenas um
isolado de ORSA, representante do clone pediátrico foi detectado, dois em 2007, nenhum em
2008 e apenas um em 2009. As duas amostras de ORSA SCCmec V, isoladas em distintos anos
53
RESULTADOS
(2006 e 2009) não apresentavam similaridade entre si, porém, uma delas exibia similaridade ao
padrão demonstrado pela cepa BK2464, representante do clone NY/JP (Figura 9).
Figura 14 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec IV, utilizando o
coeficiente de similaridade de Dice de 80% (linha vertical pontilhada), Tolerância de 1,5% e o
54
RESULTADOS
Figura 15 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec V em comparação às
cepas padrão utilizadas neste estudo (coeficiente de similaridade de Dice de 80%, representado
pela linha vertical pontilhada, tolerância de 1,5% e o método UPGMA). As colunas à direita do
dendrograma correspondem à identificação da amostra e ano de isolamento.
A Figura 16 abaixo representa a análise dos clusters dos isolados de ORSA SCCmec III
classificados de acordo com o período de isolamento, P1 e P2. Houve um grande aumento na
variedade de clusters encontrados nos últimos anos do estudo. Dos seis clusters observados
durante o P1, destaca-se aquele que apresenta mais de 80% de similaridade com a cepa HU25
do CEB. Esse cluster é compreendido por 88% dos isolados ORSA SCCmec III isolados durante
o P1. Em contraste, durante os anos do P2, 16 diferentes clusters foram detectados e apenas
cinco isolados ORSA SCCmec III (28%) apresentaram similaridade > 80% com a cepa HU25,
pertencente ao CEB. Neste estudo, 97% dos isolados de ORSA relacionados ao CEB carreavam
o SCCmec III, duas cepas isoladas em 2004 e 2008 carreavam o SCCmec I não apresentavam,
portanto, relação temporal entre si, e apenas um isolado carreava o SCCmec IV.
55
RESULTADOS
Figura 16 - Análise dos clusters das amostras ORSA contendo SCCmec III, utilizando 80% de
coeficiente de similaridade de Dice (linha vertical pontilhada), tolerância de 1,5% e o método
UPGMA. O dendograma à esquerda corresponde às amostras isoladas durante o P1 (2002 a
2005); o dendograma à direita corresponde às amostras isoladas durante o P2 (2006 a 2009).
Os ramos colaps ados (triângulo invertido) correspondem às amostras com mais de 80% de
similaridade com a cepa HU25 do clone epidêmico brasileiro.
4.3 - Avaliação da Sensibilidade aos Glicopeptídeos
4.3.1 - Vancomicina
O teste de sensibilidade para vancomicina pela metodologia de microdiluição em caldo,
utilizando-se mínimos acréscimos nas concentrações do antimicrobiano, revelou uma variação
na CIM dos isolados de S. aureus entre 0,344 e 1,5 µg/mL. A frequência das CIM para
vancomicina, encontradas no estudo, estão discriminadas na Tabela 9.
56
RESULTADOS
Tabela 09 - Distribuição das CIMs para vancomicina, por microdiluição em caldo, entre os
isolados ORSA avaliados neste estudo.
CIM Vancomicina
(µg/mL)
N
Frequência
(%)
0,344
2
1,0
Frequência
Acumulada
(%)
1,0
0,375
1
0,5
1,5
0,438
5
2,5
4,0
0,469
6
3,0
7,0
0,5
27
13,5
20,5
0,563
21
10,5
31,0
0,564
3
1,5
32,5
0,625
34
17,0
49,5
0,638
1
0,5
50,0
0,688
20
10,0
60,0
0,75
21
10,5
70,5
0,813
13
6,5
77,0
0,875
10
5,0
82,0
0,938
15
7,5
89,5
0,968
1
0,5
90,0
1
12
6,0
96,0
1,125
1
0,5
96,5
1,25
3
1,5
98,0
1,375
3
1,5
99,5
1,5
1
0,5
100,0
Total
200
100,0
Segundo as recomendações atuais do CLSI (2012), para a classificação de categorias
de sensibilidade de S. aureus para vancomicina, todos os isolados do estudo apresentaram-se
como sensíveis a esse antimicrobiano (CIM ≤ 2 µg/mL). De maneira geral, a mediana, média e
moda para vancomicina foram 0,638 µg/mL, 0,71 µg/mL e 0,50 µg/mL, respectivamente. As CIMs
capazes de inibir 50% e 90% dos isolados ORSA, ou seja, CIM50 e CIM90 foram de 0,638 µg/mL
e 0,968 µg/mL, respectivamente.
57
RESULTADOS
O método de gradiente de difusão apresentou uma variação de CIM para vancomicina
entre 0,5 µg/mL e 3 µg/mL (Tabela 10). A média geométrica, mediana e moda foram,
respectivamente, de 1,45 µg/mL, 1,50 µg/mL e 1,50 µg/mL. Em relação à metodologia padrãoouro, o método de gradiente antimicrobiano em fita (Etest®) apresentou taxas de concordância
geral e por categorias de 89,5% e 99,5%, respectivamente.
Tabela 10 - Distribuição das CIMs para vancomicina pelo método Etest® dos isolados ORSA
avaliados neste estudo.
CIM Vancomicina
(µg/mL)
N
Frequência
(%)
0,5
1
0,5
Frequência
Acumulada
(%)
0,5
0,75
9
4,5
5,0
1,0
45
22,5
27,5
1,5
105
52,5
80,0
2,0
39
19,5
99,5
3,0
1
0,5
100,0
Total
200
100,0
Uma tendência a resultados superiores de CIMs para vancomicina foi observada com a
metodologia de Etest®, como mostra a Figura 17 abaixo. Segundo os critérios de sensibilidade
estabelecidos pelo CLSI (2012), apenas um isolado de S. aureus exibiria resistência
intermediária à vancomicina pela metodologia de Etest® e constituiria um erro leve.
58
RESULTADOS
Figura 17 - Escatergrama
catergrama utilizando
utiliza
valores ajustados para diluições log2 dos resultados das
CIMs para vancomicina, obtidas por microdiluição em caldo e Etest® entre os isolados ORSA
avaliados.
Quando comparados os valores
val
das CIM50 e CIM90 para vancomicina,, de acordo com o
período de estudo (P1, 2002--2005 e P2, 2006 a 2009), observa-se
se um aumento em ambas as
taxas, apenas quando a metodologia de microdiluição em caldo com mínimos acréscimos
acrésc
foi
empregada (Figura 18).
59
RESULTADOS
Figura 18 - Aumento dos valores de CIM50 e CIM90 para vancomicina dos isolados de ORSA
entre os períodos do estudo: P1 (2002-2005) e P2 (2006-2009), * p < 0,0001.
As Figuras 19 e 20 representam aspectos importantes da variação dos valores de CIMs
de vancomicina, de acordo com o ano de estudo. Nelas podemos observar a tendência do
conjunto de dados, sendo a linha central da caixa a mediana, o limite inferior e superior da caixa,
respectivamente, o primeiro quartis (Q1) e o terceiro quartis (Q3). Além disso, é possível avaliar
a heterogeneidade na distribuição da CIM para vancomicina em cada ano de estudo, através do
tamanho da caixa, e se determinar os valores mínimos e máximos de cada conjunto. Os pontos
representados por círculos ou asteriscos, isolados nos gráficos, representam valores fora da
faixa analisada (atípicos ou “outliers”) e são calculados levando-se em consideração a diferença
interquartílica (Q3-Q1). O círculo representa valores 1,5 vezes à diferença interquartílica e o
asterisco três vezes essa diferença.
60
RESULTADOS
Figura 19 - Representação gráfica da mediana e quartis das CIMs para vancomicina dos
isolados de S. aureus, distribuídas por ano de estudo, determinadas pela metodologia de
microdiluição em caldo (p < 0,05). Intervalo entre valores máximo e mínimo, coluna representa o
espaço interquartil (entre os quartis 25 e 75) e a linha em negrito a mediana.
Na Figura 19, observa-se que nos primeiros anos do estudo (2002 e 2003), a distribuição
da CIM para vancomicina era bastante homogênea (pequenas caixas), a partir de 2004 houve
uma crescente heterogeneidade nos valores de CIM para vancomicina, determinados pela
microdiluição em caldo, assim como uma elevação na mediana progressiva até o ano de 2007 e
estabilização dessa em 2008 e 2009, porém em valores inferiores aquele atingido em 2007.
Essa tendência ao aumento da CIM para vancomicina nos isolados ORSA avaliados,
denominada de “MIC Creep” foi apenas observada e, estatisticamente significantiva, quando
61
RESULTADOS
avaliados ano a ano os resultados de microdiluição em caldo com mínimos acréscimos, como
mostra a Figura 19 (Pearson test, p < 0,0001). Entretanto, quando os valores obtidos pela
metodologia de Etest® foram avaliados foi possível observar uma tendência (p = 0,051) para o
aumento dos valores da CIM para vancomicina nos anos 2007 e 2009 (Figura 20).
isolados de S. aureus distribuídas por ano de estudo determinadas pela metodologia de Etest® (p
= 0,051).
Na Figura 20, observa-se, pelo tamanho das caixas, uma homogeneidade nos valores
de CIM para vancomicina pelo Etest® nos anos estudados, sendo que em 2005 e 2006, os
valores de Q1, Q3 e a mediana foram coincidentes, e, portanto, não há representatividade de
“caixa”.
62
RESULTADOS
4.3.2 - Teicoplanina
O teste de sensibilidade para teicoplanina, pela metodologia de microdiluição em caldo,
utilizando-se mínimos acréscimos nas concentrações do antimicrobiano, revelou uma variação
de 0,250 a 2,0 µg/mL na CIM dos isolados de ORSA. A frequência das CIM para teicoplanina
encontradas no estudo estão discriminadas na Tabela 11 abaixo.
Tabela 11 - Distribuição das CIMs para teicoplanina por microdiluição em caldo entre os isolados
ORSA avaliados neste estudo.
CIM Teicoplanina
N
Frequência (%)
0,25
6
3,0
Frequência
cumulativa
(%)
3,0
0,313
2
1,0
4,0
0,344
3
1,5
5,5
0,375
8
4,0
9,5
0,406
9
4,5
14,0
0,438
11
5,5
19,5
0,469
6
3,0
22,5
0,5
27
13,5
36,0
0,561
1
0,5
36,5
0,563
10
5,0
41,5
0,625
20
10,0
51,5
0,688
22
11,0
62,5
0,75
20
10,0
72,5
0,813
12
6,0
78,5
0,83
1
0,5
79,0
0,875
12
6,0
85,0
0,938
3
1,5
86,5
1
17
8,5
95,0
1,5
5
2,5
97,5
1,75
3
1,5
99,0
1,875
1
0,5
99,5
2
1
0,5
100,0
63
RESULTADOS
Total
200
100
De maneira geral, os valores de média, mediana e moda para as CIMs de teicoplanina
foram de 0,686 µg/mL, 0,625 µg/mL e 0,50 µg/mL, respectivamente. As CIM50 e CIM90 foram de
0,625 µg/mL e 1,0 µg/mL, respectivamente. Segundo as recomendações atuais do CLSI (2012)
para a classificação de categorias de sensibilidade de S. aureus para teicoplanina, todos os
isolados do estudo exibiram sensibilidade a esse antimicrobiano (CIM ≤ 8 µg/mL). A distribuição
das CIMs de teicoplanina pela técnica de Etest® limitou-se a valores entre 0,5 µg/mL e 3,0 µg/mL
(Tabela 12). Os valores da média geométrica, moda e mediana foram, respectivamente, de 1,58
µg/m, 1,5 µg/m e 1,5 µg/m. As CIM50 e CIM90 para os isolados ORSA analisados foram de 1,5
µg/m e 2,0 µg/m, respectivamente.
Tabela 12 - Distribuição das CIMs para teicoplanina pelo método Etest® dos isolados ORSA
avaliados neste estudo.
CIM Teicoplanina
(µg/mL)
N
%
% cumulativa
0,5
0,75
1
1,5
2
3
Total
3
1,5
1,5
6
3,0
4,5
25
12,5
17,0
101
50,5
67,5
61
30,5
98,0
4
2,0
100,0
200
100,0
Os resultados obtidos pela metodologia de Etest® para teicoplanina, atingiram uma taxa
de concordância geral com a microdiluição em caldo de apenas 71,5%, porém, obtiveram 100%
de correlação nas categorias de sensibilidade, quando os atuais pontos de corte recomendados
pelo CLSI foram empregados (S ≤ 8 µg/mL). A Figura 21, abaixo, ilustra esses dados e permite a
visualização de uma tendência a valores de CIMs para teicoplanina, superiores pela técnica de
Etest® quando comparados à microdiluição em caldo.
64
RESULTADOS
Figura 21 - Escattergrama
cattergrama utilizando
utiliza
valores ajustados para diluições log2 dos resultados das
CIMs para teicoplanina obtidas por microdiluição em caldo e Etest® entre os isolados ORSA
avaliados.
Quando comparados os valores das CIM50 e CIM90 para teicoplanina entre os períodos
do estudo (P1 e P2), não foram observadas alterações significativas na distribuição das CIMs
para teicoplanina por ambas as metodologias empregadas (Tabela 13).
65
RESULTADOS
Tabela 13 - Valores das CIM50 e CIM90 para teicoplanina dos isolados de ORSA de acordo com
o período do estudo pelas diferentes metodologias.
Teicoplanina (µg/mL)
BMD
E-test
MIC50
MIC90
MIC50
MIC90
P1 (2002-2005)
0,688
1,0
1,50
2,00
P2 (2006-2009)
0,625
1,0
1,50
2,00
Da mesma maneira, não foi observada nenhuma tendência quando os valores de CIM
para teicoplanina foram avaliados ano a ano, seja ela técnica de microdiluição em caldo (p =
0,512) como por Etest® (p = 0,214) (Figura 22 e 23). As Figuras 22 e 23 mostram uma
distribuição bastante homogênea entre os valores de CIMs para teicoplanina, de acordo com os
anos de estudo, assim como pequena variação nas respectivas medianas, independente da
metodologia testada.
66
RESULTADOS
Figura 22 - Representação gráfica da mediana e quartis das CIMs para teicoplanina dos
isolados de S. aureus distribuídas por ano de estudo, determinadas pela metodologia de
microdiluição em caldo (p = 0,512).
67
RESULTADOS
isolados de S. aureus distribuídas por ano de estudo, determinadas pela metodologia de Etest®
(p = 0,214).
Os valores das médias de CIM para vancomicina e teicoplanina, de acordo com o tipo de
SCCmec dos isolados de ORSA podem ser observados na Tabela 14 abaixo. A comparação da
média de CIM para vancomicina e teicoplanina do SCCmec III em relação aos demais tipos de
SCCmec, por ambas as metodologias de teste de sensibilidade utilizadas, demonstrou uma
singela tendência, sem alcançar significado estatístico (p = 0,077), apenas para o SCCmec II e
vancomicina por microdiluição em caldo (Tabela 14).
68
RESULTADOS
Tabela 14 - Distribuição das médias das CIMs de vancomicina, de acordo com a tipagem
molecular de SCCmec dos isolados ORSA avaliados.
Vanco_BMD
SCCmec I
SCCmec II
SCCmec III
SCCmec IV
SCCmec V
N
27
35
117
19
2
média
0,74
0,79
0,67
0,68
0,97
p*
0,734
0,077
-
1,000
0,896
* valor de p em relação ao SCCmec III; Vanco_BMD - microdiluição em caldo para vancomicina.
Apesar dos isolados ORSA SCCmec I, IV e V apresentarem valores superiores ao
SCCmec II para as médias de CIM de vancomicina por microdiluição em caldo, nenhum
resultado foi significativo na análise estatística. O mesmo ocorreu com os isolados ORSA
SCCmec I e V, em relação ao tipo III para a micordiluição em caldo para teicoplanina (Tabela
15).
Tabela 15 - Distribuição das médias das CIMs de teicoplanina, de acordo com a tipagem
molecular de SCCmec dos isolados ORSA avaliados.
Teico_BMD
SCCmec I
SCCmec II
SCCmec III
SCCmec IV
SCCmec V
N
27
35
117
19
2
média
0,73
0,60
0,71
0,62
1,11
p*
1,000
0,387
-
0,633
0,994
* valor de p em relação ao SCCmec III; Teico_BMD - microdiluição em caldo para teicomicina.
69
RESULTADOS
4.3.3 - Evolução temporal da CIM dos glicopeptídeos de amostras relacionadas ao
CEB
No subgrupo constituído apenas por ORSA com mais de 80% de similaridade ao CEB
(96 isolados), a distribuição nos anos do estudo mostraram uma diminuição importante e
progressiva da frequência desse clone (Tabela 16). Quando avaliada a sensibilidade aos
glicopeptídeos especificamente nesse grupo de ORSA, observamos que houve uma diferença
estatisticamente significativa na distribuição dos valores da CIM de vancomicina pelos anos do
estudo (p = 0,021), pela técnica de microdiluição, mas não pelo Etest® (p = 0,807) (Figuras 18 e
19). Da mesma maneira que os demais isolados de ORSA do estudo, não houve modificação
significativa nas CIM de teicoplanina por nenhuma das metodologias de sensibilidade aplicadas
(p > 0,05). Entretanto, nota-se que nos últimos anos do estudo, o número de isolados de ORSA
relacionados com o CEB foi muito inferior aos demais anos, sendo que 2009 não houve nenhum
isolado detectado.
Tabela 16 - Distribuição de ORSA com similaridade acima de 80% com o CEB.
Ano
Total
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
CIM Vanco/N°
23
24
15
16
11
3
4
0
Média
0,600
0,651
0,577
0,680
0,718
0,527
0,613
-
Mediana
0,563
0,625
0,563
0,657
0,750
0,500
0,594
-
96
Na Figura 24, abaixo, observa-se uma grande variação da mediana das CIMs para
vancomicina pela microdiluição em caldo. Além disso, observamos um aumento progressivo da
mediana, principalmente entre os anos de 2004 e 2006, entretanto, em 2007 e 2008, houve uma
diminuição acentuada dessa. Contudo, a baixa representatividade de isolados relacionados ao
70
RESULTADOS
CEB em 2007 e 2008 limita o valor dessa análise. Esse comportamento foi similar ao ocorrido
com o grupo total de ORSA avaliado neste estudo (Figura 19).
isolados de ORSA relacionados ao CEB, distribuídos por ano de estudo determinadas pela
metodologia de microdiluição em caldo (p = 0,021).
Da mesma forma que no grupo total de ORSA do estudo, o subgrupo de isolados
relacionados ao CEB apresentou uma homogeneidade nos resultados de CIM para vancomicina
obtidos por Etest®, sendo que nos anos de 2005 e 2006 os valores de Q1, Q3 e mediana foram
coincidentes, formando apenas um linha na representação gráfica (Figura 25).
71
RESULTADOS
metodologia de Etest® (p = 0,807).
As CIMs de teicoplanina obtidas por microdiluição em caldo do subgrupo de isolados
ORSA relacionados ao CEB apresentou maior homogeneidade dos grupos do que a
vancomicina e uma menor variação da mediana. Entretanto, nota-se um discreto aumento da
mediana entre os anos de 2002 e 2005, e ligeira queda nos anos subsequentes. Em 2008, o
valor da mediana foi semelhante ao de 2003 (Figura 26).
72
RESULTADOS
metodologia de microdiluição em caldo (p = 0,816).
Quando os resultados de CIMs para teicoplanina, obtidos por Etest® no subgrupo de
ORSA relacionados ao CEB, foram avaliados, nota-se que a mediana era de 2 µg/mL em 2002,
caiu para 1,5 µg/mL nos anos de 2003 a 2007 e para 1 µg/mL em 2008 (Figura 27).
73
RESULTADOS
isolados de ORSA relacionados ao CEB, distribuídos por ano de estudo e determinadas pela
metodologia de Etest® (p = 0,111).
A análise estatística das CIMs de vancomicina, comparadas entre os principais clusters
encontrados neste estudo, ou seja, CEB, NY/J e cluster K, mostrou valores mais elevados para
os dois últimos clusters, principalmente para o NY/J, como mostra a Tabela 17.
74
RESULTADOS
Tabela 17 - Análise estatística das CIMs de vancomicina por microdiluição em caldo, de acordo
com o padrão de PFGE dos isolados ORSA avaliados.
Padrão PFGE
CIM Vanco
CEB
NY/J
Cluster K
Todos
N°
96
24
14
200
média
0,652
0,796
0,748
0,707
moda
0,625
0,813
0,750
0,663
mediana
0,625
0,938
0,938
0,625
Entretanto, quando avaliados os valores de CIMs para teicoplanina, essa diferença não
foi observada para o cluster NY/J que apresentou valores menores quando comparados ao CEB
(Tabela 18). A comparação múltipla entre as médias das CIMs, de acordo com os três principais
clones observados nessa amostragem, mostrou uma tendência apenas para a CIM de
vancomicina obtida por microdiluição em caldo entre os clones NY/J e CEB, porém não
significante estatisticamente (p = 0,076). As demais combinações de método e antimicrobiano
(vancomicina/Etest®;
teicoplanina/microdiluição
em
caldo
e
teicoplanina/Etest®)
não
apresentaram diferença estatisticamente significativa entre as médias de CIM dos principais
clones observados.
75
RESULTADOS
Tabela 18 - Análise estatística das CIMs de teicoplanina por microdiluição em caldo, de acordo
com o padrão de PFGE dos isolados ORSA avaliados.
Padrão PFGE
CIM Teico
CEB
NY/J
Cluster K
Todos
N°
96
24
14
200
média
0,697
0,553
0,768
0,686
moda
0,688
0,485
0,813
0,625
mediana
0,500
0,625
0,813
0,500
76
DISCUSSÃO
5 - DISCUSSÃO
S. aureus é um dos patógenos mais frequentemente isolados no ambiente hospitalar,
podendo causar uma variedade de infecções, de leves a fatais. A vancomicina é o
antimicrobiano de escolha para o tratamento de infecções graves no ambiente hospitalar.
Entretanto, há dúvidas quanto a sua eficácia clínica para o tratamento de infecções graves
causadas por ORSA que apresentam CIM no limite superior de sensibilidade. O objetivo deste
estudo foi avaliar a dinâmica das CIMs para vancomicina e teicoplanina em cepas de ORSA
isoladas de infecções de corrente sanguínea de pacientes internados no Hospital São Paulo
durante um período de oito anos.
Os estudos que avaliaram as tendências das CIMs de glicopeptídeos ao redor do mundo
apresentaram resultados contraditórios, mostrando claramente que essa é uma questão
multifatorial e de difícil comparação devido à heterogeneidade nos estudos. Os estudos diferem
entre si pelos períodos analisados, pelos métodos de teste de sensibilidade empregados (Etest®,
microdiluição tradicional ou microdiluição com mínimos acréscimos), pelo tempo no qual o teste
de sensibilidade foi realizado (no momento do isolamento ou após congelamento) e tipo de
isolado analisado, ORSA e/ou OSSA. Além disso, a intensidade de utilização do antimicrobiano
em questão estaria diretamente relacionada às modificações graduais e não notórias nas
tendências centrais das CIMs desse, como sugere a própria definição do fenômeno creep.
Desse modo, o primeiro fator que pode influenciar a capacidade de observação do creep
é, sem dúvida, a metodologia do teste de sensibilidade empregada. Os estudos revelam que
quanto mais precisas forem as diluições testadas, mais sensível será a capacidade de se notar
mudanças nas CIMs (Sader et al., 2008). Segundo essa lógica, os primeiros estudos que
compararam a técnica de microdiluição tradicional ou semiautomatizada com o Etest®, método
que apresenta maior discriminação nos valores das CIMs, observaram a presença de creep
77
DISCUSSÃO
somente com a metodologia do Etest® (Mason et al., 2009; Pitz et al., 2010). Porém, no presente
estudo, o emprego de acréscimos mínimos nos valores das concentrações testadas por
microdiluição em caldo foram mais sensíveis para a observação do creep para vancomicina do
que o Etest® para os isolados de ORSA. Entretanto, nem todas as instituições médicas relatam
aumento nas CIMs de vancomicina. Estudo de Sader e colaboradores (2008), envolvendo nove
centros americanos e empregando acréscimos mínimos nas concentrações de vancomicina por
microdiluição em caldo, mostrou a presença de creep em apenas três centros, sugerindo a
influência de fatores locais. Portanto, o segundo fator que pode estar associado à presença ou
não de creep é a pressão seletiva do próprio antimicrobiano, ou mais claramente, a quantidade
de vancomicina consumida pela instituição (Alos et al., 2008; Ho et al., 2010). Ho e
colaboradores (2010) realizaram, em diversos centros médicos da China, estudo que
correlacionou o aumento no uso endovenoso de vancomicina com a observação de creep para
esse antimicrobiano a partir de 2004. Da mesma maneira, Yeh e colaboradores (2012)
observaram, em Taiwan, um aumento na média geométrica da CIM de vancomicina no mesmo
período no qual foi intensificado o uso de vancomicina endovenosa naquela instituição. Já, Alós
e colaboradores (2008) não observaram creep para vancomicina em sua instituição, cuja
prevalência de ORSA é baixa e, consequentemente, o uso de vancomicina endovenosa restrito.
Entretanto, esse estudo utilizou a técnica de microdiluição em caldo com diluições seriadas
tradicionais (log2), sendo a menor concentração testada de 1 µg/mL. Visto que a maioria dos
estudos observou aumento do número de isolados com CIM = 1 µg/mL em relação aos isolados
com CIM ≤ 0,5 µg/mL; em seu estudo, Alós e colaboradores (2008) não foram capazes de
detectar a frequência de isolados com CIM ≤ 0,5 µg/mL, e, portanto, não puderam descartar
completamente a presença de creep.
Adicionalmente, um novo interferente sugerido por Edwards e colaboradores (2011)
estaria relacionado ao armazenamento das cepas bacterianas. Em seu estudo, entre dezembro
78
DISCUSSÃO
de 2007 e 2010, 208 isolados de ORSA de infecção de corrente sanguínea do Reino Unido
foram avaliados, prospectivamente, por Etest® no momento do isolamento e, retrospectivamente,
por Etest® e microdiluição em caldo, após armazenagem a 70°C. Houve uma discrepância na
percepção da variação nas CIMs para vancomicina quando o teste de sensibilidade foi realizado
no momento do isolamento ou após estocagem. Uma variação (creep) foi observada nos
resultados obtidos por Etest® prospectivamente, porém, não acompanhada dos resultados
retrospectivos por ambas as metodologias (Etest® e microdiluição em caldo). Esse fato sugere
que, provavelmente, na ausência de exposição aos antimicrobianos esses isolados possam
modificar, ainda que discretamente, seu perfil de sensibilidade.
Um quarto fator que pode incorrer na observação ou não de creep e, talvez, o mais
importante deles, seriam as características epidemiológicas de cada localidade estudada. Os
resultados contraditórios na literatura documentando a elevação da CIM de vancomicina em
ORSA podem ser causados parcialmente pela irregularidade de dados de tipagem molecular dos
isolados de ORSA. Alguns clusters de ORSA possuem maior tendência à disseminação que
outros e apresentam CIM para vancomicina mais elevadas. Dessa forma, muitos dos estudos
que observaram creep para CIM de vancomicina em ORSA foram estudos restritos a uma única
instituição, assim como o presente estudo (Wang et al., 2006; Steinkraus et al., 2007; Yeh et al.,
2012) e, portanto, mais susceptíveis a diferenças epidemiológicas que os grandes estudos de
vigilância, que não demonstraram variações significativas na CIM de vancomicina (Jones et al.,
2006; Picão et al., 2008; Reynolds et al., 2012). As modificações epidemiológicas de clones de
ORSA são descritas há mais de duas décadas, e as razões para tal fenômeno permanecem
como um desafio para os epidemiologistas. Uma das possíveis explicações seria a maior
capacidade de disseminação ou ainda a vantagem seletiva presente em determinado clone, a
exemplo do ocorrido em Portugal na década de 90, com a substituição do clone Ibérico pelo
CEB, carreador da vantagem de apresentar-se resistente ao sulfametoxazol-trimetoprima. No
79
DISCUSSÃO
Brasil, os estudos epidemiológicos mostraram um quase absoluto predomínio do CEB entre os
isolados hospitalares de ORSA, assim como de isolados que carreavam o SCCmec III, até
meados da década de 2000 (Vivoni et al., 2006; Lamaro-Cardoso et al., 2007; Reinert et al.,
2008). Entretanto, alguns isolados de SCCmec IV passaram a ser relatados, em pequenos
números, entre os isolados hospitalares de ORSA (de A Trindade et al., 2005; Reinert et al.,
2008). Neste estudo, 9,5% dos isolados de ORSA carreavam o SCCmec IV, sendo que 37%
desses eram relacionados ao clone epidêmico Pediátrico.
Apenas recentemente, a diminuição da prevalência do CEB e aumento de isolados
geneticamente relacionados a outros clones epidêmicos, como o Córdoba/Chile e o NY/J foi
notada (Paschoal, 2010; Marra et al., 2011; Becker et al., 2012). No presente estudo, evidenciouse o movimento epidemiológico de ORSA com a detecção da substituição do CEB (SCCmec III)
por outros clones, o NY/J (SCCmec II) e clone K (SCCmec I), sendo que no último ano do estudo
nenhum isolado relacionado ao CEB foi detectado, e apenas 16% carreavam o SCCmec III.
Representação semelhante foi observada por Becker e colaboradores (2012), em Porto Alegre
em isolados de ORSA em 2008. Neste estudo, apesar da maioria dos ORSA pertencerem ao
CEB (60), a emergência do clone Córdoba/Chile (SCCmec I) em 37% dos ORSA foi
documentada (Becker et al., 2012). No Rio de Janeiro, Cabloco e colaboradores (2013),
observaram, a emergência de ORSA SCCmec IV e II em 23% e 14% dos isolados,
respectivamente. Contudo, dentre os poucos estudos que descreveram o fenômeno de creep
para vancomicina, nem todos analisaram os isolados de ORSA por tipagem molecular a fim de
se determinar quando o creep foi decorrente da disseminação de clusters de ORSA.
Na presente investigação, o congelamento dos isolados bacterianos, aparentemente,
não prejudicou a determinação da CIM, uma vez que pudemos observar uma variação na CIM
para vancomicina. Essa variação foi, provavelmente, impulsionada pela mudança na distribuição
de clones durante o período do estudo. Após décadas de isolados relacionados ao CEB serem
80
DISCUSSÃO
responsáveis pela maioria das infecções por ORSA em hospitais brasileiros, observou-se uma
gradual substituição desse clone, até o ano de 2009, onde o ORSA SCCmec II passou a ser
predominante, seguido do tipo I. Marra e colaboradores (2011) observaram 24% de isolados
ORSA SCCmec II em estudo multicêntrico brasileiro, nos anos de 2007 e 2010, porém o CEB
manteve-se presente em 47% dos ORSA. A substituição desse por outros clones, sendo um
deles o NY/J, foi também descrita em outros estudos (Sader et al., 2008; Ho et al., 2010). O
maior impacto desse fenômeno deve-se a observação de CIM para vancomicina mais elevada
nos isolados relacionados ao clone NY/J que nos demais clones internacionais. Assim como
observado por outros autores, nos Estados Unidos e na China, o clone NY/J apresenta valores
de CIM para vancomicina, superiores aos demais clones conhecidos, inclusive ao CEB (Ho et al.,
2010; Sader et al., 2009). No presente estudo, as medianas das CIMs para vancomicina dos
clones K e NY/J foram superiores à do CEB em 0,313 µg/mL (Tabela 17), corroborando com os
achados da literatura, nos quais o clone NY/J está mais relacionado, inclusive, ao fenótipo hVISA
ou VISA (Sader et al., 2009). A principal preocupação com a ocorrência de creep nas CIMs é,
justamente, a perda gradual da atividade de vancomicina e, consequentemente, o
comprometimento de sua utilidade clínica (Hidayat et al., 2006; Kollef, 2007; Neoh et al., 2007;
Soriano et al., 2008). Entretanto, a ocorrência do fenômeno de creep para vancomicina parece
estar limitada a alguns centros ou regiões, e quando ocorre, o aumento é de apenas uma fração
da diluição logarítmica, e sucede-se de maneira lenta, às vezes no decorrer de uma década. Por
outro lado, uma falsa percepção de creep poderia ser decorrente de substituições clonais,
principalmente quando de trata de ORSA. Entretanto, neste estudo, a observação de um
aumento discreto, porém com significado estatístico pela microdiluição em caldo, na tendência
central da CIM de vancomicina no subgrupo CEB sugere a observação do fenômeno
denominado creep, apesar do limitado número de isolados relacionados ao CEB a partir do ano
de 2007.
81
DISCUSSÃO
O aumento na variabilidade de clones, observado no segundo período deste estudo, faz
refletir sobre o fitness e a habilidade dos clones de ORSA em se disseminar pelo sistema de
saúde e o impacto que as medidas de controle podem assumir. A rápida e extensa disseminação
desses clones de ORSA, para os quais a vancomicina apresenta CIM elevada, intra e inter
hospitalar pode ter um impacto muito maior na utilidade clínica da vancomicina do que a
ocorrência lenta e gradual do verdadeiro creep em cepas selvagens de S. aureus.
A modificação das CIMs para teicoplanina, ao longo dos anos, foi abordada por apenas
quatro estudos até a presente data. O maior deles, conduzido por Jones e colaboradores (2006),
foi um estudo multicêntrico, avaliando-se um total de mais de 35 mil isolados de ORSA entre os
anos 1998 e 2003, por microdiluição em caldo tradicional. Este estudo não observou mudança
significativa na CIM para teicoplanina. Mesmo com o emprego de concentrações intermediárias
para teicoplanina e vancomicina por diluição em ágar, Reynolds e colaboradores (2012) não
detectaram o fenômeno de creep em 271 isolados de ORSA provenientes de diversos centros da
Irlanda e Reino Unido. O estudo de Tascini e colaboradores (2012) avaliou 91 isolados de S.
aureus, entre os anos de 2007 e 2010, por Etest e não observou creep para teicoplanina, mas
sim para vancomicina no mesmo grupo de S. aureus. No presente estudo, de maneira similar,
não foi observada modificações significativas nas tendências de CIM para teicoplanina por
Etest®, ou ainda empregando-se diminutos aumentos nas CIMs por microdiluição em caldo,
como ocorrido para vancomicina. Apesar de diferenças específicas entre clones de ORSA não
terem sido avaliadas em outros estudos da literatura, uma diminuição na mediana das CIMs para
teicoplanina por Etest® foi observada neste estudo quando o subgrupo CEB foi avaliado (2002 foi
de 2 µg/mL; de 2003 a 2007 µg/mL foram de 1,5 µg/mL e em 2008 foi de 1,0 µg/mL). Entretanto,
essa variação pode ser inerente ao teste e não necessariamente representa uma queda, uma
vez que não foi estatisticamente significativa (p = 0,111). Portanto, a ausência de percepção de
creep para teicoplanina, quando avaliado apenas o subgrupo de ORSA relacionado ao CEB,
82
DISCUSSÃO
sugere que a inexistência de pressão seletiva desse antimicrobiano possa desempenhar um
papel fundamental na ocorrência do fenômeno creep.
Da mesma maneira, com o emprego de concentrações intermediárias, através da
técnica de Etest, Ahlstrand e colaboradores (2011) não observaram variações significativas nas
CIMs para teicoplanina, porém, desta vez para 406 isolados clínicos de SCoN durante três
décadas (1980-2009). A resistência adquirida aos glicopeptídeos foi primeiro reconhecida em
isolados de SCoN (Biavasco et al., 2000). Desde então, tem se observado que a resistência à
teicoplanina é mais comum que à vancomicina, e mais frequente em espécies como S.
haemolyticus e S. epidermidis (Biavasco et al., 2000). Entretanto, diversos estudos que
detectaram maior taxa de resistência à teicoplanina em isolados de SCoN, quando comparados
aos isolados de S. aureus, observaram que essa nem sempre era acompanhada de taxa similar
de resistência à vancomicina (Nunes et al., 2001). O fato de, os estudos da literatura não terem
obtido sucesso na detecção de creep para teicoplanina pode estar relacionado ao menor
consumo desse antimicrobiano nas respectivas instituições. Outros fatores que também
poderiam estar relacionados, mas devem ser melhor caracterizados, seriam o efeito de clones
epidemiológicos e diferenças na atividade da teicoplanina contra Staphylococcus spp. em
relação à vancomicina.
Alguns autores sugerem que a teicoplanina atua mais lentamente que a vancomicina e a
obtenção de colônias com CIMs elevadas, após exposição in vitro a esses antimicrobianos a
partir de isolados sensíveis, é mais frequente com teicoplanina do que com vancomicina,
especialmente para algumas espécies de SCoN (Biavasco et al., 2000). Ma e colaboradores
(2011) sugeriram que a resistência a teicoplanina pode ser um marcador para a detecção de
isolados não sensíveis à vancomicina. Kuti e colaboradores (2008) demonstraram através de
modelos farmacodinâmicos que em doses habituais, tanto a vancomicina (1000 mg a cada 12
horas) como a teicoplanina (400 mg a cada 24 horas), possuem baixa fração cumulativa de
83
DISCUSSÃO
resposta (CFR) contra isolados de S. aureus no Brasil. A CFR para determinado alvo
farmacodinâmico é calculada levando em consideração a probabilidade de se atingir o alvo para
cada CIM e a porcentagem de organismos que apresentam a CIM em questão (Drusano et al.,
2001). Dessa forma, modificações nas posologias de glicopeptídeos foram sugeridas, entretanto,
a exposição farmacodinâmica pode ainda não ser suficiente mesmo em regimes de 1000 mg
cada 8 horas para vancomicina e 800 mg cada 24 horas para teicoplanina em isolados de ORSA
com CIM ≥ 2 µg/mL (Etest®) (Kuti et al., 2008). É importante ressaltar que os atuais pontos de
corte do CLSI para vancomicina foram modificados baseando-se nos achados farmacodinâmicos
assim como nos estudos que relacionaram a CIM para vancomicina com o desfecho clínico das
infecções causadas por Staphylococcus spp. Entretanto, poucos dados similares a respeito da
teicoplanina estão disponíveis e a limitada experiência clínica americana com esse
antimicrobiano não possibilitou a revisão dos pontos de corte para teicoplanina, segundo o
próprio documento do CLSI. Dessa forma, há uma diferença importante nos pontos de corte para
teicoplanina entre as recomedações do CLSI (sensível ≤ 8µg/mL) e as do comitê europeu para
teste
de
sensibilidade
aos
antimicrobianos
(EUCAST;
sensível
≤
2
µg/mL)
(http://www.eucast.org) que poderiam justificar as diferentes taxas de sensibilidade à
vancomicina e à teicoplanina, principalmente entre SCoN, nos estudos de vigilância.
O impacto da variação das CIMs para os glicopeptídeos na prática clínica mantém-se
obscuro. Porém, sabe-se que a infecção de corrente sanguínea por S. aureus é um frequente
desafio para o sistema de saúde, visto estar relacionada a altas taxas de mortalidade. Apesar
das modificações epidemiológicas a que se tem assistido o uso clínico de novos antimicrobianos
e melhorias nas terapias de suporte, a mortalidade de ICS por ORSA, no Brasil e no mundo,
permanece ao redor de 30% (Marra et al., 2011; Gasch et al., 2012). Da mesma maneira, a
resistência antimicrobiana parece evoluir continuamente. Recentemente, foram somados aos
então oito tipos de cassetes cromossômicos conhecidos em S. aureus, mais três novos tipos (IX,
84
DISCUSSÃO
X e XI), todos relacionados à resistência à oxacilina associada ou não à resistência a outros
grupos de antimicrobianos.
Devido à alta prevalência de ORSA em países como o Brasil, onde 30-40% dos isolados
de S. aureus causadores de infecção de corrente sanguínea são resistentes à oxacilina (Gales et
al., 2009; Marra et al., 2011), a principal opção terapêutica é a vancomicina. Porém, essa se
tornou palco de muitas discussões. Apesar de ser utilizada em ampla escala para o tratamento
de infecções graves causadas por ORSA nas últimas duas décadas, a grande maioria dos
isolados de ORSA permanecem sensíveis à vancomicina pelo atual ponto de corte estabelecido
pelo CLSI (Cardo et al., 2004).
Quatro décadas se passaram para que o primeiro isolado com sensibilidade reduzida
aos glicopeptídeos emergisse (Hiramatsu et al., 1997). Entretanto, apesar de sua sustentada
atividade inibitória in vitro, recentemente há um questionamento sobre a sua utilização. Os
argumentos compreendem a observação de uma atividade bactericida subótima, quando
comparada aos antimicrobianos β-lactâmicos e a tendência a um aumento nas CIMs de
vancomicina ao longo dos anos (Small et al., 1990; Sader et al., 2009). Além disso, dados
emergentes sugerem que a vancomicina pode ser menos efetiva contra infecções graves por
ORSA com valores de CIM próximos ao limite de sensibilidade atualmente estabelecido pelo
CLSI (van Hal et al., 2012).
Apesar da redução para 2 µg/mL nos critérios de sensibilidade (CLSI, 2012) para a
combinação S. aureus e vancomicina (anteriormente de 4 µg/mL), o aumento das taxas de falha
terapêutica descritas para infecções por ORSA com CIM igual a 2 µg/mL originou um debate
sobre a acurácia deste ponto de corte em predizer o sucesso clínico. Seguindo este raciocínio,
na última década, os estudos que avaliaram a mortalidade de isolados clínicos de ORSA com
redução da sensibilidade à vancomicina suscitaram apreensão no impacto clínico do fenômeno
de creep para este antimicrobiano (van Hal et al., 2012; Pastagia et al., 2012; Rojas et al., 2012).
85
DISCUSSÃO
Recentemente, uma meta-análise elaborada por van Hal e colaboradores (2012) demonstrou
uma associação entre o aumento da mortalidade e valores de CIMs de vancomicina (≥ 1,5
µg/mL por Etest®) em infecções causadas por ORSA. Esta associação foi ainda maior quando
infecções de corrente sanguínea e CIM ≥ 2 µg/mL foram avaliadas. Da mesma forma, valores
elevados de CIM para vancomicina (≥ 1,5 µg/mL) foram preditivos de falha terapêutica,
independentemente do método de sensibilidade empregado ou da fonte da infecção. Entretanto,
apenas dois estudos inclusos na meta-análise utilizaram o método padrão-ouro, ou seja,
microdiluição em caldo, na determinação da CIM de vancomicina. Levando em consideração
estes dados, 20% dos isolados de ORSA do presente estudo teriam maior risco de evoluir para
óbito (CIM ≥ 2 µg/mL pelo Etest®), e 72,5% maior risco de insucesso clínico com o uso da
vancomicina (CIM ≥ 1,5 µg/mL pelo Etest®). Porém, na mesma amostragem, utilizando-se o
padrão-ouro, ou seja, a microdiluição em caldo (ajustando-se os valores de CIM > 1 µg/mL para
1,5 µg/mL), apenas 4% dos isolados apresentaram CIM para vancomicina ≥ 1,5 µg/mL. Dessa
forma, faltam, na literatura, estudos que deem subsídios suficientes para a avaliação do
desfecho clínico em relação às CIMs de vancomicina determinadas pela metodologia padrãoouro, recomendada pelas maiores organizações de padronização do teste de sensibilidade aos
antimicrobianos no mundo (CLSI e EUCAST).
Outro interessante estudo, conduzido por Holmes e colaboradores (2011), mostrou que a
mortalidade dos pacientes tratados com oxacilina ou meticilina para infecções por OSSA com
CIM de 2 µg/mL para vancomicina tinham aumento da mortalidade em relação aos pacientes
infeção por OSSA com CIM < 2 µg/mL. Este estudo sugere que independente do antimicrobiano
utilizado para o tratamento, a resposta a β-lactâmicos ou à vancomicina mostra-se inferior,
provavelmente, devido a um espessamento da parede bacteriana, tornando-a menos susceptível
a outros antimicrobianos.
86
DISCUSSÃO
A falta de dados acurados para a verificação de sensibilidade a outros grupos de
antimicrobianos presentes no arsenal terapêuticos de infecções causadas por S. aureus não
permitiu a exploração de sua relação com os tipos de SCCmec presentes nesta instituição,
assim como sua relação com a substituição clonal e possível repercussão em outras opções
terapêuticas. Outra limitação do estudo foi a ausência de dados sobre o desfecho clínico dos
episódios de infecção de corrente sanguínea aqui apresentados e do consumo de glicopeptídeos
na instituição em questão e sua relação com a presença ou não de creep.
A presente investigação possibilitou a avaliação do comportamento epidemiológico de
isolados clínicos de S. aureus resistentes à oxacilina e a determinação da evolução temporal de
suas CIMs durante o período do estudo. Este estudo contribui para o conhecimento atual do
comportamento dos isolados ORSA, e confirma a importância da metodologia na determinação
da CIM para a avaliação do fenômeno de creep e a evidência de uma modificação no perfil de
clusters epidêmicos de ORSA nesta instituição, principalmente a partir de 2006 com uma
crescente diversidade local de linhagens de ORSA no decorrer dos anos do estudo. A
substituição do SCCmec III, como principal elemento dos isolados de ORSA desta instituição por
isolados carreadores dos SCCmec I e II foi evidenciada e correlacionada com a tendência a
valores crescentes nas CIMs de vancomicina, mas não de teicoplanina, dos isolados de ORSA
no decorrer dos anos pela técnica de microdiluição em caldo.
87
CONCLUSÕES
6 - CONCLUSÕES
Foi observado um aumento significativo nas CIMs para vancomicina dos isolados ORSA
provenientes de ICS, no período de oito anos no Hospital São Paulo, principalmente
após 2006. Entretanto, o mesmo não foi observado para teicoplanina;
A microdiluição em caldo utilizando variações sutis nas concentrações de vancomicina
foi o único método capaz de identificar o fenômeno de creep, ao contrário do Etest®.
Portanto, o presente estudo confirma a importância da técnica do teste de sensibilidade
na avaliação do fenômeno de creep para os glicopetídeos em isolados ORSA;
Durante os quatro primeiros anos de estudo (2002-2005) o CEB (SCCmec III) foi o clone
mais prevalente e disseminado entre os isolados de ORSA no Hospital São Paulo;
porém, sua frequência diminuiu consideravelmente nos quatro anos seguintes do estudo
(2006-2009);
Uma modificação nos clones epidêmicos de ORSA no Hospital São Paulo foi observada
durante os oito anos de estudo, principalmente pela substituição de isolados ORSA
carreadores de SCCmec III (CEB) por isolados carreadores dos SCCmec I (clone K) e II
(clone NY/J) evidenciada, principalmente, no período de 2006-2009;
A inserção e a disseminação de clones carreadores de SCCmec I e II contribuiram para
a elevação nas CIMs para vancomicina, mas não para teicoplanina, nos isolados de
ORSA no Hospital São Paulo;
88
CONCLUSÕES
Nos primeiros quatro anos do estudo (P1), o CEB (SCCmec III) foi o mais frequente,
sendo 88% das amostras ORSA agrupadas nesse genótipo. Por outro lado, em P2, há
uma diminuição na frequência do CEB com inserção de novos grupos clonais e uma
maior variedade genética entre os ORSA que carreavam SCCmec III. Entretanto, a
distribuição do SCCmec IV é majoritariamente clonal, sendo similar ao clone pediátrico;
89
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ahlstrand E, Svensson K, Persson L, Tidefelt U, Söderquist B. 2011. Glycopeptide resistance in
coagulase-negative staphylococci isolated in blood cultures from patients with hematological
malignancies during three decades. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30(11): 1349-1354.
Aires de Sousa M, Crisóstomo MI, Sanches IS, Wu JS, Fuzhong J, Tomasz A, de Lencastre H.
2003. Frequent recovery of a single clonal type of multidrug-resistant Staphylococcus aureus
from patients in two hospitals in Taiwan and China. J Clin Microbiol. 41(1): 159-163.
Aires de Sousa M, de Lencastre H, Santos Sanches I, Kikuchi K, Totsuka K, Tomasz A. 2000.
Similarity of antibiotic resistance patterns and molecular typing properties of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus isolates widely spread in hospitals in New York City and in a hospital in
Tokyo, Japan. Microb Drug Resist. 6(3): 253-258.
Aires de Sousa M, Miragaia M, Sanches IS, Avila S, Adamson I, Casagrande ST, Brandileone
MC, Palacio R, Dell'Acqua L, Hortal M, Camou T, Rossi A, Velazquez-Meza ME, Echaniz-Aviles
G, Solorzano-Santos F, Heitmann I, de Lencastre H. 2001. Three-year assessment of methicillinresistant Staphylococcus aureus clones in Latin America from 1996 to 1998. J Clin Microbiol.
39(6): 2197-2205.
Aligholi M, Emaneini M, Jabalameli F, Shahsavan S, Dabiri H, Sedaght H. 2008. Emergence of
high-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus in the Imam Khomeini Hospital in Tehran.
Med Princ Pract. 17(5): 432-434.
Alós JI, García-Cañas A, García-Hierro P, Rodríguez-Salvanés F. 2008. Vancomycin MICs did
not creep in Staphylococcus aureus isolates from 2002 to 2006 in a setting with low vancomycin
usage. J Antimicrob Chemother. 62(4): 773-775.
Amorim ML, Aires de Sousa M, Sanches IS, Sá-Leão R, Cabeda JM, Amorim JM, de Lencastre
H. 2002. Clonal and antibiotic resistance profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) from a Portuguese hospital over time. Microb Drug Resist. 8(4): 301-309.
Amorim ML, Faria NA, Oliveira DC, Vasconcelos C, Cabeda JC, Mendes AC, Calado E, Castro
AP, Ramos MH, Amorim JM, de Lencastre H. 2007. Changes in the clonal nature and antibiotic
90
resistance profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with spread
of the EMRSA-15 clone in a tertiary care Portuguese hospital. J Clin Microbiol. 45(9): 2881-2888.
Andrade-Baiocchi S, Tognim MC, Baiocchi OC, Sader HS. 2003. Endocarditis due to
glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus: case report and strain characterization. Diagn
Microbiol Infect Dis. 45(2): 149-152.
Appelbaum PC. 2007. Reduced glycopeptide susceptibility in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA). Int J Antimicrob Agents. 30(5): 398-408.
Azimian A, Havaei SA, Fazeli H, Naderi M, Ghazvini K, Samiee SM, Soleimani M, Peerayeh SN.
2012. Genetic characterization of a vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolate from the
respiratory tract of a patient in a university hospital in northeastern Iran. J Clin Microbiol. 50(11):
3581-3585.
Baggett HC, Hennessy TW, Leman R, Hamlin C, Bruden D, Reasonover A, Martinez P, Butler
JC. 2003. An outbreak of community-onset methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin
infections in southwestern Alaska. Infect Control Hosp Epidemiol. 24(6): 397-402.
Barrett FF, McGehee RF Jr, Finland M. 1968. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus at
Boston City Hospital. Bacteriologic and epidemiologic observations. N Engl J Med. 279(9): 441448.
Becker AP, Santos O, Castrucci FM, Dias C, D'Azevedo PA. 2012. First report of methicillinresistant Staphylococcus aureus Cordobes/Chilean clone involved in nosocomial infections in
Brazil. Epidemiol Infect. 140(8): 1372-1375.
Biavasco F, Vignaroli C, Varaldo PE. 2000. Glycopeptide resistance in coagulase-negative
staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 19(6): 403-417.
Bierbaum G, Fuchs K, Lenz W, Szekat C, Sahl HG. 1999. Presence of Staphylococcus aureus
with reduced susceptibility to vancomycin in Germany. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 18(10):
691-696.
91
Boyle-Vavra S, Daum RS. 2007. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus
aureus: the role of Panton-Valentine leukocidin. Lab Invest. 87(1): 3-9.
Boyle-Vavra S, Ereshefsky B, Wang CC, Daum RS. 2005. Successful multiresistant communityassociated methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineage from Taipei, Taiwan, that carries
either the novel Staphylococcal chromosome cassette mec (SCCmec) type VT or SCCmec type
IV. J Clin Microbiol. 43(9): 4719-4730. Erratum in: J Clin Microbiol. 2005. 43(12): 6223.
Brown DF, Edwards DI, Hawkey PM, Morrison D, Ridgway GL, Towner KJ, Wren MW;Joint
Working Party of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy; Hospital Infection Society;
Infection Control Nurses Association. 2005. Guidelines for the laboratory diagnosis and
susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J Antimicrob
Chemother. 56(6): 1000-1018.
Brumfitt W, Hamilton-Miller J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. 1989. N Engl J Med.
320(18): 1188-1196.
Bures S, Fishbain JT, Uyehara CF, Parker JM, Berg BW. 2000. Computer keyboards and faucet
handles as reservoirs of nosocomial pathogens in the intensive care unit. Am J Infect Control.
28(6): 465-471.
Busato CR, Gabardo J, Leão MT. 2006. The evolution of the resistance of Staphylococcus
aureus found on healthcare workers correlated with local consumption of antibiotics. Braz J Infect
Dis. 10(3): 185-190.
Caboclo RM, Cavalcante FS, Pontes Iorio NL, Schuenck RP, Olendzki AN, Felix MJ, Chamon
RC, Netto Dos Santos KR. 2012. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Rio de Janeiro
hospitals: Dissemination of the USA400/ST1 and USA800/ST5 SCCmec type IV and
USA100/ST5 SCCmec type II lineages in a public institution and polyclonal presence in a private
one. Am J Infect Control. Dec 20. doi:pii: S0196-6553(12)01204-7.10.1016/j.ajic.2012.08.008.
[Epub ahead of print].
92
Cardo D, Horan T, Andrus M, et al. 2004. National nosocomial infections surveillance (NNIS)
system report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J
Infect Control. 32(8): 470-485.
Carleton HA, Diep BA, Charlebois ED, Sensabaugh GF, Perdreau-Remington F. 2004.
Community-adapted methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA): population dynamics of
an expanding community reservoir of MRSA. J Infect Dis. 190(10): 1730-1738.
Carvalho KS, Mamizuka EM, Gontijo Filho PP. 2010. Methicillin/Oxacillin-resistant
Staphylococcus aureus as a hospital and public health threat in Brazil. Braz J Infect Dis. 14(1):
71-76.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 2000. Staphylococcus aureus with reduced
susceptibility to vancomycin-Illinois, 1999. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 48(51-52): 1165-1167.
Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Vancomycin resistant Staphylococcus aureusPennsylvania. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 51: 902.
Centers for Disease Control and Prevention. 2004. Vancomycin resistant Staphylococcus aureusNew York, 2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 53: 322-323.
Chambers HF, Deleo FR. 2009. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era.
Nat Rev Microbiol. 7(9): 629-641.
Chambers HF. 1997. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and
clinical implications. Clin Microbiol Rev. 10(4): 781-791.
Chang S, Sievert DM, Hageman JC, Boulton ML, Tenover FC, Downes FP, Shah S, Rudrik JT,
Pupp GR, Brown WJ, Cardo D, Fridkin SK, Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus
Investigative Team. 2003. Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing
the vanA resistance gene. N Engl J Med. 348(14): 1342-1347.
Chongtrakool P, Ito T, Ma XX, Kondo Y, Trakulsomboon S, Tiensasitorn C, Jamklang M, Chavalit
T, Song JH, Hiramatsu K. 2006. Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated in 11 Asian countries: a proposal for a
new nomenclature for SCCmec elements. Antimicrob Agents Chemother. 50(3): 1001-1012.
93
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2009. Methods for dilution antimicrobial susceptibility
tests for bacteria that grow aerobically. Approved guideline M7-A8. CLSI, Wayne, PA.
Clinical Laboratory Standards Institute. 2006. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing: sixteenth Informational Supplement. Clinical Laboratory Standards Institute,
Wayne, PA.
Clinical Laboratory Standards Institute. 2012. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing twenth-two Informational Supplement. Clinical Laboratory Standards
Institute, Wayne, PA.
Cohen ML. 1986. Staphylococcus aureus: biology, mechanisms of virulence, epidemiology. J
Pediatr.108(5 Pt 2): 796-799.
Conceição T, Aires-de-Sousa M, Füzi M, Tóth A, Pászti J, Ungvári E, van Leeuwen WB, van
Belkum A, Grundmann H, de Lencastre H. 2007. Replacement of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clones in Hungary over time: a 10-year surveillance study. Clin Microbiol
Infect. 13(10): 971-979.
Conterno LO. Avaliação dos aspectos epidemiológicos e evolutivos das bacteremias por
Staphylococcus aureus resistente à oxacilina. Comparação entre dois períodos: 1991-1992 e
1995-1996. Tese de Doutorado - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). 1999, p. 110.
Crawford PA, Hand MF, Richards SJ, Masterton RG. 1994. Septicaemia caused by a catalasenegative Staphylococcus aureus. J Hosp Infect. 27(4): 320-322.
Cuevas O, Cercenado E, Bouza E, Castellares C, Trincado P, Cabrera R, Vindel A; Spanish
Group for the Study of Staphylococcus. 2007. Molecular epidemiology of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in Spain: a multicentre prevalence study (2002). Clin Microbiol Infect.
13(3): 250-256.
Cui L, Murakami H, Kuwahara-Arai K, Hanaki H, Hiramatsu K. 2000. Contribution of a thickened
cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed by
Staphylococcus aureus Mu50. Antimicrob Agents Chemother. 44(9): 2276-2285.
94
da Silva EC, Samico TM, Cardoso RR, Rabelo MA, Bezerra Neto AM, de Melo FL, de Souza
Lopes AC, da Silva Aca I, Maciel MA. 2012. Colonization by Staphylococcus aureus among the
nursing staff of a teaching hospital in Pernambuco]. Rev Esc Enferm USP. 46(1): 132-137.
de A Trindade P, Pacheco RL, Costa SF, Rossi F, Barone AA, Mamizuka EM, Levin AS. 2005.
Prevalence of SCCmec type IV in nosocomial bloodstream isolates of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 43(7): 3435-3437.
de Almeida Filho E, Nader Filho A. 2000. Occurrence of Staphylococcus aureus in "frescal" type
cheese. Rev Saude Publica. 34(6): 578-580.
de Lencastre H, de Lencastre A, Tomasz A. 1996. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
isolates recovered from a New York City hospital: analysis by molecular fingerprinting techniques.
J Clin Microbiol. 34(9): 2121-2124.
de Miranda OP, Silva-Carvalho MC, Ribeiro A, Portela F, Cordeiro RP, Caetano N, Vidal CF,
Figueiredo AM. 2007. Emergence in Brazil of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates
carrying SCCmec IV that are related genetically to the USA800 clone. Clin Microbiol Infect.
13(12): 1165-1172.
DeLeo FR, Otto M, Kreiswirth BN, Chambers HF. 2010. Community-associated meticillinresistant Staphylococcus aureus. Lancet. 375(9725): 1557-1568.
Dezfulian A, Aslani MM, Oskoui M, Farrokh P, Azimirad M, Dabiri H, Salehian MT, Zali MR. 2012.
Identification and characterization of a high vancomycin-resistant Staphylococcus aureus
harboring vanA gene cluster isolated from diabetic foot ulcer. Iran J Basic Med Sci. 15(2): 803806.
Diekema DJ, Pfaller MA, Schmitz FJ, Smayevsky J, Bell J, Jones RN, Beach M; SENTRY
Partcipants Group. 2001. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of
occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada,
Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program, 1997-1999. Clin Infect Dis. 32(Suppl 2): S114-S132.
95
Dominguez MA, de Lencastre H, Linares J, Tomasz A. 1994. Spread and maintenance of a
dominant methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone during an outbreak of MRSA
disease in a Spanish hospital. J Clin Microbiol. 32(9):2081-2087.
Drusano GL, Preston SL, Hardalo C, Hare R, Banfield C, Andes D, Vesga O, Craig WA. 2001.
Use of preclinical data for selection of a phase II/III dose for evernimicin and identification of a
preclinical MIC breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 45(1): 13-22.
Edwards B, Milne K, Lawes T, Cook I, Robb A, Gould IM. 2012. Is vancomycin MIC "creep"
method dependent? Analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus susceptibility trends
in blood isolates from North East Scotland from 2006 to 2010. J Clin Microbiol. 50(2): 318-325.
Ena J, Dick RW, Jones RN, Wenzel RP. 1993. The epidemiology of intravenous vancomycin
usage in a university hospital. A 10-year study. JAMA. 269(5): 598-602.
Fitch L, Johnson AP. 1998. Reduced susceptibility to teicoplanin in a methicillin-resistant strain of
Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 41(5): 578.
Fortes CQ, Espanha CA, Bustorff FP, Zappa BC, Ferreira AL, Moreira RB, Pereira NG, Fowler
VG Jr, Deshmukh H. 2008. First reported case of infective endocarditis caused by communityacquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus not associated with healthcare contact in
Brazil. Braz J Infect Dis. 12(6): 541-543.
Fukuta Y, Cunningham CA, Harris PL, Wagener MM, Muder RR. 2012. Identifying the risk factors
for hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection among
patients colonized with MRSA on admission. Infect Control Hosp Epidemiol. 33(12): 1219-1225.
Gales AC, Sader HS, Ribeiro J, Zoccoli C, Barth A, Pignatari AC. 2009. Antimicrobial
susceptibility of gram-positive bacteria isolated in Brazilian hospitals participating in the SENTRY
Program (2005-2008). Braz J Infect Dis. 13(2): 90-98.
García-Álvarez L, Holden MT, Lindsay H, Webb CR, Brown DF, Curran MD, Walpole E, Brooks
K, Pickard DJ, Teale C, Parkhill J, Bentley SD, Edwards GF, Girvan EK, Kearns AM, Pichon B,
Hill RL, Larsen AR, Skov RL, Peacock SJ, Maskell DJ, Holmes MA. 2011. Meticillin-resistant
Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the
UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis. 11(8): 595-603.
96
Gasch O, Camoez M, Dominguez MA, Padilla B, Pintado V, Almirante B, Molina J, LopezMedrano F, Ruiz E, Martinez JA, Bereciartua E, Rodriguez-Lopez F, Fernandez-Mazarrasa C,
Goenaga MA, Benito N, Rodriguez-Baño J, Espejo E, Pujol M; on behalf of REIPI/GEIH Study
Groups. Predictive factors for mortality in patients with methicillin-resistant Staphylococcus
aureus bloodstream infection: impact on outcome of host, microorganism and therapy. Clin
Microbiol Infect. 2012 Nov 22. doi: 10.1111/1469-0691.12108. [Epub ahead of print].
Gelatti LC, Sukiennik T, Becker AP, Inoue FM, do Carmo MS, Castrucci FM, Pignatari AC,
Ribeiro LC, Bonamigo RR, d'Azevedo PA. 2009. Sepsis due to community-acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus in southern Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 42(4): 458-460.
Gomes AR, Sanches IS, Aires de Sousa M, Castañeda E, de Lencastre H. 2001. Molecular
epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Colombian hospitals: dominance
of a single unique multidrug-resistant clone. Microb Drug Resist. 7(1): 23-32.
Hackbarth CJ, Chambers HF. 1989. Methicillin-resistant staphylococci: detection methods and
treatment of infections. Antimicrob Agents Chemother. 33(7): 995-999.
Hanaki H, Hiramatsu K. 1999. Combination effect of teicoplanin and various antibiotics against
hetero-VRSA and VRSA. Kansenshogaku Zasshi. 73(10): 1048-1053.
Hanaki H, Kuwahara-Arai K, Boyle-Vavra S, Daum RS, Labischinski H, Hiramatsu K. 1998.
Activated cell-wall synthesis is associated with vancomycin resistance in methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clinical strains Mu3 and Mu50. J Antimicrob Chemother. 42(2): 199-209.
Hidayat LK, Hsu DI, Quist R, Shriner KA, Wong-Beringer A. 2006. High-dose vancomycin therapy
for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections: efficacy and toxicity. Arch Intern Med.
166(19): 2138-2144.
Higuchi W, Takano T, Teng LJ, Yamamoto T. 2008. Structure and specific detection of
staphylococcal cassette chromosome mec type VII. Biochem Biophys Res Commun. 377(3): 752756.
97
Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. 1997b. Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob
Chemother. 40(1): 135-136.
Hiramatsu K, Katayama Y, Yuzawa H, Ito T. 2002. Molecular genetics of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Int J Med Microbiol. 292(2): 67-74.
Hisata K, Kuwahara-Arai K, Yamanoto M, Ito T, Nakatomi Y, Cui L, Baba T, Terasawa M,
Sotozono C, Kinoshita S, Yamashiro Y, Hiramatsu K. 2005. Dissemination of methicillin-resistant
staphylococci among healthy Japanese children. J Clin Microbiol. 43(7): 3364-3372.
Ho PL, Lo PY, Chow KH, Lau EH, Lai EL, Cheng VC, Kao RY. 2010. Vancomycin MIC creep in
MRSA isolates from 1997 to 2008 in a healthcare region in Hong Kong. J Infect. 60(2): 140-145.
Holmes NE, Turnidge JD, Munckhof WJ, Robinson JO, Korman TM, O'Sullivan MV, Anderson TL,
Roberts SA, Gao W, Christiansen KJ, Coombs GW, Johnson PD, Howden BP. 2011. Antibiotic
choice may not explain poorer outcomes in patients with Staphylococcus aureus bacteremia and
high vancomycin minimum inhibitory concentrations. J Infect Dis. 204(3): 340-347.
Huang FL, Chen PY, Ma JS, Yu HW, Lu KC, Chi CS, Lau YJ, Peng HC. 2002. Clinical experience
of managing empyema thoracic in children. J Microbiol Immunol Infect. 35(2): 115-120.
Hübscher J, Jansen A, Kotte O, Schäfer J, Majcherczyk PA, Harris LG, Bierbaum G, Heinemann
M, Berger-Bächi B. 2007. Living with an imperfect cell wall: compensation of femAB inactivation
in Staphylococcus aureus. BMC Genomics. 8: 307.
Inoue FM. Infecções da corrente sanguínea por Staphylococcus aureus resistente à oxacilina no
Hospital São Paulo (2002-2005): fatores de risco e diversidade genética. Dissertação de
Mestrado - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). 2008. p. 87.
International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome
Elements (IWG-SCC). 2009. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec
(SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrob Agents Chemother.
53(12): 4961-4967.
98
Ito T, Hiramatsu K. 1998. Acquisition of methicillin resistance and progression of multiantibiotic
resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Yonsei Med J. 39(6): 526-533.
Ito T, Katayama Y, Asada K, Mori N, Tsutsumimoto K, Tiensasitorn C, Hiramatsu K. 2001.
Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in
the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother.
45(5): 1323-1336.
Ito T, Katayama Y, Hiramatsu K. 1999. Cloning and nucleotide sequence determination of the
entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents
Chemother. 43(6): 1449-1458.
Ito T, Kuwahara K, Hiramatsu K. 2007. Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec)
analysis of MRSA. Methods Mol Biol. 391: 87-102.
Ito T, Ma XX, Takeuchi F, Okuma K, Yuzawa H, Hiramatsu K. 2004. Novel type V staphylococcal
cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC.
Antimicrob Agents Chemother. 48(7): 2637-2651.
Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K. 2003. Insights on antibiotic resistance of
Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat. 6(1):
41-52.
Jessen O, Rosendal K, Bülow P, Faber V, Eriksen KR. 1969. Changing staphylococci and
staphylococcal infections. A ten-year study of bacteria and cases of bacteremia. N Engl J Med.
281(12): 627-635.
Jevons MP. 1961. “Celbenin” - resistant staphylococci. British Medical Journal. 1: 124-125.
Jones RN. 2006. Microbiological features of vancomycin in the 21st century: minimum inhibitory
concentration creep, bactericidal/static activity, and applied breakpoints to predict clinical
outcomes or detect resistant strains. Clin Infect Dis. 42(Suppl 1):S13-S24.
99
Kallen AJ, Mu Y, Bulens S, Reingold A, Petit S, Gershman K, Ray SM, Harrison LH, Lynfield R,
Dumyati G, Townes JM, Schaffner W, Patel PR, Fridkin SK. 2010. Active Bacterial Core
surveillance (ABCs) MRSA Investigators of the Emerging Infections Program. Health careassociated invasive MRSA infections, 2005-2008. JAMA. 304(6): 641-648.
Kantzanou M, Tassios PT, Tseleni-Kotsovili A, Legakis NJ, Vatopoulos AC. 1999. Reduced
susceptibility to vancomycin of nosocomial isolates of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. J Antimicrob Chemother. 43(5): 729-731.
Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. 2000. A new class of genetic element, staphylococcus cassette
chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents
Chemother. 44(6): 1549-1555.
Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. 2001. Genetic organization of the chromosome region
surrounding mecA in clinical staphylococcal strains: role of IS431-mediated mecI deletion in
expression of resistance in mecA-carrying, low-level methicillin-resistant Staphylococcus
haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother. 45(7): 1955-1963.
Kehrmann J, Kaase M, Szabados F, Gatermann SG, Buer J, Rath PM, Steinmann J. 2011.
Vancomycin MIC creep in MRSA blood culture isolates from Germany: a regional problem? Eur J
Clin Microbiol Infect Dis. 30(5): 677-683.
Kirst HA, Thompson DG, Nicas TI. 1998. Historical yearly usage of vancomycin. Antimicrob
Agents Chemother. 42(5): 1303-1304.
Kloos WE, Bannerman TL. 1994. Update on clinical significance of coagulase-negative
staphylococci. Clin Microbiol Rev. 7(1): 117-140.
Kloos WE. 1997. Taxonomy and systematics of staphylococci indigenous to humans. The
Staphylococci In Human Disease New York, Churchill Livingstone. p. 113-38.
Kluytmans-Vandenbergh MF, Kluytmans JA. 2006. Community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus: current perspectives. Clin Microbiol Infect. 12(Suppl 1):9-15.
100
Kollef MH. 2007. Limitations of vancomycin in the management of resistant staphylococcal
infections. Clin Infect Dis. 45(Suppl 3):S191-S195.
Kondo Y, Ito T, Ma XX, Watanabe S, Kreiswirth BN, Etienne J, Hiramatsu K. 2007. Combination
of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid
identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrob Agents
Chemother. 51(1): 264-274.
Konemam EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Jr WC. 2001. Coccos GramPositivos: Estafilococos e microrganismos relacionados In: Diagnóstico Microbiológico. Texto e
atlas colorido. 5. ed. Rio de Janeiro: Medsi. p. 551-588.
Korn GP, Martino MD, Mimica IM, Mimica LJ, Chiavone PA, Musolino LR. 2001. High frequency
of colonization and absence of identifiable risk factors for methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA) in intensive care units in Brazil. Braz J Infect Dis. 5(1): 1-7.
Krzysztoń-Russjan J, Gniadkowski M, Połowniak-Pracka H, Hagmajer E, Hryniewicz W. 2002.
The first Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to vancomycin in Poland. J
Antimicrob Chemother. 50(6): 1065-1069.
Kuti JL, Kiffer CR, Mendes CM, Nicolau DP. 2008. Pharmacodynamic comparison of linezolid,
teicoplanin and vancomycin against clinical isolates of Staphylococcus aureus and coagulasenegative staphylococci collected from hospitals in Brazil. Clin Microbiol Infect. 14(2): 116-123.
Lamaro-Cardoso J, Castanheira M, de Oliveira RM, e Silva SA, Pignatari AC, Mendes RE,
Pimenta FC, Andrade AL. 2007. Carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in
children in Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis. 57(4): 467-470.
Li S, Skov RL, Han X, Larsen AR, Larsen J, Sørum M, Wulf M, Voss A, Hiramatsu K, Ito T. 2011.
Novel types of staphylococcal cassette chromosome mec elements identified in clonal complex
398 methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother. 55(6):
3046-3050.
101
Lodise TP, Graves J, Evans A, Graffunder E, Helmecke M, Lomaestro BM,Stellrecht K. 2008.
Relationship between vancomycin MIC and failure among patients with methicillin-resistant
Staphylococcus aureus bacteremia treated with vancomycin. Antimicrob Agents Chemother.
52(9): 3315-3320.
Lowy FD. 1998. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med. 339(8): 520-532.
Lowy FD. 2003. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. J Clin Invest.
111(9): 1265-1273.
Ma XX, Ito T, Tiensasitorn C, Jamklang M, Chongtrakool P, Boyle-Vavra S, Daum RS, Hiramatsu
K. 2002. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in communityacquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agents Chemother.
46(4): 1147-1152.
Ma XX, Wang EH, Liu Y, Luo EJ. 2011. Antibiotic susceptibility of coagulase-negative
staphylococci (CoNS): emergence of teicoplanin-non-susceptible CoNS strains with inducible
resistance to vancomycin. J Med Microbiol. 60(Pt 11): 1661-1668.
Marra AR, Camargo LF, Pignatari AC, Sukiennik T, Behar PR, Medeiros EA, Ribeiro J, Girão E,
Correa L, Guerra C, Brites C, Pereira CA, Carneiro I, Reis M, de Souza MA, Tranchesi R, Barata
CU, Edmond MB; Brazilian SCOPE Study Group. 2011. Nosocomial bloodstream infections in
Brazilian hospitals: analysis of 2,563 cases from a prospective nationwide surveillance study. J
Clin Microbiol. 49(5): 1866-1871.
McDougal LK, Steward CD, Killgore GE, Chaitram JM, McAllister SK, Tenover FC. 2003. Pulsedfield gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the
United States: establishing a national database. J Clin Microbiol. 41(11): 5113-5120.
Mediavilla JR, Chen L, Mathema B, Kreiswirth BN. 2012. Global epidemiology of communityassociated methicillin resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA). Curr Opin Microbiol. 15(5):
588-595.
102
Melo MC, Silva-Carvalho MC, Ferreira RL, Coelho LR, Souza RR, Gobbi CN, Rozenbaum R,
Solari CA, Ferreira-Carvalho BT, Figueiredo AM. 2004. Detection and molecular characterization
of a gentamicin-susceptible, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone in Rio de
Janeiro that resembles the New York/Japanese clone. J Hosp Infect. 58(4): 276-285.
Melter O, Aires de Sousa M, Urbásková P, Jakubů V, Zemlicková H, de Lencastre H. 2003.
Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the Czech
Republic. J Clin Microbiol. 41(11): 4998-5005.
Moet GJ, Jones RN, Biedenbach DJ, Stilwell MG, Fritsche TR. 2007. Contemporary causes of
skin and soft tissue infections in North America, Latin America, and Europe: report from the
SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1998-2004). Diagn Microbiol Infect Dis. 57(1): 713.
Moise-Broder PA, Forrest A, Birmingham MC, Schentag JJ. 2004a. Pharmacodynamics of
vancomycin and other antimicrobials in patients with Staphylococcus aureus lower respiratory
tract infections. Clin Pharmacokinet. 43(13): 925-942.
Moran GJ, Mount J. 2003. Update on emerging infections: news from the Centers for Disease
Control and Prevention. Ann Emerg Med. 41(1): 148-151.
Murchan S, Kaufmann ME, Deplano A, de Ryck R, Struelens M, Zinn CE, Fussing V,
Salmenlinna S, Vuopio-Varkila J, El Solh N, Cuny C, Witte W, Tassios PT, Legakis N, van
Leeuwen W, van Belkum A, Vindel A, Laconcha I, Garaizar J, Haeggman S, Olsson-Liljequist B,
Ransjo U, Coombes G, Cookson B. 2003. Harmonization of pulsed-field gel electrophoresis
protocols for epidemiological typing of strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a
single approach developed by consensus in 10 European laboratories and its application for
tracing the spread of related strains. J Clin Microbiol. 41(4): 1574-1585.
Naimi TS, LeDell KH, Como-Sabetti K, Borchardt SM, Boxrud DJ, Etienne J, Johnson SK,
Vandenesch F, Fridkin S, O'Boyle C, Danila RN, Lynfield R. 2003. Comparison of communityand health care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. JAMA. 290(22):
2976-2984.
103
Neoh HM, Hori S, Komatsu M, Oguri T, Takeuchi F, Cui L, Hiramatsu K. 2007. Impact of reduced
vancomycin susceptibility on the therapeutic outcome of MRSA bloodstream infections. Ann Clin
Microbiol Antimicrob. 6:13.
Nimmo GR, Schooneveldt J, O'Kane G, McCall B, Vickery A. 2000. Community acquisition of
gentamicin-sensitive methicillin-resistant Staphylococcus aureus in southeast Queensland,
Australia. J Clin Microbiol. 38(11): 3926-3931.
Nunes AP, Schuenck RP, Bastos CC, Magnanini MM, Long JB, Iorio NL, Santos KR. 2007.
Heterogeneous resistance to vancomycin and teicoplanin among Staphylococcus spp. isolated
from bacteremia. Braz J Infect Dis. 11(3): 345-350. Erratum in: Braz J Infect Dis. 2007.11(5): 528.
O'Brien FG, Coombs GW, Pearson JC, Christiansen KJ, Grubb WB. 2005. Type V staphylococcal
cassette chromosome mec in community staphylococci from Australia. Antimicrob Agents
Chemother. 49(12): 5129-5132.
Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, Grubb WB, Bell JM, O'Brien FG, Coombs GW, Pearman JW,
Tenover FC, Kapi M, Tiensasitorn C, Ito T, Hiramatsu K. 2002. Dissemination of new methicillinresistant Staphylococcus aureus clones in the community. J Clin Microbiol. 40(11): 4289-4294.
Oliveira DC, Milheiriço C, de Lencastre H. 2006. Redefining a structural variant of staphylococcal
cassette chromosome mec, SCCmec type VI. Antimicrob Agents Chemother. 50(10): 3457-3459.
Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H. 2001. The evolution of pandemic clones of methicillinresistant Staphylococcus aureus: identification of two ancestral genetic backgrounds and the
associated mec elements. Microb Drug Resist. 7(4): 349-361.
Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H. 2002. Secrets of success of a human pathogen:
molecular evolution of pandemic clones of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet
Infect Dis. 2(3): 180-189.
Oliveira GA, Faria JB, Levy CE, Mamizuka EM. 2001b. Characterization of the Brazilian endemic
clone of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from hospitals throughout Brazil.
Braz J Infect Dis. 5(4): 163-170.
104
Paschoal L. Epidemiologia molecular de infecções da corrente sanguínea por Staphylococcus
aureus resistente à oxacilina: Estudo multicêntrico (Projeto SCOPE Brasil). Dissertação de
Mestrado - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). 2010, p. 115.
Pastagia M, Kleinman LC. Lacerda de la Cruz EG, Jenkins SG. 2012. Predicting risk for death
from MRSA bacteremia. Emerg Infect Dis.18(7): 1072-1080.
Peacock SJ, de Silva I, Lowy FD. 2001. What determines nasal carriage of Staphylococcus
aureus? Trends Microbiol. 9(12): 605-610.
Pedro RJ, Branchini MLM. Estafilococcias. In. Veronesi R, Focaccia R. Tratado de Infectologia.
São Paulo: Atheneu, 1996: 654-665.
Picão RC, Sader HS, Jones RN, Andrade SS, Gales AC. Analysis of resistance and vancomycin
"reverse creep" in Latin American Staphylococcus aureus: ten-year report of the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (1997-2006). In: European Congress of Clinical Microbiology
and Infectious Diseases, 2008, Barcelona. European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases, 2008.
Piechowicz L, Garbacz K, Budzyńska A, Dąbrowska-Szponar M. 2012. Outbreak of bullous
impetigo caused by Staphylococcus aureus strains of phage type 3C/71 in a maternity ward
linked to nasal carriage of a healthcare worker. Eur J Dermatol. 22(2): 252-255.
Ploy MC, Grélaud C, Martin C, de Lumley L, Denis F. 1998. First clinical isolate of vancomycinintermediate Staphylococcus aureus in a French hospital. Lancet. 351(9110): 1212.
Poston SM. 1966. Cellular location of the genes controlling penicillinase production and
resistance to streptomycin and tetracycline in a strain of Staphylococcus aureus. Nature.
210(5038): 802-804.
Potel C, Alvarez M, Alvarez P, Otero I, Fluiters E. 2007.Evolution, antimicrobial susceptibility and
assignment to international clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated over a
9-year period in two Spanish hospitals. Clin Microbiol Infect. 13(7): 728-730.
105
Price J, Atkinson S, Llewelyn M, Paul J. 2009. Paradoxical relationship between the clinical
outcome of Staphylococcus aureus bacteremia and the minimum inhibitory concentration of
vancomycin. Clin Infect Dis. 48(7): 997-998.
Rammelkamp C.H. & Maxton T. 1942. Resistance of Staphylococcus aureus to the action of
penicilin. Proc. Royal Soc. Exper. Biol. Med. 51: 386-389.
Razera F, De Stefani S, Bonamigo RR, Olm GS, Dias CA, Narvaez GA. 2009. CA-MRSA in
furunculosis: case report of southern Brazil. An Bras Dermatol. 84(5): 515-518.
Reinert C, McCulloch JA, Watanabe S, Ito T, Hiramatsu K, Mamizuka EM. 2008. Type IV
SCCmec found in decade old Brazilian MRSA isolates. Braz J Infect Dis. 12(3): 213-216.
Reynolds R, Hope R, Warner M, MacGowan AP, Livermore DM, Ellington MJ; BSAC Extended
Working Party on Resistance Surveillance. 2012. Lack of upward creep of glycopeptide MICs for
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolated in the UK and Ireland 2001-07. J
Antimicrob Chemother. 67(12): 2912-2918.
Ribeiro A, Dias C, Silva-Carvalho MC, Berquó L, Ferreira FA, Santos RN, Ferreira-Carvalho BT,
Figueiredo AM. 2005. First report of infection with community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in South America. J Clin Microbiol. 43(4): 1985-1988.
Roberts RB, de Lencastre A, Eisner W, Severina EP, Shopsin B, Kreiswirth BN,Tomasz A. 1998.
Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in 12 New York hospitals.
MRSA Collaborative Study Group. J Infect Dis. 178(1): 164-171.
Robinson DA, Enright MC. 2003. Evolutionary models of the emergence of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 47(12): 3926-3934.
Rojas L, Bunsow E, Munoz P, Cercenado E, Rodriguez-Creixems M, Bouza E. 2012.
Vancomycin MICs do not predict the outcome of methicillin resistant Staphylococcus aureus
bloodstream infections in correctly treated patients. J Antimicrob Chemother. 67(7): 1760-1768.
106
Rossi F, Andreazzi DB. Resistência Bacteriana Interpretando o Antibiograma. São Paulo:
Atheneu, 2005. p. 118.
Rozenbaum R, Sampaio MG, Batista GS, Garibaldi AM, Terra GM, Souza MJ, Vieira EN, SilvaCarvalho MC, Teixeira LA, Figueiredo AM. 2009. The first report in Brazil of severe infection
caused by community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA). Braz J
Med Biol Res. 42(8): 756-760.
Sader HS, Fey PD, Limaye AP, Madinger N, Pankey G, Rahal J, Rybak MJ, Snydman DR, Steed
LL, Waites K, Jones RN. 2009. Evaluation of vancomycin and daptomycin potency trends (MIC
creep) against methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in nine U.S. medical
centers from 2002 to 2006. Antimicrob Agents Chemother. 53(10): 4127-4132. Erratum in:
Antimicrob Agents Chemother. 2010 Mar; 54(3):1383. Fish, Douglas N [corrected to Madinger,
Nancy].
Sader HS, Fritsche TR, Jones RN. 2008. Frequency of occurrence and daptomycin susceptibility
rates of Gram-positive organisms causing bloodstream infections in cancer patients. J
Chemother. 20(5): 570-576.
Sader HS, Gales AC, Pfaller MA, Mendes RE, Zoccoli C, Barth A, Jones RN. 2001. Pathogen
frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals: summary of results from three years of
the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Braz J Infect Dis. 5(4): 200-214.
Sader HS, Pignatari AC, Hollis RJ, Jones RN. 1994. Evaluation of interhospital spread of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Sao Paulo, Brazil, using pulsed-field gel
electrophoresis of chromosomal DNA. Infect Control Hosp Epidemiol. 15(5): 320-323.
Sader HS, Pignatari AC, Hollis RJ, Leme I, Jones RN. 1993. Oxacillin- and quinolone-resistant
Staphylococcus aureus in Sao Paulo, Brazil: a multicenter molecular epidemiology study. Infect
Control Hosp Epidemiol. 14(5): 260-264.
Saha B, Singh AK, Ghosh A, Bal M. 2008. Identification and characterization of a vancomycin
resistant Staphylococcus aureus isolated from Kolkata (South Asia). J Med Microbiol. 57(Pt 1):
72-79.
107
Sakoulas G, Moise-Broder PA, Schentag J, Forrest A, Moellering RC Jr, Eliopoulos GM. 2004.
Relationship of MIC and bactericidal activity to efficacy of vancomycin for treatment of methicillinresistant Staphylococcus aureus bacteremia. J Clin Microbiol. 42(6): 2398-2402.
Sá-Leão R, Santos Sanches I, Dias D, Peres I, Barros RM, de Lencastre H. 1999. Detection of an
archaic clone of Staphylococcus aureus with low-level resistance to methicillin in a pediatric
hospital in Portugal and in international samples: relics of a formerly widely disseminated strain?
J Clin Microbiol. 37(6): 1913-1920.
Sanches IS, Aires de Sousa M, Sobral L, Calheiros I, Felicio L, Pedra I, de Lencastre H. 1995.
Multidrug-resistant Iberian epidemic clone of methicillin-resistant Staphylococcus aureus endemic
in a hospital in northern Portugal. Microb Drug Resist. 1(4): 299-306.
Santos BM. 1999. A longitudinal study of healthy Staphylococcus aureus carriers among the
students of a nursing aide course. Rev Soc Bras Med Trop. 32(4): 395-400.
Santos Filho L, Silva Sader H, Bortolotto VI, Gontijo FIlho PP, Pignatari AC. 1996. Analysis of the
clonal diversity of Staphylococcus aureus methicillin-resistant strains isolated at João Pessoa,
state of Paraíba. Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 91(1): 101-105.
Saravolatz LD, Markowitz N, Arking L, Pohlod D, Fisher E. 1982. Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Epidemiologic observations during a community-acquired outbreak. Ann
Intern Med. 96(1): 11-16.
Schaberg DR. 1997. Gene exchange and antimicrobial resistance in gram-positive cocci. Trans
Am Clin Climatol Assoc.108: 59-66; discussion 66-68.
Schleifer & Bell, 2010: http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ss/staphylococcaceae.html.
Sharma VK, Hackbarth CJ, Dickinson TM, Archer GL. 1998. Interaction of native and mutant
MecI repressors with sequences that regulate mecA, the gene encoding penicillin binding protein
2a in methicillin-resistant staphylococci. J Bacteriol. 180(8): 2160-2166.
108
Shore A, Rossney AS, Keane CT, Enright MC, Coleman DC. 2005. Seven novel variants of the
staphylococcal chromosomal cassette mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates
from Ireland. Antimicrob Agents Chemother. 49(5): 2070-2083.
Shore AC, Deasy EC, Slickers P, Brennan G, O'Connell B, Monecke S, Ehricht R, Coleman DC.
2011. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent
mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 55(8): 3765-3773.
Sieradzki K, Pinho MG, Tomasz A. 1997. Inactivated pbp4 in highly glycopeptide-resistant
laboratory mutants of Staphylococcus aureus. J Biol Chem. 274(27): 18942-18946.
Skinner,D. & Keefer,C.S. 1941. Significance of bacteremia caused by Staphylococcus aureus.
Arch. Intern. Med. 68: 851-875.
Small PM, Chambers HF. 1990. Vancomycin for Staphylococcus aureus endocarditis in
intravenous drug users. Antimicrob Agents Chemother. 34(6): 1227-1231.
Smith TL, Pearson ML, Wilcox KR, Cruz C, Lancaster MV, Robinson-Dunn B, Tenover FC,
Zervos MJ, Band JD, White E, Jarvis WR. 1999. Emergence of vancomycin resistance in
Staphylococcus aureus. Glycopeptide-Intermediate Staphylococcus aureus Working Group. N
Engl J Med. 340(7): 493-501.
Sola C, Cortes P, Saka HA, Vindel A, Bocco JL. 2006. Evolution and molecular characterization
of methicillin-resistant Staphylococcus aureus epidemic and sporadic clones in Cordoba,
Argentina. J Clin Microbiol. 44(1): 192-200.
Sola C, Gribaudo G, Vindel A, Patrito L, Bocco JL; Córdoba MRSA Collaborative Study Group.
2002. Identification of a novel methicillin-resistant Staphylococcus aureus epidemic clone in
Córdoba, Argentina, involved in nosocomial infections. J Clin Microbiol. 40(4): 1427-1435.
Soriano A, Marco F, Martínez JA, Pisos E, Almela M, Dimova VP, Alamo D, Ortega M, Lopez J,
Mensa J. 2008. Influence of vancomycin minimum inhibitory concentration on the treatment of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis. 46(2): 193-200.
109
Stapleton PD, Taylor PW. 2002. Methicillin resistance in Staphylococcus aureus: mechanisms
and modulation. Sci Prog. 85(Pt 1): 57-72.
Steinkraus G, White R, Friedrich L. 2007. Vancomycin MIC creep in non-vancomycinintermediate Staphylococcus aureus (VISA), vancomycin-susceptible clinical methicillin-resistant
S. aureus (MRSA) blood isolates from 2001-05. J Antimicrob Chemother. 60(4): 788-794.
Tacconelli E, De Angelis G, Cataldo MA, Pozzi E, Cauda R. 2008. Does antibiotic exposure
increase the risk of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolation? A systematic
review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother. 61(1): 26-38.
Tascini C, Flammini S, Leonildi A, Ciullo I, Tagliaferri E, Menichetti F. 2012. Comparison of
teicoplanin and vancomycin in vitro activity on clinical isolates of Staphylococcus aureus. J
Chemother. 24(4): 187-190.
Teixeira LA, Resende CA, Ormonde LR, Rosenbaum R, Figueiredo AM, de Lencastre H, Tomasz
A. 1995. Geographic spread of epidemic multiresistant Staphylococcus aureus clone in Brazil. J
Clin Microbiol. 33(9): 2400-2404.
Tenover FC, Biddle JW, Lancaster MV. 2001. Increasing resistance to vancomycin and other
glycopeptides in Staphylococcus aureus. Emerg Infect Dis. 7(2): 327-332.
Tenover FC, Weigel LM, Appelbaum PC, McDougal LK, Chaitram J, McAllister S, Clark N,
Killgore G, O'Hara CM, Jevitt L, Patel JB, Bozdogan B. 2004. Vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus isolate from a patient in Pennsylvania. Antimicrob Agents Chemother.
48(1): 275-280.
Tomasz A, Drugeon HB, de Lencastre HM, Jabes D, McDougall L, Bille J. 1989. New mechanism
for methicillin resistance in Staphylococcus aureus: clinical isolates that lack the PBP 2a gene
and contain normal penicillin-binding proteins with modified penicillin-binding capacity. Antimicrob
110
Trakulsomboon S, Danchaivijitr S, Rongrungruang Y, Dhiraputra C, Susaemgrat W, Ito T,
Hiramatsu K. 2001. First report of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced
susceptibility to vancomycin in Thailand. J Clin Microbiol. 39(2): 591-595.
Turnidge JD, Bell JM. 2000. Methicillin-resistant Staphylococcal aureus evolution in Australia over
35 years. Microb Drug Resist. 6(3): 223-229.
Udo EE, Pearman JW, Grubb WB. 1993. Genetic analysis of community isolates of methicillinresistant Staphylococcus aureus in Western Australia. J Hosp Infect. 25(2): 97-108.
van Hal SJ, Lodise TP, Paterson DL. 2012. The clinical significance of vancomycin minimum
inhibitory concentration in Staphylococcus aureus infections: a systematic review and metaanalysis. Clin Infect Dis. 54(6): 755-771.
Velazquez-Meza ME, Aires de Sousa M, Echaniz-Aviles G, Solórzano-Santos F, MirandaNovales G, Silva-Sanchez J, de Lencastre H. 2004. Surveillance of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in a pediatric hospital in Mexico City during a 7-year period (1997 to
2003): clonal evolution and impact of infection control. J Clin Microbiol. 42(8): 3877-3880.
Vestergaard M, Cavaco LM, Sirichote P, Unahalekhaka A, Dangsakul W, Svendsen CA,
Aarestrup FM, Hendriksen RS. 2012. SCCmec Type IX Element in Methicillin Resistant
Staphylococcus aureus spa Type t337 (CC9) Isolated from Pigs and Pork in Thailand. Front
Microbiol. 3: 103.
Vidal PM, Trindade PA, Garcia TO, Pacheco RL, Costa SF, Reinert C, Hiramatsu K, Mamizuka
EM, Garcia CP, Levin AS. 2009. Differences between "classical" risk factors for infections caused
by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and risk factors for nosocomial
bloodstream infections caused by multiple clones of the staphylococcal cassette chromosome
mec type IV MRSA strain. Infect Control Hosp Epidemiol. 30(2): 139-145.
Vindel A, Trincado P, Gómez E, Cabrera R, Boquete T, Solá C, Valdezate S, Saez-Nieto JA.
2006. Prevalence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Spanish
hospitals between 1996 and 2002. J Clin Microbiol. 44(1): 266-270.
111
Vivoni AM, Diep BA, de Gouveia Magalhães AC, Santos KR, Riley LW, Sensabaugh GF, Moreira
BM. 2006. Clonal composition of Staphylococcus aureus isolates at a Brazilian university
hospital: identification of international circulating lineages. J Clin Microbiol. 44(5): 1686-1691.
Waldvogel D, van Gelderen P, Muellbacher W, Ziemann U, Immisch I, Hallett M. 2000. The
relative metabolic demand of inhibition and excitation. Nature. 406(6799): 995-998.
Wang G, Hindler JF, Ward KW, Bruckner DA. 2006. Increased vancomycin MICs for
Staphylococcus aureus clinical isolates from a university hospital during a 5-year period. J Clin
Microbiol. 44(11): 3883-3886.
Ward PB, Johnson PD, Grabsch EA, Mayall BC, Grayson ML. 2001.Treatment failure due to
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with reduced susceptibility to vancomycin.
Med J Aust. 175(9): 480-483.
Weigel LM, Clewell DB, Gill SR, Clark NC, McDougal LK, Flannagan SE, Kolonay JF, Shetty J,
Killgore GE, Tenover FC. 2003. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of
Staphylococcus aureus. Science. 302(5650): 1569-1571.
Weigel LM, Donlan RM, Shin DH, Jensen B, Clark NC, McDougal LK, Zhu W, Musser KA,
Thompson J, Kohlerschmidt D, Dumas N, Limberger RJ, Patel JB. 2007. High-level vancomycinresistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm. Antimicrob.
Wilson AP, O'Hare MD, Felmingham D, Grüneberg RN. 1986. Teicoplanin-resistant coagulasenegative staphylococcus. Lancet. 2(8513): 973.
Wong SS, Ng TK, Yam WC, Tsang DN, Woo PC, Fung SK, Yuen KY. 2000. Bacteremia due to
Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin. Diagn Microbiol Infect Dis.
36(4): 261-268.
Wu SW, de Lencastre H, Tomasz A. 2001. Recruitment of the mecA gene homologue of
Staphylococcus sciuri into a resistance determinant and expression of the resistant phenotype in
Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 183(8): 2417-2424.
112
Yamamoto T, Nishiyama A, Takano T, Yabe S, Higuchi W, Razvina O, Shi D. 2010. Communityacquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: community transmission, pathogenesis,
and drug resistance. J Infect Chemother. 16(4): 225-254.
Yeh YC, Yeh KM, Lin TY, Chiu SK, Yang YS, Wang YC, Lin JC. 2012. Impact of vancomycin MIC
creep on patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. J Microbiol
Immunol Infect. 45(3): 214-220.
Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Conly JM. 2009. Novel staphylococcal cassette chromosome
mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes
in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents
Chemother. 53(2): 531-540.
Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Louie T, Conly JM. 2005. Novel multiplex PCR assay for
characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I
to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 43(10): 5026-5033.
113

Clique para visualizar o trabalho completo.

Transcrição

Documentos relacionados

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E MODULADORA

staphclin latex

Staphylococcus aureus resistentes à meticilina isolados de

25A staphylococcal mastitis rabbit Ciencia Rural Brazil 2003 Mar

pesquisa de staphylococcus aureus resistente a meticilina (mrsa)

Expressão e caracterização de HtrA de S. aureus, possível

Penetrox-A - macroluzconectores.com.br

baixe o pdf

Pauta - Rede de mulheres parlamentares das américas

Bula - Eurofarma