universidade de são paulo faculdade de medicina de ribeirão preto

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE
INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE
ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS
MÁRCIA CRISTINA LIVONESI
RIBEIRÃO PRETO – SP
2006
MÁRCIA CRISTINA LIVONESI
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO INTERFERON-ALFA E DE
INIBIDORES DA INOSINA MONOFOSFATO DESIDROGENASE SOBRE
ORTHOBUNYAVIRUS BRASILEIROS
Tese (Doutorado) apresentada ao curso de
Pós-graduação em Imunologia Básica e
Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo,
para obtenção do título de Doutor (a) em
Ciências
–
Área
de
Concentração:
Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador:
Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo
Ribeirão Preto – SP
2006
FICHA CATALOGRÁFICA
Livonesi, Márcia Cristina
Estudo da atividade antiviral do interferon-alfa e de inibidores da
inosina monofosfato desidrogenase sobre Orthobunyavirus
brasileiros.
Ribeirão Preto, 2006.
172p.: il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes.
1.Bunyaviridae 2.Ribavirina 3.Ácido Micofenólico 4.Interferon-alfa
5.Ensaio de placa 6.in vivo
Trabalho
realizado
no
Centro
de
Pesquisa em Virologia da Faculdade de
Medicina
de
Ribeirão
Preto
-
Universidade de São Paulo, com auxílio
financeiro da CAPES e FAPESP (No
03/03682-3).
EPÍGRAFE
A Sabedoria brilha, não fenece; deixa-se ver facilmente pelos que a amam,
deixa-se encontrar pelos que a procuram.
Antecipa-se aos que a desejam, sendo a primeira a se dar a conhecer.
Quem parte cedo à sua procura não se fadigará, pois a encontrará sentada
à sua porta.
Apaixonar-se por ela é a perfeição do discernimento, e quem velar por sua
causa estará em breve sem inquietações.
Pois ela deambula em busca dos que dela são dignos, aparece-lhes
benevolamente nos caminhos e vai ao encontro deles em cada um de seus
pensamentos.
Sabedoria 6:12-16.
DEDICATÓRIA
À Santíssima Trindade e à Virgem Maria: “Celebrai o Senhor de todo o
poder, porque Ele é bom e sua fidelidade é para sempre”. (Jeremias 33:11)
Aos meus pais, Luiz e Orminda: imensurável amor que acolhe, aquece e
reconforta...
As minhas irmãs Denise e Liz: companheiras de viagem no trem da vida e
cuja amizade facilita a transposição de qualquer obstáculo.
A minha sobrinha Vitória: amor puro e sincero, cujo sorriso e alegria nos
cerca de felicidade.
Ao Ricardo: Sol que ilumina os meus dias, que aquece e preenche o meu
coração de amor e felicidade.
AMO TODOS VOCÊS
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais (Luiz e Orminda), as minhas irmãs (Denise e Liz) e ao meu
namorado (Ricardo) pelo carinho, apoio e ajuda em todos os momentos
desta jornada.
Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo que me aceitou como aluna em
seu laboratório, mesmo sem me conhecer; que me introduziu no mundo
da virologia e que confiou a mim um trabalho nunca dantes realizado em
seu laboratório e que me orgulhei muito de fazer. Obrigada pelos
ensinamentos, confiança e amizade.
Aos professores Francisco de Paula Pinheiro, Aramis Augusto Pinto, Yara
Maria Lucisano Valim e Karla de Melo Lima por terem aceitado participar
da minha banca, pela atenção com que me atenderam e pelas sugestões e
correções referentes a esta tese.
A todos os professores que passaram pela minha vida, cujos ensinamentos
foram fundamentais para meu crescimento pessoal e profissional.
A Ana Cristine S. Ferreira, pessoa exemplar que muito me ajudou tanto no
mestrado como no doutorado. Mãe dedicada e amorosa que recebe e trata
todos os alunos com muito carinho e atenção. Ana, agradeço de todo o
coração o que você fez por mim, nunca vou esquecer... Obrigada.
Aos funcionários da Faculdade de Medicina que sempre me receberam
com um sorriso no rosto e que se tornaram pessoas preciosas para mim.
Assim refiro-me a Rosângela, Ronaldo, Wander, Cristiane (Mila), “Gil”,
“Pity”, Marli, Isa, Maria Helena, Lúcia(s), Maria Inês, Júlio, Ednelson,
Sávio, Denise, Vânia e muitos, muitos outros.
Aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação, da Biblioteca Central,
do Biotério Central e do Biotério do Anexo A pelos valiosos serviços
prestados, pela atenção e paciência em nos atender.
Aos funcionários e amigos do Centro de Pesquisa em Virologia que me
ajudaram muito e que tornaram meus afazeres mais fáceis. Assim refirome a Soraya, Sueli, Paulo, Pavanelli, Regina, Andréa e Fernanda. Agradeço
também a “Guina”, ao Thiago e a Estela que não trabalham mais neste
departamento, mas que foram muito importantes para mim. Muito
obrigada.
Aos
meus
amigos
e
companheiros
de
jornada:
Viviane,
Marcos,
Alessandra, Roberta, Veridiana, Juliana, Thalita, Mário, Neusa, Aline,
Gelse, Laura, Nadiele, Aldo, Victor, Paula, Glauciane, Luzia, Raquel, Liz e
Alberto. Agradeço a amizade, o carinho, as conversas descontraídas e
algumas vezes sérias, a compreensão e apoio no dia-a-dia. “Eu teria muita
coisa a te escrever, mas não quero fazê-lo com tinta e pena; pois espero
rever-te em breve, e conversaremos pessoalmente” (Terceira Epístola de
João).
Aos colegas de cursos, de congressos e dos “corredores da vida” que me
escolheram para fazer parte de suas vidas, mesmo que tenha sido por um
pequeno instante.
A todos que não citei, mas que de uma forma ou de outra contribuíram
para a realização deste trabalho.
A CAPES e a FAPESP pelo indispensável apoio financeiro.
Aos animaizinhos cujo destino foi dado em prol da ciência...
ABREVIAÇÕES E SIGLAS
AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA)
ATF: “activating transcription factor”
Coronavirus-SARS: Coronavirus da síndrome respiratória aguda severa
EMC: vírus da encefalomiocardite
HCV: vírus da hepatite C
HIV: vírus da imunodeficiência humana
IRF: “interferon regulatory factor”
ISGF3: “interferon-stimulated gene factor 3”
JAK: Janus quinase
MeM: meio mínimo essencial
MHC: complexo de histocompatibilidade principal
NFκB: fator nuclear κB
PFU: unidade formadora de placa
SBF: soro bovino fetal
STAT: transdutores de sinal e ativadores de transcrição
Th: linfócito T auxiliar (helper)
TyK: tirosina quinase pertencente à família da JAK
VSV: vírus da estomatite vesicular
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO
01
1.1. Gênero Orthobunyavirus
01
1.2. Drogas Antivirais
10
1.2.1. Inibidores de Inosina Monofosfato Desidrogenase
10
1.2.1.1. Ribavirina
12
1.2.1.2. Ácido Micofenólico
18
1.2.2. Interferon-alfa
22
2. OBJETIVOS
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
31
3.1. Amostras virais
31
3.2. Estoque viral ou semente viral
31
3.3. Experimentos in vitro
32
3.3.1. Cultura de células
32
3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in
vitro
33
3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-α-2a
sobre as células Vero E6
3.3.4. Otimização da metodologia do ensaio de placa
34
36
3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do
IFN-α-2a sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in
vitro
38
3.4. Experimentos in vivo
40
3.4.1. Animais
40
3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in
vivo
40
3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal
100 (DL100) pela via de inoculação intra-peritoneal
41
3.4.4. Determinação da concentração máxima tolerada dos
medicamentos RBV e IFN-αA pelos camundongos
suíços lactentes
41
3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da
RBV e do IFN-αA sobre animais infectados
3.5. Análise Estatística
4. RESULTADOS
4.1. Resultados referentes às padronizações
43
45
46
46
4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos
RBV, MPA e IFN-α-2a para células Vero E6
46
4.1.2. Susceptibilidade de camundongos suíços à infecção
intra-peritoneal pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e
TCM
51
4.1.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal
100 (DL100) para os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM
em animais suíços através da via de inoculação intraperitoneal
54
4.1.4. Detecção e quantificação de vírus no sangue e no
cérebro
56
4.1.5. Concentração máxima tolerada dos medicamentos
RBV e IFN-αA pelos camundongos suíços lactentes
4.2. Resultados referentes à Ribavirina
60
64
4.2.1. Atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV,
GROV e TCMV in vitro
64
4.2.2. Atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR,
GUA, GRO e TCM em experimentos in vivo
4.3. Resultados referentes ao Ácido Micofenólico
70
73
4.3.1. Avaliação da capacidade antiviral do MPA sobre
OROV,CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro
73
4.3.2. Avaliação da capacidade antiviral da RBV e do MPA
quando utilizados concomitantemente sobre os vírus
ORO, CAR e GRO
4.4. Resultados referentes ao Interferon-alfa
79
83
4.4.1. Atividade antiviral do IFN-α sobre os vírus ORO, CAR,
GUA, GRO e TCM in vitro
83
4.4.2. Atividade antiviral do IFN-α sobre OROV, CARV,
GUAV, GROV e TCMV em experimentos in vivo
87
5. DISCUSSÃO
96
6. CONCLUSÕES
112
7. RESUMO
114
8. ABSTRACT
115
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
116
10. ANEXOS
136
10.1. Artigo referente aos resultados de Ribavirina
136
10.2. Artigo referente aos resultados do Ácido Micofenólico
155
10.3.
Carta
de
aprovação
Experimentação Animal
da
Comissão
de
Ética
em
171
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Gênero Orthobunyavirus
O gênero Orthobunyavirus pertence à família Bunyaviridae, a
qual
compreende
outros
quatro
gêneros:
Hantavirus,
Nairovirus,
Phlebovirus e Tospovirus (CALISHER, 1996; ELLIOT, 2000). A grande
maioria destes vírus é transmitida por mosquitos, flebótomos ou
carrapatos, com exceção dos Hantavirus que infectam roedores e possuem
mecanismo
de
transmissão
relacionado
à
inalação
de
aerossóis
proveniente das excretas destes animais (SCHMALJOHN & HJELLE,
1997).
Os vírus da família Bunyaviridae são esféricos, envelopados,
medindo cerca de 80 a 120 nm, possuindo na sua superfície projeções
glicoprotéicas (Figura 1) (ELLIOT, 1997). Seu genoma é constituído por
RNA de fita simples de polaridade negativa, tri-segmentado, denominado
de grande (L), médio (M) e pequeno (S), sendo que este último pode atuar
ainda de forma “ambisense” em processo replicativo (ELLIOT, 1997). O
segmento L origina a RNA polimerase viral (ou proteína L), enquanto o
segmento M produz uma poliproteína que é clivada formando as
glicoproteínas G1 e G2. O segmento M também produz uma proteína não
estrutural, denominada NSm, enquanto o segmento S é responsável por
originar a proteína do nucleocapsídio (proteína N) e uma pequena proteína
não estrutural denominada NSs (ELLIOT, 1997).
2
Figura 1: Estrutura esquemática dos vírus pertencentes à família
Bunyaviridae. L, M e S são os RNAs do vírus, a esfera em cor verde é a
polimerase viral. (Fonte: www.stanford.edu/group/virus/bunya).
A infecção por vírus da família Bunyaviridae inicia-se pela
adsorção do microrganismo à membrana celular tendo como ligantes a
proteína G1 para células de vertebrados e a proteína G2 para células de
artrópodes. Os vírus penetram na célula, provavelmente por endocitose e
fundem seu envelope às membranas endossômicas o que permite ao
nucleocapsídio viral atingir o citoplasma (Figura 2). Primeiramente,
utilizando a polimerase viral, ocorre uma transcrição primária do RNA de
polaridade negativa (-) do vírus para RNA mensageiro (+) e RNA
complementar (+). Posteriormente, a polimerase viral inicia a transcrição
do RNA complementar (+) para RNA (-) encapsidado, originando o genoma
da progênie viral (SCHMALJOHN, 1996). Enquanto isso, ribossomos livres
fazem a tradução dos segmentos L, M e S dos RNAs mensageiros. Por fim,
a montagem viral ocorre após o acúmulo das glicoproteínas G1 e G2 junto
ao aparelho de Golgi, do qual a partícula viral brota e a progênie viral é
liberada por pinocitose reversa com fusão das membranas das vesículas
3
citoplasmáticas à membrana celular (SCHMALJOHN, 1996). A partícula
viral proveniente do aparelho de Golgi pode também unir-se diretamente à
membrana celular alcançando o meio exterior, como uma maneira
alternativa de completar o processo replicativo (ELLIOT, 1997).
Figura 2: Esquema do processo replicativo dos vírus pertencentes à
família Bunyaviridae. (Fonte: SCHMALJOHN, 1996).
Uma vez no organismo do hospedeiro, os vírus da família
Bunyaviridae podem causar uma série de sinais e sintomas que variam de
acordo com o agente viral, podendo muitas vezes causar desde encefalites
até febres hemorrágicas, como ocorre, por exemplo, nas infecções
causadas pelos vírus La Crosse, Hantaan, febre do Vale Rift, febre
4
hemorrágica
do
Crimean-Congo
e
hantavirus
do
Novo
Mundo
(MANGIAFICO et al., 1988; ELLIOT, 1997).
No
Brasil
Orthobunyavirus,
foram
sendo
o
isoladas
mais
dezenas
importante
de
do
vírus
ponto
do
de
gênero
vista
epidemiológico, o vírus Oropouche, por causar extensas epidemias na
região Amazônica (VASCONCELOS et al., 1992), sendo superado apenas
pelo dengue em número de casos notificados (VASCONCELOS et al., 1992;
DIXON et al., 1981; PINHEIRO et al., 1982).
O vírus Oropouche foi isolado pela primeira vez em 1955, em
Trinidad, a partir do sangue de um morador da localidade de Vega de
Oropouche (ANDERSON et al., 1961). No Brasil, o vírus foi isolado pela
primeira vez em 1960, do sangue de uma preguiça (Bradypus tridactylus)
e de um “pool” de Aedes serratus capturados nas margens da rodovia
Belém-Brasília. O vírus Oropouche mantém-se na natureza utilizando 2
ciclos, um urbano e outro silvestre. O ciclo silvestre, que mantém o vírus
originalmente na natureza, envolve como reservatórios 95 espécies de
animais que incluem diversas aves silvestres, macacos e preguiças.
Suspeita-se que o mosquito Aedes serratus possa ser o vetor silvestre do
vírus Oropouche. O ciclo urbano, provavelmente, ocorreu como uma
adaptação rápida do vírus às localidades ribeirinhas amazônicas, o que
levou à emergência de uma nova doença humana epidêmica, a febre do
Oropouche. As epidemias costumam ocorrer nas estações chuvosas,
quando o vírus seria trazido do meio silvestre às comunidades urbanas,
sendo transmitido aos seres humanos pelo mosquito Culicoides paraensis
(maruim) (PINHEIRO et al., 1981; ROBERTS et al., 1981).
5
As epidemias de febre do Oropouche são extensas e explosivas
acometendo cidades e vilarejos tanto da região Amazônica como do
Planalto Central (GONZALEZ-SCARANO & NATHANSON, 1996; KINNEY &
CALISHER, 1981). Estima-se em mais de meio milhão o número de casos
ocorridos no Brasil nos últimos 30 anos e, além do Brasil, há registros de
ocorrências de infecção pelo vírus Oropouche no Panamá, Peru, Suriname
e Trinidad (PINHEIRO et al., 2004). Evidências sorológicas demonstraram
que o vírus pode circular eventualmente em outras regiões do Brasil, como
no interior do Estado de São Paulo em que 2 indivíduos apresentaram
anticorpos para o Oropouche (FIGUEIREDO et al., 1986).
O vírus Oropouche apresenta grande capacidade de adaptação,
existindo o risco de epidemias da febre do Oropouche em outras regiões
brasileiras, uma vez que o mosquito transmissor, conhecido por maruim,
é abundante nas regiões litorâneas (ANDERSON et al., 1961) e pelo fato do
vírus ter sido recentemente isolado de um macaco do gênero Callithrix sp
na região sudeste do Brasil (NUNES et al., 2005).
A patogenia da infecção pelo arbovírus Oropouche é pouco
conhecida.
Sabe-se
que
a
infecção
é
sistêmica
e
provavelmente,
viscerotrópica, indicando que no quadro clínico agudo febril deve haver a
participação de substâncias mediadoras de reação de fase aguda,
incluindo as citocinas: TNF-α, IFNs e IL-1, além de quimiocinas. Contudo,
as células que participam da replicação viral não são conhecidas (ARAÚJO
et al., 1978).
A febre do Oropouche tem período de incubação de 4 a 8 dias e
se caracteriza por quadro abrupto de febre de 39 a 40oC, mal-estar,
6
cefaléia, anorexia, mialgias e artralgias generalizadas, tonturas, fotofobia,
prostração e, em 5% dos casos, exantema máculo-papular em tórax,
dorso, braços e pernas. Congestão conjuntival, dor retro-orbitária, tosse,
coriza, náuseas e diarréia são ocasionalmente descritas. O quadro clínico
perdura por 2 a 5 dias, mas as mialgias, a astenia e, em alguns casos a
cefaléia, pode prolongar-se por até um mês. Também, recidiva dos
sintomas acontece em até 60% dos pacientes entre 10 a 14 dias após
cessar
o
quadro
inicial
(PINHEIRO
et
al.,
1982).
Meningite
linfomonocitária é um achado freqüente nos surtos de febre do Oropouche
e o vírus já foi, inclusive, isolado de líquor (PINHEIRO et al., 1982). Esta
meningite ocorre comumente na 2a semana de doença, tendo evolução
benigna. Viremia é achado praticamente universal nos dois primeiros dias
de doença, mas declina rapidamente podendo o isolamento viral ocorrer
até o 5o ou 6o dia de doença (PINHEIRO et al., 1981 e 1997). A febre do
Oropouche na gestação, provavelmente, se associou a abortamento em 2
de 9 grávidas em que a virose ocorreu no segundo mês de gravidez
(PINHEIRO et al., 1997). Embora não pareça causar mortalidade
importante, a febre por Oropouche causa grande morbidade, com grande
impacto econômico e social (VASCONCELOS et al., 1989 e 1992;
PINHEIRO et al., 1981 e 1982), uma vez que os pacientes precisam ficar
acamados e muitas vezes afluem em grande número aos hospitais,
chegando a causar total congestionamento dos mesmos.
Além do vírus Oropouche, no Brasil foram isolados outros
Orthobunyavirus que causam doença febril na espécie humana, dentre
7
eles podemos citar: vírus Caraparu, vírus Guamá, vírus Guaroa e vírus
Tacaiuma.
O vírus Caraparu foi primeiramente isolado na região Amazônica
(KARABATSOS, 1985) e posteriormente na Mata Atlântica do estado de
São Paulo, principalmente na região do Vale do Ribeira, onde existe uma
alta prevalência de pessoas soropositivas para este vírus (IVERSSON,
1994). A febre do Caraparu é uma doença de início súbito, apresentando
como sintomas, febre alta, cefaléia, mialgias, dor retroocular e fotofobia,
que pode ter duração de 4 a 5 dias com evolução para a cura
(VASCONCELOS et al., 1998). Estudos demonstraram que o vírus
Caraparu pode ter como hospedeiros, tanto roedores silvestres (Akodon,
Nectomys,
marsupiais
Oryzomys,
Oxymecterus
(Didelphis
marsupialis)
e
Coendou
pelo
fato
milanurus),
dos
como
mesmos
terem
apresentado anticorpos anti-Caraparu. Além disso, acredita-se que
mosquitos Culicidae possam ser os vetores, pois o vírus foi isolado de
mosquitos da espécie Culex sacchettae (VASCONCELOS et al., 1992).
O
vírus
Guamá,
primeiramente
identificado
em
Trinidad
(JONKERS et al., 1968), tem sido isolado de seres humanos na região
Amazônica, apresentando como sintomas: febre moderada, calafrios
intensos, mal-estar, tonturas, cefaléia holocraniana, mialgias, artralgias,
anorexia, fotofobia e dor à movimentação dos olhos. A duração dos
sintomas
é
de
aproximadamente
5
dias
e
evolui
para
a
cura
(VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et al., 1985). Acredita-se
que o ciclo silvático deste vírus envolva Culex portesi como vetor e vários
8
roedores como reservatórios (Oryzomys e Zygodontomys) (JONKERS et al.,
1968).
O vírus Guaroa foi descrito pela primeira vez por GROOT e
colaboradores, em 1959, sendo primeiramente isolado em habitantes da
Colômbia. No Brasil, o vírus Guaroa foi isolado pela primeira vez a partir
da biópsia de fígado de um paciente que apresentava hepatopatia,
paralisia e queda de cabelos. Posteriormente, evidências sorológicas
demonstraram a presença deste vírus tanto na região Amazônica, onde se
encontrou uma alta prevalência de pessoas soropositivas (8 a 18%)
(PINHEIRO, 1985; IVERSSON, 1994), quanto no interior do Estado de São
Paulo (FIGUEIREDO et al., 1986). A febre do Guaroa tem início abrupto
com febre elevada (39oC a 40oC), calafrios, cefaléia e mialgias, que podem
durar por 3 a 5 dias, apresentando evolução benigna. Este vírus tem aves
silvestres como reservatórios e mosquitos Anopheles como vetores
(KARABATSOS, 1985; VASCONCELOS et al., 1992 e 1998; PINHEIRO et
al., 1997).
O vírus Tacaiuma foi encontrado em diversos países como
Argentina, Guiana Francesa, Suriname e Brasil (Van TONGEREN, 1967;
KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al., 1965). No Brasil, anticorpos para
o vírus Tacaiuma foram encontrados em seres humanos, cavalos,
morcegos, roedores silvestres e pássaros, enquanto isolamento viral
ocorreu a partir de amostras de sangue de pessoas febris residentes na
região norte do país, de macacos Cebus apella e de mosquitos dos gêneros
Haemagogos sp e Anopheles sp. (KARABATSOS, 1985; SABATTINI et al.,
1965). Estes artrópodes são considerados os vetores do vírus Tacaiuma na
9
região Amazônica. Na década de 80, em um inquérito sorológico para
arbovírus na região de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, foi
demonstrada a presença de anticorpos inibidores da hemaglutinação para
o vírus Tacaiuma em um morador de zona rural (FIGUEIREDO et al.,
1986). Posteriormente, foram encontrados anticorpos para o vírus
Tacaiuma em cavalos da região do Pantanal Mato-grossense (IVERSSON et
al., 1993), dando indício de que o vírus Tacaiuma possa estar circulando
em todas as regiões brasileiras. Os sintomas da febre do Tacaiuma são
além
de
febre,
cefaléia,
mialgias,
calafrios,
astenia
e
artralgia,
apresentando evolução benigna (VASCONCELOS et al., 1998; PINHEIRO
et al., 1997).
A maioria das arboviroses descritas ocorre em pessoas que
entram em contato com o meio silvestre ou rural. No entanto, existem
arboviroses que afetam habitantes das áreas urbanas, como a febre do
Oropouche, devido a uma adaptação do vírus tanto ao mosquito
transmissor presente nestas áreas, quanto ao hospedeiro humano. Nestes
casos as arboviroses são responsáveis por grandes epidemias, que geram,
às cidades atingidas, grande impacto econômico e social, uma vez que
estas
doenças
possuem
uma
natureza
debilitante
de
duração
razoavelmente longa, fazendo com que as pessoas atingidas afluam em
grande número aos hospitais por necessitar de acompanhamento médico
(VASCONCELOS et al., 1989 e 1992; PINHEIRO et al., 1981 e 1982),
gerando, assim, um problema de saúde pública.
Diante disso, uma alternativa para tentar conter as epidemias,
bem como amenizar os sintomas dessas infecções virais, seria o
10
tratamento dos indivíduos infectados com drogas antivirais eficientes. No
entanto, para todas as infecções virais supracitadas, ainda não existe
tratamento antiviral, sendo que, nestes casos recomenda-se o uso de
antitérmicos para o controle da febre e antiinflamatórios e antieméticos
quando necessário (PINHEIRO et al., 1997).
1.2. Drogas Antivirais
1.2.1. Inibidores da Inosina Monofosfato Desidrogenase
Inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH) é uma enzima que
catalisa o primeiro e único passo da síntese de novo de nucleotídeos de
guanina (Figura 3).
Inosina Monofosfato
IMPDH
Adenilsuccinato
Xantosina Monofosfato
GMP sintetase
Adenosina Monofosfato
Guanosina Monofosfato
GDP, GTP, dGDP, dGTP
Figura 3: Esquema da síntese de novo de nucleotídeos de guanina.
Enzimas estão em itálico. (Fonte: Adaptado de GRACI & CAMERON, 2006).
11
IMPDH converte inosina monofosfato (IMP) para xantosina
monofosfato (XMP), a qual recebe grupamento amina pela ação da enzima
guanosina monofosfato sintetase (GMP sintetase) e origina guanosina
monofosfato (GMP). GMP é então convertida em metabólitos de guanina
como GTP e dGTP (Figura 3) (GRACI & CAMERON, 2006).
Até o momento foram identificadas duas isoformas de IMPDH: a
forma tipo I que é expressa em baixas concentrações em todos os tipos
celulares e a forma tipo II que é altamente expressa em células em estado
proliferativo ou em transformação. As duas isoformas apresentam 84% de
identidade na sua seqüência de aminoácidos e ambas são cataliticamente
ativas quando na forma de tetrâmeros contendo subunidades de 55kDa (JI
et al., 2006). O sítio ativo da IMPDH localiza-se na interface monômeromonômero, sendo que seu substrato (IMP) e seu co-fator (NAD+) ligam-se
numa fenda presente na região C-terminal de cada tetrâmero (COLBY et
al., 1999).
Os metabólitos de guanina como GTP e dGTP provenientes da via
sintética de novo são precursores essenciais para a síntese de RNA e DNA,
respectivamente. Como IMPDH é a enzima responsável por esta via, a
mesma
tem
sido
identificada
como
um
importante
regulador
da
proliferação celular. Além disso, GTP tem importantes funções no estoque
de energia, na sinalização intracelular, na tradução realizada pelos
ribossomos e na síntese de glicoproteínas (GRACI & CAMERON, 2006).
Diante da importância da IMPDH, esta enzima pode ser alvo da
ação de substâncias inibidoras, que já apresentam atividade antiviral
12
comprovada, como é o caso da ribavirina, ou que vem demonstrando ter
ações antivirais, como é o caso do ácido micofenólico.
1.2.1.1. Ribavirina
A
Ribavirina
(RBV)
(1-β-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-
carboxamida), comercialmente conhecida como Virazole, é um nucleosídeo
sintético, com estrutura semelhante à da guanosina (Figura 4).
Figura 4: Estrutura química da ribavirina. (Fonte: GRACI & CAMERON,
2006).
A
RBV
foi
primeiramente
sintetizada
por
SIDWELL
e
colaboradores em 1972, os quais também foram responsáveis por
demonstrar pela primeira vez a atividade antiviral da RBV sobre muitos
vírus de DNA e de RNA tanto in vitro como in vivo (WITKOWSKI et al., 1972;
SIDWELL et al., 1972). Apesar disso, a RBV hoje, é somente utilizada no
tratamento das infecções causadas pelo vírus da hepatite C (HCV) (em
combinação com Interferon-α) (DAVIS et al., 1998; McHUTCHISON et al.,
1998; MANGIA et al., 2005), pelo vírus sincicial respiratório (WYDE, 1998;
13
COOPER et al., 2003) e experimentalmente nas infecções causadas pelo
vírus da febre de Lassa (McCORMICK et al., 1986).
Passados mais de trinta anos após a sua descoberta, o
mecanismo de ação antiviral da RBV ainda gera controvérsia. Existem até o
momento, 5 mecanismos descritos que podem ser os responsáveis pela
atividade antiviral da RBV, sendo que os mesmos podem ou não atuar
conjuntamente, dependendo do tipo celular e da estirpe viral envolvidos.
No interior da célula, a RBV sofre processo de fosforilação
originando as formas mono-, di- e tri-fosfato (WILLIS et al., 1978; PAGE &
CONNOR, 1990). A ribavirina monofosfato (RMP), por mimetizar o
substrato IMP, é o inibidor competitivo da IMPDH (Figura 3), fazendo com
que os níveis de GTP e outros metabólitos de guanina diminuam no meio
intracelular (STREETER et al., 1973). A redução nos níveis de GPT e dGTP
pode resultar em dois efeitos: um para as células, que com a diminuição da
síntese de DNA, RNA e proteínas deixam de proliferar, tendo a RMP um
efeito citostático sobre as mesmas (MULLER et al., 1977); e outro para os
vírus, cuja redução de GTP e dGTP impede a progressão do ciclo replicativo
viral, por prejudicar a tradução, a transcrição e a replicação do RNA ou
DNA dos vírus (STREETER et al., 1973). Este mecanismo de ação antiviral
é o principal responsável pela inibição da replicação de flavivírus e
paramixovírus in vitro (LEYSSEN et al., 2005) e pode explicar a capacidade
da RBV em inibir ambos vírus de RNA e de DNA. Contudo, alguns
pesquisadores sugerem que a inibição da IMPDH por si só, não é suficiente
para explicar a atividade antiviral da RBV. WRAY e colaboradores (1985)
observaram que concentrações crescentes de RBV não são capazes de
14
reduzir completamente os níveis de GTP intracelular, contudo, a dose
crescente do medicamento apresenta efeito antiviral sobre o vírus influenza
mais e mais pronunciado. Além disso, nem todos os inibidores de IMPDH
apresentam atividade antiviral (CROTTY et al., 2000; LANFORD et al.,
2001), sugerindo, então, que a RBV tenha outros mecanismos de ação.
A maioria dos RNAs celulares e alguns RNAs virais possuem na
sua porção final 5’ uma estrutura essencial tanto para a estabilidade como
para a tradução do RNA mensageiro, denominada estrutura de “cap 7metilguanosina” (GOSWAMI et al., 1979). A formação desta estrutura
requer a ação consecutiva de três enzimas, das quais uma é responsável
por catalisar a adição de guanosina monofosfato (GMP) na região 5’ do
RNA, sendo denominada por isso de guanililtransferase (BISAILLON &
LEMAY, 1997). A RBV, na sua forma trifosfatada (RTP), por ser um análogo
da guanosina, foi vista formar com a guanililtransferase um complexo
covalente enzima-RTP, inibindo a atividade enzimática da mesma e
prejudicando o “capping” do RNAm do vírus vaccínia por exemplo, com
conseqüente redução da síntese protéica desse vírus (GOSWAMI et al.,
1979; BOUGIE & BISAILLON, 2004). Além disso, foi demonstrado através
de experimentos bioquímicos que a guanililtransferase possui a capacidade
de transferir RMP ao RNA, formando um “cap” contendo RBV em sua
estrutura. O “cap” constituído por RBV não é reconhecido pela maquinaria
do “capping” do vírus vaccínia e, portanto, não sofre adição do grupamento
7-metil, gerando um RNA com “cap” incompleto que não é reconhecido
pelos ribossomos e conseqüentemente não sofre processo de tradução
(BOUGIE & BISAILLON, 2004). Este mecanismo antiviral da RBV pode
15
funcionar para vírus que necessitam do “cap” durante sua replicação, mas
é incapaz de explicar a atividade antiviral que a RBV possui sobre os vírus
que não utilizam “cap” para gerar sua progênie.
A RBV trifosfato (RTP), além de agir sobre a guanililtransferase,
foi vista ter ação inibitória sobre polimerases virais. Estudos in vitro
realizados por ERIKSSON e colaboradores (1977) mostraram que a RTP
possui a capacidade de inibir a RNA polimerase do vírus influenza e que
nem a RBV, nem a RMP apresentaram tal ação. Neste caso, a RTP agiu
como um inibidor competitivo da RNA polimerase, competindo com ATP e
GTP pelo sítio ativo da enzima. Inibição da polimerase viral por RBV
também foi visto para os vírus da estomatite vesicular (FERNANDEZLARSSON et al., 1989; TOLTZIS et al., 1988) e HCV (MAAG et al., 2001; VO
et al., 2003).
CROTTY e colaboradores em 2000 observaram que a RNA
polimerase do poliovírus poderia se ligar a RTP e não ter sua atividade
inibida, pelo contrário, a polimerase conseguia adicionar moléculas de RTP
ao RNA viral durante o processo replicativo numa razão baixa de
incorporação, na ordem de 1 a 2 moléculas de RTP para cada 7500
nucleotídeos do RNA viral. Os pesquisadores observaram ainda que, a RTP
por apresentar estrutura análoga ao do GTP e do ATP, era adicionada ao
RNA viral no lugar destes nucleotídeos, causando mutações no genoma do
poliovírus.
Durante
o
processo
replicativo
do
poliovírus
ocorrem
normalmente 1,5 mutações por genoma, mas na presença da RTP houve
um aumento de 2 a 4 mutações por genoma, dependendo da concentração
de RBV adicionada à cultura celular. Esse aumento no número de
16
mutações superou o limiar permitido de alterações genômicas para o
poliovírus, causando no mesmo o fenômeno de mutação letal, onde excesso
de mutações origina progênie não infecciosa, com conseqüente perda da
viabilidade reprodutiva viral (CROTTY et al., 2000). Estes achados deram a
RBV mais uma função dentre as já mencionadas: a de causar mutações de
caráter letal no genoma viral. Posteriormente, essa capacidade da RBV em
aumentar a freqüência de mutações com conseqüente diminuição da
viabilidade viral foi também observada para: réplicons de HCV (LANFORD
et al., 2003; ZHOU et al., 2003), vírus GBV-B (LANFORD et al., 2001),
vírus Hantaan (SEVERSON et al., 2003) e vírus West Nile (DAY et al.,
2005).
Além dos mecanismos antivirais descritos acima, estudos têm
demonstrado que a RBV possui a capacidade de modular a resposta imune
direcionando-a para um padrão de resposta do tipo Th1 (NING et al., 1998;
TAM et al., 1999; HULTGREN et al., 1998). Resposta do tipo Th1 associa-se
com imunidade celular e presença da citocina interferon-γ; enquanto
resposta do tipo Th2 promove imunidade humoral com presença de
interleucina (IL)-4 e IL-5 (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Resposta imune do
tipo Th2 tem sido associada ao desenvolvimento de doença crônica nas
infecções causadas pelo vírus HCV (TSAI et al., 1997) e estudos in vitro
com células humanas têm demonstrado que baixos níveis de RBV (5-10µM)
inibem a resposta Th2 das células e promovem uma resposta Th1 tanto em
células CD4+ como CD8+ (TAM et al., 1999). Contudo, até o momento,
estudos clínicos não conseguiram comprovar essa ação imunomoduladora
da RBV em pacientes infectados por HCV, permanecendo uma dúvida
17
sobre se este fenômeno ocorre também in vivo. No entanto, permanece o
fato de que pacientes infectados por HCV e que fazem uso da terapia
antiviral com RBV e interferon-α apresentam carga viral menor que os
pacientes que fazem uso de interferon-α somente, reafirmando o papel de
droga antiviral para a RBV, sem, no entanto, demonstrar sua função
imunomoduladora (PAWLOTSKY et al., 2004).
Utilizando-se de seus mecanismos de ação antiviral, a RBV
apresentou atividade antiviral in vitro e/ou in vivo sobre vários vírus de
RNA pertencentes a diferentes famílias, como: Paramyxoviridae (HRUSKA
et al., 1980; LEYSSEN et al., 2005), Flaviviridae (NEYTS et al., 1996;
JORDAN et al., 2000; LEYSSEN et al., 2005), Picornaviridae (CROTTY et
al.,
2000),
Orthomyxoviridae (DURR
&
LINDH,
1975),
Arenaviridae
(JAHRLING et al., 1980; ANDREI & DE CLERCQ, 1990) e Bunyaviridae
(HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994; CASSIDY &
PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997). Diante do fato da RBV
apresentar
atividade
antiviral
sobre
diferentes
gêneros
da
família
Bunyaviridae (HUGGINS et al., 1986; SIDWELL et al., 1988 e 1994;
CASSIDY & PATTERSON, 1989; CRANCE et al., 1997), e pelo fato dos vírus
Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma pertencerem à mesma,
apresentando genoma de RNA e possuindo RNA polimerase, é possível que
a RBV possa apresentar atividade antiviral sobre estes vírus, porém, até o
momento, não há relatos na literatura sobre a ação deste medicamento
sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma.
18
1.2.1.2. Ácido Micofenólico
O ácido micofenólico (ácido (E)-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi7-metil-3-oxo-5-iso-benzofuranil)-4-metil-4- hexenóico) (Figura 5) é um
produto de fermentação de várias espécies de Penicillium como: P.
brevicompactum e P. stoloniferum (THE MERCK INDEX, 1996).
Figura 5: Estrutura química do ácido micofenólico. (Fonte: LIPSKY,
1996).
O ácido micofenólico (MPA) foi descrito pela primeira vez por
FLOREY e colaboradores em 1946 onde os pesquisadores observaram que
esta substância apresentava propriedades antifúngicas. Posteriormente,
KORZYBSKI e colaboradores (1967) verificaram que essa substância
também apresentava propriedades antibacterianas, mas foi em meados de
1969 que PLANTEROSE fez os primeiros relatos de atividade antiviral
relacionada ao MPA. Neste estudo, o pesquisador observou que o MPA foi
capaz de inibir a replicação em cultura de células, dos seguintes vírus:
vaccínia, herpes simplex, Semliki Forest, vírus da encefalomiocardite,
Coxsackie B1 e influenza (A-NWS). Entretanto, quando testes in vivo foram
19
realizados para vaccínia, Semliki Forest e vírus da encefalomiocardite,
PLANTEROSE
não
observou
qualquer
ação
antiviral
do
MPA.
Posteriormente, a função antimicrobiana do MPA deixou de ser avaliada
pela
comunidade
científica,
quando
este
medicamento
apresentou
atividade antineoplásica (TRESSLER et al., 1994) e imunossupressora,
podendo enfim, ser utilizado no tratamento de várias doenças, incluindo
artrite reumatóide (GOLDBLUM, 1993), psoríase (EPINETTE et al., 1987) e
na prevenção de rejeição de órgãos após transplante (LIPSKY, 1996).
O ácido micofenólico, de maneira similar à RBV, é um inibidor da
IMPDH, porém, o MPA não apresenta estrutura análoga de nucleosídeo,
como a RBV e não necessita sofrer processos de fosforilação intracelular
para ter ação inibitória sobre a IMPDH (ALLISON & EUGUI, 1996). O MPA
possui a capacidade de interagir com a IMPDH de maneira a alterar sua
estrutura conformacional, levando a formação de agregados anulares de
proteína impedindo a atividade enzimática da IMPDH (Figura 6). Estes
agregados não se associam a nenhuma organela intracelular e podem ser
convertidos aos tetrâmeros em arranjos lineares e funcionais pela ação da
GTP (Figura 6). Desta forma, observa-se que GTP age como um
antagonista do MPA, por se ligar à enzima e reverter a alteração
conformacional ocasionada pelo MPA (JI et al., 2006).
20
Figura
6:
Esquema
estrutural
das
alterações
conformacionais
ocorridas na IMPDH pela ação de MPA e nucleotídeos. (Fonte: JI et al.,
2006).
Com o advento da AIDS e com a descoberta de que o MPA
poderia agir sobre a IMPDH diminuindo os níveis intracelulares de GTP e
dGTP, ocasionando entre outros efeitos uma ação citostática sobre células
proliferativas, diversos grupos de pesquisa começaram a investigar a
possibilidade do MPA apresentar alguma ação anti-HIV. Foi assim que em
1995, ICHIMURA & LEVY demonstraram que o MPA, em concentrações
clinicamente aceitáveis de 1 a 10µM conseguia suprimir in vitro a
replicação do HIV. Posteriormente, MARGOLIS e colaboradores (1999)
demonstraram que o MPA apresentava sinergismo com abacavir, um
inibidor da transcriptase reversa, aumentando os efeitos anti-HIV. Neste
mesmo
ano,
MARGOLIS
e
colaboradores
propuseram
o
uso
da
combinação de micofenolato mofetil (MMF) (agente terapêutico proveniente
21
do MPA) com abacavir em pacientes portadores de linhagens de HIV
resistentes às terapias antiretrovirais convencionais.
A partir destes estudos ou concomitantemente a eles, outros
grupos de pesquisa começaram a cogitar a possibilidade do MPA ser
utilizado no tratamento de outras doenças virais. Assim, pesquisas
demonstraram que o MPA ou seu derivado MMF apresentaram atividade
antiviral in vitro e/ou in vivo sobre o vírus da febre amarela (NEYTS et al.,
1996), herpes simplex (potencializando a ação do aciclovir, ganciclovir e
penciclovir) (NEYTS & DE CLERCQ, 1998), vírus da hepatite B (HBV)
(GONG et al., 1999), vírus do dengue (DIAMOND et al., 2002) e reovirus
aviário (ROBERTSON et al., 2004). Além disso, o MMF foi capaz de inibir o
processo de miocardite ocasionado pelo vírus Coxsackie B3 em um modelo
experimental
utilizando
camundongos,
sem,
no
entanto,
inibir
a
replicação do vírus (PADALKO et al., 2003).
Com relação aos vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e
Tacaiuma, não há relatos na literatura descrevendo a ação do ácido
micofenólico sobre a replicação destes vírus, sendo que o mesmo poderá
apresentar ação antiviral sobre estes vírus, uma vez que a droga inibe a
IMPDH e com isso reduz os níveis de GTP intracelular que são necessários
para o processo de replicação dos vírus de RNA.
22
1.2.2. Interferon-alfa
Interferon (IFN)-α é parte integrante de um conjunto de proteínas
pertencentes ao grupo dos Interferons (IFNs) que foram primeiramente
descritos como substâncias resistentes a pH ácido, produzidas por células
incubadas com vírus influenza inativado pelo calor e que poderiam inibir
(interferir com) a replicação do mesmo vírus ou vírus heterólogo quando
adicionado à outra cultura celular (ISAACS & LINDENMANN, 1957).
O IFN-α, também conhecido por IFN leucocitário pelo fato de ser
secretado em abundância por fagócitos mononucleares, pertence ao grupo
dos IFNs do tipo I que incluem ainda o IFN-β (interferon fibroblástico) e o
IFN-ω (proveniente de células hematopoiéticas) (JOHNSON et al., 1994).
Os seres humanos podem expressar mais de 10 subtipos de IFN-α (a
partir do gene IFNA), mas expressam somente um tipo de IFN-β (IFNB) e
um tipo de IFN-ω (IFNW), sendo que todos os genes estão presentes no
cromossomo 9 (SAMUEL, 1991) (Tabela 1). De maneira semelhante,
camundongos também expressam vários subtipos de IFN-α (>10), e
somente um IFN-β, sendo que os genes estão contidos no cromossomo 4
destes animais (KELLEY et al., 1983 e 1985; DANDOY et al., 1985).
Coletivamente, estes IFNs podem apresentar diversas funções
biológicas, como atividade antiviral (ISAACS & LINDENMANN, 1957;
GRESSER,
1990),
atividade
antiproliferativa
(FLEISCHMANN
&
FLEISCHMANN, 1988) e atividade imunomoduladora (MOORE, 1983;
23
BELARDELLI, 1995 e 1996), dependendo das vias de transdução de sinal
ativadas por eles nas células (DARNELL et al., 1994).
Tabela 1: Os tipos e subtipos de IFN tipo I (Fonte: FOSTER & FINTER,
1998).
Lócus gênico
Símbolo da proteína
Interferon-α
α
IFNA1
IFN-α1
IFNA2
IFN-α2
IFNA4
IFN-α4
IFNA5
IFNA6
IFN-α5
IFN-α6
IFNA7
IFN-α7
IFNA8
IFN-α8
IFNA10
IFN-α10
IFNA13
IFN-α13
IFNA14
IFN-α14
IFNA16
IFN-α16
IFNA17
IFN-α17
IFNA21
IFN-α21
Interferon-β
β
IFNB
Interferon-ω
ω
IFNW1
IFN-β
IFN-ω
Variantes alélicas
IFN-α1a
IFN-α1b
IFN-α2a
IFN-α2b
IFN-α2c
IFN-α4a
IFN-α4b
IFN-α5
IFN-α6
IFN-α7a
IFN-α7b
IFN-α7c
IFN-α8a
IFN-α8b
IFN-α8c
IFN-α10a
IFN-α10b
IFN-α13
IFN-α14a
IFN-α14b
IFN-α14c
IFN-α16
IFN-α17a
IFN-α17b
IFN-α17c
IFN-α17d
IFN-α21a
IFN-α21b
IFN-α24
24
Embora o IFN-α e o IFN-β sejam estruturalmente diferentes, eles
reconhecem o mesmo receptor, denominado IFNAR, presente na superfície
de todas as células eucarióticas. A ligação desses IFNs ao seu receptor
resulta na ativação de duas proteínas, a JAK1 e a Tyk2, que fosforilam os
fatores de transcrição STAT1 e STAT2, os quais formam um heterodímero
que desloca-se para o núcleo da célula onde se associa com p48/IRF-9
para formar o complexo ISGF3. O complexo ISGF3 liga-se a regiões
específicas do DNA e estimula a transcrição de vários genes. Atualmente
sabe-se que 100 genes podem ser estimulados à transcrição pela ligação
de IFN-α ao receptor, enquanto 300 genes podem ser transcritos pela
ligação do IFN-β (DER et al., 1998). Dentre os produtos gênicos
transcritos, destacam-se aqueles responsáveis pela atividade antiviral do
IFN tipo I como: proteína quinase ativada por RNA de dupla fita (PKR),
2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS) e proteínas Mx (KHABAR et al.,
2000).
A PKR é uma enzima presente em células eucarióticas em
quantidades
muito
pequenas,
que
aumenta
consideravelmente
na
presença de IFN tipo I. Contudo, PKR, no interior das células, apresentase sob uma forma inativa, não exercendo sua função até que ocorra
interação da mesma com RNA de dupla fita proveniente do processo
replicativo dos vírus. Interação entre PKR e RNA de dupla fita causa na
enzima uma mudança conformacional que resulta em autofosforilação e
dimerização tornando-a enzimaticamente ativa. PKR na forma ativa
fosforila e inibe um fator celular importante no processo de tradução de
25
proteínas, denominado eIF-2α prejudicando assim, a síntese protéica
(Figura 7) (citado por GARCIA-SASTRE, 2001).
De modo semelhante à PKR, no interior das células eucarióticas
existe baixa quantidade da enzima 2’,5’-oligoadenilato sintetase (2-5AS),
que aumenta após estímulo celular com IFN tipo I. A 2-5AS também
apresenta-se na forma inativa no interior das células, sendo que sua
ativação ocorre após interação com RNA de dupla fita. Assim, a 2-5AS
enzimaticamente ativa pode exercer sua função na ativação de uma RNase
latente (RNase L). A RNase ativada provoca a degradação dos RNAs
presentes
na
célula
incluindo
os
RNAs
mensageiros
e
os
RNAs
ribossômicos, prejudicando desta forma a síntese protéica (Figura 7)
(STARK et al., 1998).
Dentre os produtos gênicos induzidos pelo IFN tipo I, as
proteínas Mx são as que mais apresentam evidências experimentais de
sua atividade antiviral. Em modelos experimentais utilizando-se animais
foi demonstrado que as proteínas Mx, mesmo na ausência de qualquer
outra proteína induzida pelos IFN-α/β, foram capazes de bloquear a
replicação de diversos vírus (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al.,
1998). As proteínas Mx são GTPases que fazem parte de uma grande
família de GTPases semelhantes à dinamina, as quais estão envolvidas em
processos de endocitose e transporte de vesículas (STAEHELI et al., 1986;
Van der BLIEK, 1999). Para sua ação antiviral, as proteínas Mx formam
oligômeros, sendo que sua atividade GTPase é fundamental nesta ação
antiviral, assim como é importante também sua localização no meio
intracelular (PTOSSI et al., 1993). O genoma humano produz dois tipos de
26
proteínas Mx, a MxA e a MxB, ambas induzidas por interferon, mas que
divergem na sua capacidade antiviral (AEBI et al., 1989; HALLER et al.,
1998; STAEHELI et al., 1993). A proteína MxA normalmente acumula-se
no citoplasma da célula e apresenta atividade antiviral sobre membros da
família Orthomyxoviridae (vírus influenza A e C e vírus Thogoto)
(ARNHEITER et al., 1996; FRESE et al., 1995; HALLER et al., 1998;
MARSCHALL et al., 2000; PAVLOVIC et al., 1992), Paramyxoviridae (vírus
do sarampo e parainfluenza 3), Rhabdoviridae (VSV), Togaviridae (vírus
Semliki Forest) e Bunyaviridae (Vírus La Crosse, Hantaan, vírus da febre
do Vale Rift e vírus da febre de sandfly) (ARNHEITER et al., 1996; HALLER
et al., 1998; PAVLOVIC et al., 1995; FRESE et al., 1996; citado por
SAMUEL, 2001). Contudo, as proteínas MxA não apresentam qualquer
atividade antiviral sobre os vírus Mengo e EMC, pertencentes à família
Picornaviridae (citado por SAMUEL, 2001). Contrariamente ao observado
para as proteínas MxA, as proteínas MxB não apresentam propriedades
antivirais (Figura 7) (HALLER et al., 1998).
Camundongos também codificam duas proteínas Mx, a Mx1 e a
Mx2 (ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998). A Mx1 acumula-se
no núcleo (DREIDING et al., 1985) e é induzida pela ação de IFN tipo I,
sendo capaz de inibir a replicação dos vírus influenza e Thogoto
(ARNHEITER et al., 1996; HALLER et al., 1998; STAEHELI et al., 1993).
Contrariamente a Mx1, o gene que pode originar a proteína Mx2 não é
funcional nas linhagens de camundongos de laboratório (STAEHELI &
SUTCLIFFE, 1988), sendo, portanto, inviável a utilização destes animais
para demonstrar se a Mx2 apresenta ou não atividade antiviral. Contudo,
27
existem duas linhagens de camundongos, NJL e SPR, que apresentam o
gene que codifica a Mx2 funcional. Nestes animais, a proteína Mx2
acumulou-se no citoplasma após estímulo com IFN tipo I e foi capaz de
conferir resistência aos animais após inoculação de vírus da estomatite
vesicular (VSV) (JIN et al., 1999), apresentando, portanto, ação antiviral.
Figura 7: Mecanismos antivirais induzidos pela ação do IFN tipo I
(Fonte: STARK et al., 1998).
O IFN secretado por uma célula infectada pode agir tanto de
modo autócrino como parácrino nas células. De maneira autócrina, o IFN
tipo
I
estimula
na
célula
infectada,
os
mecanismos
antivirais
anteriormente citados, tendo como conseqüência a inibição do processo
replicativo viral. De modo parácrino, o IFN secretado age sobre as células
vizinhas que ainda não foram infectadas ativando nas mesmas um estado
28
antiviral, ou seja, torna as células resistentes à infecção viral (ABBAS &
LICHTMAN, 2005).
Além dos mecanismos antivirais já mencionados, o IFN tipo I
pode auxiliar o sistema imune no reconhecimento de células infectadas,
causando a destruição das mesmas. Neste caso, o IFN tipo I estimula o
aumento da expressão de moléculas MHC de classe I na superfície das
células infectadas que, carreando peptídeos virais, são facilmente
reconhecidas
pelos
linfócitos
TCD8+
citotóxicos.
Os
linfócitos
ao
reconhecerem os antígenos virais via MHC de classe I provocam nas
células infectadas a sua morte, estimulando a apoptose nas mesmas ou
causando sua lise (ABBAS & LICHTMAN, 2005). O IFN tipo I pode agir
sobre células NK (“natural killer”) e aumentar sua atividade citolítica
podendo assim, eliminar com mais facilidade células infectadas que
deixaram de expressar em sua superfície o MHC de classe I por uma
intervenção viral (ABBAS & LICHTMAN, 2005). Assim, as principais
atividades do IFN tipo I funcionam de comum acordo na tentativa de
erradicar infecções virais. Por isso mesmo, muitas pesquisas foram e estão
sendo realizadas com o intuito de utilizar o IFN tipo I como medicamento
antiviral. Para tanto, preparações farmacêuticas contendo IFN-α ou IFN-β
começaram a ser produzidas em diversos laboratórios e foram testadas in
vitro ou in vivo sobre diversos grupos virais. Destas pesquisas, as
preparações de IFN-α demonstraram ter efeito antiviral in vitro e/ou in
vivo sobre o vírus da febre sandfly Siciliana (CRANCE et al., 1997), vírus
da dengue (DIAMOND et al., 2000), Coronavirus SARS (TAN et al., 2004;
STRÖHER et al., 2004), vírus da hepatite murina (FUCHIZAKI et al.,
29
2003), vírus vaccínia (LIU et al., 2004), vírus Ebola (MAHANTY et al.,
2003), rotavírus (PETERSEN et al., 1997) e vírus da febre do Vale Rift
(MORRIL et al., 1989). Apesar de resultados promissores, as formulações
de IFN-α são utilizadas somente no tratamento das infecções crônicas
causadas
pelos
vírus
da
Hepatite
B
e
C
(DAVIS
et
al.,
1998;
McHUTCHISON et al., 1998) e no tratamento das infecções genitais
causadas pelo papiloma vírus humano (citado por SEN, 2001).
Como pudemos observar anteriormente, o IFN-α apresenta
atividade antiviral sobre dois membros da família Bunyaviridae, o vírus da
febre sandfly Siciliana e o vírus da febre do Vale Rift. Adicionalmente, há
na literatura uma descrição referente à ação do IFN-α, IFN-β e IFN-γ sobre
o vírus Caraparu (BRINTON et al., 1993). Neste estudo, fêmeas de
camundongos B6C3F1, de 4 a 6 semanas de idade, foram inoculadas
intra-peritonealmente com o vírus Caraparu e após o desenvolvimento de
necrose hepática coagulativa sucumbiram à doença e morreram entre 4 a
6 dias após a infecção. Tratamento destes animais com preparações de
IFN-α ou IFN-β não evitou a morte dos animais, não apresentando,
portanto, atividade antiviral sobre o vírus Caraparu. Contudo, tratamento
com IFN-γ aumentou de maneira significante o tempo de vida dos animais
infectados/tratados em relação aos animais infectados/não tratados com
IFN-γ (BRINTON et al., 1993). Apesar de haver este estudo, não há na
literatura qualquer relato da ação antiviral do IFN-α sobre os vírus
Oropouche, Guamá, Guaroa e Tacaiuma, o qual deve, portanto, ser
avaliado.
30
2. OBJETIVOS
Baseado no exposto e na tentativa de estabelecer um tratamento
eficaz para as arboviroses causadas pelos vírus Oropouche, Caraparu,
Guamá, Guaroa e Tacaiuma, os objetivos deste trabalho foram:
2.1. Avaliar a ação antiviral in vitro dos medicamentos Ribavirina,
Ácido Micofenólico e Interferon-α-2a sobre os Orthobunyavirus: Oropouche,
Caraparu,
Guamá,
Guaroa
e
Tacaiuma,
utilizando
para
tanto,
a
metodologia de ensaio de placa com células Vero E6.
2.2. Avaliar a ação antiviral in vivo do medicamento Ribavirina e
da citocina recombinante Interferon-αA de camundongo sobre os vírus
Oropouche,
Caraparu,
Guamá,
Guaroa
e
Tacaiuma,
camundongos suíços recém-nascidos como modelo experimental.
utilizando
31
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Amostras Virais
As
amostras
dos
vírus
Oropouche
(BeAn19991),
Guamá
(BeAn277), Guaroa (BeH22063) e Tacaiuma (BeAn73) foram gentilmente
cedidas pelo Prof. Dr. Pedro Vasconcelos, do Instituto Evandro Chagas Belém, Brasil e pela Profa. Dra. Amélia Travassos da Rosa, da
Universidade do Texas - Texas, EUA. A amostra do vírus Caraparu
(SPAn2049) foi doada pela Profa. Dra. Terezinha Lisieux Coimbra, do
Instituto Adolfo Lutz - São Paulo, Brasil.
A partir destas amostras virais foram obtidos os estoques virais
ou sementes virais.
3.2. Estoque viral ou semente viral
As sementes virais foram utilizadas tanto para infectar as células
quanto os camundongos e foram preparadas como descrito a seguir.
Amostras do vírus Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV),
Guaroa (GROV) e Tacaiuma (TCMV) foram diluídas 1/100 em solução de
cloreto
de
sódio
(NaCl)
a
0,85%
(salina)
e
foram
inoculadas
intracerebralmente em camundongos suíços recém-nascidos (1 dia de vida)
na quantidade de 20µL/camundongo. Após o aparecimento dos sintomas
de encefalite nos animais caracterizado por paralisia dos membros
32
posteriores, tremor, dificuldade em se alimentar, os mesmos foram
sacrificados
por
hipotermia, para conservação dos vírus, e foram
identificados e armazenados em freezer –70oC. Posteriormente, os cérebros
destes animais foram retirados, macerados e misturados em salina
tamponada em fosfato (PBS) pH 7,2 – 7,4, numa proporção de 1:10 p/v (1
cérebro para 0,9mL de PBS). A suspensão obtida foi centrifugada a 2000×g
por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado, identificado e
armazenado à temperatura de –70oC até o uso.
3.3. Experimentos in vitro
3.3.1. Cultura de células
Células de rim de macaco verde africano, também denominadas
células Vero E6 (ATCC-CCL81) foram mantidas em meio mínimo essencial
(MeM, Cultilab, Campinas-SP, Brasil) suplementado com 10% de soro
bovino fetal (SBF) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), sob uma temperatura
média de 36oC e na presença de 5% de CO2. Os repiques para
manutenção celular foram realizados a cada 3 ou 4 dias, com a utilização
de tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil) para o desprendimento celular.
33
3.3.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vitro
•
Ribavirina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em
solução de NaCl a 0,85% em água destilada e estocada a 4oC.
•
Ácido micofenólico (Sigma Chemical Co. St. Louis MO): diluído
em solução etanólica a 30% e estocado a 4oC.
•
Interferon-alfa-2a ou Roferon-A (Hoffmann-La Roche, EUA):
mantido a 4oC.
•
Guanosina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO): diluída em
solução de etanol a 30% e estocada a 4oC.
•
Solução de “trypan blue” utilizada no ensaio de citotoxicidade:
Para cada 10mL da solução estoque adicionou-se 100mg de “trypan blue”
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 10mL de PBS. Esta solução foi
armazenada no escuro à temperatura ambiente.
•
Solução de agarose 1% utilizada no ensaio de placa: Para
cada 200mL de solução estoque adicionou-se 2g de agarose “low-meltingpoint” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em 200mL de água destilada.
A suspensão assim preparada foi esterilizada a 120oC e armazenada em
geladeira. No momento do uso, o gel formado era liquefeito colocando-se a
agarose em microondas por 2 minutos seguido de manutenção da solução
em banho-maria a 37oC até o uso.
•
Meio MeM 2x utilizado no ensaio de placa: Para cada litro de
meio adicionou-se 200mL de MeM 10x (suplementado com glutamina e
antibiótico) (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), 100mL de SBF (Cultilab,
Campinas-SP, Brasil), 20mL de uma solução de aminoácidos não-
34
essenciais (0,2mM) (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.), 2mL de uma
solução de piruvato de sódio (2mM) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
38mL de uma solução de bicarbonato de sódio a 8,4% e 500mL de água
destilada ou água deionizada em MILLI-Q. Todos os compostos foram
misturados, com exceção do SBF e o pH da solução foi corrigido para pH
7,2 – 7,4 com soluções de bicarbonato de sódio ou carbonato de sódio.
Posteriormente, foi adicionado à solução água destilada ou água
deionizada em MILLI-Q em q.s.p. 900mL. O meio obtido foi esterilizado por
processo de filtragem em membrana de poro de 0,22µm em um sistema
fechado (Corning, NY, EUA). Após a filtração, o SBF foi adicionado ao meio
e o mesmo foi aliquotado e armazenado em geladeira até o momento do
uso.
•
Solução de “naphtol blue-black” utilizada no ensaio de placa:
Para cada litro da solução estoque adicionou-se 1,0g de “naphtol blueblack” (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 13,6g de acetato de sódio
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 60mL de ácido acético glacial (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) e 940mL de água destilada. Esta solução foi
armazenada no escuro à temperatura ambiente (MORENS et al., 1985).
3.3.3. Avaliação da toxicidade da RBV, do MPA e do IFN-α
α-2a sobre
células Vero E6
A avaliação da toxicidade dos medicamentos selecionados sobre
as células Vero E6 foi realizada por meio da metodologia de exclusão por
“trypan blue” (KINCHINGTON et al., 1995). Resumidamente, células Vero
35
E6 distribuídas em placas de 24 cavidades receberam somente meio ou
este adicionado de diferentes concentrações de RBV, MPA ou IFN-α-2a
(Tabela 2). A placa foi, então, incubada por 3 dias em estufa a 36oC e 5%
de CO2. Decorrido o período de incubação, as células provenientes do
sobrenadante e as células desprendidas das cavidades com auxílio de
tripsina (Cultilab, Campinas-SP, Brasil), foram centrifugadas a 2000×g por
10 minutos a 4oC e ressuspensas em uma solução (v/v) de PBS e de
“trypan blue” (500µL de cada). Em seguida, realizou-se a contagem de
células mortas (azuis) e vivas (não coradas) em câmara de Neubauer e a
porcentagem de células viáveis foi calculada tanto para as células
incubadas com meio, como para as células incubadas com as diferentes
concentrações dos medicamentos. Determinada a concentração máxima
não tóxica, diluições da droga abaixo deste valor e incluindo o mesmo
foram utilizadas nos experimentos in vitro na presença dos vírus.
Tabela 2: Concentração dos medicamentos adicionados à cultura de
células Vero E6.
Medicamento
Concentrações utilizadas
Ribavirina
2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256 µg/mL
Ácido micofenólico
2; 4; 8; 16; 32; 64; 128 µg/mL
Interferon-alfa-2a
1; 10; 100; 1.000; 10.000; 100.000
UI/mL
36
3.3.4. Otimização da metodologia de ensaio de placa
O ensaio de placa utilizado para quantificação viral, foi
padronizado por nós, baseado na metodologia preconizada por MORENS e
colaboradores em 1985, com algumas modificações.
Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades e
incubadas por 24 horas a 36°C e 5% CO2 tiveram o meio removido e no
lugar deste foi adicionado 200µL de meio (controle negativo) ou 200µL das
diferentes diluições virais (10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7) provenientes da
diluição de alíquotas da semente viral em meio MeM contendo 5% de SBF.
As amostras foram distribuídas em quadruplicata conforme demonstrado
na figura 8 e as células foram incubadas por 2 horas a 36oC e 5% de CO2,
sofrendo agitação branda a cada 30 minutos. Após o período de
incubação, tanto o meio como o inóculo viral foram removidos e em
seguida, adicionou-se 1mL/cavidade de meio proveniente da mistura (v/v)
de agarose 1% e de meio MeM 2x e as células foram incubadas em estufa
por 3 dias para OROV e GUAV, 5 dias para CARV e GROV, e 9 dias para
TCMV. A cada 3 dias o meio (500µL de MeM 2x/agarose) era substituído
para
manutenção
da
viabilidade
celular.
Decorrido
o
período
de
incubação, o meio foi removido por completo e no lugar deste adicionou-se
500µL da solução de “naphtol blue black” e as placas foram incubadas por
15 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de
“naphtol blue black” foi removida e as placas formadas pela ação citolítica
dos vírus foram contadas utilizando-se microscópio invertido. O título viral
37
obtido foi determinado como PFU (Unidade Formadora de Placa) por
mililitro (mL), cujo cálculo está exemplificado na figura 8:
Meio
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Exemplo de cálculo de PFU/mL baseado na figura anterior:
•
Diluição viral onde é possível a contagem individual das placas (em
branco): 10-5
•
Média do total da contagem das placas: 8 placas ÷ 4 (quadruplicata)
=2
•
Resultado A: 2 x 105 PFU/200µL do inóculo viral
•
Correção do valor obtido para 1mL: multiplica por 5 o resultado A
•
Resultado B (definitivo): 2 x 105 x 5 PFU/mL = 1,0 x 106 PFU/mL
•
Neste caso, o título viral é: 1,0 x 106 PFU/mL
Figura 8: Esquema ilustrativo de uma placa de 24 cavidades após ser
submetida à metodologia de ensaio de placa, bem como um exemplo
de cálculo do título viral obtido pela leitura desta placa.
38
3.3.5. Avaliação da atividade antiviral da RBV, do MPA e do IFN-α
α-2a
sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vitro
Uma vez determinadas as concentrações não tóxicas dos
medicamentos para as células Vero E6 e uma vez padronizado o ensaio de
placa para OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, fomos avaliar a atividade
antiviral dos medicamentos sobre os vírus utilizando-se de 3 diferentes
análises
segundo
a
metodologia
preconizada
por
DIAMOND
e
colaboradores (2002).
Primeiramente analisamos o efeito antiviral dos medicamentos
quando adicionados à cultura celular, na concentração máxima não
tóxica, em um período antecedente à infecção viral. Para este fim, células
Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com a
dose máxima não tóxica 24 horas antes do contato com o inóculo viral
(item 3.3.4), junto do inóculo viral e posteriormente ao mesmo no
momento da adição do meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle
negativo, células Vero E6 receberam somente meio nestes mesmos
períodos. Os medicamentos foram recolocados a cada três dias quando o
meio das células Vero E6 era substituído por meio novo (item 3.3.4).
Em uma segunda análise, fomos avaliar o efeito antiviral dos
medicamentos quando adicionados em cultura celular num período
posterior à infecção viral. Para tanto, células Vero E6 distribuídas em
placas de 24 cavidades foram tratadas com a dose máxima não tóxica dos
medicamentos 2 horas após a adição do inóculo viral conjuntamente ao
meio MeM 2x/agarose (item 3.3.4). Como controle negativo, células Vero
39
E6 receberam somente meio neste período. Além do período de 2 horas
após a infecção viral, foi testado também a atividade antiviral dos
compostos quando os mesmos eram adicionados 24, 48 e 72 horas após a
infecção viral. Da mesma maneira, os medicamentos eram recolocados a
cada três dias no momento da troca do meio de manutenção.
A terceira análise foi realizada somente após o medicamento ter
apresentado capacidade antiviral significante sobre os vírus, quando da
aplicação da primeira e segunda análise anteriormente descrita. Assim, a
terceira análise foi realizada com a finalidade de obter uma concentração
do medicamento menor que a máxima concentração não tóxica e que fosse
capaz de inibir de maneira significante a replicação viral em tratamentos
iniciados 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral. Portanto, tal
análise poderia sugerir uma dose com eficácia antiviral, mas que por estar
em menor concentração causaria menor dano celular.
A partir dos dados obtidos destas três análises, foi possível
predizer a possibilidade dos medicamentos selecionados de apresentarem
ou não atividade antiviral em experimentos in vivo, os quais foram
realizados em seguida.
40
3.4. Experimentos in vivo
3.4.1. Animais
Foram utilizados em todos os experimentos camundongos suíços
recém-nascidos provenientes do biotério central da Universidade de São
Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil. Os animais foram mantidos em
caixas individuais num sistema isolado no biotério do Centro de Pesquisa
em Virologia (USP), onde todos os experimentos foram realizados. Todos os
protocolos experimentais utilizando animais foram aprovados pelo Comitê
de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (USP) através do número 006/2004 (Anexo 10.3).
3.4.2. Compostos e soluções utilizados nos experimentos in vivo
• Ribavirina (Item 3.3.2) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO).
• Interferon-alfaA recombinante de camundongo expresso em E.
coli (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO): diluído em uma solução de NaCl a
0,85% e de albumina bovina a 0,1% conforme instruções do fabricante,
aliquotado e estocado a -70oC. No momento do uso, o IFN-αA foi diluído
em solução fisiológica gelada e permaneceu em gelo no decorrer dos
experimentos in vivo.
41
3.4.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100)
pela via de inoculação intra-peritoneal
Para determinar a DL50, alíquotas da semente viral foram
diluídas para 10-2 a 10-9 em solução salina e grupos de 6 camundongos
com 3 dias de vida foram infectados pela via intra-peritoneal com 40µL de
cada diluição. Nos dias subseqüentes, os animais foram observados tendo
sua mortalidade anotada. Cálculos envolvendo a quantidade de animais
sobreviventes e animais mortos foram feitos pelo método de Reed &
Muench (REED & MUENCH, 1938), obtendo-se, então a dose letal 50
(DL50) para cada vírus.
Após a determinação da DL50, grupos de 6 camundongos foram
infectados intra-peritonealmente com 10, 100 ou 1000 vezes a DL50 a fim
de se obter a dose capaz de causar a morte de 100% dos animais (DL100).
A dose obtida foi utilizada na infecção dos animais em todos os
experimentos in vivo.
3.4.4.
Determinação
da
concentração
máxima
tolerada
dos
medicamentos RBV e IFN-α
αA pelos camundongos suíços lactentes
Antes de verificar a ação dos medicamentos sobre os animais
infectados, foi determinada a concentração máxima de cada um dos
compostos que poderia ser utilizada e que não causaria reações adversas
ou morte nos mesmos (HUGGINS et al., 1986). Para tanto, diferentes
42
concentrações dos medicamentos (Tabela 3) foram inoculados pela via
intra-peritoneal (30µL/camundongo) iniciando o tratamento no 2o dia de
vida e prolongando-se por 10 dias (KOFF et al., 1983; KENDE et al., 1985;
KENYON et al., 1986; SASAKI et al., 1986; FUCHIZAKI et al., 2003). No
decorrer deste período, os animais foram observados e seus pesos foram
anotados,
bem
como
a
ocorrência
de
morte.
Como
controle
do
experimento, grupos de animais receberam somente salina via intraperitoneal e o peso destes camundongos foi anotado e comparado com os
dos animais tratados com os medicamentos.
Através da comparação estatística entre os pesos dos animais
tratados ou não com os medicamentos foi determinada a concentração
máxima tolerada dos compostos, a qual foi utilizada em todos os
experimentos in vivo.
Tabela 3: Concentração dos medicamentos RBV e IFN-αA testadas em
camundongos lactentes.
Medicamentos
Concentrações
Ribavirina
35; 45 mg/Kg/dia
Interferon-alfaA
103 UI/mL (30 UI); 104 UI/mL (300
UI); 105 UI/mL (3000 UI)
43
3.4.5. Metodologia para determinar a atividade antiviral da RBV e do
IFN-α
αA sobre os animais infectados
A determinação da atividade antiviral da RBV e do IFN-αA sobre
os animais infectados foi realizada segundo a metodologia preconizada por
HUGGINS e colaboradores (1986) e por SASAKI e colaboradores (1986).
Para tanto, dois tipos de análise foram utilizadas: uma profilática e outra
terapêutica.
Na análise profilática, os medicamentos e o placebo (salina)
foram administrados pela via intra-peritoneal (30µL), na concentração
máxima tolerada, 24 horas antes da infecção viral, no momento da
infecção e diariamente por mais 5 dias, totalizando 7 dias de tratamento.
As drogas foram administradas 1 vez ao dia.
Na análise terapêutica, os medicamentos começaram a ser
administrados 3 horas ou 24 horas após a infecção viral, seguido de uma
dose de manutenção a cada 24 horas totalizando também 7 dias de
tratamento. As drogas foram administradas 1 vez ao dia, num volume de
30µL/camundongo.
Durante o período de tratamento e posteriormente a ele, a
eficácia do medicamento foi avaliada a partir de 4 parâmetros: curva de
sobrevivência, tempo médio de vida, viremia e quantidade de vírus no
cérebro.
A curva de sobrevivência revelou graficamente a quantidade de
animais que sobreviveram à infecção por um determinado período de
44
tempo, comparando o grupo tratado com o medicamento com o grupo
tratado com salina. Os resultados provenientes da curva de sobrevivência
foram demonstrados em tabelas onde colocou-se o número total de
animais sobreviventes ao final do experimento sobre o número total de
animais inicialmente infectados (tratados ou não com medicamento).
O tempo médio de vida (TMV) correspondeu ao valor médio
obtido entre o 1o dia e o último dia em que houve o aparecimento de
animais mortos no decorrer do experimento.
A viremia e a quantificação de vírus no cérebro foram realizadas
segundo XIAO e colaboradores (2001). Para tanto, grupos de 18 animais
com 3 dias de vida foram infectados com a DL100 e foram tratados em dias
pré-determinados com os medicamentos ou com o placebo. Nos dias 1, 2,
3, 5, 7 e 9 após a infecção viral, foram retirados de 2 animais de cada
grupo 100µL de sangue e cérebro. Para determinação da viremia, o sangue
foi diluído 1/10 em meio MeM 1x contendo 5% de SBF, foi centrifugado a
2000×g por 10 minutos a 4oC e o sobrenadante obtido foi aliquotado e
armazenado a –70oC. Concomitantemente, os cérebros foram macerados e
misturados com meio MeM, numa proporção de 1:10 (1 cérebro para
0,9mL de meio MeM), a suspensão cerebral foi centrifugada a 2000×g por
10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi aliquotado e armazenado à
temperatura de –70oC. Posteriormente, o sobrenadante proveniente do
sangue e do cérebro foram diluídos de 10-2 a 10-6 ou 10-3 a 10-7 em meio
MeM (5% de SBF) e foram distribuídos em quadruplicata, em placas de 24
cavidades (200µL/cavidade) contendo monocamada de células Vero E6 e o
45
ensaio
seguiu
conforme
item
3.3.4.
Os
valores
obtidos
foram
demonstrados graficamente.
A eficácia antiviral dos medicamentos foi então analisada pela
sua capacidade de impedir a mortalidade, de aumentar o tempo de vida
dos animais, de inibir ou diminuir o processo virêmico e inibir ou diminuir
a replicação viral no cérebro.
3.5. Análise estatística
Para analisar os experimentos in vitro foram utilizados a análise
de variância (ANOVA) e o método de Tukey-Kramer. Para os experimentos
in vivo foi utilizado o Teste de t (Student’s t-test). Um valor de P menor que
0,05 (P<0,05) foi considerado estatisticamente significante. A análise de
variância, o método de Tukey-Kramer e o Teste de t (Student’s t-test) foram
realizados através do programa estatístico INSTAT, Graph Pad, Califórnia,
EUA.
46
4. RESULTADOS
4.1. Resultados referentes às padronizações
4.1.1. Concentração máxima não tóxica dos medicamentos RBV, MPA
e IFN-α
α-2a para células Vero E6
Utilizando-se das concentrações discriminadas na tabela 2 (item
3.3.3) podemos observar que a RBV apresenta elevado grau de toxicidade
sobre as células Vero E6 em concentrações ≥ 128µg/mL, com declínio da
viabilidade celular superior a 30% em relação às células cultivadas na
presença de meio somente (Figura 9). Porém, concentrações ≤ 64µg/mL
apresentaram uma viabilidade em torno de 80 a 90%, podendo, portanto,
serem utilizadas em culturas de células Vero E6 (Figura 9). No entanto,
DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que o uso da RBV na
concentração de 50µg/mL é capaz de inibir em 50% o crescimento das
células Vero E6, mostrando um efeito citostático sobre as mesmas. Diante
deste fato, concentrações ≤ 50µg/mL foram utilizadas para avaliar a
atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV em
cultura de células Vero E6.
Com relação ao MPA podemos observar pela figura 10 que a
concentração de 32µg/mL foi muito tóxica para as células, causando uma
diminuição da viabilidade celular em torno de 30% em relação às células
cultivadas com meio somente. Entretanto, doses ≤ 16µg/mL apresentaram
uma
porcentagem
de
viabilidade
em
torno
de
80
a
90%,
não
47
apresentando, portanto toxicidade significante sobre as células Vero E6.
Contudo, DIAMOND e colaboradores (2002) observaram que uma
concentração de MPA ≥ 10µg/mL causa um efeito citostático sobre as
células Vero E6, diminuindo em 50% seu processo replicativo. Assim
sendo, nos experimentos in vitro utilizamos concentrações de MPA ≤
10µg/mL.
Segundo dados da literatura, concentração de 100.000 UI/mL de
IFN-α-2a não apresenta qualquer efeito tóxico sobre células Vero E6 em
cultura (TAN et al., 2004) e corroborando com este dado, a figura 11
mostra-nos que a concentração de 100.000 UI/mL apresenta uma
porcentagem média de viabilidade de 95%. Dessa forma, doses ≤ 100.000
UI/mL foram utilizadas por nós nos experimentos in vitro.
Porcentagem de células
Vero E6 viáveis (%)
48
100
80
60
40
20
0
M
2
4
8 16 32 64 128 256
Concentração de RBV (µ
µ g/mL)
Figura 9: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na
presença de diferentes concentrações de RBV. A contagem das células
foi realizada em câmara de Neubauer após mantê-las incubadas em
solução de “trypan blue”. O valor proveniente da contagem das células
cultivadas com meio somente (M) representa o controle negativo. As
barras representam a média ± desvio-padrão (SD) de valores obtidos de
uma duplicata.
Porcentagem de células
Vero E6 viáveis (%)
49
100
80
60
40
20
0
M
2
4
8
16
32
64 128
Concentração de MPA (µ
µ g/mL)
Figura 10: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na
presença de diferentes concentrações de MPA. A contagem das células
foi realizada em câmara de Neubauer após incubá-las em solução de
“trypan blue”. Os dados provenientes da contagem das células cultivadas
com meio somente (M) representam o controle negativo. As barras
representam a média ± SD de valores obtidos de uma duplicata.
Porcentagem de células Vero
E6 viáveis (%)
50
100
80
60
40
20
0
M
1
10
100 1000 10000 100000
Concentração de IFN-α
α (UI/mL)
Figura 11: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na
presença de diferentes concentrações de IFN-α
α-2a. A contagem das
células foi realizada em câmara de Neubauer após incubá-las em solução
de “trypan blue”. Os dados provenientes da contagem das células
cultivadas com meio somente (M) representam o controle negativo. As
barras representam a média ± SD de valores obtidos de uma duplicata.
51
4.1.2. Susceptibilidade de camundongos suíços à infecção intraperitoneal pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM
Devido ao fato de algumas drogas a serem testadas não
atravessarem a barreira hemato-encefálica (IFNs) (RANG & DALE, 1993) e
outras não atingirem concentrações adequadas no cérebro (RBV) (KOFF et
al., 1983), a opção de inocular os vírus pela via cerebral causando uma
inflamação local e imediata, dificultaria a observação da ação dos
medicamentos sobre os vírus. Diante disso, optou-se por inocular os vírus
pela via intra-peritoneal (i.p.), que acarretaria primeiramente uma infecção
sistêmica (GONZALEZ-SCARANO et al., 1996) nos animais, permitindo
analisar de uma forma mais eficaz o efeito das drogas sobre os vírus.
Assim sendo, foi necessário saber se os Orthobunyavirus
selecionados eram capazes de provocar a morte dos animais quando
inoculados pela via intra-peritoneal. Relatos na literatura demonstraram
que o OROV (PINHEIRO et al., 1997) e GROV (MARCH & HETRICK, 1967;
TURNER et al., 1970) são capazes de levar à morte camundongos
lactentes inoculados pela via i.p. Contudo, até o momento, o mesmo não
foi relatado para CARV, GUAV e TCMV.
Diante disso, foram realizados testes com o intuito de verificar se
as sementes virais produzidas para os cinco vírus escolhidos eram
capazes de causar morte em animais suíços com três dias de vida quando
os vírus eram inoculados pela via intra-peritoneal (40µL). A título de
comparação e como um controle do experimento, outro grupo de animais
recebeu pela via intracerebral (i.c.) 20µL da mesma suspensão viral.
52
Os
resultados
demonstraram
que
os
5
Orthobunyavirus
selecionados possuem a capacidade de causar doença e provocar a morte
em camundongos lactentes com 3 dias de vida, quando inoculados pela
via i.p. (Figura 12). Contudo, a morte foi mais rápida quando os vírus
foram inoculados pela via i.c., com exceção do GROV que provocou a
morte de 100% dos animais até o 4o dia pós-infecção, independentemente
da via do inóculo.
Vale ressaltar que o volume injetado pela via i.p. foi o dobro
daquele inoculado pela via i.c., uma vez que, em testes anteriores
utilizando-se o volume de 20µL em ambas inoculações, não observamos
100% de mortalidade para OROV e CARV.
Sabendo que os camundongos lactentes são susceptíveis aos
vírus supracitados quando os mesmos são inoculados pela via i.p. restou
determinar a DL50 e a DL100 para serem utilizadas em testes com as
drogas antivirais.
53
Sobrevivência (%)
OROV
100
80
IC
60
40
IP
20
0
0
2
4
6
8
10
Dias de infecção
GUAV
Sobrevivência (%)
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
60
40
20
0
0
2
4
6
8
Dias de infecção
GROV
TCMV
80
60
40
20
0
80
Dias de infecção
100
0
100
10
Sobrevivência (%)
Sobrevivência (%)
Sobrevivência (%)
CARV
2
4
6
8
10
100
10
Dias de infecção
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
Dias de infecção
Figura 12: Susceptibilidade de camundongos suíços à inoculação
intra-peritoneal de OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV. Camundongos
com 3 dias de vida foram inoculados com a semente viral na diluição de
1/20 pela via i.p. ou pela via i.c. Os resultados representam 1 de 2
experimentos realizados independentemente.
54
4.1.3. Determinação da dose letal 50 (DL50) e da dose letal 100 (DL100)
para os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM em animais suíços através
da via de inoculação intra-peritoneal
Os resultados da DL50 estão apresentados na tabela 4, a qual
mostra a DL50 por volume de inóculo bem como por mL de suspensão
viral.
Para a determinação da DL50 via i.p. dos animais inoculados com
OROV, a suspensão viral necessitou ser diluída de 10-1 a 10-6, pois em
experimentos prévios utilizando-se as diluições de 10-2 a 10-9 a DL50 ficou
abaixo de 102. Neste sentido, podemos inferir que os animais suíços com
três dias de vida já mostram certa resistência à infecção causada pelo
vírus ORO, os quais são totalmente resistentes à doença a partir do
quarto dia de vida. O mesmo fenômeno não foi observado para os outros
vírus estudados.
Tabela 4: DL50, por volume de inóculo e por mL, dos vírus ORO, CAR,
GUA, GRO e TCM pela administração intra-peritoneal em camundongos
suíços com 3 dias de vida.
DL50
Vírus
Por 40µL
Por mL
OROV
10
1.3
10
2.7
CARV
10
5.2
10
6.6
GUAV
10
7.0
10
8.4
GROV
10
6.4
10
7.8
TCMV
10
6.4
10
7.8
55
Após
a
obtenção
da
DL50,
realizamos
experimentos
para
determinar a DL100. Para tanto, grupos de 6 camundongos foram
inoculados intra-peritonealmente (40µL) com diferentes valores da DL50
(10 DL50; 100 DL50; 1.000 DL50) e os animais foram observados por um
período de 10 dias tendo sua mortalidade anotada. Os resultados estão
descritos na tabela 5.
Tabela 5: Valor de DL50 capaz de causar 100% de mortalidade (DL100) em
camundongos suíços com três dias de vida.
Vírus
DL100
OROV
10 DL50*
CARV
1.000 DL50
GUAV
100 DL50
GROV
100 DL50
TCMV
1.000 DL50
*Volume do inóculo foi de 100µL para obter 100% de mortalidade para o
vírus ORO, ao contrário dos outros vírus cujo inóculo foi de 40µL.
As doses acima determinadas foram utilizadas nos experimentos
in vivo para avaliação da eficácia antiviral dos medicamentos RBV e IFNαA.
56
4.1.4. Detecção e quantificação de vírus no sangue e no cérebro
Para utilizarmos a viremia e a quantidade de vírus no cérebro
como padrões de avaliação da eficácia antiviral dos medicamentos RBV e
IFN-αA, foi necessário saber em quais momentos os vírus aparecem nestes
dois tecidos e em quais títulos. Dessa forma, grupos de animais foram
inoculados
pela
via
intra-peritoneal
com
as
doses
letais
e
em
determinados dias o sangue e o cérebro foram retirados e processados
para quantificação viral. Como controle negativo, utilizou-se sangue e
cérebro de animais não infectados.
Através da figura 13 podemos observar que não foi possível
detectar a presença de vírus no sangue dos animais infectados por OROV
e CARV. Além disso, a quantidade de vírus encontrada no sangue dos
camundongos infectados por GUAV, GROV e TCMV foi muito reduzida,
muitas vezes não sendo confirmada em experimentos posteriores. Diante
destes resultados a viremia não foi utilizada como padrão de avaliação da
atividade antiviral dos medicamentos selecionados.
Com relação à quantificação de vírus no cérebro, esta pôde ser
realizada com sucesso e reprodutibilidade através da técnica de ensaio de
placa (item 3.3.4). Observando a figura 14 notamos que OROV foi
detectado no cérebro 72 horas após a inoculação do vírus. O mesmo foi
observado para GROV.
57
Viremia (Log10 PFU/mL)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
1
2
3
5
7
CARV
1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
2
3
5
7
9
GROV
1
2
3
5
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
1
2
3
5
7
TCMV
1
2
3
5
7
Dias após infecção
Figura
13:
Detecção
e
quantificação
de
vírus
no
sangue
de
camundongos infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV
utilizando a metodologia de ensaio de placa. Grupos de animais foram
infectados aos 3 dias de vida com a semente viral na DL100 e seu sangue
foi retirado e processado para quantificação viral. As barras representam o
valor médio ± SD de valores em duplicata. Os resultados representam 1 de
3 experimentos realizados independentemente.
58
O vírus CAR, de maneira similar ao TCMV, foi detectado em
quantidades elevadas no 5o dia após a inoculação dos animais e os
valorem mantiveram-se elevado até o final da doença (Figura 14).
Contrariamente aos vírus anteriores, GUAV foi encontrado
precocemente no cérebro, especificamente às 48 horas após o inóculo viral
e sua quantidade foi aumentando com o decorrer do período alcançando
valor máximo no 7o dia de infecção (Figura 14).
Diante dos resultados obtidos, a quantificação viral no cérebro
foi um dos parâmetros empregados para avaliar a atividade antiviral dos
medicamentos RBV e IFN-αA em camundongos lactentes.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
1
2
3
5
7
CARV
1
2
3
5
7
9
GROV
)
Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL)
59
1
2
3
5
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
1
2
3
5
7
TCMV
1
2
3
5
7
Dias após infecção
Figura 14: Detecção e quantificação de vírus no cérebro de animais
infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV utilizando a
metodologia de ensaio de placa. Grupos de animais foram infectados
aos 3 dias de vida com a DL100 e seus cérebros foram retirados e
processados para quantificação viral em dias determinados. As barras
representam o valor médio ± SD de valores em duplicata. Os resultados
representam 1 de 3 experimentos realizados independentemente.
60
4.1.5. Concentração máxima tolerada dos medicamentos RBV e IFNαA pelos camundongos suíços lactentes
Normalmente, a RBV é um medicamento antiviral bem tolerado,
contudo, ela freqüentemente causa anemia hemolítica em seus usuários
(RANG & DALE; 1993; GRATTAGLIANO et al., 2005). Diante disso, foi
procurado nos camundongos tratados com RBV sinal de uma possível
anemia, através da medida diária do peso dos mesmos e comparando os
valores obtidos com os pesos dos animais tratados com salina somente.
Perda significante de peso perante administração de uma determinada
dose foi interpretada como tóxica para os camundongos suíços lactentes.
Os resultados para RBV estão dispostos na figura 15 (A e B),
onde podemos observar que animais tratados com a concentração de
35mg/Kg/dia apresentaram aumento diário de peso semelhante aquele
dos animais tratados com salina. Por outro lado, animais que receberam a
dose de 45mg/Kg/dia mostraram dificuldade em adquirir massa corpórea,
apresentando um ganho de peso sempre inferior ao dos camundongos
controle (Figura 15B), sendo que a partir do 7o dia de tratamento a
diminuição de peso tornou-se significante em relação aos animais tratados
com salina (Figura 15A). Portanto, a concentração de 45mg de RBV/Kg de
peso foi considerada tóxica para os camundongos suíços lactentes por
provocar perda de peso significante (possível sinal de anemia) e foi por isso
descartada. Então, a dose de escolha para ser utilizada durante o
processo de avaliação antiviral da RBV in vivo foi a de 35mg de RBV/Kg de
peso/dia.
61
Com relação ao IFN-α, dados da literatura mostram que o mesmo
é
bem
tolerado
independentemente
por
da
diversas
idade
dos
linhagens
mesmos
de
(SASAKI
camundongos
et
al.,
1986;
LUKASZEWSKI & BROOKS, 2000; BROOKS & PHILLPOTTS, 1999;
FUCHIZAKI et al., 2003). Desta forma, até o presente momento não há
relatos na literatura descrevendo reações adversas após administração de
doses iguais a 105 UI/mL, a qual se aproxima da mais alta dose de IFN-α
recombinante (30 milhões de unidades/dia) administrada em humanos
para tratamento da hepatite B ou C (BROOKS & PHILLPOTTS, 1999).
Assim, foram testadas doses ≤ 105 UI/mL em camundongos lactentes por
um período de 10 dias.
Os
resultados
mostram
que
todas
as
doses
de
IFN-α
administradas intra-peritonealmente foram bem toleradas pelos animais
durante todo o período experimental (Figura 16A). Contudo, houve
pequena toxicidade durante a administração da concentração de 105
UI/mL, onde verificamos que os animais apresentaram certa dificuldade
em ganhar peso quando comparado com os animais que receberam salina,
mantendo um ganho de peso sempre inferior ao dos camundongos
controle (Figura 16B). Entretanto, estas diferenças não foram significantes
e
assim
sendo,
a
concentração
de
escolha
experimentos in vivo foi a de 105 UI/mL de IFN-α.
para
realização
dos
Média do peso (gramas)
62
A
Salina
35,0 mg/Kg
45,0 mg/Kg
15
*
* *
10
↓
5
0
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Média do ganho de peso
(gramas)
Dias de Vida
3
B
2
↓
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Dias de Vida
Figura 15: Determinação da concentração máxima tolerada de RBV
pelos camundongos suíços lactentes. O gráfico A representa a média do
peso diário em gramas dos camundongos que receberam salina ou
diferentes concentrações de RBV via intra-peritoneal, enquanto o gráfico B
representa a média do ganho de peso medido diariamente dos animais
tratados com salina ou diferentes concentrações de RBV. As setas
representam o 1o dia de administração da RBV. O tratamento foi realizado
por dez dias consecutivos. Resultados similares foram obtidos em um
segundo experimento. *p<0.05, estatisticamente significante quando
comparado com o grupo controle.
Média do peso (gramas)
63
10
Salina
A
8
103 UI/mL
6
105 UI/mL
104 UI/mL
4
↓
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Média do ganho de peso
(gramas)
Dias de vida
1.00
B
0.75
↓
0.50
0.25
0.00
0
2
4
6
8
10
12
14
Dias de Vida
Figura 16: Determinação da concentração máxima tolerada de IFN-αA
pelos camundongos suíços lactentes. O gráfico A representa a média do
peso diário em gramas dos camundongos que receberam salina ou
diferentes concentrações de IFN-αA via intra-peritoneal, enquanto o
gráfico B representa a média do ganho de peso medido diariamente dos
animais tratados com salina ou diferentes concentrações de IFN-αA. As
setas representam o 1o dia de administração do IFN-αA. O tratamento foi
realizado por dez dias consecutivos. Resultados similares foram obtidos
em um segundo experimento.
64
4.2. Resultados referentes à Ribavirina
4.2.1. Atividade antiviral da RBV sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e
TCMV in vitro
Posteriormente
à
padronização
do
ensaio
de
placa
e
à
determinação das doses não tóxicas de RBV sobre as células Vero E6,
foram realizados experimentos para observar atividade antiviral da RBV
sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM quando o medicamento era
adicionado à cultura em períodos de 24 horas antes ou 2 horas após a
infecção das células Vero E6.
A tabela 6 mostra-nos que a RBV (50µg/mL) não foi capaz de
inibir o ciclo replicativo dos vírus ORO, CAR ou GRO em nenhum dos
tipos de tratamento. Contudo, houve uma porcentagem de inibição, não
significante, sobre a formação de placas em cultura de células infectadas
pelo vírus GUA (Redução de 7%), em tratamento iniciado 24 horas antes
da infecção das células. Entretanto, a RBV foi capaz de inibir de maneira
significante a formação de placas pelo TCMV em ambos períodos de
tratamento, sendo que a inibição foi maior quando o tratamento das
células foi realizado 24 horas antes da infecção, com uma redução de
aproximadamente
85%
(p<0.005)
na
formação
de
placas
quando
comparada à quantidade de placas formadas na cultura de células
tratadas com meio somente (Tabela 6). A adição de RBV no período de 2
horas após a infecção das células com TCMV inibiu em 62% (p<0.01) a
formação de placas (Tabela 6).
65
Tabela 6: Efeito da adição de RBV (50µg/mL) sobre a replicação dos
Orthobunyavirus em cultura de células Vero E6.
Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%)
Tratamento 24h antes da
Tratamento 2h após a
infecção
infecção
OROV
0
0
CARV
0
0
GUAV
7
0
GROV
0
0
TCMV
85
Vírus
a
b
a
62
b
p<0.005
p<0.01
Este resultado demonstra que a RBV não possui atividade
antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV e GROV. Ao contrário, a RBV
parece apresentar atividade antiviral sobre o TCMV in vitro e a partir desta
informação fomos avaliar a capacidade deste medicamento em inibir o
TCMV em outras condições.
Para tanto, células Vero E6 foram tratadas com concentrações ≤
50µg/mL nos mesmos períodos analisados anteriormente, a fim de
observarmos se doses menores de RBV também apresentariam capacidade
de inibir a replicação do TCMV.
A figura 17 (A e B) mostra-nos que somente a concentração de
50µg/mL é capaz de inibir o ciclo replicativo do TCMV em ambos períodos
de tratamento, como demonstrado na tabela 6, sugerindo que o processo
inibitório da RBV sobre o TCMV é dependente da dose.
66
10
A
9
8
7
6
*
5
Log10 PFU/mL
4
3
2
M
10
20
30
40
50
10
B
9
8
7
6
*
5
4
3
2
M
10
20
30
40
50
Concentração de RBV (ug/mL)
Figura 17: Observação do efeito de concentrações menores ou iguais
a 50µg/mL de RBV sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6
distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou
este adicionado de diferentes concentrações de RBV, 24 horas antes (A) ou
2 horas após (B) a infecção pelo TCMV. 9 dias depois, o meio foi removido,
as células foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas
foram contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL
obtido de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo
experimento. *p<0.05 em relação às células infectadas e tratadas com
meio.
67
Posteriormente, fomos verificar se a dose de 50µg/mL de RBV
teria efeito inibitório sobre o TCMV quando adicionado à cultura em
períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral. Pela análise da figura 18,
podemos observar que a RBV não mais apresenta atividade inibitória
sobre a replicação do TCMV quando adicionada à cultura em períodos de
24 e 48 horas após infecção, sugerindo que a RBV não consegue inibir o
processo replicativo quando este já foi iniciado, tendo capacidade
inibitória somente quando adicionada antes do processo replicativo ou
concomitantemente ao seu início, demonstrando que a RBV apresenta
uma atividade antiviral limitada sobre TCMV. Apesar disso, fomos
investigar se a ação inibitória da RBV sobre TCMV foi causada por uma
redução nos níveis de GTP intracelular.
Para elucidar isto, guanosina exógena na concentração de
30µg/mL foi adicionada à cultura junto com a RBV no período de 24
horas antes da infecção das células Vero E6 pelo TCMV. A figura 19
mostra-nos que a RBV inibe a replicação do TCMV, mas a adição de
guanosina consegue reverter esta inibição, sugerindo que a atividade
antiviral da RBV sobre TCMV está relacionada à inibição da enzima
IMPDH e como conseqüência, à uma diminuição dos níveis de GTP
intracelular que parece ser necessário ao processo replicativo do TCMV.
68
10
Log10 PFU/mL
9
8
7
6
5
4
3
2
M
24
48
Horas após infecção
Figura 18: Observação do efeito da RBV sobre a replicação do TCMV,
quando a droga foi adicionada 24 ou 48 horas após a infecção viral.
Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas
com meio (M) ou este adicionado de RBV (50µg/mL) 24 ou 48 horas após a
infecção pelo TCMV. Depois de 9 dias, o meio foi removido, as células
foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram
contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido
de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo
experimento.
69
10
Log10 PFU/mL
9
8
7
6
5
4
3
2
M
M+G
RBV
RBV+G
Tipo de tratamento
Figura 19: Adição de guanosina à cultura reverte a ação inibitória da
RBV sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6 distribuídas em
placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M), ou meio adicionado
de guanosina (30µg/mL), ou meio adicionado de RBV (50µg/mL), ou meio
adicionado de RBV e guanosina 24 horas antes da infecção pelo TCMV.
Após 9 dias, o meio foi removido, as células foram coradas pela solução de
“naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala de barras
representa a média ± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata.
70
4.2.2. Atividade antiviral da RBV sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO
e TCM em experimentos in vivo
Primeiramente iniciamos com a análise profilática, onde os
animais foram tratados com 35mg de RBV/Kg/dia 24 horas antes de
serem inoculados com a semente viral diluída para a DL100. Como controle
um grupo de animais recebeu somente salina antes de serem infectados.
Os resultados estão expostos na tabela 7, onde podemos notar que a RBV
não foi capaz de prevenir a morte dos animais infectados por OROV,
CARV, GUAV, GROV e TCMV, assim como não foi capaz de aumentar o
tempo de vida dos camundongos infectados, gerando resultados similares
aos dos animais infectados e tratados com salina (Tabela 7).
Tabela 7: Efeito da administração de RBV sobre a vida de animais
infectados com os Orthobunyavirus.
TMVb ± SD
TMV± SD
(Dias)
(Dias)
Salina
RBV
1/16 (6%)
11.0 ± 2.8
11.5 ± 3.5
1/16 (6%)c
2/16 (12%)
9.0 ± 2.8
14.0 ± 7.0
GUAV
0/16
0/16
7.0 ± 1.4
7.0 ± 1.4
GROV
0/16
0/16
5.5 ± 2.1
5.5 ± 2.1
TCMV
0/16
0/16
8.5 ± 2.1
8.0 ± 1.4
Vivos a/total
Vivos/total
Salina
RBV
OROV
0/16
CARV
Vírus
a
Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de
animais que participaram do experimento
b Tempo médio de vida (TMV)
c Razão de sobrevivência (x%)
71
Diante de tais resultados, fomos pesquisar a quantidade de vírus
no cérebro dos animais infectados e tratados com salina, bem como dos
animais infectados e tratados com a RBV a fim de observarmos se existia
alguma diferença em relação ao título viral no cérebro de ambos grupos
analisados.
A figura 20 mostra que tratamento com RBV 24 horas antes da
infecção não apresenta qualquer influência na migração dos vírus para o
cérebro, uma vez que os vírus apareceram em tempos iguais, com exceção
do
GROV,
onde
observamos
que
animais
tratados
com
salina
apresentaram vírus no cérebro aos três dias de infecção, enquanto nos
animais tratados com RBV nada foi detectado neste dia. Adicionalmente,
tratamento com RBV foi incapaz de diminuir o título viral no cérebro dos
animais, pois as quantidades encontradas foram similares em ambos
grupos estudados, podendo explicar o motivo pelo qual o período de morte
de ambos grupos foi similar.
Diante dos resultados obtidos, a análise terapêutica deixou de
ser realizada, uma vez que já foi possível observar que a RBV não possui
atividade antiviral sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV in vivo,
sugerindo que estes vírus são resistentes à ação antiviral da RBV.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
Salina
RBV
1
2
3
5
7
Dias após infecção
Quantidade de vírus no
cérebro (PFU/mL)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CARV
1
2
3
5
7
9
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
1
Dias de infecção
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GROV
1
2
2
3
5
7
Dias de infecção
mL)
Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL)
72
3
5
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
TCMV
1
2
3
5
7
Dias após infecção
Figura 20: Influência da RBV sobre a quantidade de vírus encontrado
no cérebro de animais infectados com OROV, CARV, GUAV, GROV e
TCMV. Camundongos foram inoculados i.p. com os vírus e foram tratados
com RBV (35mg/Kg/dia) ou salina nos dias –1 a 5 da infecção, sendo que
em dias determinados, os cérebros dos animais foram removidos e
devidamente processados para quantificação viral por método de ensaio de
placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de vírus
encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por
experimento.
Estes
independentes.
resultados
representam
1
de
2
experimentos
73
4.3. Resultados referentes ao Ácido Micofenólico
4.3.1. Avaliação da capacidade antiviral do MPA sobre OROV, CARV,
GUAV, GROV e TCMV in vitro
Uma vez que a dose de 10µg/mL de MPA não apresenta efeito
tóxico sobre as células Vero E6 e uma vez que esta concentração equivale
aos níveis clinicamente terapêuticos (LIPSKY, 1996), a mesma foi
escolhida para investigar as propriedades antivirais do MPA sobre os vírus
ORO, CAR, GUA, GRO e TCM in vitro.
Assim, MPA adicionado às células Vero E6 em períodos de 24
horas antes ou 2 horas após a infecção com TCMV foi capaz de inibir de
maneira
significante
o
processo
replicativo
deste
vírus
(p<0.005),
chegando a inibir por completo a replicação quando o tratamento das
células foi iniciado 24 horas antes da infecção (Tabela 8). Adicionalmente,
o MPA foi capaz de inibir significantemente a replicação do GUAV em
tratamento anterior à infecção viral (p<0.05), sem, no entanto, inibir sua
replicação quando o tratamento foi iniciado 2 horas após a infecção.
Com relação aos vírus ORO, CAR e GRO, os mesmos não tiveram
seu processo replicativo inibido pelo tratamento celular com MPA,
demonstrando que MPA não apresenta efeito antiviral sobre estes vírus in
vitro (Tabela 8).
74
Tabela 8: Efeito da adição de MPA (10µg/mL) sobre a replicação dos
Orthobunyavirus brasileiros em cultura de células Vero E6.
Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%)
Tratamento 24h antes da
Tratamento 2h após a
infecção
infecção
OROV
0
0
CARV
0
0
GUAV
79
GROV
0
TCMV
100
Vírus
a
b
a
0
0
b
95
b
p<0.05
p<0.005
Com o intuito de saber se a diminuição da capacidade replicativa
dos vírus GUA e TCM foi ocasionada por uma redução dos níveis de GTP
intracelular, nós adicionamos à cultura de células Vero E6, guanosina
exógena na concentração de 30µg/mL, concomitantemente ao tratamento
com MPA, no período de 24 horas antes da infecção pelo GUAV e TCMV. A
figura 21 mostra que o MPA inibe parcialmente a replicação do vírus GUA
e inibe por completo a replicação do vírus TCM, porém a adição de
guanosina consegue eficientemente reverter a ação inibitória do MPA
sobre estes vírus, sugerindo que a atividade antiviral do MPA, neste caso,
está relacionada à inibição da enzima IMPDH que tem como conseqüência
uma redução dos níveis de GTP intracelular que parece ser necessário à
replicação dos vírus GUA e TCM.
Log10 PFU/mL
75
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
M
M+G
MPA
MPA+G
M+G
MPA
MPA+G
TCMV
M
Tipo de tratamento
Figura 21: Adição de guanosina à cultura reverte a ação inibitória do
MPA sobre a replicação do GUAV e TCMV. Células Vero E6 distribuídas
em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M), ou meio
adicionado de guanosina (30µg/mL), ou meio adicionado de MPA
(10µg/mL), ou meio adicionado de MPA e guanosina 24 horas antes da
infecção pelo GUAV ou TCMV. Em dias determinados, o meio de cultura
foi removido, as células foram coradas pela solução de “naphtol blue
black” e as placas foram contadas. A escala em barras representa a média
± SD de PFU/mL obtido de quadruplicata. Resultados similares foram
obtidos em um segundo experimento.
76
Devido ao fato do MPA não possuir capacidade de inibir o ciclo
replicativo dos vírus ORO, CAR, e GRO, e diante do fato do MPA
apresentar efeito inibitório sobre GUAV somente quando o medicamento é
adicionado 24 horas antes da infecção, nós decidimos analisar somente a
ação do MPA sobre o TCMV em outras condições.
Assim, fomos avaliar qual seria o efeito de concentrações ≤
10µg/mL de MPA sobre a replicação do TCMV. A figura 22 mostra-nos que
somente a concentração de 10µg/mL é capaz de inibir o ciclo replicativo
do TCMV em períodos de tratamento de 24 horas antes ou 2 horas após a
infecção viral, conforme observado na tabela 8, sugerindo que o processo
inibitório do MPA sobre TCMV depende da dose administrada.
Adicionalmente, fomos verificar se a dose de 10µg/mL de MPA
teria efeito inibitório sobre TCMV quando adicionado à cultura em
períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral. Pela análise da figura 23,
podemos observar que MPA perde sua capacidade inibitória sobre TCMV
quando adicionada à cultura em períodos ≥ 24 horas após infecção. Este
resultado demonstra que o MPA não consegue inibir o processo replicativo
quando o mesmo já foi iniciado, sugerindo, que este composto, assim
como a RBV, apresenta uma atividade antiviral limitada sobre TCMV.
Log10 PFU/mL
77
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
A
0
0.625 1.25
2.5
5
10
B
*
0
0,625 1,25
2,5
5
10
Concentração de MPA (µ
µg/mL)
Figura 22: Observação do efeito de concentrações ≤ 10µg/mL de MPA
sobre a replicação do TCMV. Células Vero E6 distribuídas em placas de
24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de
diferentes concentrações de MPA 24 horas antes (A) ou 2 horas após (B) a
infecção pelo TCMV. Nove dias depois, o meio foi removido, as células
foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram
contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido
de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo
experimento. *p<0.05 em relação às células infectadas/tratadas com meio.
Log10 PFU/mL
78
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
M
24
48
Horas após infecção
Figura 23: Observação do efeito do MPA sobre a replicação do TCMV,
quando a droga foi adicionada 24 ou 48 horas após a infecção viral.
Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 cavidades foram tratadas
com meio (M) ou este adicionado de MPA (10µg/mL) 24 ou 48 horas após a
infecção pelo TCMV. Depois de 9 dias, o meio foi removido, as células
foram coradas pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram
contadas. A escala em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido
de quadruplicata. Resultado semelhante foi obtido em um segundo
experimento.
79
4.3.2. Avaliação da capacidade antiviral da RBV e do MPA quando
utilizados concomitantemente sobre os vírus ORO, CAR e GRO
Até o momento, observamos que tanto a RBV quanto o MPA não
tiveram qualquer ação antiviral sobre os vírus ORO, CAR e GRO quando
testados separadamente. Sabendo que a RBV é um análogo da guanosina
e um inibidor competitivo da IMPDH, e que o MPA é um inibidor de
IMPDH não competitivo, nós investigamos a possibilidade de uma
combinação destes dois medicamentos ser capaz de inibir a replicação dos
vírus
ORO,
CAR
e
GRO.
Primeiramente,
fomos
determinar
uma
combinação das drogas que não fosse tóxica para as células Vero E6. Para
tanto, células Vero foram incubadas por três dias na presença das
combinações dos compostos descritas na Tabela 9 e sua viabilidade foi
determinada pelo uso do método de exclusão por “trypan blue” conforme
item 3.3.3.
Tabela 9: Combinações dos medicamentos RBV e MPA a serem testadas
sobre as células Vero E6.
Concentrações utilizadas em µg/mL
RBV
MPA
50
0
0
10
50
10
25
10
50
5
5
25
80
O resultado da toxicidade da combinação dos compostos está
representado na figura 24, onde podemos observar que os compostos
quando utilizados sozinhos não são tóxicos para as células Vero E6 como
previamente sugerido (item 4.1.1). Entretanto, quando adicionamos à
cultura 50µg/mL de RBV com 10µg/mL de MPA a viabilidade celular
diminuiu em mais de 50%, sendo uma combinação extremamente tóxica
para as células Vero E6. Contudo, as combinações restantes (Tabela 9)
foram bem toleradas pelas células, mas a mais bem tolerada, gerando
uma viabilidade celular em torno de 90%, foi a combinação de 25µg/mL
de RBV com 10µg/mL de MPA, sendo portanto, a combinação escolhida
para ser testada sobre as células infectadas pelos vírus ORO, CAR e GRO.
A figura 25 mostra-nos os resultados provenientes da ação da
combinação dos compostos RBV e MPA sobre OROV, CARV e GROV, onde
podemos observar que a combinação escolhida foi capaz de inibir
fracamente a replicação do CARV, sem, no entanto ser estatisticamente
significante (p=0.07). Contrariamente, o uso conjunto de RBV e MPA não
foi capaz de inibir o ciclo replicativo do OROV e GROV, sugerindo que o
processo replicativo destes vírus parece ser pouco dependente dos níveis
de GTP intracelular disponíveis.
Concentração de MPA e
RBV (µ g/mL)
81
MPA5/RBV25
MPA5/RBV50
MPA10/RBV25
MPA10/RBV50
RBV50
MPA10
Meio
0
25
50
75
100
125
% células Vero E6 viáveis
Figura 24: Viabilidade das células Vero E6 após 72 horas de cultivo na
presença de diferentes combinações dos compostos RBV e MPA. A
contagem das células Vero E6 viáveis foi realizada em câmara de
Neubauer após mantê-las incubadas em solução de “trypan blue”. O valor
proveniente da contagem das células cultivadas com meio somente
representa o controle negativo. As barras representam a média ± desviopadrão (SD) dos valores obtidos em triplicata.
82
Log10 PFU/mL
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
Meio
RBV 50µ
µ g/mL
MPA 10µ
µ g/mL
MPA10/RBV25µ
µ g/mL
M
RBV
MPA
MPA/RBV
CARV
M
RBV
MPA
MPA/RBV
GROV
M
RBV
MPA
MPA/RBV
Tipo de tratamento
Figura 25: Observação do efeito da combinação de RBV e MPA sobre a
replicação dos vírus ORO, CAR e GRO. Células Vero E6 distribuídas em
placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este adicionado de
diferentes combinações de RBV e MPA 24 horas antes da infecção viral.
Em dias pré-determinados, o meio foi removido, as células foram coradas
pela solução de “naphtol blue black” e as placas foram contadas. A escala
em barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido de duplicata.
Similar resultado foi obtido em um segundo experimento.
83
4.4. Resultados referentes ao Interferon-alfa
4.4.1. Atividade antiviral do IFN-α sobre os vírus ORO, CAR, GUA,
GRO e TCM in vitro
Posteriormente
à
padronização
do
ensaio
de
placa
e
à
determinação das doses não tóxicas de IFN-α-2a sobre as células Vero E6,
foram realizados experimentos para observar se o IFN-α-2a apresentaria
ou não atividade antiviral sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV
quando o medicamento era adicionado à cultura em períodos de 24 horas
antes ou 2 horas após a infecção das células Vero E6.
Os resultados obtidos estão expostos na tabela 10, onde
podemos observar que o IFN-α-2a na concentração de 100.000 UI/mL foi
capaz de inibir de maneira significante (p<0.0005) o ciclo replicativo de
todos os vírus em estudo nos dois tipos de tratamento.
Tabela 10: Efeito da adição de IFN-α-2a (100.000 UI/mL) sobre a
replicação dos Orthobunyavirus em cultura de células Vero E6.
Porcentagem de inibição sobre a formação de placas (%)
Tratamento 24h antes da
Tratamento 2h após a
infecção
infecção
OROV
99a
99a
CARV
100
100
GUAV
100
100
GROV
100
100
TCMV
100
99a
Vírus
a
p<0.0005
84
Uma vez que o IFN-α-2a foi capaz de inibir o ciclo replicativo de
todos os vírus em estudo, fomos verificar se doses < 100.000 UI/mL
teriam capacidade de inibir a replicação viral quando adicionada à cultura
em período de 2 horas após a infecção.
A figura 26 mostra que a concentração de 10.000 UI/mL foi
capaz de inibir por completo a replicação dos vírus CAR, GUA e GRO
(p<0.01) e inibiu parcialmente, mas significantemente a replicação do
vírus TCM (p<0.01). Contudo, 10.000 UI/mL não teve qualquer efeito
inibitório sobre a replicação do vírus ORO. Adicionalmente, podemos notar
que a concentração de 1.000 UI/mL foi capaz de inibir de maneira
significante a replicação dos vírus CAR, GRO e TCM (p<0.01), sem no
entanto, apresentar atividade antiviral sobre OROV e GUAV.
Em seguida, fomos observar se a concentração de 100.000 UI/ml
de IFN-α-2a seria capaz de inibir a replicação dos vírus em períodos iguais
e posteriores a 24 horas após a infecção.
A figura 27 nos mostra que tratamento com IFN-α-2a iniciado 1
dia depois da infecção viral foi capaz de inibir significantemente a
replicação do GUAV (p<0.01) e TCMV (p<0.001), sem alterar a replicação
do OROV, CARV e GROV. Adicionalmente, tratamento realizado 2 dias
após a infecção viral foi capaz de inibir a replicação do TCMV (p<0.001).
Os resultados obtidos sugerem que IFN-α-2a apresenta atividade
antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, porém esta é
limitada e dependente tanto da concentração do medicamento como do
início do período de tratamento.
85
10
OROV
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
M
1
10
100
1000
10000
10
CARV
9
Log10 PFU/mL
8
10
8
7
7
6
6
*
5
5
4
4
3
3
2
2
1
0
*
M
1
10
100
1000
10000
1
0
*
M
1
10
100
1000
10000
10
10
GROV
9
8
7
7
6
6
5
5
4
3
2
2
1
*
1
10
100
*
4
*
3
M
TCMV
9
8
0
GUAV
9
1000
10000
*
1
0
M
1
10
100
1000
10000
Concentração de IFN-α
α-2a (UI/mL)
Figura 26: Observação do efeito de concentrações menores que
100.000 UI/mL de IFN-α-2a sobre a replicação dos vírus ORO, CAR,
GUA, GRO e TCM. Células Vero E6 distribuídas em placas de 24 poços
foram
tratadas
com
meio
(M)
ou
este
adicionado
de
diferentes
concentrações de IFN-α-2a, duas horas após a infecção pelos vírus
supracitados. Em dias determinados, as placas foram reveladas e
contadas. A escala de barras representa a média ± SD de PFU/mL obtido
de
duplicata.
Resultado
semelhante
foi
obtido
em
um
segundo
experimento. *p<0.01 em relação às células tratadas com meio somente.
86
Log10 PFU/mL
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
M
1
2
CARV
M
1
2
3
GROV
M
1
2
3
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
*
M
1
2
TCMV
**
**
M
1
2
3
4
5
Dias de tratamento com IFN-α
α-2a
Figura 27: Observação do efeito do IFN-α-2a sobre a replicação dos
vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM, quando a droga é adicionada em
períodos ≥ 24 horas após a infecção viral. Células Vero E6 distribuídas
em placas de 24 cavidades foram tratadas com meio (M) ou este
adicionado de IFN-α-2a (100.000 UI/mL) em períodos ≥ 24 horas após a
infecção pelo vírus supracitados. Em dias determinados, as placas foram
reveladas e contadas. A escala em barras representa a média ± SD de
PFU/mL obtido de duplicata. Resultado semelhante foi obtido em um
segundo experimento. *p<0.01 e **p<0.001 em relação às células tratadas
com meio somente.
87
4.4.2. Atividade antiviral do IFN-α sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e
TCMV em experimentos in vivo
Os experimentos in vivo foram iniciados com a análise profilática,
onde os animais foram tratados com 100.000 UI/mL de IFN-α, 24 horas
antes de serem inoculados com a semente viral diluída para a DL100.
Como controle, um grupo de animais recebeu somente salina antes de
serem infectados. Os resultados estão expostos na tabela 11, onde
podemos observar que o IFN-α foi capaz de impedir em 100% a morte dos
animais infectados por OROV e GROV, contrastando com a ausência de
sobreviventes no grupo controle. Em relação aos animais infectados com
CARV, podemos observar que houve uma sobrevida de aproximadamente
40% nos animais tratados com IFN-α, um valor superior àquele observado
no grupo controle, que apresentou uma sobrevida de aproximadamente
10%, sugerindo que este aumento no número de sobreviventes possa estar
relacionado à uma ação antiviral do IFN-α. Diferente do observado para
OROV, GROV e CARV, o IFN-α foi incapaz de prevenir a morte dos animais
infectados por GUAV e TCMV, porém, o tratamento com IFN-α prolongou
um pouco o tempo médio de vida dos camundongos (Tabela 11).
Pela comparação da sobrevida dos animais, podemos inferir que
a citocina IFN-α, quando administrada 24 horas antes da infecção, tem
atividade antiviral in vivo sobre OROV e GROV, mostrando uma ação
antiviral parcial sobre CARV e ausente atividade sobre GUAV e TCMV.
88
Tabela 11: Efeito da administração de IFN-α sobre a vida de animais
infectados com os Orthobunyavirus.
TMVb ± SD
TMV± SD
(Dias)
(Dias)
Salina
IFN-α
16/16 (100%)
8.5 ± 3.5
>20
2/16 (12%)c
6/16 (37%)
8.0 ± 2.8
9.0 ± 2.8
GUAV
0/16
0/16
6.0 ± 0
9.5 ± 3.5
GROV
0/16
16/16 (100%)
6.0 ± 0
>20
TCMV
0/16
0/16
6.5 ± 3.5
10.0 ± 2.8
Vivos a/total
Vivos/total
Salina
IFN-α
OROV
0/16
CARV
Vírus
a
Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de
animais que participaram do experimento
b
Tempo médio de vida (TMV)
c
Razão de sobrevivência (x%)
Além dos efeitos observados na sobrevida dos animais, fomos
verificar se o IFN-α era capaz de diminuir de maneira significativa a
quantidade de vírus no cérebro. Os resultados estão apresentados na
figura 28, onde podemos observar que animais infectados por OROV e
GROV/tratados com IFN-α, 24 horas antes da infecção, não apresentaram
em seu tecido cerebral qualquer vestígio de vírus, diferentemente dos
animais controle, que apresentaram alta carga viral no tecido cerebral.
Estes resultados indicam que o IFN-α foi capaz de inibir a replicação viral,
bem como a migração de vírus para o sistema nervoso central, explicando
a ausência de morte observada nos camundongos tratados com IFN-α.
Animais infectados com CARV e tratados com IFN-α ou salina
apresentam semelhantes quantidades de vírus no cérebro, sugerindo que
89
tratamento com IFN-α não impediu a migração e a replicação deste vírus
no cérebro (Figura 28).
Em relação aos animais infectados por GUAV e TCMV, podemos
observar que tratamento com IFN-α não teve influência sobre a
quantidade de vírus encontrada no tecido cerebral em relação aos grupos
controles; assim como não influenciou no desenvolvimento do processo
infeccioso, uma vez que os vírus apareceram no cérebro no mesmo período
para ambos grupos (Figura 28).
Estes resultados sugerem que IFN-α não tem ação antiviral in
vivo sobre os vírus CAR, GUA e TCM, mas contrariamente apresenta
atividade antiviral sobre os vírus ORO e GRO em tratamento iniciado 24
horas antes da infecção viral.
Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL)
90
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
Salina
IFN-α
α
1
2
3
5
7
CARV
1
2
3
5
7
9
GROV
1
2
3
5
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
1
2
3
5
7
9
TCMV
1
2
3
5
7
9
11
Dias após infecção
Figura 28: Influência do IFN-α sobre a quantidade de vírus encontrada
no cérebro de animais infectados por OROV, CARV, GUAV, GROV e
TCMV. Camundongos suíços com três dias de vida foram inoculados i.p.
com os vírus e foram tratados com IFN-α (105 UI/mL) ou salina nos dias –
1 a 5 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos
animais foram removidos e devidamente processados para quantificação
viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD
da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de
dois animais por experimento. Estes resultados representam 1 de 2
experimentos independentes.
91
Uma vez que IFN-α mostrou ser eficaz no tratamento profilático
para as infecções causadas por OROV e GROV, fomos verificar se a droga
seria capaz de inibir a doença causada por estes vírus em um tratamento
terapêutico. Desta forma, fomos testar primeiramente uma terapia
iniciada 3 horas após a infecção viral.
Os resultados estão descritos na tabela 12, onde podemos
observar que animais infectados por OROV e tratados com IFN-α
apresentaram uma sobrevida 33%, porém, esta diferença não foi
significante em relação ao grupo controle e demonstrou que o composto
IFN-α perde sua eficácia antiviral quando administrado em tempos
posteriores à infecção por OROV.
Em relação ao vírus GRO, tratamento dos animais com IFN-α
num período de 3 horas após a infecção, resultou numa sobrevida de
88%, demonstrando que o composto preserva sua capacidade antiviral
sobre este vírus em período posterior à infecção.
Tabela 12: Efeito da administração de IFN-α, 3 horas após a infecção de
camundongos com os vírus ORO e GRO.
TMV± SD
(Dias)
(Dias)
Salina
IFN-α
3/9 (33%)
5.0 ± 2.8
6.5 ± 2.1
8/9 (88%)
6.5 ± 2.1
>20
Vivos/total
Salina
IFN-α
OROV
1/9 (11%)c
GROV
0/9
Vírus
a
TMVb ± SD
Vivos a/total
Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de
animais que participaram do experimento
b
Tempo médio de vida (TMV)
c
Razão de sobrevivência (x%)
92
Paralelamente aos experimentos de sobrevida, fomos verificar se
o IFN-α era capaz de reduzir a quantidade de vírus no cérebro. Os
resultados estão apresentados na figura 29, onde podemos notar que IFNα não impediu a migração e a replicação do OROV no cérebro, embora o
vírus fosse encontrado somente no 7o dia de infecção, diferentemente do
observado em animais tratados com salina, que apresentaram OROV no
cérebro desde o 3o dia de infecção. Em relação ao GROV, podemos notar
que tratamento com IFN-α no período de três horas após a infecção viral
foi capaz de inibir a migração e a replicação deste vírus no cérebro dos
camundongos, diferentemente do encontrado no cérebro dos animais do
grupo controle que apresentaram alta carga viral no 5o dia após a infecção
(Figura 29).
Quantidade de vírus no cérebro (Log10 PFU/mL)
93
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
Salina
IFN-α
1
2
3
5
7
GROV
1
2
3
5
Dias após infecção
Figura 29: Influência do IFN-α sobre a quantidade de vírus encontrada
no cérebro de animais infectados com OROV e GROV. Camundongos
suíços com três dias de vida foram inoculados i.p. com os vírus e foram
tratados com IFN-α (105 UI/mL) ou salina 3 horas após a infecção até o
dia 7 da infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos
animais foram removidos e devidamente processados para quantificação
viral por método de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD
da quantidade de vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de
dois animais por experimento. Estes resultados representam 1 de 2
experimentos independentes.
94
Uma vez que IFN-α teve um fraco efeito protetor sobre os animais
infectados por OROV, em tratamento iniciado 3 horas após a infecção,
fomos observar o efeito deste composto quando administrado no período
de 24 horas após a infecção somente para o vírus GRO. A tabela 13
mostra que IFN-α administrado 24 horas após infecção pelo GROV perde
seu efeito protetor, uma vez que a sobrevida dos camundongos foi de
somente 22%, um valor não significante em relação ao grupo controle.
Tabela 13: Efeito da administração de IFN-α, 24 horas após a infecção de
camundongos com GROV.
Vírus
GROV
a
Vivos a/total
Vivos/total
Salina
IFN-α
0/9
2/9 (22%)c
TMVb ± SD
TMV± SD
(Dias)
(Dias)
Salina
IFN-α
7.0 ± 2.8
7.0 ± 2.8
Razão entre o número de animais que sobreviveram pelo número total de
animais que participaram do experimento
b
Tempo médio de vida (TMV)
c
Razão de sobrevivência (x%)
Em seguida, fomos verificar a quantidade de vírus no cérebro dos
animais infectados por GROV/tratados com IFN-α. A figura 30 mostra-nos
que o composto IFN-α foi incapaz de impedir a replicação do vírus GRO no
tecido cerebral dos camundongos tratados com a droga, mostrando carga
viral similar àquela encontrada nos animais controle.
Os resultados obtidos demonstram que o IFN-α apresenta
atividade antiviral in vivo sobre os vírus ORO e GRO, porém esta atividade
é limitada e dependente da precocidade do tratamento.
Quantidade de vírus no
cérebro (Log10 PFU/mL)
95
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GROV
Salina
IFN-α
1
2
3
5
7
Dias após infecção
Figura 30: Influência do IFN-α sobre a quantidade de GROV
encontrada no cérebro de animais infectados. Camundongos suíços
com três dias de vida foram inoculados i.p. com GROV e foram tratados
com IFN-α (105 UI/mL) ou salina 24 horas após a infecção até o dia 8 da
infecção, sendo que em dias determinados, os cérebros dos animais foram
removidos e devidamente processados para quantificação viral por método
de ensaio de placa. As barras representam a média ± SD da quantidade de
vírus encontrado num “pool” de cérebros proveniente de dois animais por
experimento.
Estes
independentes.
resultados
representam
1
de
2
experimentos
96
5. DISCUSSÃO
No presente estudo foram avaliadas drogas antivirais como a
Ribavirina, o Ácido Micofenólico e o Interferon-alfa sobre os vírus
Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa (GROV) e
Tacaiuma (TCMV), objetivando um tratamento eficaz para as doenças
ocasionadas por estes vírus, que acometem pessoas em diversas regiões
brasileiras e em diversos países centro/sul-americanos, sendo muitas
vezes responsáveis por epidemias que geram um problema de saúde
pública nas regiões afetadas, com grande impacto econômico e social.
Assim sendo, fomos primeiramente buscar metodologias que
pudessem avaliar de maneira adequada a atividade antiviral dos
compostos Ribavirina (RBV), Ácido Micofenólico (MPA) e Interferon-alfa
(IFN-α) sobre os Orthobunyavirus supracitados. Para tanto, o método de
ensaio de placa, utilizado por muitos pesquisadores para titulação viral e
neutralização (MORENS et al., 1985; DIAMOND, et al., 2000 e 2002;
ROBERTSON et al., 2004), sofreu pequenas modificações para ser
aplicado pela 1ª vez, na quantificação dos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e
TCM (Item 3.3.4 e Figuras 13 e 14). O ensaio de placa, padronizado para
estes vírus, mostrou-se de fácil manuseio e reprodutibilidade podendo ser
utilizado em experimentos in vitro com as drogas, bem como em
experimentos in vivo para quantificação de vírus proveniente do tecido
cerebral de camundongos infectados.
Em seguida, foram padronizadas metodologias para serem
utilizadas em experimentos in vivo, sendo que os resultados obtidos
97
mostraram pela 1ª vez a susceptibilidade de camundongos lactentes à
infecção intra-peritoneal pelos vírus CAR, GUA e TCM (Figura 12 e
Tabelas 4 e 5). Adicionalmente, foi observada migração e replicação viral
no cérebro de animais infectados pela via intra-peritoneal e esta replicação
mostrou-se associada à morte dos animais (Figura 14). Além disso, foram
padronizadas as concentrações máximas dos medicamentos que poderiam
ser utilizadas in vitro e in vivo, sem prejuízo para as células ou para os
animais (Figuras 9 a 11, 15 e 16). A partir da padronização dos métodos in
vitro e in vivo, foram testadas a ação antiviral dos medicamentos RBV,
MPA e IFN-α sobre os Orthobunyavirus selecionados.
Os resultados obtidos in vitro demonstraram que tanto a RBV
quanto o MPA foram capazes de inibir a replicação do TCMV em
tratamento iniciado 24 horas antes ou 2 horas após a infecção viral
(Tabelas 6 e 8). Tal efeito inibitório foi revertido pela adição de guanosina
exógena à cultura celular (Figuras 19 e 21), sugerindo que a atividade
antiviral da RBV e do MPA sobre o TCMV ocorreu por inibição da enzima
IMPDH, responsável pela diminuição nos níveis de GTP intracelular,
dificultando a progressão do ciclo replicativo viral. Vários estudos
demonstraram que a inibição da IMPDH, por ação ou da RBV ou do MPA,
foi o principal mecanismo responsável por prejudicar a replicação in vitro
de diversos vírus, dentre os quais podemos citar: vaccínia, herpes simplex,
sarampo (CLINE et al., 1969), febre amarela vacinal 17D, vírus
parainfluenza humana tipo 3 (hPIV3) (LEYSSEN et al., 2005), dengue
(DIAMOND et al., 2002) e reovirus aviário (ROBERTSON et al., 2004).
98
Embora RBV e MPA tenham mostrado atividade antiviral sobre
TCMV, esta foi abolida quando os medicamentos foram adicionados à
cultura celular em concentrações menores que 50µg/mL para RBV (Figura
17) e 10µg/mL para MPA (Figura 22), sugerindo que a progressão do ciclo
replicativo do TCMV necessita de uma quantidade determinada de GTP
intracelular, que torna-se indisponível somente na presença de altas
concentrações de RBV ou de MPA. Ademais, os compostos não
apresentaram atividade antiviral sobre o TCMV quando colocados na
cultura celular em períodos de 24 e 48 horas após a infecção viral (Figuras
18 e 23), sugerindo, também, que para inibir a replicação deste vírus fazse necessário diminuir os níveis de GTP intracelular antes que o processo
replicativo se inicie ou logo após o seu início, caso contrário, uma vez
estabelecido o ciclo replicativo, a quantidade intracelular de GTP parece
não ter influência sobre o mesmo.
Adicionalmente, a RBV e o MPA apresentaram efeito inibitório in
vitro sobre a replicação do GUAV em tratamento iniciado 24 horas antes
da infecção viral (Tabelas 6 e 8), porém, a atividade da RBV sobre o GUAV
não foi significante, diferentemente da atividade do MPA que inibiu a
formação de placas em 79% (p<0.05). Esta inibição produzida por MPA
sobre GUAV foi também revertida pela adição de guanosina exógena à
cultura celular (Figura 21), sugerindo que MPA diminui a replicação do
vírus GUA por inibir a enzima IMPDH, ocasionando redução nos níveis de
GTP intracelular. Entretanto, o vírus GUA parece ser menos susceptível à
redução dos níveis de GTP intracelular que o vírus TCM, pois o MPA foi
incapaz de inibir este vírus quando adicionado à cultura no tempo de 2
99
horas após a infecção viral (Tabela 8). Somado a isso, a replicação do
TCMV foi inibida por RBV (Tabela 6), enquanto que a mesma droga, usada
em igual concentração, não teve atividade antiviral sobre GUAV.
Contrariamente ao observado para os vírus TCM e GUA, a RBV e
o MPA, quando utilizadas sozinhas, não conseguiram inibir o ciclo
replicativo dos vírus ORO, CAR e GRO, em nenhum dos períodos
analisados (Tabelas 6 e 8). No entanto, quando os medicamentos foram
adicionados conjuntamente à cultura celular em período antecedente à
infecção (Figura 25), observou-se uma pequena inibição, somente no ciclo
replicativo do CARV, porém esta não foi significante (p=0.07). Estes
resultados sugerem que o processo replicativo destes vírus é pouco
dependente das quantidades de GTP intracelular disponíveis, sendo,
portanto, resistentes à ação antiviral da RBV e do MPA.
SCHIEDEL e colaboradores (1987) produziram uma linhagem do
vírus Sindbis (Família Togaviridae, gênero Alfavirus) resistente a RBV e ao
MPA, pela passagem em série deste vírus em cultura de células de Aedes
albopictus na presença de MPA. Nesta época, os autores sugeriram que o
vírus Sindbis mutante conseguia replicar na presença de RBV e/ou MPA
por apresentar uma guanililtransferase ou uma RNA polimerase (ou
ambas) com maior afinidade pelo GTP intracelular. Entretanto, em
estudos posteriores, SCHIEDEL e colaboradores (1991) revelaram que a
resistência do vírus Sindbis mutante à RBV e ao MPA devia-se a uma
alteração de sua guanililtransferase e não de sua RNA polimerase. A
enzima guanililtransferase tem importante função na formação da
estrutura de “cap 7-metilguanosina” (ou simplesmente “cap”) na porção 5’
100
do RNA mensageiro celular e viral, sendo responsável por catalisar a
adição de guanosina monofosfato (GMP) a esta estrutura (GOSWANI et al.,
1979; BISAILLON & LEMAY, 1997). Contudo, os vírus pertencentes à
família Bunyaviridae, não produzem as enzimas formadoras do “cap” do
RNA mensageiro, pois possuem a capacidade de adquirir a porção “cap” do
RNA
mensageiro
celular,
utilizando-o
para
iniciar
o
processo
de
transcrição do seu RNA. Este mecanismo de aquisição do “cap” da célula
do hospedeiro é conhecido como “cap-snatching” (JIN et al., 1993).
Portanto, é pertinente sugerir que a resistência dos vírus ORO, CAR, GUA
e GRO à ação antiviral da RBV e do MPA, bem como a susceptibilidade
limitada do vírus TCM a estes compostos, pode estar relacionado a alguma
particularidade da RNA polimerase destes vírus.
Resistência ao MPA foi descrita somente para o vírus Sindbis
(SCHIEDEL et al., 1987 e 1999), porém resistência à RBV foi relatada para
o vírus HCV (YOUNG et al., 2003), Coronavirus SARS (TAN et al., 2004) e
poliovírus (ARNOLD et al., 2005; PFEIFFER et al., 2003).
Vírus HCV resistente à ação da RBV foi isolado de um grupo de
pacientes
apresentou
que
recebiam
uma
monoterapia
mutação
com
caracterizada
esta
pela
droga.
Este
substituição
de
HCV
um
aminoácido em sua RNA polimerase dependente de RNA (RdRp).
Interessantemente,
quando
o
tratamento
foi
interrompido,
alguns
pacientes apresentaram vírus com reversão do aminoácido para o original,
uma fenilalanina, e os mesmos mostraram ser susceptíveis à ação
antiviral da RBV. A mutação ocorrida no HCV foi supostamente devida à
101
ação mutagênica da RBV. No entanto, nestes experimentos, não foi
possível comprovar esta suposição (YOUNG et al., 2003).
Poliovírus resistente à RBV foi isolado por dois grupos de
pesquisadores,
PFEIFFER
e
colaboradores
(2003)
e
ARNOLD
e
colaboradores (2005), que observaram como causa da resistência, uma
mutação em sua RdRp, por troca de um resíduo de glicina por um de
serina. A possibilidade de mutagênese ter ocorrido foi descartada, uma vez
que esta linhagem de caráter resistente foi detectada entre a população
viral, sendo considerada como “quasispecie”, que apesar de ter resistência
à RBV, foi vista ter fenótipo atenuado e restrito tropismo tecidual em
camundongos susceptíveis à infecção pelo poliovírus (VIGNUZZI et al.,
2006).
Estes dados dão suporte à idéia de que a resistência à ação
antiviral da RBV pelo OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV possa estar
relacionada a alguma particularidade (mutação?) da RNA polimerase
destes vírus. Entretanto, este dado não foi analisado no presente estudo.
Os resultados obtidos in vivo em relação à RBV mostraram que
este medicamento foi incapaz de prevenir a morte dos animais infectados
por OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV (Tabela 7). Além disso, animais
tratados com RBV ou tratados com salina apresentaram quantidades
similares de vírus no cérebro (Figura 20). Sabe-se que a inoculação intraperitoneal de vírus produz primeiramente uma infecção sistêmica
(GONZALEZ-SCARANO et al., 1996), que em nosso estudo (Figuras 12 e
14) foi seguida por migração e replicação dos vírus no cérebro dos
camundongos lactentes (Figura 14), causando a morte dos mesmos
102
(Figura 12). Diante disso, podemos propor que a resistência observada in
vivo do OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV à ação da RBV pode estar
associada a alguma particularidade da RNA polimerase destes vírus que
funciona normalmente, mesmo sofrendo interferências da RBV, o que
permitiu multiplicação viral no organismo dos animais e migração destes
vírus para o cérebro, causando encefalite e morte dos camundongos.
Adicionalmente a isto, estudos mostraram que a RBV não é um
medicamento eficaz no tratamento de infecções virais que utilizam a via
intracerebral de inoculação em camundongos, a menos que o composto
seja administrado diretamente no cérebro (ALLEN, 1980). Isto sugere que
a RBV ou seus metabólitos ativos não alcancem concentrações adequadas
no cérebro, provavelmente porque a RBV não atravessa eficientemente a
barreira hemato-encefálica (KOFF et al., 1983). Desta forma, quando os
vírus alcançam o cérebro após a infecção sistêmica, eles encontram um
micro-ambiente favorável à sua replicação, sem interferência da RBV,
aumentando a carga viral neste local e levando os animais à morte. Esta
hipótese foi elegantemente demonstrada por KOFF e colaboradores (1983),
que inocularam camundongos Balb/c intracerebralmente com vírus do
dengue tipo 2 e trataram estes animais utilizando a via intra-peritoneal ou
com RBV ou utilizando um derivado lipofílico da RBV, denominado 2’,3’,5’triacetato de ribavirina. Os autores observaram que animais tratados com
o derivado lipofílico da RBV apresentaram tempo médio de vida e razão de
sobrevivência significantemente superiores aos animais tratados com RBV
somente. Isto teria ocorrido porque o derivado lipofílico consegue
103
atravessar mais eficientemente a barreira hemato-encefálica, o que não
acontece com a RBV.
Todos estes dados sugerem que, tanto a RBV como o MPA não
apresentam atividade antiviral in vitro sobre os vírus ORO, CAR, GUA e
GRO e mesmo que ambos compostos apresentem atividade antiviral sobre
o vírus TCM nesta condição, esta é limitada e não comprovada in vivo,
pelo menos no caso da RBV. Desta forma, tanto a RBV quanto o MPA
devem ser desconsiderados como agentes terapêuticos para tratar as
doenças causadas pelos vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM.
Resultados mais animadores foram observados em nosso estudo
utilizando o IFN-α-2a, onde os resultados in vitro mostraram que o
medicamento, na concentração de 100.000 UI/mL, foi capaz de inibir a
replicação de todos os Orthobunyavirus selecionados, tanto em tratamento
iniciado 24 horas antes como naquele realizado 2 horas após a infecção
viral (Tabela 10). Adicionalmente, a concentração de 10.000 UI/mL de
IFN-α-2a foi capaz de inibir em 100% a replicação de CARV, GUAV e
GROV e inibiu significantemente a replicação do TCMV (p<0.01) em
tratamento iniciado 2 horas após a infecção viral (Figura 26). Por fim,
tratamento das células (100.000 UI/mL de IFN-α-2a) iniciado 24 horas
após a infecção viral mostrou ação antiviral significante sobre GUAV e
TCMV, mas não sobre OROV, CARV e GROV (Figura 27). Além disso,
TCMV teve sua replicação significantemente inibida em tratamento
iniciado 48 horas após a infecção viral (p<0.001) (Figura 27).
Estes resultados sugerem que IFN-α-2a apresenta atividade
antiviral in vitro sobre OROV, CARV, GUAV, GROV e TCMV, contudo, esta
104
é limitada e dependente tanto da concentração do medicamento como do
momento de início do tratamento.
As respostas provenientes do sistema interferon (Figura 7)
representam o mais precoce mecanismo de defesa contra as infecções
virais, e é um importante componente da imunidade inata (VILCEK &
SEN, 1996). Sabe-se que RNAs de dupla fita (dsRNA) gerados durante a
replicação viral são importantes indutores da resposta de IFN tipo I
(JACOBS & LANGLAND, 1996). Os dsRNAs podem estimular a produção
de IFN do tipo I por ativarem fatores de transcrição como IRF, NFκB e ATF
(Citado por SEN et al., 2001) ou por ativar a via de sinalização do “Toll-like
receptor 7” (TLR7) (Citado por BARTON & MEDZHITOV, 2003). Estes
componentes celulares induzem produção de IFN-α/β e este, ao ligar-se a
seu receptor IFNAR, ativa uma cascata de sinalização intracelular que
culmina por ativar genes produtores de proteínas com atividade antiviral
(Figura 7). Assim, células primadas com IFN tipo I possuem altos níveis
das enzimas PKR e 2-5AS. Estas enzimas, ao interagirem com o dsRNA
proveniente da replicação viral, ativarão vias que levarão à inibição da
síntese protéica, clivagem de RNA e à apoptose da célula infectada (Figura
7) (STARK et al., 1998), evitando assim a replicação e a disseminação dos
vírus pelo organismo do hospedeiro (Figura 7) (STARK et al., 1998).
A resposta antiviral proveniente da estimulação celular por IFN
tipo I é poderosa e imediata. Por isso, não surpreende que muitos vírus
tenham desenvolvido no decorrer de sua evolução mecanismos inibidores
destas respostas antivirais, que podem antagonizar desde a produção do
IFN até as respostas provenientes de sua ativação (WEBER et al., 2002;
105
ALCAMI & KOSZINOWSKI, 2000; CEBULLA et al., 1999; GALE & KATZE,
1998; GOODBOURN et al., 2000; KALVAKOLANU, 1999; PLOEGH, 1998).
Vírus de RNA de polaridade negativa que inclui os ortomixovírus,
paramixovírus, filovírus, arenavírus e bunyavírus, produzem fatores com
habilidade de inibir o sistema IFN (Citado por GARCIA-SASTRE, 2001).
Como exemplo, podemos citar o vírus influenza A, um ortomixovírus, que
produz uma proteína não estrutural denominada NS1, a qual funciona
como antagonista tanto da produção de IFN como da resposta gerada pelo
IFN, por se ligar aos dsRNAs, impedindo que estas moléculas ativem PKR
e 2-5AS (Citado por GARCIA-SASTRE, 2001).
Especificamente
em
relação
aos
bunyavírus,
estudos
têm
demonstrado que a proteína não estrutural NSs produzida pelo vírus
Bunyanwera (gênero Orthobunyavirus) é capaz de inibir a ativação dos
fatores de transcrição IRF-3 e NFκB, impedindo assim, a produção de IFN
do tipo I pela célula infectada (WEBER et al., 2002). De maneira
semelhante, o vírus da febre do Vale Rift (gênero Phlebovirus) que também
expressa a proteína NSs, foi visto bloquear a expressão do gene de IFN,
porém, não por inibir os fatores IRF-3 ou NFκB, mas por inibir um fator de
transcrição presente em um passo subseqüente (BOULOY et al,. 2001;
BILLECOCQ et al., 2004). Contrariamente, membros pertencentes aos
gêneros Hantavirus e Nairovirus não produzem a proteína NSs a partir do
segmento S do seu genoma. Contudo, até o momento, nenhum membro do
gênero Nairovirus foi visto induzir produção de IFN por células em cultura,
enquanto que o vírus Hantaan, pertencente ao gênero Hantavirus, foi visto
estimular produção de IFN-β por células endoteliais (PENSIERO et al.,
106
1992), bem como, foi capaz de ativar os fatores de transcrição IRF-3 e
NFκB (SUNDSTROM et al., 2001). Portanto, é possível que membros da
família Bunyaviridae, que não expressem a proteína NSs, possam usar de
outras estratégias para escapar da ação antiviral do IFN tipo I (WEBER et
al., 2002). Estas informações explicam em parte os resultados obtidos in
vitro neste trabalho (Tabela 10 e Figuras 26 e 27). Sabe-se que células
Vero E6 são deficientes em genes que produzem IFN tipo I, sendo, por
isso, incapazes de produzir IFN-α/β (MOSCA & PITHA, 1986). Contudo, as
vias dependentes de IFN são funcionais e podem ser ativadas por IFN
exógeno adicionado à cultura. Assim sendo, quando adicionamos IFN-α-2a
em período de 24 horas antes da infecção por OROV, CARV, GUAV, GROV
e TCMV, as células Vero E6 já teriam sido primadas e assim adquiriram
um estado antiviral, que as tornou resistentes à infecção, podendo isto ser
responsável pela elevada inibição na formação de placas observada neste
período (Tabela 10).
Além disso, adição de IFN-α-2a em período de 2 horas após a
infecção viral, teria ativado o sistema IFN no momento em que a
replicação viral estava iniciando, inibindo-a de forma significante (Tabela
10). Porém, quando o medicamento foi adicionado em períodos ≥ a 24
horas após a infecção, quando a replicação viral já estava estabelecida, o
IFN-α-2a inibiu apenas, de forma limitada, a replicação dos vírus GUA e
TCM, sem atividade sobre OROV, CARV e GROV (Figura 27). Esta
ausência de atividade antiviral sugere que, durante a replicação, estes
vírus possam produzir algum fator que iniba a ação do sistema IFN sobre
eles. Considerando que NSs tenha sido descrita apenas como inibidora
107
das vias de produção de IFN do tipo I, é possível que, em nossos
experimentos, o mecanismo inibitório dos vírus sobre IFN tenha sido
diferente pois o IFN-α-2a foi adicionado à cultura celular. Isto sugere que
os Orthobunyavirus possuem outro mecanismo de escape das ações do
IFN ainda não descrito. Contudo, os Orthobunyavirus possuem um
genoma pequeno e é pouco provável que existam outros fatores virais além
de NSs com atividade anti-IFN. Assim, é possível que esta proteína tenha
funções anti-IFN ainda desconhecidas. Isto também poderia explicar como
doses similares de IFN-α-2a não exibiram as mesmas capacidades
inibitórias sobre os diferentes Orthobunyavirus estudados (Figura 26).
Em relação aos resultados in vivo, podemos observar que a
administração profilática de IFN-αA não foi capaz de evitar a morte de
animais infectados pelos vírus CAR, GUA e TCM (Tabela 11), bem como
não evitou a migração e a replicação viral no cérebro (Figura 28). Isto
sugere que esta citocina, embora apresente atividade antiviral limitada in
vitro sobre estes vírus, esta não ocorre in vivo. Este resultado está de
acordo com o estudo realizado por BRINTON e colaboradores (1993), que
observaram que camundongos infectados com CARV e tratados com IFN-α
sucumbiam à infecção e morriam entre 4 a 6 dias como os animais
tratados com salina, demonstrando que IFN-α não apresenta atividade
antiviral sobre CARV, como observado por nós.
Contrariamente, IFN-αA eficientemente evitou a morte dos
camundongos infectados por OROV e GROV (Tabela 11) por inibir a
migração e/ou replicação de vírus no cérebro destes animais (Figura 28),
108
em tratamento iniciado 24 horas antes da infecção, confirmando os
resultados obtidos in vitro.
Posteriormente,
administração
terapêutica
da
citocina
em
período de 3 horas após a infecção viral, preveniu a morte de mais de 80%
dos animais infectados por GROV, assim como inibiu a migração e/ou
replicação de vírus no tecido cerebral (Tabela 12 e Figura 29). Porém,
quando a citocina foi administrada 24 horas após a infecção viral a
sobrevida dos animais caiu para 22%, sendo que estes morreram por
encefalite (Tabela 13 e Figura 30). Estes dados estão correlacionados com
os obtidos nos experimentos in vitro (Tabela 10 e Figura 27), sugerindo
que a citocina IFN-α, apresenta atividade antiviral sobre GROV. Porém,
como observado in vitro, esta atividade é dependente da ministração
precoce do IFN-α, até 3 horas após a infecção.
Com relação ao OROV, a administração do IFN-α 3 horas após a
infecção viral mostrou uma sobrevida de 33% (Tabela 12), sendo que os
camundongos morreram devido à encefalite (Figura 29). Portanto, para o
vírus ORO, a citocina IFN-α apresentou efeito antiviral somente em
tratamento profilático e não em tratamento terapêutico.
Os resultados obtidos in vivo com a citocina IFN-α sugerem que
os vírus ORO e GRO, mas principalmente CARV, GUAV e TCMV
apresentam algum mecanismo de escape das ações antivirais do sistema
IFN, que pode ou não estar associado à proteína NSs produzida pelos
mesmos, como previamente discutido.
É válido ressaltar ainda, que as citocinas testadas in vitro e in
vivo fazem parte de um grupo maior de citocinas de IFN-α existentes
109
(Tabela 1). Portanto, não se pode afirmar categoricamente se outras
citocinas de IFN-α apresentariam propriedades antivirais similares às aqui
observadas. TAN e colaboradores (2004) testaram in vitro 4 tipos de
citocinas IFN-α disponíveis no mercado, Roferon-A (IFN-α-2a), Intron A
(IFN-α-2b), Wellferon (IFN-α-n1) e Alferon (IFN-α-n3), sobre o Coronavirus
SARS (SARS-CoV) e observaram que somente 2 delas, o Wellferon e o
Alferon, conseguiram inibir o efeito citopático ocasionado pelo vírus em
cultura de células Vero E6. O mecanismo relacionado a estas diferenças
de atividade não é conhecido, sendo que a diferença primária entre estes
IFNs está relacionado à sua origem, onde algumas preparações são
derivadas de células linfoblastóides humanas ou leucócitos humanos
derivados do sangue periférico estimulados com vírus Sendai, enquanto
outras preparações foram produzidas por E. coli ou por células de
mamíferos transfectadas (FOSTER & FINTER, 1998). O IFN-α usado em
nossos experimentos foi o Roferon-A e o IFN-αA ambos produzidos por E.
coli, sendo que o RoferonA não apresentou qualquer atividade antiviral
sobre SARS-CoV, no trabalho realizado por TAN e colaboradores.
De qualquer forma, os resultados obtidos para IFN-α sugerem
que este medicamento apresenta atividade antiviral in vitro sobre os vírus
CAR, GUA e TCM, porém esta ação é limitada e não foi comprovada in
vivo. Portanto, o mesmo não deve ser considerado como agente terapêutico
para tratar as doenças causadas por estes vírus. No entanto, o IFN-α
apresentou atividade antiviral profilática in vitro e in vivo sobre OROV e
GROV e também mostrou ação antiviral terapêutica para GROV. Este
110
medicamento, se confirmada uma ação similar em seres humanos,
poderia ser utilizado profilaticamente durante epidemias ocasionadas por
estes dois vírus e poderia ser utilizado terapeuticamente para GROV em
caso de acidentes laboratoriais, sendo que neste caso o tratamento deve
ser iniciado dentro de até 3 horas após a inoculação acidental.
O vírus GRO pertence ao sorogrupo da encefalite da Califórnia,
cujos vírus são responsáveis por causar epidemias em várias regiões
norte-americanas (PAVLOVIC et al., 2000), para os quais ainda não existe
tratamento antiviral. A susceptibilidade do GROV à atividade antiviral do
IFN-α poderia ser utilizado como estímulo ao início de pesquisas da ação
deste composto sobre o vírus da encefalite da Califórnia, objetivando
amenizar as doenças ocasionadas por este vírus.
Em suma, a metodologia utilizada nos experimentos in vitro e in
vivo, viabilizou-nos pesquisar a ação antiviral de 3 diferentes compostos
sobre os vírus ORO, CAR, GUA, GRO e TCM pertencentes ao gênero
Orthobunyavirus.
Mesmo obtendo resultados favoráveis somente para os vírus ORO
e GRO com o medicamento IFN-α, esta metodologia poderá ser utilizada
ainda
para
selecionar
outros
compostos
com
atividade
antiviral,
conhecidos ou não, para tratar as doenças ocasionadas pelos vírus ORO,
CAR, GUA, GRO e TCM que tanto transtorno causam às pessoas
atingidas.
Consideramos importante para o país, desenvolver tecnologias
que permitam descobrir a viabilidade antiviral de compostos e, nesse
sentido, a metodologia utilizada no presente trabalho, realizando testes in
111
vitro e in vivo, se mostrou ferramenta simples e confiável que pode
continuar a ser utilizada na avaliação preliminar da capacidade antiviral
de um número ilimitado de compostos, sobre vírus que tenham interesse
em saúde pública.
112
6. CONCLUSÕES
6.1. A metodologia in vitro e in vivo utilizada neste estudo
mostrou-se adequada para a seleção de compostos com atividade antiviral
sobre os vírus Oropouche, Caraparu, Guamá, Guaroa e Tacaiuma;
6.2. A Ribavirina apresenta atividade antiviral in vitro somente
sobre o vírus Tacaiuma, sendo que esta atividade é dependente da
concentração e do período de administração do medicamento;
6.3. A atividade antiviral in vitro da Ribavirina sobre o vírus
Tacaiuma, está associada à redução dos níveis intracelulares de GTP;
6.4. O Ácido Micofenólico apresenta atividade antiviral sobre os
vírus Guamá e Tacaiuma em experimentos in vitro, sendo que esta
atividade depende da concentração do medicamento e do período de
administração do composto;
6.5. A atividade antiviral do Ácido Micofenólico sobre os vírus
Guamá e Tacaiuma está relacionada à redução nos níveis de GTP
intracelular;
6.6. O medicamento Interferon-alfa apresenta atividade antiviral
in vitro sobre todos os Orthobunyavirus selecionados, sendo que esta
113
atividade é dependente da concentração do medicamento e do período de
administração do composto;
6.7. Interferon-alfa apresenta atividade antiviral in vivo sobre os
vírus Oropouche e Guaroa, em período precoce da infecção, sendo,
portanto,
potencialmente
utilizável
doenças ocasionadas por estes vírus.
para
tratar
preventivamente
as
114
7. RESUMO
Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guamá (GUAV), Guaroa
(GROV) e Tacaiuma (TCMV) são vírus de RNA que pertencem ao gênero
Orthobunyavirus, família Bunyaviridae. Estes vírus são transmitidos por
mosquitos e causam doença febril e encefalite em seres humanos, tendo
importância em saúde pública no Brasil. Objetivando tratar ou amenizar
os sintomas destas doenças, testou-se in vitro e/ou in vivo os compostos
ribavirina (RBV), ácido micofenólico (MPA) e interferon-alfa (IFN-α) sobre
os vírus supracitados. Os resultados mostraram que a RBV (50µg/mL)
possui atividade antiviral in vitro sobre TCMV quando o tratamento é
realizado precocemente e esta atividade, relacionou-se à redução nos
níveis de GTP intracelular. MPA (10µg/mL) mostrou atividade antiviral in
vitro sobre os vírus GUA e TCM, quando adicionado precocemente à
cultura celular. Esta atividade também, se relacionou com redução nos
níveis de GTP intracelular. IFN-α (105UI/mL) mostrou atividade antiviral
in vitro sobre todos os Orthobunyavirus em estudo, quando adicionado à
cultura celular antes da infecção viral. A atividade antiviral observada in
vitro pela ação do IFN foi confirmada in vivo sobre os vírus ORO e GRO em
tratamento realizado antes da infecção viral. Além disso, IFN-α (105UI/mL)
mostrou atividade antiviral sobre GROV em tratamento iniciado 3 horas
após a infecção dos camundongos lactentes. Portanto, os resultados
sugerem que o IFN-α é um medicamento potencialmente utilizável na
prevenção e/ou tratamento das doenças ocasionadas pelo OROV e GROV.
115
8. ABSTRACT
Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guama (GUAV), Guaroa
(GROV), and Tacaiuma (TCMV) are RNA viruses that belong to the
Orthobunyavirus
genus,
Bunyaviridae
family.
These
viruses
are
transmitted by mosquitoes, and cause human febrile illness and
encephalitis, having importance in public health in Brazil. Aiming to treat
or reduce the symptoms of these diseases, ribavirin (RBV), mycophenolic
acid (MPA) and interferon-alpha (IFN-α) coumponds were tested in vitro
and/or in vivo on the above-mentioned viruses. The results indicated that
RBV (50µg/mL) showed in vitro antiviral activity on TCMV when the
treatment was early performed. This activity was associated with
reduction of intracellular GTP levels. MPA (10µg/mL) exhibited in vitro
antiviral activity on GUAV and TCMV when early added to the cell
cultures. This activity was also associated with reduction on intracellular
GTP levels. IFN-α (105 IU/mL) demonstrated in vitro antiviral activity on all
Orthobunyavirus studied when added to cell cultures just before viral
infection. The in vitro antiviral activity observed for IFN-α was confirmed in
vivo on ORO and GRO viruses when treatment was carried out before viral
infection. Moreover, IFN-α (105 IU/mL) showed antiviral activity on GROV
when treatment was initiated 3 hours after infection of suckling mice.
Thus, the results suggest that IFN-α may be a potentially useful drug for
the prevention and/or treatment of diseases caused by OROV and GROV.
116
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Citocinas, p.:268-269. In A.K. Abbas and
A.H. Lichtman (eds). Imunologia Celular e Molecular 5o edição.
Elsevier Editora Ltda, Rio de Janeiro, Brasil. 2005.
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Mecanismos efetores da imunidade
mediada por células, p.:307-326. In A.K. Abbas and A.H.
Lichtman (eds). Imunologia Celular e Molecular 5o edição.
Elsevier Editora Ltda, Rio de Janeiro, Brasil. 2005.
AEBI, M.; FÄH, J.; HURT, N.; SAMUEL, C.E.; THOMIS, D.; BAZZIGHER,
L.; PAVLOVIC, J.; HALLER, O.; STAEHELI, P. cDNA strutures
and regulation of two interferon-induced human Mx proteins.
Mol. Cell. Biol., 9: 5062-5072, 1989.
ALCAMI, A.; KOSZINOWSKI, U.H. Viral mechanisms of immune evasion.
Immunol. Today, 21: 447-455, 2000.
ALLEN, L.B. Review of in vivo efficacy of ribavirin, p.:43-58. In: R.A. Smith
and W. Kirkpatrick (eds). Ribavirin: a broad spectrum antiviral
agent. Academic Press Inc., New York, USA. 1980.
ALLISON, A.C.; EUGUI, E.M. Purine metabolism and immunosuppressive
effects of mycophenolate mofetil (MMF). Clin Transplant, 10: 77–
84, 1996.
ANDERSON, C.R.; SPENCE, L.; DOWNS, W.G.; AITKEN, T.H.G. Oropouche
virus: a new human disease agent from Trinidad, West Indies.
Am. J. Trop. Med. Hyg., 10: 574-578, 1961.
ANDREI, G.; De CLERCQ, E. Inhibitory effect of selected antiviral
compounds on arenavirus replication in vitro. Antiviral Res.,
14(4–5): 287-299, 1990.
ARAÚJO, R.; DIAS, L.B.; ARAÚJO, M.T.F.; PINHEIRO, F.; OLIVA, O.F.P.
Alterações ultraestruturais no fígado de hamster após inoculação
experimental com arbovírus Oropouche (Tipo BeAn 19991). Rev.
Inst. Med. Trop. São Paulo, 20: 45-54, 1978.
117
ARNHEITER, H.; FRESE, M.; KAMADUR, R.; MEIER, E.; HALLER, O. Mx
transgenic mice-animal models of health. Curr. Top. Microbiol.,
206: 119-147, 1996.
ARNOLD, J.J.; VIGNUZZI, M.; STONE, J.K.; ANDINI, R.; CAMERON, C.E.
Remote site control of na active site fidelity checkpoint in a viral
RNA-dependent RNA polymerase. J. Biol. Chem., 280(27): 2570625716, 2005.
BARTON, G.M.; MEDZHITOV, R. Linking Toll-like receptors to IFN-α/β
expression. Nature Immunol., 4(5): 432-433, 2003.
BELARDELLI, F. Role of interferons and other cytokines in the regulation
of the immune response. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand.,
103: 161-179, 1995.
BELARDELLI, F.; GRESSER, I. The neglected role of type I interferon in
the T-cell response: implications for its clinical use. Immunol.
Today., 17: 369-372, 1996.
BILLECOCQ, A.; SPIEGEL, M.; VIALAT, P.; KOHL, A.; WEBER, F.;
BOULOY, M.; HALLER, O. NSs protein of Rift Valley fever virus
blocks
interferon
production
by
inhibiting
host
gene
transcription. J. Virology, 78(18): 9798-9806, 2004.
BISAILLON, M.; LEMAY, G. Viral and cellular enzymes involved in
synthesis of mRNA cap structure. Virology, 236(1): 1–7, 1997.
BOUGIE, I.; BISAILLON, M. The broad spectrum antiviral nucleoside
ribavirin as a substrate for a viral RNA capping enzyme. J. Biol.
Chem., 279(21): 22124–22130, 2004.
BOULOY, M.; JANZEN, C.; VIALAT, P.; KHUN, H.; PAVLOVIC, J.;
HUERRE, M.; HALLER, O.
Genetic evidence for an interferon-
antagonistic function of Rift Valley fever virus nonstructural
protein NSs. J. Virology, 75(3): 1371-1377, 2001.
BRINTON, M.A.; GAVIN, E.I.; LO, W.K.; PINTO, A.J.; MORAHAN, P.S.
Characterization of murine Caraparu Bunyavirus liver infection
and immunomodulator-mediated antiviral protection. Antiviral
Res., 20(2): 155-171, 1993.
118
BROOKS, T.J.G.; PHILLPOTTS, R.J. Interferon-alpha protects mice
against lethal infection with St Louis encephalitis virus delivered
by the aerosol and subcutaneous routes. Antiviral Res., 41: 5764, 1999.
CALISHER, C.H. History, classification, and taxonomy of viruses in the
family
Bunyaviridae,
p.
1-17.
In
RM
Elliot
(ed.),
The
Bunyaviridae. Plenum Press, Inc., New York, NY. 1996.
CASSIDY, L.F.; PATTERSON, J.L. Mechanism of La Crosse virus inhibition
by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother., 33: 2009-2011,
1989.
CEBULLA, C.M.; MILLER, D.M.; SEDMAK, D.D. Viral inhibition of
interferon signal transduction. Intervirology, 42: 325-330, 1999.
CLINE, J.C.; NELSON, J.D.; GERZON, K.; WILLIAMS, R.H.; DELONG, D.C.
In vitro antiviral activity of mycophenolic acid and its reversal by
guanine-type compounds. Applied Microbiology, 18(1): 14-20,
1969.
COLBY, T.D.; VANDERVEEN, K.; STRICKLER, M.D.; MARKHAM, G.D.;
GOLDSTEIN, B.M. Crystal structure of human type II inosine
monophosphate dehydrogenase: implications for ligand binding
and drug design. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96: 3531-3536,
1999.
COOPER, A.C.; BANASIAK, N.C.; ALLEN, P.J. Management and prevention
strategies for respiratory syncytial virus (RSV) bronchiolitis in
infants and young children: a review of evidence-based practice
interventions. Pediatr. Nurs., 29(6): 452–456, 2003.
CRANCE, J.M., GRATIER, D.; GUIMET, J.; JOUAN, A. Inhibition of sandfly
fever Sicilian virus (Phlebovirus) replication in vitro by antiviral
compounds. Res. Virol., 148: 353-365, 1997.
CROTTY, S.; MAAG, D.; ARNOLD, J.J.; ZHONG, W.; LAU, J.Y.; HONG, Z.;
ANDINO, R.; CAMERON, C.E. The broad-spectrum antiviral
ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen. Nat. Med., 6:
1375-1379, 2000.
119
DANDOY, F.; De MAEYER, E.; BONHOMME, F.; GUENET, J.L.; De
MAEYER-GUIGNARD, J. Segregation of restriction fragment
length polymorphism in an interspecies cross of laboratory and
wild mice indicates tight linkage of the murine interferon-b gene
to the murine interferon-a genes. J. Virology, 56: 216-220, 1985.
DARNELL, J.E.;. KERR Jr, I.M.; STARK, G.R. Jak-STAT pathways and
transcriptional
activation
in
response
to
IFNs
and
other
extracellular signaling proteins. Science, 264: 1415-1421, 1994.
DAVIS, G.L.; ESTEBAN-MUR, R.; RUSTGI, V.; HOEFS, J.; GORDON, S.C.;
TREPO, C.; SHIFFMAN, M.L.; ZEUZEM, S.; CRAXI, A.; LING,
M.H.; ALBRECHT, J. Interferon alfa-2b alone or in combination
with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C.
International Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J.
Med. 339: 1493-1499, 1998.
DAY,
C.W.;
SMEE,
D.F.;
JULANDER,
J.G.;
YAMSHCHIKOK,
V.F.;
SIDWELL, R.W.; MORREY, J.D. Error-prone replication of West
Nile virus caused by ribavirin. Antiviral Res., 67(1): 38-45, 2005.
DER, S.D.; ZHOU, A.; WILLIAMS, B.R.; SILVERMAN, R.H. Identification of
genes differentially regulatedby by interferon alpha, beta, or
gamma using oligonucleotide arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95: 15623-15628, 1998.
DIAMOND, M.S.; ROBERTS, T.G.; EDGIL, D.; LU, B.; ERNST, J.; HARRIS,
E. Modulation of dengue virus infection in human cells by alpha,
beta, and gamma interferons. J. Virology, 74: 4957-4966, 2000.
DIAMOND, M.S.; ZACHARIAH, M.; HARRIS, E. Mycophenolic acid inhibits
dengue virus infection by preventing replication of viral RNA.
Virology, 304: 211-221, 2002.
DIXON, K.E.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.;
LLEWELLYN,
C.H.
Oropouche
virus.
II.
Epidemiological
observations during an epidemie in Santarém, Pará, Brazil in
1975. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 161-164, 1981.
120
DREIDING, P.; STAEHELI, P.; HALLER, O. Interferon-induced protein Mx
accumulates in nuclei of mouse cells expressing resistance to
influenza viruses. Virology, 140: 192-196. 1985.
DURR, F.E.; LINDH, H.F. Efficacy of ribavirin against influenza virus in
tissue culture and in mice. Ann. N. Y. Acad. Sci., 255: 366-371,
1975.
ELLIOT, R.M.; CALISHER, C.H.; GOLDBACH, R.; MOYER, J.T.; NICHOL,
S.T.; PETTERSSON, R.; PLYUSNIN, A.; SCHMALJOHN, C.S.
Bunyaviridae,
p.
599-621.
In
C.M.
Fauquet,
M.H.V.
van
Regenmortel, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M.
Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D.H. McGooch, C.R. Pringle, and
R.B. Wickner (ed.), Virus taxonomy. Seventh report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic
Press, Inc., San Diego, Calif. 2000.
ELLIOTT, R.M. Emerging viruses: the Bunyaviridae. Mol. Med., 9: 572577, 1997.
EPINETTE,
W.W.;
PARKER,
C.M.;
JONES,
E.L.;
GREIST,
M.C.
Mycophenolic acid for psoriasis. J. Am. Acad. Dermatol., 17: 962–
971, 1987.
ERIKSSON, B.; HELGSTRAND, E.; JOHANNSON, N.; LARSSON, A.;
MISIONNY, A.; NOREN, J.O.; PHILIPSON, L.; STENBERG, K.;
STENING, G.; STRIDH, S.; OBERG, B. Inhibition of influenza
virus ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphosphate.
Antimicrob. Agents Chemother., 11: 946-951, 1977.
FERNANDEZ-LARSSON, R.; O’CONNELL, K.; KOUMANS, E.; PATTERSON,
J.L. Molecular analysis of the inhibitory effect of phosphorylated
ribavirin on the vesicular stomatitis virus in vitro polymerase
reaction. Antimicrob. Agents Chemother., 33(10): 1668–1673,
1989.
FIGUEIREDO, L.T.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; FIORILLO, A.M. Níveis
de anticorpos para arbovírus em indivíduos da região de Ribeirão
Preto, SP (Brasil). Rev. de Saúde Pública São Paulo, 20: 204-211,
1986.
121
FLEISCHMANN,
C.M.;
FLEISCHMANN,
W.R.
Jr.
Differential
antiproliferative activities of IFNs a, b and g: kinetics of
establishment of their antiproliferative effects and the rapid
development of resistance to IFNs a and b. J. Biol. Regul.
Homeost. Agents, 2: 173-185, 1988.
FLOREY,
H.W.;
GILLIVER,
K.;
JENNINGS,
M.A.;
SANDERS,
A.G.
Mycophenolic acid: an antibiotic from Penicillium brevicompactum
Dierckx. Lancet, i: 46–49, 1946.
FOSTER, G.R.; FINTER, N.B. Are all Tipe I human interferons equivalent?
J. Viral Hepatitis, 5: 143-152, 1998.
FRESE, M.; KOCHS, G.; FELDMANN, H.; HERTKORN, C.; HALLER, O.
Inhibition of Bunyaviruses, Phleboviruses, and Hantaviruses by
human MxA protein. J. Virology, 70: 915-923, 1996.
FRESE, M.; KOCHS, G.; MEIER-DIETER, U.; SIEBLER, J.; HALLER, O.
Human MxA protein inhibits tick-borne Thogoto virus but not
Dhori virus. J. Virology, 69: 3904-3909, 1995.
FUCHIZAKI, U.; KANEKO, S.; NAKAMOTO, Y.; SUGIYAMA, Y.; IMAGAWA,
K.; KIKUCHI, M.; KOBAYASHI, K. Synergistic antiviral effect of a
combination of mouse interferon-alpha and interferon-gamma on
mouse hepatitis virus. J. Med. Virol., 69(2): 188-194, 2003.
GALE, M.I.; KATZE, M.G. Molecular mechanisms of interferon resistance
mediated by viral-directed inhibition of PKR, the the interferon
induced protein kinase. Pharmacol. Ther., 78: 29-46, 1998.
GARCIA-SASTRE, A. Inhibition of interferon-madiated antiviral responses
by influenza A viruses and other negative-strand RNA viruses.
Virology, 279: 375-384, 2001.
GOLDBLUM, R. Therapy of rheumatoid arthritis with mycophenolate
mofetil. Clin. Exp. Rheumatol., 11: S117–119, 1993.
GONG, Z.J.; De MEYER, S.; CLARYSSE, C.; VERSLYPE, C.; NEYTS, J.; De
CLERCQ,
E.;
YAP,
S.H.
Mycophenolic
acid,
an
immunosuppressive agent, inhibits HBV replication in vitro. J.
Viral Hepat., 6: 229-236, 1999.
122
GONZALEZ-SCARANO, F.; NATHANSON, N. Bunyaviruses, p. 1473-1504.
In: B.N. Fields; D.M. Knipe (ed). Fields Virology, LippincottRaven, Philadelphia, USA. 1996.
GOODBOURN, S.; DIDCOCK, L.; RANDALL, R.E.
Interferons: cell
signalling, immune modulation, antiviral response and virus
countermeasures. J. Gen. Virol., 81: 2341-2364, 2000.
GOSWAMI, B.B.; BOREK, E.; SHALMA, D.K.; FUJITAKI, J.; SMITH, R.A.
The broad spectrum antiviral agent ribavirin inhibits capping of
mRNA. Biochem. Biophis. Res. Commun., 89: 830-836, 1979.
GRACI, J.D.; CAMERON, C.E. Mechanisms of action of ribavirin against
distinct viruses. Rev. Med. Virol., 16(1): 37-48, 2006.
GRATTAGLIANO, I.; RUSSMANN, S.; PALMIERI, V.O.; PORTINCASA, P.;
PALASCIANO, G.; LAUTERBURG, B.H. Glutathione peroxidase,
thioredoxin, and membrane protein changes in erythrcytes
predict ribavirin-induced anemia. Clin. Pharmacol. Ther., 78:
422-432, 2005.
GRESSER, I. Biologic effects of interferons. J. Invest. Dermatol., 95(6
Suppl): 66S-71S, 1990.
GROOT, H.; OYA, A.; BERNAL, C.; BARRETO-REYES, P. Guaroa virus, a
new agent isolated in Colombia, South America. Am. J. Trop.
Med. Hyg., 8: 604-609, 1959.
HALLER, O.; FRESE, M.; KOCHS, G. Mx proteins: mediators of innate
resistance to RNA viruses. Rev. Sci. Technol. Off. Int. Epizootol.,
17: 220-230, 1998.
HRUSKA, J.F.; BERNSTEIN, J.M.; DOUGLAS, R.G. Jr; HALL, C.B. Effects
of ribavirin on respiratory syncytial virus in vitro. Antimicrob.
Agents Chemother., 17: 770-775, 1980.
HUGGINS, J.W.; KIM, G.R.; BRAND, O.M.; McKEE Jr, K.T. Ribavirin
therapy for Hantaan virus infection in suckling mice. J. Infect.
Dis., 153(3): 489-497, 1986.
HULTGREN, C.; MILICH, D.R.; WEILAND, O.; SALLBERG, M. The antiviral
compound ribavirin modulates the T helper (Th) 1/Th2 subset
123
balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. J.
Gen. Virol., 79(Pt10): 2381-2391, 1998.
ICHIMURA, H.; LEVY, J.A. Polymerase substrate depletion: a novel
strategy
for
inhibiting
the
replication
of
the
human
immunodeficiency virus. Virology, 211: 554-560, 1995.
ISAACS, A.; LINDENMANN, J. Virus interference I. The interferon. Proc. R.
Soc. Lond. B. Biol. Sci., 147(927): 258-267, 1957.
IVERSSON, L.B. Current status of the eco-epidemiological knowledge on
arboviruses pathogenic to humans in the Atlantic Forest region
of the State of São Paulo. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 36:
343-353, 1994.
IVERSSON, L.B.; SILVA, R.A.M.S.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.;
BARROS, V.L.R.S. Circulation of Eastern Equine Encephalitis,
Western Equine Encephalitis, Ilhéus, Maguari, and Tacaiuma
viruses in equines of the Brazilian Pantanal, South America. Rev.
Inst. Med. Trop. São Paulo, 35: 355-359, 1993.
JACOBS, B.L.; LANGLAND, I.O. When two strands are better than one:
The mediators and modulators of the cellular responses to
double-strand RNA. Virology, 219: 339-349, 1996.
JAHRLING, P.B.; HESSE, R.A.; EDDY, G.A.; JOHNSON, K.M.; CALLIS,
R.T.; STEPHEN, E.L. Lassa virus infection of rhesus monkeys:
pathogenesis and treatment with ribavirin. J. Infect. Dis., 141:
580-589, 1980.
JI, Y.; GU, J.; MAKHOV, A.M.; GRIFFITH, J.D.; MITCHELL, B.S.
Regulation
of
the
interation
of
inosine
monophosphate
dehydrogenase with mycophenolic acid by GTP. J. Biol. Chem.,
281(1): 206-212, 2006.
JIN, H.; ELLIOT, R.M. Non-viral sequences at the 5’ ends of Dugbe
nairovirus S mRNAs. J. Gen. Virol., 74: 2293-2297, 1993.
JIN, H.K.; TAKADA, A.; KON, Y.; HALLER, O.; WATANABE, T. Identication
of the murine Mx2 gene: interferon-induced expression of the
Mx2 protein from the feral mouse gene confers resistance to
vesicular stomatitis virus. J. Virology, 73: 4925-4930, 1999.
124
JOHNSON, H.M.; BAZER, F.W.; SZENTE, B.E.; JARPE, M.A. How
interferons fight disease. Sci. Am., 270(50): 68-75, 1994.
JONKERS, A.H.; Spence, L.; Olivier, O. Laboratory studies with wild
rodents and viruses native to Trinidad. III. Studies with three
Guama-group viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 17: 299-307,
1968.
JORDAN, I.; BRIESE, T.; FISCHER, N.; LAU, J.Y.; LIPKIN, W.I. Ribavirin
inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in
neural cells. J. Infect. Dis., 82: 1214-1217, 2000.
KALVAKOLANU, D.V. Virus interception of cytokine regulated pathwyas.
Trends Microbiol., 7: 166-171, 1999.
KARABATSOS, N. International catalogue of arbovirus including certain
other viruses of vertebrates. Am. Soc. Trop. Med. Hyg., San
Antonio, Tex. 1985.
KELLEY, K.A.; KOZAK, C.A.; DANDOY, F.; SOR, F.; SKUP, D.; WINDASS,
J.D.; De MAEYER-GUIGNARD, J.; PITHA, P.M.; DeMAEYER E.
Mapping of murine interferon-a genes to chromosome 4. Gene,
26(2-3): 181-188,1983.
KELLEY, K.A.; PITHA, P.M. Characterization of a mouse interferon gene
locus. I. Isolation of a cluster of four alpha-interferon genes.
Nucleic Acids Res.,13: 805-823, 1985.
KENDE, H.; ALVING, C.R.; RILL, W.L.; SWARTZ Jr., G.M.; CANONICO,
P.G.
Enhanced
efficacy
of
liposome-encapsulated
ribavirin
against Rift Valley fever virus infection in mice. Antimicrob.
Agents Chemother., 27(6): 903-907, 1985.
KENYON, R.H.; CANONICO, P.G.; GREEN, D.E.; PETERS, C.J. Effect of
ribavirin and tributylribavirin on argentine hemorrhagic fever
(Junin virus) in guinea pigs. Antimicrob. Agents Chemother.,
29(3): 521-523, 1986.
KHABAR, K.S.; DHALLA, M.; SIDDIQUI, Y.; ZHOU, A.; AL-AHDAL, M.N.;
DER,
S.D.;
SILVERMAN,
R.H.;
WILLIAMS,
B.R.
Effect
of
deficiency of the double-stranded RNA-dependent protein kinase,
PKR, on antiviral resistance in the presence or absense of
125
ribonuclease L: HSV-1 replication is particularly sensitive to
deficiency of the major IFN-mediated enzymes. J. Interferon
Cytokine Res., 20: 653-659, 2000.
KINCHINGTON, D.; KANGRO, H.; JEFFRIES, D.J. Design and testing of
antiviral compounds p.:154-155. In: Medical Virology – A
practical approach. U Desselberger ed. Oxford University Press New York, USA, 1995.
KINNEY, R.M.; CALISHER, C.H. Antigenic relationships among Simbu
serogroup (Bunyaviridae) viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30:
1307-1318, 1981.
KOFF,
W.C.;
PRATT,
HALSTEAD,
R.D.;
S.B.
ELM
Jr,
Treatment
J.L.;
of
VENKATESHAN,
intracranial
dengue
C.N.;
virus
infections in mice with a lipophilic derivative of ribavirin.
Antimicrob. Agents Chem., 24: 134-136, 1983.
KORZYBSKI,
T.;
KOWSZYK-GINDIFER,
Z.;
KURYLOWICZ,
W.
In:
Antibiotics, Origin, Nature and properties, vol. 2, p.:1203.
Translated by E. Paryski. Pergamon Press, London and New
York, USA, 1967.
LANFORD, R.E.; CHAVEZ, D.; GUERRA, B.; LAU, J.Y.; HONG, Z.;
BRASKY, K.M.; BEAMES, B. Ribavirin induces error-prone
replication of GB virus B in primary tamarin hepatocytes. J.
Virolology, 75(17): 8074–8081, 2001.
LANFORD, R.E.; GUERRA, B.; LEE, H.; AVERETT, D.R.; PFEIFFER, B.;
CHAVEZ, D.; NOTVALL, L.; BIGGER, C. Antiviral effect and
virus-host interations in response to alpha interferon, gamma
interferon, poly(i)-poly(c), tumor necrosis factor alpha, and
ribavirin in hepatitis C virus subgenomic replicons. J. Virology,
77(2): 1092-1104, 2003.
LEYSSEN, P.; BALZARINI, J.; De CLERCQ, E.; NEYTS, J. The predominant
mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro
against
flaviviruses
and
paramixoviruses
is
mediated
by
inhibition of IMP dehydrogenase. J. Virology, 79(3): 1943-1947,
2005.
126
LIPSKY, J.J. Mycophenolate mofetil. Lancet, 348: 1357-1359, 1996.
LIU, G.; ZHAI, Q.; SCHAFFNER, D.J.; WU, A.; YOHANNES, A.; ROBINSON,
T.M.; MALAND, M.; WELLS, J.; VOSS, T.; BAILEY, C.; ALIBEK, K.
Prevention of letal respiratory vaccinia infections in mice with
interferon-α and interferon-γ. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 40:
201-206, 2004.
LUKASZEWSKI, R.A.; BROOKS, T.J.G. Pegylated alpha interferon is an
effective treatment for virulent venezuelan equine encephalitis
virus and has profound effects on the host immune response to
infection. J. Virology, 74(11): 5006-5015, 2000.
MAAG, D.; CASTRO, C.; HONG, Z.; CAMERON, C.E. Hepatitis C virus
RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) as a mediator of the
antiviral activity of ribavirin. J. Biol. Chem., 276(49): 46094–
46098, 2001.
MAHANTY, S.; GUPTA, M.; PARAGAS, J.; BRAY, M.; AHMED, R.; ROLLIN,
P.E. Protection from lethal infection is determined by innate
immune responses in a mouse model of Ebola virus infection.
Virology, 312: 415-424, 2003.
MANGIA, A.; SANTORO, R.; MINERVA, N.; RICCI, G.L.; CARRETA, V.;
PERSICO, M.; VINELLI, F.; SCOTTO, G.; BACCA, D.; ANNESE,
M.; ROMANO, M.; ZECHINI, F.; SOGARI, F.; SPIRITO, F.;
ANDRUILLI, A. Peginterferon alfa-2b and ribavirin for 12 vs. 24
weeks in HCV genotype 2 or 3. N. Engl. J. Med., 352(25): 2609–
2617, 2005.
MANGIAFICO, J.A.; SANCHEZ, J.L., FIGUEIREDO, L.T.; LeDUC, J.W.;
PETERS, C.J. Isolation of a newly recognized Bunyamwera
serogroup virus from a febrile human in Panama. Am. J. Trop.
Med. Hyg., 39: 593-596, 1988.
MARCH, R.W.; HETRICK, F.M. Studies on Guaroa virus. II. Observations
in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg., 16(2): 196-199, 1967.
MARGOLIS, D.; HEREDIA, A.; GAYWEE, J.; OLDACH, D.; DRUSANO, G.;
REDFIELD, R. Abacavir and mycophenolic acid, an inhibitor of
inosine monophosphate dehydrogenase, have profound and
127
synergistic anti-HIV activity. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr.,
21(5): 362-370, 1999.
MARSCHALL, M.; ZACH, A.; HECHTFISCHER, A.; FOERST, G.; MEIEREWERT, H.; HALLER, O. Inhibition of influenza C viruses by
human MxA protein. Virus Res., 67: 179-188, 2000.
McCORMICK, J.B.; KING, I.J.; WEBB, P.A.; SCRIBNER, C.L.; CRAVEN,
R.B.; JOHNSON, K.M.; ELLIOTT, L.H.; BELMONT-WILLIAMS, R.
Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N. Engl. J. Med.,
314: 20-26, 1986.
McHUTCHISON, J.G.; GORDON, S.C.; SCHIFF, E.R.; SHIFFMAN, M.L.;
LEE, W.M.; RUSTGI, V.K.; GOODMAN, Z.D.; LING, M.H.; CORT,
S.; ALBRECHT, J.K. Interferon alfa-2b alone or in combination
with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C.
Hepatitis Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339:
1485-1492, 1998.
MOORE, M. Interferon and the immune system. II. Effect of interferon on
the immune system, p. 181. In Interferon: From Molecular
Biology to Clinical Application. Thirty-fifth Symposium of the
Society for General Microbiology. D.C. Burke and A.G. Morris,
eds. Cambridge University Press, Cambridge, 1983.
MORENS,
D.M.;
HALSTEAD,
S.B.;
REPIK,
P.M.;
PUTVATANA,
R.;
RAYBOURNE, N. Simplified plaque reduction neutralization
assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells:
comparison of the BHK suspension test with standard plaque
reduction neutralization. J. Clin. Microbiol., 22(2): 250-254, 1985.
MORRIL, J.C.; JENNINGS, G.B.; COSGRIFF, T.M.; GIBBS, P.H.; PETERS,
C.J. Prevention of Rift Valley fever in Rhesus monkeys with
interferon-α. Rev. Infect. Dis., 11(4 Suppl): S815-S825, 1989.
MOSCA, J.D.; PITHA, P.M. Transcriptional and posttranscriptional
regulation of exogenous human beta interferon gene in simian
cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol., 6: 22792283, 1986.
128
MULLER, W.E.; MAIDHOF, A.; TASCHNER, H.; ZAHN, R.K. Virazole (1beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide: a cytostatic
agent. Biochem. Pharmacol., 26(11): 1071–1075, 1977.
NEYTS, J.; De CLERCQ, E. Mycophenolate mofetil strongly potentiates the
anti-herpesvirus activity of acyclovir. Antiviral Res., 40: 53-56,
1998.
NEYTS, J.; MEERBACH, A.; McKENNA, P.; De CLERCQ, E. Use of the
yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies
for the treatment of yellow fever virus infections. Antiviral Res.,
30: 125-132, 1996.
NING, Q.; BROWN, D.; PARODO, J.; CATTRAL, M.; GORCZYNSKI, R.;
COLE, E.; FUNG, L.; DING, J.W.; LIU, M.F.; ROTSTEIN, O.;
PHILLIPS,
M.J.;
LEVY,
G.
Ribavirin
inhibits viral-induced
macrophage production of TNF, IL-1, the procoagulant fgl2
prothrombinase, and preserves TH1 cytokine production but
inhibits TH2 cytokine response. J. Immunol., 160: 3487-3493,
1998.
NUNES, M.R.T.; MARTINS, L.C.; RODRIGUES, S.G.; CHIANG, J.O.;
AZEVEDO,
R.S.S.;
TRAVASSOS
DA
ROSA,
A.P.A.;
VASCONCELOS, P.F.C. Oropouche virus isolation, Southeast
Brazil. Emerg. Infect. Dis., 11: 1610-1613, 2005.
PADALKO, E.; VERBEKEN, E.; MATTHYS P.; AERTS, J.L.; De CLERCQ,
E.; NEYTS, J. Mycophenolate mofetil inhibits the development of
Coxsackie B3-virus-induced myocarditis in mice. BMC Microbiol.,
3: 25-33, 2003.
PAGE, T.; CONNOR, J.D. The metabolism of ribavirin in erythrocytes and
nucleated cells. Int. J. Biochem., 22(4): 379–383, 1990.
PAVLOVIC, J.; ARZET, H.A.; HEFTI, H.P.; FRESE, M.; ROST, D.; ERNST,
B.; KOLB, E.; STAEHELI, P.; HALLER, O. Enhanced virus
resistance of transgenic mice expressing the human MxA protein.
J. Virology, 69: 4506-4510, 1995.
129
PAVLOVIC, J.; HALLER, O.; STAEHELI, P. Human and mouse Mx proteins
inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.
J. Virology, 66: 2564-2569, 1992.
PAVLOVIC, J.; SCHULTZ, J.; HEFTI, H.P.; SCHUH, T.; MOLLING, K. DNA
vaccination against La Crosse virus. Intervirology, 43(4-6): 312321, 2000.
PAWLOTSKY,
J.M.;
DAHARI,
H.;
NEUMANN,
A.U.;
HEZODE,
C.;
GERMANIDIS, G.; LONJON, I.; CASTERA, L.; DHUMEAUX, D.
Antiviral
action
of
ribavirin
in
chronic
hepatitis
C.
Gastroenterology, 126(3): 703-714, 2004.
PENSIERO, M.N.; SHAREFKIN, J.B.; DIEFFENBACH, C.W.; HAY, J.
Hantaan virus infection of human endothelial cells. J. Virology,
66: 5929-5936, 1992.
PETERSEN, C.; BRUNS, E.; KUSKE, M.; Von WUSSOW, P. Treatment of
extrahepatic biliary atresia with interferon-α in a murine
infectious model. Pediatric Res., 42(5): 623-628, 1997.
PFEIFFER, J.K.; KIRKEGAARD, K. A single mutation in poliovirus RNAdependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic
nucleotide analogs via increased fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 100(12): 7289-7294, 2003.
PINHEIRO, F.P. Situação das arboviroses na região Amazônica. Anais do
simpósio internacional sobre arbovírus dos trópicos e febres
hemorrágicas, p. 27-48. Academia Brasileira de Ciências, Belém,
Brazil, 1985.
PINHEIRO, F.P.; ROCHA, A.G.; FREITAS, R.B.; OHANA, B.A.; TRAVASSOS
DA ROSA, A.P.A.; ROGÉRIO, J.S.; LINHARES, A.C. Meningite
associada às infecções por vírus Oropouche. Rev. Inst. Med. Trop.
São Paulo, 24: 246-251, 1982.
PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TRAVASSOS DA ROSA,
J.F.S.; ISHAK, R.; FREITAS, R.B.; GOMES, M.L.; LeDUC, J.W.;
OLIVA,
O.F.P.
Oropouche
virus.
I.
A
review
of
clinical,
epidemiological and ecological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg.,
30: 149-160, 1981.
130
PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; VASCONCELOS, P.F.C.
Doenças Infecciosas e Parasitárias, Enfoque Amazônico, p. 285298. In: R.N.Q. Leão (ed). CEJUP, Belém, Brasil, 1997.
PINHEIRO, F.P.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; VASCONCELOS, P.F.C.
Oropouche fever, p 2418-2423. In: R.D. Feigin (ed). Textbook of
pediatric infectioius diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia,
2004.
PLANTEROSE, D.N. Antiviral and cytotoxic effects of mycophenolic acid. J.
Gen. Virol., 4: 629-630, 1969.
PLOEGH, H.L. Viral strategies of immune evasion. Science, 280: 248-253,
1998.
PTOSSI, F.; BLANK, A.; SCHRÖDER, A.; SCHWARZ, A.; HÜSSI, P.;
SCHWEMMLE, M.; PAVLOVIC, J.; STAEHELI, P. A functional
GTP-binding motif is necessary for antiviral activity of Mx
proteins. J. Virology, 67: 6726-6732, 1993.
RANG, H.P.; DALE, M.M. Drogas antivirais, p.509-515. In: Farmacologia,
2a edição. H.P. Rang e M.M. Dale eds. Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil. 1993.
REED, L.J.; MUENCH, H. A simple method of estimating fifty percent end
points. Am. J. Hyg., 27: 493-497, 1938.
ROBERTS, D.R.; HOCH, A.L.; DIXON, K.E.; LLEWELLYN, C.H. Oropouche
virus. III. Entomological observations from three epidemics in
Pará, Brazil, 1975. Am. J. Trop. Med. Hyg., 30: 165-171, 1981.
ROBERTSON, C.M.; HERMANN, L.L.; COOMBS, K.M. Mycophenolic acid
inhibits avian reovirus replication. Antiviral Res., 64: 55-61,
2004.
SABATTINI, M.S.; SHOPE, R.E.; VANELLA, J.M. Serological survey for
arboviruses in Cordoba Province, Argentina. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 14: 1073-1078, 1965.
SAMUEL, C.E. Antiviral actions of interferon: interferon-regulated cellular
proteins and their surprisingly selective antiviral activities.
Virology, 183: 1-11, 1991.
131
SAMUEL, C.E. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev., 14(4):
778-809, 2001.
SASAKI, O.; KARAKI, T.; IMANISHI, J. Protective effect of interferon on
infections with hand, foot, and mouth disease virus in newborn
mice. J. Infec. Dis., 153(3): 498-502, 1986.
SCHEIDEL, L.M.; DURBIN, R.K.; STOLLAR, V. Sindbis virus mutants
resistant to Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology, 158: 1-7,
1987.
SCHEIDEL, L.M.; STOLLAR, V. Mutations that confer resistance to
mycophenolic acid and ribavirin on Sindbis virus map to the
nonstructural protein nsP1. Virology, 181: 490-499, 1991.
SCHMALJOHN, C.S. Fundamental Virology, p. 649-673. In: B. Fields,
D.M. Knipe, and Howley (ed). Lipincott-Raven, Inc., Philadelphia,
1996.
SCHMALJOHN, C.S.; HJELLE, B. Hantaviruses: a global disease problem.
Emerg. Infect. Dis., 3: 95-104, 1997.
SEN, G.C. Viruses and interferons. Annu. Rev. Microbiol., 55: 255-281,
2001.
SEVERSON, W.E.; SCHMALJOHN, C.S.; JAVADIAN, A.; JONSSON, C.B.
Ribavirin
causes
error
catastrophe
during
Hantaan
virus
replication. J. Virology, 77(1): 481-488, 2003.
SIDWELL, R.W.; HUFFMAN, J.H.; BARNARD, D.L.; SMEE, D.F.; WARREN,
R.P.; CHIRIGOS, M.A.; KENDE, M.; HUGGINS, J. Antiviral and
immunomodulating inhibitors of experimentally-induced Punta
Toro virus infections. Antiviral Res., 25: 105-122, 1994.
SIDWELL, R.W.; HUFFMAN, J.H.; BARNETT, B.B.; PIFAT, D.Y. In vitro and
in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents
Chemother., 32: 331-336, 1988.
SIDWELL,
R.W.;
HUFFMAN,
WITKOWSKI,
activity
of
J.T.;
J.H.;
ROBINS,
Virazole:
KHARE,
R.K.
G.P.;
ALLEN,
Broad-spectrum
L.B.;
antiviral
1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-
carboxamide. Science, 177(50): 705–706, 1972.
132
STAEHELI, P.; HALLER, O.; BOLL, W.; LINDENMANN, J.; WEISSMANN, C.
Mx protein: constitutive expression in 3T3 cells transformed with
cloned Mx cDNA confers selective resistance to influenza virus.
Cell, 44: 147-158, 1986.
STAEHELI, P.; PITOSSI, F.; PAVLOVIC, J. Mx proteins: GTPases with
antiviral activity. Trends Cell Biol., 3: 268-272, 1993.
STAEHELI, P.; SUTCLIFFE, J.G. Identification of a second interferonregulated murine Mx gene. Mol. Cell Biol., 8: 4524-4528, 1988.
STARK,
G.R.;
KERR,
I.M.;
WILLIAMS,
B.R.;
SILVERMAN,
R.H.;
SCHREIBER, R.D. How cells respond to interferons. Annu. Rev.
Biochem., 67: 227-264, 1998.
STREETER, D.G.; WITKOWSKI, J.T.; KHARE, G.P.; SIDWELL, R.W.;
BAUER, R.J.; ROBINS, R.K.; SIMON, L.N. Mechanism of action of
1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (Virazole), a
new broad-spectrum antiviral agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
70: 1174-1178, 1973.
STRÖHER, U.; DiCARO, A.; LI, Y.; STRONG, J.E.; AOKI, F.; PLUMMER, F.;
JONES,
S.M.;
FELDMANN,
H.
Severe
acute
respiratory
syndrome-related Coronavirus is inhibit by interferon-α. J. Infect.
Dis., 189: 1164-1167, 2004.
SUNDSTROM, J.B.; McMULLAN, L.K.; SPIROPOULOU, C.F.; HOPPER,
W.C.; ANSARI, A.A.; PETERS, C.J.; ROLLIN, P.E. Hantavirus
infection induces the expression of RANTES and IP-10 without
causing increased permeability in human lung microvascular
endothelial cells. J. Virology, 75:6076-6085, 2001.
TAM, R.C.; PAI, B.; BARD, J.; LIM, C.; AVERETT, D.R.; PHAN, U.T.;
MILOVANOVIC, T. Ribavirin polarizes human T cell responses
towards a Type 1 cytokine profile. J. Hepatol., 30(3): 376-382,
1999.
TAN, E.L.C.; OOI, E.E.; LIN, C.; TAN, H.C.; LING, A.E.; LIM, B.; STANTON,
L.W. Inhibition of SARS coronavirus infection in vitro with
clinically approved antiviral drugs. Emerg. Infec. Dis., 10(4): 581586, 2004.
133
THE MERK INDEX. Published by Merck Research Laboratories Division of
Merck & Co.; Inc. Whitehouse Station, NJ. USA. 1996.
TOLTZIS, P.; O’CONNELL, K.; PATTERSON, J.L. Effect of phosphorylated
ribavirin on vesicular stomatitis virus transcription. Antimicrob.
Agents Chemother., 32(4): 492–497, 1988.
TRESSLER, R.J.; GARVIN, L.J.; SLATE, D.L. Anti-tumor activity of
mycophenolate mofetil against human and mouse tumors in vivo.
Int. J. Cancer, 57: 568–573, 1994.
TSAI, S.L.; LIAW, Y.F.; CHEN, M.H.; HUANG, C.Y.; KUO, G.C. Detection of
type
2-like
T-helper
cells
in
hepatitis
C
virus
infection:
implications for hepatitis C virus chronicity. Hepatology, 25(2):
449-458, 1997.
TURNER, W.; GIBSON, W.; CHIRIGOS, M.A. Enhancement of murine
sarcoma virus (Moloney) infection in mice by Guaroa virus.
Cancer Res., 30: 2645-2651, 1970.
Van der BLIEK, A.M. Functional diversity in the dynamin family. Trends
Cell Biol., 3: 96-102, 1999.
Van TONGEREN, H.A. Occurence of arboviruses belonging to the C-,
Bunyamwera and Guama groups, and of Oropouche, Junin,
Tacaiuma and Kwatta viruses in man in the province of
Brokopondo, Surinam: a serological survey. Trop. Geogr. Med.,
19: 309-325, 1967.
VASCONCELOS, P.F.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; DÉGALLIER, N.;
TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S.; PINHEIRO, F.P. Ciência e Cultura,
44: 117-124, 1992.
VASCONCELOS, P.F.C.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; PINHEIRO, F.P.;
SHOPE, R.E.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.; RODRIGUES, S.G.;
DEGALLIER, N.; TRAVASSOS DA ROSA, E.S. Arboviruses
pathogenic for man in Brazil, p. 72-99. In: A.P.A. Travassos da
Rosa, P.F.C. Vasconcelos, J.F.S. Travassos da Rosa (ed). An
overview of arbovirology in Brazil and neighbouring countries.
Instituto Evandro Chagas, Belém, Brazil, 1998.
134
VIGNUZZI, M.; STONE, J.K.; ARNOLD, J.J.; CAMERON, C.E.; ANDINO, R.
Quasispecies
diversity
determines
pathogenesis
through
cooperative interactions in a viral population. Nature, 439(7074):
344-348, 2006.
VILCEK, J.; SEN, G.C. Interferons and others cytokines, p.: 375-399. In:
Fields Virology. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, R.M.
Chanock, J.L. Melnick, T.P. Monath, B. Roizman, S.E. Straus
(eds). Lippincott-Raven, Philadelphia, USA. 1996.
VO, N.V.; YOUNG, K.C.; L.A.I., M.M. Mutagenic and inhibitory effects of
ribavirin on hepatitis C virus RNA polymerase. Biochemistry,
42(35): 10462–10471, 2003.
WEBER, F.; BRIDGEN, A.; FAZAKERLEY, J.K.; STREITENFELD, H.;
KESSLER,
N.; RANDALL, R.E.; ELLIOTT, R.M. Bunyamwera
bunyavirus nonstrutural protein NSs counteracts the induction
of alpha/beta interferon. J. Virology, 76(16): 7949-7955, 2002.
WILLIS, RC; CARSON, DA; SEEGMILLER, JE. Adenosine kinase initiates
the major route of ribavirin activation in a cultured human cell
line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75(7): 3042–3044, 1978.
WITKOWSKI, J.T.; ROBINS, R.K.; SIDWELL, R.W.; SIMON, L.N. Design,
synthesis, and broad spectrum antiviral activity of 1-beta-Dribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide
and
related
nucleosides. J. Med. Chem., 15(11): 1150–1154, 1972.
WRAY, S.K.; GILBERT, B.E.; NOALL, M.W.; KNIGHT, V. Mode of action of
ribavirin: effect of nucleotide pool alterations on influenza virus
ribonucleoprotein synthesis. Antiviral Res., 5(1): 29–37, 1985.
WYDE, P.R. Respiratory syncytial virus (RSV) disease and prospects for its
control. Antiviral Res., 39: 63-79,1998.
XIAO, S.; GUZMAN, H.; ZHANG, H.; TRAVASSOS DA ROSA, A.P.A.; TESH,
R.B.
West
Nile
virus
infection
in
the
golden
hamster
(Mesocricetus auratus): a model for West Nile encephalitis.
Emerg. Infect. Dis., 7(4): 714-721, 2001.
YOUNG, K.C.; LINDSAY, K.L.; LEE, K.J.; LIU, W.C.; HE, J.W.; MILSTEIN,
S.L.; LAI, M.M. Indetification of a ribavirin-resistant NS5B
135
mutation of hepatitis C vírus during ribavirin monotherapy.
Hepatology, 38(4): 869-878, 2003.
ZHOU, S.; LIU, R.; BAROUDY, B.M.; MALCOLM, B.A.; REYES, G.R. The
effect of ribavirin and IMPDH inhibitors on hepatitis C virus
subgenomic replicon RNA. Virology, 310(2): 333-342, 2003.
136
10. ANEXOS
10.1. Artigo referente aos resultados de Ribavirina
Manuscrito submetido para publicação na “American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene”.
137
LRH: LIVONESI AND OTHERS
RRH: RIBAVIRIN ACTION ON BRAZILIAN ORTHOBUNYAVIRUS
IN VITRO AND IN VIVO STUDIES OF THE RIBAVIRIN ACTION ON
BRAZILIAN ORTHOBUNYAVIRUS
MÁRCIA C. LIVONESI, RICARDO L. MORO DE SOUSA, SORAYA J. BADRA, AND
LUIZ T. M. FIGUEIREDO
Center for Research in Virology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São
Paulo USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
138
Abstract
Oropouche,
Caraparu,
Guama,
Guaroa
and
Tacaiuma
are
viruses
(Orthobunyavirus genus) that cause human febrile illnesses and encephalitis. The goal of
this study was to evaluate the antiviral action of Ribavirin on these Orthobunyavirus to
achieve a therapeutical agent to treat the diseases caused by these viruses. Results in vitro
showed that the ribavirin (50 µg/mL) have antiviral activity only on the Tacaiuma virus.
Addition of guanosine in the culture reverted the antiviral effect of ribavirin on Tacaiuma
virus, suggesting that ribavirin inhibited this virus by reducing intracellular guanosine
pool. Moreover, ribavirin was not an effective drug in vivo, because it was unable to inhibit
the death of the mice, and the virus replication in the brain. The results suggest that
ribavirin does not have antiviral activity on the Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and
Tacaiuma viruses and consequently the ribavirin would not be a good therapeutical agent
to treat these arboviruses.
139
1. Introduction
The Oropouche (OROV), Caraparu (CARV), Guama (GUAV), Guaroa
(GROV) and Tacaiuma (TCMV) viruses belong to distinct antigenic serogroups of the
Orthobunyavirus genus, in the Bunyaviridae family. These viruses are enveloped with
trisegmented single-stranded RNA genome of negative or ambisense polarity, replicate in
the cytoplasm and bud into the Golgi apparatus or upon the plasma membrane.1, 2
The OROV (Simbu group) is transmitted mainly by the biting midge
(Culicoides paraensis) and has been associated with dengue-like acute febrile illness. The
OROV fever has emerged over the past 40 years as a serious public health problem in
tropical and subtropical areas of Central and South America, having caused least 30
reported outbreaks, involving more than half a million people.3 Clinical features of the
OROV fever include abrupt onset of fever, chills, severe headache, dizziness, myalgia,
arthralgia, nausea, and vomiting. Occasionally, neurologic involvement has been reported.
All ages and both sexes appear to be equally susceptible to infection.4 Similar to OROV,
CARV (C group), GUAV (Guama group), GROV (Bunyamwera group) and TCMV
(Anopheles A group) have also been associated with febrile illness, as well as encephalitis
in humans. They are transmitted by mosquitoes, and cause disease mainly in residents of
the Amazon region of Brazil.5--8 Due to the high attack rates of OROV epidemics and to
the debilitating nature and duration of symptoms of the clinical syndromes caused by this
and other Brazilian Orthobunyavirus, an antiviral therapy, if available, would become a
very helpful intervention.
Ribavirin,
the
nucleoside
analog
1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-
carboxamide, exhibits antiviral activity against a variety of RNA viruses in cell culture 9, 10
including viruses from the Paramyxoviridae,11,12 Flaviviridae,12--14 Picornaviridae,15
Orthomyxoviridae,16 Arenaviridae 17, 18 and Bunyaviridae 19, 20 families. In humans, RBV is
used clinically to treat infections by hepatitis C virus (in combination with interferon-α),21,
22
respiratory syncytial virus23 and Lassa fever virus.24 Ribavirin is phosphorylated by
cellular enzymes, and has been proposed to exert antiviral effects through several
mechanisms:25 (A) reduction in cellular guanosine triphosphate (GTP) pools via inosine
monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inhibition,26 (B) inhibition of the viral RNA
guanylyltransferase and, consequently, reduction of the capping of viral mRNA,27 (C)
inhibition of the viral RNA polymerase,28 (D) incorporation of the compound either as a
GTP or an ATP analogue, causing lethal mutagenesis of the viral RNA genomes,15 and (E)
enhancement of the Th1 antiviral immune response.29 Ribavirin monophosphate is the
140
derivative responsible for the first mechanism, and RBV triphosphate is linked to the
second, third and fourth of these mechanisms.30
In an effort to characterize antiviral agents that could attenuate infection caused
by OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV, we tested the action of RBV, an antiviral
of broad-spectrum, on these viruses both in vitro and in vivo.
2. Materials and methods
2.1. Viruses
The ORO (BeAn19991), GUA (BeAn277), GRO (BeH22063), and TCM
(BeAn73) viruses were kindly supplied by Dr. Pedro Vasconcelos and Dr. Amélia
Travassos da Rosa, (Evandro Chagas Institute, Brazilian Ministry of Health, Belém, Brazil
and University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, USA). The CARV
(SPAn2049) was kindly supplied by Dr. Terezinha Lisieux Coimbra (Adolpho Lutz
Institute, São Paulo, Brazil). Viral stocks were obtained from the brains of intracerebrally
infected suckling mice. Brains were mixed with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and
centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C. The supernatants were harvested and stored
at -70oC until use.
2.2. Cell culture
African green monkey kidney (Vero E6) cells (ATCC-CCL81) were grown in
minimum essential medium (MEM, Cultilab, Brazil) supplemented with 10% inactivated,
Mycoplasma free, fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Brazil), 1% L-glutamine and 0.3%
sodium bicarbonate.
2.3. Compounds
Ribavirin and guanosine were purchased commercially (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO). Ribavirin was diluted in 0.85% NaCl solution and guanosine (G) was
diluted in 30o ethanol, and they were stored at 4oC until use.
2.4. Animals
Swiss newborn mice were obtained from the laboratory animal facility of the
University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil. The mice were maintained in microisolator
cages in the animal housing facility of the Center for Research in Virology, University of
141
São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil. The experiments were approved by the ethical committe
on vertebrate animal experiments of the University of São Paulo (No 006/2004).
2.5. In vitro antiviral evaluation
In vitro antiviral evaluation was done by using plaque assay. Vero E6 cells were
seeded in 24-well plates in MEM with 10% FBS, for 24hr at 37°C and 5% CO2. Medium
was removed and serial 10-fold dilutions of viral stocks diluted in MEM with 5% FBS
were added (0.2 mL/well) in quadruplicates, and the cells were incubated for 2h at 37°C.
Subsequently, the viral inoculum was removed and 1.0 mL of a combination (v/v) of 1%
low-melting-point agarose plus 2X MEM (10% FBS) was added to each well, and the
plates were incubated at 37°C for 3 days for OROV and GUAV, 5 days for CARV and
GROV, and 9 days for TCMV. The plaques were visualized by staining with a naphtol
blue black solution (15 minutes) after the removal of the agarose plug.31 The plaques were
counted under an inverted microscope and the virus titer was determined as Log10 PFU per
milliliter.
Ribavirin and guanosine were diluted in the medium and added to cells on the
day before, or 2 hr after viral infection. A comparison between the virus titers obtained in
the presence or absence of RBV were done and the results were plotted as percentage of
inhibition on plaque formation.
Concentration of RBV added to the cell cultures was ≤50 µg/mL, because this
concentration had a mild cytostatic effect, as they inhibited Vero E6 cell growth by 50%.32
Moreover, clinically therapeutic levels of RBV are 25 µg/mL (or 100 µM).33 Exogenous
guanosina was added to the cell cultures, at the concentration of 30 µg/mL.
2.6. Determination in vivo of RBV toxicity
Ribavirin toxicity was evaluated by significant weight loss, which is a sign of
RBV-induced anemia. Applied RBV doses were 45 and 35 mg/kg/day. The mice were
treated intraperitoneally (IP) daily for 10 days. The animal weights were determined prior
to the first treatment and daily for 10 days.
2.7. Intraperitoneal challenge with viruses and administration with RBV
Three-day-old Swiss mice were infected IP with OROV (10 DL50), CARV
(1,000 DL50), GUAV(100 DL50), GROV(100 DL50), or TCMV (1,000 DL50) in a volume
142
of 40 µL per mouse. The mice were treated intraperitoneally with RBV or placebo in a
volume of 30 µL per mouse. The treatment was initiated 24 hr before infection and
maintained each every day. The animals were daily monitored for mortality.
2.8. Determination of brain virus titers
The brains of mice (two mice per group) were taken aseptically on days 1, 2, 3,
5, 7, and 9 after infection. Brains were mixed with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and
centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C. The supernatants were harvested and stored
at -70oC before plaque assay on Vero E6 cells. The viruses titer in brain were expressed as
Log10 PFU/mL.
2.9. Statistical Analysis
Analysis of variance, followed by the parametric Tukey-Kramer test was used
in the in vitro experiments. Student’s t-test was used to determine if there was a significant
difference in the body weight of the mouse treated with different doses of RBV or placebo
and virus titers between the treated and the placebo groups. A P value less than 0.05 was
considered to indicate statistical significance.
3. Results
3.1. In vitro antiviral effect of Ribavirin
Ribavirin (50 µg/mL) presented significant inhibitory effect on the TCMV
replication, either 24hr before (inhibition 85%; p<0.005) or 2hr after (inhibition 62%;
p<0.01) infection in Vero E6 cells. Moreover, RBV showed a weak inhibitory effect on the
GUAV replication, when the treatment was initiated 24hr prior infection. On the other
hand, RBV was unable to inhibit the replication of other viruses tested (Table 1).
To know whether fewer doses than 50 µg/mL are able to inhibit TCMV
replication, cells were treated one day before (Fig.1A) or 2hr after (Fig.1B) infection with
doses ≤ 50 µg/mL. Figure 1 shows that only the concentration of 50 µg/mL is able to
significantly inhibit TCMV replication. Moreover, the concentration of 50 µg/mL have
antiviral effect only when the treatment is initiated early, because treatment 24hr and 48hr
after infection do not have inhibitory effect on TCMV replication (Fig.1C).
To investigate whether the inhibition of TCMV replication by RBV was caused
by depletion of the GTP pool, exogenous guanosine was added to the culture medium at
143
concentration of 30 µg/mL. Figure 1D shows that addition of guanosine efficiently
reversed the inhibitory effect of RBV on the TCMV replication in Vero E6 cells,
suggesting that the antiviral activity of RBV on TCMV is indeed related to reduction in
GTP intracellular levels.
3.2. In vivo antiviral effect of Ribavirin
To determine the maximum dose to cause no toxicity, suckling mice were
treated with placebo, either 35 mg/kg, or 45 mg/kg of a RBV single daily dose for 10 days.
Figure 2 shows that the dose of 35 mg/kg/day was well tolerated by mice because they
presented an increase of weight similar to the placebo-treated mice. On the other hand,
mice treated with the dose of 45 mg/kg/day had significant weight loss beginning on day 7
of treatment (p<0.05), when compared to placebo-treated mice, demonstrating that this
dose is toxic to suckling mice. Then, 35 mg/kg/day of RBV was the dose chosen to treat
the mice infected by viruses ORO, CAR, GUA, GRO, and TCM.
Ribavirin treatment consisting of a single daily dose was initiated 1 day before
the viral infection, until the death of placebo-treated mice. Intraperitoneal administration of
RBV did not prevent the death of mice infected by studied Orthobunyaviruses (Table 2),
although RBV-treated mice infected by OROV or CARV presented survival rates of 6 and
12%, respectively, which was not significant (Table 2). Likewise, RBV treatment did not
result in a significant increase in the mean time to death of infected mice (Table 2),
demonstrating that RBV do not have antiviral action in vivo on the OROV, CARV,
GUAV, GROV, and TCMV.
Next, we studied the effect of RBV treatment on virus migration and replication
in brain tissue. Figure 3 shows that RBV treatment was unable to prevent neither migration
nor replication of the studied Orthobunyaviruses because the viruses appeared in the brains
of the two groups in the same period, and the virus titer in the brain was equivalent
between RBV-treated and placebo-treated groups. This data can explain the ineffectiveness
of RBV to prevent the death of virus-infected mice and to confirm that the RBV does not
have antiviral activity in vivo on the studied viruses.
4. Discussion
In this study, RBV was evaluated for its antiviral action on the OROV, CARV,
GUAV, GROV and TCMV in vitro and in vivo. RBV had significant antiviral effect in
vitro, only on the TCMV, either before or after viral infection (Table 1). However, this
144
antiviral effect was abolished when the treatment starting 24 hr after infection (Fig.1C), or
when we used concentrations lower than 50 µg/mL (Figs.1A and 1B), suggesting that to
use therapeutic level of RBV, which is 25 µg/mL, could be ineffective to treat illness
caused by TCMV. This supposition is confirmed by experiments in vivo, where the RBV
did not show any antiviral effect on the OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV. Thus,
the RBV was unable to prevent the death of infected mice, it did not prolong the mean time
to death (Table 2), and neither prevented the virus migration and replication in the brain
tissue (Fig.3).
The inhibitory effect of RBV on TCMV in vitro was reversed by the addition of
guanosine (Fig.1D), suggesting that the mechanism of these antiviral action, in this model,
was mediated through depletion of GTP intracellular, what could hypothetically reduce the
efficiency of the viral polymerase activity. However, RBV did not have any inhibitory
effect on OROV, CARV, GUAV, or GROV replication (Table 1), suggesting that the
replicative cycle of these viruses is less dependent on GTP intracellular levels. Schiedel et
al., 1987,30 produced RBV-resistant Sindbis virus (family Togaviridae, genus Alphavirus)
by performing serial passages of the virus in A. Albopictus cells in the presence of MPA
(Mycophenolic Acid). The authors suggested that Sindbis virus mutants were able to
replicate in the presence of RBV and MPA because they generated a guanylyltranferase
and/or RNA polymerase with an increased GTP affinity. Subsequently, Schiedel et al.,
1991,34 showed that the MPA resistent Sindbis virus had an alteration on the RNA
guanylyltransferase. Guanylyltransferase is an important protein for the 5’cap structure
formation of cellular and viral mRNAs. However, viruses of the Bunyaviridae family do
not encode enzymes for making 5’cap of mRNAs because they have a mechanism known
as cap-snatching where they use host-derived primers to initiate the mRNA transcription
process.35 Thus, the resistance to RBV observed in vitro by OROV, CARV, GUAV,
GROV, and TCMV (when doses lower than 50 µg/mL were used, and treatment starting
24 hr post-infection) is not associated with guanylyltransferase protein, but it could be
related to some particularity of the RNA polymerase of these viruses. A similar result was
reported on abscense action of RBV on SARS-CoV (Severe acute respiratory syndromecoronavirus). However, the RBV resistance mechanism has not been explained by the
authors.36
Intraperitoneal inoculation of virus produces first a sistemic disease and later
the viruses migrate to the brain, where they replicate and cause the death of suckling mice
145
(data not showed). Then, we can propose that the RBV resistance in vivo by the OROV,
CARV, GUAV, GROV, and TCMV can be associated with 2 factors: First to some
particularity of the RNA polymerase of these viruses, which was not inhibited by RBV
action, permiting the virus replication with consequent increase viral burden, which
consequently got to the brain of mice, causing illness and death; second, RBV was seen not
to be effective against intracerebral virus infections of mice, unless it is administered
directly into the brain,37 suggesting that RBV or its active metabolites do not reach the
brain in adequate concentrations, probably because the RBV does not cross the blood-brain
barrier.38 Then, when the viruses reach the brain, they can replicate in an environment
without the antiviral action of RBV, causing disease and death in the infected animals. This
second factor was described in mice infected with dengue virus, which treatment with
RBV was ineffective, but treatment with a lipophilic analog of RBV was effective, because
this one crossed the blood-brain barrier.38
In conclusion, our results indicate that the compound RBV does not present
antiviral action on OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV, and consequently the
RBV will not be a good therapeutical agent to treat these arboviruses. Future studies will
be necessary to characterize other antiviral agents to attenuate the infection caused by these
viruses.
Acknowledgments
We thank Dr. Pedro Vasconcelos, Dr. Amélia Travassos da Rosa, and Dr. Terezinha
Lisieux Coimbra for kindly supplying viruses used in this study, and Dr. Eurico de Arruda
Neto for his critical review of the manuscript.
Financial Support
This work was supported by FAPESP grant to L.T.M. Figueiredo (No 03/03682-3) and by
fellowship from CAPES to M.C. Livonesi.
Address
Márcia C. Livonesi; Ricardo L. M. de Sousa, Soraya J. Badra, and Luiz T. M. Figueiredo
Centro de Pesquisa em Virologia, Universidade de São Paulo (USP)
Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Phone/Fax: +55-16-602-3376.
146
Adress for reprint
Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo
Centro de Pesquisa em Virologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo (USP).
Av. Bandeirantes, 3900. CEP: 14049-900 - Ribeirão Preto, SP, Brasil.
References
1. Elliot RM, 1996. The Bunyaviridae. Plenum Press, New York, N.Y.
2. Goldsmith CS, Elliot LH, Peters CJ, Zaki SR, 1995. Ultrastrutural characteristics of Sin
Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch. Virol. 140: 2107-2122.
3. Pinheiro FP, Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC, 2004. Oropouche fever. Feigin
RD, ed. Textbook of pediatric infectious diseases. WB Saunders Co 2418--2423.
4. LeDuc JW, Pinheiro FP, 1988. Oropouche fever. Monath TP, ed. The Arboviruses:
Epidemiology and Ecology. Volume IV. Boca Raton FI: CRC Press, 1--15.
5. Brinton MA, Gavin EI, Lo WK, Pinto AJ, Morahan PS, 1993. Characterization of
murine Caraparu Bunyavirus liver infection and immunomodulator-mediated antiviral
protection. Antiviral Res. 20: 155--171.
6. Jonkers AH, Spence L, Olivier O, 1968. Laboratory studies with rodents and native to
Trinidad. Am. J. Trop. Med. Hyg. 17: 299--307.
7. March RW, Hetrick FM, 1967. Studies on Guaroa virus. Am. J. Trop. Med. Hyg. 16:
191--195.
8. Travassos da Rosa APA, Travassos da Rosa JFS, Pinheiro FP, Vasconcelos PFC, 1997.
Leão RNQ, ed. Doenças Infecciosas e Parasitárias – Enfoque Amazônico. Belém, CEJUP,
207--241.
9. De Clercq E, 1993. Antiviral agents: characteristic activity spectrum depending on the
molecular target with which they interact. Adv. Virus Res. 42: 1--55.
10. Crotty S, Cameron CE, Andini R, 2001. RNA virus error catastrophe: direct molecular
test by using Ribavirin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 6895--6900.
11. Hruska JF, Bernstein JM, Douglas RG Jr, Hall CB, 1980. Effects of ribavirin on
respiratory syncytial virus in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 17: 770--775.
12. Leyssen P, Balzarini J, De Clercq E, Neyts J, 2005. The predominant mechanism by
which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramixoviruses
is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virology 79: 1943--1947.
147
13. Neyts J, Meerbach A, McKenna P, De Clercq E, 1996. Use of the yellow fever virus
vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus
infections. Antiviral Res. 30: 125--132.
14. Jordan I, Briese T, Fischer N, Lau JY, Lipkin WI, 2000. Ribavirin inhibits West Nile
virus replication and cytopathic effect in neural cells. J. Infect. Dis. 82: 1214--1217.
15. Crotty S, Maag D, Arnold JJ, Zhong W, Lau JY, Hong Z, Andino R, Cameron CE,
2000. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an RNA virus mutagen. Nat.
Med. 6: 1375--1379.
16. Durr FE, Lindh HF, 1975. Efficacy of ribavirin against influenza virus in tissue culture
and in mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 255: 366--371.
17. Jahrling PB, Hesse RA, Eddy GA, Johnson KM, Callis RT, Stephen EL, 1980. Lassa
virus infection of rhesus monkeys: pathogenesis and treatment with ribavirin. J. Infect. Dis.
141: 580--589.
18. Andrei G, De Clercq E, 1990. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on
arenavirus replication in vitro. Antiviral Res. 14:287--299.
19. Sidwell RW, Huffman JH, Barnett BB, Pifat DY, 1988. In vitro and in vivo
Phlebovirus inhibition by ribavirin. Antimicrob. Agents Chemother. 32: 331--336.
20. Cassidy LF, Patterson JL, 1989. Mechanism of La Crosse virus inhibition by ribavirin.
Antimicrob. Agents Chemother. 33: 2009--2011.
21. Davis GL, Esteban-Mur R, Rustgi V, Hoefs J, Gordon SC, Trepo C, Shiffman ML,
Zeuzem S, Craxi A, Ling MH, Albrecht J, 1998. Interferon alfa-2b alone or in combination
with ribavirin for the treatment of relapse of chronic hepatitis C. International Hepatitis
Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1493--1499.
22. McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK,
Goodman ZD, Ling MH, Cort S, Albrecht JK, 1998. Interferon alfa-2b alone or in
combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis
Interventional Therapy Group. N. Engl. J. Med. 339: 1485--1492.
23. Wyde PR, 1998. Respiratory syncytial virus (RSV) disease and prospects for its
control. Antiviral Res. 39: 63--79.
24. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH,
Belmont-Williams R, 1986. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N. Engl. J. Med.
314: 20--26.
25. Graci JD, Cameron CE, 2006. Mechanisms of action of ribavirin against distinct
viruses. Rev. Med. Virol. 16:37--48.
148
26. Streeter DG, Witkowski JT, Khare GP, Sidwell RW, Bauer RJ, Robins RK, Simon LN,
1973. Mechanism of action of 1-beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide
(Virazole), a new broad-spectrum antiviral agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70: 1174-1178.
27. Goswami BB, Borek E, Shalma DK, Fujitaki J, Smith RA, 1979. The broad spectrum
antiviral agent ribavirin inhibits capping of mRNA. Biochem. Biophis. Res. Commun. 89:
830--836.
28. Eriksson B, Helgstrand E, Johannson N, Larsson A, Misionny, A, Noren JO, Philipson
L, Stenberg K, Stening G, Stridh S, Oberg B, 1977. Inhibition of influenza virus
ribonucleic acid polymerase by ribavirin triphosphate. Antimicrob. Agents Chemother. 11:
946--951.
29. Ning Q, Brown D, Parodo J, Cattral M, Gorczynski R, Cole E, Fung L, Ding JW, Liu
MF, Rotstein O, Phillips MJ, Levy G, 1998. Ribavirin inhibits viral-induced macrophage
production of TNF, IL-1, the procoagulant fgl2 prothrombinase, and preserves TH1
cytokine production but inhibits TH2 cytokine response. J. Immunol. 160: 3487--3493.
30. Scheidel LM, Durbin RK, Stollar V, 1987. Sindbis Virus mutants resistant to
Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology 158: 1--7.
31. Morens DM, Halstead SB, Repik PM, Putvatana R, Raybourne N, 1985. Simplified
plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21
cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction
neutralization. J Clin Microbiol; 22: 250--254.
32. Diamond MS, Zachariah M, Harris E, 2002. Mycophenolic Acid inhibits Dengue virus
infection by preventing replication of viral RNA. Virology 304: 211--221.
33. Lipsky JJ, 1996. Mycophenolate mofetil. Lancet 348: 1357--1359.
34. Scheidel LM, Stollar V, 1991. Mutations that confer resistance to mycophenolic acid
and ribavirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsP1. Virology 181: 490-499.
35. Jin H, Elliot RM, 1993. Non-viral sequences at the 5’ends of Dugbe nairovirus S
mRNAs. J. Gen. Virol. 74: 2293--2297.
36. Tan ELC, Ooi EE, Lin C, Tan HC, Ling AE, Lim B, Stanton LW, 2004. Inhibition of
SARS coronavirus infection in vitro with clinically approved antiviral drugs. Emerg. Infec.
Dis. 10: 581--586.
37. Allen LB, 1980. Review of in vivo efficacy of ribavirin. Smith RA, Kirkpatrick W, eds,
Ribavirin: a broad spectrum antiviral agent. Academic Press, Inc., New York, 43--58.
149
38. Koff WC, Pratt RD, Elm Jr, JL, Venkateshan CN, Halstead SB, 1983. Treatment of
intracranial dengue virus infections in mice with a lipophilic derivative of ribavirin.
Antimicrob. Agents Chemother. 24:134--136.
Figure legends
Figure 1: RBV presents antiviral effect on the TCMV only in dose of 50 µg/mL, which
it is abolished by addition of guanosine. A-B: Vero E6 cells cultured in 24-well plates
were treates only with medium (M) or it added to different concentrations RBV (≤ 50
µg/mL) 24hr before (A) or 2hr after (B) infection by TCMV. C: Vero E6 cells were treated
only with medium (M) or medium added to RBV (50 µg/mL) 24 or 48hr after infection by
TCMV. D: Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated only with medium (M) or
medium added to Guanosine (G), or medium added to RBV, or medium plus RBV and
Guanosine 24hr before infection by TCMV. A-D: 9-days after infection the overlay was
removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units
(PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained
from quadruplicate cultures. Similar results were obtained in a second experiment. *
p<0.05 compared with medium-treated infected cells.
Figure 2: The dose of RBV of 35 mg/kg/day does not present toxic effect in suckling
mice. Groups of Swiss mice were treated daily with placebo, or doses of 45 or 35 mg/kg of
RBV for 10 consecutive days. The treatment was initiated on 2-day-old mice (black arrow)
and was maintained for 10 days. The animals were weighed before of treatment and daily
for 10 days. Values represent the mean of mouse weights of each group. * p<0.05
compared with placebo-treated mice. Similar results were obtained in a second experiment.
Figure 3: RBV-treated and placebo-treated mice present similar virus titer in the
brain. Groups of 16 three-day-old Swiss mice were infected intraperitoneally with OROV,
CARV, GUAV, GROV, or TCMV and they were treated intraperitoneally with RBV (35
mg/kg/day) or placebo. The treatment was initiated 24hr before infection and maintained
each every day. The mice brain (two mice per group) were taken on days 1, 2, 3, 5, 7, and
9 after infection. The virus titer in the brain was measured by plaque assay. The scale bars
represent the mean ± SD of PFU/mL. Similar results were obtained in a second
experiment.
150
Table 1: Livonesi et al.,
Table 1: Effect of RBV on Brazilian Orthobunyavirus replication in Vero E6 cells
Percentage of inhibition on plaque formation a (%)
a
Viruses
Treatment 24h before infection
Treatment 2h after infection
OROV
0
0
CARV
0
0
GUAV
7
0
GROV
0
0
TCMV
85 b
62 c
Percentage of inhibition on plaque formation by virus in Vero cells treated with 50
µg/mL of RBV
b p< 0.005
c
p< 0.01
151
Figure 1: Livonesi et al.,
10
A
9
8
7
6
*
5
4
3
2
B
9
Log10 PFU/mL
Log10 PFU/mL
10
8
7
6
*
5
4
3
M
10
20
30
40
2
50
M
RBV (ug/mL)
30
40
50
10
C
8
7
6
5
4
3
D
9
Log10 PFU/mL
9
Log10 PFU/mL
20
RBV (ug/mL)
10
2
10
8
7
6
5
4
3
M
24
Hours after infection
48
2
M
M+G
RBV
RBV+G
152
Mean of animal weight
(gms)
Figure 2: Livonesi et al.,
15
Placebo
35,0 mg/Kg
45,0 mg/Kg
10
*
↓
5
0
*
* *
0
2
4
6
8
Days
10
12
14
153
Table 2: Livonesi et al.,
Table 2: Effect of RBV on mice infected i.p. with Brazilian Orthobunyavirus
Viruses
Survived/total
Placebo
Survived/total
RBV
MTD a ± S.D.
(days)
Placebo
MTD ± S.D.
(days)
RBV
OROV
0/16
1/16 (6%)b
11.0 ± 2.8
11.5 ± 3.5
CARV
1/16 (6%)b
2/16 (12%)b
9.0 ± 2.8
14.0 ± 7.0
GUAV
0/16
0/16
7.0 ± 1.4
7.0 ± 1.4
GROV
0/16
0/16
5.5 ± 2.1
5.5 ± 2.1
TCMV
0/16
0/16
8.5 ± 2.1
8.0 ± 1.4
a Mean
b
time to death
(x %) = Survival rates
154
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
Placebo
RBV
1
2
3
5
7
CARV
Q
Viral titer in the brain (Log10 PFU/mL)
Figure 3: Livonesi et al.,
1
2
3
5
7
9
GROV
1
2
3
Days after infection
5
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
1
2
3
5
7
2
3
5
7
TCMV
1
Days after infection
155
10.2. Artigo referente aos resultados do Ácido Micofenólico
Manuscrito submetido para publicação na “Intervirology”.
156
CATEGORY:
Original Article
TITLE:
In vitro study of antiviral activity of Mycophenolic Acid on Brazilian Orthobunyavirus.
RUNNING TITLE:
Mycophenolic Acid action on Brazilian Orthobunyavirus
AUTHORS’ NAMES:
Márcia Cristina Livonesi a, Ricardo Luiz Moro de Sousa b, and Luiz Tadeu Moraes
Figueiredo a.
a
Centre of Research in Virology, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São
Paulo-USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
b
Department of Veterinary Pathology, School of Veterinary and Agrarian Sciences, São
Paulo State University – UNESP, Jaboticabal, SP, Brazil.
CORRESPONDING AUTHOR:
Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP).
Av. Bandeirantes, 3900. CEP: 14049-900 - Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Phone/Fax: +55-16-602-3376.
E-mail: [email protected]
157
Abstract
Objective: Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma are ssRNA viruses that
belong to Orthobunyavirus genus and have been associated with human febrile illnesses
and encephalitis. In this study, we evaluated the antiviral action of Mycophenolic Acid
(MPA) on these Orthobunyavirus to achieve a therapeutical agent to treat the diseases
caused by these viruses. Methods: The in vitro antiviral evaluation to MPA was done by
using plaque assay, in differents periods of treatment and concentrations of the compound.
Results: Results showed that MPA in the concentration of 10µg/mL has significant
antiviral activity on Tacaiuma virus when treatment was initiated either prior or after viral
infection. Moreover, MPA presents inhibitory effect on Guama virus replication, but only
when treatment was initiated before cell infection. Addition of guanosine in the culture
reverted the inhibitory effect of MPA on Tacaiuma and Guama viruses, suggesting that the
antiviral activity of this substance was via depleting intracellular guanosine pool. However,
doses lower than 10µg/mL and treatment starting 24 hours after infection did not show any
antiviral activity on Tacaiuma virus, suggesting that the compound MPA presents limited
antiviral activity on Tacaiuma virus. Conclusion: Our results suggest that MPA would not
be a good therapeutical agent to treat the diseases caused by Oropouche, Caraparu, Guama,
Guaroa, and Tacaiuma viruses.
Keywords: Mycophenolic Acid, Oropouche virus, Caraparu virus, Guama virus, Guaroa
virus, Tacaiuma virus, Orthobunyavirus, IMPDH, antivirals.
158
Introduction
The Oropouche, Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma viruses belong to the
Orthobunyavirus genus, in the Bunyaviridae family. These viruses are enveloped, with
trisegmented single-stranded RNA genome of negative or ambisense polarity, replicate in
the cytoplasm and bud into the Golgi apparatus [1] or upon the plasma membrane [2].
Oropouche virus is transmitted mainly by the biting midge (Culicoides
paraensis) and has been associated with dengue-like acute febrile illness. The Oropouche
fever has emerged over the past 40 years as a serious public health problem in tropical and
subtropical areas of South America, having caused at least 30 reported outbreaks,
involving more than half a million people [3]. Similar to Oropouche virus, Caraparu,
Guama, Guaroa, and Tacaiuma viruses have been associated with febrile illness, as well as
encephalitis in humans. These viruses are transmitted by mosquitoes, and cause disease
mainly in residents of the Amazon region of Brazil [4-7]. Due to the high attack rates of
Oropouche fever epidemics and to the debilitating nature and duration of symptoms of the
clinical syndromes caused by this and other Brazilian Orthobunyavirus, an antiviral
therapy, if available, would become a very helpful intervention.
Mycophenolic acid (MPA), a fermentation product of several Penicillium
species, is a potent, selective, reversible, and noncompetitive inhibitor of the enzyme
inosine monophosphate dehydrogenase IMPDH [8]. IMPDH is an enzyme that facilitates
the conversion of IMP to xanthosine monophosphate. Inhibition of IMPDH depletes the
intracellular guanosine pool, blocking RNA and DNA synthesis [9]. MPA is used clinically
in the prevention of rejection of transplanted organs [10]. However, MPA can inhibit to
varying degrees the infection of cells in vitro with several viruses: vaccinia, Semliki
Forest, influenza A [11], yellow fever [12], dengue [13], and avian reovirus [14]. Thus, in
an effort to characterize antiviral agents that could attenuate infection caused by Brazilian
Orthobunyavirus, we tested the inhibitory effect of MPA on the replication of Oropouche,
Caraparu, Guama, Guaroa, and Tacaiuma viruses in Vero E6 cell cultures by using plaque
assay.
159
Materials and methods
Viruses
Oropouche (OROV) (BeAn19991), Guama (GUAV) (BeAn277), Guaroa
(GROV) (BeH22063), and Tacaiuma (TCMV) (BeAn73) viruses were kindly supplied by
Dr. Pedro Vasconcelos and Dr. Amélia Travassos da Rosa, (Evandro Chagas Institute,
Brazilian Ministry of Health, Belém, Brazil and University of Texas Medical Branch,
Galveston, Texas, USA). The Caraparu virus (CARV) (SPAn2049) was kindly supplied by
Dr. Terezinha Lisieux Coimbra (Adolpho Lutz Institute, São Paulo, Brazil). Viral stocks
were obtained from the brains of intracerebrally infected suckling mice. Brains were mixed
with PBS (dilution 1:10 w/v), macerated and centrifuged at 2000×g for 10 minutes at 4°C.
The supernatants were harvested and stored at -70oC until use.
Cell culture
African green monkey kidney cells (Vero E6) were grown in minimum
essential medium (MEM, Cultilab, Brazil) supplemented with 10% inactivated,
Mycoplasma free, fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Brazil), 1% L-glutamine and 0.3%
sodium bicarbonate.
Compounds
Mycophenolic acid (MPA) and guanosine were purchased commercially
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). These compounds were diluted in 30o ethanol, and
they were stored at 4oC until use.
In vitro antiviral evaluation
In vitro antiviral evaluation was done by using plaque assay. Vero E6 cells were
seeded in 24-well plates in MEM with 10% FBS, for 24hr at 37°C and 5% CO2. Medium
was removed and serial 10-fold dilutions of viral stocks diluted in MEM with 5% FBS
were added (0.2mL/well) in quadruplicates, and the cells were incubated for 2hr at 37°C.
Subsequently, the viral inoculum was removed and 1.0mL of a combination (v/v) of 1%
low-melting-point agarose plus 2X MEM (7% FBS) was added to each well, and the plates
were incubated at 37°C for 3 days for OROV and GUAV, 5 days for CARV and GROV,
and 9 days for TCMV. The plaques were visualized by staining with a naphtol blue black
solution (15 minutes) after the removal of the agarose plug [15]. The plaques were counted
under an inverted microscope and the virus titer was determined as PFU per milliliter.
160
MPA and guanosine were diluted in the medium and added to cells on the day
before, or 2 hours after viral infection.
Determination in vitro of MPA toxicity
MPA toxicity on Vero E6 cells was evaluated by trypan blue exclusion assay.
MPA doses ≤ 128µg/mL were added on Vero E6 cell cultures by three days.Then the
percentage of viable cells was obtained.
Statistical Analysis
Analysis of variance, followed by the parametric Tukey-Kramer test was used
(INSTAT software, GraphPad, San Diego, CA). A P value less than 0.05 was considered
to indicate statistical significance.
Results
MPA inhibits replication of GUAV and TCMV
Mycophenolic acid concentration lower than 16µg/mL resulted in a percentage
of viable cells of approximately 90% (Fig.1). However, concentration of MPA of 10µg/mL
has presented a mild cytostatic effect on Vero E6 cells, because this dose inhibits cell
growth by 50% [13]. Additionaly, clinically therapeutic levels of MPA are 10µg/mL (or
30µM) [10]. Then, the dose of 10µg/mL MPA was chosen used to evaluated antiviral
activity this compound on Brazilian Orthobunyavirus. Vero E6 cells were treated with
MPA 24hr before or 2hr after infection by OROV, CARV, GUAV, GROV and TCMV.
The Figure 2 shows that MPA was able to inhibit the replication of TCMV either 24hr
before as 2hr after infection (p<0.005). Moreover, MPA presented inhibitory activity on
replication of GUAV (p<0.05) when treatment was initiated 24hr before infection. On the
other hand, MPA was unable to inhibit the replication of OROV, CARV, and GROV.
Addition of exogenous guanosine rescue viral growth of GUAV and TCMV
To verify whether the inhibiton of GUAV and TCMV replication by MPA was
caused by depletion of the intracellular pool of GTP, guanosine was added to the culture
medium at a concentration of 30µg/mL. Figure 3 shows that addition of guanosine
efficiently reversed the inhibitory effect of MPA on GUAV and TCMV replication,
161
suggesting that MPA antiviral effect is related to a depletion of the intracellular pool of
GTP.
Lower doses than 10µg/mL and treatment starting 24 hours after infection are unable to
inhibit TCMV replication.
To verify whether lower MPA doses than 10µg/mL have inhibitory effect on
TCMV replication, cells were treated a day before (Fig.4A) or 2hr after (Fig.4B) viral
infection with the following doses: 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, and 10µg/mL. The Figure 4 shows
that only the concentration of 10µg/mL is able to inhibit TCMV replication. Furthermore,
treatment with MPA starting 24 or 48 hr after TCMV infection was unable to inhibit viral
replication (Fig.5), suggesting that antiviral effect of MPA on TCMV is limited and
depend of determined conditions, as concentration and treatment period.
Discussion
In this study, we evaluate the antiviral action of MPA on OROV, CARV,
GUAV, GROV and TCMV in vitro. The MPA had significant antiviral effect on the
TCMV, either before or after viral infection (Fig.2). This inhibitory effect was reversed by
the addition of guanosine in the cell culture (Fig.3), suggesting that the predominant
mechanism of inhibitory effect of MPA on TCMV, in this model, is mediated through
depletion of intracellular GTP pool. Additionally, MPA showed inhibitory effect on
GUAV replication (Fig.2), which was reversed when guanosine was added into the cell
culture (Fig.3), suggesting that the mechanism of action of MPA, also in this case, was
mediated by the depletion of intracellular GTP pool. Otherwise, 10µg/mL of MPA did not
produce any inhibitory effect on OROV, CARV, and GROV, despite this concentration to
be sufficient to inhibit the replication of many virus, as follows: yellow fever [12], dengue
[13], and avian reovirus [14], suggesting that the replicative cycle of these viruses is less
dependent on intracellular GTP levels. Schiedel et al., 1987 [16], produced ribavirin
(RBV)/MPA-resistant Sindbis virus (family Togaviridae, genus Alphavirus) by performing
serial passages of the virus in A. Albopictus cells in the presence of MPA. The authors
suggested that Sindbis virus mutants were able to replicate in the presence of MPA and
RBV because they generated a guanylyltranferase and/or RNA polymerase with an
increased GTP affinity. Subsequently, Schiedel et al., 1991 [17], showed that the MPA
resistent
Sindbis
virus
had
an
alteration
on
the
RNA
guanylyltransferase.
162
Guanylyltransferase is an important protein for the 5’cap structure formation of cellular
and viral mRNAs. However, viruses of the Bunyaviridae family do not encode enzymes
for making 5’cap of mRNAs because they have a mechanism known as cap-snatching,
where they use host-derived primers to initiate the mRNA transcription process [18]. Thus,
the resistance of OROV, CARV, and GROV, and the weak susceptibility of GUAV and
TCMV to MPA action is not associated with guanylyltransferase protein, but it could be
related to some particularity (mutation?) of the RNA polymerase of these viruses. It is
important to emphasize that this is the first an in vitro study describing the resistance of
Brazilian Orthobunyavirus to MPA antiviral action.
In conclusion, our results showed that MPA present antiviral activity on GUAV
and TCMV, presenting as a possible mechanism of action to the inhibition of inosine
monophosphate dehydrogenase (IMPDH) enzyme. However, this antiviral action is
limited, because it depends on either concentration of MPA, as the treatment period. Thus,
MPA could not be a good therapeutical agent to treat diseases caused by Oropouche,
Caraparu, Guama, Guaroa and Tacaiuma viruses. More studies will be necessary to
characterize other antiviral agents to attenuate the infections caused by these viruses.
Acknowledgments
We thank Dr. Pedro Vasconcelos, Dr. Amélia Travassos da Rosa, and Dr.
Terezinha Lisieux Coimbra for kindly supplying viruses used in this study, and Dr. Eurico
de Arruda Neto for his critical review of the manuscript. This work was supported by
FAPESP grant to L.T.M. Figueiredo (No 03/03682-3) and by fellowships from CAPES to
M.C. Livonesi.
References
1. Elliot RM. The Bunyaviridae. Plenum Press, New York. 1996.
2. Goldsmith CS, Elliot LH, Peters CJ, Zaki SR. Ultrastrutural characteristics of Sin
Nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch Virol
1995; 140:2107-2122.
3. Pinheiro FP, Travassos da Rosa APA, Vasconcelos PFC. Oropouche fever. In:
Feigin RD (ed): Textbook of pediatric infectious diseases. Philadelphia: W.B.
Saunders Co., 2004, pp 2418–2423.
163
4. Brinton MA, Gavin EI, Lo WK, Pinto AJ, Morahan PS. Characterization of murine
Caraparu Bunyavirus liver infection and immunomodulator-mediated antiviral
protection. Antiviral Res 1993; 20(2):155-171.
5. Jonkers AH, Spence L, Olivier O. Laboratory studies with rodents and native to
Trinidad. Am J Trop Med Hyg 1968; 17:299–307.
6. March RW, Hetrick FM. Studies on Guaroa virus. Am J Trop Med Hyg 1967;
16:191–195.
7. Travassos da Rosa APA, Travassos da Rosa JFS, Pinheiro FP, Vasconcelos PFC.
Doenças Infecciosas e Parasitárias – Enfoque Amazônico. In: Leão RNQ (ed).
Belém, CEJUP, 1997, pp 207-241.
8. Eugui EM, Almquist SJ, Muller CD, Allison AC. Lymphocyte-selective cytostatic
and immunosuppressive effects of mycophenolic acid in vitro: role of
deoxyguanosine nucleotide depletion. Scand J Immunol 1991; 33:161-173.
9. Catapano CV, Dayton JS, Mitchell BS, Fernandes DJ. GTP depletion induced by
IMP dehydrogenase inhibitors blocks RNA-primed DNA synthesis. Mol Pharmacol
1995; 47:948-955.
10. Lipsky JJ. Mycophenolate mofetil. Lancet 1996; 348:1357-1359.
11. Planterose DN. Antiviral and cytotoxic effects of mycophenolic acid. J Gen Virol
1969; 4:629-630.
12. Neyts J, Meerbach A, McKenna P, De Clercq E. Use of the yellow fever virus
vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of yellow fever virus
infections. Antiviral Res 1996; 30:125-132.
13. Diamond MS, Zachariah M, Harris E. Mycophenolic Acid inhibits Dengue virus
infection by preventing replication of viral RNA. Virology 2002; 304:211-221.
14. Robertson CM, Hermann LL, Coombs KM. Mycophenolic acid inhibits avian
reovirus replication. Antiviral Research 2004; 64:55-61.
15. Morens DM, Halstead SB, Repik PM, Putvatana R, Raybourne N. Simplified
plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in
BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque
reduction neutralization. J Clin Microbiol 1985; 22(2):250-254.
16. Scheidel LM, Durbin RK, Stollar V. Sindbis Virus mutants resistant to
Mycophenolic Acid and Ribavirin. Virology 1987; 158:1-7.
164
17. Scheidel LM, Stollar V. Mutations that confer resistance to mycophenolic acid and
ribavirin on Sindbis virus map to the nonstructural protein nsP1. Virology 1991;
181:490-499.
18. Jin H, Elliot RM. Non-viral sequences at the 5’ends of Dugbe nairovirus S mRNAs.
J Gen Virol 1993; 74:2293-2297.
Figure legends
Figure 1: Concentrations of MPA lower than 16 µg/mL are not toxic to Vero E6 cells.
Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or it was added to
different concentrations of MPA. Three days after, the viable cells were counted by
exclusion trypan blue assay, and the results were expressed as the mean ± SD of
percentage of viable cells obtained of duplicate cultures.
Figure 2: MPA presents antiviral activity on the GUAV and TCMV. Vero E6 cells
were treated only with medium (M) or it was added to MPA (10µg/mL) 24hr before or 2hr
after infection by OROV, CARV, GUAV, GROV, and TCMV. In determinated days after
infection the overlay was removed, the cells were stained with naphtol blue black, and the
plaques forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of
Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. ** p<0.005 and * p<0.05 compared
with medium-treated infected cells. Similar results were obtained in a second experiment.
Figure 3: Guanosine abolishes the antiviral effect of MPA on the GUAV and TCMV.
Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or this added to
Guanosine (G), or medium added to MPA, or medium added to MPA and Guanosine 24hr
before infection by GUAV and TCMV. Subsequently the overlay was removed, the cells
were stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted.
The scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate
cultures. Similar results were obtained in a second experiment.
Figure 4: MPA presents inhibitory effect on the TCMV only at a concentration of
10µg/mL. Vero E6 cells cultured in 24-well plates were treated with medium (M) or this
added to different concentrations MPA (≤ 10µg/mL) 24hr before (A) or 2hr after (B)
165
infection by TCMV. Nine days after infection the overlay was removed, the cells were
stained with naphtol blue black, and the plaques forming units (PFU) were counted. The
scale bars represent the mean ± SD of Log10 PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. *
p<0.05 compared with medium-treated infected cells. Similar results were obtained in a
second experiment.
Figure 5: TCMV replication is not inhibited when treatment of cells starting 24 hours
after infection. Vero E6 cells were treated with medium (M) or medium added to MPA
(10µg/mL) 24 or 48hr after infection by TCMV. Nine days after infection the plaques
forming units (PFU) were counted. The scale bars represent the mean ± SD of Log10
PFU/mL obtained of quadruplicate cultures. Similar results were obtained in a second
experiment.
166
Percentage of Vero E6
cells viable (%)
Figure 1: Livonesi et al.,
100
80
60
40
20
0
M
2
4
8
16
32
64
MPA concentration (µ g/mL)
128
167
Figure 2: Livonesi et al.,
Treatment 24hr before infection
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Log10 PFU/mL
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
M
MPA
CARV
M
MPA
GUAV
*
M
MPA
GROV
M
MPA
TCMV
M
MPA
Treatment 2hr after infection
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
OROV
M
MPA
CARV
M
MPA
GUAV
M
MPA
GROV
M
MPA
TCMV
**
M
MPA
168
Log10 PFU/mL
Figure 3: Livonesi et al.,
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GUAV
M
M+G
MPA
MPA+G
M+G
MPA
MPA+G
TCMV
M
Treatment
169
Log10 PFU/mL
Figure 4: Livonesi et al.,
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
A
0
0.625
1.25
2.5
5
10
B
**
0
0.625
1.25
2.5
5
10
MPA concentration (µ
µg/mL)
170
Log10 PFU/mL
Figure 5: Livonesi et al.,
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
M
24
Hours post-infection
48
171
10.3. Carta de Aprovação da Comissão de Ética em Experimentação
Animal
O projeto intitulado “Ação de drogas antivirais e interferons sobre
Orthobunyavirus brasileiros” foi aprovado de acordo com o Protocolo No
006/2004.
172
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