márcio tiradentes cunha nível sérico de glutamato, serina e glicina

Transcrição

MÁRCIO TIRADENTES CUNHA
NÍVEL SÉRICO DE GLUTAMATO, SERINA E GLICINA EM
PACIENTES PORTADORES DE ESQUIZOFRENIA E SEUS
FAMILIARES EM PRIMEIRO GRAU
Ribeirão Preto
2008
MÁRCIO TIRADENTES CUNHA
NÍVEL SÉRICO DE GLUTAMATO, SERINA E GLICINA EM
PACIENTES PORTADORES DE ESQUIZOFRENIA E SEUS
FAMILIARES EM PRIMEIRO GRAU
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Mestre
em Saúde Mental.
Área de Concentração: Saúde Mental
Orientador: Prof. Dr. Jaime E. C. Hallak
Ribeirão Preto
2008
FICHA CATALOGRÁFICA
Cunha, Marcio Tiradentes
Nível sérico de glutamato, serina e glicina em pacientes
portadores de esquizofrenia e seus familiares em primeiro grau.
Ribeirão Preto, 2008.
90p.
Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Saúde Mental.
Orientador: Hallak, Jaime Eduardo Cecílio.
1. Serina. 2.Glicina. 3. Esquizofrenia. 4. Glutamato.
Dedico esse trabalho ao meu
filho Mateus, que, após seu
nascimento, tem me transformado
em um ser À PROVA DE TUDO.
AGRADECIMENTOS
Um especial agradecimento ao meu orientador e amigo Jaime Eduardo Cecílio
Hallak pela oportunidade concedida de uma forma muito generosa e dotada da maior
nobreza humana.
Agradeço aos meus amigos Valter Seabra e Eloisa, sem os quais não teria sido
possível concluir esse trabalho.
Agradeço ao João Paulo, a Marciana, ao Gladimir, ao André Maltos, ao Nelson e a
todas as outras pessoas que contribuíram na elaboração dessa monografia.
Agradeço a minha família pela paciência e tolerância para suportar minha
ansiedade.
Agradeço a professora Roseli e aos técnicos da disciplina de bioquímica da UFTM
que realizaram as análises laboratoriais.
De maneira muito carinhosa agradeço aos pacientes, seus familiares e os
voluntários que “deram seu sangue” na esperança de que os avanços científicos de alguma
forma amenizem os seus sofrimentos.
RESUMO
CUNHA, M. T. Nível sérico de glutamato, serina e glicina em pacientes portadores de
esquizofrenia e seus familiares em primeiro grau. 2008. 90 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Nas últimas duas décadas, alternativas à hipótese da disfunção da transmissão
dopaminérgica na esquizofrenia têm sido buscadas intensamente, uma vez que as
possibilidades terapêuticas que enfocam esse sistema não têm se mostrado satisfatoriamente
eficientes. Um especial interesse tem recaído sobre uma provável disfunção da transmissão
glutamatérgica, englobando aqui não somente o glutamato, mas também seus precursores, a
serina e a glicina. Apesar dos diversos estudos que buscaram identificar alterações nesse
sistema na esquizofrenia, ainda existem diversas questões a serem respondidas. Uma delas
diz respeito aos níveis plasmáticos destes aminoácidos. As evidências atualmente disponíveis
são contraditórias no sentido de esclarecer qual a natureza destas alterações, se é que elas
ocorrem. Assim, procuramos no presente estudo identificar se existem alterações nos níveis
plasmáticos de pacientes portadores de esquizofrenia crônica em tratamento antipsicótico
comparados com voluntários sadios. Além disso, buscamos identificar se tais alterações
ocorrem em familiares de primeiro grau destes pacientes e se seria possível utilizá-las como
possíveis marcadores de risco para o desenvolvimento da esquizofrenia ou como um
preditor
da
resposta
terapêutica.
Assim,
foram
selecionados
quinze
pacientes
esquizofrênicos em tratamento antipsicótico tradicional (denominados de responsivos) e
seus familiares em primeiro grau, quinze pacientes esquizofrênicos em tratamento
antipsicótico com clozapina (denominados de não-responsivos) e seus familiares e sessenta
voluntários sadios emparelhados quanto ao gênero e idade. Em relação à glicina, foram
encontradas diferenças significativas entre os grupos, com pacientes responsivos
apresentando os maiores níveis plasmáticos. Quanto ao glutamato, foi encontrado um
aumento dos níveis plasmáticos em pacientes não-responsivos comparados com pacientes
responsivos e controles sadios. Em relação aos familiares, houve também diferenças entre os
grupos, em que os familiares de pacientes responsivos apresentaram níveis menores que os
outros familiares. Estes achados sugerem que pacientes esquizofrênicos considerados
responsivos e não-responsivos em tratamento farmacológico e estabilizados diferem quanto
aos níveis plasmáticos de glutamato e glicina, mas não de serina. O fato novo dessa pesquisa
foi a verificação de uma alteração nos níveis de glutamato em familiares de pacientes
esquizofrênicos, sem que os mesmos sejam portadores de esquizofrenia. Novas pesquisas
são necessárias para que se confirmem e se compreendam esses resultados.
Palavras-chave: Serina, Glicina, Esquizofrenia, Glutamato.
ABSTRACT
CUNHA, M. T. Glutamate, serine and glycine plasma levels in schizophrenic patients
and their first-degree relatives, 2008. 90 f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
In the last two decades, alternatives to the dysfunction in the dopaminergic transmission in
squizophrenia have been intensively sought after, since the therapeutic approaches focused
on this system have not been satisfactorily efficient. Particular interest has been raised
regarding a probable dysfunction in the glutamatergic transmission, encompassing not only
glutamate itself but also its precursors, serine and glycine. In spite of the several studies
which investigated alterations in this system in schizophrenia, many questions remain to be
answered. One of those refers to the plasma levels of these amino acids. The evidence
available thus far is contradictory in the sense of clarifying the nature of such alterations, or
even if they indeed occur. Thus, in this study we tried to identify possible changes in the
plasma levels of amino acids in chronic schizophrenic patients on antipsychotic treatment
compared to healthy volunteers. Additionally, we investigated whether those changes
occur in the patients’ first-degree relatives and, in case they do, if it would be possible to
use them as possible risk markers for the development of schizophrenia or its therapeutic
responses. The sample comprised 15 schizophrenic patients under usual treatment with
antipsychotics (responsive) and their first-degree relatives, 15 schizophrenic patients under
antipsychotic treatment with clozapine (non-responsive) and their first-degree relatives, and
60 healthy volunteers matched to the other participants according to gender and age.
Significant differences were found between the groups concerning glicina, with responsive
patients presenting higher plasma levels. Regarding glutamate plasma levels, however, nonresponsive patients presented higher glutamate plasma levels compared to their controls
and to responsive patients. Differences were also found between the first-degree relatives,
with relatives of responsive patients presenting lower glutamate levels than the others.
These findings suggest that stabilized treatment-responsive and resistant schizophrenic
patients present differences concerning glutamate and glycine - but not serine - plasma
levels. The novel aspect of the study were the measures involving first-degree relatives of
schizophrenic patients, which provide evidence about changes in the glutamate levels in
this group of healthy participants. Further investigation is required so that these results
may be confirmed and better understood.
Keywords: Serine, Glicine, Glutamate, Schizophrenia
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Estrutura do receptor NMDA...................................................................... 19
Figura 2. Médias de idade dos 6 grupos participantes do estudo. As colunas
representam a média de idade dos voluntários (coluna azul = esquizofrênicos
responsivos – Esq R; coluna vinho = familiares de esquizofrênicos responsivos – Fam
Esq R; coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna verde =
familiares de esquizofrênicos não-responsivos – Fam Esq NR; coluna cinza = controles
emparelhados com esquizofrênicos – Controle Esq; coluna laranja = controles
emparelhados com familiares de esquizofrênicos – Controle Fam Esq). As barras acima
das colunas indicam o erro-padrão das médias............................................................. 41
Figura 3. Escores médios da PANSS negativa. As colunas representam a média dos
escores dos pacientes (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq R; coluna
amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR). As barras acima das colunas
indicam o erro-padrão das médias. O asterisco indica uma diferença estatísticamente
significativa entre grupos (p < 0,05) ........................................................................... 44
Figura 4. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de serina em pacientes e controles. As
colunas representam os voluntários (coluna azul-claro = esquizofrênicos
responsivos – Esq R; coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR;
coluna cinza = controles emparelhados aos Esq). As barras acima das colunas
indicam o erro-padrão das médias ..........................................................................45
Figura 5. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina em pacientes e controles. As colunas
representam os voluntários (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq R;
coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna cinza = controles
emparelhados aos Esq). As barras acima das colunas indicam o erro-padrão das médias.
* indica diferença estatística do grupo em relação aos demais grupos (p < 0,05) ........ 46
Figura 6. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato em pacientes e controles. As
colunas representam os voluntários (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq
R; coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna cinza =
controles emparelhados aos Esq). As barras acima das colunas indicam o erro-padrão
das médias. * indica diferença estatística do grupo em relação aos demais grupos (p <
0,05) ............................................................................................................................. 47
Figura 7. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina e serina em
ambos os grupos de pacientes ...................................................................................... 48
Figura 8. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato e serina em
ambos os grupos de pacientes ...................................................................................... 48
Figura 9. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato e escores da
PANSS negativa em ambos os grupos de pacientes ..................................................... 49
Figura 10. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato e glicina
nos grupos de pacientes Esq R ..................................................................................... 50
Figura 11. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina e serina nos
grupos de pacientes Esq NR ........................................................................................ 51
Figura 12. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato e serina
nos grupos de pacientes Esq NR .................................................................................. 51
nos grupos de pacientes Esq NR .................................................................................. 52
Figura 14. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de serina em familiares e controles. As
colunas representam os voluntários (coluna vinho = familiares de esquizofrênicos
responsivos – Esq R; coluna verde = familiares de esquizofrênicos não-responsivos –
Esq NR; coluna laranja = controles emparelhados aos familiares de Esq). As barras
acima das colunas indicam o erro-padrão das médias................................................... 53
Figura 15. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina em familiares e controles. As
acima das colunas indicam o erro padrão das médias................................................... 54
Figura 16. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato em familiares e controles. As
acima das colunas indicam o erro-padrão das médias. * indica diferença estatística do
grupo em relação aos demais grupos (p<0,05) ............................................................ 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Receptores do glutamato .............................................................................. 16
Tabela 2. Distribuição de subunidades do receptor NMDA no SNC dos mamíferos ....... 16
Tabela 3. Teste de Tukey em relação à faixa etária dos grupos participantes no
estudo ....................................................................................................................42
Tabela 4. Características clínico-demográficas dos pacientes participantes do estudo ....... 43
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 11
1.1 OS RECEPTORES GLUTAMATÉRGICOS ............................................... 15
1.2 TRANSMISSÃO GLUTAMATÉRGICA ..................................................... 21
1.3 GLUTAMATO E ESQUIZOFRENIA ......................................................... 22
1.4 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE GLUTAMATO ............................................. 25
1.5 GLICINA E SERINA ..................................................................................... 27
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 31
3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 33
3.1 PARTICIPANTES.......................................................................................... 34
3.1.1 Critérios de inclusão ................................................................................. 34
3.1.2 Critérios de exclusão ................................................................................. 35
3.2 INSTRUMENTOS ......................................................................................... 35
3.2.1 Método para análise de aminoácidos ......................................................... 36
3.3 PROCEDIMENTO........................................................................................ 37
3.3.1 Análise Estatística...................................................................................... 38
4 RESULTADOS ............................................................................................. 40
4.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-DEMOGRÁFICAS................................. 41
4.2 NÍVEIS PLASMÁTICOS DOS AMINOÁCIDOS DOS PACIENTES ....... 45
4.3 CORRELAÇÕES DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE AMINOÁCIDOS
DOS PACIENTES ENTRE SI E COM AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E
USO DE ANTIPSICÓTICOS ............................................................................. 47
4.4 NÍVEIS PLASMÁTICOS DOS AMINOÁCIDOS DOS FAMILIARES...... 52
5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 55
6 CONCLUSÕES ............................................................................................ 68
7 REFERÊNCIAS............................................................................................ 70
8 APÊNDICES ................................................................................................ 84
APÊNDICE A – Aprovação do comitê de ética. .................................................. 85
APÊNDICE B – Termo de consentimento livre e esclarecido ............................. 89
ARTIGO
1 INTRODUÇÃO
12
Tradicionalmente, acredita-se que a esquizofrenia, inicialmente referida por
Kraepelin como demência precoce e, posteriormente, designada por Bleuler com seu nome
atual, seja tão antiga quanto a raça humana (LEES, 2008). O registro mais antigo de uma
condição semelhante à esquizofrenia é proveniente dos antigos hindus, por volta de 1400 AC,
descrevendo uma condição provocada por demônios (LEES, 2008). Até por volta de 1800,
doenças acompanhadas por delírios, alucinações, alterações do pensamento e isolamento social
eram classificadas como mania (ADITYANJEE et al., 1999; KYZIRIDIS, 2005).
Em 1853, Benedict Morel foi o primeiro a utilizar o termo “démencè précoce”
para descrever o quadro de um garoto de 14 anos que havia se tornado cada vez mais
isolado, degenerando em um estado de demência e expressando idéias homicidas em relação
a seu pai. Kahlbaum (1963) foi o primeiro a classificar os transtornos mentais conforme a
sintomatologia apresentada e, em 1863, Hecker introduziu o termo “hebefrenia”, referindose a uma insanidade própria da juventude. Entretanto, foi Emil Kraepelin que, ao defender
as idéias de Kahlbaum, ganhou o reconhecimento (ADITYANJEE et al., 1999;
KYZIRIDIS, 2005). Ele agrupou essas condições clínicas em uma única doença, a qual ele
denominou dementia praecox, para diferencia-lá das demências próprias dos idosos.
A esquizofrenia é uma condição clínica que acomete o pensamento, a iniciativa,
a afetividade e até hoje intriga pesquisadores devido ao seu caráter heterogêneo e suas
múltiplas hipóteses etiológicas. Cerca de 1% da população é portadora desse distúrbio
(Manual Diagnóstico e Estatístico da Associação Psiquiátrica Americana – DSM IV), que
tem seu início por ocasião da adolescência ou no início da idade adulta, tendo assim um
impacto importante no trabalho e na vida social e familiar. Apesar dos avanços
13
farmacológicos, cerca de 25 % dos pacientes ainda hoje não apresentam uma resposta
satisfatória ao tratamento medicamentoso.
Segundo Javitt e Coyle (2004), os pesquisadores interessados no estudo da gênese
da esquizofrenia necessitam considerar que a mesma possui uma miríade de sintomas que se
distribuem em diferentes esferas e categorias, incluindo sintomas positivos, negativos e
cognitivos.
Dentre os sintomas positivos, podemos incluir a agitação psicomotora, os
delírios e as alucinações. Já os sintomas negativos e cognitivos incluem o autismo,
ambivalência, afeto embotado, perda da capacidade da associação, falta de espontaneidade,
discurso empobrecido, dificuldade em estabelecer relações e lentidão de movimento,
alterações de memória e atenção, dentre outros (JAVITT; COYLE, 2004).
A maior ênfase na investigação do papel dos neurotransmissores na gênese da
esquizofrenia tem recaído sobre a dopamina, isso desde que foi demonstrado que drogas
antipsicóticas alteram o nível de catecolaminas no cérebro (CARLSSON; LINDQVIST,
1963). A hipótese da hiperfunção dopaminérgica continuou a evoluir principalmente
quando foi descoberto que a eficácia e a potência das drogas antipsicóticas tradicionais eram
diretamente relacionadas à sua habilidade em antagonizar os receptores dopaminérgicos D2
(CRESSE et al., 1976). Entretanto, não existe dúvida que o mecanismo fisiopatológico da
esquizofrenia é mais complexo do que apenas um aumento de dopamina (BACHUS;
KLEINAMAN, 1996). A maior parte dos antipsicóticos tradicionais, que são antagonistas
D2, possui eficácia limitada, não promovendo, por exemplo, o alívio dos sintomas
negativos da esquizofrenia (DAVIS et al., 1991).
Em adição a dopamina, outros sistemas neurotransmissores passaram a ser
investigados como tendo um papel na patogênese da esquizofrenia, como a serotonina, a
14
epinefrina, a norepinefrina, os canabinóides endógenos e, atualmente, o glutamato, que
compreende um dos principais focos de estudo.
Parte dessa nova investigação deveu-se ao fato que uma expressiva quantidade
dos portadores desta patologia não responde a drogas antipsicóticas tradicionais, os
antagonistas dopaminérgicos D2. Em cerca de 20-30% dos casos, a doença não responde à
intervenção com antipsicóticos típicos (BRENNER; MERLO, 1995).
Esta parcela dos pacientes é composta principalmente por indivíduos do sexo
masculino, caracterizados pelo aparecimento de sintomas em faixas etárias anteriores, por
um maior número de hospitalizações e por um funcionamento social ainda mais
prejudicado que aquele observado em outros pacientes (HENNA et al., 1999; MELTZER
et al., 1997). Devido a estas características peculiares, a doença nestes casos recebe a
designação de “esquizofrenia refratária”.
O termo esquizofrenia refratária já foi objeto de divergências na literatura
científica, sendo erroneamente utilizado para designar, por exemplo, casos onde a adesão do
paciente ao tratamento medicamentoso era duvidosa (HELKIS; MELTZER, 2007). De
acordo com aqueles autores, a aplicação do termo deve antes ser utilizada para se referir
àquelas situações onde a doença em si não responde ao tratamento da forma esperada, ainda
que este seja seguido à risca, assim parece que os termos “responsivo” e “não-responsivo” ao
tratamento farmacológico são mais adequados.
De acordo com o The International Psychopharmacology Algorithm Project
(www.ipap.org), a condição de refratariedade ou não-responsividade farmacológica é
preenchida quando três critérios específicos (adaptados de Kane et al., 1988) estiverem
presentes: “(1) ausência de períodos de bom funcionamento durante cinco anos; (2) ausência
de resposta a pelo menos duas drogas antipsicóticas de classes químicas diferentes,
15
administradas durante períodos entre quatro e seis semanas em doses equivalentes a 400
mg/dia de clorpromazina ou 5 mg/dia de risperidona; e (3) sintomatologia de severa a
moderada, especialmente com sintomas positivos: desorganização conceitual, suspeição,
delírios ou comportamento alucinatório”.
Essa diferenciação entre pacientes responsivos e não-responsivos não parece ser
de menor importância, uma vez que uma das grandes dificuldades na pesquisa, assim como
na prática clínica, é a busca por subgrupos mais específicos deste transtorno, o que
permitiria uma melhor compreensão de aspectos fisiopatológicos e terapêuticos do mesmo.
1.1 OS RECEPTORES GLUTAMATÉRGICOS
Antes de começar um aprofundamento nos mecanismos glutamatérgicos da
esquizofrenia é importante que se tenha uma noção a respeito da complexidade dos
receptores glutamatérgicos.
O glutamato é o principal neurotransmissor aminoácido excitatório do SNC e
atua através de três famílias de receptores ionotrópicos e em diferentes famílias de
receptores metabotrópicos. Esses receptores são encontrados em neurônios por todo o
SNC, tanto pré como pós-sinapticamente, e também na glia (TAMMINGA, 1999).
Os receptores metabotrópicos ligam-se tanto ao L-glutamato quanto ao
quisqualato, ativando uma proteína G associada, o que estimula a fosfolipase C ou inibe a
adenil-ciclase, ativando ou inibindo as vias de segundos-mensageiros (SCHOEPP et al.,
1990; TANABE et al., 1992). Já os três receptores ionotrópicos são receptores que fazem
parte de canais iônicos que medeiam a vasta maioria da neurotransmissão excitatória do
cérebro (BRESSAN, 2003; DINGLEDINE et al., 1999).
16
Os três receptores ionotrópicos foram nomeados de acordo com seus agonistas
seletivos: 1) ácido N-metil-D-aspartato (NMDA); 2) ácido kaínico (kainato); e 3) ácido alfaamino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazole propiônico (AMPA) (TAMMINGA, 1998). Esses
receptores se diferenciam por possuírem diferentes propriedades farmacológicas e
características eletrofisiológicas e também por terem sido clonados recentemente.
Atualmente, acredita-se que as subunidades dos receptores NMDA, AMPA e kainato sejam
codificadas por seis famílias de genes, sendo três famílias para o receptor NMDA, uma
única para o AMPA e duas famílias de genes para os receptores kainato (Tabela 1)
(BOULTER et al., 1990; BRESSAN, 2003; DINGLEDINE et al., 1999; HOLLMANN;
HEINEMANN, 1994; NAKANISHI, 1992). Embora existam evidências que sugiram que
esses genes possuam uma origem evolutiva comum, eles encontram-se espalhados em
numerosos cromossomos (DINGLEDINE et al., 1999).
Tabela 1. Receptores do glutamato.
Ionotrópicos (ligados ao canal iônico)
Receptor
Subunidades
Constituintes
NMDA
Kainato
AMPA
NMDAR1A-G
NMDAR2A-D
NMDAR3A-B
GluR5-7
(baixa afinidade)
KA1-2
(alta afinidade)
GluR1-4
Metabotrópicos (ligados à proteína G)
Grupo
Receptor
Grupo I
Grupo II
Grupo III
mGluR1, 5
mGluR2-3
mGluR4, 6-8
Fonte: CULL-CANDY et al., 2001 (adaptado).
17
Quando são comparadas as localizações dos receptores dentro do SNC, os
receptores AMPA existem em maior densidade, os receptores kainato são os de menor
densidade dentro do SNC e os receptores NMDA parecem se concentrar primariamente no
sistema límbico (Tabela 2) (BRESSAN, 2003; HUNTLEY et al., 1994).
Tabela 2. Distribuição de subunidades do receptor NMDA no SNC dos mamíferos.
NMDA subunidades receptoras
NMDAR1
Padrão de Expressão
Vasta expressão por toda a matéria cinzenta.
Proeminente no hipocampo, córtex frontal e
temporal, caudado, putamen e tálamo
NMDAR2A
Córtex cerebral, hipocampo, córtex cerebelar
córtex e bulbo olfatório
NMDAR2B
Telencéfalo
NMDAR2C
Cerebelo
NMDAR2D
Diencéfalo e tronco cerebral
Fonte: AKBARIAN et al., 1996 (adaptado).
Os receptores ionotrópicos podem se combinar em formas homoméricas e
heteroméricas, a fim de fazerem uma grande variação multimérica através do SNC que se
expressam
diferentemente
em
diferentes
regiões
cerebrais
(BRESSAN,
2003;
DINGLEDINE et al., 1999; MONYER et al., 1994). As subunidades dos receptores AMPA
incluem o GLU R1-GLU R4, enquanto as subunidades do kainato compreendem os
receptores GLU R5–GLU R7 e KA1-2 (BRESSAN, 2003; DINGLEDINE et al., 1999).
Essas subunidades de receptores ionotrópicos estão sujeitas a alterações póstranscripcionais, incluindo segmentação mRNA alternativa e edição pós-transcripcional, o
que lhes propicia uma grande diversidade funcional e estrutural (DINGLEDINE et al.,
18
1999). Tanto o receptor AMPA quanto o kainato são ligados a canais de sódio e potássio
que abrem em presença de glutamato. Isso resulta em um fluxo iônico de menos de 1
milissegundo (ms), causando uma despolarização de curta duração do neurônio póssináptico (JAVITT; ZUKIN, 1990).
Já o receptor NMDA é estruturalmente mais complexo que os outros
receptores ionotrópicos e por isso é conhecido como complexo NMDA. A base molecular
da diversidade dentro do complexo NMDA foi classificada de acordo com a subseqüente
clonagem de genes para o receptor NMDA (BRESSAN, 2003; HOLLMAN;
HEINEMANN, 1994; NAKANISHI; MASU, 1994). Este receptor é composto de duas
diferentes subunidades protéicas denominadas NMDAR1 (NR1), com 4 subunidades
tetraméricas variantes (NR1 1-4), e NMDAR2 (NR2), com cinco diferentes genes
codificando as variantes (NR2 A-D, NR3 A) (BRESSAN< 2003; DINGLEDINE et al.,
1999).
Acredita-se que uma unidade NR1 tem que se combinar com uma ou mais
subunidades NR2 para formar uma estrutura pentamérica (três NR1, dois NR2) ou
tetramérica (duas NR1, duas NR2) (BRESSAN, 2003; DINGLEDINE et al., 1999).
Aparentemente, existem ao menos seis sítios farmacológicos distintos aos quais
algum composto pode se ligar ao complexo NMDA e alterar a atividade desse receptor.
Como pode ser visto na figura 1, esses sítios de ligação são:
1) um sítio neurotransmissor primário liga-se ao aspartato, NMDA e glutamato,
os quais promovem a abertura dos canais de alta condutividade, o que permite a entrada de
sódio e cálcio na célula.
2) um sítio de ligação co-agonista que se liga a glicina e que precisa estar ocupado
para que o canal iônico funcione.
19
3) um sítio de ligação voltagem-dependente ao qual se liga o magnésio,
principalmente durante o potencial de repouso, e que bloqueia a condutância do canal.
4) um sítio inibitório ao qual se ligam o PCP, a ketamina e o MK-801.
5) um sítio poliamina regulatório ao qual se ligam a espermina e espermidina e
que facilita a transmissão mediada pelo receptor NMDA.
6) um sítio catiônico bivalente inibitório próximo à entrada do canal que tem
afinidade pelo Zn2+ e produz um bloqueio voltagem independente (BRESSAN, 2003).
Ocorre o influxo de sódio, potássio e cálcio para dentro do receptor quando o
glutamato é liberado pré-sinapticamente e também na presença de glicina (OLNEY;
FARBER, 1995).
Figura 1. Estrutura do receptor NMDA. Fonte: www.puc.cl/sw_edu/neurociencias/html.
20
A heterogeneidade farmacológica dos receptores NMDA parece variar de
acordo com a região e a etapa de desenvolvimento cerebral (LYNCH; GALLAGHER,
1996). Avanços recentes, tal como o reconhecimento da família NMDAR3, têm mostrado
que a complexidade funcional dos receptores NMDA é muito maior que o pensado
anteriormente. Estabelecer o significado desta grande heterogeneidade continua a ser um
grande desafio (BRESSAN, 2003; CULL-CANDY et al., 2001).
Os receptores NMDA são compostos, portanto, por vários locais de ligação
(Figura 1), aos quais se ligam numerosas substâncias endógenas e exógenas. Estas substâncias
atuam como agonistas e antagonistas que regulam a atividade do receptor NMDA in vivo.
Por exemplo, prótons (H+) inibem os receptores dos canais NMDA com valores de IC50
próximos ao pH fisiológico, significando que os canais dos receptores NMDA são
tonicamente inibidos sob condições normais (BRESSAN, 2003; TRAYNELIS; CULLCANDY, 1990).
Dentre os sítios de ligação regulatórios dos receptores NMDA (Figura 1), o sítio
de ligação do PCP é de especial interesse para o entendimento da esquizofrenia.
Antagonistas não-competitivos dos receptores NMDA atuam no sítio de ligação PCP
bloqueando o canal (bloqueadores de canal). Para isso ocorrer é necessário que o canal esteja
em estado aberto. Isso equivale a dizer que mesmo os antagonistas não-competitivos acabam
produzindo um efeito equivalente de antagonismo direto dos receptores NMDA
(HUETTNER; BEAN, 1988). Essa necessidade do canal iônico estar aberto ocorre porque
as características de ligação a este sítio são sensíveis ao estado funcional do canal NMDA,
ou seja, algumas ligações só podem acontecer no canal aberto (BRESSAN, 2003; JAVITT;
ZUKIN, 2000).
21
Para se estudar a fisiologia do receptor NMDA, bloqueadores de canal têm sido
largamente usados para medir ativação do receptor NMDA in vitro (CHEN et al., 1999;
DZUBAY; JAHR, 1996; FLETCHER; MACDONALD; 1993). Quando os ligantes do
sítio PCP ligam-se a este, eles ficam presos dentro do canal (BLANPIED et al., 1997). A
afinidade do ligante pelo sítio é que vai determinar a intensidade dos bloqueios cinéticos e
as posteriores ativações sucessivas dos receptores NMDA (PARSONS et al., 1995;
ROGAWSKI, 1993).
1.2 TRANSMISSÃO GLUTAMATÉRGICA
A neurotransmissão glutamatérgica é o mecanismo de excitação primário do
cérebro e, portanto, modula praticamente todos os neurônios no SNC. O glutamato é
armazenado em vesículas sinápticas no terminal nervoso pré-sináptico (NAITO; UEDA,
1989; STORM-MATHISEN et al., 1986).
De uma maneira simplista, o sistema
glutamatérgico é organizado em um sistema neuronal ascendente e um sistema neuronal
descendente. No sistema ascendente, os axônios se prolongam a partir do complexo
hipocampal e se estendem até os gânglios basais; enquanto no sistema descendente os
axônios se estendem a partir do neocórtex até as estruturas subcorticais (TAMMINGA,
1999). O L-glutamato descendente estimula o fluxo de ácido γ-aminobutírico (GABA) a
partir do nucleus accumbens, do estriado e do hipocampo (JANAKY et al., 1993;
STELZER; WONG, 1989). Isso acontece em oposição às vias dopaminérgicas ascendentes
que inibem a liberação de GABA a partir do estriado ligando-se a receptores
dopaminérgicos do tipo 2 (D2) em neurônios colinérgicos e GABAérgicos (NICOLLON et
22
al., 1983). O L-glutamato descendente também estimula a liberação tônica de dopamina
pelo núcleo accumbens e pelo estriado (THORNBERG; SAKLAD, 1996).
Além disso, existem outras fortes evidências a respeito de ações recíprocas entre
os sistemas dopaminérgicos e glutamatérgicos (CARLSSON, 1995). Por exemplo: a)
receptores dopaminérgicos são localizados nas projeções terminais de neurônios
glutamatérgicos córtico-estriatais (SCHWARCZ et al., 1978); b) receptores glutamatérgicos
são encontrados em terminais nervosos das vias dopaminérgicas nigro-estriatais
(ROBERTS; ANDERSON, 1979); c) ativação de receptores NMDA no córtex pré-frontal
aumenta a liberação de dopamina e aumenta a ativação dopaminérgica seletiva (KALIVAS
et al., 1989); e d) ambos neurônios dopaminérgicos e glutamatérgicos estimulam as espículas
de células piramidais (SMILEY et al., 1992).
Visto que existem receptores glutamatérgicos em neurônios dopaminérgicos e
receptores dopaminérgicos em vias glutamatérgicas, um desequilíbrio nos níveis dessas duas
substâncias pode predispor o indivíduo à esquizofrenia (HIRSCH et al., 1997). Claramente
esses achados sustentam a necessidade de o cérebro manter um balanço regular entre a
dopamina e o glutamato (RIEDERER et al., 1992).
1.3 GLUTAMATO E ESQUIZOFRENIA
Como já dito acima, o foco dos trabalhos que investigam o papel dos
neurotransmissores na gênese da esquizofrenia tem recaído sobre a dopamina, isso desde
que foi demonstrado que drogas antipsicóticas alteram o nível de catecolaminas no cérebro
(CARLSSON; LINDQVIST, 1963). A hipótese da hiperfunção dopaminérgica continuou a
evoluir ao verificar-se que a eficácia e a potência das drogas antipsicóticas tradicionais eram
23
diretamente relacionadas à sua habilidade em antagonizar os receptores dopaminérgicos D2
(CREESE et al., 1976). Entretanto, não existe dúvida que o mecanismo neuropatológico da
esquizofrenia é mais complexo que apenas um aumento de dopamina (KAPLAN;
SADOCK, 1998; BACHUS; KLEINMAN, 1996). DAVIS et al., 1991, mostraram, por
exemplo, que a maior parte dos antipsicóticos tradicionais (antagonistas D2) possui eficácia
limitada, não promovendo o alívio dos sintomas negativos da esquizofrenia.
Além da dopamina, outros sistemas neurotransmissores passaram a ser
investigados na patogênese da esquizofrenia, tais como a serotonina, a epinefrina, a
norepinefrina, os canabinóides endógenos e, atualmente, o glutamato, que representa um
dos principais focos de estudo na área.
Embora diversas linhas de pesquisa estejam investindo o papel do glutamato, até
o momento ainda não existe nenhum antipsicótico disponível comercialmente que atue
primariamente sobre esse sistema (CARLSSON et al., 1999; DEAKIN et al., 1989;
DURSUN et al., 1999; DURSUN; DEAKIN, 2001; FARBER, 1995; HIRSCH et al., 1997;
OLNEY; TAMMINGA, 1999, 1998).
De maneira geral, pode-se afirmar que existem duas hipóteses opostas, mas não
totalmente contraditórias, sobre o modo o glutamato estaria envolvido na esquizofrenia: (i)
hipótese da hipofunção glutamatérgica e (ii) hipótese da hiperfunção glutamatérgica
(DURSUN; DEAKIN, 2001).
A hipofunção glutamatérgica foi primeiramente proposta por Kim et al. (1980)
que relataram que esquizofrênicos apresentavam baixos níveis de glutamato no líquido
cérebro-espinhal e foi reforçada pela descoberta de que antagonistas NMDA como a
ketamina podiam induzir efeitos psicotomiméticos em humanos (JENTSCH; ROTH,
1999; STEMPRESIS, 1996; THORNBERG; SAKLAD, 1996).
24
Dados provenientes de estudos post-mortem com pacientes esquizofrênicos
também indicaram anormalidades dos receptores glutamatérgicos no córtex e nos lobos
temporais, reforçando a hipótese de que a esquizofrenia poderia resultar de um decréscimo
da liberação de glutamato nessas áreas (HUMPHRIES et al., 1996; ISHIMARU et al., 1994;
SHERMAN et al., 1991; TAMMINGA, 1998). Esses achados prontamente induziram ao
teste de substâncias que pudessem restaurar o suposto déficit de glutamato em pacientes
com esquizofrenia. Entretanto, o uso de glicina demonstrou apenas limitada eficácia
(HERESCO-LEVY et al., 1996; JAVITT et al., 1994; LEIDERMAN et al., 1996; POTKIN
et al., 1999; WAZIRI, 1988), enquanto a milacemida não mostrou eficácia alguma (ROSSE
et al., 1991) e a cicloserina e a glicina bloquearam os efeitos terapêuticos da clozapina em
alguns pacientes (GOFF et al., 1996; POTKIN et al., 1999).
A hipótese da hiperfunção glutamatérgica foi primeiramente sugerida pelos
achados de níveis plasmáticos aumentados em portadores de esquizofrenia (SACKLER et
al., 1954) e, posteriormente, desenvolvida por Deakin et al. (1989) a partir de evidências
neuroquímicas de uma superabundância de sinapses glutamatérgicas no córtex frontal de
esquizofrênicos (DEAKIN et al., 1989; DEAKIN; SIMPSON, 1997; SIMPSON et al.,
1998). Em um teste explícito dessa hipótese de hiperfunção glutamatérgica, Dursun et al.
(1999) testaram a adição de um inibidor da liberação de glutamato, a lamotrigina, à
clozapina no tratamento de esquizofrênicos refratários e observaram um efeito de melhora
dramática em todo o espectro sintomatológico e psicopatológico em seis pacientes.
Recentemente, Saba et al. (2002) reproduziram esse achado com outros três pacientes
(SABA et al., 2002) e Tiihonen et al. (2003) confirmaram esses dados em um ensaio duplocego.
25
Embora as evidências conectando transmissão glutamatérgica e esquizofrenia
sejam na sua maioria indiretas e grande atenção seja dirigida à possibilidade de uma
hipofunção glutamatérgica (TSAI; COYLE, 2002),
uma revisão acurada da literatura
internacional suporta a idéia de que a esquizofrenia seja um distúrbio de complexas redes
neurais no qual as anormalidades dos receptores glutamatérgicos possuem um papel
fundamental, coexistindo no cérebro diferentes áreas com características hipo e
hiperglutamatérgicas.
1.4 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE GLUTAMATO
Uma maneira de se investigar a existência de anormalidades na transmissão
glutamatérgica na esquizofrenia é através da mensuração dos níveis deste aminoácido. O
primeiro relato a respeito dos níveis de glutamato no líquido cefalorraquidiano (LCR)
mostrou que, em um grupo de 20 (16 medicados) esquizofrênicos paranóides, esses níveis
eram menores que os dos controles utilizados (KIM et al., 1980). Desde então, outros
laboratórios têm produzido resultados conflitantes ao medirem os níveis de glutamato em
humanos. Em pacientes esquizofrênicos, a maioria estando medicada, Gattaz et al. (1982,
1985) relataram um aumento nos níveis de glutamato no LCR e concluíram que deve haver
uma correlação entre a eficácia dos neurolépticos e o nível de glutamato cerebral. Em
comparação, Korpi et al. (1987) verificaram não haver diferenças nos níveis de glutamato de
23 pacientes esquizofrênicos crônicos não-medicados quando comparados com os controles.
Além disso, verificaram ainda não haver diferenças nos níveis de glutamato no LCR nos
períodos pré e pós-tratamento em seis desses pacientes.
26
Van der Heijden et al. (2004), Tortorella et al. (2001) e Sackler et al. (1954),
examinando a concentração sanguínea encontraram níveis aumentados no plasma de
pacientes esquizofrênicos quando comparado com controles normais. Van der Heijden et
al. (2004) ainda encontraram
uma correlação inversa entre os níveis de glutamato e
sintomas negativos e mostraram que o glutamato aumentou após o tratamento com um
neuroléptico atípico. No estudo de Tortorella et al. (2001), o glutamato que estava
aumentado diminuiu após o uso de clozapina, embora ainda tenha se mantido aumentado
(foram considerados valores estatisticamente significativos).
Macciardi et al. (1990), quando examinando a concentração sanguínea e urinária
de vários aminoácidos encontraram níveis elevados de glicina, glutamato e serina em
esquizofrênicos comparados a controles. Entretanto, quando comparados a outros pacientes
psiquiátricos ambulatoriais, os pacientes esquizofrênicos não apresentaram níveis anormais
de glutamato (ALTRAMURA et al., 1993). A análise conjunta desses dados não permite
conclusões definitivas, uma vez que esse tipo de estudo apresenta alguns pontos fracos
metodológicos. Dentre esses, pode ser incluída a instabilidade do glutamato durante o
processamento do LCR (FERRARESE et al., 1993).
Além de se medir o glutamato propriamente dito, é possível se investigar os
precursores e as enzimas envolvidas no metabolismo glutamatérgico. A N-acetil-alfadipeptidase-ligada ácida (NAALADase) é a enzima que converte o precursor de glutamato
N-acetil-aspartil-glutamato (NAAG) em N-acetil-aspartato (NAA) e em glutamato no
mesmo tecido. Tsai et al. (1995) encontraram níveis reduzidos de NAALADase, bem como
um aumento em NAAG no hipocampo e no córtex cerebral de esquizofrênicos quando
comparados a controles tratados com neurolépticos e a controles não-psiquiátricos.
27
1.5 GLICINA E SERINA
Quanto a glicina, esta é um co-agonista obrigatório em receptores NMDA que
aumenta a transmissão glutamatérgica, assim como sua precursora a serina. Estes são
aminoácidos que merecem atenção na pesquisa da esquizofrenia. A glicina atua melhorando
a ativação do canal de cátions voltagem-dependente do receptor NMDA (SUMIYOSHI et
al., 2004). Achados histoquímicos sugerem que a D-Serina pode modular as posições de
glicina no receptor NMDA (SUMIYOSHI et al., 2004).
A glicina é produzida através da serina que está sujeita a ação da enzima SHMT
(serina hidroximetil transferase) e do GCS (sistema de clivagem enzimática da glicina). A
enzima SHMT tem apresentado atividade deficitária em alguns esquizofrênicos.
Observa-se que há uma correlação entre os níveis séricos e liquóricos de glicina e
serina. E ainda, observa-se também uma correlação dos mesmos com sintomas
esquizofrênicos, embora os achados tenham se apresentado controversos, ou seja, ora os
níveis estão aumentados, ora estão diminuídos ou normais (SUMIYOSHI et al., 2004).
Outros estudos revelam que os sintomas negativos melhoram quando a glicina é
associada ao tratamento antipsicótico. Assim, a queda de glicina sérica reforça a hipótese
hipoglutamatérgica da esquizofrenia, ou seja, níveis de glicina mais baixos que os normais
estariam relacionados com sintomas negativos. Tais achados sugerem que a D-Serina pode
servir como um marcador periférico da esquizofrenia (SUMIYOSHI et al., 2004).
A enzima SHMT (serina hidroximetil transferase) que participa da reação
serina-glicina pode ter dificuldade de ser ativada em alguns esquizofrênicos, assim como
níveis elevados de serina e glicina também são observados na esquizofrenia (SUMIYOSHI
et al., 2004).
28
A serina é o aminoácido mais investigado nas psicoses. Waziri et al. (1993)
observaram níveis aumentados de serina no sangue e no cérebro de pacientes
esquizofrênicos. Este mesmo autor também aponta que os níveis plamáticos de serina estão
aumentados na psicose ativa quando se comparam com níveis de serina em pacientes que
melhoraram dos sintomas psicóticos, porém estes níveis ainda são maiores do que nos
controles.
Macciardi et al. (1990) também encontraram aumento plasmático de serina, mas,
diferentemente de Waziri et al. (1985), não afirmam que tal aumento possa ser considerado
um marcador biológico de psicose per se. Usando outra metodologia, Carl et al. (1992)
trabalharam com pacientes esquizofrênicos crônicos hospitalizados e também não
encontraram diferenças em relação a serina quando compararam tais pacientes com
trabalhadores normais do hospital.
Baruah et al. (1993) encontraram concentrações anormalmente aumentadas de
serina e baixa atividade de serina hidroximetil transferase (SHMT) em pacientes psicóticos e
esquizofrênicos quando comparados com controles. Em concordância, Wilcox et al. (1985)
também encontraram que a atividade de SHMT está diminuída em pacientes psicóticos.
Foram descritos também aumentos de glicina e serina e alteração de SHMT em cérebros
necropsiados de esquizofrênicos (BARUAH et al., 1993).
Já quando foram realizados estudos a respeito da ação dos neurolépticos sobre o
metabolismo dos aminoácidos, Waziri et al. (1984) observaram níveis plamáticos de serina
decrescentes com o tratamento antipsicótico. Grundig et al. (1976) administraram altas
doses de fenotiazinas que produziram rigidez e tremor em ratos e 20 minutos após a
decaptação dos mesmos foram encontradas concentrações aumentadas de serina e glicina no
fígado e cérebro dos ratos.
29
Em estudo prévio, Baruah et al. (1993) revelou o efeito dos neurolépticos em
um grupo misto de pacientes esquizofrênicos e afetivos, os quais ficaram livres de
antipsicóticos por três semanas e quando estes foram reintroduzidos observou-se uma
concentração baixa dos mesmos, mas sem afetar a atividade plasmática de SHMT.
Os achados da pesquisa têm mostrado que os efeitos dos neurolépticos sobre os
aminoácidos são mais relevantes quando comparados à dieta e outras variáveis. Porém,
ainda não se conhece o possível local de ação dos neurolépticos sobre a glicina, a serina e o
glutamato (BARUAH et al., 1993).
Os achados de Baruah et al. (1993) sugerem que neurolépticos são, na verdade,
neuroprotetores por seus efeitos sobre a concentração de serina e glicina, pois a
concentração elevada das mesmas teriam uma ação neurotóxica na via glutamatérgica
através do receptor NMDA. Logo, os neurolépticos tenderiam a normalizar a concentração
de serina e glicina no cérebro de esquizofrêncios.
Van der Heijden et al. (2004) verificaram a ação dos antipsicóticos atípicos sobre
o glutamato e encontraram uma elevação dos níveis glutamatérgicos em pacientes
esquizofrênicos. Perceberam, ainda, que há uma correlação inversa entre os níveis de
glutamato e sintomas negativos. Entretanto, observaram que o tratamento de
esquizofrênicos com neurolépticos atípicos aumenta a concentração de glutamato.
Tortorella et al. (2001) observaram que os valores do glutamato estavam
aumentados em pacientes livres de neurolépticos e após doze semanas de tratamento com
clozapina houve significativa redução dos níveis glutamatérgicos, embora não restaurados
até os valores encontrados em controles normais.
30
Tortorella et al. (2001) encontraram concentração de serina diminuída em
pacientes livre de drogas e que continuou diminuída quando a clozapina foi introduzida,
embora fosse observada uma melhora clínica dos pacientes.
Frente a esses achados, fica claro que ocorre algum grau de disfunção na
transmissão
glutamatérgica em pacientes esquizofrênicos. O que ainda não está claro é a real natureza
dessa disfunção e também o quanto a mesma pode ser identificada através da mensuração
dos níveis deste aminoácido e seus precursores e agonistas em nível periférico (valores
sorológicos ou plasmáticos).
Além disso, tem sido descrita em estudos de neuroimagem, particularmente com
o uso da espectroscopia de prótons, uma alteração dos valores de glutamato nos cérebros de
pacientes em primeiro episódio psicótico e crônicos, bem como em familiares considerados
como de alto risco para o desenvolvimento de esquizofrenia (THÉBERGE et al., 2002;
THÉBERGE et al., 2003; TIBBO et al., 2004).
Em relação aos níveis plasmáticos, não há relatos suficientes na literatura em
relação aos familiares. Assim, o presente trabalho justifica-se, em primeiro lugar, tentando
reproduzir os achados da literatura com uma população bem caracterizada e uniforme do
ponto de vista clínico. Em segundo lugar, acrescentando o grupo de familiares em primeiro
grau, o que poderá ajudar a identificar se essas variações ocorrem e se poderiam ser
consideradas um marcador ou um fator de risco para o desenvolvimento de esquizofrenia.
31
2 OBJETIVOS
32
Este estudo teve por objetivo avaliar os níveis dos aminoácidos glutamato,
serina e glicina no soro de pacientes esquizofrênicos em tratamento com haloperidol e
clozapina e em seus familiares em primeiro grau e compará-los com os níveis séricos de
controles sadios. Além disso, objetivou-se correlacionar tais níveis entre si e com a
expressão sintomatológica dos pacientes e com a medicação em uso pelos mesmos.
33
3 MATERIAIS E MÉTODOS
34
3.1 PARTICIPANTES
Foram selecionados 15 pacientes portadores de esquizofrenia diagnosticada
pelos critérios diagnósticos do Manual Diagnóstico e Estatístico da Associação Psiquiátrica
Americana – 4a edição (Diagnostic and Statistical Manual – DSM-IV) em tratamento
antipsicótico tradicional, denominados de responsivos (Grupo Esq R); 15 pacientes
portadores de esquizofrenia diagnosticada pelos critérios diagnósticos do DSM-IV em
tratamento antipsicótico com clozapina, denominados não-responsivos conforme os
critérios adaptados de Kane et al. (1988) (Grupo Esq NR); 30 familiares em primeiro grau
dos respectivos pacientes (Grupo Fam Esq R e Grupo Fam Esq NR) e 60 voluntários sadios
emparelhados de acordo com a idade e o sexo com os respectivos grupos do estudo (grupos
Controle Esq R, Controle Fam Esq R, Controle Esq NR, Controle Fam Esq NR). O
emparelhamento dos grupos de pacientes e familiares com os voluntários sadios foi
realizado dois a dois da seguinte maneira: Grupo Esq R com o Grupo Controle Esq R,
Grupo Fam Esq R com o Grupo Controle Fam Esq R, Grupo Esq NR com o Grupo
Controle Esq NR, Grupo Fam Esq NR com o Grupo Controle Esq NR.
3.1.1 Critérios de inclusão
Pacientes com esquizofrenia, familiares em primeiro grau dos mesmos e
voluntários sadios. Todos dentro da faixa etária entre 18 e 75 anos, de ambos os sexos. Os
pacientes deviam estar em tratamento farmacológico com antipsicóticos tradicionais ou
35
clozapina. Os pacientes aqui denominados como responsivos obtiveram um controle clínico
satisfatório com antipsicóticos tradicionais, estabilizados com a mesma dose de medicação
antipsicótica por ao menos quatro meses. Os pacientes aqui denominados como nãoresponsivos assim o foram devido ao fato de terem sido submetidos a pelo menos dois ensaios
clínicos completos com antipsicóticos tradicionais ou de segunda geração, o que levou a
necessidade de introdução de clozapina para atingir estabilização clínica, sendo necessário
também que não houvesse modificação do esquema posológico por pelo menos 4 meses.
3.1.2 Critérios de exclusão
Pacientes fora da faixa etária de 18 a 75 anos, portadores de quadros orgânicos
clínicos significativos, erros inatos do metabolismo, co-morbidades psiquiátricas, abuso ou
dependência de álcool e drogas.
Os familiares deveriam estar na faixa etária de 18 a 75 anos, e não apresentar
diagnóstico psiquiátrico ou clínico significativo e nem abuso ou dependência de álcool ou drogas.
Os voluntários sadios não poderiam apresentar história familiar de quadros
psiquiátricos, nem apresentar diagnóstico psiquiátrico ou clínico significativo e nem abuso
ou dependência de álcool ou drogas.
3.2 INSTRUMENTOS
•
Escala de Avaliação Psiquiátrica Breve (Brief Psychiatric Rating Scale – BPRS,
OVERALL; GORHAM, 1962) modificada por Bech (1986), traduzida e adaptada
para o português (ZUARDI et al., 1994).
36
•
Escala de Avaliação das Síndromes Positiva e Negativa para Esquizofrenia - Escala
Negativa (Positive and Negative Syndrome Scale - PANSS, KAY et al., 1987),
traduzida e adaptada para o português por Vessoni (1993).
•
Cromatógrafo
3.2.1 Método para análise de aminoácidos
A concentração dos aminoácidos serina, glicina e glutamato foi determinada no
soro através do método cromatográfico descrito por Burbach et al. (1982). O sangue venoso
(10ml) foi coletado de pacientes em jejum, em tubos a vácuo sem anticoagulante. As
amostras foram deixadas coagular em temperatura ambiente e o soro foi separado por
centrifugação a 3.500 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi separado, aliquotado e
congelado a –20ºC até o momento do uso.
As amostras (0,2 ml) foram preparadas pela adição de ácido tricloroacético
(Merck) (0,2ml) a 5%, mantidas a 4ºC por 10 minutos e centrifugadas a 14.000 rpm.
Procedimento idêntico foi realizado com as amostras após a adição de 250umol do
aminoácido Norleucina (padrão interno). Foi feita neutralização das amostras utilizando-se
uma solução de Li(OH)3 (Merck) 4 M.
As análises de aminoácidos foram realizadas usando uma coluna de
octadecilsilano (Lichrospher, 4,6 x 125mm, Merck), equilibrada em metanol (Carlo Erba,
Grau HPLC) a 20 % em tampão citrato de sódio 0,1 M, pH 6,5 e eluída com um gradiente
de metanol 100%. Foi utilizada a pré-derivação com o-ftalaldeído (Sigma), segundo Burbach
et al. ( 1982).
37
3.3 PROCEDIMENTO
Os pacientes e seus familiares foram selecionados a partir da população usuária
do Ambulatório de Esquizofrenia da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro e do
Ambulatório de Reabilitação Psicossocial da Enfermaria de Psiquiatria do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. O
projeto de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Faculdade de
Medicina do Triângulo Mineiro (APÊNDICE A). Todos aqueles pacientes e seus familiares
que aceitaram participar do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido
pós–informação (APÊNDICE B).
O diagnóstico de esquizofrenia foi confirmado através de entrevista clínica
utilizando-se os critérios diagnósticos do DSM-IV, realizada pelo autor do projeto. No ato
da entrevista diagnóstica também foram aplicadas a BPRS e a PANSS negativa, com a
finalidade de identificar a predominância sintomatológica no momento da coleta do sangue,
para posterior correlação dos níveis plasmáticos dos aminoácidos com as manifestações
clínicas dos pacientes.
Os voluntários sadios foram selecionados a partir de busca ativa de moradores
da cidade de Uberaba emparelhados de acordo com a idade e o gênero com os pacientes e
seus familiares. Uma vez identificados, eram submetidos a uma entrevista não-estruturada
para identificação de possíveis critérios de exclusão. Não havendo contra-indicação eram
então convidados a assinar o termo de consentimento livre e esclarecido pós-informação e
era agendada uma data para coleta das amostras de sangue.
38
Foram colhidas amostras de sangue de voluntários de todos os grupos após doze
horas de jejum e a seguir, pelo método de cromatografia, foram mensurados os níveis de
serina, glicina e glutamato, comparando-os entre si.
3.3.1 Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas usando o pacote estatístico SPSS, versão
13.0 (SSPS - Incorporation, 2001).
A análise dos dados demográficos e clínicos da amostra estudada foi realizada
por meio da aplicação de testes estatísticos descritivos paramétricos e não-paramétricos.
Para a comparação entre grupos, foi utilizada uma Análise de Variância - ANOVA para a
comparação da idade, sendo submetidos à análise post-hoc com o teste de Tukey, e o Teste
do Qui-quadrado para a comparação de gênero entre os grupos. Adotou-se como nível de
significância p < 0,05.
Os dois grupos de pacientes tiveram seus escores das escalas BPRS e PANSS
comparados através do teste t de Student. Para a BPRS foi realizada ainda uma análise dos
quatro fatores que a compõem (Ansiedade-Depressão, Retraimento-Retardo, Distúrbio do
Pensamento, Ativação), de acordo com Crippa et al. (2002).
Os níveis séricos dos diferentes grupos foram analisados através da ANOVA,
sendo submetidos à análise post-hoc com o teste de Tukey. Esta análise considerou dois
agrupamentos dos voluntários investigados neste estudo, assim delineados: os pacientes
responsivos e não-responsivos, juntamente com seus respectivos voluntários sadios foram
comparados entre si, o mesmo tendo sido feito para os familiares dos pacientes responsivos
e não-responsivos e seus respectivos controles.
39
A correlação entre os níveis plasmáticos dos aminoácidos e os sintomas
psicopatológicos dos pacientes foi realizada através do Coeficiente de Correlação de
Pearson, bem como a correlação com a dose diária de antipsicóticos. A dose diária de
antipsicóticos tradicionais foi transformada em equivalentes de clorpromazina para fins de
análise.
40
4 RESULTADOS
41
4.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-DEMOGRÁFICAS
Os seis grupos de voluntários foram comparados em relação à faixa etária
utilizando uma ANOVA seguida pelo teste post-hoc de Tuckey. A ANOVA identificou
uma diferença estatística entre os grupos (F5,115=25,467; p < 0,001). A Figura 2 mostra as
médias de idade dos diferentes grupos participantes deste estudo.
70
60
50
Esq R
Fam Esq R
40
anos
Esq NR
Fam Esq NR
30
Controle Esq
Controle Fam
20
10
0
idade
Figura 2. Médias de idade dos seis grupos participantes do estudo. As colunas
representam a média de idade dos voluntários (coluna azul = esquizofrênicos
responsivos – Esq R; coluna vinho = familiares de esquizofrênicos responsivos –
Fam Esq R; coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna
verde = familiares de esquizofrênicos não-responsivos – Fam Esq NR; coluna cinza
= controles emparelhados com esquizofrênicos – Controle Esq; coluna laranja =
controles emparelhados com familiares de esquizofrênicos – Controle Fam Esq). As
barras acima das colunas indicam o erro-padrão das médias.
42
Já o teste de Tuckey mostrou que os grupos dispuseram-se em 2 agrupamentos
conforme a faixa etária, confirmando a eficiência do emparelhamento realizado no processo
de seleção (Tabela 3). Quanto ao gênero, não houve diferenças estatísticas entre as médias
de idade dos grupos (x2=8,142; GL=5; p=0,149).
Tabela 3. Teste de Tukey em relação à faixa etária dos grupos
participantes no estudo
Subset para alpha = 0,05
GRUPO
1*
Esq R
33,47
Esq NR
36,20
Controle Esq
35,47
2*
Fam Esq R
54,60
Fam Esq NR
58,62
Controle Fam Esq
62,13
Sig.
0,979
0,499
* Média de idade em anos
A Tabela 4 apresenta algumas características clínico-demográficas dos grupos de
pacientes responsivos e não-responsivos.
43
Tabela 4. Características clínico-demográficas dos pacientes participantes do estudo.
N° Cadastro
Pacientes
Idade
(anos)
Sexo
Medicamento
(dose diária em mg)
Diagnóstico
001-001
37
F
Haloperidol 15 mg/dia
F 20.0
001-002
35
M
Clorpromazina 300mg/dia
F 20.0
001-003
23
M
F 20.0
001-004
45
M
Haloperidol 15mg/dia
F 20.0
001-005
24
M
F 20.0
001-006
38
F
F 20.0
001-007
43
M
F 20.3
001-008
37
F
F 20.3
001-009
28
M
F 20.0
001-010
29
M
F 20.0
001-011
45
F
F 20.3
001-012
30
F
F 20.0
001-013
25
F
F 20.0
001-014
33
F
Clorpromazina 400 mg/dia
F 20.0
001-015
30
M
Haloperidol 15 mg/dia
F 20.0
003-001
36
M
Clozapina 300 mg/dia
F 20.0
003-002
45
M
F 20.3
003-003
31
M
F 20.0
003-004
28
F
F 20.0
003-005
35
M
F 20.1
003-006
30
M
F 20.0
003-007
41
M
F 20.3
003-008
28
F
F 20.1
003-009
32
M
F 20.0
003-010
40
M
F 20.1
003-011
42
M
F 20.0
003-012
27
M
F 20.0
003-013
49
F
F 20.3
003-014
31
F
F 20.3
003-015
51
M
F 20.1
44
Em relação à sintomatologia, os grupos de pacientes Esq R e Esq NR não
apresentaram diferenças estatísticas quanto à sintomatologia avaliada utilizando a BPRS e
considerando os escores totais da mesma (t=-1,504; GL=28; p=0,144). Já a análise dos
fatores que compõem a escala mostrou diferenças estatisticamente significativas em relação
ao fator Ansiedade-Depressão, com escores maiores para o grupo Esq NR (t=-3,479;
GL=28; p=0,002), mas não para os outros fatores (Retraimento-Retardo, t=-1,330;
GL=28; p=0,194 – Distúrbio do Pensamento, t=0,649; GL=28; p=0,522 – Ativação, t=0,922; GL=28; p=0,365).
Quanto à PANSS negativa, foram identificadas diferenças estatisticamente
significativas entre os dois grupos de pacientes, com os escores aumentados para o grupo de
pacientes Esq NR (t=-5,103; GL=28,p<0,001 – Figura 3).
*
Figura 3. Escores médios da PANSS negativa. As colunas representam a média
dos escores dos pacientes (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq R;
coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR). As barras acima
das colunas indicam o erro-padrão das médias. O asterisco indica uma diferença
estatísticamente significativa entre grupos (p < 0,05).
45
4.2 NÍVEIS PLASMÁTICOS DOS AMINOÁCIDOS DOS PACIENTES
A comparação entre os níveis plasmáticos de serina, glicina e glutamato foi feita
comparando-se os grupos de pacientes com os respectivos controles (três grupos
comparados entre si).
Em relação aos níveis plasmáticos de serina dos pacientes comparados aos de
seus controles não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos (F2,58=1,206;
p=0,307) (Figura 4).
A comparação dos níveis plasmáticos de glicina de pacientes e seus controles
evidenciou diferenças estatísticas entre os grupos (F2,58=3,796; p=0,028), com os Esq R
apresentando níveis plasmáticos aumentados em relação aos outros grupos (Figura 5).
Níveis plasmáticos de serina em pacientes e controles
100
90
80
nmol/ml
70
60
Esq R
50
Esq NR
Controle Esq
40
30
20
10
0
serina
Figura 4. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de serina em pacientes e controles. As colunas
representam os voluntários (coluna azul-claro = esquizofrênicos responsivos – Esq R;
coluna amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna cinza = controles
emparelhados aos Esq). As barras acima das colunas indicam o erro-padrão das médias.
46
Níveis plasmáticos de glicina em pacientes e controles
250
*
nmol/ml
200
150
Esq R
Esq NR
Controle Esq
100
50
0
glicina
Figura 5. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina em pacientes e controles. As colunas
representam os voluntários (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq R; coluna
amarela = esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna cinza = controles
emparelhados aos Esq). As barras acima das colunas indicam o erro-padrão das médias. *
indica diferença estatística do grupo em relação aos demais grupos (p < 0,05).
Em relação aos níveis plasmáticos de glutamato dos pacientes comparados aos de
seus controles foram encontradas diferenças estatísticas, com esquizofrênicos nãoresponsivos apresentando níveis plasmáticos aumentados em relação aos controles e aos
pacientes responsivos (F2,58=10,585; p<0,001) (Figura 6).
47
Níveis plasmáticos de glutamato em pacientes e controles
400
*
350
300
nmol/ml
250
Esq R
Esq NR
200
Controle Esq
150
100
50
0
glutamato
Figura 6. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato em pacientes e controles. As colunas
representam os voluntários (coluna azul = esquizofrênicos responsivos – Esq R; coluna amarela
= esquizofrênicos não-responsivos – Esq NR; coluna cinza = controles emparelhados aos Esq).
As barras acima das colunas indicam o erro-padrão das médias. * indica diferença estatística do
grupo em relação aos demais grupos (p < 0,05).
4.3 CORRELAÇÕES DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE AMINOÁCIDOS DOS
PACIENTES ENTRE SI E COM AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E USO DE
ANTIPSICÓTICOS
Em relação às correlações, quando foram avaliados ambos os grupos de
pacientes conjuntamente, foi notada uma correlação positiva entre os níveis plasmáticos de
serina com os de glicina (r=0,433; p=0,017 – Figura 7) e de glutamato (r=0,513; p=0,004 –
Figura 8), mas não entre glicina e glutamato (r=-0,244; p=0,194).
48
350
300
Glicina (nmol/ml)
250
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Serina (nmol/ml)
Figura 7. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina e serina
em ambos os grupos de pacientes.
600
Glutamato (nmol/ml)
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Serina (nmol/ml)
Figura 8. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato e
serina em ambos os grupos de pacientes.
49
A correlação entre os níveis plasmáticos e os sintomas apresentados pelos
pacientes mostrou uma correlação positiva entre os níveis de glutamato e os escores da
PANSS negativa (r=0,401; p=0,028 – Figura 9), mas não foi observada nenhuma correlação
significativa entre as outras medidas plasmáticas e os escores da BPRS total ou dos fatores da
BPRS.
25
PANSS Negativa
20
15
10
5
0
0
100
200
300
400
500
600
Glutamato (nmol/ml)
escores da PANSS negativa em ambos os grupos de pacientes.
Quando os grupos de pacientes foram analisados separadamente, foi observada
uma correlação negativa entre os níveis de glicina e de glutamato (r=-0,642; p=0,010 –
Figura 10), mas não houve correlações significativas entre os níveis de serina e glicina
considerando o grupo Esq R (r=0,119; p=0,672), nem entre serina e glutamato (r=0,176;
p=0,531).
50
600
Glutamato (nmol/ml)
500
400
300
200
100
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Glicina (nmol/ml)
glicina nos grupos de pacientes Esq R.
Em relação à correlação entre os níveis plasmáticos dos aminoácidos e os sintomas
dos pacientes, não foi observada correlações significativas quando se examinando apenas o
grupo de pacientes responsivos. Curiosamente, também não houve correlação entre os níveis
plasmáticos e os equivalentes de clorpromazina, e nem destes com os sintomas, fossem medidos
pela BPRS e seus fatores, fossem medidos com a PANSS negativa.
Já a análise de correlação entre os níveis plasmáticos dos aminoácidos no grupo
Esq NR mostrou uma correlação positiva entre os níveis de serina tanto com a glicina
(r=0,827; p<0,001 – Figura 11), quanto com o glutamato (r=0,804; p<0,001 – Figura 12).
O mesmo foi encontrado para os níveis de glicina e glutamato (r=525; p=0,045 – Figura
13). Na correlação entre os níveis plasmáticos de aminoácidos dos Esq NR com os sintomas
(BPRS total e fatores e PANSS negativa) e com a dose diária de clozapina, também não
foram evidenciadas correlações significativas, como já ocorrera com o grupo Esq R.
51
350
300
Glicina (nmol/ml)
250
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Serina (nmol/ml)
Figura 11. Correlações entre os níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina e serina
nos grupos de pacientes Esq NR.
600
Glutamato (nmol/ml)
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Serina (nmol/ml)
serina nos grupos de pacientes Esq NR.
52
600
Glutamato (nmol/ml)
500
400
300
200
100
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Glicina (nmol/ml)
nos grupos de pacientes Esq NR.
4.4 NÍVEIS PLASMÁTICOS DOS AMINOÁCIDOS DOS FAMILIARES
A comparação entre os níveis plasmáticos de serina, glicina e glutamato foi feita
comparando-se os grupos de familiares com os respectivos controles (quatro grupos
comparados entre si).
Assim como para os pacientes, os níveis plasmáticos de serina dos familiares
comparados aos de seus controles não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos
(F2,58=2,252; p=0,114) – Figura 14.
53
Níveis plasmáticos de serina em familiares e controles
100
90
80
nmol/ml
70
60
Fam Esq R
50
Fam Esq NR
Controle Fam
40
30
20
10
0
serina
Figura 14. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de serina em familiares e controles. As
acima das colunas indicam o erro-padrão das médias.
A comparação dos níveis plasmáticos de glicina dos familiares comparados aos
de seus controles também não apresentou diferenças estatísticas entre os grupos
(F2,58=1,044; p=0,358) – Figura 15.
Quanto aos níveis plasmáticos de glutamato dos familiares, também houve
diferença entre os grupos, com os familiares de pacientes responsivos com níveis menores
que os outros familiares e os respectivos controles (F2,58=9,114; p<0,001) – Figura 16.
54
Níveis plasmáticos de glicina em familiares e controles
200
180
160
nmol/ml
140
120
Fam Esq R
100
Fam Esq NR
Controle Fam
80
60
40
20
0
glicina
Figura 15. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glicina em familiares e controles. As
acima das colunas indicam o erro padrão das médias.
Níveis plasmáticos de glutamato em familiares e controles
*
280
260
240
220
200
nmol/ml
180
160
Fam Esq R
140
Fam Esq NR
120
Controle Fam
100
80
60
40
20
0
glutamato
Figura 16. Níveis plasmáticos (nmol/ml) de glutamato em familiares e controles. As
acima das colunas indicam o erro-padrão das médias. * indica diferença estatística do
grupo em relação aos demais grupos (p<0,05).
55
5 DISCUSSÃO
56
A partir do estudo seminal de Sakler et al. (1954) que evidenciaram um aumento
dos níveis plasmáticos de glutamato em pacientes esquizofrênicos crônicos internados e,
apesar do longo intervalo, de Kim et al. (1980) que descreveram uma diminuição dos níveis
liquóricos deste aminoácido, ficou patente que uma maneira de se investigar a hipótese de
uma disfunção glutamatérgica na esquizofrenia seria através da mensuração direta dos níveis
de glutamato e seus precursores, serina e glicina, no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no
plasma de pacientes portadores de esquizofrenia. Frente à complexidade técnica e questões
éticas envolvidas na coleta seriada de LCR, a mensuração periférica torna-se uma alternativa
viável.
Entretanto, em revisão realizada em 2007, Cunha e Hallak (submetido)
identificaram que a literatura atualmente disponível apresenta resultados discordantes. A
partir da revisão de 24 artigos selecionados, os autores identificaram que os grupos que têm
investigado alterações da transmissão glutamatérgica através da mensuração dos níveis
plasmáticos ou liquóricos de glutamato e seus precursores serina e glicina pressupõem que a
mesma esteja alterada na esquizofrenia, independente da direção que esta alteração siga.
Além disso, foi possível identificar um esforço em correlacionar estas alterações com as
manifestações de grupos específicos de sintomas (particularmente sintomas negativos) e com
a ação antipsicótica de medicações utilizadas para o tratamento deste transtorno.
Um ponto que chama a atenção neste estudo de revisão foi a identificação de
que os diferentes trabalhos apresentam uma grande variabilidade na seleção de seus sujeitos
e também de seus controles, tanto em relação ao número de sujeitos, quanto a
características clínicas das amostras.
57
Por exemplo, em relação ao número de sujeitos que compunham a amostra foi
possível observar uma variabilidade bastante grande, com os estudos indo de um mínimo de
12 pacientes esquizofrênicos a um máximo de 144. Além dessa diferença na quantidade de
sujeitos, foi bastante difícil caracterizar os critérios utilizados para o emparelhamento dos
diferentes grupos estudados, com alguns trabalhos incluindo outras patologias psiquiátricas
(e.g. depressão) e até neurológicas (que foram de cefaléia a coréia de Huntington), o que
pode ser utilizado para explicar a variabilidade dos achados da revisão.
No presente estudo, foi realizado um esforço grande para uniformizar as
características demográficas e clínicas para reforçar o significado de possíveis resultados
positivos.
Assim, houve um emparelhamento sujeito a sujeito para a composição dos
grupos participantes envolvidos no estudo. Isso pode ser identificado na ausência de
diferenças estatísticas entre os grupos nos critérios utilizados para tal emparelhamento
(gênero e idade).
Quanto às características clínicas dos pacientes, também é possível identificar o
esforço para a composição de subgrupos homogêneos, haja vista a grande semelhança de
subtipos diagnósticos de esquizofrenia em cada grupo. Já a diferença entre os dois grupos de
pacientes na sintomatologia aferida pela BPRS e seus fatores e pela PANSS negativa pode
ser explicada pela refratariedade aos antipsicóticos do grupo não-responsivo, o que indica
uma maior gravidade do transtorno nesse grupo.
Em relação à metodologia para dosagem de aminoácidos, foi optado pela
cromatografia no presente estudo, uma vez que esta é a modalidade mais utilizada em
pesquisas semelhantes. Além disso, Cunha e Hallak (submetido) apontam em sua revisão
que dentre os estudos que dosaram os aminoácidos no plasma em portadores de
58
esquizofrenia, dez deles usaram a cromatografia para esta finalidade e quatro usaram outros
métodos. Dos seis estudos que encontraram níveis alterados, dois utilizavam outras técnicas
que não a cromatografia e dos oito que não encontraram alterações, dois usavam a
fluorometria.
A comparação dos níveis plasmáticos de serina entre os pacientes responsivos e
não-responsivos e seus controles não evidenciou diferenças estatisticamente significativas,
indo ao encontro de resultados presentes na literatura (ALTAMURA et al., 1993;
BARUAH et al., 1993; BJERKENSTEDT et al., 1985; PERRY; LUCCA et al., 1992;
NEEMAN et al., 2005; HANSEN, 1985). Entretanto, existem estudos que evidenciam um
aumento nos níveis plasmáticos de serina em portadores de esquizofrenia (CARL et al.,
1992; FEKKES et al., 1994; SUMIYOSHI et al., 2004) e mesmo um estudo que encontrou
diminuição de serina em pacientes comparados a controles sadios (TORTORELLA et al.,
2001).
O que a maior parte destes autores refere como fonte de discordância entre seus
resultados é a questão metodológica, particularmente o tamanho das amostras
(SUMIYOSHI et al., 2004) e o uso de medicações (SUMIYOSHI et al., 2004). Ambas as
explicações são questionáveis, uma vez que mesmo estudos que utilizaram pacientes livres
de medicação ou com amostras comparáveis em magnitude apresentaram resultados
discordantes.
Apesar dessa ausência de alterações nos níveis plasmáticos de serina em
portadores de esquizofrenia em parte dos estudos, tem sido descrito um possível efeito das
medicações antipsicóticas sobre os mesmos. Por exemplo, Tortorella et al. (2001) descrevem
um aumento nos níveis plasmáticos de serina após a introdução de clozapina em pacientes
livres de medicação. Em compensação, Baruah et al. (1993) descrevem uma diminuição não-
59
significativa dos níveis plasmáticos de serina em pacientes em tratamento com haloperidol e
significativa em ratos tratados com haloperidol. No presente estudo, não foi possível fazer
tal comparação, uma vez que todos os pacientes estavam estabilizados e em uso da mesma
dosagem de antipsicóticos há pelo menos quatro meses. Ainda assim não foi encontrada
diferença entre os dois grupos de pacientes em relação aos níveis de serina.
Uma possibilidade para explicar tal discrepância entre os resultados existentes na
literatura poderia ser a própria variação sintomatológica da esquizofrenia, com pacientes
apresentando uma grande multiplicidade de apresentações clínicas, mesmo dentre os
diferentes subtipos diagnósticos. Entretanto, nossos resultados não reforçam tal hipótese,
uma vez que os níveis plasmáticos de serina não apresentaram correlações significativas com
os sintomas expressos pelos pacientes.
Os achados da comparação entre os grupos de pacientes esquizofrênicos
responsivos e não-responsivos e seus respectivos controles quanto aos níveis plasmáticos de
glicina apontaram um aumento destes níveis nos pacientes responsivos. Uma possibilidade
para explicar tal achado é que um aumento nos níveis deste precursor seria compensatório a
uma função glutamatérgica diminuída em portadores de esquizofrenia. Para explicar que
este aumento ocorra somente no grupo Esq R e não no Esq NR, outra possibilidade seria
que o uso de clozapina diminuiria tais níveis plasmáticos, ou isso seria em decorrência de
um provável aumento de glutamaton pela clozapina.
A literatura aponta, em relação aos níveis plasmáticos de glicina, que os mesmos
foram relatados como aumentados quando comparados a controles no estudo de Baruah et
al. (1993), e diminuídos nos estudos de Neeman et al. (2005) e Sumioshy et al. (2004).
Novamente Baruah et al. (1993) afirma que o uso de antipsicóticos diminui os níveis
também deste aminoácido, mas não os corrige, já Neeman et al. (2005) não confirmaram
60
esses achados, nem com o uso de clozapina. Quanto a Neeman et al. (2005) e Sumiyoshi et
al. (2004), os autores correlacionaram os achados com a expressão de sintomas negativos
pelos pacientes. Além disso, Neeman et al. (2005) mostraram em seu estudo que a glicina
estava diminuída mais em homens do que em mulheres.
Em 2005, Sumiyoshi et al., não compararam os níveis plasmáticos de serina e
glicina com os de controles, mas buscaram correlacionar os mesmos com o uso de
clozapina, encontrando que níveis diminuídos de serina e glicina são preditores de resposta
à clozapina. Isso poder-se-ia dever a uma provável modificação dos níveis de glutamato.
Apesar desses achados positivos, outros estudos também não encontraram
diferenças entre os níveis plasmáticos de glicina em pacientes com esquizofrenia e controles
normais (BJERKENSTEDT et al., 1985; CARL et al., 1992; LUCCA et al., 1993; PERRY;
HANSEN, 1984; TORTORELLA et al., 2001). A correlação entre os níveis plasmáticos
com sintomatologia ou dosagem utilizada de antipsicóticos foi negativa. Novamente a
explicação possível estaria nas diferenças metodológicas entre os diversos estudos, bem
como nas características clínicas e terapêuticas dos pacientes, que poderiam ter interferido
nos resultados.
Já a mensuração dos níveis plasmáticos de glutamato em pacientes e controles
apresentou diferenças entre os três grupos, com uma maior concentração plasmática deste
aminoácido nos controles e em pacientes portadores de esquizofrenia não-responsiva ao uso
de antipsicóticos tradicionais, sendo que estes dois outros grupos de voluntários não
diferiram entre si.
Esse é um achado importante que merece uma discussão detalhada à luz da
literatura e das hipóteses que envolvem o glutamato na gênese da esquizofrenia.
61
Essa concentração aumentada de glutamato periférico poderia ser explicada de
algumas maneiras: inicialmente, se a hipótese de que ocorre uma hiperfunção
glutamatérgica na esquizofrenia, secundária ou não a uma deficiência específica na
transmissão NMDA, estiver correta, seria esperado que níveis plasmáticos de glutamato
estivessem aumentados na esquizofrenia. Isso porque, aparentemente, existe uma correlação
entre os níveis plasmáticos e cerebrais de aminoácidos excitatórios (ALFREDSSON et al.,
1988; SUMIYOSHI et al., 2004), apesar de que alguns autores questionem tal fato. Shulman
et al. (2006) questionam, mais particularmente, a validade de se medir aminoácidos
perifericamente, uma vez que, utilizando a espectroscopia de prótons realizada com uma
máquina de ressonância magnética de 3 Teslas, não conseguiram encontrar uma correlação
entre estes e os níveis medidos pela espectroscopia no córtex pré-frontal. Apesar da
observação destes autores, ainda que pese o avanço das técnicas de neuroimagem, estas não
parecem ter atingido um grau de sensibilidade e especificidade totalmente satisfatório para
se medir o glutamato cerebral.
Assim, uma explicação plausível para este aumento de glutamato nos pacientes
não-responsivos, mas não nos responsivos, seria a própria gravidade do transtorno ou
intensidade dos sintomas. Ou seja, pacientes mais gravemente enfermos apresentariam um
maior desequilíbrio na sua função glutamatérgica.
Outra explicação possível seria o uso de medicações antipsicóticas. Aqui duas
possibilidades se apresentam: primeiro – o uso de antipsicóticos típicos diminuiria os níveis
de glutamato; segundo – o uso de clozapina aumentaria os níveis de glutamato e; terceiro: as
duas alternativas anteriores acontecem conjuntamente.
Como já apontado anteriormente, antipsicóticos tradicionais, particularmente o
haloperidol, apresentam uma propensão a diminuir os níveis liquóricos de glutamato
62
(LABARCA et al., 1995). Quanto aos antipsicóticos atípicos, em seu estudo, Van der
Heijden et al., (2004) verificaram em um grupo de pacientes esquizofrênicos, após um
período de livre de medicação, que o mesmo apresentava níveis aumentados de glutamato
comparados a controles sadios e que o uso de antipsicóticos atípicos (incluindo olanzapina,
quetiapina e sertindole) elevava esses níveis após 3, 6 e 14 semanas de uso. Esse fato vai ao
encontro de nossos resultados no sentido de que a clozapina também pode ser considerada
um antipsicótico atípico, embora apresente um perfil particular de ação e que nossos
pacientes encontravam-se estabilizados há pelo menos 16 semanas. Infelizmente, não
possuímos dados prévios ao uso da clozapina para comparação. Estudos animais apresentam
significativas evidências de que a clozapina aumenta a transmissão glutamatérgica, quando
comparada com haloperidol, particularmente na região cortical pré-frontal (AEVAVNOV
et al., 1997; DALY e MOGADHAM, 1993; TARAZI et al., 1996; YAMAMOTO et al.,
1994a; YAMAMOTO et al., 1994b). Entretanto, Tortorella et al. (2001) observaram uma
significativa redução dos níveis glutamatérgicos, embora não restaurados até os valores
encontrados em controles normais após introdução de clozapina e uso subseqüente por
pelo menos 12 semanas, o que reforçaria a idéia de um aumento de glutamato nos pacientes
mais graves.
Em suma, como apontado por Heresco-Levy (2003), parece que a eficácia dos
agentes antipsicóticos em uso na prática clínica diária pode ser relacionada, ao menos em
parte, à sua capacidade em modular, direta ou indiretamente, a neurotransmissão
glutamatérgica. Ele embasa esta observação no fato de Gattaz et al. (1985) terem relatado
uma ausência de alterações nos níveis liquóricos de glutamato em pacientes esquizofrênicos
paranóides livres de medicação em comparação com pacientes em tratamento antipsicótico
tradicional, que apresentaram um aumento nesses níveis; e também nos achados de
63
Alfredsson e Wiesel (1990) que descreveram um aumento nos níveis de glutamato em
pacientes responsivos e diminuídos em não-responsivos medicados com o antipsicótico
sulpiride.
Heresco-Levy (2003) afirma que essa observação de uma ação diferencial dos
antipsicóticos atípicos, particularmente a clozapina, sobre a atividade glutamatérgica
comparados aos antipsicóticos tradicionais seria de grande importância para explicar o
melhor desempenho dos atípicos. Essa idéia seria reforçada pelos achados de Goff et al.
(1996) que relataram um aumento significativo dos níveis plasmáticos de pacientes em uso
de clozapina comparados a pacientes em uso de antipsicóticos tradicionais, assim como
observado no presente estudo. Além disso, Evins et al. (1997) demonstraram que a troca de
antipsicóticos tradicionais por clozapina resultava em um aumento de glutamato
plasmático.
Ainda que parte desses achados pareça contraditória entre si, fica clara a
existência de uma alteração nos níveis de glutamato na esquizofrenia, bem como uma ação
diferencial dos antipsicóticos nesses níveis. Estudos animais podem ajudar a entender tais
discrepâncias. Por exemplo, Daly e Moghaddam (1993) descrevem que a administração
aguda de clozapina produz um aumento nos níveis extracelulares de glutamato no córtex
pré-frontal medial, e que a administração aguda de haloperidol não produz as mesmas
alterações. Yamamoto et al. (1994a) por sua vez, também relataram que a administração de
clozapina ou haloperidol por 3 semanas produziu um aumento nos níveis extracelulares de
glutamato no córtex pré-frontal, mas não no caudado-putamen e no núcleo accumbens.
Pietraszek et al. (2002), em um estudo de 6 semanas de administração de clozapina ou
haloperidol, demonstraram uma diminuição dos níveis basais de glutamato no córtex
fronto-parietal no grupo clozapina e um aumento no grupo haloperidol. Assim, parece que
64
o tempo de administração dessas medicações e também as condições clínicas do momento
da medida desses níveis influenciariam o resultado final da mesma, devendo ser
considerados no delineamento do estudo para que se esclareçam essas alterações.
Finalmente quanto aos achados relativos aos pacientes de uma correlação
positiva entre os níveis plasmáticos de serina e glicina, esta seria esperada, uma vez que a
glicina é proveniente da transformação da serina pela SHMT. A ausência de correlações
significativas entre serina e glicina com o glutamato na análise dos dois grupos de pacientes
conjuntamente pode dever-se a mistura de dois grupos com uso de antipsicóticos distintos
(tal idéia é reforçada pelo encontro de correlações entre estes níveis, quando considerando
os grupos isoladamente). Mais difícil é explicar o padrão de correlações encontrado quando
se analisa os grupos de pacientes isoladamente, mas pode ser que o pequeno número de
sujeitos compondo cada grupo e a falta de uma maior variabilidade das doses de medicação
utilizadas tenham contribuído para o mesmo.
Em nosso estudo, foi encontrada uma correlação positiva entre os níveis de
glutamato e os escores da PANSS negativa, assim como nenhuma correlação significativa
entre as outras medidas plasmáticas e os escores da BPRS total e seus fatores ao se analisar
todos os pacientes conjuntamente. Quando os dois grupos de pacientes são separados não
foram observadas correlações significativas quando se examinando apenas o grupo de
pacientes responsivos e também não houve correlação entre os níveis plasmáticos e os
equivalentes de clorpromazina, e nem destes com os sintomas, fossem medidos pela BPRS e
seus fatores, fossem medidos com a PANSS negativa.
Esse achado de uma correlação positiva entre os sintomas negativos medidos
com a PANSS e os níveis de glutamato poderia ser devido a um possível papel neurotóxico
de uma sobrecarga de glutamato, caso a teoria hiperglutamatérgica proposta por Deakin et
65
al. (1989) esteja correta. Ou seja, maiores níveis de glutamato, particularmente em regiões
pré-frontais poderiam gerar uma maior expressão de sintomas negativos e déficits
cognitivos em pacientes esquizofrênicos crônicos, explicando tal achado. Outra
possibilidade é que a clozapina aumente os níveis de glutamato, e como esta é reservada
para uso em pacientes mais graves e, conseqüentemente, mais deficitários, ou seja, com mais
sintomas negativos, seria uma correlação esperada.
Novamente, a ausência de outras correlações entre níveis plasmáticos de
aminoácidos e sintomatologia, bem como com as doses de medicação, diferindo de outros
resultados da literatura (FAUSTMAN et al., 1999; NEEMAN et al., 2005; SUMIYOSHI et
al., 2004), pode dever-se ao número de sujeitos avaliados, bem como às próprias
características clínicas das populações avaliadas neste estudo, conforme apontado por
Sumiyoshi et al. (2004).
A grande inovação deste estudo foi ter incluído pela primeira vez, ao menos em
nosso conhecimento, familiares em primeiro grau de pacientes portadores de esquizofrenia,
tanto de responsivos, quanto de não-responsivos, em um estudo mensurando níveis
plasmáticos de aminoácidos.
Tal idéia surgiu da hipótese de que uma alteração genética responsável pelo
desenvolvimento de esquizofrenia deveria implicar em alterações no metabolismo de
glutamato. Se isso realmente ocorre, seria de se esperar que houvesse uma propensão para
alteração neste mesmo metabolismo em familiares de pacientes esquizofrênicos.
Essa hipótese é reforçada pelos achados de Tibbo et al. (2004), que relataram um
aumento da concentração cerebral de glutamato/glutamina em filhos de pacientes
esquizofrênicos através do uso de espectroscopia de prótons por ressonância magnética.
66
Além disso, Viña et al. (1997) afirmam que o glutamato não atravessa a barreira
hemato-encefálica em quantidades consideráveis em ratos adultos, mas que a permeabilidade
desta barreira em ratos recém-nascidos é maior que a dos adultos, particularmente no
hipocampo e cerebelo. Além disso, não notaram evidências que a exposição aguda a níveis
plasmáticos de glutamato resultasse em danos à barreira hemato-encefálica, mas não
descartam a possibilidade de tal fenômeno ocorrer em situações de exposição crônica.
Partindo
da
idéia
que
a
esquizofrenia
possui
ao
menos
um
componente
neurodesenvolvimental, poderia ser esperado que tanto na gênese, quanto no
desenvolvimento do feto, se ocorresse uma alteração nos níveis plasmáticos da mãe, ou do
próprio feto, isto poderia vir a alterar o seu desenvolvimento cerebral posterior.
Assim, nós selecionamos familiares em primeiro grau de nossos pacientes e
medimos os níveis plasmáticos de serina, glicina e glutamato. Foi encontrado que os níveis
de serina e glicina não diferiram entre os grupos avaliados. Já a comparação entre os níveis
plasmáticos de glutamato apresentou diferenças entre os grupos, com os familiares de
pacientes responsivos apresentando uma diminuição na concentração de glutamato em
relação aos outros dois grupos.
Esse por si só, já é um achado importante, ainda que pese o fato de que seria
esperado encontrar alterações em ambos os grupos de familiares de pacientes. A diminuição
de glutamato em familiares poderia ser utilizada como marcador para o reconhecimento de
pessoas com risco para o desenvolvimento de esquizofrenia. O fato de apenas os familiares
de pacientes responsivos terem esses níveis diminuídos levanta a possibilidade de que a
esquizofrenia que responde ao tratamento antipsicótico tradicional difira da esquizofrenia
não-responsiva. Uma vez que a esquizofrenia é considerada um distúrbio em parte
neurodesenvolvimental, pode ser que esses níveis diminuídos de glutamato, se ocorrerem
67
desde a gestação, facilitariam um desenvolvimento cerebral anormal facilitando o
aparecimento do transtorno, ainda que pese o fato dos pacientes responsivos não
apresentarem em nosso estudo alterações nos níveis de glutamato (embora tal achado possa
ser explicado pelo uso dos antipsicóticos).
O achado negativo em relação aos familiares de esquizofrênicos nãoresponsivos, com os mesmos apresentando níveis de glutamato semelhantes aos controles
sadios não descarta essa hipótese, já que algum outro tipo de alteração cerebral que possa
estar ocorrendo levará no futuro ao aparecimento de sintomas em seus familiares, que não
responderão ao tratamento farmacológico tradicional.
Outra consideração possível seria decorrente do fato de se ter coletado amostra
apenas de um familiar (pai, mãe ou irmão), o que cria a possibilidade de se ter colhido
material apenas de sujeitos que não seriam portadores da carga genética responsável pelos
níveis diminuídos de glutamato.
68
6 CONCLUSÕES
69
Pode-se concluir a partir dos resultados apresentados que pacientes
esquizofrênicos responsivos e não-responsivos em tratamento farmacológico e estabilizados
diferem quanto aos níveis plasmáticos de glutamato e glicina, mas não de serina. Além
disso, pode-se afirmar que diferentes antipsicóticos (haloperidol e clorpromazina) geram
modificações nos níveis plasmáticos de glutamato diversas daquelas observadas com o uso
de clozapina.
Conclui-se também que familiares de pacientes responsivos a antipsicóticos
tradicionais apresentam níveis diminuídos de glutamato quando comparados com familiares
de esquizofrênicos não-responsivos e controles sadios. Esse é um achado importante que
cria possibilidades amplas de investigação que busquem a identificação de marcadores para a
gênese da esquizofrenia e/ou de resposta ao tratamento antipsicótico.
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84
8 APÊNDICES
85
APÊNDICE A – Aprovação do comitê de ética.
86
87
88
89
APÊNDICE B – Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Você está sendo convidado a participar do estudo Nível sérico de glutamato, serina e
glicina em pacientes portadores de esquizofrenia e seus familiares em primeiro grau, que
busca identificar possíveis alterações em pessoas que sejam portadoras de esquizofrenia. Os
avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a sua participação é
importante. O objetivo deste estudo é avaliar os níveis dos aminoácidos glutamato, serina e
glicina no soro de pacientes esquizofrênicos em tratamento com haloperidol e clozapina, de
seus familiares em primeiro grau e compará-los com os níveis séricos de controles sadios.
Caso você participe, será necessária a realização de uma entrevista para confirmar ou excluir
diagnósticos psiquiátricos, bem como medir a intensidade dos sintomas (caso você seja um
paciente). Além disso, você terá que fazer um exame de sangue que permitirá medir os níveis
de glutamato, serina e glicina no mesmo. Tal procedimento não oferece nenhum risco a sua
vida, mas tem o desconforto de receber uma picada de agulha em seu braço.
Você poderá ter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou
retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua
participação no estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a garantia de
que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de sua
responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois você será
identificado com um número.
Dr. Márcio Tiradentes Cunha
Pesquisador Responsável
CRM 29597T
90
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Eu, _________________________________________, li e/ou ouvi o esclarecimento
acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que serei
submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu
entendi que sou livre para interromper minha participação a qualquer momento, sem
justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento. Sei que meu nome
não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro por participar
do estudo. Eu concordo em participar do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
__________________________________________
_______________________
Assinatura do voluntário e/ou seu responsável legal
Documento de identidade
______________________________
_________________________________
Assinatura do pesquisador responsável
Assinatura do pesquisador orientador
Dr Márcio Tiradentes Cunha
Prof. Dr. Jaime E. C. Hallak
CRM 29597T
CRM 71498
Telefone de contato dos pesquisadores: (34) 9994-5535
Em caso de dúvida em relação a esse documento, você pode entrar em contato
com o Comitê Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina do Triângulo
Mineiro, pelo telefone 3318-5854.
91
ARTIGO
TITLE PAGE
SERUM GLUTAMATE, SERINE, AND GLYCINE IN TREATMENT-RESPONSIVE
AND
TREATMENT-RESISTANT
SCHIZOPHRENIA
WITH
SYMPTOM
REMISSION: PSYCHOPATHOLOGICAL CORRELATIONS
Authors:
Marcio Tiradentes Cunha – Uberaba Medical School – Uberaba Minas Gerais –
Brazil
Rosely A. Gomes – Uberaba Medical School – Uberaba – Minas Gerais – Brazil
João Paulo Machado de Sousa – Neurology, Psychiatry and Psychological
Medicine Department – Ribeirão Preto Medical School – University of São Paulo –
Brazil
Serdar M. Dursun – University of Alberta – Edmonton – Canada
Jaime E. C. Hallak – Neurology, Psychiatry and Psychological Medicine
Department – Ribeirão Preto Medical School – University of São Paulo – Brazil
Correspondence author’s address:
Jaime E. C. Hallak
Neurology, Psychiatry and Psychological Medicine Department
Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – Terceiro Andar
Avenida Bandeirantes 3900 – Campus Universitário
Ribeirão Preto – São Paulo – Brazil – ZIP 14048-900
e-mail: [email protected]
ABSTRACT
Since the seminal work by Sackler et al (1954), peripheral amino acid changes
have been extensively reported in schizophrenia, although results remain
inconsistent to date. One of the reasons for the inconsistent data may be related
heterogeneity and poor phenotypic definition of the patients investigated.
Therefore, we measured serum levels of serine, glycine and glutamate in 15
chronic patients with schizophrenia who are treatment responsive and in full
remission and 15 treatment-resistant schizophrenia (TRS) patients treated with
clozapine, and compared the data of both groups to healthy volunteers. Two
psychiatric symptoms scales were used to assess psychopathology. No
differences between groups were found in glycine and serine levels, but serum
glutamate proved increased in treatment-resistant patients. Glutamate increase
correlated with negative symptoms as measured by the PANSS in TRS. These
data suggest that changes in serum amino acid levels may influence the central
glutamatergic transmission in treatment-resistant schizophrenia and play a role in
the persistence of negative symptoms in this group. Furthermore, serum glutamate
levels may be a marker and should indeed be explored to predict treatmentresistance from first episode of the illness.
KEYWORDS
Schizophrenia, glutamate, serine, glycine, clozapine
INTRODUCTION
Schizophrenia is the most heterogeneous mental disorder. The distinct
manifestations of the disease are commonly described in different groups or
dimensions of psychopathology: positive (reality distortion), negative, and
disorganized. The positive syndrome includes psychomotor agitation, dellusions,
and hallucinations; while autism, ambivalence, flat affect, and poor speech, among
others, are representative of the negative syndrome (Javitt e Coyle, 2004). The
disorganization dimension includes symptoms of inappropriate affect, poverty of
content of speech, tangentiality, derailment, pressure of speech, and distractibility
(Andreasen et al, 2005).
As previously mentioned, schizophrenia is a rather heterogeneous condition, a fact
to be considered when discussing the participation of different pathways and
substances in the etiology of the disorder. In around 20-30% of the cases, the
condition does not respond to the intervention with typical antipsychotics (Brenner
& Merlo, 1995). This group comprises mostly male patients and is characterized by
early onset of symptoms, higher number of hospitalizations, and greater social
functioning impairment as compared to other patients (Meltzer et al, 1997; Henna
et al, 1999). Due to these peculiar features, the condition in these cases is named
“treatment-resistant schizophrenia”, according to the fulfillment of three specific
criteria (adaptaded from Kane et al, 1988): “(1) no period of good functioning in
previous five years; (2) prior non-response to at least two antipsychitic drugs of two
different chemical classes for at least 4-6 weeks each at doses ≥ 400 mg
equivalents of chlorpromazine or 5 mg/day risperidone; and (3) moderate to severe
psychopathology, especially positive symptoms: conceptual disorganization,
suspiciousness, delusions or hallucinatory behavior.
Despite poor response to pharmacological treatments, there are no
peripheral markers to predict the patients from first episode who would then be
managed more assertively. Almost all known neurotransmitters have been
implicated in the pathophysiology of schizophrenia (Bachus & Kleinaman, 1996;
Tamminga, 1999)
Regarding the role of glutamate in schizophrenia, we came across two
opposite hypotheses, though not totally contradictory: (i) the hypothesis of
glutamatergic hypofunction and (ii) the hypothesis of glutamatergic hyperfunction
(Dursun & Deakin, 2001).
The hypothesis of glutamatergic hypofunction was first proposed by Kim et al
(1980), who reported that schizophrenics presented low levels of glutamate in the
cerebrospinal fluid, and reinforced by the discovery that NMDA antagonists such
as ketamine could induce psicotomimetic effects in humans (Stempresis, 1996;
Thornberg & Saklad, 1996; Jentsch & Roth, 1999).
The glutamatergic hyperfunction hypothesis was suggested according to the
findings of increased levels of this substance in patients with schizophrenia
(Sackler et al, 1954) and later developed by Deakin et al (1989) based on
neurochemical evidence of an overabundance of glutamatergic synapses in the
frontal cortex of schizophrenics (Deakin et al, 1989; Deakin & Simpson, 1997;
Simpson et al, 1998).
Serine and glycine are co-agonists in the glutamatergic neurotransmission,
which make them of special interest in the study of schizophrenia. Glycine is
biosynthesized from the amino acid serine catalyzed by the enzyme serine
hydroxymethyltransferase and by the GCE (glycine cleavage enzyme). There is a
correlation between seric and liquoric levels of glycine and serine, and between
these levels and schizophrenic symptoms. Nonetheless, findings concerning the
levels of these substances are controversial, with reports of increase, decrease, or
even even absence of alterations (Sumiyoshi et al, 2004).
In this context, studies have shown that low glycine levels are implicated in
the appearance of negative symptoms, and that the association of glycine in the
antipsychotic treatment results, indeed, in improvement of these symptoms. These
results support the hypoglutamatergic hypothesis of the disorder and the idea that
D-Serine, a serine isomer precursor to glycine, might be a peripheral marker of
schizophrenia (Sumiyoshi et al, 2004).
Serine is the most widely investigated amino acid in psychosis (Tortorella et
al., 2001). Waziri et al (1993) reported increased serine levels in the blood and in
the brain of schizophrenic patients. Macciardi et al (1990) also found increased
plasma serine, but differently from Waziri et al (1985), these investigators have not
suggested that such increase can be considered a psychosis biological marker per
se.
Accordingly, the present study quantified the amino acids glutamate, serine,
and glycine in the plasma of treatment-responsive and treatment-resistant
schizophrenic patients on clozapine, in an attempt to identify possible differences
in the characterization of these two patient groups.
MATERIAL AND METHOD
The Structured Clinical Interview for the DSM-IV (SCID-IV; First et al, 1997)
was used for diagnostic purposes. Treatment-resistant schizophrenics (TRS) were
defined as those who fulfilled the above mentioned criteria and who, for presenting
no clinical response to at least two antipsychotics, were on clozapine (150-850
mg/day). Another group comprised patients who presented clinical response to
typical neuroleptics, and was defined as ‘treatment-responsive schizophrenia’
(TRes).
Both experimental groups comprised only schizophrenic patients regarded
as in remission. The concept of symptom remission has been object of debate in
the last decade, and on 2003 a working group was formed to develop a
standardized set of remission criteria to be used in clinical and research settings.
According to the group’s conclusions, remission can defined through widely used
symptom scales with individual items scored as mild or less (Positive and Negative
Syndrome Scale – PANSS ≤3; Brief Psychiatric Rating Scale – BPRS ≤3; Scale for
the Assessment of Positive Symptoms – SAPS and Scale for the Assessment of
Negative symptoms – SANS ≤2), sustained for a period of six months (Andreasen
et al., 2005).
A total of 60 volunteers took part in the study, enrolled in three different
groups as follows: 15 patients with schizophrenia in treatment with traditional
antipsychotic medications (TRes); 15 patients with schizophrenia in treatment with
clozapine (TRS); and 30 healthy controls matched one by one with the patient
groups in terms of age and gender. The inclusion criteria used were: age between
18 and 50 years, both genders, and use of medications corresponding to the TRes
and TRS groups.
The patients were select from those in follow-up at the Mental Health Outpatients Clinics of the University Hospital of Uberaba Medical School or at the
Resistant Schizophrenia Out-Patient Clinics of the General Hospital of the Ribeirão
Preto Medical School. The healthy controls were select at the vicinities of the
patients and were select on an individual basis. All patients and their relatives
signed the informed consent, so the controls. The research protocl was aproved by
the local Ethics Committee.
Blood samples (10ml) were collected from all groups after a 12-hour fast
and analyzed through the chromatography method by quantification and
comparison of serine, glycine, and glutamate levels. During the experimental
sessions patients were evaluated with the BPRS and the negative subscale of the
PANSS (PANSS-N).
Chromatography procedure
The samples were allowed to coagulate at room temperature and the plasma
was separated by centrifugation at 3.500 rpm for 10 minutes. The supernatant
liquid was separated, aliquoted and stored at –20ºC until assayed for. Samples
(0,2 ml) were prepared by the addiction of trichloroacetic acid (Merck) (0,2ml) of
5%, kept at 04ºC for 10 minutes and e centrifuged at 14.000 rpm. An identical
procedure was performed with the samples after addiction of 250umol of the amino
acid Norleucine (internal standard). The samples were neutralized using a solution
of Li(OH)3 (Merck) 4 M. At last, the amino acid analyses were performed with the
use of an octadecylsilane column (Lichrospher, 4,6 x 125mm, Merck) equilibrated
in methanol (Carlo Erba, HPLC Degree) of 20 % in a sodium citrate tampon/buffer
0,1 M, pH 6,5 and eluted with a methanol gradient of 100%. The pre-derivation with
o-phthalaldehyde (Sigma) was performed according to Burbach et al (1982).
The statistical analyses were performed using the statistical package SPSS,
version 11.0 (SSPS - Incorporation, 2001) and the serum levels of the different
groups were analyzed by analyses of variance. Tukey’s test was used for the posthoc analysis. Correlations between clinical data and amino acids levels were
analyzed through Pearson´s correlation coefficient.
RESULTS
The amino acid quantifications in both patient groups, the first on traditional
antipsychotics and the second on clozapine, are detailed on the table below, along
with the clinical-demographic characteristics of the groups.
INSERT TABLE 1
No significant differences were found in the levels serine in treatmentresponsive and resistant patients when compared with healthy controls. Regarding
glycine levels, it was found an increase in TRes compared to TRS and controls
(Table 2). In relation to glutamate, significant increases (p ≥ 0,05) were observed in
TRS compared to controls and TRes (Table 2).
INSERT TABLE 2
The correlation analysis involving the two groups of patients showed only a
positive correlation between glutamate serum levels and intensity of negative
symptoms assesses by the PANSS-N (R = 0,401; p = 0,028). The same analysis
involving the data of the BPRS did not reveal any significant correlations.
DISCUSSION
We opted, in this work, for the collect of peripheral blood in the face of the
ethical complexities involved in the serial collect of CSF.
Analyzing the available findings related to serine levels, there is no
consonance among the different investigators. Baruah et al (1993), Altramura et al
(1993), and Neeman et al (2005), among others, obtained findings which are
similar to those of the present study; while Carl et al (1992), Fekkes et al (1994),
Sumiyoshi et al (2004), and others reported divergent findings. To Sumioshy et al
(2004), what most of these authors regard as the source of such disagreement are
methodological issues, particularly sample size and use of medications. In this
point of view, Carl et al (1992) affirm that there is some disagreement in the
literature concerning the use of plasma serine concentrations as a biological
marker for psychoses including schizophrenia. Using the same methodology (high
pressure liquid chromatography) than Carl et al (1992), we also did not find
difference in plasma serine concentrations when comparing schizophrenia patients
and a well-matched sample of healthy volunteers.
Regarding the plasma glycine, increased levels in comparison with controls
have been reported by Baruah et al (1993), and decreased levels were found by
Neeman et al (2005) and Sumioshy et al (2004). Baruah et al (1993) support that
the use of antipsychotics decreases the levels of this amino acid. Conversely,
Neeman et al (2005) did not replicate these findings in a study that also included
patients on clozapine. The groups of Neeman et al (2005) and Sumioshy et al
(2004) correlated the findings with the expression of negative symptoms by the
patients, showing that decreased glycine availability may be related to the
pathophysiology of negative symptoms. In addition, Sumiyoshi et al (2005) found
that the levels of glycine, serine, and their ratio were predictive of the SANS after
six weeks in treatment with clozapine, indicating the association of the
concentration of these amino acids with response to clozapine in terms of negative
symptoms.
One possibility for this discrepancy between our results and the above
mentioned ones could be the fact that our patients were all in remission, which
could also explain the absence of a correlation between this amino acid and
negative symptoms. Another possibility could be that, since most studies did not
differentiate between TRes and TRS, antipsychotic answer is a confound factor. A
third possibility is related to the choice of controls, which was really strict, being
chosen a control for each patient in his/her vicinities. A final explanation could be
that th CNS after chronic treatment with neuroleptics could rearrange its own
neurotransmission, correcting the acute lowering effects of neuroleptic described
by Baruah et al (1993).
The quantification of glutamate plasma levels in patients and controls
presented differences among the three groups, with higher concentrations in
patients with treatment-resistant schizophrenia.
Such increased concentrations of peripheral glutamate could be explained
by the hypothesis that a glutamatergic hyperfunction occurs in schizophrenia,
secondary or not to specific deficiencies in NMDA transmission. This could be due
to the apparent correlation between plasma and brain levels of excitatory amino
acids (Alfredsson et al, 1988; Sumiyoshi et al, 2004).
The results of a positive correlation between glutamate and the PANSS-N
are in accordance with those described by Sumiyoshy et al (2004/05), which allows
us to assume that the decrease in the levels of glycine in those studies might have
been compensatory to a possibly increased glutamate levels as found in our study,
or vice-versa.
Another possible explanation for this could be the use of antipsychotic
medications. As mentioned elsewhere, traditional antipsychotics, especially
haloperidol, have a tendency to decrease liquor glutamate levels (Labarca et al,
1995), the same being true for atypical antipsychotics, including clozapine.
In their study, Van der Heijden et al (2004) found that a group of
schizophrenic patients submitted to a medication-free period presented increased
glutamate levels compared to healthy controls, and that the use of atypical
antipsychotics (including olanzapine, quetiapine, and sertindole) elevated these
levels after three, six and 14 weeks. This finding differs from our results in the
sense that clozapine, though being considered as an atypical antipsychotic,
presents a particular action profile, and that our patients had been stable for at
least 16 weeks. Unfortunately, no data prior to the use of clozapine were available
for comparison. In summary, as pointed out by Heresco-Levy (2003), it seems that
the efficacy of antipsychotic agents in the daily clinical practice might be related, at
least in part, to their capacity to indirectly or directly modulate the glutamatergic
neurotransmission. Goff et al (1996) reported a significant increase in glutamate
plasma levels in patients on clozapine, compared to patients using traditional
antipsychotics, exactly as found in the present study. Additionally, Evins et al
(1997) demonstrated that the change from traditional antipsychotics to clozapine
resulted in increased plasma glutamate. Alternatively, Tortorella et al (2001) found
a decrease of glutamate plasma levels after introduction of clozapine in resistant
schizophrenia patients, although this decrease was unsufficient to reach similar
blood levels as those seen in controls. Even though a part of these findings may
sound contradictory, the existence of alterations in glutamate plasma levels in
schizophrenia is clear, as well as a differential action of antipsychotics over such
levels.
These data suggest that changes in serum amino acid levels may influence
the central glutamatergic transmission in treatment-resistant schizophrenia and
play a role in the persistence of negative symptoms in this group. Furthermore,
serum glutamate levels may be a marker and should indeed be explored to predict
treatment-resistance from first episode of the illness.
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Table 1: Clinical and demographic data
Group
Sex
Age
Male Female (+/- SD)
Responsive
33.46
Schizophrenia
8
7
(13.74)
(TRes)
Resistant
Schizophrenia
(TRS)
11
Control
19
4
11
36.20
(8.05)
35.47
(9.95)
Medication
(range mg/day)
Haloperidol
Chlorpromazine
(15 mg/day) (300-400 mg/day)
11
Schizophrenia subtype
F-20.0
F-20.3 F-20.1
12
3
0
7
4
4
NA
NA
NA
4
Clozapine
(150-850 mg/day)
15
NA
Table 2: Plasma levels of amino acids +/- SD (nmol/mL)
Responsive
Resistant Schizophrenia
Amino Acid
Schizophrenia (TRes)
(TRS)
81.61 (20.31)
92.19 (27.31)
Serine
200.60 (56.69)
147.06 (75.99)
Glycine
187.95
(126.79)
331.83
(98.73)
Glutamate
Control
F; p
89.49 (14.40)
157.30 (47.82)
241.50 (49.17)
F2,58=1.206; p=0.307
F2,58=3.796; p=0.028
F2,58=10.585; p<0.001

márcio tiradentes cunha nível sérico de glutamato, serina e glicina

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