EFFECT OF OBESITY ON P2X2 RECEPTOR AND

D3-EFEITO DA OBESIDADE SOBRE O RECEPTOR P2X2 E O CÓDIGO
QUÍMICO NOS NEURÔNIOS MIOENTÉRICOS DE CAMUNDONGOS
MACHOS E FÊMEAS (ob/ob).
MIZUNO1, Marcia Sanae; VELLOSO2, Licio Augusto; CASTELUCCI3,
Patricia.
E-mail: [email protected]
1- Professora Doutora, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM),
Centro de Ciências da Saúde, Departamento de Morfologia, Santa Maria RS.
2- Professor Doutor, Universidade de Campinas (Unicamp), Faculdade de
Ciências Médicas, Departamento de Clínica Médica, Campinas – SP.
3- Professora Doutora, Universidade de São Paulo (USP), Instituto de
Ciências Biomédicas, Departamento de Anatomia, São Paulo - SP.
Resumo
Grande número de sintomas gastrintestinais estão associados com a
obesidade. Este trabalho avaliou o efeito da obesidade sobre a expressão do
receptor P2X2 e nas classes funcionais dos neurônios mioentéricos do íleo
de camundongos machos e fêmeas (ob/ob). Íleos dos camundongos
C57BL/6J controle (CM, CF) e obeso (OBM, OBF) foram imunomarcados
para o receptor P2X2/NOS (óxido nítrico sintase – inibitórios), ChAT (colina
acetiltransferase - excitatório) ou Calr (calretinina - excitatório e sensorial).
Resultados de CF/OBF: A imunomarcação do receptor P2X2, NOS, ChAT e
Calr foram detectados nas membranas celular e nuclear, e no citoplasma
neuronal de ambos os grupos. A densidade dos neurônios receptor P2X2
aumentou 62%, e dos neurônios NOS e ChAT diminuíram 49% e 57%. A
área do perfil celular aumentou 20% e 55% nos neurônios ChAT e Calr, os
neurônios NOS tenderam a diminuição em 34% e os neurônios P2X2 não
apresentaram mudanças nesta característica. Resultados de CM/OBM: A
expressão do receptor P2X2 foi identificado somente nos neurônios do grupo
CM e a imunomarcação ao NOS, ChAT e Calr foram observados nos dois
grupos. A densidade dos neurônios NOS e Calr diminuíram 31% e 16%,
enquanto que a população ChAT aumentou 31%. Os neurônios Calr
exibiram morfologia Dogiel tipos I e II, e houve diminuição de 20% na
densidade dos neurônios Dogiel I. No OBM, o Western Blotting mostrou
redução de 36% na expressão proteica do receptor P2X2. Podemos inferir
que neste modelo experimental (C57BL/6J ob/ob) a obesidade e o gênero
podem contribuir com a atividade intestinal diferenciada.
Palavras-chave: receptor P2X2, mioentérico, obesidade
Introdução
Estudos relacionados com os sintomas gastrintestinais em indivíduos
com sobrepeso e obesos têm sido muito limitados. A prevalência global da
obesidade foi verificada em estudos de revisão, onde foram analisados
trabalhos relatando um grande número de sintomas gastrintestinais
significativamente associados com aumento do índice de corporal (IMC)1,2.
Considerando que as purinas influenciam na motilidade gastrintestinal (GI)3,
uma clara caracterização dos diferentes subtipos de receptores P2
envolvidos tem sido estabelecido3,4. Trabalhos do presente laboratório tem
demonstrado alterações no código químico dos neurônios entéricos de ratos
submetidos à desnutrição e renutrição protéica imunorreativos ao receptor
P2X2 no íleo5 e receptores P2X2 e 7 no colo distal6. Além disso, estudos
envolvendo modelo de ratos submetidos à isquemia/reperfusão intestinal7,8
têm demonstrado modificações no receptor P2X2 e no receptor P2X7. Este
trabalho teve como objetivo demonstrar o efeito da obesidade sobre os
neurônios do plexo mioentérico imunorreativos ao receptor P2X2 e seu
código químico nos neurônios imunorreativos à NOS, ChAT e Calr.
Materiais e métodos
Neste estudo foram utilizados camundongos homozigotos obesos
C57BL/6J (ob/ob) e camundongos homozigotos controle C57BL/6J(+/+) de
ambos os sexos com idade de 12 meses. Os camundongos foram divididos
em grupos de acordo com a tipagem genética e sexo: controle macho (CM),
obeso macho (OBM), controle fêmea (CF) e obeso fêmea (OBF). Após a
coleta do segmento ileal, este foi submetido à fixação para posterior
dissecação e confecção dos preparados de membranas. As membranas
foram submetidas ao método imuno-histoquímico de duplas-marcações
usando as combinações dos anticorpos do receptor P2X2 e NOS, ChAT ou
Calr. As densidades dos neurônios imunorreativos (neurônios/cm2) ao
receptor P2X2, NOS, ChAT e Calr no plexo mioentérico, bem como a área do
perfil neuronal, a classificação morfológica em neurônios Dogiel tipo I e II e
sua densidade foram obtidas. O Western Blotting foi utilizado para avaliar a
expressão protéica do receptor P2X2 e todos os dados obtidos foram
estatisticamente comparados empregando-se o teste t de Student ao nível
de significância p<0,05.
Resultados e Discussão
A imunomarcação à NOS, ChAT e Calr foram observadas nas
membranas celular e nuclear, e no citoplasma dos neurônios de todos os
grupos, como verificado em outras espécies animais4,9. No entanto, a
expressão do receptor P2X 2 foi identificado apenas nos grupos CF, OBF e
CM. O subtipo receptor P2X 2 foi identificado em neurônios motores
musculares inibitórios e neurônios sensoriais intrínsecos, e que juntos,
perfazem cerca de 40% dos neurônios do plexo mioentérico4. Em nosso
estudo, a obesidade nos animais fêmea promoveu aumento significativo de
62% na densidade dos neurônios imunorreativos ao receptor P2X 2 . No
macho, a expressão do receptor P2X 2 foi identificada somente no grupo
controle.
A densidade das populações de neurônios inibitórios e excitatórios da
camada muscular, imunomarcados com NOS e ChAT, apresentaram no
grupo OBF diminuição significante de 49% e 57%, respectivamente; no
grupo OBM foi constatado uma redução de 31% na densidade de neurônios
NOS e os neurônios ChAT demonstraram um aumento significativo em 31%.
Diminuição na expressão da NOS neuronal em segmentos do trato
gastrintestinal tem sido verificado em camundongos obesos diabeticos10.
A população de neurônios imunomarcados à Calr apresentou uma
diferença de apenas 2% entre os grupos CF e OBF, não detectando
diferença estatística significante. No grupo OBM foi observada redução
significante de 16,5% em comparação ao seu controle (CM). A Calretinina é
encontrada em três classes neuronais no íleo de cobaia, denominado
neurônios colinérgicos excitatórios inervando o músculo longitudinal,
interneurônios ascendentes no plexo mioentérico, e neurônios
secretomotores/vasodilatadores colinérgicos com corpos celulares no
gânglio submucoso11.
Mudanças na área do perfil neuronal em diferentes classes funcionais
foram observadas em protocolos de desnutrição5,6 e inflamação provocada
pela isquemia e reperfusão7,8. No presente trabalho as áreas do perfil celular
do grupo OBF em neurônios receptor P2X 2 imunomarcados apresentaram
diferenças de 3,2% e nos neurônios NOS foi observada uma tendência à um
aumento em 33,6%, porém não significativa. Os neurônios ChAT e Calr
apresentaram aumento significativo de 20,3% e 55% em relação ao seu
controle (CF). A análise da área do perfil mostrou que os neurônios
imunorreativos ao receptor P2X 2 no grupo CM foi de 436,7±190μm2. E que a
obesidade nos machos não promoveu alterações morfológicas significante
nos neurônios mioentéricos imunomarcados.
Como os neurônios imunomarcados pela Calr apresentam diferentes
morfologias9 foi realizada a avaliação morfológica baseada na classificação
em Dogiel tipos I e II, os quais neurônios que apresentaram morfologia
Dogiel I são neurônios motores excitatórios e os Dogiel tipo II são neurônios
sensoriais (IPANs)11. Apesar da densidade dos neurônios Dogiel tipos I e II
terem apresentado tendência à diminuição, no grupo OBF, em 9,1% e 17,3%
a análise estatística não demonstrou diferença significante entre os grupos.
No grupo OBM, a população de neurônios Dogiel tipo I apresentou
diminuição significativa de 20,4% e os neurônios Dogiel tipo II indicou
tendência à diminuição de 15,3%.
Devido à detecção da imunorreatividade ao receptor P2X 2 nos
neurônios mioentéricos não ter sido evidente no grupo OBM, realizamos a
técnica do Western Blotting. O resultado demonstrou uma redução
significativa de 36% nos níveis de expressão protéica deste receptor na
porção distal do íleo (62,8±5,3%, p<0,05) em relação aos animais do grupo
CM (98,9±6,0%).
Conclusões
Neste modelo experimental tanto a obesidade (C57BL/6J ob/ob) como
os gêneros podem contribuir com a modificação na expressão do receptor
P2X 2 , na densidade e morfologia dos neurônios NOS, ChAT e Calr, os quais
podem conduzir a alterações na atividade funcional normal do trato
gastrintestinal.
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