Propriedades estruturais e morfológicas de nanoestruturas de

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
PROPRIEDADES ESTRUTURAIS E MORFOLÓGICAS DE
NANOESTRUTURAS DE PEPTÍDEOS
BRUNO BARROS CUNHA
Santo André
(06/2011)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
PROPRIEDADES ESTRUTURAIS E MORFOLÓGICAS DE
NANOESTRUTURAS DE PEPTÍDEOS
BRUNO BARROS CUNHA
Dissertação apresentada à Universidade Federal do ABC, para a obtenção do título de Mestre
em Nanociências, junto ao programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Nanociências e
Materiais Avançados área de concentração Materiais Funcionais.
Orientador: Prof. Dr. José Antonio Souza
Co-orientador: Prof. Dr. Wendel A. Alves
Santo André
(06/2011)
Dedico esta dissertação ao meu filho, Pedro Arthur
Agradecimentos
Gostaria de agradecer em primeiro lugar e acima de tudo a Deus, pois me iluminou por toda
esta caminhada que enfrentei, mostrando as saídas para todos os obstáculos colocados em
minha vida. Sempre abençoando a mim e minha família. Deus eu te agradeço!
Agradeço em especial a minha família que perseverante acreditou e me apoiou em todas
minhas decisões, me dando forças para lutar. Por suas orações e palavras acolhedoras de
carinho materno, de coração a minha mãe Iraneide Barros Cunha e também ao meu pai
Francisco Carlos Sousa Cunha mesmo que com poucas palavras ou quase sem, pelos seus
pensamentos positivos. O fruto da boa educação me levou a novos horizontes, um novo
mundo... Agradeço isto aos meus pais. Aos meus irmãos Hugo Leonardo Barros Cunha e
Eliza Gabriela Barros Cunha pelos laços de amizade e carinho eu os agradeço. Ao meu filho
Pedro Arthur com suas palavrinhas de carinho e saudades motivaram a dar continuidade aos
meus estudos.
De forma direta no trabalho, agradeço:
Ao prof. José Antonio Souza pela orientação e contribuição para o desenvolvimento e término
deste trabalho;
Ao prof. Wendel A. Alves pela co-orientação e oportunidade em trabalhar em seu laboratório,
vital para iniciar o desenvolvimento deste trabalho.
Ao prof. Fábio Furlan Ferreira, pelos conhecimentos transmitidos e pela ajuda direta nos
refinamentos dos dados de difração de raios-x, assim como sua amizade.
A instituição de fomento CAPES pelo apoio financeiro, assim também ao programa de pósgraduação em Nanociências e Materiais Avançados da Universidade Federal do ABC pela
oportunidade da realização do mestrado, contribuindo para minha formação acadêmica.
Agradeço também a Dra. Sonia Tomie Tanimoto pela ajuda nas interpretações e pela amizade.
Por fim, mas não o menos importante aos meus amigos de república em especial ao Gustavo
Lessa e Júlio Ximenes. Aos amigos de mestrado Eduardo de Souza e Thiago Cipriano. E
todos os amigos de laboratório que aqui não foram citados, eu os agradeço pela convivência e
amizade, assim como todos aqueles amigos que de forma direta ou indireta contribuíram na
minha vida...
“Não tentes ser bem sucedido, tenta antes ser um homem de valor”
Albert Einstein
RESUMO
Neste trabalho foi realizado um estudo das propriedades térmicas e estruturais em
amostras envolvendo nanoestruturas de L-difenilalanina. A preparação das amostras foi
realizada em função da variação do pH da solução e introdução de íons de metal de transição
(Fe) presentes no composto conhecido como microperoxidase 11 (MP11). Estudos obtidos
através de difração de raios X revelam que esse sistema se cristaliza em uma estrutura
hexagonal com grupo de simetria P61. Propriedades estruturais, estudadas através do
refinamento Rietveld, sugerem que os parâmetros estruturais não sofrem alterações
significativas com a variação do pH 3, 7 e 12. A intercalação do composto MP11 na
nanoestrutura de peptídeo foi realizada em pH 7. Foram produzidas duas amostras dopadas
com concentrações distintas de MP11 (0, 744 mg/L e 1,488 mg/L). Os resultados obtidos
através de refinamentos Rietveld, sugerem que a introdução de MP11 resulta em um aumento
dos parâmetros de rede a e b e uma diminuição do parâmetro c. Amostra de peptídeo puro
possui parâmetros a = b = 24,1650(9) e c = 5,580(1). Amostra de peptídeo com 0,0744 mg/L
de MP11 possui parâmetros a = b = 24,2080(1) e c = 5,470(4). Amostra de peptídeo com
1,488 mg/L de MP11 possui parâmetros a = b = 24,2099(9)e c = 5,4798(3). Estas amostras se
auto-estruturam formando canais com diâmetros da ordem de 10 Å.
Estudos teóricos sobre a influência da presença de moléculas de água na formação de
nanotubos impulsionaram a realização de estudos em função de tratamentos térmicos.
Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura indicaram que não ocorreram
alterações significativas quanto à morfologia com o aumento da temperatura de tratamento
térmico. Análises termogravimétricas e calorimetria diferencial de varredura indicam
temperaturas críticas relacionadas à perda de material e também a uma transição de fase
estrutural. Foi realizado um estudo sistemático das propriedades estruturais destas amostras
através de difração de raios X e espectroscopia de infravermelho. O grupo de simetria na qual
a amostra se cristaliza depois da transição foi identificado e a estrutura cristalina resolvida.
Através dos resultados obtidos pelo refinamento Rietveld dos dados de difração de raios X foi
possível confirmar a transição estrutural da fase hexagonal P61 para a fase ortorrômbica Pba2.
Esta transição estrutural ocorre na temperatura crítica de 136 °C, corroborando os resultados
de calorimetria diferencial de varredura. Os principais modos de vibração do composto de Ldifenilalanina foram identificados através da espectroscopia de infravermelho. Através da
identificação das conformações β-sheet e β-turn um melhor entendimento da estrutura
cristalina após a transição de fase foi alcançado. Os resultados sugerem fortemente que estes
microfios/microfitas são formados por estruturas tubulares (amostras tratadas termicamente
em baixas temperaturas) ou por estruturas continuas (amostras tratadas termicamente em altas
temperaturas). As estruturas tubulares estariam associadas à fase hexagonal e a estrutura
continua (do tipo bulk) à fase cristalográfica ortorrômbica.
Palavras-chave: nanoestruturas de L-difenilalanina, transição estrutural, microperoxidase 11,
DRX e FTIR.
ABSTRACT
A systematic study of the thermal and structural properties of samples obtained from
nanostrutuctures of L-difenilalanina is presented. The samples preparation were prepared as a
function of both pH of the solution and the introduction of transition metal ions (Fe) with is
found in a compound (C84H16FeN20O21S2) known as microperoxidase 11 (MP11). Analyses
obtained through X-ray diffraction indicate that this system crystallizes into hexagonal
structure with space group symmetry P61. Structural properties studied by Rietveld
refinement suggest that the structural parameters do not change significantly with the
variation of pH 3, 7 and 12. The intercalation of MP11 into peptide nanostructure was
performed at pH 7. We have produced two samples doped with different concentrations of
MP11 (0.744 mg/L and 1.488 mg/L). The results suggest that the introduction of MP11 results
in an increase of the cell parameters a and b as well as decrease of c. MP11 free peptide
sample shows cell parameters a = b = 24.1650(9) and c = 5.580(1). Samples with 0.0744
mg/L of MP11 have a = b = 24.2080(1) and c = 5.470(4) and with 1.488 mg/L of MP11, a = b
= 24.2099(9) and c = 5.4798(3). These samples are self-assembly forming channels with
diameters of around 10 Å.
Theoretical studies on the influence of the presence of water molecules in the formation
of nanotubes motivated studies as a function of heat treatments. Images obtained by scanning
electron microscopy indicated that there were no significant changes in their morphology with
increasing annealing temperature. Differential scanning calorimetry and thermogravimetric
analysis indicate critical temperatures related to the loss of material and also to a structural
phase transition. We conducted a systematic study of the structural properties of these samples
by x-ray diffraction and infrared spectroscopy. The symmetry group in which the sample is
crystallized when the system undergoes a structural transition was identified and the crystal
structure has been solved. From the results obtained by Rietveld refinement of X-ray
diffraction data a structural transition from hexagonal P61 to orthorhombic PBA2 phase was
corroborating the results of differential scanning calorimetry. The main vibration phonon
modes of the compound L-difenilalanina were identified by infrared spectroscopy. Through
the identification of β-sheet and β-turn conformation a better understanding of the crystalline
structure after the phase transition was achieved. The results strongly suggest that these
microwires/microribbons are formed by tubular structures (samples annealed at low
temperatures) or continuous structures (samples annealed at high temperatures). The tubular
structures may be related to the hexagonal phase and the bulk-like continue structure (bulk) to
the orthorhombic crystallographic phase.
Key-words: L-difenilalanina nanostructures, structural transition, microperoxidase 11, XRD
and FTIR.
.
Índice
CAPÍTULO 1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................... 1
1.1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
1.2. FORMAÇÃO DE NANOTUBOS DE PEPTÍDEO ........................................................ 2
1.3. CONFORMAÇÕES EM PEPTÍDEOS ........................................................................... 6
1.4. OBJETIVOS DO TRABALHO ...................................................................................... 9
CAPÍTULO 2- TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ........................ 10
2.1. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS ................................................................................ 10
2.2. ANÁLISE TÉRMICA ................................................................................................... 12
2.2.1. Análise Termogravimétrica ............................................................................... 12
2.2.2. Calorimetria Diferencial de Varredura .............................................................. 14
2.3. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA .................................................. 15
2.4. DIFRAÇÃO DE RAIOS X ........................................................................................... 16
2.5. ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO ........................................................... 18
CAPÍTULO 3- RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 22
3.1. NANOESTRUTURAS DE L-DIFENILALANINA ..................................................... 22
3.2. INTERAÇÃO DA MP11 EM NANOESTRUTURAS DE L-DIFENILALANINA .... 30
3.3. TRANSIÇÃO DE FASE ESTRUTURAL INDUZIDA PELA TEMPERATURA ....... 33
3.3.1 Propriedades Térmicas ....................................................................................... 33
3.3.2 Propriedades Morfológicas ................................................................................ 39
3.3.3 Propriedades Estruturais .................................................................................... 45
3.3.3.1. Difração de Raios X ................................................................................. 45
3.3.3.2. Espectroscopia de Infravermelho ............................................................ 55
CAPÍTULO 4- CONCLUSÃO .............................................................................................. 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 64
Lista de Abreviações
DMSO
Dimetilsulfóxido
DRX
Difração de raios X
DSC
Calorimetria Diferencial de Varredura, do inglês: Differential Scanning
Calorimetry
FF
L-Fenilalanina-L-Fenilalanina
FL
L-Fenilalanina-L-Leucina
FW
L-Fenilalanina-L-Triptofano
FTIR
Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier, do
inglês: Fourier Transform Infrared Spectroscopy
HFP
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol
IPEN
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares
LF
L-leucina-L-fenilalanina
LL
L-leucina-L-leucina
LNLS
Laboratório Nacional de Luz Síncrotron
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
MPs
Microperoxidases
MP11
Microperoxidase 11
NTPs
Nanotubos de Peptídeos
PSD
Detector sensível à posição
TGA
Análise Termogravimétrica do inglês: Thermogravimetric Analysis
TGD
UV-Vis
Termogravimetria Derivada
Espectroscopia na região do Ultra Violeta – Visível
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1.1: O empacotamento molecular e cela unitária de nanoestruturas de dipeptídeos.
Encontram-se estruturas do tipo hexagonal (FF), ortorrômbica (FL e LL) e tetragonal (WG)
[17]. .............................................................................................................................................. 3
Fig. 1.2: (a) Fórmulas estruturais da L-difenilalanina. (b) Estrutura tridimensional da FF
[14]. .............................................................................................................................................. 3
Fig. 1.3: Modelo arbitrário para a construção das fibras de FF. Átomos das cadeias
principais do dipeptídeo são coloridos de acordo com o tipo de átomo, enquanto os átomos
nas cadeias laterais fenilalanina estão representados em laranja. (a) Tubo com um diâmetro
exterior 110nm e 50nm de diâmetro interior. O quadrado branco indica a parte ampliada (b)
apresentando um modelo da interface do canal de peptídeo na superfície interna. O
retângulo representa a visão detalhada dada em (c) uma representação de varas fechadas
com átomos que constituem a superfície dos poros preenchidos [14]. ........................................ 4
Fig. 1.4: Conjunto de peptídeos mediados por um complexo de rênio [21] ............................... 5
Fig. 1.5: a) Representação esquemática da formação do nanotubo de peptídeo de
monômeros de peptídeo cíclico. b) camada única porosa montada pela coluna de peptídeos
dendríticos [21]. ........................................................................................................................... 5
Fig. 1.6: Vistas esquemáticas de hélices α. (A) Um modelo em esferas e bastões. (B) Uma
representação em fita. (C) Uma representação cilíndrica [32]. ................................................... 7
Fig. 1.7: (A) As cadeias laterais (verdes) situam-se alternadamente acima e abaixo do
plano da fita. (B) Fitas β adjacentes estendem-se em sentidos opostos, ligações de
hidrogênio entre grupamentos NH e CO conectam cada aminoácido em uma fita adjacente,
estabilizando a estrutura. (C) Fitas β adjacentes estendem-se no mesmo sentido, ligações de
hidrogênio conectam cada aminoácido em uma fita com dois diferentes aminoácidos na fita
adjacente. (D) Com mais diversidade estrutural do que as hélices α, as folhas β podem ser
quase planas, mas a maioria adota uma forma um pouco retorcida [32] ..................................... 7
Fig. 1.8: Estrutura de volta reversa (β-turn). O grupamento CO do aminoácido i da cadeia
peptídica faz ligação de hidrogênio com NH do aminoácido i+3, estabilizando a volta.
Esferas em branco e cinza representam os átomos de hidrogênio e carbono,
respectivamente. A cadeia lateral, amina (NH3) e carboxila (COO-) são representadas pelas
esferas verde, azul e vermelha, respectivamente [32].................................................................. 8
Fig. 2.1: Fluxograma descritivo da rota de síntese fase-líquida............................................... 10
Fig. 2.2: Microperoxidase 11 (MP11), segmento do citocromo c do coração do cavalo [40]....11
Fig. 2.3: Esquema do aparato (eletrobalança) para a análise termogravimétrica (TGA) ......... 13
Fig. 2.4: Curva DSC para os processos endotérmicos e exotérmicos ...................................... 14
Fig. 2.5: Difração de raios X por planos do cristal [48]. ........................................................... 16
Fig. 2.6: Efeito do tamanho de pequenas partículas em curvas de difração. ........................... 17
Fig. 2.7: Classificação dos seis tipos de modos de vibração moleculares. .............................. 19
Fig. 2.8: Esquema dos níveis de energia para o espectro no infravermelho. ........................... 21
Fig. 3.1: Difratograma em alta resolução de amostra de peptídeo preparada em solução
com pH 7, refinado pelo Método Rietveld. O símbolo x representa a curva observada
experimentalmente (observado), a curva em vermelho representa o modelo (calculado), a
curva em azul representa a diferença entre as curvas experimental e teórica (diferença) e
traços em magenta representam as posições angulares das reflexões permitidas pela fase
cristalográfica ........................................................................................................................... 23
Fig. 3.2: Refinamento Rietveld dos difratogramas de amostras de peptídeos preparadas em
solução com pH 3 (painel à esquerda) e pH 12 (painel à direita). ............................................ 24
Fig. 3.3: Painel à esquerda mostra a molécula de difenilalanina. Painel à direita mostra a
cela unitária formada por seis moléculas de difenilalanina. Ambos os painéis tratam de
amostras em pH 7. Os átomos de oxigênio, nitrogênio, carbono e hidrogênio são
representados por esferas em vermelho, azul, cinza e brancas, respectivamente ..................... 26
Fig. 3.4: Painel à esquerda mostra a formação cíclica das moléculas de difenilalanina nos
vértices da cela unitária. Painel à direita mostra a nanoestruturação do canal da amostra de
peptídeo .................................................................................................................................... 27
Fig. 3.5: Posições da água (por raio de van der Waals) no canal da estrutura do nanotubo Ldifenilalanina, esferas em azul. As ligações de hidrogênio entre as moléculas de peptídeo
são mostradas por linhas tracejadas. Cadeias laterais de peptídeos foram omitidas para
maior clareza............................................................................................................................. 28
Fig. 3.6: Definição das interações em nanoestruturas peptídicas de difenilalanina e
formação das microestruturas. Veja também Fig. 1.3............................................................... 29
Fig. 3.7: (A) Definição de ângulo de torção de forma genérica para todos os tipos de
dipeptídeos. (B) Estrutura molecular do dipeptídeo difenilalanina. ......................................... 31
Fig. 3.8: Padrões de difração de raios X em alta resolução das amostras preparadas em
solução de pH 7 e com as concentrações diferentes de MP11, 2X (painel à esquerda) e 5X
(painel à direita). Marcas de escala encontram-se abaixo dos perfis experimentais
indicando as posições das reflexões permitidas de Bragg para o grupo espacial de simetria
hexagonal (P61). ....................................................................................................................... 32
Fig. 3.9: (A) Resultados da análise termogravimétrica mostrando a variação de massa em
função da temperatura. Utilizou-se uma rampa de aquecimento de 5 °C/min, iniciando a
temperatura ambiente e finalizando a 350 °C. (B) Uma ampliação do termograma. ............... 35
Fig. 3.10: Calorimetria Diferencial de Varredura na amostra de dipeptídeo ajustada em pH
7 com rampa de aquecimento de 5 °C/min (painel superior) e 10 °C/min (painel inferior).
Adota-se a seguinte sistemática para o ciclo térmico: temperatura ambiente até 200 °C (i)
resfriamento até a temperatura de -30 °C (ii) e aquecendo novamente até 200 °C (iii). .......... 36
Fig. 3.11: Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura na amostra de dipeptídeo
ajustada em pH 7 com rampa de aquecimento de 5 °C/min. Antes da análise, a amostra foi
tratada termicamente a 190 °C e depois ressuspensa em H2O. ................................................ 38
Fig. 3.12: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra obtida na
temperatura ambiente ............................................................................................................... 39
Fig. 3.13: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra tratada em 137 °C .... 40
Fig. 3.14: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra tratada a 165 °C ....... 41
Fig. 3.15: AFM (A) e MEV (B) mostrando a formação da estrutura peptídica
(difenilalanina) preparados em solução de pH 7 [29] ................................................................ 42
Fig. 3.19: Comparação das imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra de
peptídeos tratadas em diferentes temperaturas ......................................................................... 44
Fig. 3.20: Comparação dos difratogramas das amostras de peptídeo tratadas termicamente
em diferentes temperaturas. O grupo espacial de simetria indexado é Hexagonal P61............ 46
Fig. 3.21: Difratogramas das amostras de peptídeo tratadas termicamente. (A) Comparação
dos tratamentos a 135 °C e 140 °C com grupo de simetria hexagonal P61. (B) Comparação
de dois tratamentos com temperaturas de 140 °C e 150 °C. (C) Comparação das demais
temperaturas em135 °C, 170 °C com o grupo de simetria hexagonal P61 ............................... 47
Fig. 3.22: Refinamento Rietveld do difratograma de amostra de peptídeo tratada
termicamente a 190 °C. A fase cristalina encontrada é a ortorrômbica com grupo de
simetria Pba2. ........................................................................................................................... 48
Fig. 3.23: (A) Molécula de peptídeo, formando uma unidade mínima para a formação da
cela unitária. (B) Empacotamento das moléculas de peptídeo na cela unitária ........................ 49
Fig. 3.24: (A) Formação da estrutura tubular com canais nanométricos, corresponde à
amostra de peptídeo na fase hexagonal P61. (B) Formação da estrutura contínua em
amostra de peptídeo na fase ortorrômbica Pba2. ..................................................................... 51
Fig. 3.25: Comparação das celas unitárias das fases hexagonal (A) e ortorrômbica (B), no
plano ab. Mudança na perspectiva para visualização do eixo c, das fases hexagonal (C) e
ortorrômbica (D). ...................................................................................................................... 52
Fig. 3.26: (A) Difratogramas da amostra de peptídeo tratada termicamente nas
temperaturas de: 190 °C, 220 °C e 260 °C. (B) Amplificação dos difratogramas para
melhor identificação das intensidades relativas dos planos (2 0 0) e (2 1 0). O grupo
espacial de simetria indexado é ortorrômbico Pba2................................................................. 53
Fig. 3.27: (A) Comparação das fases hexagonal e ortorrômbica encontradas na amostra
após o tratamento térmico. (B) Amplificação dos difratogramas para melhor visualização. ... 54
Fig. 3.28: Espectros de FTIR de amostras de peptídeo. Inicia-se o tratamento térmico a
partir da temperatura ambiente nas respectivas temperaturas 80 °C, 140 °C, 190 °C, 220 °C
e 260 °C. ................................................................................................................................... 55
Fig. 3.29: (A) Identificação das bandas FTIR mais importantes das amostras da fase
Hexagonal. (B) Ampliação do espectro para melhor visualização do deslocamento da
banda da amida secundária. ...................................................................................................... 56
Fig. 3.30: Deconvolução através da distribuição de funções Lorentzianas da nanoestrutura
de peptídeo à temperatura ambiente (painéis superiores) e tratada termicamente a 190 °C
(painéis inferiores). ................................................................................................................... 58
Fig. 3.31: Comparação dos espectros de infravermelho das fases hexagonal e ortorrômbica . 59
Fig. 3.32: Análise comparativa das diferentes bandas de FTIR para as distintas fases
presentes na amostra tratada termicamente. . ........................................................................... 60
Fig. 3.33: Identificação das conformações β-sheet e β-turn no espectro de FTIR................... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Ângulo de varredura, índice de Miller, distâncias interplanares (d) dada em
angstroms da amostra de peptídeo em pH 7. Dados obtidos em alta resolução. ...................... 23
Tabela 3.2: Informações cristalográficas obtidos em diferentes valores de pH. Número de
átomos por cela unitária (Z). A concordância entre o perfil observado e calculado são os
resíduos, obtidos a partir da diferença entre as intensidades observadas e calculadas.
Representa-se a qualidade do ajuste por Rp, Rwp, RBragg e χ2. ................................................... 25
Tabela 3.3: Ângulos de torção [°]. ........................................................................................... 30
Tabela 3.4: Informações cristalográficas de amostra de peptídeo em pH 7 obtidos em
diferentes valores de concentração de MP11, medidas realizadas no modo de alta
resolução. .................................................................................................................................. 33
Tabela 3.5: Informações cristalográficas da amostra de peptídeo tratadas nas respectivas
temperaturas: ambiente, 80 °C, 140 °C e 190 °C. .................................................................... 49
Tabela 3.6: Informações cristalográficas da amostra tratada termicamente em temperaturas
acima da transição de fase estrutural. ....................................................................................... 50
Tabela 3.7: Dados da espectroscopia FTIR [62,69,70,71] ............................................................. 57
CAPÍTULO 1: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1-
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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1- INTRODUÇÃO
Sistemas nanomagnéticos são constituídos e observados na forma de partículas, fios,
tubos ou aglomerados de partículas magnéticas, com tamanho na escala nanométrica (0,1100nm). Tais sistemas podem ser encontrados em sólidos ou em meios líquidos. Os sistemas
magnéticos nanoestruturados apresentam propriedades únicas que não são observadas em
materiais volumosos ou massivos (tamanho macroscópico). Na última década, os sistemas
nanomagnéticos vêm suscitando crescente interesse científico e tecnológico desde a
descoberta do efeito de magnetorresistência gigante (GMR) [1,2,3] no qual culminou no prêmio
Nobel de física de 2007. Neste contexto, além da ciência básica, existe uma notória atenção
por parte dos cientistas acerca da nanociência. Do ponto de vista científico, quando o tamanho
de um material é reduzido para a escala nanométrica comparável com, por exemplo, o livre
caminho médio, os efeitos quânticos se tornam muito mais pronunciados, alterando
radicalmente as propriedades físicas outrora observadas em materiais volumosos. Em geral, as
explicações para os efeitos observados nos materiais macroscópicos divergem daqueles
observados na escala nanoscópica.
Nanofios e nanotubos magnéticos são cientificamente interessantes, com possíveis em
diversas áreas da nanotecnologia incluindo mídias magnéticas padronizadas, dispositivos
magnéticos, materiais para aplicações de microondas, dispositivos piezoelétricos e
supercapacitores [4,5]. O estudo de vários tipos de nanotubos, inorgânicos bem como
orgânicos, tem sido alvo de grandes esforços durante os últimos anos [6]. A funcionalização de
nanotubos de peptídeos dopados com íons de metal de transição originando novos
nanomateriais híbridos é uma forma de obtenção de novas propriedades físicas interessantes.
Materiais que podem ser empregados na funcionalização são nanopartículas, polímeros,
fluoróforos, entre outros [7,8,9,10]. Dessa forma, um dos objetivos é obter um melhor
entendimento acerca das propriedades estruturais e morfológicas dos nanotubos de peptídeo e
utilizá-los como matrizes orgânicas de metais de transição as quais possuem momento
magnético efetivo. Neste sentido, as propriedades elétricas e/ou magnéticas destes materiais
podem ser estudadas após a dopagem. Recentemente, foi descoberto que estes materiais
também apresentaram propriedades piezoelétricas interessantes [5]. Os nanotubos utilizados
nos experimentos são produzidos pelo dipeptídeo chamado de difenilalanina. Os dois
aminoácidos constituintes deste dipeptídeo são a fenilalanina. Este processo de formação é
rápido e simples, pois estes dipeptídeos se auto-organizam por um processo espontâneo que
resulta na estruturação de nanofios/nanofitas e/ou nanotubos. Esse é o principal motivo pelo
qual esses materiais foram escolhidos para serem usados como matrizes de íons magnéticos.
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1.2- FORMAÇÃO DE NANOTUBOS DE PEPTÍDEO
A química supramolecular tem atraído muita atenção, pois pode fornecer novas
propriedades físicas, químicas e biológicas para as espécies moleculares. Estas se organizam
por meio de interações intermoleculares, que são mais fracas que as ligações covalentes.
Como por exemplo, ligações de hidrogênio, forças de van der Waals, coordenação de metais,
forças hidrofóbicas e/ou efeitos eletrostáticos. O sistema supramolecular é inspirado na
automontagem das unidades precursoras, chamado de building blocks, fornecendo novas
propriedades intrínsecas ao conjunto. Nesse sentido, moléculas têm sido projetadas com
propriedades específicas, tais como automontagem, reconhecimento molecular,
transformação, transporte e sinalização [7]. Em particular, peptídeos têm sido relatados na
fabricação de várias nanoestruturas bem definidas incluindo nanofibras, nanotubos e esferas
fechadas em gaiolas [11]. Devido à facilidade de modificação de suas propriedades químicas e
funcionalidades biológicas, nanoestruturas de peptídeos têm sido utilizadas para várias
aplicações, incluindo os transportadores de droga, estruturas para engenharia de tecidos,
bioengenharia, dispositivos de detecção de moléculas biológicas, modelos de canais de íons
e/ou poros de membranas e templates para metais e semicondutores [6,11].
Nanomateriais peptídicos formam estruturas supramoleculares diversificadas ligadas
por interações intermoleculares como forças de van der Waals, eletrostáticas, hidrofóbicas e
ligações de hidrogênio [12,13]. Vários grupos de compostos formados por peptídeos
apresentam estruturas tubulares. Estas são formadas pelo empilhamento de moléculas cíclicas
através da formação de ligações de hidrogênio intermoleculares entre os grupos funcionais
nas cadeias principais de peptídeos. Esta estrutura tubular foi sugerida em 1974 com base em
análises teóricas [14,6]. Um trabalho pioneiro sobre este tipo de estrutura foi efetuada por
Ghadiri et al. [15]. Nas estruturas cristalinas dos dipeptídeos, é comum existir uma interação
eletrostática na cadeia do tipo cabeça-calda -NH3+…-OOC- formando uma folha
bidimensional. Foi descoberto por Görbtiz [16] que L-Val-L-Ala (VA) formam cristais com
estreitos canais hidrofóbicos que são capazes de acolher pequenas moléculas orgânicas como
metanol e acetonitrila. De fato, outras estruturas tubulares são geradas a partir da
automontagem de moléculas muito pequenas agrupadas por ligações de hidrogênio, o
crescimento da cadeia é do tipo cabeça-cauda na forma de hélices por um processo de
automontagem espontânea. Alguns outros aminoácidos se arranjam em forma cristalina a
partir de dipeptídeos, isto é, união de dois aminoácidos, como por exemplo: L-Leu-L-Leu
(LL), L-Leu-L-Phe (LF), L-Phe-L-Leu (FL), L-L-L-L(LL) e L-Phe-L-Phe (FF), este ultimo
pode ser reescrito como L-difenilalanina (FF) [17,18]. Os aminoácidos valina (Val), alanina
(Ala), leucina (Leu) e fenilalanina (Phe) estão dispostas na forma de dipeptídeos com caráter
levógira (L), isto é, efeito físico de desviar a luz para a esquerda do espectro determinando
uma atividade biológica ao aminoácido. A LL se cristaliza na presença de solventes como: 2metil-1-propanol, etanol, 1-propanol e 2-propanol, e DMSO, enquanto LF cristaliza-se na
Página |3
presença de 2-propanol. Estas estruturas são divididas em duas regiões, uma hidrofóbica e
outra hidrofílica [6].
FW
FF
FL
WG
Fig. 1.1: O empacotamento molecular e cela unitária de nanoestruturas de dipeptídeos. Encontram-se
17
estruturas do tipo hexagonal (FF), ortorrômbica (FL e LL) e tetragonal (WG) [ ].
Vários peptídeos têm uma grande tendência em formar longas agulhas ou fibras
quando são cristalizados em soluções aquosas ou soluções não aquosas. A estrutura da Ldifenilalanina (FF), que será utilizada neste trabalho, é representada na Fig. 1.1. Publicado em
2001, este trabalho baseia-se em dados experimentais coletados de uma amostra
monocristalina com dimensões 550 x 26 x 24 μm crescida por evaporação rápida de uma
solução aquosa do peptídeo a 80 °C [6]. Reches e Gazit [19] concluíram que os nanotubos de
L-difenilalanina utilizados para a produção de fios possuem um arranjo molecular
completamente diferente das estruturas tubulares individuais automontadas.
14
Fig. 1.2: (a) Fórmulas estruturais da L-difenilalanina. (b) Estrutura tridimensional da FF [ ].
Görbitz propôs um modelo experimental para a construção de um nanotubo de
peptídeo, foi escolhido arbitrariamente para ter um diâmetro externo e interno de 110 e 50nm,
Página |4
respectivamente, é apresentado na Fig. 1.3 (a). A natureza exata da superfície interna mostrada
na Fig. 1.3 (b) não é conhecida, mas pode ser uma mistura das propriedades hidrofóbica e
hidrofílica, ou completamente hidrofóbica. Os canais estreitos têm seus diâmetros calculados
através da equação de estado de van der Waals, com diâmetro = 10 Å [6], Fig. 1.3 (c). Estes
estreitos canais de natureza hidrofílica podem acomodar moléculas hospedeiras de certa
dimensão, bem como íons metálicos hidratados. Como é claro, Fig. 1.3, os grupos aromáticos
geraram por empilhamento um impressionante arranjo tridimensional. As ligações de
hidrogênio existente entre as cadeias principais dos peptídeos ligam os nanotubos,
promovendo a formação da fibra [14].
Fig. 1.3: Modelo arbitrário para a construção das fibras de FF. Átomos das cadeias principais do
dipeptídeo são coloridos de acordo com o tipo de átomo, enquanto os átomos nas cadeias laterais
fenilalanina estão representados em laranja. (a) Tubo com um diâmetro exterior 110nm e 50nm de
diâmetro interior. O quadrado branco indica a parte ampliada (b) apresentando um modelo da interface
do canal de peptídeo na superfície interna. O retângulo representa a visão detalhada dada em (c) uma
representação de varas fechadas com átomos que constituem a superfície dos poros preenchidos [14].
A formação de nanotubos peptídicos tem sido estudada extensivamente para entender
os aminoácidos e as seqüências responsáveis pela agregação tubular. Informações sobre as
sequências peptídicas responsáveis pela agregação são utilizadas para evitar a formação de
agregações de proteínas causadoras das doenças como Alzheimer e Parkinson [20]. No campo
da engenharia de materiais esse conhecimento pode ser aplicado no desenvolvimento de
novas nanoestruturas peptídicas. Por exemplo, sínteses de polipeptídeos são projetadas para
duplicar a estrutura dos nanotubos por meio de combinações peptídicas. Um conjunto de
amostras de polipeptídeos constituídos por alguns aminoácidos polares (His, Lys, Asn, Asp,
Gln, Glu) e alguns resíduos não polares (Leu, Ile, Val, Phe, Met) foram produzidas, a fim de
se produzir nanotubos com diferentes tamanhos. A disposição destes aminoácidos em cadeia
determina as dimensões dos tubos. Recentemente, estes polipeptídeos também foram
aplicados na forma linear e não linear para a formação de nanotubos dipeptídicos [21].
Outra forma de organização e crescimento de nanotubos de peptídeo é por meio de um
metal ligante com interações altamente direcionais, em vez de interações entre terminações
hidrofóbico-hidrofílicas. Os monômeros polipeptídicos são incubados com íons de Re (rênio),
estes íons ligados aos monômeros se reúnem para formar os nanotubos, cujo comprimento é
Página |5
controlado pelo número de íons, veja Fig. 1.4 [21].
21
Fig. 1.4: Conjunto de peptídeos mediados por um complexo de rênio [ ].
Outra abordagem para produzir nanotubos de peptídeos é a utilização de moléculas
orgânicas simples para automontagem, por exemplo, o uso de moléculas anfifílicas.
Monômeros das moléculas anfifílicas montam-se automaticamente por interações
hidrofóbico-hidrofílicas entre os surfactantes anfifílicos. Condições experimentais como
temperatura, pressão e concentração dos precursores influenciam a formação de nanotubos
[22]. Outro parâmetro para o controle das estruturas acontece por ligações de hidrogênio entre
os aminoácidos. Isso pode tornar os nanotubos anfifílicos peptídicos mais sensíveis ao pH,
pois a protonação dos resíduos de aminoácidos altera a força de ligações de hidrogênio entre
as moléculas [23,24,25]. Além de ligações de hidrogênio, a hidrofobicidade de monômeros
peptídicos também é um fator importante na determinação das dimensões dos nanotubos de
peptídeos. Portanto as propriedades mecânicas, químicas e físicas dos nanotubos de peptídeos
são muito sensíveis a estrutura química dos monômeros [21].
Fig. 1.5: a) Representação esquemática da formação do nanotubo de peptídeo de monômeros de
peptídeo cíclico. b) camada única porosa montada pela coluna de peptídeos dendríticos [21].
Em 1974, De Santis et al. [26] propuseram que estas estruturas orgânicas formadas por
aminoácidos com dimensão nanométrica podem se auto-organizar por empilhamento de
unidades de peptídicos cíclicos, o que depois foi demonstrado por Ghadiri et al. [15]. O
mecanismo típico de automontagem dos monômeros peptídicos cíclicos é mostrado na Fig.
1.5 (a). Anéis de peptídeos são empilhados por meio de ligações de hidrogênio da cadeia
principal entre grupos amida vizinhos para formar uma estrutura tubular. Um exemplo é uma
Página |6
seqüência de oito peptídeos por ciclo [-(L-Gln-D-Ala-L-Glu-L-Ala)2-]. Geralmente, nanotubos
podem ser montados a partir de monômeros de peptídeos cíclicos por D, L-α-aminoácidos, βaminoácidos, α, β-aminoácidos, α, γ-aminoácidos e δ-aminoácidos. Recentemente, a alteração
heterocíclica entre α- e ε-aminoácidos no peptídeo cíclico foram demonstrados para formar a
estrutura tubular. Monômeros dendríticos de peptídeos também se auto-organizam para
formar estruturas cíclicas por ligações de hidrogênio nas extremidades dos peptídeos (veja a
Fig. 1.5-b). Nesta estrutura, o diâmetro dos nanotubos pode ser alterado de 10 para 24 Å
alternando a composição dos aminoácidos [21]. Uma característica importante dos nanotubos
de peptídeos é o controle preciso do diâmetro, determinado pelo comprimento da cadeia,
tamanho da cadeia lateral, ângulo de ligação dos monômeros e estereoquímica dos
aminoácidos. O número e a seqüência dos aminoácidos definem as propriedades superficiais
dentro e fora dos nanotubos [21]. Além disso, outras linhas de pesquisa envolvendo técnicas de
imobilização de enzimas e compostos biomiméticos em nanoestruturas peptídicas vêm sendo
desenvolvidas pelo grupo de pesquisa coordenado pelo Prof. Dr. Wendel Alves [27,28,29,30].
Têm sido realizados estudos de funcionalização das paredes ou do interior dos nanotubos
peptídicos com nanopartículas de ouro e compostos fluoróforos e como isso influencia na
estrutura eletrônica e nas propriedades de transporte destes sistemas [7].
1.3- CONFORMAÇÕES EM PEPTÍDEOS
A estrutura secundária é uma função dos ângulos formados pelas ligações peptídicas
que ligam seus respectivos amino ácidos, este tipo de estrutura chama-se de conformações.
As conformações α-helix, β-sheet e β-turn são voltas que acontecem de forma periódica na
cadeia peptídica por um padrão regular de ligações de hidrogênio entre os agrupamentos
peptídicos N-H e C=O dos aminoácidos que estão perto uns dos outros na sequência linear. As
conformações foram denominadas β, pois foram a segunda estrutura elucidada por Pauling e
Corey [31], a primeira foi α-helix que ajudará no entendimento sobre a forma como os
nanotubos se estruturam. Estes pesquisadores analisaram quais conformações de peptídeos
eram permitidas estericamente, isto é, algumas combinações de ângulos causam colisões
desfavoráveis entre grupos da cadeia principal e/ou as cadeias laterais, e quais aproveitavam
mais completamente a capacidade de formação de ligações de hidrogênio dos grupamentos
NH e CO da cadeia principal [32].
(A)
(B)
Página |7
(C)
Fig. 1.6: Vistas esquemáticas de hélices α. (A) Um modelo em esferas e bastões. (B) Uma
representação em fita. (C) Uma representação cilíndrica [32].
A α-helix tem uma forma semelhante a um bastão (Fig. 1.6) no qual existe um
arcabouço principal firmemente espiralado formando a parte interna do bastão e cujas cadeias
se projetam para fora em uma disposição helicoidal e estabilizada por ligações de hidrogênio,
com exceção dos posicionados perto das pontas da α-helix. O sentido de giro de uma hélice
pode ser para a direita (sentido horário), ou para a esquerda (sentido anti-horário). [32].
(A): Estrutura de uma fita β
(C): Uma folha β paralela
(B): Uma folha β antiparalela
(D): Estrutura de uma folha β mista
Fig. 1.7: (A) As cadeias laterais (verdes) situam-se alternadamente acima e abaixo do plano da fita.
(B) Fitas β adjacentes estendem-se em sentidos opostos, ligações de hidrogênio entre grupamentos NH
e CO conectam cada aminoácido em uma fita adjacente, estabilizando a estrutura. (C) Fitas β
adjacentes estendem-se no mesmo sentido, ligações de hidrogênio conectam cada aminoácido em uma
fita com dois diferentes aminoácidos na fita adjacente. (D) Com mais diversidade estrutural do que as
hélices α, as folhas β podem ser quase planas, mas a maioria adota uma forma um pouco retorcida [32].
Página |8
A conformação β-sheet difere da conformação α-helix em forma de bastão, pois é
composta de duas ou mais cadeias peptídicas no formato de fitas chamadas β-strand. Esta fita
é quase totalmente distendida em vez de firmemente enrolada como na α-helix. A
conformação β-sheet é formada pela união de dois ou mais filamentos β por ligações de
hidrogênio. Cadeias adjacentes em uma folha β podem se estender em sentidos opostos (βsheet antiparalela) ou no mesmo sentido (β-sheet paralela). No arranjo antiparalelo, os
grupamentos NH e CO de cada aminoácido fazem, respectivamente, ligações de hidrogênio
com os agrupamentos CO e NH da cadeia adjacente, Fig. 1.7 (B). No arranjo paralelo, o
esquema de ligações de hidrogênio é um pouco mais complicado. Para cada aminoácido, o
grupamento NH faz ligação de hidrogênio com CO de um aminoácido no filamento adjacente,
enquanto o CO faz ponte com o NH do aminoácido a dois monômeros adiante ao longo da
cadeia, Fig. 1.7 (C). Muitos filamentos, tipicamente 4 ou 5, podem se reunir em folhas (βsheet). Tais folhas podem ser puramente antiparalelas, puramente paralelas, ou mistas, Fig. 1.7
(D) [32].
Fig. 1.8: Estrutura de volta reversa (β-turn). O grupamento CO do aminoácido i da cadeia peptídica
faz ligação de hidrogênio com NH do aminoácido i+3, estabilizando a volta. Esferas em branco e
cinza representam os átomos de hidrogênio e carbono, respectivamente. A cadeia lateral, amina (NH3)
32
e carboxila (COO-) são representadas pelas esferas verde, azul e vermelha, respectivamente [ ].
Por outro lado as cadeias peptídicas podem mudar de direção, fazendo voltas reversas
e alças. Muitas destas reversões são feitas por um elemento estrutural comum chamado de
volta reversa (β-turn). Em muitas destas voltas, o agrupamento CO do aminoácido i de uma
cadeia peptídica forma ligação de hidrogênio com o grupamento NH do aminoácido i+3. Esta
interação estabiliza mudanças abruptas de sentido da cadeia peptídica. Ao contrário das
hélices-α e fitas-β, a volta reversa, isto é β-turn não tem estruturas periódicas regulares. No
entanto, as estruturas em alças são freqüentemente rígidas e bem definidas [32].
Página |9
1.4- OBJETIVOS DO TRABALHO
O objetivo geral deste trabalho é estudar as propriedades térmicas, estruturais e
morfológicas de nanoestruturas peptídicas (difenilalanina) em função da alteração do
potencial hidrogeniônico (pH) e da introdução de íons de metal de transição. Em específico,
utilizou-se a microperoxidase 11 (MP11), que contém o íon de ferro(III). Além disso, realizar
um estudo sistemático acerca da influência de moléculas de água nas propriedades estruturais
e morfológicas dessas amostras através da realização de tratamentos térmicos. As
caracterizações serão realizadas em amostras sintetizadas em altas temperaturas e estudadas
através de análise termogravimétrica, calorimetria diferencial de varredura, microscopia
eletrônica de varredura, difração de raios X e espectroscopia de infravermelho.
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
P á g i n a | 10
2-
TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
2.1- PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Classicamente a síntese de nanotubos/nanofios pode acontecer de duas formas, por
processo químico ou por processo físico. Processos químicos: hidrotérmico, solvotérmico em
fase líquida ou sólida, electrospinning e deposição química de vapor (DQV). Processos
físicos, por deposição física de vapor (DFV): evaporação térmica, sputtering e ablação a laser
[15,19,33,34,35,36].
Nanoestruturas peptídicas são sintetizadas pelo acoplamento da carboxila (C-terminal)
de um aminoácido ao grupo amino (N-terminal) do outro. A possibilidade de reações
indesejáveis é esperada. Portanto, grupos de proteção são geralmente necessários. A síntese
química dos peptídeos começa no final da carboxila e finaliza no grupo amino. Este é o
oposto da biossíntese de proteínas, que começa no fim do grupo amino. A síntese em fase
líquida é uma abordagem clássica e amplamente utilizada para a fabricação de nanoestruturas
de peptídeos, e foi empregada para a fabricação das amostras do presente trabalho.
Utilizaram-se os mesmos procedimentos realizados por Reches e Gazit. Estes sintetizaram
nanotubos peptídicos (NTPs) por síntese em fase líquida, baseados na sequência (L-Phe···LPhe) por automontagem. Neste caso, os nanotubos são obtidos por meio de um método
relativamente simples baseado na dissolução do dipeptídeo em 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2propanol (HFP) seguido pela diluição em água. [19]. Uma descrição simplificada desta síntese
pode ser entendida pelo fluxograma da Fig. 2.1.
L-Phe-L-Phe
(Peptídeo)
Dissolução
em HFP
Diluição
em H2 O
Tempo de
reação de
24h
Nanotubo
Fig. 2.1: Fluxograma descritivo da rota de síntese fase-líquida.
Nanotubos foram inicialmente preparados a partir do aminoácido apolar fenilalanina
(phe) na forma dipeptídica (phe-phe) líquida, por síntese fase-líquida. Soluções cuja
concentração é padronizada, usualmente chamada de solução estoque, foram preparadas por
dissolução da forma liofilizada dos peptídeos L-phe-L-phe líquida na concentração de partida
[ ]p = 100 mg/mL em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFP). Em uma síntese que inicia
com 2,5 mg de peptídeo, são necessários 25 μL de HFP em seguida deve ser agitado
levemente para solubilização. Depois desta etapa, a solução foi diluída a 5 mg/mL em 475 μL
de água ultra-pura, devendo ser novamente agitado até que todo material se disperse e adquira
um aspecto de gel. É Importante que os reagentes estejam à temperatura ambiente. A amostra
foi armazenada na geladeira por aproximadamente 24 horas. O processo de purificação
consistiu em centrifugar todo material e retirar o solvente que não sofreu reação
(sobrenadante), em seguida repor a mesma quantidade de água que foi usada inicialmente na
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 11
diluição.
Foram realizados três ensaios cujo potencial hidrogeniônico (pH) da solução foi
previamente ajustado para valores de 3, 7 e 12, adicionando-se algumas gotas de CH3COOH
e/ou HCl preparada a 1 mol L-1 aumenta a acidez da solução. A solução de NaOH 55 mmol L1
que faz o processo inverso. Para evitar qualquer pré-agregação, as soluções estoque foram
preparadas para cada experimento.
Outra sistemática adotada foi a introdução de metais de transição na estrutura
cristalina dos nanotubos. Neste sentido, foi escolhido o composto microperoxidase-11 (MP11)
que contém o íon de ferro(III). As microperoxidases (MPs) são peptídeos produzidos pela
digestão proteolítica de uma proteína presente no citocromo c por meio da transferência de
elétrons. Um dos destacados representantes de microperoxidase é o peptídeo MP11, que
contém um grupo heme c anexado a onze aminoácidos (undecapeptideo), que se assemelha ao
segmento V11-E21 do citocromo c do coração do cavalo (Fig. 2.2) representando o modelo da
estrutura da microperoxidase 11 [37]. A MP11 serve para propósitos mais aplicados
funcionando como um biossensor para o peróxido de hidrogênio (H2O2) [38,39]. Foram
escolhidos nanotubos em concentrações de 5mg/mL em solução cujo valor de pH igual a 7,
pois neste valor de pH há uma maior estabilidade além de ser o pH adequado para a enzima.
Outros valores extremos de pH causariam desnaturação da proteína MP11, impossibilitando
seu uso.
A solução de nanotubos na concentração de 5 mg/mL a partir das soluções estoques foi
centrifugada por 15 min em uma centrífuga MPW a 12.000 rpm. O sobrenadante foi removido
e o precipitado foi lavado com água ultra-pura e centrifugado por mais 15 min. A este
precipitado, material sólido, foi adicionado soluções com diferentes concentrações de MP11
(0,744 mg/L, 1,488 mg/L) e envelhecido por 12 horas produzindo duas amostras diferentes. O
MP11/NTPs foi centrifugado e lavado com água ultra-pura, três vezes para remover o excesso
de MP11.
Cl
(A)
(B)
Fig. 2.2: Microperoxidase 11 (MP11), segmento do citocromo c do coração do cavalo [40].
N
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 12
2.2- ANÁLISE TÉRMICA
Análise térmica é um termo que abrange um grupo de técnicas nas quais uma
propriedade física ou química de uma substância, ou de seus produtos de reação, é monitorada
em função do tempo e/ou da temperatura. A caracterização térmica das amostras de nanotubos
de L-difenilalanina foi realizada por meio de duas técnicas: a) Termogravimetria; b)
Calorimetria Diferencial de Varredura.
a- Termogravimetria: os dados foram obtidos utilizando um instrumento do tipo TGA
Q500 V20.8 Build 34, via método de rampa (5 °C/min), com atmosfera de nitrogênio.
As medidas foram obtidas a partir da temperatura ambiente até a temperatura de 600
°C.
b- Calorimetria Diferencial de Varredura: os dados foram obtidos utilizando um aparato
instrumental do tipo DSC Q200 V24.2 Build 107, via método
aquecimento/resfriamento/aquecimento, com atmosfera de nitrogênio. Foram
realizadas duas coletas de dados, com rampas de aquecimento/resfriamento distintas,
uma a 5 °C/min e outra a 10 °C/min. Em ambas as coletas foi utilizado o mesmo
método de aquecimento, iniciando com o aquecimento da amostra a partir da
temperatura ambiente até 200 °C depois resfriando até -30 °C e aquecendo novamente
até 200 °C.
2.2.1- Análise Termogravimétrica
O conhecimento detalhado sobre as alterações que o aquecimento térmico pode
provocar na massa das substâncias data de muitos anos. Além disso, é de extrema importância
conhecer a faixa de temperatura em que o material estudado começa a se decompor, bem
como o mapeamento de reação de desidratação e oxidação decomposição, etc. A
termogravimetria foi pela primeira vez utilizada por P. Truchot, em 1907, no levantamento das
curvas de decomposição térmica de piritas [41]. Em 1912, G. Urbain e C. Boulanger [42]
construíram uma balança dotada de compensação eletromagnética para acompanhar a
eflorescência de sais hidratados. A termobalança é um instrumento utilizado para estudar as
curvas de decomposição térmica de compostos.
As termobalanças modernas são instrumentos que permitem a pesagem contínua de
uma amostra em função da temperatura, ou seja, na medida em que ela é aquecida ou
resfriada. Dessa forma, curvas de variação de massa em função da temperatura são obtidas,
em geral as perdas de massas. Os componentes fundamentais das termobalanças modernas
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 13
são: balança registradora, forno, suporte de amostra e sensor de temperatura, programador da
temperatura do forno, sistema registrador e controle da atmosfera do forno. Na Fig. 2.3 é
esquematizado o funcionamento da termobalança elétrica [43].
Análise da evolução
dos gases
Computador
• coleta de dados
• controle
Mecanismo
da balança
T
amostra
Forno
Injetor
gás
massa
programador
Display
Temperatura
Fig. 2.3: Esquema do aparato (eletrobalança) para a análise termogravimétrica (TGA).
As balanças operam continuamente em equilíbrio, e os eventuais deslocamentos do
travessão são detectados por um arranjo: feixe luminoso anteparo-fotoválvula e o equilíbrio
restabelecido através da força de um motor de torque magnético. Outros sistemas utilizam
balanças do tipo de deflexão de espirais ou feixes, cujos deslocamentos são registrados por
um transformador diferencial de tensão linear (LVDT) ou outros transdutores [43].
Os fornos, em geral, são construídos para operar até temperaturas de 1200 °C. Os
instrumentos atuais permitem controlar a atmosfera que circunda a amostra, permitindo que se
trabalhe com atmosferas estáticas ou dinâmicas a pressão ambiente ou sob pressão reduzida.
Os fatores que podem influenciar as medidas pertencem a dois grandes grupos: o
primeiro fator é o instrumental que relaciona a razão de aquecimento do forno, atmosfera do
forno, geometria do suporte de amostra e do forno. Por último, fatores ligados às
características da amostra são: tamanho de partículas, quantidade de amostra, solubilidade dos
gases liberados na própria amostra, calor de reação, compactação da amostra, natureza da
amostra e condutividade térmica da amostra.
Na termogravimetria, a massa da amostra (m) é continuamente registrada como função
da temperatura (T) ou tempo (t). Portanto, nas curvas de termogravimetria, as modificações
que ocorrem no eixo das ordenadas correspondem às variações de massa sofridas pela amostra
e permitem obter dados quantitativos. Na termogravimetria diferencial (TGD), a derivada da
variação de massa em relação ao tempo (dm/dt) é registrada em função da temperatura. Neste
método são obtidas curvas que correspondem à derivada primeira da curva TG e nos quais os
degraus são substituídos por picos que delimitam áreas proporcionais às alterações de massa
sofridas pela amostra [43].
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 14
2.2.2- Calorimetria Diferencial de Varredura
A calorimetria diferencial de varredura, (do inglês, differential scanning calorimetry DSC) é uma técnica na qual se mede a diferença de energia fornecida a uma substância, e a
um material de referência, em função da temperatura. A amostra e o material de referência são
submetidos a uma programação controlada de temperatura. Existem duas modalidades quanto
ao método de medição: calorimetria diferencial de varredura com compensação de potência e
calorimetria com fluxo de calor [44,45].
Podem-se acompanhar através desta técnica os efeitos do calor associados com as
alterações físicas e/ou químicas da amostra, tais como transições de fase. Estas podem
ocasionar variações do fluxo de calor registrados nas curvas de DSC, assim como a fusão,
ebulição, sublimação, solidificação, alterações de estruturas cristalinas, ou reações de
desidratação, de dissociação, de decomposição, de óxido-redução, etc. Em geral, transições de
fase, desidratações, reduções e certas reações de decomposição produzem efeitos
endotérmicos, enquanto que cristalizações, oxidações, algumas reações de decomposição
produzem efeitos exotérmicos. Essa técnica permite também, estudar transições que envolvem
variações de entropia das quais as mais comuns são transições vítreas que certos polímeros
podem sofrer [43].
No DSC com compensação de potência a amostra e o material de referência são
mantidos a temperatura constante pelo uso de aquecedores individuais. O parâmetro medido é
a diferença na potência de entrada dos aquecedores, obtido também por
46
Q/dt ou dH/dt.
dH/dT (mcal s-1 )
Watson et al. [ ], aparentemente foram os primeiros a usar o termo “Differential Scanning
Calorimetry” para descrever a técnica instrumental desenvolvida em 1960. Nessa técnica a
amostra e o material de referência são mantidos a temperatura constante pela aplicação de
energia elétrica quando eles são aquecidos ou resfriados a uma razão linear. A curva obtida é o
registro do fluxo de calor dH/dt em mcal s-1 como função da temperatura [43].
Processo
Endotérmico
Processo
Exotérmico
Temperatura (°C)
Fig. 2.4: Curva DSC para os processos endotérmicos e exotérmicos.
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 15
Termodinamicamente o pico endotérmico é indicado no sentido ascendente (aumento
na entalpia), enquanto que um pico exotérmico é registrado na direção oposta. A área do pico
da curva DSC é diretamente proporcional a variação de entalpia. A determinação do calor de
transição (ou reação) ou da massa da amostra reativa é obtida da área abaixo da curva, logo:
A
H
m
k
(2.2.1)
Onde A é área do pico, H é o calor de transição (reação), m é a massa da amostra
reativa, k é o coeficiente de calibração. A constante de calibração está relacionada com a
geometria e à condutividade térmica do suporte de amostra e usualmente é determinada pela
calibração do sistema com compostos que possuem calores de transição ou reação conhecidos.
Aspectos positivos da técnica são [43]:
a- Rapidez nas determinações.
b- Uso de pouca massa de amostra.
c- Amostra pode ser sólida ou líquida.
d- Aplicável a processo de resfriamento e medidas sob alta pressão.
e- Permite estudar diferentes tipos de reações químicas.
2.3- MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
As imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram obtidas no
Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS). Elas forma realizadas pela proposta de
pesquisa SEM-LV 10254 e o microscópio utilizado foi o LV-SEM JEOL (JSM 5900LV).
O princípio de funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes de elétrons por
um filamento capilar de tungstênio (eletrodo negativo), mediante a aplicação de uma
diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30 KV. Essa variação de voltagem permite a
variação da aceleração dos elétrons, e também provoca o aquecimento do filamento. A parte
positiva em relação ao filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os
elétrons gerados, resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A correção do
percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direção à
abertura da objetiva. As imagens obtidas têm uma aparência tridimensionais característica e
são úteis para avaliar a estrutura superficial de uma dada amostra [47].
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 16
2.4- DIFRAÇÃO DE RAIOS X
A caracterização através de difração de raios X das amostras de nanoestruturas de Ldifenilalanina foi feita utilizando-se um difratômetro D8 Discover (Bruker); radiação Cu Kα,
fenda de divergência de 0,6 mm com fenda de espalhamento de 8 mm, detector: LynxEye (do
inglês, position sensitive detector - PSD), abertura angular de 3 graus (2θ), varredura
contínua, com passo ~ 0,008 graus (2θ). Algumas medidas foram obtidas em colaboração com
o Prof. Reginaldo Muccillo do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN)
utilizando o difratômetro Bruker-ASX modelo Advance D8 com radiação Kα do Cu. Também
foram realizadas algumas caracterizações no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS)
com a obtenção de medidas de difração de alta resolução, com comprimento de onda de 1,24
Å. A seguir são descritos de forma resumida os princípios da difração de raios X.
Quando um feixe de raios X incide em um material cristalino, uma parte deste feixe é
espalhada elasticamente em todas as direções pelos elétrons de cada átomo ou íon [48,49].
Fig. 2.5: Difração de raios X por planos do cristal [48].
Considere dois planos paralelos de átomos A-A' e B-B' ilustrados na Fig. 2.5 e
representados pelos índices de Miller h, k e l. A posição e orientação dos planos atômicos do
cristal é definido por três pontos não colineares, o inverso dos menores números inteiros
originam os índices de Miller. Os planos estão separados pelo espaçamento interplanar dhkl.
Quando um feixe de raios X de comprimento de onda (λ), monocromático e coerente (em
fase) incide sobre estes planos com um ângulo θ, dois raios neste feixe, denominados 1 e 2,
são espalhados pelos átomos P e Q. Interferência construtiva dos raios espalhados 1' e 2'
ocorre se a diferença do caminho óptico entre 1-P-1' e 2-Q-2' for igual a um múltiplo do
comprimento de onda (nλ = SQ + QT). Essa condição de difração é dada pela lei de Bragg
[48].
2d hkl sen( )
n
(2.4.1)
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 17
Imáxima
Imáxima
(a)
Intensidade (u. arb.)
Nessa derivação assumimos condições ideais, ou seja, um cristal perfeito e um feixe
incidente composto perfeitamente por radiação paralela e rigorosamente monocromática. A
teoria de difração norteia a um método para estimar o tamanho dos domínios com coerência
cristalográfica (cristalitos) [49].
β
2θ2 2θB 2θ1
(b)
2θ
2θ
2θB
Fig. 2.6: Efeito do tamanho de pequenas partículas em curvas de difração.
A largura da reflexão de difração, mostrada na Fig. 2.6, aumenta à medida que a
espessura do cristal diminui, pois a diferença angular (2θ1 - 2θ2) aumenta à medida que m
diminui. A largura β é normalmente medida, em radianos, com uma intensidade igual à
metade da intensidade máxima, denominada largura à meia altura. Esta largura nos fornece
informações importantes a cerca do tamanho dos domínios com coerência cristalográfica.
Pode-se obter calcular o tamanho dos domínios pela seguinte relação:
t
0.9
. cos B
(2.4.2)
onde t é o tamanho médio dos domínios com coerência cristalográfica (cristalito) e β é a
largura a meia altura do pico de difração já corrigido, ou seja, já descontado a largura devido a
divergência do feixe. [49]. Esta fórmula é conhecida como a fórmula de Scherrer. Uma
correção é feita para a divergência do feixe incidente que é dada pela equação [50,51]:
e
2
p
2
(2.4.3)
βp é a largura a meia altura da reflexão causada devido a resolução do equipamento. Esse
valor é obtido medindo-se uma amostra padrão, neste caso, amostras de silício foram
utilizadas. O parâmetro βe é a largura a meia altura da reflexão de Bragg da amostra em
análise.
Os difratogramas experimentais foram refinados utilizando o método Rietveld [51]. O
método de Rietveld é amplamente utilizado na análise estrutural de materiais cristalinos. Este
método é utilizado como uma ferramenta versátil para análise quantitativa de fases em
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 18
diversas áreas como a ciência de materiais, geologia, na física e na química. Informações
estruturais de uma dada amostra tais como: coordenadas atômicas, agitação térmica e
parâmetros de rede. Estes são refinados, através do procedimento de minimização das somas
em todo o padrão de difração, considerando as diferenças das intensidades experimentais e
calculada até obter a melhor concordância possível do padrão de difração teórico com o
experimental. O refinamento é feito através do método de mínimos quadrados, de tal maneira
que um difratograma teórico se aproxime ao máximo possível do difratograma experimental.
Quando isso acontece, os valores obtidos para o conjunto dos parâmetros refinados
representam a melhor solução para o refinamento, aproximando-se ao máximo da estrutura
em análise. Os resultados obtidos neste trabalho foram obtidos usando o programa GSAS [52],
que utiliza o EXPGUI como interface gráfica [53].
2.4- ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO
A caracterização através da espectroscopia na região do infravermelho das amostras de
nanoestruturas de L-difenilalanina foi obtida utilizando-se um espectrômetro FT-IR modelo
Varian 660-IR, com 100 varreduras por amostra, 100 varreduras de radiação de fundo,
resolução de 0,25 cm-1, varredura do tipo absorbância, variação de varredura de 400 a 4000
cm-1. Os dados foram coletados a uma velocidade de 25 kHz (1,58 cm/s), utilizado um filtro
passa-baixa eletrônico de 6,4 kHz. Quanto a configuração instrumental, foi utilizada uma
fonte de IR (infravermelho) da Mirsource, ligado em modo normal, com divisor de feixe de
KBr, detector da MCT, Broad Band. Quanto à abertura e atenuação utilizou-se a abertura da
fonte de 0,25 cm-1 a 2000 cm-1, com 100% de atenuação do feixe. A seguir são descritos de
maneira resumida os fundamentos da espectroscopia de infravermelho.
A espectroscopia é uma técnica importante no estudo da interação da radiação
eletromagnética com a matéria e na determinação dos níveis de energia de átomos e/ou
moléculas. Em moléculas, a região espectral onde estas transições são observadas depende do
tipo de níveis envolvidos: eletrônicos, vibracionais ou rotacionais. Normalmente, as
transições eletrônicas são situadas na região do ultravioleta ou visível, as vibracionais na
região do infravermelho e as rotacionais na região de microondas. As diferentes regiões
espectrais exigem espectrômetros com elementos dispersivos e detectores apropriados, logo
cada tipo de espectroscopia tem uma tecnologia própria [54,55].
Quando se realiza medidas em uma amostra, um raio monocromático de luz
infravermelho é transmitido pela amostra, e a quantidade de energia transmitida é registrada.
Um gráfico de transmitância em função do "número de onda" em cm-1 pode ser construído. A
energia total de uma molécula será a soma da energia eletrônica, vibracional e rotacional
(desconsiderando a energia devido ao movimento translacional). A energia eletrônica é muito
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 19
maior do que a vibracional e esta muito maior do que a rotacional. Isto permite, em uma
primeira aproximação, que estes níveis possam ser considerados separadamente, isto é, cada
tipo de espectro possa ser estudado independentemente das interações entre eles [54].
A condição para que ocorra absorção da radiação infravermelha é que haja variação do
momento de dipolo elétrico da molécula por conseqüência de seu movimento vibracional ou
rotacional. Determina-se o momento do dipolo elétrico pela magnitude da diferença de carga
e a distância entre dois centros de carga. A espectroscopia no infravermelho se baseia no fato
de que as ligações químicas das substâncias possuem frequências de vibrações específicas, as
quais correspondem a níveis de energia da molécula. Tais frequências dependem da geometria
molecular, da forma da superfície de energia potencial da molécula, das massas dos átomos e
eventualmente da interação entre estados eletrônicos e estados vibratórios (ou fônons). Esta
interação é chamada de acoplamento vibrônico e também é conhecido como efeito pseudoJahn-Teller. As frequências de ressonância podem ser, em uma primeira aproximação,
relacionadas ao comprimento da ligação e as massas dos átomos [54,55].
Os átomos em uma molécula nunca estão parados, assim, se em um sistema, há N
átomos livres para se movimentarem nas três dimensões, o sistema terá 3N graus de liberdade.
Esses graus de liberdade correspondem aos diferentes modos normais de vibração de uma
molécula. Um modo normal de vibração é aquele em que cada núcleo realiza uma oscilação
harmônica simples em torno de sua posição de equilíbrio, todos os núcleos se movem com a
mesma frequência e em fase e o centro de gravidade da molécula permanece inalterado. Na
prática, nem sempre o número de modos normais de vibração corresponde ao número de
bandas observadas no espectro. Isso ocorre devido à existência de vibrações de mesma
energia (degenerescência), apresentando a mesma frequência e, conseqüentemente, a mesma
posição no espectro.
As vibrações moleculares podem ser classificadas em deformação axial (ou
estiramento) e deformação angular e podem ser simétricas ou assimétricas. As vibrações
angulares podem ainda ser classificadas como no plano ou fora do plano. Os diferentes tipos
de vibração são mostrados na Fig. 2.7 [55].
Estiramento
Deformação angular
+
_
+
+
_
Assimétrico Simétrico Assimétrica Assimétrica Simétrica
Simétrica
no plano fora do plano no plano
no plano
Fig. 2.7: Classificação dos seis tipos de modos de vibração moleculares.
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 20
Para qualquer modo de vibração os átomos oscilam em movimento harmônico
simples, isto é, obedecendo à lei de Hooke. Os estados de energia vibracional, Viv, podem ser
descritos pela seguinte equação
V
iv
h
i
n
i
1
2
(2.4.1)
Onde h é a constante de Planck, νi é a frequência fundamental do modo particular e ni
é o número quântico vibracional (ni = 0, 1, 2,...). A interação entre uma molécula e a
componente elétrica (oscilante) da radiação eletromagnética, para a absorção ou emissão de
um fóton de frequência ν, só ocorre se a molécula tiver um dipolo elétrico oscilando na
frequência do campo. Assim a molécula pode absorver fótons e realizar transição do estado
básico aos níveis fundamentais apropriados. A probabilidade de ocorrência de cada transição
depende da relação entre o momento do dipolo elétrico da molécula e as funções de onda de
seus estados básico e fundamental correspondentes. Na mecânica quântica se expressa em
termos do momento de dipolo de transição, μmn. Pode se expandir o momento de dipolo em
uma série de Taylor da coordenada q, para cada uma das componentes µx, µy e µz ou numa
forma condensada [54].
μ
μ0
dμ
dq 0
q 
(2.4.2)
Onde µ0 é o vetor do momento de dipolo permanente e a derivada é considerada na
posição de equilíbrio. Pode-se também definir μ como operador momento de dipolo elétrico.
Para pequenos deslocamentos, relação a esta posição de equilíbrio podem-se desprezar os
termos de ordem mais alta. A condição para a variação do momento de dipolo deve haver
absorção no infravermelho, implica-se que (dµ/dq0) ≠ 0, pelo menos para uma das
componentes µx, µy ou µz. A transição entre dois estados são caracterizados pelas funções de
onda ψm e ψn, é descrita pelo momento de transição de dipolo por μmn = ∫ ψm μ ψn dτ. O
momento de transição pode ser interpretado como variação do momento do dipolo associado
ao movimento dos elétrons durante a transição entre os dois estados envolvidos. Somente se o
momento de transição for diferente de zero a transição contribuirá para o espectro [54].
Para que haja atividade no infravermelho é necessário que a molécula possua
momento de dipolo permanente. Como conseqüência, moléculas diatômicas homonucleares
não apresentam espectro rotacional no infravermelho. Para moléculas deverá haver variação
do dipolo com a vibração na posição de equilíbrio. Supondo a molécula como um dipolo entre
placas de um condensador, pela aplicação de um campo elétrico ela se orientará, efetuando
uma rotação em relação ao campo aplicado. Como não há dipolo permanente para uma
molécula homonuclear, a aplicação do campo não produzirá nenhum efeito, logo não haverá
absorção de energia. Na Fig. 2.8 são esquematizados os níveis, as transições permitidas e o
tipo de espectro observado [54].
CAPÍTULO 2:
TÉCNICAS E
P á g i n a | 21
Fig. 2.8: Esquema dos níveis de energia para o espectro no infravermelho.
CAPÍTULO 3: RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.-
P á g i n a | 22
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1.- NANOESTRUTURAS DE L-DIFENILALANINA
Diversas morfologias ou arranjos podem ser formados com nanoestruturas peptídicas,
como nanofios, nanofitas e nanotubos. Foi relatado que amostras de nanoestruturas peptídicas
produzidas em concentração de 5 mg/ml adquirem formas de tubos [19]. O início deste
trabalho teve como objetivo estudar as propriedades morfológicas e estruturais alterando-se o
pH da solução durante sua síntese, utilizaram-se os respectivos pH 3, 7 e 12. Para obtenção
dos dados de difração de raios X, as amostras passaram por secagem e dispersão em um porta
amostra de vidro. Essas medidas têm como objetivo primário a identificação da fase
cristalográfica na qual a amostra se cristaliza. Em seguida, uma análise mais detalhada através
do método Rietveld foi realizada para a obtenção dos parâmetros estruturais com maior
precisão.
Várias medidas de difração de raios X em amostras com diferentes condições de pH
foram realizadas utilizando um difratômetro convencional (não mostrado). Este conjunto de
amostras (pH 3, 7 e 12) foi caracterizado à temperatura ambiente. Pode-se então identificar as
reflexões de Bragg de cada plano cristalográfico para essas amostras de difenilalanina em seus
diferentes pHs. Este conjunto de amostras foi indexado usando o grupo de simetria hexagonal
(P61), Fig. 3.2. Isto está de acordo com o grupo de simetria da estrutura de nanotubos de
peptídeos proposta por Gorbitz [14]. Todas as reflexões observadas pertencem à fase cristalina
hexagonal indicando que não há fases espúrias na amostra que eventualmente poderiam surgir
devido a problemas de síntese ou contaminação. A Fig. 3.1 mostra o difratograma juntamente
com o refinamento dos parâmetros estruturais da amostra de difenilalanina preparada em
solução com pH 7 realizadas em alta resolução. Os parâmetros de rede refinados para esta
amostra, cujo grupo espacial de simetria é P61, foram: a = b = 24,1650(9) Å e c = 5,580(1) Å,
V = 2821,8 Å3, α =90°, β = 90°, γ = 120°. Na Tabela 3.1 são mostrados os índices de Miller
(usados para descrever o conjunto de planos existentes em uma estrutura cristalina) e
distâncias interplanares para as amostras com diferentes valores de pH. Informações mais
detalhadas do refinamento Rietveld e dos parâmetros estruturais encontrados são apresentados
na Tabela 3.2.
P á g i n a | 23
3000
Observado
Calculado
Reflexões permitidas
Diferença
Intensidade (u.arb.)
2000
1000
0
4
8
12
16
20
24
28
2 (graus)
Fig. 3.1: Difratograma em alta resolução de amostra de peptídeo preparada em solução com pH 7,
refinado pelo Método Rietveld. O símbolo x representa a curva observada experimentalmente
(observado), a curva em vermelho representa o modelo (calculado), a curva em azul representa a
diferença entre as curvas experimental e teórica (diferença) e traços em magenta representam as
posições angulares das reflexões permitidas pela fase cristalográfica.
Tabela 3.1: Ângulo de varredura, índice de Miller, distâncias interplanares (d) dada em angstroms da
amostra de peptídeo em pH 7. Dados obtidos em alta resolução.
2θ (graus)
h
k
l
d
2θ (graus)
h
k
l
d
3,39
1
0
0
20,96802
17,58
4
-2
1
4,05824
5,87
2
-1
0
12,1059
17,90
4
-1
1
3,9843
6,78
2
0
0
10,484
18,84
4
0
1
3,78459
8,97
3
-1
0
7,92515
19,76
5
-2
1
3,61219
10,17
3
0
0
6,98932
20,32
5
-4
1
3,50954
11,76
4
-2
0
6,05293
21,46
5
0
2
3,32802
13,44
1
0
1
15,2926
22,36
7
-6
0
3,19759
14,29
2
-1
1
4,98454
23,06
6
-5
1
3,10184
14,68
2
0
1
4,8494
24,56
7
-4
1
2,91629
14,81
5
-2
0
4,810338
25,03
7
-2
1
2,86146
15,58
5
-1
0
4,57559
27,29
8
-5
1
2,62725
15,84
3
-1
1
4,50165
29,81
9
-5
1
2,41002
P á g i n a | 24
7500
Observado
Calculado
Background
Diferença
6000
4500
3000
1500
0
8
12
16
20
24
28
2 (graus)
32
36
40
Observado
Calculado
Background
Diferença
6000
4500
3000
1500
0
8
12
16
20
24
28
32
36
40
2 (graus)
Fig. 3.2: Refinamento Rietveld dos difratogramas de amostras de peptídeos preparadas em solução
com pH 3 (painel à esquerda) e pH 12 (painel à direita).
Os difratogramas das amostras preparadas em pH 3 e 12 são mostrados na Fig. 3.2. O
resultado do refinamento para estas amostras é ilustrado na Tabela 3.2. Com os resultados
expostos na Tabela 3.2 percebe-se que não houve uma variação sistemática nos parâmetros
estruturais a, b e c em relação à variação do pH. Na Fig. 3.2 observa-se no intervalo 8-15° o
surgimento de uma elevação expressiva do “background”. Esse resultado poderia ser
identificado como uma banda amorfa ou provavelmente poderia se tratar de água confinada na
estrutura tubular das amostras. Entretanto, verificou-se tratar de um artefato experimental
relacionado ao equipamento devido à presença desta mesma banda em outras análises
realizadas em amostras diferentes, logo por este motivo não se pode afirmar categoricamente
a inexistência de moléculas de água confinadas. Por este motivo, a indicação da possibilidade
da existência de moléculas de água confinada motivou estudos sobre o comportamento da
água na amostra através de análises térmicas por termogravimetria e calorimetria diferencial
de varredura, subsecção 3.3.1.
P á g i n a | 25
Tabela 3.2: Informações cristalográficas obtidas em diferentes valores de pH. Número de moléculas
por cela unitária (Z). A concordância entre o perfil observado e calculado são os resíduos, obtidos a
partir da diferença entre as intensidades observadas e calculadas. Representa-se a qualidade do ajuste
por Rp, Rwp, RBragg e χ2.
pH 3
pH 7*
pH 12
Fórmula
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
Sistema cristalino
Hexagonal
Hexagonal
Hexagonal
Grupo espacial
P61
P61
P61
a [Å]
24,1827(6)
24,1650(9)
24,177(1)
b [Å]
24,1827(6)
24,1650(9)
24,177(1)
c [Å]
5,432(4)
5,580(1)
5,437(3)
V
2751,06
2821,82
2752,77
Z
6
6
6
Rwp
0,0396
13,611
0,0345
Rp
0,0297
10,044
0,0261
RBragg
1,394
χ2
2,200
1,390
1,549
* Dados obtidos em alta resolução no Laboratório Nacional Luz Síncrotron.
Outra informação relevante acerca da estrutura cristalina seria a obtenção do tamanho
dos domínios com coerência cristalográfica (cristalito). Além disso, esse resultado poderá
auxiliar na interpretação das propriedades morfológicas por Microscopia Eletrônica de
Varredura. No entanto, o tamanho médio dos domínios com coerência cristalográfica das
amostras de NTPs em valores 3 e 12 de pH discriminados acima não pode ser estimado de
forma acurada devido à baixa resolução do equipamento, pois estas amostras forma medidas
em difratômetro convencional. Pode-se entender isso analisando a seguinte equação:
e
2
p
2
(2.4.3)
onde βe é a largura de linha a meia altura da intensidade máxima da reflexão experimental do
plano cristalino e βp é um alargamento artificial causado pelo instrumento. Realizando
medições em uma amostra padrão para encontrar o valor de βp, foi observado que βp é maior
que βe. Neste caso, o resultado da Eq. 2.4.3 o valor numérico não é pertencente aos números
reais, inviabilizando o cálculo do tamanho do domínio com coerência cristalográfica pela
equação de Scherrer. Como as reflexões medidas são estreitas (menores do que o padrão),
qualitativamente, pode-se concluir que o tamanho médio dos domínios cristalográficos é bem
grande, pois quanto menor a largura das reflexões experimentais à meia altura (βe) maior o
tamanho destes domínios.
Por outro lado, como algumas amostras foram medidas no modo de alta resolução no
LNLS, o tamanho médio dos domínios com coerência cristalográfica pode ser obtido. O
tamanho do domínio com coerência cristalográfica (t) pode ser encontrado através de ajustes
de perfil. A amostra padrão no qual é medida no equipamento de difração do LNLS possui um
domínio t com dimensão comparável ao domínio t da amostra de peptídeo. Com ajustes dos
perfis do difratograma experimental levando em consideração o perfil da amostra padrão
conseguiu-se medir o tamanho médio dos domínios com coerência cristalográfica (NTPs em
P á g i n a | 26
pH 7) cujo valor é aproximadamente 1000 Å.
Estudos realizados sobre as propriedades morfológicas mostram microfios com
diâmetro de aproximadamente 4,8 μm (Fig. 3.12). Correlacionando-se este valor com o valor
obtido para o domínio (t = 1000 Å), estima-se 48 domínios com coerência cristalográfica na
direção do diâmetro do microfio. A determinação do tamanho médio dos domínios com
coerência cristalográfica foi obtida por uma média volumétrica baseada levando em
consideração o maior número possível de reflexões. Pode-se também efetuar o cálculo dos
domínios somente para um plano cristalográfico pela equação de Scherrer, no entanto deve-se
levar em consideração o efeito relativo à microdeformação. A microdeformação advém de
como os domínios são deformados, determinou-se que a microdeformação para esta amostra
um valor de 0,1% pode ser desconsiderado. Tanto a microdeformação quanto o tamanho dos
domínios são efeitos que causam alargamentos nos picos de difração. Estes alargamentos
podem ser isotrópicos ou anisotrópicos, ou seja, neste último caso, algumas famílias de planos
são mais largas do que outras. Muitas vezes estes efeitos estão acoplados.
Fig. 3.3: Painel à esquerda mostra a molécula de difenilalanina. Painel à direita mostra a cela unitária
formada por seis moléculas de difenilalanina. Ambos os painéis tratam de amostras em pH 7. Os
átomos de oxigênio, nitrogênio, carbono e hidrogênio são representados por esferas em vermelho,
azul, cinza e brancas, respectivamente.
Na sequência, uma interpretação detalhada e ilustrativa dos resultados obtidos através
do refinamento Rietveld usando a difração de alta resolução é realizada. O arranjo estrutural
na qual a difenilalanina se cristaliza leva a formação espontânea de uma estrutura tubular. A
Fig. 3.3 mostra o arranjo estrutural dos átomos constituintes da cela unitária. No painel à
esquerda tem-se uma molécula de difenilalanina, que corresponde à unidade mínima de
repetição para a amostra cristalina. Assim tem-se que a cela unitária é formada por seis
moléculas de difenilalanina. Os nano canais são formados nos vértices da cela unitária. A
orientação do crescimento do tubo acontece na direção do parâmetro de rede c, a partir da
interação entre as moléculas localizadas nos vértices das celas unitárias mais próximas, Fig.
3.4.
P á g i n a | 27
c
Fig. 3.4: Painel à esquerda mostra a formação cíclica das moléculas de difenilalanina nos vértices da
cela unitária. Painel à direita mostra a nanoestruturação do canal da amostra de peptídeo.
Estas moléculas formam canais com uma forma muito bem definida, que
geometricamente se assemelham a um pseudo-hexágono, ou seja, um hexágono cujos vértices
não pertencem ao mesmo plano. A formação dos canais acontece através da auto-organização
espontânea das moléculas de difenilalanina, que se agrupam formando hexágonos não
fechados, pois as extremidades das moléculas crescem ligando-se aos próximos hexágonos de
forma helicoidal. A água desempenha um papel importante na orientação da formação dos
tubos na direção do eixo c (Fig. 3.5).
O modelo cristalográfico propõe nove sítios cristalográficos para a água, que são
conectadas às moléculas de difenilalanina. As posições dos átomos de oxigênio são
determinadas sugerindo as posições para as moléculas de água por raio de van der Walls. As
moléculas de água formam uma entidade única com ligações de hidrogênio. A estrutura da
água é muito complexa na formação da região tubular da amostra de peptídeo. O canal desta
estrutura de peptídeo é de aproximadamente 10 Å de diâmetro. Este canal é revestido com
doadores e receptores que fazem ligações de hidrogênio com os grupos (-NH3+ e -COO-).
P á g i n a | 28
Fig. 3.5: Posições da água (por raio de van der Waals) no canal da estrutura do nanotubo Ldifenilalanina, esferas em azul. As ligações de hidrogênio entre as moléculas de peptídeo são
mostradas por linhas tracejadas. Cadeias laterais de peptídeos foram omitidas para maior clareza.
O padrão de ligação de hidrogênio entre moléculas de peptídeo é qualitativamente a
mesma em todos as amostras de peptídeo em pH 3, 7 e 12. Observa-se que uma cadeia do tipo
cabeça-cauda com ligações de hidrogênio, estas definem o primeiro nível, formado por uma
cadeia com uma unidade de repetição. Forma-se uma hélice com a mão direita, cada volta
completa envolve quantidade de moléculas correspondentes a uma cela unitária. A hélice é
formada por seis moléculas de difenilalanina capaz de formar uma estrutura rígida e tubular.
As moléculas de água também fornecem átomos adicionais de hidrogênio para os grupos
carboxilato (Fig. 3.5).
P á g i n a | 29
Água
Peptídeo-água
Interações por
ligação de
hidrogênio
Peptídeo
Interações por
ligação covalente
Peptídeo-peptídeo
Interações
eletrostáticas
Entre hélices de peptídeos
Interações do tipo π-stacking
e van der Waals
Entre os nanotubos
Interações do tipo π-stacking
e van der Waals
Formação de
Microestruturas peptídicas
Fig. 3.6: Definição das interações em nanoestruturas peptídicas de difenilalanina e formação das
microestruturas. Veja também Fig. 1.3.
As interações presentes nas moléculas de peptídeo (difenilalanina) são extremamente
importantes para processo de auto-organização. Existe uma interação forte do tipo covalente
na cadeia principal do peptídeo, conferindo rigidez à cadeia. Os peptídeos interagem entre si
formando um padrão de repetição de 6 moléculas, chamado de hélice de peptídeo. Estas
interações são eletrostáticas, pois entre as cadeias do tipo cabeça-calda (carboxilato e grupo
P á g i n a | 30
amino protonado) existe uma diferença de carga elétrica. Os canais internos (hidrofílicos)
possuem moléculas de água que interagem com as cadeias de peptídeo por ligações de
hidrogênio. As hélices de peptídeo possuem anéis benzênicos voltados para fora do tubo
interno hidrofóbico. Assim, estes anéis hidrofóbicos interatuam por uma ligação não
localizada do orbital π, chamado de interações π-stacking. Estas interações conferem
orientação na formação dos tubos na direção do eixo cristalográfico c. Existe também ligação
de van der Waals presente entre as hélices de peptídeos e entre os nanotubos (Fig. 3.6). Esta
ligação propicia a formação das microestruturas peptídicas vistas nas micrografias na
subsecção 3.3.2.
Tabela 3.3: Ângulos de torção [°].
pH 7 *
ψ1 (N4-C10-C26-N8)
ω1 (C10-C26-N8-C27)
145,39
163,73
Φ2 (C26-N8-C27-C43)
73,57
ψT (N8-C27-C43-O2)
23,75
1
1
2 ,1
1
2, 2
1
1
2
2 ,1
2
2, 2
2
(N4-C10-C12-C15)
69,20
(C10-C12-C15-C16)
113,63
(C10-C12-C15-C24)
-64,05
(N8-C27-C29-C32)
-101,91
(C27-C29-C32-C33)
177,10
(C27-C29-C32-C41)
θ (C12-C10...C27-C29)
-1,41
45,51
* Dados obtidos em alta resolução no Laboratório Nacional Luz Síncrotron.
Uma descrição simplificada da conformação molecular de um dipeptídeo é fornecida
pelo ângulo de torção θ (C12-C10…C27-C29) que define as posições relativas das duas cadeias
laterais, como mostra o esquema da Fig. 3.7.
C
θ
P á g i n a | 31
COO-
N
H3+N
O
(A)
C
(B)
Fig. 3.7: (A) Definição de ângulo de torção de forma genérica para todos os tipos de dipeptídeos. (B)
Estrutura molecular do dipeptídeo difenilalanina.
Pode ser imediatamente reconhecido que as moléculas representadas na Fig.3.7 (B)
ocorrem em conformações mais incomuns com ambas as cadeias laterais localizadas no
mesmo lado do plano definido pela ligação peptídica. Todos têm θ < 43,10°, descrito na
Tabela 3.3. Os ângulos de torção regulares, também descrito na Tabela 3.3, mostram que os
valores são raros para θ sustentado principalmente por uma rotação em torno da ligação N8C27. Amostras com diferentes pHs possuem diferentes ângulos de torção ω1 (C10-C26-N8-C27).
Logo a variação do ângulo de torção para ω1 é -163,73° < θ < 177,62°.
Dessa forma, uma descrição detalhada da estrutura cristalina, e do grupo de simetria,
refinada através do método Rietveld usando dados obtidos no modo de alta resolução é
apresentada para essas nanoestruturas de peptídeos. Não foi observada uma variação
significativa nos parâmetros de rede dessas amostras quando sintetizadas em soluções com
diferentes pHs. Estudos detalhados sobre a estrutura da amostra de L-difenilalanina realizados
nesta subsecção foram importantes para o melhor entendimento acerca da formação dos
nanotubos e sobre a influência do pH na estruturação destes. Dessa forma, amostras de
nanotubos produzidas em solução com pH 7 foram escolhidas para a intercalação da
microperoxidase-11, pois estas foram minuciosamente caracterizadas por difração de raio-x e
apresentam ambiente favorável para hospedar o peptídeo sem desnaturá-lo.
P á g i n a | 32
3.2.- INTERAÇÃO
DIFENILALANINA
DA
MP11
EM
NANOESTRUTURAS
DE
L-
Estudos sobre o crescimento dos nanotubos mostraram que estes canais possuem
moléculas de água na parte interna que são responsáveis pela sua orientação. Dessa forma,
sugere-se que os tubos formados podem acomodar íons metálicos em sua própria estrutura ou
nos nano canais, pois estes canais possuem diâmetro aproximado de 10Å. Neste sentido,
amostras de nanofios/nanotubos dopadas com íons de ferro(III) são de interesse especial. A
possibilidade de obtenção desses materiais foi motivada por estudos teóricos e experimentais
acerca de um possível acoplamento magnético entre os íons de metais de transição [56,57]
fomentando a possibilidade da obtenção de nanofios magnéticos. Com o intuito de se obter
um melhor entendimento acerca de um eventual acoplamento magnético entre esses íons,
introduzidos na matriz nanofios/nanotubos, amostras dopadas com microperoxidase (MP11),
contendo o íon de Fe(III), foram produzidas.
Três amostras com concentrações diferentes de MP11 e com valores constantes de pH
igual a 7 foram produzidas. As concentrações de partida foram 0,744 mg/L, 0,1488 mg/L e
3,72 mg/L, denominadas respectivamente de X, 2X e 5X.
4200
Observado
Calculado
Diferença
Reflexões
permitidas
2000
3000
1000
0
-1000
5
10
15
20
2 (graus)
25
30
Observado
Calculado
Diferença
Reflexões
permitidas
2800
1400
0
4
8
12
16
20
24
28
2 (graus)
Fig. 3.8: Padrões de difração de raios X em alta resolução das amostras preparadas em solução de pH
7 e com as concentrações diferentes de MP11, 2X (painel à esquerda) e 5X (painel à direita). Marcas
de escala encontram-se abaixo dos perfis experimentais indicando as posições das reflexões permitidas
de Bragg para o grupo espacial de simetria hexagonal (P61).
Medidas de difração de raios X das amostras de peptídeos em solução de pH 7 com
duas concentrações diferentes de MP11 são mostrados na Fig. 3.8. Todas as reflexões
observadas associadas a uma dada família de planos foram indexadas como pertencendo ao
grupo espacial de simetria hexagonal P61. Observa-se que com adição de MP11 as distâncias
entre os planos cristalográficos são alteradas, influenciando os parâmetros de rede. A
introdução de MP11 na matriz resulta no aumento dos parâmetros a e b e uma diminuição do
P á g i n a | 33
parâmetro c. Descrição mais detalhada das informações cristalográficas encontra-se na Tabela
3.4. Além disso, pode-se inferir que existe uma introdução da molécula de MP11 na matriz de
peptídeo, através da observação da alteração da coloração da amostra resultante. Assim, os
microfios/microfitas apresentaram uma cor púrpura, característica do íon metálico de Fe(III)
presente na MP11. As propriedades magnéticas serão caracterizadas através de medidas
macroscópicas (susceptibilidade magnética) e espectroscópicas (ressonância paramagnética
eletrônica). Embora essas caracterizações estejam em andamento, esses estudos estão além do
escopo deste trabalho.
Tabela 3.4: Informações cristalográficas de amostra de peptídeo em pH 7 obtidos em diferentes
valores de concentração de MP11, medidas realizadas no modo de alta resolução.
pH 7 (puro)
pH 7+2xMP11
pH 7+5xMP11
Fórmula
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
Sistema cristalino
Hexagonal
Hexagonal
Hexagonal
Grupo espacial
P61
P61
P61
a [Å]
24,1650(9)
24,2080(1)
24,2099(9)
b [Å]
24,1650(9)
24,2080(1)
24,2099(9)
c [Å]
5,580(1)
5,470(4)
5,4798(3)
V
2776,81
2776,09
2776,41
Z
6
6
6
Rwp
13,611
13,657
13,199
Rp
10,044
10,292
9,981
RBragg
1,394
1,372
1,439
χ2
1,390
1,394
1,388
3.3.- TRANSIÇÃO
TEMPERATURA
3.3.1-
DE
FASE
ESTRUTURAL
INDUZIDA
PELA
Propriedades Térmicas
As nanoestruturas estudadas neste trabalho são formadas pela automontagem de
moléculas de L-difenilalanina devido a vários tipos de interações como: ligações de
hidrogênio entre as moléculas de peptídeo-peptídeo e peptídeo-água [6], eletrostáticas entre as
cadeias do tipo cabeça-calda, van der Waals e π-stacking entre as cadeias laterais aromáticas
(ver Fig. 3.6). A literatura revela que a água realiza um papel importante na formação e
estruturação desses nanotubos. Em especial, com base na estrutura cristalina, Görbitz [14]
mostrou que o empilhamento de moléculas aromáticas de difenilalanina ocorre em uma matriz
em torno da molécula de água. Desta forma, as fibrilas são crescidas ao longo da direção do
canal de água, por ligações de hidrogênio, assim alterando o ponto de ebulição da molécula de
água. Assim, a realização de um estudo acerca das propriedades térmicas revelando
assinaturas de qualquer natureza e a influência da água na estruturação desses materiais
P á g i n a | 34
assume importância significativa [14].
Primeiramente, algumas propriedades térmicas foram estudadas através da análise
termogravimétrica (TGA) e calorimetria diferencial de varredura (DSC). O estudo do
comportamento térmico de um dado sistema pode revelar pontos importantes em relação à
perda de massa e estabilidade térmica do material em análise, e que variações abruptas do
fluxo do calor em DSC eventualmente estejam associadas a algum tipo de transição de fase
[58].
Análise Termogravimétrica: A Fig. 3.9 (A) mostra um termograma com resultados da
perda de massa da amostra em função da temperatura. A amostra começa perder quantidades
significativas de massa de forma espontânea pelo calor fornecido, a temperatura relacionada
ao inicio deste processo chama-se de temperatura de degradação, que se inicia a partir de
218,4 °C até 295,7 °C, neste intervalo houve uma diminuição expressiva na massa passando
de 4,52 mg para uma massa residual de 0,08941 mg (cerca de 1,66% da massa inicial),
confirmando sua completa degradação. A curva em azul mostra a derivada da taxa de variação
da massa da amostra com o aumento da temperatura. Na Fig. 3.9 (B) existem dois picos
importantes no gráfico da derivada da massa em relação à temperatura que podem
corresponder à evaporação das moléculas de água: 132 °C e 162 °C. Estas moléculas estão
presentes na superfície e no interior do canal, assim, é sugerido que estas temperaturas
correspondem à evaporação da água da superfície e do interior do nanotubo, respectivamente.
Realmente, foi encontrada uma temperatura para evaporação acima de 100 °C para as
moléculas de água, isto acontece porque estas estão mais fortemente ligadas no interior da
estrutura dos nanotubos por ligações intermoleculares de hidrogênio fazendo com que as
temperaturas de evaporação sejam mais elevadas. A total liberação da água acontece até
aproximadamente 162 °C, estima-se uma perda de 7,3% de massa entre o intervalo de
temperatura de 111 °C a 160 °C. Estes resultados são similares aos obtidos recentemente por
Ryu et al. [58].
P á g i n a | 35
0.20
Massa (mg)
5
(A)
39.55min
218,4
C
218.43°C
4,52mg
4.517mg
18.60min
113,7 C
113.69°C
4,90mg
4.897mg
288,1 C
0,17mg/ C
53.48min
288.06°C
0.1727mg/°C 0.15
0.00min
22,6
C
22.62°C
5.37mg
4 5.373mg
131,8 C
22.23min
4.78mg
131.83°C
4.782mg
28.32min
162,3
C
162.25°C
4,54mg
4.542mg
0.10
3
4,43mg
4.428mg
26.56min
153.48°C
153,5
C
0.01285mg/°C
0,013mg/
C
2
1
0.05
0.00
40,0
C
3.84min
0,010mg/
39.96°C C
0
20
124,220.71min
C
0,0096mg/
C
124.22°C
0.009945mg/°C
60
100
0.009580mg/°C
140
180
295.66°C
295,7 C
55.02min
0,090mg
0.08941mg
(A)
Deriv. Troca de Massa (mg/°C)
6
-0.05
220
260
300
340
Temperatura(°C)
5
(B)
(A)
(mg)
Massa(mg)
Massa
(mg)
Massa
4.8
44
4.6
33
4.4
22
4.2
1
0,013mg/ C
137.25 C
117.18 C
295.66°CC
295.66°C
0.03355mg·min/
124,220.71min
C20.71min
0.009560mg·min/
C
55.02min
39.96°CC
124.22°C
295,7
C
0,010mg/
55.02min
0,0096mg/
C
39.96°C
124.22°C
0.08941mg
0.009580mg/°C
0.009945mg/°C
0,090mg
0.08941mg
0.009580mg/°C
0.009945mg/°C
1
4.0
3.84min
40,0
C
3.84min
3.8
00
20
110
20
0.00
0.00 0.00
(A)(B)
(mg/°C)
Massa(mg/°C)
Deriv.Troca
Trocade
deMassa
Deriv.
5.0
5
0.20
0.20 0.20
39.55min
18.60min
39.55min
18.60min
113,7 C
288,1 C
218.43°C
113.69°C
218,4
C
0.1192mg
218.43°C
113.69°C
4,90mg
0,17mg/
C
4.517mg
4.897mg
140.59
C
4,52mg
53.48min
4.517mg
4.897mg
53.48min
(2.219%)
288.06°C
4.744mg
288.06°C
121.14 C
0.15
0.1727mg/°C
0.15 0.15
0.1727mg/°C
0.1966mg
0.00min
0.00min
22,6
C
(3.659%)
22.62°C
22.62°C
28.32min
5.37mg
147.51 C
28.32min
162,3
C
C
5.373mg 126.58131,8
5.373mg
162.25°C
C
22.23min 4,54mg
162.25°C
22.23min
0.10
4.542mg
4.78mg
0.10 0.10
131.83°C 4.542mg
131.83°C
4.782mg
4.782mg
111.35 C
134.72 C
156.82 C
4.907mg
4.772mg
4.428mg
4,43mg
4.428mg
11.19% (5.373 mg)
0.05
0.05 0.05
26.56min
26.56min
153.48°C
153.48°C
153,5
C 154.02°C
124.03°C
0.01285mg/°C
0.01285mg/°C
Deriv. Troca de Massa (mg/°C)
5.2
66
-0.05
-0.05 -0.05
60120 100
100130140
140 140
220 260160
260 300 300
150
170340 340
180
60
180180 220
5
(mg/°C)
Massa(mg/°C)
Deriv.Troca
Trocade
deMassa
Deriv.
Temperatura
(°C)
Temperatura(°C)
Temperatura(°C)
Fig. 3.9: (A) Resultados
da análise termogravimétrica mostrando a variação0.20
de massa em função da
6
0.20
5.2
39.55min
temperatura. Utilizou-se uma18.60min
rampa de aquecimento
de 5 °C/min, iniciando a temperatura ambiente e
218.43°C
113.69°C
0.1192mg
finalizando a 350
°C. (B) Uma
ampliação140.59
do termograma.
4.517mg
4.897mg
C
53.48min
(2.219%)
5.0
(B)
(mg)
Massa (mg)
Massa
288.06°C
4.744mg
121.14 C
0.15
0.1727mg/°C 0.15
0.1966mg
0.00min
(3.659%)
4.8 22.62°C
28.32min
147.51 C
4 5.373mg 126.58 C
162.25°C
22.23min
Calorimetria Diferencial
de Varredura (DSC): Medidas de calorimetria
diferencial
0.10
0.10
131.83°C 4.542mg
4.6
4.782mg
111.35
foram realizadas3 com
o Cobjetivo de
verificar
possíveis transições de fase associadas à saída de
134.72
C
156.82 C
4.907mg
4.772mg
4.428mg
4.4 ou qualquer outra
água do sistema
transição
foram obtidos
11.19%
(5.373 mg) espontânea. Dois termogramas
0.05
0.05
26.56min
2
153.48°C
com valores diferentes de124.03°C
rampa de aquecimento/resfriamento,
5 e 10 °C/min, representados
154.02°C
0.01285mg/°C
4.2
na Fig. 3.10 (A) e Fig. 3.10 (B), respectivamente. Dois picos0.00
indicando variações
0.00
1
137.25 C
117.18 C
4.0
3.84min
significativas no fluxo
de0.009560mg·min/
calor são20.71min
observados
na295.66°C
Fig. C3.10 (A). (B)
Essas variações ocorrem nas
0.03355mg·min/
C
55.02min
39.96°C
124.22°C
0.08941mg
0.009945mg/°C
temperaturas 136,5
°C e 181,3 °C0.009580mg/°C
e seus respectivos
valores de variação
0
-0.05 de entalpia foram
3.8
-0.05
20
60120 100130 140 140 180 150
220
260
300
340
110
160
170
180
estimados em 53,50 J/g e 48,77 Temperatura
J/g. É importante
salientar que essas variações são
(°C)
Temperatura(°C)
irreversíveis ocorrendo apenas durante o primeiro processo de aquecimento. Esse resultado
P á g i n a | 36
sugere uma dependência com a perda parcial de material. Como o fluxo de calor é positivo, o
processo é classificado como endotérmico, isto é, ocorre uma absorção de calor durante a
transição, estes resultados são similares aos obtidos recentemente por Ryu et al. [58]. Três
etapas foram adotadas para o ciclo térmico de aquecimento/resfriamento na amostra: (i)
inicia-se em 25 °C e aquece a amostra até 200 °C, (ii) a partir de 200 °C resfria-se até -30 °C
e (iii) de -30 °C aquece-se até 200 °C. Na Fig. 3.10 (A) observa-se que durante as etapas (ii) e
(iii) não ocorre uma mudança significativa na variação do fluxo de calor. No entanto
evidencia-se uma variação no fluxo de calor entre os ciclos (ii) e (iii) com valor mínimo de
99,10 mW/g e máximo de 0,2 W/g.
0.5
0.2024W/g
(A)
Fluxo de calor (W/g)
(ii)
0.0
0.09910W/g
(iii)
26.79°C
165.64°C
48.77J/g
0.3859W/g 133.25°C
53.50J/g
(i)
181.31°C
-0.5
106.16°C
-1.0
(A)
136.46°C
-1.5
-30
-10
10
30
50
70
90
110
Temperatura (°C)
130
150
170
190
0.5
(ii)
(B)
167.91°C
51.56J/g
(iii)
0.0
43.48 C
-0.5
0.5215W/g
(i)
135.38°C
55.83J/g
184.00°C
100.15 C
-1.0
-1.5
-2.0
139.63°C
-2.5
-30
-10
10
30
50
70
90
110
(B)
130 150 170 190
Temperatura (°C)
Fig. 3.10: Calorimetria Diferencial de Varredura na amostra de dipeptídeo ajustada em pH 7 com
rampa de aquecimento de 5 °C/min (painel superior) e 10 °C/min (painel inferior). Adota-se a seguinte
sistemática para o ciclo térmico: temperatura ambiente até 200 °C (i) resfriamento até a temperatura de
-30 °C (ii) e aquecendo novamente até 200 °C (iii).
P á g i n a | 37
Uma variação na rampa de aquecimento para 10 °C/min resulta em uma sutil alteração
das temperaturas críticas relacionadas às variações mais significativas no fluxo de calor como
mostrado na Fig. 3.10 (B). Novos valores foram encontrados para estas temperaturas: 139,6
°C e 184 °C com valores respectivos de entalpia de 55,83J/g e 51,56J/g. Valores para a
entropia foram determinados nas mesmas temperaturas segundo a relação S = H/T, obtevese 46,01 e 37,9 J.mol-1.K-1, respectivamente. No processo endotérmico a amostra deve receber
mais calor que o material de referência usado nas medições de DSC. O calor em excesso
transferido para amostra em termos de uma variação aparente da capacidade calorífica a
pressão constante, Cp, durante a varredura da temperatura conduz a um cálculo simples da
variação de entalpia associada ao processo que ocorre na amostra. A capacidade calorífica
pode ser calculada através da variação da entalpia,
H, em uma variação finita de
temperatura, T, em que esta ocorre. Pode-se determinar a capacidade calorífica pela relação
H = Cp T. No termograma com rampa de 5 °C/min tem-se para a primeira e segunda
transição Cp = 3,32 e 1,17 J/g K-1, respectivamente. Para o termograma com rampa de 10
°C/min tem-se para a primeira e segunda transição Cp = 2,89 e 1,18 J/g K-1, respectivamente.
Assim tem-se que as capacidades caloríficas em temperaturas abaixo da segunda transição (T
~ 181 °C, para termograma com rampa de 5 °C/min) são maiores.
Com o objetivo de obter um melhor entendimento acerca da irreversibilidade destas
alterações parte do material utilizado passou por um tratamento térmico a 190 °C por 40
minutos. Na sequência, o material foi hidratado com o objetivo de obter o material de partida
depois de ter apresentado supostas transições de fase devido a perda de moléculas de água. É
conhecido que o processo de formação das nanoestruturas peptídicas depende fortemente da
água para a auto-organização e formação dos canais dos nanotubos [14]. Dessa forma, depois
da ressuspensão em água e secagem a temperatura ambiente, a amostra foi submetida à
análise de DSC seguindo os mesmos parâmetros experimentais mostrados na Fig. 3.10 (A). A
Fig. 3.11 mostra os resultados obtidos depois da hidratação do material. Percebe-se que não
existe uma variação expressiva do fluxo de calor, tampouco se identifica o pico relacionado à
variação estrutural deste material. Esses resultados sugerem que outras alterações, além da
saída da água, aconteceram, pois não foram identificados novos picos depois da hidratação do
material. Para obter um melhor entendimento acerca dessas variações de calor e
eventualmente associá-los a uma possível transição de fase estrutural, medidas de difração de
raios X e espectroscopia no infravermelho foram realizadas.
P á g i n a | 38
0.2
0.1
0.2223W/g
0.07270W/g
0.0
-0.1
-0.2
-30 -10 10
30
50
70
90 110 130 150 170 190
Temperatura (°C)
Fig. 3.11: Análise de Calorimetria Diferencial de Varredura na amostra de dipeptídeo ajustada em pH 7
com rampa de aquecimento de 5 °C/min. Antes da análise, a amostra foi tratada termicamente a 190
°C e depois ressuspensa em H2O.
3.3.2-
P á g i n a | 39
Propriedades Morfológicas
A morfologia das nanoestruturas de difenilalanina é determinada por interações
intermoleculares. Com o aumento da temperatura, algumas ligações são rearranjadas, como
por exemplo, as ligações de hidrogênio entre as moléculas de difenilalanina e água [58]. As
morfologias do tipo tubos, fios e fitas podem ser formadas pela automontagem das moléculas
de difenilalanina através de ligações de hidrogênio entre os anéis aromáticos e interações
eletrostáticas. As ligações intermoleculares nestas amostras acontecem entre peptídeopeptídeo e peptídeo-molécula de água, assim como interações aromáticas (π-π) entre as
cadeias laterais aromáticas têm sido relatadas [59].
As propriedades morfológicas desses materiais formados por peptídeos foram
estudados através de microscopia eletrônica de varredura. Além de uma caracterização geral
desses materiais, correlacionou-se os picos característicos observados nas análises térmicas
com uma possível alteração conformacional na amostra. Imagens de MEV foram obtidas após
a amostra passar por tratamentos térmicos subsequentes a T = 25, 137, 165, 190 e 220 °C.
4.8μm
Fig. 3.12: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra obtida na temperatura ambiente.
P á g i n a | 40
A Fig. 3.12 mostra imagens obtidas de uma amostra de peptídeo à temperatura
ambiente. Observam-se microfios/microfitas dispostos de forma aleatória que aparentemente
possuem pouca rugosidade. Convém salientar que a morfologia do tipo fio, fita ou tubo dessas
amostras depende fortemente das condições de síntese. Estima-se um diâmetro de 4,82 µm
para estes microfios/microfitas. A disposição bem orientada e ordenada dos nanotubos na
formação dos microfios/microfitas pode ser explicada por interações entre os anéis aromáticos
( interações π-stacking) e por forças de van der Walls na região superficial destes materiais.
Fig. 3.13: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra tratada em 137 °C.
Na Fig. 3.13 identifica-se a presença de várias morfologias na amostra tratada à
temperatura de 137 °C: microtubos (extremidade quase circular e aberta), microfios
(extremidade fechada se assemelhando a um tronco de pirâmide) e microfitas. Em
comparação com as imagens da Fig. 3.12 percebe-se que na Fig. 3.13 as microestruturas têm
um aspecto mais fragmentado, pois surgem pequenas frações em sua superfície.
P á g i n a | 41
Fig. 3.14: Imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra tratada a 165 °C.
A Fig. 3.14 evidencia imagens consideravelmente diferentes das micrografias
anteriores. Pequenas cerdas, ou nanofios, misturadas aos microfios/microfitas são observadas.
A imagem de mais alta resolução sugere um desmembramento de nanofios ocorrendo logo
acima do primeiro pico de variação no fluxo de calor T ~ 140 °C. A dispersão dessas cerdas,
nanofios ou nanotubos, pode ser causada pela quebra das ligações de hidrogênio devido à
amostra ter sido submetida a tratamentos térmicos em altas temperaturas [60]. Desta forma as
ligações presentes entre peptídeo-molécula de água e peptídeo-peptídeo são perdidas. Foi
encontrada por Victoria et al. [61] em micrografias obtidas por AFM de nanotubos de Ldifenilalanina uma diminuição em 82% na altura e 66% na largura quando estas foram
tratadas termicamente a 150 °C, resultando em estruturas semelhantes a fitas. Micrografias
obtidas por Hartgerink et al. [62] para este mesmo tipo de amostra quando submetida a
temperaturas acima de 150 °C, revelam uma desagregação similar ao encontrado no presente
trabalho. Na subsecção 3.3.1 (Fig. 3.10), observa-se que o início da segunda transição em
calorimetria diferencial de varredura acontece em T ~ 165 °C. Nesta temperatura sugere-se
que está relacionada à queima/combustão parcial de material. O material perdido com o
aumento de temperatura (T = 165 °C) seria, portanto as pequenas cerdas observadas na Fig.
3.14.
(A)
P á g i n a | 42
(B)
(C)
Fig. 3.15: AFM (A) e MEV (B) mostrando a formação da estrutura peptídica (difenilalanina)
preparados em solução de pH 7. Cortesia Ref. 29.
A literatura relata que nas condições adotadas de síntese no presente trabalho (síntese
em fase líquida) para produção de amostras de peptídeo pode-se observar a formação de
estruturas na escala nanométrica. A Fig. 3.15 ilustra a formação orientada de tubos formando
uma estrutura fibrilar. [29]. Assim, pode-se sugerir que a formação das pequenas cerdas, ou
nanofios, misturadas aos microfios/microfitas (Fig. 3.14) são um desarranjo da estrutura
fibrilar.
P á g i n a | 43
A micrografia obtida da amostra tratada termicamente a 190 °C é mostrada na Fig.
3.16. Como pode ser verificado, não se observa mais a desagregação das cerdas, nanofios ou
nanotubos, em torno das microestruturas. Neste caso, as nanoestruturas se assemelham mais a
uma microfita.
Na Fig. 3.17 identifica-se uma microfita mais rugosa e quebradiça após o aumento da
temperatura de tratamento térmico. Estruturas nanométricas de forma orientada também
podem ser identificadas. Como previsto pelos resultados da TGA, a degradação total destas
microestruturas de difenilalanina ocorre acima de 300 °C, mostrada na Fig. 3.18.
P á g i n a | 44
Fig. 3.19: Comparação das imagens de microscopia eletrônica de varredura da amostra de peptídeos
tratadas em diferentes temperaturas.
Dessa forma, pode-se concluir através dos dados de microscopia eletrônica de
varredura que ocorre alteração significativa na morfologia dessas amostras quando tratadas
termicamente. Assim, se observa que há uma tendência para formação de microfitas com o
aumento da temperatura de tratamento, além do aparecimento de cerdas nas microestruturas.
Estas são as principais evidências de alterações morfológicas. A observação da desagregação
de nanofios/nanotubos dos microfios/microfitas na temperatura de T = 165 °C sugere
correlação com o primeiro pico de variação do fluxo de calor T = 140 °C, observado através
da análise térmica. Esse resultado sugere fortemente que essas microestruturas são formadas
pela automontagem de nanotubos/nanofios.
3.3.3-
Propriedades Estruturais
3.3.3.1.-
Difração de Raios X
P á g i n a | 45
A confirmação de que realmente houve uma transição de fase estrutural, sugerida pelos
resultados das análises térmicas, foi realizada através da difração de raios X. É importante
destacar que a análise térmica revela duas temperaturas críticas, T = 136,5 °C e 181,3 °C,
estas podem estar relacionadas a eventuais transições de fase. As medidas de difração foram
realizadas (no modo) ex-situ. Dessa forma, as amostras passaram por processos de tratamento
térmico seguindo os resultados obtidos na calorimetria diferencial. As medidas de DRX foram
realizadas ao final de cada tratamento térmico. Por exemplo, depois da realização da medida à
temperatura ambiente, a amostra foi submetida a um tratamento térmico com o auxílio de uma
mufla por vinte minutos a 80 °C. Então a amostra é retirada da mufla e resfriada até a
temperatura ambiente para a realização da segunda medida de DRX. Em seguida, a amostra
passa novamente pela mufla à temperatura de 140 °C é resfriada e obtém-se um novo
difratograma e assim se segue até a temperatura de 310 °C. As temperaturas utilizadas no
tratamento térmico foram respectivamente: 80, 140, 150, 170, 190, 220, 260 e 310 °C.
Medidas realizadas em T = 310 °C apresentaram apenas um perfil amorfo indicando uma
degradação completa da amostra. O resultado comparativo entre as reflexões observadas e
permitidas podem ser observadas nas Figuras 3.20, 3.21 e 3.23.
P á g i n a | 46
Fase Hexagonal P61
T = 25°C
T = 80°C
T = 140°C
20000
10000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2 (graus)
Fase Hexagonal P61
20000
T = 25°C
T = 80°C
T = 140°C
(2 -1 0)
(5 -3 0)
(5 -1 0)
(2 0 0)
10000
0
7.0
7.5
8.0
8.5
18.5
19.0
19.5
20.0
2 (graus)
Fig. 3.20: Comparação dos difratogramas das amostras de peptídeo tratadas termicamente em
diferentes temperaturas. O grupo espacial de simetria indexado é Hexagonal P61.
Através da Fig. 3.20 pode-se concluir que a fase cristalográfica não é alterada quando
a amostra é submetida a diferentes tratamentos térmicos apenas até a temperatura de transição
de fase. Todas as reflexões observadas são pertencentes ao grupo de simetria P61. No entanto,
com o aumento da temperatura de tratamento térmico evidenciou-se que as reflexões se
deslocaram para ângulos mais baixos. Dessa forma, pode-se concluir através da Lei de Bragg,
que as distâncias interplanares estão aumentando. Esses resultados indicam que o aumento da
temperatura de tratamento resulta em um aumento das distâncias interplanares. É importante
mencionar que embora as análises fossem feitas depois de cada tratamento térmico, as
medidas foram realizadas à temperatura ambiente, ou seja, depois que a amostra se resfriou.
Nota-se uma redução significativa na intensidade das reflexões dos conjuntos de planos (2 -1
0) e (5 -3 0). Este resultado sugere que a amostra pode estar perdendo material, o que
corrobora os resultados de microscopia eletrônica de varredura e calorimetria diferencial.
P á g i n a | 47
14000
T = 135°C
T = 140°C
Hexagonal P61
12000
(A)
Intensidade ( u. arb. )
10000
T = 140°C
T =150°C
8000
(B)
6000
4000
T = 135°C
T =170°C
Hexagonal P61
2000
(C)
0
8
10
12
14
16
18
20
2 ( graus)
22
24
26
28
30
Fig. 3.21: Difratogramas das amostras de peptídeo tratadas termicamente. (A) Comparação dos
tratamentos a 135 °C e 140 °C com grupo de simetria hexagonal P61. (B) Comparação de dois
tratamentos com temperaturas de 140 °C e 150 °C. (C) Comparação das demais temperaturas em 135
°C, 170 °C com o grupo de simetria hexagonal P61.
A Fig. 3.21 ilustra difratogramas da amostra tratada termicamente em outros valores
de temperatura (135, 140, 150 e 170 °C). Em T = 135 °C observam-se reflexões intensas e
larguras a meia altura estreitas quando comparadas às do diagrama obtido em T = 140 °C.
Nesta temperatura as reflexões se alargam indicando uma diminuição do tamanho dos
domínios com coerência cristalográfica o que anuncia uma aparente amorfização e com o
aumento da temperatura de tratamento surge uma recristalização com possível alteração
estrutural. Em T = 150 °C, várias reflexões não esperadas, baseado no grupo de simetria
hexagonal, aparecem e outras esvanecem. Esse resultado sugere fortemente alteração no
grupo de simetria, ou seja, uma transição de fase estrutural. Comparando-se as posições em 2θ
da amostra tratada em diferentes temperaturas, percebe-se que a transição de fase ocorre
aproximadamente a 140 °C. A amorfização da amostra acontece quando esta começa a
transitar para a nova fase, assim os picos ficam mais largos e menos definidos. Na
temperatura de 150 °C as reflexões se estreitam novamente e ficam mais intensas. A
indexação dessas novas reflexões de Bragg foi realizada e o grupo de simetria determinado. A
Fig. 3.22 mostra um refinamento do difratograma obtido em T = 190 °C utilizando o grupo de
P á g i n a | 48
simetria ortorrômbico Pba2.
O processo de solução de estrutura cristalina inicia-se com a determinação do grupo
espacial através da indexação dos planos cristalográficos. Esta tarefa é geralmente realizada
por uma cuidadosa investigação das intensidades observadas, visando caracterizar os grupos
de extinção, isto é, grupos teoricamente não representam os dados experimentais. O programa
utilizado para a determinação da estrutura cristalina e seus respectivos parâmetros de rede
possui um procedimento probabilístico visando reconhecer o símbolo de extinção [63]. Utiliza
as estatísticas da intensidade normalizada z (como extraídas pelo método Le Bail) para
calcular a probabilidade de cada símbolo de extinção compatível com o sistema cristalino
sugerido pelo procedimento de indexação. O DASH é um programa utilizado para a
indexação do grupo espacial, tem como implemento interno uma versão do DICVOL [ 64]. Um
peso adequado z está associado a cada intensidade de reflexão, dependendo da confiabilidade
esperada de sua estimativa. O algoritmo fornece uma probabilidade para cada símbolo da
extinção do sistema cristalino considerado. A baixa precisão das intensidades de reflexão pode
invalidar o cálculo da probabilidade associada a cada grupo de extinção que é compatível com
o sistema cristalino determinado na etapa de indexação. O procedimento para a determinação
da estrutura cristalina pelo software EXPO 2009 é eficiente proporcionando bons resultados
[65,66].
6000
Observado
Calculado
Diferença
Reflexões Permitidas
4500
3000
1500
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2 (graus)
Fig. 3.22: Refinamento Rietveld do difratograma de amostra de peptídeo tratada termicamente a 190
°C. A fase cristalina encontrada é a ortorrômbica com grupo de simetria Pba2.
A identificação da fase cristalina foi realizada utilizando a amostra tratada
termicamente a 190 °C. A Figura 3.22 mostra detalhes do diagrama de difração de raios X
com o refinamento das reflexões experimentais utilizando o modelo com grupo de simetria
ortorrômbico Pba2. Outros subgrupos de simetria como o Pna21 também apresentou uma
P á g i n a | 49
significativa representabilidade do sistema. O grupo de simetria Pba2 retornou o melhor valor
de χ² em comparação ao grupo de simetria Pna21 quando indexados usando o programa Topas
Academic v.4.1 [67]. Apesar dos dois grupos pertencerem ao mesmo grupo espacial,
ortorrômbico, as operações de simetria são diferentes. Parâmetros da qualidade dos ajustes
indicam um refinamento com grande confiabilidade. A estrutura cristalina com as moléculas
de peptídeo alocada na cela unitária é mostrada na Fig. 3.23.
(B)
(A)
Fig. 3.23: (A) Molécula de peptídeo, formando uma unidade mínima para a formação da cela unitária.
(B) Empacotamento das moléculas de peptídeo na cela unitária.
Tabela 3.5: Informações cristalográficas da amostra de peptídeo tratadas nas respectivas temperaturas:
ambiente, 80 °C, 140 °C e 190 °C.
T = 25 °C
T = 80 °C
T = 140 °C
T = 190 °C
Fórmula
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
C18 H20 N2 O5,5
Sistema cristalino
Grupo espacial
a [Å]
b [Å]
c [Å]
V
Z
Rwp
Rp
RBragg
χ2
Hexagonal
P 61
24,1649(9)
24,1649(9)
5,579(1)
2821,82
6
13,611
10,044
1,394
1,390
Hexagonal
P 61
24,1473 (5)
24,1473 (5)
5,5873(6)
2821,45
6
5,553
4,189
2,449
1,535
Hexagonal
P 61
24,1842(4)
24,1842(4)
5,5960(8)
2834,51
6
9,515
6,035
12,121
2,572
Ortorrômbica
Pba2
23,9467(10)
10,3428(4)
4,0843(9)
1011,57(23)
4
4,268
3,194
0,355
1,150
Os resultados do refinamento Rietveld da amostra em análise tratada em diferentes
temperaturas T = 25, 80, 140 e 190 °C são mostrados na Tabela 3.5. Os parâmetros de rede da
amostra após o tratamento térmico até 140 °C possuem resultados muito semelhantes. A
P á g i n a | 50
amostra tratada termicamente a temperaturas abaixo de 140 °C foi indexada no grupo de
simetria hexagonal P61. A amostra tratada termicamente a 150 °C pode ser classificada ao
mesmo grupo de simetria Pba2 da amostra a 190 °C cujas informações estruturais foram
obtidas pelo refinamento Rietveld. Dessa forma, conclui-se que as amostras de peptídeo
sujeitas a tratamentos térmicos acima de 140 °C experimentam uma transição de fase de
grupo de simetria hexagonal P61 para ortorrômbico Pba2. A Tabela 3.6 mostra os parâmetros
de rede para temperaturas acima da transição de fase estrutural, assim observa-se que o
aumento da temperatura proporciona um aumento do volume da cela unitária, apesar de que a
variação dos parâmetros a, b e c não variam sistematicamente em relação à temperatura.
Tabela 3.6: Informações cristalográficas da amostra tratada termicamente em temperaturas acima da
transição de fase estrutural.
150 °C
170 °C
190 °C
Fórmula
Sistema cristalino
Grupo espacial
a [Å]
b [Å]
c [Å]
V
C18 H20 N2 O5,5
Ortorrômbica
Pba2
23,3988(8)
10,1279(7)
4,22169(9)
1000,5(3)
C18 H20 N2 O5,5
Ortorrômbica
Pba2
23,1994(9)
10,3927(8)
4,18951(9)
1010,1(3)
C18 H20 N2 O5,5
Ortorrômbica
Pba2
23,9467(9)
10,3428(4)
4,0843(9)
1011,6(2)
As estruturas cristalográficas de ambas as fases são ilustradas na Fig. 3.24. Observa-se
claramente a diferença no empacotamento cristalino das moléculas de difenilalanina. Quando
a amostra é tratada termicamente em altas temperaturas e experimenta uma transição de fase
(T > 140 °C), um processo espontâneo de recristalização leva a uma coalescência das
moléculas fechando os canais que abrigavam as moléculas de água e formando assim uma
estrutura contínua. Esses resultados são realmente importantes e contribuem para um melhor
entendimento da formação de estruturas tubulares e contínuas de peptídeos e são dependentes
do grupo de simetria da rede cristalina. Estudos recentes obtidos por Amdursky et al.[68] em
nanotubos de L-difenilalanina através de difração de raios sugerem um novo arranjo para a
molécula de L-difenilalanina. Vários subgrupos podem representar o arranjo cristalográfico:
Pbca, Pnma, Pbam e Pbcn. Entretanto, a determinação exata do grupo de simetria necessita
de dados de alta resolução. Por outro lado, é conhecido da literatura que estruturas peptídicas
formadas por pares de peptídeos distintos podem também cristalizar-se sem a formação de
uma estrutura tubular. Alguns destes dipeptídeos são, por exemplo: leucina-leucina (LL),
fenilalanina-leucina (FL), isoleucina-leucina (IL) e serina-fenilalanina (SF). É interessante
notar que a literatura revela que quando a estrutura peptídica não apresenta morfologia
tubular, o grupo espacial de simetria na qual o sistema se cristaliza é o ortorrômbico e/ou
monoclínico [6].
P á g i n a | 51
(A)
(B)
Fig. 3.24: (A) Estrutura cristalina hexagonal P61 com a formação de canais tubulares. (B) Estrutura
cristalina ortorrômbica Pba2 com a formação de um padrão contínuo das moléculas de peptídeo.
P á g i n a | 52
a
a
b
b
(B)
(A)
a
c
c
a
b
b
(C)
(D)
Fig. 3.25: Comparação das celas unitárias das fases hexagonal (A) e ortorrômbica (B), no plano ab.
Desenho em perspectiva para visualização do eixo c das fases hexagonal (C) e ortorrômbica (D).
Essa transição de fase estrutural também resulta na alteração das propriedades elétricas
e elásticas dessas amostras. Isso abre a possibilidade da fabricação de sensores de temperatura
com indicativo para temperaturas acima de 140°C e atuadores em nanoescala. Realmente,
Heredia et al.[60] mostraram que nanotubos de difenilalanina possuem propriedades físicas
interessantes como a piezoeletricidade. Estes nanotubos são formados por uma entidade de 6
moléculas de difenilalanina formando os anéis FF ou monômeros. Na fase hexagonal, os anéis
se agrupam paralelamente de forma a apresentar um alto coeficiente piezoelétrico,
característica comum observada em materiais ferroelétricos. Essa propriedade surge do efeito
cooperativo dos dipolos elétricos e é possível fazer uma reversão da polarização elétrica
através de um campo elétrico. Quando a amostra é submetida a tratamentos térmicos a,
polarização elétrica diminui gradualmente devido a alteração em sua estrutura cristalina. Na
fase ortorrômbica a amostra possui momento de dipolo elétrico resultante muito pequeno
devido à orientação antiparalela dos anéis, semelhante aos materiais antiferroelétricos. O
comportamento antiferroelétrico se origina a partir de ligações de hidrogênio entre os
monômeros de difenilalanina que são perdidas com o aumento da temperatura [60].
P á g i n a | 53
Fase Ortorrômbica Pba2
6000
T = 190°C
T = 220°C
T = 260°C
3000
(A)
0
10
20
30
40
2 (graus)
8000
A Fig. 3.26 (A) mostra os difratogramas obtidos em T = 190, 220 e 260 °C. As barras
pequenas em cor magenta indicam as posições esperadas das reflexões de Bragg dos planos
cristalinos para a fase ortorrômbica. Todas as reflexões ocorrem nas mesmas posições
angulares revelando que não houve alterações significativas nos parâmetros estruturais do
sistema.
Fase Ortorrômbica Pba2
6000
T = 190°C
T = 220°C
T = 260°C
(2 0 0)
(2 1 0)
4000
(B)
2000
0
7.0
7.5
8.0
11.0
11.5
12.0
12.5
2 (graus)
Fig. 3.26: (A) Difratogramas da amostra de peptídeo tratada termicamente nas temperaturas de: 190
°C, 220 °C e 260 °C. (B) Amplificação dos difratogramas para melhor identificação das intensidades
relativas dos planos (2 0 0) e (2 1 0). O grupo espacial de simetria indexado é ortorrômbico Pba2.
Uma análise mais cuidadosa das reflexões (2 0 0) e (2 1 0) é mostrada na Fig. 3.26 (B).
Esses resultados indicam que não houve alteração nas distâncias interplanares bem como na
intensidade. É importante salientar que nestas temperaturas não se espera encontrar a presença
das moléculas de água confinada nos nanocanais.
P á g i n a | 54
14000
Fase Hexagonal - P61
Fase Ortorrômbica - Pba2
10500
T = 80°C
T = 190°C
7000
(A)
3500
0
10
15
20
25
30
35
40
2 (graus)
18000
Fase Hexagonal - P61
Fase Ortorrômbica - Pba2
13500
T = 80°C
T = 190°C
9000
(B)
4500
0
6
8
10
12
14
16
18
20
2 (graus)
Fig. 3.27: (A) Comparação das fases hexagonal e ortorrômbica encontradas na amostra após o
tratamento térmico. (B) Amplificação dos difratogramas para melhor visualização.
As fases cristalográficas hexagonal e ortorrômbica são comparadas na Fig. 3.27 com o
auxílio das barras identificando a posição angular das reflexões permitidas para cada fase.
Percebe-se claramente a diferença entre as posições angulares das reflexões esperadas
originadas de diferentes grupos de simetria. A fase hexagonal estando presente na amostra
tratadas termicamente até temperaturas de 140 °C e a fase ortorrômbica em amostras tratadas
acima de 140 °C. Comparando-se a largura das reflexões de cada uma das fases, identifica-se
um alargamento do pico de difração. O alargamento está relacionado com o tamanho do
domínio com coerência cristalográfica (t) e também devido à microdeformação. Infere-se pela
equação de Scherrer (Eq. 2.4.2) que na fase ortorrômbica os cristalitos são menores do que a
fase hexagonal, pois as larguras de linha da largura a meia alturas são 0,09005 e 0,09041
graus das fases hexagonal e ortorrômbica, respectivamente.
P á g i n a | 55
3.3.3.2-
Espectroscopia de Infravermelho
A espectroscopia no infravermelho se baseia no fato de que as ligações químicas das
substâncias possuem frequências de vibração específicas que correspondem a níveis
vibracionais de energia da molécula. A caracterização da geometria e arranjo molecular
através das frequências características pode fornecer informações importantes acerca da
natureza da transição de fase estrutural descrita anteriormente. O estudo da espectroscopia de
infravermelho por transformada de Fourier foi realizado usando a mesma sistemática utilizado
em amostras tratadas termicamente na difração de raios X. Além de uma caracterização geral
dos modos vibracionais, pode-se obter um melhor entendimento acerca da transição de fase
estrutural revelada através dos dados de difração de raios X. A Fig. 3.28 mostra espectros que
estão representados por absorbância em função do número de onda. As medidas mostram
claramente alterações nos picos de absorção quando se compara amostra tratadas
termicamente em 25 e 190 °C. Bandas entre 2280 - 2390 cm-1 características do CO2
apresentadas no espectro de FTIR não são mostradas. Antes de discutir mais especificamente
acerca da natureza da transição de fase estrutural, os modos vibracionais serão identificados
para essa amostra e comparados com a literatura.
Absorbância
T = 25°
T = 80°C
T = 140°C
T = 190°C
T = 220°C
T = 260°C
T = 140°C
T = 260°C
400
800
1200
1600
3000
-1
3500
4000
Número de onda (cm )
Fig. 3.28: Espectros de FTIR de amostras de peptídeo obtidos depois da realização de tratamentos
térmicos nas respectivas temperaturas 80 °C, 140 °C, 190 °C, 220 °C e 260 °C.
P á g i n a | 56
T. ambiente
T = 80°C
T = 140°C
Absorbância
0.04
L
0.03
N
C
O
D
0.02
(A)
M
J
B
0.01
I
F G
E
A
H
0.00
600
750
900
1050
1200
1350
1500
1650
-1
Número de Onda (cm )
0.05
T. ambiente
T = 80°C
T = 140°C
0.04
Absorbância
Amida I
Amida
Secundária
0.03
(B)
0.02
0.01
0.00
1550
Amida A
1575
1600
1625
1650
-1
1675
1700
Fig. 3.29: (A) Identificação das bandas FTIR mais importantes das amostras da fase Hexagonal. (B)
Ampliação do espectro para melhor visualização do deslocamento da banda da amida secundária.
A Fig. 3.29 mostra espectros de absorção obtidos a temperaturas diferentes. Identificase que as amostras possuem a banda da amida secundária (1626 - 1714 cm-1). Uma
característica importante que está presente nos nanotubos de difenilalanina são os modos de
estiramento C=O (amida I) e o modo de estiramento N-H (amida A), Fig. 3.29 (B). Com base
na literatura, é possível identificar os principais modos vibracionais presentes nesta amostra,
que são mostrados na Tabela 3.7.
P á g i n a | 57
Tabela 3.7: Dados da espectroscopia FTIR [62,69,70,71].
Número de onda (cm-1)
(literatura)
Simbologia
Número de onda (cm-1)
observado
Atribuições
579
A
584
Deformação C-C
642
B
656
703
C
699
744
D
747
859
-
852
879
E
882
1040
F
G
H
I
J
L
M
1033
1046
1077
1091
1134
1156
1211
1329
1352
1385
1453
1584
1607
1658
1674
2925
3033
1081
1097
1130
1161
1218
1332
1358
1393
1449
1596
1610
1626 – 1714
1683
2918
3028
N
O
-
Substituição das posições 1,4
do anel benzênico
Anel benzênico
Vibração no plano (rocking)
CH2
Balanço NH3+
Substituição das posições 1,4
do anel benzênico
Estiramento C-N
Estiramento C-N
Grupo Arila
Estiramento C-C
Estiramento C-C
Estiramento C-C
Balanço CH2
Plano de flexão OH
Ligação OH
Deformação C=O
Estiramento simétrico C=O
Estiramento anti-simétrico C=O
Estiramento N-H
Amida Secundária
Deformação NH3+
Estiramento anti-simétrico CH2
Estiramento C-H
Existem duas regiões importantes do espectro que revelam a presença de cargas
elétricas na molécula de L-difenilalanina, compreendidas entre 1253-1286 cm-1, esta carga é
referente ao íon carboxilato (ânion), e os picos em 1496 e 1606 cm-1 e também ao íon amônio
(cátion). As bandas características de frequências situadas aproximadamente em 3460 cm-1 e
1480 cm-1 são devidas ao estiramento assimétrico NH e estiramento COO-, confirmando a
presença do grupo amino. Encontra-se também o estiramento C=C o qual só pode ser
observado após a deconvolução dos picos experimentais, como mostrado na Fig. 3.30. O
modo de estiramento N-H é altamente localizado, sua frequência é observada em 3260 cm-1
para a fase hexagonal e 3291 cm-1 para a fase ortorrômbica. Este estiramento depende da
força da ligação de hidrogênio da cadeia N-H…O=C que é sensível à estrutura e suas
Absorbância
0.03
Calculado
Lorentziana
Diferença
0.03
Calculado
Lorentziana
Diferença
0.02
C A P Í T U L O 3 : R E S U L T A D O S 0.02
E DISCUSSÃO
0.01
P á g i n a | 58
0.01
Absorbância
Absorbância
variações. O0.00
estiramento NH observado sugere fortemente a presença de várias ligações de
0.00
hidrogênio presentes entre as subunidades de peptídeo, fornecendo informações sobre a
-0.01
1200
1300
1400 2800 2900 3000 3100 3200 3300 3400
geometria. 1000 1100
0.030
0.03
0.025
0.02
0.020
Calculado
Calculado
Lorentziana
Lorentziana
Diferença
Diferença
0.015
0.01
0.010
0.020
0.03
0.015
0.02
Calculado
Lorentziana
Diferença
Calculado
Lorentziana
Diferença
0.010
0.01
0.005
0.00
0.005
0.00
0.000
0.000
-0.01
1000
11001200 1200
13001500 1400
1000 1100
1300 1400
1600 2800
3000 2900
3100 3000
3200 3100
3300 3200
3400 3300
3500 3400
3600
Número de onda (cm -1)
Absorbância
Absorbância
0.030
0.03
0.025
0.02
0.020
Calculado
Calculado
Lorentziana
Lorentziana
Diferença
Diferença
0.015
0.01
0.010
0.00
0.005
0.03
0.020
0.015
0.02
Calculado
Lorentziana
Diferença
Calculado
Lorentziana
Diferença
0.010
0.01
0.005
0.00
0.000
0.000
-0.01
1000
1100
1300
2800 3100
2900 3200
3000 3300
3100 3400
3200 3500
3300 3600
3400
1000 1100
1200 1200
1300 1400
1500 1400
1600 3000
Absorbância
0.030
Fig. 3.30: Deconvolução
através da distribuição de funções
Calculado de peptídeo
Calculado
0.020 Lorentzianas da nanoestrutura
Lorentziana
0.025
à temperatura
ambienteLorentziana
(painéis superiores) e tratada termicamente a 190 °C (painéis
inferiores).
0.020
Diferença
0.015
Diferença
0.015uma diferença no número de picos
0.010 do espectro entre as distintas fases,
Existe
0.010
relacionados aos diversos tipos de interações0.005
existentes na amostra de peptídeo como
0.005
observado na Fig. 3.31. A descrição formal deste sistema molecular é obtida pelo grau de
0.000
0.000
liberdade, que é um parâmetro independente que contribui para o estado de um sistema físico.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600
Assim em mecânica,
um corpo
de forma
independente
nas três
de onda
(cm -1)
Número
de ondapode-se
(cm -1) movimentarNúmero
dimensões do espaço, que são definidas por três componentes, chamadas de grau de liberdade.
Para uma molécula não linear com mais de 2 átomos, isto é, N > 2, existe a seguinte relação:
3N-6. Onde N é o número de átomos da molécula, esta relação é uma estimativa simples do
número de modos vibracionais onde se consideram os três graus de liberdade rotacionais do
movimento. Assim é de se esperar uma maior quantidade de modos de vibração para a
estrutura hexagonal, pois a existência de moléculas de água aumenta o número de interações e
ligações químicas, como observado no espectro de infravermelho. Na fase ortorrômbica,
obtida em altas temperaturas (acima de 140 °C), espera-se que moléculas de água não estejam
mais presentes, diminuindo assim o número de interações intermoleculares e resultando em
um número menor de modos vibracionais. Esse resultado é corroborado pelos resultados
apresentados na Fig. 3.31.
P á g i n a | 59
0.20
Fase hexagonal
Fase ortorrômbica
Absorbância
0.16
0.12
0.08
0.04
0.00
600
900
1200 1500
3000 -1
3300
3600
Fig. 3.31: Comparação dos espectros de infravermelho das fases hexagonal e ortorrômbica.
A frequência referente à vibração do grupo amida observada no espectro é deslocada
para uma frequência menor quando com o aumento da temperatura de tratamento na amostra
de peptídeo, Fig. 3.29 (painel inferior). Este deslocamento é provocado devido à interação
intramolecular ser menor em amostras tratadas em menores temperaturas, fazendo com que a
frequência de absorção de radiação no infravermelho diminua. Em espectroscopia vibracional
a frequência de absorção é dada por
, onde ν é a frequência da vibração, κ é a
constante elástica da ligação, e μ é a massa reduzida do sistema [72]. O deslocamento da
frequência dos modos vibracionais induzido pelo tratamento térmico pode estar relacionado
com uma diminuição da constante elástica do sistema. Como o grau de rigidez é proporcional
a constante elástica, pode-se sugerir que a fase ortorrômbica apresenta uma menor rigidez,
pois possui menor valor para κ, quando comparada com a fase hexagonal. Além disso, com o
aumento da temperatura há uma perda das ligações dos monômeros de dipeptídeo. Desta
forma as distâncias das ligações entre os dipeptídeos são modificadas. Isso pode ser inferido
através do alargamento e deslocamento dos picos do espectro de infravermelho para um
número de onda menor, Fig. 3.29 (B). Por conseqüência, o sistema passa para estados de
menor energia de ligação pelo fato de possuir menos ligações em relação a fase hexagonal,
devido ao aumento da temperatura.
A estabilidade térmica é alcançada após as amostras experimentarem a transição de
fase. Observa-se nos espectros a T = 190, 220, e 260 °C que as intensidades das bandas de
absorbância e as frequência pouco variam, possuindo uma considerável justaposição, como
mostra a Fig. 3.32.
0.00
C A-0.01
PÍTULO 3: RESULTADOS E DISCUSSÃO
2850
3000
3150
3300
-1
P á g i n a | 60
3450
Absorbância
0.15
0.10
T. ambiente
T = 80°C
T = 140°C
T = 190°C
T = 220°C
T = 260°C
0.05
0.00
1200
1300
1400
1500
-1
1600
1700
Fig. 3.32: Análise comparativa das diferentes bandas de FTIR para as diferentes fases cristalográficas.
A Fig. 3.33 ilustra uma região expandida do espectro de absorção na região entre 1620
a 1700 cm-1. A identificação de algumas bandas de energia originadas de conformações como
β-sheet e β-turn pode auxiliar na determinação do arranjo destas estruturas peptídicas. Na
temperatura ambiente e até T = 80 °C, apenas um pico em 1688 cm-1 atribuído a conformação
β-turn é observado. Em T = 140 °C observa-se o deslocamento da banda de absorção (β-turn)
e o surgimento da intensidade de absorbância referente à conformação β-sheet ainda que
pouco intensa. Acima da transição a T = 140 °C ocorre uma variação abrupta na intensidade
do espectro de absorção, como pode ser observado nesta figura. Observa-se um pico intenso
em 1658 cm-1, atribuído à conformação β-sheet e um pico de intensidade média em 1674 cm-1
atribuído a conformação β-turn. Como apresentado na introdução, a presença das
conformações β-sheet e β-turn pode ser interpretada como uma assinatura de estruturas
contínuas e tubulares [58], respectivamente. Dessa forma, os resultados sugerem fortemente
que estes microfios/microfitas são formados por estruturas tubulares (amostras tratadas
termicamente a baixas temperaturas) ou por estruturas continuas (amostras tratadas
termicamente em altas temperaturas) como ilustrado na Fig. 3.24. As nanoestruturas tubulares
estariam associadas à fase hexagonal e a estrutura contínua (do tipo bulk) à fase
cristalográfica ortorrômbica. Essa interpretação é corroborada pelos resultados obtidos por
difração de raios X. A Fig. 3.24(B) ilustra a estrutura planar contínua em que as moléculas de
peptídeo se arranjam.
P á g i n a | 61
0.16
-sheet
T = 25°C
T = 80°C
T = 140°C
T = 190°C
Absorbância
0.12
-turn
0.08
0.04
-turn
0.00
1630
1640
1650
1660
1670
1680
1690
-1
Fig. 3.33: Identificação das conformações β-sheet e β-turn no espectro de FTIR.
1700
CAPÍTULO 4: CONCLUSÃO
4-
P á g i n a | 62
CONCLUSÃO
Microestruturas de peptídeos com morfologia do tipo fio, fita e tubo foram obtidas
através da síntese por fase-líquida em concentração de 5 mg/mL. Resultados obtidos através
do refinamento Rietveld sugerem que os parâmetros estruturais não são alterados
significativamente em amostras preparadas em diferentes pHs (pH 3, 7 e 12). As amostras
apresentam grupo de simetria hexagonal P61 e parâmetros de rede: (pH 3) a = b = 24,1827(6) e
c = 5,432(4), (pH 7) a = b =24,1650(9) e c = 5,580(1), (pH 12) a = b = 24,177(1) e c = 5,437(3).
Uma análise mais detalhada envolvendo difração de raios X utilizando radiação síncrotron no
modo de alta resolução foi realizada na amostra em pH 7. O tamanho médio dos domínios
com coerência cristalográfica e a microdeformação foram obtidos: 1000 Å e 0,1%,
respectivamente. O diâmetro médio dos canais formados nas microestruturas é de 10 Å.
Moléculas de microperoxidase foram introduzidas (em concentrações de 2X MP11 e 5X
MP11) em matrizes de peptídeo preparadas em pH 7. Os valores dos parâmetros de rede
encontrados para estas amostras são: (2X MP11) a = b = 24,2080(1) e c = 5,470(4), (5X
MP11) a = b = 24,2099(9) e c = 5,4798(3). Os resultados indicam que a introdução dessas
moléculas resulta em um aumento dos parâmetros a e b e uma diminuição do parâmetro c em
relação à amostra pura.
Resultados das análises de termogravimetria e calorimetria diferencial de varredura
indicaram temperaturas críticas de perda de material da nanoestrutura e transição de fase
estrutural. Variações abruptas no fluxo de calor obtidas por calorimetria diferencial de
varredura ocorrem nas temperaturas de 136,46 °C e 181,31 °C. Seus respectivos valores de
variação de entalpia foram estimados em 53,50 J/g e 48,77 J/g, sendo um processo
endotérmico, pois absorve calor e apresenta valores positivos para a entropia. As variações
ocorrem somente durante o primeiro processo de aquecimento, sugerindo a dependência com
a perda de moléculas de água da estrutura. A transição de fase não foi evidenciada na amostra
ressuspendida em água quando tratada previamente a 190 °C, revelando que a transição
estrutural é irreversível.
Imagens obtidas através de microscopia eletrônica de varredura em amostras
sintetizadas em diferentes temperaturas revelam estruturas do tipo microfios/microtubos (da
ordem de 4,82 µm) (em T < 137 °C) e microfitas (em T > 137 °C). Na temperatura de 137 °C
foi observado o desprendimento de cerdas de dimensão nanométrica, similares a nanotubos ou
nanofios. Esses resultados sugerem que amostras do tipo microfios/microtubos tratadas
abaixo da temperatura de transição estrutural são formadas por nanotubos ordenados.
Resultados obtidos através de refinamento Rietveld em função da temperatura
revelaram uma transição de fase estrutural em T ~ 140 °C. O grupo de simetria definido para a
amostra tratada abaixo da transição estrutural é o hexagonal P61. Acima desta temperatura, o
sistema se cristaliza em uma estrutura com grupo espacial de simetria ortorrômbica Pba2. A
CAPÍTULO 4: CONCLUSÃO
P á g i n a | 63
estrutura cristalina do material foi resolvida.
A caracterização geral dos modos vibracionais foi obtida por espectroscopia no
infravermelho. Os principais modos vibracionais, como a banda da amida secundária entre
1626 – 1714 cm-1, do grupo amina em 1480 cm-1 e 3460 cm-1 e das conformações β-sheet e βturn foram identificados. A presença das conformações β-sheet e β-turn podem ser
interpretadas como uma assinatura de estruturas contínuas e tubulares, respectivamente. Dessa
forma, os resultados sugerem fortemente que estes microfios/microfitas são formados por
estruturas tubulares (amostras tratadas termicamente em baixas temperaturas) ou por
estruturas contínuas (amostras tratadas termicamente em altas temperaturas). As
nanoestruturas tubulares estariam associadas à fase hexagonal e a contínua (do tipo bulk) à
fase cristalográfica ortorrômbica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
P á g i n a | 64
1
Baibich, M. N.; Broto, J. M.; Fert, A.; Van Dau, F. N.; Petroff, F.; Etienne, P.; Creuzet, G.;
Friederich, A.; Chazelas, J., Giant Magnetoresistance of (001)Fe/(001)Cr Magnetic Superlattices.
Physical Review Letters 1988, 61 (21), 2472.
2
Binasch, G.; Grünberg, P.; Saurenbach, F.; Zinn, W., Enhanced magnetoresistance in layered
magnetic structures with antiferromagnetic interlayer exchange. Physical Review B 1989, 39 (7), 4828.
3
Barth, J. V.; Costantini, G.; Kern, K., Engineering atomic and molecular nanostructures at
surfaces. Nature 2005, 437 (7059), 671-679.
4
Sander, D.; Skomski, R.; Schmidthals, C.; Enders, A.; Kirschner, J., Film Stress and Domain
Wall Pinning in Sesquilayer Iron Films on W(110). Physical Review Letters 1996, 77 (12), 2566.
5
Kholkin, A.; Amdursky, N.; Bdikin, I.; Gazit, E.; Rosenman, G., Strong Piezoelectricity in
Bioinspired Peptide Nanotubes. ACS Nano 2010, 4 (2), 610-614.
Gorbitz, C. H., Nanotube Formation by Hydrophobic Dipeptides. Chemistry – A European
Journal 2001, 7 (23), 5153-5159.
6
7
Martins, T. D.; de Souza, M. R. I.; Cunha, B. B.; Takahashi, P. M.; Ferreira, F. F.; Souza, J. A.;
Fileti, E. E.; Alves, W. A., Influence of pH and Pyrenyl on the Structural and Morphological Control of
Peptide Nanotubes. The Journal of Physical Chemistry C 2011, 115 (16), 7906-7913.
8
Reches, M.; Gazit, E., Controlled patterning of aligned self-assembled peptide nanotubes. Nat
Nano 2006, 1 (3), 195-200.
9
Song, Y.; Challa, S. R.; Medforth, C. J.; Qiu, Y.; Watt, R. K.; Pena, D.; Miller, J. E.; Swol, F.
v.; Shelnutt, J. A., Synthesis of peptide-nanotube platinum-nanoparticle composites. Chemical
Communications 2004, (9), 1044-1045.
10
Adler-Abramovich, L.; Reches, M.; Sedman, V. L.; Allen, S.; Tendler, S. J. B.; Gazit, E.,
Thermal and Chemical Stability of Diphenylalanine Peptide Nanotubes: Implications for
Nanotechnological Applications. Langmuir 2006, 22 (3), 1313-1320.
11
Han, T. H.; Park, J. S.; Oh, J. K.; Kim, S. O., Morphology Control of One-Dimensional
Peptide Nanostructures. Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2008, 8, 5547-5550.
12
Cheng, J.; Zhu, J.; Liu, B., Molecular modeling investigation of adsorption of self-assembled
peptide nanotube of cyclo-[(1R,3S)-[gamma]-Acc-d-Phe]3 in CHCl3. Chemical Physics 2007, 333 (23), 105-111.
13
Colombo, G.; Soto, P.; Gazit, E., Peptide self-assembly at the nanoscale: a challenging target
for computational and experimental biotechnology. Trends in Biotechnology 2007, 25 (5), 211-218.
14
Gorbitz, C. H., The structure of nanotubes formed by diphenylalanine, the core recognition
motif of Alzheimer's [small beta]-amyloid polypeptide. Chemical Communications 2006, (22), 23322334.
15
Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Milligan, R. A.; McRee, D. E.; Khazanovich, N., Selfassembling organic nanotubes based on a cyclic peptide architecture. Nature 1993, 366 (6453), 324327.
16
Gorbitz, C. H.; Gundersen, E., l-Valyl-l-alanine. Acta Crystallographica Section C 1996, 52
(7), 1764-1767.
17
Gorbitz, C., l-Phenylalanyl-l-tryptophan 0.75-hydrate. Acta Crystallographica Section C 2006,
62 (6), o328-o330.
18
Emge, T. J.; Agrawal, A.; Dalessio, J. P.; Dukovic, G.; Inghrim, J. A.; Janjua, K.; Macaluso,
M.; Robertson, L. L.; Stiglic, T. J.; Volovik, Y.; Georgiadis, M. M., Alaninyltryptophan hydrate,
glycyltryptophan dihydrate and tryptophylglycine hydrate. Acta Crystallographica Section C 2000, 56
P á g i n a | 65
(10), e469-e471.
19
Reches, M.; Gazit, E., Casting Metal Nanowires Within Discrete Self-Assembled Peptide
Nanotubes. Science 2003, 300 (5619), 625-627.
20
Harkany, T.; Hortobágyi, T.; Sasvári, M.; Kónya, C.; Penke, B.; Luiten, P. G. M.; Csaba, N.,
Neuroprotective approaches in experimental models of [beta]-Amyloid neurotoxicity: Relevance to
Alzheimer's disease. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry 1999, 23 (6),
963-1008.
21
Gao, X.; Matsui, H., Peptide-Based Nanotubes and Their Applications in Bionanotechnology.
Advanced Materials 2005, 17 (17), 2037-2050.
22
Fuhrhop, J.-H.; Koning, J. Membranes and Molecular Assemblies: The Synkinetic Approach.
Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1994.
23
Nakashima, N.; Asakuma, S.; Kunitake, T., Optical microscopic study of helical
superstructures of chiral bilayer membranes. Journal of the American Chemical Society 1985, 107 (2),
509-510.
24
Fuhrhop, J. H.; Helfrich, W., Fluid and solid fibers made of lipid molecular bilayers. Chemical
Reviews 1993, 93 (4), 1565-1582.
25
Shimizu, T.; Hato, M., Self-assembling properties of synthetic peptidic lipids. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1993, 1147 (1), 50-58
26
De Santis, P.; Morosetti, S.; Rizzo, R., Conformational Analysis of Regular Enantiomeric
Sequences. Macromolecules 1974, 7 (1), 52-58.
27
Sousa, C. P.; Polo, A. S.; Torresi, R. M.; de Torresi, S. I. C.; Alves, W. A., Chemical
modification of a nanocrystalline TiO2 film for efficient electric connection of glucose oxidase.
Journal of Colloid and Interface Science 2010, 346 (2), 442-447.
28
Alves, W. A.; Fiorito, P. A.; Córdoba de Torresi, S. I.; Torresi, R. M., Design of molecular
wires based on supramolecular structures for application in glucose biosensors. Biosensors and
Bioelectronics 2006, 22 (2), 298-305.
29
Cipriano, T.; Takahashi, P.; de Lima, D.; Oliveira, V.; Souza, J.; Martinho, H.; Alves, W.,
Spatial organization of peptide nanotubes for electrochemical devices. Journal of Materials Science
2010, 45 (18), 5101-5108.
30
Alves, W.; Ribeiro, A. O.; Pinheiro, M. V. B.; Krambrock, K.; Haber, F. E.; Froyer, G.;
Chauvet, O.; Ando, R. A.; Souza, F. L.; Alves, W. A., Quenching of Photoactivity in Phthalocyanine
Copper(II) -Titanate Nanotube Hybrid Systems. The Journal of Physical Chemistry C 2011, null-null.
31
Pauling, L.; Corey, R. B., with positive slope but their salts with small anions yield linear plots
with negative slope. Proceedings of the National Academy of Sciences 1951, 37, 729–740.
32
Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L., Bioquímica. 5 ed.; Editora Guanabara Koogan: Rio de
Janeiro, 2008.
33
Singh, G.; Bittner, A. M.; Loscher, S.; Malinowski, N.; Kern, K., Electrospinning of
Diphenylalanine Nanotubes. Advanced Materials 2008, 20 (12), 2332-2336.
34
Ryu, J.; Park, C. B., High-Temperature Self-Assembly of Peptides into Vertically WellAligned Nanowires by Aniline Vapor. Advanced Materials 2008, 20 (19), 3754-3758.
35
Adler-Abramovich, L.; Aronov, D.; Beker, P.; Yevnin, M.; Stempler, S.; Buzhansky, L.;
Rosenman, G.; Gazit, E., Self-assembled arrays of peptide nanotubes by vapour deposition. Nat Nano
2009, 4 (12), 849-854.
36
Savu, R. Síntese de Nanofios de Óxidos Semicondutores para Aplicações em Dispositivos
Ópticos e Eletrônicos. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho", Bauru, 2009.
P á g i n a | 66
37
Wende, H.; Bernien, M.; Luo, J.; Sorg, C.; Ponpandian, N.; Kurde, J.; Miguel, J.; Piantek, M.;
Xu, X.; Eckhold, P.; Kuch, W.; Baberschke, K.; Panchmatia, P. M.; Sanyal, B.; Oppeneer, P. M.;
Eriksson, O., Substrate-induced magnetic ordering and switching of iron porphyrin molecules. Nat
Mater 2007, 6 (7), 516-520.
38
Verbaro, D.; Hagarman, A.; Kohli, A.; Schweitzer-Stenner, R., Microperoxidase 11: a model
system for porphyrin networks and heme–protein interactions. Journal of Biological Inorganic
Chemistry 2009, 14 (8), 1289-1300.
39
Bushnell, G. W.; Louie, G. V.; Brayer, G. D., High-resolution three-dimensional structure of
horse heart cytochrome c. Journal of Molecular Biology 1990, 214, 585-595.
40
Perry, C. B.; Chick, T.; Ntlokwana, A.; Davies, G.; Marques, H. M., The co-ordination of
ligands by iron porphyrins: a comparison of ligand binding by myoglobin from sperm whale and the
haem undecapeptide from cytochrome c. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions 2002,
(3), 449-457.
41
Truchot, P., Ignition of Barium Sulphate. Annals Chimie Analytique 12, 267-268.
42
Urbain, G.; Boulanger, C., Comptes Rendus 1912, 154, 347-349.
43
Giolito, G., Princípios Básicos da Termogravimetria e Análise
Diferencial/Calorimetria Exploratória Diferencial. Giz Editorial: Araraquara, 1974.
Térmica
44
Ionashiro, M. A.; Giolito, I., Nomenclatura, padrões e apresentação dos resultados em análise
térmica. Cerâmica 1980, 26 (121), 17-24.
45
Giolito, I.; Ionashiro, M. A., A nomenclatura em análise térmica parte II. Cerâmica 1988, 34
(225), 163-164.
46
Watson, E. S.; O'Neill, M. J.; Justin, J.; Brenner, N., A Differential Scanning Calorimeter for
Quantitative Differential Thermal Analysis. Analytical Chemistry 1964, 36 (7), 1233-1238.
47
Kestenbach, H.-J.; Nocite, N. C. P. S.; Gregório, R. F.; Loos, J.; Petermann, J., Resolução
lamelar num novo microscópio eletrônico de varredura. Polímeros 1997, 7 (1), 58-66.
48
Callister, W. D. J., Materials Science and Engineering, An Introduction. 8 ed.; John Wiley &
Sons, Inc.: 2007.
49
Cullity, D., Elements of X-RAY DIFFRACTION. 2 ed.; Addison-Wesley Publishing Company
Inc.: 1978.
50
Azároff, L. V.; Buerguer, M. J., The Powder Method in X-Ray Crystallography. McGraw-Hill:
New York, 1958.
51
Young, R. A., The Rietveld Method. Oxford University Press: 1993.
52
Larson, A. C.; Dreele, R. B. V., General Structure Analysis System (GSAS). Los Alamos
National Laboratory Report LAUR 2004, 86-748.
53
Toby, B., EXPGUI, a graphical user interface for GSAS. Journal of Applied Crystallography
2001, 34 (2), 210-213.
54
Sala, O., Fundamentos da espectroscopia Raman e no infravermelho. 2 ed.; Editora Unesp:
2009.
55
Skoog, D. A.; Leary, J. J., 4 ed.; College Publishing: 1993.
56
Sanyal, B.; Eriksson, O.; Arvidsson, P. I., Cobalt-doped beta -peptide nanotubes: A class of
spintronic materials. Physical Review B 2008, 77 (15), 155407.
57
Steckel, J. S.; Persky, N. S.; Martinez, C. R.; Barnes, C. L.; Fry, E. A.; Kulkarni, J.; Burgess, J.
D.; Pacheco, R. B.; Stoll, S. L., Monolayer and Multilayer Films of [Mn12O12(O2CMe)16]. Nano
Letters 2004, 4 (3), 399-402.
P á g i n a | 67
58
Ryu, J.; Park, C. B., High stability of self-assembled peptide nanowires against thermal,
chemical, and proteolytic attacks. Biotechnology and Bioengineering 2010, 105 (2), 221-230.
59
Kim, J.; Han, T. H.; Kim, Y.-I.; Park, J. S.; Choi, J.; Churchill, D. G.; Kim, S. O.; Ihee, H.,
Role of Water in Directing Diphenylalanine Assembly into Nanotubes and Nanowires. Advanced
Materials 2010, 22 (5), 583-587.
60
Heredia, A.; Bdikin, I.; Kopyl, S.; Mishina, E.; Semin, S.; Sigov, A.; German, K.; Bystrov, V.;
Gracio, J.; Kholkin, A. L., Temperature-driven phase transformation in self-assembled diphenylalanine
peptide nanotubes. journal of Physics D: Applied Physics 2010, 43 (46), 462001.
61
Sedman, V. L.; Adler-Abramovich, L.; Allen, S.; Gazit, E.; Tendler, S. J. B., Direct
Observation of the Release of Phenylalanine from Diphenylalanine Nanotubes. Journal of the
American Chemical Society 2006, 128 (21), 6903-6908.
62
Hartgerink, J. D.; Granja, J. R.; Milligan, R. A.; Ghadiri, M. R., Self-Assembling Peptide
Nanotubes. Journal of the American Chemical Society 1996, 118 (1), 43-50.
63
Altomare, A.; Caliandro, R.; Camalli, M.; Cuocci, C.; Giacovazzo, C.; Moliterni, A. G. G.;
Rizzi, R., Automatic structure determination from powder data with EXPO2004. Journal of Applied
Crystallography 2004, 37 (6), 1025-1028.
64
David, W. I. F.; Shankland, K.; van de Streek, J.; Pidcock, E.; Motherwell, W. D. S.; Cole, J.
C., DASH: a program for crystal structure determination from powder diffraction data. Journal of
Applied crystallography 2006, 39 (6), 910-915.
65
Altomare, A.; Cuocci, C.; Giacovazzo, C.; Kamel, G. S.; Moliterni, A.; Rizzi, R., Minimally
resolution biased electron-density maps. Acta Crystallographica Section A 2008, 64 (2), 326-336.
66
Altomare, A.; Cuocci, C.; Giacovazzo, C.; Moliterni, A.; Rizzi, R., Correcting resolution bias
in electron density maps of organic molecules derived by direct methods from powder data. Journal of
Applied Crystallography 2008, 41 (3), 592-599.
Oszlányi, G.; Sütő, A., Ab initio structure solution by charge flipping. II. Use of weak
reflections. Acta Crystallographica Section A 2005, 61 (1), 147-152.
67
68
Amdursky, N.; Beker, P.; Koren, I.; Bank-Srour, B.; Mishina, E.; Semin, S.; Rasing, T.;
Rosenberg, Y.; Barkay, Z.; Gazit, E.; Rosenman, G., Structural Transition in Peptide Nanotubes.
Biomacromolecules 2011, 12 (4), 1349-1354.
69
Mahalakshmi, R.; Jesuraja, S. X.; Das, S. J., Growth and characterization of L-phenylalanine.
Crystal Research and Technology 2006, 41 (8), 780-783.
70
Silverstein, R.; Webster, F. X.; Kiemle, D. J., Spectrometric Identification of Organic
Compounds. 7 ed.; John Wiley & Sons, INC.,: 2005.
71
72
Pradyot, P., Dean's Analytical Chemistry Handbook. 2 ed.; McGraw-Hill: 2004.
Willard, H. H.; Merritt, L. L. J.; Dean, J. A., Instrumental Methods of Analysis. Wadsworth P.
Company: 1988.

Propriedades estruturais e morfológicas de nanoestruturas de

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