NOVA Lite® ANCA IFA Kit

NOVA Lite® ANCA Kits/Substrate Slides
Para Diagnóstico In Vitro
Código do Produto: 708295, 708297
508295, 508297, 508295.10, 508297.20
Complexidade CLIA: Elevada
Aplicação Diagnóstica
Este produto (kit ou lâminas com substrato) é indicado para o despiste e quantificação dos auto-anticorpos antineutrófilos citoplasmáticos (ANCA). Estes anticorpos são marcadores para o diagnóstico e tratamento de
1
granulomatose de Wegener’s e outras vasculites sistémicas.
Resumo e Explicação do teste
As vasculites necrosantes, incluindo granulomatose de Wegener’s, poliarterite nodosa, síndroma de Churg Strauss,
glomerulonefrite idiopática crescente e ‘overlap’ vasculite sistémica são um grupo de doenças relacionadas que podem
variar consideravelmente nas manifestações clínicas, o que causa consequentemente, problemas no diagnóstico.
Granulomatose de Wegener’s é uma doença vascular grave caracterizada por granulomas necrosantes do tracto
respiratório e glomerulonefrite focal. Um diagnóstico precoce é importante como terapia imunossupresiva rápida tendo
um maior efeito no resultado renal, mas sintomas iniciais na apresentação e exames histológicos por biópsias são
2
frequentemente não específicos.
Em 1982 Davies et al descreveu a presença de anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA) no soro de doentes
3
com glomerulonefrite necrotising. Também foi descrito, em 1985 numa publicação de Van de Woude et al 25 de 27
doentes com granulomatose de Wegener’s activa que exibiam o padrão citoplasmático clássico (c-ANCA) por
1
imunofluorescência indirecta. O padrão clássico c-ANCA com os neutrófilos fixados em etanol revelam uma coloração
característica granular citoplasmática com uma coloração mínima dos lobos nucleares. O antigénio c-ANCA alvo é, na
sua maioria, a proteinase 3, uma protease serina.
Um segundo padrão de coloração ANCA (perinuclear, p-ANCA) foi descrito em 1988 por Falk et al em doentes renais
4
com vasculite sistémica. Pensa-se que o antigénio p-ANCA alvo seja a mieloperoxidase, porém outros antigénios (Ex.
lactoferina, elastase, catepsina G) encontram-se associados mas a um grau mais baixo. O padrão p-ANCA com os
neutrófilos fixados em etanol revelam uma coloração perinuclear nitidamente delineada.
Muitas amostras que foram submetidas a testes para detecção dos ANCA, podem ser positivas para anti-dsDNA, antihistonas e outros autoanticorpos antinucleares (ANA), podendo acompanhar o padrão p-ANCA. Amostras de doentes
positivas para ANA podem também ser positivas para p-ANCA. É obviamente crítico distinguir um verdadeiro padrão cANCA e p-ANCA de outros artefactos não-ANCA. Isto é conseguido utilizando uma combinação de lâminas com
neutrófilos fixados com etanol e formol.
Nos neutrófilos fixados com etanol ocorre uma migração dos grânulos citoplasmáticos positivamente carregados para o
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DNA do núcleo carregado negativamente, resultando no padrão perinuclear (p-ANCA). Se os neutrófilos são tratados
com um fixador como o formol, então esta migração não ocorre e as proteínas granulares citoplasmáticas permanecem
no citoplasma onde amostras p-ANCA verdadeiras mostram um padrão granular citoplasmático c-ANCA em lâminas
fixadas com formol. Amostras ANA positivas, quando testadas com neutrófilos fixados com formol, tornam-se negativas
ou revelam uma grande redução na intensidade da coloração. Amostras ANA específico de granulócitos (GS–ANA)
mostram uma reacção nuclear ou perinuclear em neutrófilos fixados com etanol, sendo negativos quando testados com
neutrófilos fixados com formol.
A imunofluorescência indirecta de lâminas com neutrófilos é o método de referência para o despiste dos ANCA. As
lâminas da INOVA utilizam neutrófilos humanos purificados, sendo preparados e fixados de modo a atingir padrões
óptimos de coloração. Amostras cujo resultado é ANCA positivo, ANA e padrões atípicos devem ser titulados à parte.
Princípio do Procedimento
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É utilizada uma técnica de imunofluorescência indirecta, com este kit , em que quer as amostras dos doentes, quer os
controlos apropriados são incubados com o substrato neutrófilos. Os anticorpos que não reagem são eliminados por
lavagem, sendo depois aplicado um conjugado marcado com fluoresceína. O conjugado excedente é depois removido
também por lavagem. As lâminas são observadas ao microscópio de fluorescência, onde se observa uma fluorescência
“verde-maçã” no caso das amostras positivas, que correspondem a áreas dos neutrófilos onde o anticorpo se ligou.
Composição do dispositivo
1.
Substrato de neutrófilos fixados com formol em lâminas de 6 e 12 poços.
Apenas em kit
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Dois ou mais soros controlo positivo contendo azida de sódio a 0,09% (ex. p-ANCA, c-ANCA, ANA). Pré-diluído
e pronto a utilizar.
Soro controlo negativo contendo azida de sódio a 0,09%. Pré-diluído e pronto a utilizar.
Anti-IgG humana de cabra, purificada por afinidade e conjugada com fluoresceína com Azul de Evans contendo
azida de sódio a 0,09%. Pré-diluído e pronto a utilizar.
Azul de Evans a 1%, como contrastante opcional
Tampão fosfato (PBS II), 40x concentrado na forma líquida
Meio de montagem, contendo um agente que evita a perda de fluorescência
Lamelas
1
Advertências/Precauções
Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro. Este produto deve ser apenas manipulado por pessoal treinado e para
o objectivo indicado. Recomenda-se que seja seguido o procedimento. Todos os dadores de soro fornecido nos kits
foram examinados e determinados negativos para o antigénio da superfície do vírus Hepatite B, anticorpos contra o
vírus da Hepatite C e para o Vírus de Imunodeficiência Humana (HIV 1 & 2). No entanto estes testes não garantem a
ausência de agentes infecciosos. Deverão ser estabelecidas medidas adequadas para o manuseamento e eliminação
de material potencialmente infectado e o procedimento deverá ser efectuado apenas por pessoal treinado nestes
métodos. Alguns componentes do kit contêm azida de sódio a 0,09% como conservante e devem ser manuseados com
cuidado – não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou membranas mucosas. Em caso de contacto lavar
abundantemente com água e procurar um médico. Podem formar-se azidas metálicas explosivas nas canalizações de
cobre e alumínio; quando eliminar o reagente lavar abundantemente com água para impedir a formação das azidas.
Condições de Armazenamento
Os kits fechados devem ser guardados a 2-8ºC e podem ser utilizados até à data de validade inscrita. NÃO
CONGELAR. Quando se retirar as lâminas do invólucro, estas deverão ser utilizadas imediatamente. O PBS II diluído
pode ser armazenado até um mês a 2-8ºC. O conjugado com fluoresceína do kit deve ser mantido afastado da luz
solar, fluorescente e U.V., sempre que possível e armazenado a 2-8°C. Todos os reagentes devem ser guardados a
2-8ºC.
Colheita de Amostras
As amostras de sangue devem ser colhidas por punção venosa, deixar coagular naturalmente e separar o soro o mais
10
rápido possível para prevenir a hemólise. O soro pode ser conservado de 2-8°C até 7 dias antes do teste , ou em
aliquotas a -20°C ou menos, para períodos mais prolongados. Não congelar e descongelar o soro mais do que uma
vez. Evitar a utilização de soros lipémicos, hemolisados e contaminados com microorganismos dado que poderá
ocorrer uma diminuição do título ou um padrão de marcação pouco claro.
Procedimento
Material fornecido (kits)
708295
10
1
1
1
1
2
1
1
1
1
ANCA Neutrophil Substrate Slides – 6-well (lâminas x 6 poços com neutrófilos, fixados com formol).
1mL p-ANCA Positive Control (Controlo positivo p-ANCA)
1mL ANA Positive Control (Controlo positivo ANA, somente)
1mL IFA System Negative Control for ANCA (Controlo negativo)
7mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado anti-IgG humano purificado e marcadocom
fluoresceína com Azul de Evans)
25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado, x40)
3mL 1% Evans Blue Counterstain (Contrastante Azul de Evans 1%)
3mL Mounting Medium (Meio de montagem)
10 Coverslips (Lamelas)
folheto de instrucções
708297
20
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
ANCA Neutrophil Substrate Slides – 12-well (lâminas x 12 poços com neutrófilos, fixados com formol).
1mL p-ANCA Positive Control (Controlo positivo p-ANCA)
1mL c-ANCA Positive Control (Controlo positivo c-ANCA)
1mL ANA Positive Control (Controlo positivo ANA, somente)
1mL IFA System Negative Control for ANCA (Controlo negativo)
15mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado anti-IgG humano purificado e
marcado com fluoresceína com Azul de Evans)
25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado, x40)
3mL 1% Evans Blue Counterstain (Contrastante Azul de Evans 1%)
10mL Mounting Medium (Meio de montagem)
20 Coverslips (Lamelas)
folheto de instrucções
Material fornecido (lâminas)
508295.10
508295.20
10 x ANCA Neutrophil Substrate Slide – 6-well (lâminas x 6 poços com neutrofílos, fixados com formol)
20 x ANCA Neutrophil Substrate Slide – 12-well (lâminas x 12 poços com neutrofílos, fixados com
formol)
Material Necessário Não Fornecido
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Água destilada para diluir o PBS II concentrado
Recipiente para o tampão PBS II
Micropipetas e pontas descartáveis para aplicação das amostras dos doentes.
Câmara húmida para os passos de incubação
Microscópio de fuorescência com filtro excitador de 495nm e um filtro barreira de 515nm
Esguicho de plástico para a lavagem inicial com o PBS II
No caso de utilização apenas das lâminas, deverá necessitar do seguinte material (números de peça de INOVA):
controlo positivo; ex. c-ANCA (508191), p-ANCA (508291), controlo negativo (508007), conjugado IgG marcado com
FITC (508113) ou conjugado anti-IgGAM humana marcado com FITC (504031), PBS II (508998), Azul de Evans
(504049, opcional), meio de montagem de neutrófilos (508001, 508005, 508006), lamelas.
2
Procedimento
Controlo de Qualidade
Os controlos positivos e negativos devem ser utilizados sempre que são testadas as amostras.
1.
Diluir o PBS II concentrado. Diluir o PBS II concentrado em água destilada (1 parte de PBS II concentrado + 39
partes de água destilada) e misturar bem. Nota: o PBS II é utilizado para diluir as amostras dos doentes e como
tampão de lavagem. Diluir todo o PBS II apenas se todo o kit for utilizado dentro de um mês.
2.
Diluição das amostras
Despiste: Diluir as amostras 1/20 adicionando 10µL de soro a 190µL de tampão PBS II.
Quantificação: Efectuar diluições sucessivas das amostras positivas com o tampão PBS II (ex: 1/40, 1/80,
1/160, 1/320 e 1/640 etc). Por exemplo: Uma amostras de 100µL com uma diluição de 1/20 misturar com
100µL de PBS II para obter uma diluição de 1/40. Repetir este procedimento para as diluições seguintes.
3.
Lâminas com substrato: Deixar as lâminas com substrato durante 30 minutos à temperatura ambiente (1828ºC) antes de se retirarem do invólucro. Rotular as amostras correctamente, colocar na câmara húmida e
adicionar uma gota de controlo positivo e outra de controlo negativo nos respectivos poços. Adicionar 25µL de
amostra nos restantes poços.
2.
Incubação das lâminas. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente
(18-28ºC).
3.
Lavagem com PBS II. Remover as lâminas da câmara húmida e lavar abundantemente com o esguicho de
PBS II, mas com cuidado. Não deitar directamente nos poços. Colocar as lâminas num suporte e imergi-las em
PBS II e agitar durante 10 minutos.
4.
Adição do conjugado fluorescente. Colocar novamente as lâminas na câmara húmida e colocar imediatamente
uma gota de conjugado fluorescente em cada poço. NÃO DEIXAR OS POÇOS SECOS POR MAIS DE 15
SEGUNDOS. Se o substrato secar os resultados serão seriamente afectados.
5.
Incubação da lâmina. Incubar as lâminas durante 30 minutos na câmara húmida à temperatura ambiente (1828ºC) no escuro.
6.
Lavagem com PBS II. Lavar novamente como descrito no passo 5. Contraste opcional: Adicionar 2-3 gotas de
Azul de Evans a 1% por 100mL de PBS II antes de imergir a lâmina.
7.
Montagem com a lamela. Remover uma lâmina de cada vez da solução de PBS II. Adicionar uma gota de meio
de montagem a cada poço. Colocar cuidadosamente a lamela na lâmina, evitando a formação de bolhas de ar;
no entanto se existirem não tentar removê-las. Cuidadosamente, limpar algum excesso de meio de montagem.
8.
Observação das lâminas num microscópio de fluorescência. As lâminas devem ser conservadas entre os 28ºC. Devem ser observadas com a maior brevidade possível.
Controlo de Qualidade
Em neutrófilos fixados com formol, amostras c-ANCA e p-ANCA revelam uma coloração granular do citoplasma. Em
mas em neutrófilos fixados com formol essa ANA positividade não se observa. O controlo negativo não deverá
apresentar alguma fluorescência. Se os controlos não se apresentam como o descrito, o teste deve ser considerado
inválido, pelo que deve ser repetido.
Interpretação dos Resultados
Negativo
Uma amostra é considerada negativa se a coloração específica do neutrófilo é equivalente ao do poço correspondente
ao controlo negativo.
Positivo
Uma amostra é considerada positivo se se observar uma coloração citoplasmática. Nota: Cada laboratório deve
estabelecer qual o ponto pelo qual um resultado positivo é considerado como tendo significado clínico.
Interpretação dos padrões
c-ANCA (coloração citoplasmática)
Quer em lâminas fixadas com formol, amostras c-ANCA positivas revelam uma coloração granular generalizada do
citoplasma.
p-ANCA (padrão perinuclear)
Em lâminas fixadas com formol, as p-ANCA amostras revelam uma coloração granular generalizada do citoplasma,
similar à obtida para amostras c-ANCA positivas.
Padrão ANA
Em lâminas fixadas com formol, a maioria dos antigénios nucleares foram destruídos, pelo que revelam uma
fluorescência negativa ou muito reduzida, quando comparada com o controlo positivo p-ANCA.
Limitações do Procedimento
1.
2.
3.
Amostras inactivadas pelo calor, hemolisadas ou imcompletamente desfibrinadas podem causar interferências
na coloração, tornando assim a interpretação mais difícil. Assim, devem ser obtidas novas amostras para se
proceder a um novo teste. Amostras problemáticas devem ser diluídas com tampão PBS II contendo albumina
a 2% ou soro bovino, de modo a reduzir eventuais interferências na coloração.
A fonte de luz, os filtros e as oculares de microscópios de fluorescência diferentes irão influenciar a
sensibilidade do teste. A qualidade do microscópio é significativamente influenciado pela manutenção correcta,
especialmente o címbre da lâmpada de vapor de mercúrio e substituição da lâmpada após o período de tempo
recomendado.
Os resultados positivos por IFA devem ser confirmados através dos kits por EIA mieloperoxidase (MPO) e
11,12
proteinase 3 (PR3).
As lâminas de ANCA fixadas com formol podem também contribuir para a
determinação da especificidade do anticorpo, especialmente para amostras com títulos baixos ou altos.
3
4.
5.
6.
7.
8.
Amostras ANCA positivas nem sempre revelam resultados positivos para mieloperoxidase (MPO) ou
proteinase serina 3 (PR3) utilizando EIA, isto porque a positividade para ANCA se pode dever a outros
antigénios granulares primários, que poderão ser responsáveis por padrões positivos de coloração p- ou cANCA. Nestes incluem-se elastase, lactoferrina, catepsina G, proteína catiónica 57 e outros antigénios de
neutrófilos ainda não identificados.
Anticorpos anti-músculo liso (actina) podem reagir com neutrófilos humanos fixados com etanol, bem como
7
aloanticorpos tais como, mart ou NB1 Anticorpos anti-músculo liso ou actina podem reagir com o citoplasma
dos neutrófilos dando um padrão homogéneo, em lugar de um padrão de coloração típico de c-ANCA,
fortemente mosqueado. Aloanticorpos também reagem com o citoplasma dos neutrófilos revelando um padrão
finamente mosqueado. Geralmente, somente 40% das células ou menos evidencia fluorescência.
As amostras podem conter mais do que um autoanticorpo, ex. c-ANCA e p-ANCA ou c-ANCA e ANA.
Anticorpos reactivos aos neutrófilos podem também ser encontrados em soros de doentes com a doença
8
inflamatória de Bowel ou Colite ulcerativa. Em lâminas de neutrófilos fixados com etanol, estas amostras
surgem com um padrão p-ANCA, isto é, com uma coloração perinuclear muito acentuada. Em lâminas de
neutrófilos fixados com formol estas amostras são negativas ou evidenciam uma fluorescência muito reduzida.
Este teste por si só não deve ser considerado como diagnóstico. Outros factores deverão ser tomados em
conta tais como, a história clínica do doente e outros resultados serológicos e biópsias.
As lâminas vendidas em separado têm a classificação de “Reagentes específicos de analitos”. Excepto como
componente do kit NOVA Lite® ANCA IFA, as características analíticas e de desempenho não foram estabelecidas.
Características especiais
Valores Esperados
Grupo de doentes
Pessoas saudáveis
Doença de Crohn
Colite ulcerativa
Esclerose colangite primária com
doença inflamatória de bowel
Cirrose biliar primária
Hepatite autoimune
Granulomatose de Wegener
Poliarterite nodosum *
No.
30
80
46
% Positivo
p-ANCA c-ANCA
0
0
25
0
46
0
17
58
0
25
15
30
5
28
33
0
0
0
0
100
100
9
Toda a informação acima descrita, deriva de Seibold et al , com excepção da marcada *, que foi obtida por estudos “inhouse” na The Binding Site Ltd.
Precisão
10 soros de doentes (três p-ANCA positivo, três c-ANCA positivo, dois ANA positivo e dois negativos) foram testados
nove vezes (em triplicado com três lotes de kits diferentes). O padrão de coloração obtido para cada amostra não diferiu
mais do que uma unidade de coloração (baseado numa escala de 1+ (coloração fraca) a 3+ (coloração forte).
Estudo comparativo
Competitor
100 amostras de soro clínicas e 40 de dadores de soro adultos (20 homens, 20 mulheres) foram testados com o kit da
Binding Site ANCA Combi e com um kit da concorrência. Os resultados foram os seguintes:
The Binding Site
c-ANCA
60
c-ANCA
3
p-ANCA
0
p-/c-ANCA
0
ANA
0
Neg.
p-ANCA
3
27
0
0
0
ANA
0
0
0
6
0
Neg.
0
0
0
0
40
p-/c-ANCA
0
0
1
0
0
134 das 140 amostras testadas deram resultados idênticos pelos dois métodos. Para o padrão c-ANCA, a sensibilidade
relativa foi de 95%, a especificidade relativa foi de 96%, e a concordância foi de 96%. Para o padrão p-ANCA, a
sensibilidade relativa foi de 90%; a especificidade relativa foi de 97% e a concordância relativa foi de 96%. Para as seis
amostras que deram padrões diferentes, todos demonstraram uma forte ou fraca coloração em um ou em ambos os
kits, o que torna a interpretação difícil.
RESUMO DA TÉCNICA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Diluir o PBS II com água destilada.
Diluir as amostras 1/20 com PBS II.
Retirar as lâminas do frio e equilibrar à temperatura ambiente (18-28°C).
Retirar a lâmina do invólucro e colocar na câmara húmida. Adicionar 25µL dos controlos e amostras.
Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Enxaguar as lâminas com o esguicho de PBS II.
Lavar durante 10 minutos no suporte.
Adicionar imediatamente uma gota de conjugado fluorescente.
Incubar as lâminas durante 30 minutos.
Lavar novamente como descrito no paço 7.
Adicionar o meio de montagem a cada poço e a lamela.
Observar as lâminas num microscópio de fluorescência.
NOVA Lite é uma marca registada da INOVA Diagnostics, Inc.Copyright 2012 Todos os Direitos Reservados©
4
Referências
1.
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3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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Review.
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December 2012
Revision 1
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