Preservação da fertilidade da mulher

PRÁTICA
GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA
Suplemento Rev N.º 21
Maio 2007
Preservação da fertilidade da mulher - Perspectivas actuais
Teresa Almeida Santos1,2, Raquel Brito2 e João Ramalho-Santos3,4
1
Clínica Universitária de Genética da
Faculdade de Medicina de Coimbra.
2
Serviço de Genética Médica e Reprodução
Humana dos Hospitais de Universidade de Coimbra.
3
Centro de Neurociências e Biologia Celular
de Coimbra (CNC).
4
Departamento de Zoologia da Faculdade de
Ciências e Tecnologia de Universidade de Coimbra.
Os ovários são órgãos pares, situados
de cada lado do útero, tendo uma
forma oval achatada, com 3 a 5 cm
na sua maior dimensão. É neles que
se processa a ovogénese. Os ovários
têm também uma função endócrina,
produzindo estrogénios e progesterona que sincronizam a actividade
do tracto genital e da glândula mamária com o ciclo menstrual.
No ovário identifica-se uma zona
periférica designada córtex e uma
central denominada medula. No córtex há numerosos folículos em diversos estádios de desenvolvimento,
bem como folículos pós-ovulatórios,
chamados corpus luteum e corpus
albicans (o segundo formado por
regressão do primeiro).
Figura 1 – Esquema do ovário humano mostrando os diferentes estádios do desenvolvimento do ovócito.
in Atlas de Reproducción Assistida SERONO
No ovário de uma mulher jovem os
folículos primordiais são os mais
numerosos constituindo a população
a partir da qual uma coorte inicia o
processo de maturação. O folículo
primordial é composto por um ovócito primário envolvido por uma
camada de células foliculares achatadas. O ovócito primário tem, aproximadamente, 25 µm de diâmetro,
apresentando um núcleo volumoso e
um citoplasma relativamente reduzido em relação ao volume total da
célula.
Quando estimulado pelas hormonas
hipofisárias o folículo primordial
aumenta de volume e transforma-se
num folículo primário. Neste, o
ovócito já tem maiores dimensões, e
as células foliculares aumentam o
seu tamanho e número originando as
células da granulosa, algumas das
quais, após a ovulação se mantêm
ligadas ao ovócito formando o cumulus ophorus. Entre o ovócito e as
células foliculares desenvolve-se
uma membrana glicoproteica denominada zona pelúcida.
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
Os folículos primários desenvolvem-se
e originam os folículos secundários,
que se encontram localizados mais profundamente no córtex ovárico.
O córtex de um ovário humano apresenta um número finito de células
germinativas primordiais, o qual vai
decrescendo ao longo da vida da
mulher, como consequência das ovulações e da atrésia (Fig.2). No
momento do nascimento, o número
de ovócitos primários é de cerca de
dois milhões, tendo a população de
células germinativas atingido um
máximo de sete milhões a meio da
gestação. Por altura da menarca existem apenas 300.000 folículos (1).
A “perda “ de folículos aumenta con-
Figura 2 – Zona cortical do ovário humano (320X).Coloração
com hematoxilina-eosina.
sideravelmente por volta dos 37,5
anos, existindo, nessa altura, cerca de
1000 folículos. Inicia-se, então um
decréscimo da função endócrina,
começando a mulher a entrar no climatério (2). Associada a este processo ocorre também uma redução da
qualidade ovocitária que poderá estar
associada a uma disfunção mitocondrial (3). A data exacta da menopausa
é determinada, quer pela quantidade
inicial de células germinativas, quer
pela sua deplecção ao longo da vida.
No mundo ocidental a idade média
em que ocorre a menopausa situa-se
nos 51 anos (2).
2
Nas mulheres submetidas a tratamentos de quimioterapia e/ou radioterapia por doença neoplásica pode surgir uma menopausa precoce, dado
que estes tratamentos afectam as
células em divisão, comprometendo
assim, a gametogénese e mesmo a
função endócrina do ovário. Este
efeito gonadotóxico tem particular
importância na medida em que a
sobrevida das mulheres após estas
tarapêuticas tem tido um aumento
significativo nos últimos anos, particularmente nas pacientes mais
jovens (4). Usando um modelo
matemático estimou-se que uma
redução de 90% da população de
células germinativas que ocorra por
volta dos 14 anos, origina falência
ovárica
precoce
permanente
(menopausa) por volta dos 27 anos
de idade (2).
A criopreservação de espermatozóides é uma realidade actualmente
e não envolve tecnologias muito
complexas. Porém, a preservação de
gâmetas femininos implica grandes
dificuldades de índole diversa,
nomeadamente na sua obtenção e na
conservação a longo prazo.
É absolutamente necessário discutir
com os doentes oncológicos as
opções disponíveis em termos de fertilidade e de possibilidades reprodutivas futuras. Esta realidade é particularmente importante nas mulheres
jovens com cancro da mama, antes
de proceder a quimioterapia. Acresce
que se verifica em todo o mundo
desenvolvido uma tendência generalizada para adiar o casamento e
protelar a primeira gravidez, o que
torna esta situação mais premente já
que, se não forem tomadas medidas
para preservar a fertilidade antes de
iniciar o tratamento, a lesão ovárica e
a subsequente menopausa prematura
poderão impedir uma gravidez no
futuro.
1 - Estratégias para a Preservação da
Fertilidade
Existem actualmente três métodos
possíveis para a preservação da
fertilidade nas pacientes portadoras
de neoplasias em risco de falência
ovárica permanente: 1) Criopreservação de Embriões; 2) Criopreservação de Ovócitos; 3) Criopreservação de Tecido Ovárico.
O processo de criopreservação
requer, primeiramente a escolha do
crioprotector ideal em consonância
com um protocolo de congelação e
descongelação adaptados às células
que se pretende criopreservar. No
caso dos gâmetas femininos, o maior
problema reside na formação de
cristais de gelo intracelular capazes
de originar lesões que podem levar à
lise da célula. Outra dificuldade
advém da toxicidade dos crioprotectores utilizados e consequentemente
o tempo de exposição das células aos
mesmos.
1.1 - Criopreservação de Embriões
Em 1985 foi descrito o primeiro
caso, na espécie humana, de um
nascimento após transferência de
embriões congelados (5). Actualmente esta técnica encontra-se
amplamente difundida e com elevadas taxas de sucesso.
As pacientes portadoras de doenças
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
oncológicas podem recorrer à estimulação ovárica e à punção folicular e
posterior inseminação por Fecundação in vitro (FIV) ou por
Microinjecção de espematozóides
(ICSI) antes de iniciar a terapêutica
ou durante um intervalo nos tratamentos (6). Infelizmente esta técnica
não é aplicável a todas as doentes
com cancro sendo, por exemplo,
inadequada em raparigas antes da
puberdade e pouco aceitável para
mulheres solteiras que não desejem o
uso de esperma de um dador. Para
além disto, todo o processo de
estimulação hormonal pode necessitar de algumas semanas, podendo
representar um atraso considerável
nos tratamento oncológicos. Acresce
que, nas doentes com tumores hormono-sensíveis (ex: cancro da
mama), a exposição a níveis elevados
de estrogénios pode ter um efeito
deletério.
1.2 - Criopreservação de Ovócitos
A criopreservação de ovócitos é, teoricamente, uma alternativa interessante ao congelamento de embriões.
No entanto, apesar de os resultados
terem sido bastante animadores em
animais (7;8), o processo de congelação de ovócitos humanos tem-se
revelado pouco eficaz e até mesmo
frustrante. As taxas de sobrevivência
e fecundação pós-descongelação descritas são muito variáveis apresentando valores que oscilam entre os 25
e os 69% (9;10). Por outro lado, tal
como na criopreservação de embriões,
também é imprescindível a estimulação hormonal dos ovários.
A criopreservação de ovócitos madu-
ros é uma técnica bastante complexa,
muito mais exigente do que a dos
embriões, uma vez que os gâmetas
femininos são muito sensíveis a
modificações de temperatura e apresentam deficiente capacidade de
recuperação de lesões citoplasmáticas (11;12). Os ovócitos humanos
podem ser criopreservados no estádio de Metafase II ou de Vesícula
Germinativa (Profase I).
1.2.1. - Ovócitos Maduros (Metafase II)
Os ovócitos maduros encontram-se
em metafase II. Nesta fase, a célula
está altamente organizada exibindo
A
B
Figura 2 – Ovócitos humanos maduros (MetafaseII). A) Ovócito
rodeado pelas células do cumulus; B) Ovócito depois de
desnudado sendo evidentes a zona pelúcida e o primeiro globo
polar localizado no espaço perivitelino.
uma zona pelúcida, um fuso acromático e grânulos corticais (Fig.2).
Qualquer dano que ocorra em alguma destas estruturas poderá produzir
efeitos negativos na viabilidade e
funcionalidade da célula após a
descongelação. Na metafase II os
cromossomas do ovócito encontramse alinhados ao longo dos microtúbulos do fuso acromático os quais são
sensíveis à temperatura e às soluções
crioprotectoras. Os microtúbulos são
responsáveis pela separação das
cromátides-irmãs que ocorre na 2ª
divisão da meiose. Assim, qualquer
alteração nestas estruturas pode levar
a processos de não-disjunção e, consequentemente, a um risco aumentado de aneuploidias ou poliploidias
(13;14;15).
A criopreservação de ovócitos maduros apresenta-se como uma opção
bastante atractiva no campo da
Reprodução Medicamente Assistida.
No entanto, as taxas de viabilidade e
fecundação pós-congelação são bastante variáveis assim como as gravidezes documentadas (16;17;18).
Estes resultados poderão
estar intimamente relacionados com
as lesões resultantes dos processos de
congelação/descongelação, dada a
elevada sensibilidade destas células.
As principais alterações associadas à
congelação/descongelação podem
afectar diferentes sistemas celulares
sendo exemplos a ruptura na membrana citoplasmática do ovócito,
alterações na configuração do fuso
acromático e, consequentemente,
alterações nos cromossomas (19).
As variações nas taxas de sobrevivência dos ovócitos descongelados
estão relacionadas com factores morfológicos e biofísicos. A presença de
cumulus oophorus parece desempenhar um papel muito importante na
protecção do ovócito contra os
efeitos adversos dos crioprotectores e
da temperatura. O principal factor
biofísico que afecta a taxa de sobrevivência pós-congelação é a formação de gelo intra-celular que pode
3
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
levar à lise da célula (20).
Ultimamente, têm sido descritos protocolos que incluem o uso de elevadas concentrações de sacarose juntamente com 1,2-propanodiol. Os protocolos mais antigos referenciavam
concentrações da ordem de 0,1M/L
de sacarose, não se tendo revelado
eficazes no processo de desidratação
do ovócito pré-congelação e consequentemente, originando gelo intracelular. Efectivamente, concentrações mais elevadas de sacarose
(0,3M/L) parecem ser as ideais para
atingir os níveis de desidratação que
impedem a formação de gelo intracelular (21). Com estas concentrações são alcançadas taxas elevadas de
sobrevivência pós-congelação (74%
vs 35%) e de fecundação. Ficam no
entanto por explicar as baixas taxas
de implantação obtidas (17,18).
1.2.2 - Ovócitos Imaturos - Vesícula
Germinativa
4
Uma alternativa à congelação de
ovócitos em metafase II parece ser a
utilização de ovócitos em fase de
vesícula germinativa (VG).
Os ovócitos nesta fase de VG já apresentam o seu tamanho máximo
(Fig.3) e a cromatina encontra-se em
diplóteno da Profase I e, como tal,
não existe fuso acromático. Mas, ao
contrário dos gâmetas que sofreram
maturação in vivo e se encontram em
MII, os ovócitos colhidos naquele
Figura 3 – Ovócito em Profase I. Observe-se a presença da
Vesícula Germinativa.
estádio requerem um período de maturação in vitro pós-descongelação,
prévio ao processo de fecundação.
O processo de maturação in vitro de
ovócitos imaturos foi inicialmente
descrito em animais tendo-se verificado que ovócitos imaturos de coelho removidos do ovário apresentavam a capacidade de atingirem
espontaneamente um estado de maturação in vitro (21). Já em 1965 foram
obtidos resultados semelhantes na
espécie humana (22). Esta técnica é
muitas vezes utilizada na tentativa de
amadurecimento (“rescue technique”) de ovócitos imaturos colhidos para fecundação in vitro (FIV).
No entanto, na maioria dos casos
estes ovócitos foram previamente
desnudados (isolados das células da
granulosa) para uma melhor visualização do seu estado de maturação e,
consequentemente, são colocados em
cultura sem o seu “invólucro” natural. Vários estudos revelaram que
esta técnica induz a formação de
ovócitos com potencial de fecundação reduzido podendo pensar-se
que estes ovócitos imaturos terão à
partida alterações do processo de
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
maturação já que, apesar de terem
sido submetidos a elevados níveis
exógenos de gonadotrofinas in vivo,
estas células não tiveram capacidade
de amadurecer, será então pouco
provável que in vitro a maturação
ocorra de forma fisiológica.
O recurso à utilização de ovócitos
imaturos retirados de folículos que
não tenham sofrido qualquer tipo de
estimulação hormonal poderá ser
uma alternativa a considerar (23). No
entanto, os processos de maturação
in vitro ainda requerem optimização
ao nível da constituição ideal dos
meios de maturação e da melhor técnica de fecundação a utilizar (fecundação in vitro vs microinjecção de
espermatozóides). Assim, o uso destas
células envolve dois problemas: um
relacionado com a congelação em si,
o outro com a maturação.
1.3. – Criopreservação de Tecido
Ovárico
A criopreservação de tecido do cór-
tex ovárico parece ser uma aposta
bastante promissora para a preservação da fertilidade da mulher (24).
As amostras de tecido do córtex
podem ser colhidas da paciente em
qualquer fase do ciclo menstrual,
através de laparoscopia.
O córtex do ovário alberga uma
enorme quantidade de folículos primordiais que por serem pequenos e
pouco diferenciados, desprovidos de
zona pelúcida e de células da granulosa, apresentam uma maior tolerância à criopreservação e posterior
descongelação. O tecido ovárico
depois de descongelado deverá repor
a função endócrina e a fertilidade.
Desta forma poderão ser evitados
inúmeros problemas éticos e morais.
Também é de realçar que nesta técnica não é necessária qualquer estimulação hormonal, nem ocorre o atraso
consequente no início da terapêutica
anti-neoplásica (Fig.4).
Existe, no entanto, um risco potencial: a possibilidade de criopreservar
tecido ovárico com células neoplási-
cas. É por isso premente efectuar, por
rotina, uma avaliação histológica dos
fragmentos do tecido colhido antes
de realizar a criopreservação.
A criopreservação de tecido ovárico
começou por ser realizada em ratinhos, ratazanas e hamsters (25;26;27) e
após descongelação o tecido ovárico
foi agrafado sob a pele dos animais o
que originou gravidezes e descendência. Nestas circunstâncias o crioprotector utilizado foi o glicerol.
Mais tarde, em carneiros e utilizando
o dimetilsulfóxido (DMSO) como
crioprotector, em conjugação com a
técnica de slow-freezing, o transplante do tecido pós-congelação
resultou em actividade cíclica dos
ovários e em gravidezes, estando
documentado o nascimento de um
carneiro vivo (28).
Desde então, têm sido descritos
vários casos de sucesso em diferentes
espécies animais, incluindo um primata não humano, embora neste caso
o implante de tecido tenha sido feito
sem congelação (29).
Os primeiros casos descritos de criopreservação de tecido ovárico na
espécie humana remontam ao ano de
1996 (30;31).
2 – Exposição aos Crioprotectores
Figura 4 – Estratégias para preservar a fertilidade feminina após terapia anti-neoplásica
A primeira etapa em qualquer protocolo de criopreservação é tentar atingir um equilíbrio entre as células e o
crioprotector. Todos os crioprotectores apresentam características
comuns nomeadamente o facto de
serem completamente miscíveis em
água e a capacidade de facilmente
serem incorporados pelas mem5
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
branas celulares. Existe uma enorme
variedade de crioprotectores, sendo a
sua principal função proteger as células dos efeitos da exposição ao frio,
estabilizando a estrutura celular e
evitando a formação de cristais de
gelo intracelular, principais causadores de danos na célula. O factor
que mais influencia a resposta da
célula à congelação é a relação entre
a área de superfície da célula e o vo-
cionais (32;33;34). As pacientes
devem ser informadas acerca das
opções que existem para a preservação da sua fertilidade e devem ser
devidamente orientadas e aconselhadas acerca do aspecto experimental do procedimento em questão (33).
A criopreservação de tecido ovárico
só deverá ser oferecida a mulheres
que estejam em risco perder a sua
fertilidade e que apresentem um
Material
Tecido Ovárico
Ovócito Imaturo(VG)
Ovócito Maturo(MII)
Disponibilidade
Inumeros; Sempre
presentes
Escassos; Apenas nos
folículos antrais
Escassos
Obtenção
Fácil (biópsia)
Punção ovocitária
Punção ovocitária
Tamanho (µm)
<50 µm
Células Suporte
Poucas; Pequenas
Fase Nuclear
Profase I;
Membrana nuclear
80-300 µm
(depende espécie)
Muitas
corona/cumulus
VG: Membrana
nuclear
80-300 µm
(depende espécie)
Muitas
corona/cumulus
Metafase II; sem
membrana nuclear
Zona
Não
Sim
Sim
Grânulos Corticais
Não
Centrais
Periféricos
Lípidos Intracelulares
Poucos
Podem ser
abundantes
Podem ser
abundantes
Taxa Metabólica
Baixa
Baixa
Baixa
Superfície / Volume
Alta
Baixa
Baixa
Tabela I – Comparação de características que influenciam a criosensibilidade e a adequabilidade para o crio-armazenamento entre
ovócitos em diferente estádios de desenvolvimento. (Adaptado de Shaw et al.,)
lume da mesma. Isto é, quanto maior
a célula, mais lento deve ser o
arrefecimento no processo de congelação (Tabela I).
3 – Directrizes Clínicas para a
Criopreservação de Tecido Ovárico
Devido ao crescente interesse que se
tem verificado na criopreservação de
tecido ovárico é necessário que sejam
traçadas directrizes clínicas relativas
aos diferentes procedimentos.
A criopreservação de tecido ovárico
deve ser realizada como procedimento laboratorial, a título experimental,
tendo em consideração os aspectos
mencionados nas directrizes interna6
prognóstico favorável pós-terapia
oncológica.
4. - Desafios na Criopreservação de
Tecido Ovárico
A criopreservação de tecido ovárico
e possível transplante apresenta-se
como uma alternativa promissora
para a preservação da fertilidade em
mulheres com doença neoplásica. No
entanto, é necessário acautelar determinadas questões como a isquémia
(por deficiente neovascularização do
tecido) e o possível risco de transmissão de células neoplásicas.
Referências Bibliográficas:
1. Lobo RA (2003) Early ovarian
ageing: a hypothesis. Hum. Reprod.
18:1762-1764
2. Faddy, M.J., Gosden, R.G.,
Gougeon, A., Richardson SJ, Nelson
JF. (1992) Accelarated disappearance
of ovarian follicles in mid-life: implications for forecasting menopause.
Hum. Reprod. 7:1342-1346.
3. Almeida Santos T (2003)
Esterilidade ovocitária – Contribuição para o diagnóstico etiológico
da ausência de fecundação in vitro e
definição de uma nova classe de
esterilidade - Tese de Doutoramento.
Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
4. Boring, C.C., Squires, T.S., Tong,
T. and Montgomery, S. (1994) cancer
statistics. CA Cancer J. Clin., 44:7-26
5. Mohr LR, Trounson AO. (1985)
Cryopreservation of human embryos.
Ann N Y Acad Sci., 442:536-43.
6. Brown JR, Modell E, Obasaju M,
King YK. (1996) Natural cycle invitro fertilization with embryo cryopreservation prior to chemotherapy
for carcinoma of the breast. Hum
Reprod. 11:197-199.
7. Whittingham DG. (1977) Fertilization in vitro and development to
term of unfertilized mouse oocytes
previously stored at -196 degrees C. J
Reprod Fertil; 49: 89-94.
8. Fuku E, Kojima T, Shioya Y,
Marcus GJ, Downey BR. (1992) In
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
vitro fertilization and development of
frozen-thawed bovine oocytes. Cryobiol. 4:485-92.
9. Trounson A. (1986) Preservation
of human eggs and embryos. Fertil
Steril.; 46:1-12.
10. Gook DA, Osborn SM, Johnston
WI. (1993) Cryopreservation of
mouse and human oocytes using 1,2propanediol and the configuration of
the meiotic spindle. Hum Reprod.
7:1101-9.
11. Baka SG, Toth TL, Veeks LL,
Jones HW, Muasher SJ, Lanzendorf
SE. (1995) Evaluation of the spindle
apparatus of in-vitro matured humanoocytes following cryopreservation.
Hum Reprod. 10: 1816 –20.
12. Pickering S.J, Braude PR,
Johnson M.H, Cant A, Currie J
(1990) Transient cooling to room
temperature can cause irreversible
disruption of the meiotic spindle in
the human oocyte. Fertil. Steril.;
54:102– 8.
13. Al-Hasani S, Diedrich K, Van der
Ven H, Reineke A, Hartje M and
Krebs D (1987) Cryopreservation of
human oocytes. Hum Reprod
2:695–700.
14. Bos-Mikich, A and Whittingham,
D.G. (1995) Analysis of chromosome
complement of frozen-thawed mouse
oocytes after parthenogenetic activation. Mol.Reprod. Dev. 42:254-260.
15. Whittingham DG. (1977) Ferti-
lization in vitro and development to
term of unfertilized mouse oocytes
previously stored at --196 degrees C.
J Reprod Fertil; 49:89-94.
16. Borini A, Bonu MA, Coticchio G,
Bianchi V, Cattoli M and Flamigni C
(2004) Pregnancies and births after
oocyte cryopreservation. Fertil Steril
82:601–605.
17. Borini A, Sciajno R, Bianchi V,
Sereni E, Flamigni C and Coticchio G
(2006) Clinical outcome of oocyte cryopreservation after slow cooling with a
protocol using a high sucrose concentration. Hum Reprod. 21:512–517.
18. Levi Setti PE, Albani E, Novara
PV, Cesana A and Morreale G (2006)
Cryopreservation of supernumerary
oocytes in IVF/ICSI cycles. Hum
Reprod. 21:370–375.
19. Shaw JM, Oranratnachai A,
Trounson AO (2000) Fundamental
cryobiology of mammalian oocytes
and ovarian tissue. Theriogen.
53:59–72.
20. Fabbri R, Porcu E, Marsella T,
Rocchetta G, Venturoli S and
Flamigni C(2001) Human oocyte
cryopreservation: new perspectives
regarding oocyte survival. Hum
Reprod 16: 411–416.
21.Pincus G., Enzmann EV. (1935)
Comparative behaviour of mammalian eggs in vivo and in vitro.
J.Exp.Med.62: 665-678.
22. Edwards RG (1965) Maturation
Ginecobstet, Prat 2007; (N.º 21)
in vitro of human ovarian oocytes.
Lancet 2:926-924.
23. Jurema M, Nogueira D (2006) In
Vitro maturation of human oocytes
for assisted reproduction. Fertility
and Sterility 86:1277-1291.
24. Wood CE, Shaw JM and
Trounsen AO (1997) Cryopreservation of ovarian tissue; potential
“reproductive insurance” for women
at risk of early ovarian failure. Med.
J. Aust., 166:366-369
25. Deanesly, R. (1954) Immature rat
ovaries grafted after freezing and
thawing. J.Endocrinol. 11:197–200.
26. Green S, Smith AU, Zuckerman
S (1956) The numbers of oocytes in
ovarian autografts after freezing and
thawing. J. Endocrinol. 13:330–334.
27. Parkers AS (1958) Factors affecting the viability of frozen ovarian tissue. J.Endocrinol 17:337–343.
28. Gosden RG, Baird DT, Wade JC,
Webb R (1994) Restoration of fertility
to oophorectomised sheep by ovarian
autographs stored at –196°C. Hum.
Reprod. 9: 597–603.
29. Lee DM, Yeoman R, Battaglia
DE, Stouffer RL, Fanton J and Wolf
DP (2003) Birth of a rhesus monkey
after transplantation of ovarian tissue. Fertil Steril 80 (Suppl), 21.
30. Hovatta, R Silye, T Krausz, R
Abir, R Margara, G Trew, A Lass,
RM Winston (1996) Cryopreservation of human ovarian tissue using
dimethylsulphoxide and propanediol-sucrose as cryoprotectants. Human Reproduction 11:1268–1272.
31. Newton H, Aubard Y, Rutherford
A, Sharma V, Gosden R (1996) Low
temperature storage and grafting of
human ovarian tissue. Hum.Reprod
11: 1487–1491.
32. RAFT-Regulatory Authority for
Fertility and Tissue - 2004
33. ASRM: The Ethics Committee of
the American Society for Reproductive
Medicine. Fertility preservation and
reproduction in cancer patients – Fertil
Sterility. 83: June 2005.
34. American Society of Clinical
Oncology http://www.asco.org/guidelines/fertility.