Potencial osteocondutor de grânulos de hidroxiapatita em defeitos

Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza Herdy”
UNIGRANRIO
LEONARDO JORGE CARVALHO TEIXEIRA
Potencial osteocondutor de grânulos de
hidroxiapatita em defeitos críticos na calvária de ratos
Duque de Caxias
2009
LEONARDO JORGE CARVALHO TEIXEIRA
Potencial osteocondutor de grânulos de
hidroxiapatita em defeitos críticos na calvária de ratos
Dissertação apresentada à Universidade do
Grande Rio - “Prof. José de Souza Herdy”,
como requisito para obtenção de grau de
mestre em Odontologia.
Área de concentração: Implantologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Márcio Baltazar Conz.
Duque de Caxias
2009
CATALOGAÇÃO NA FONTE/BIBLIOTECA - UNIGRANRIO
T266p
Teixeira, Leonardo Jorge Carvalho
Potencial osteocondutor de grânulos de hidroxiapatita em defeitos críticos
na calvária de ratos / Leonardo Jorge Carvalho. – 2009.
71 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado em Odontologia) – Universidade do Grande Rio
“Prof. José de Souza Herdy”, Escola de Ciências da Saúde, 2009
“Orientador: Prof. Márcio Baltazar Conz
Bibliografia: f. 61-69
1. Odontologia. 2. Enxerto ósseo. 3. Hidroxiapatitas. 4. Regeneração
óssea. 5 . Ratos. I. Conz, Márcio Baltazar. II. Universidade do Grande Rio
“Prof. José de Souza Herdy “. III. Título.
CDD – 617.6
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a DEUS por iluminar sempre o meu caminho, me guiando e
protegendo em todos os momentos dessa minha caminhada.
Ao meu orientador Márcio Baltazar Conz, pelos ensinamentos, pela orientação
valiosa e segura, pela confiança depositada em mim, e pela oportunidade de dar
continuidade a um trabalho de muita seriedade e dedicação de uma vida.
Aos meus queridos e amados pais, Delson Gonçalves Teixeira e Eliana Carvalho
Teixeira, responsáveis por mais esse momento da minha vida e eterna gratidão por
todo incentivo aos meus estudos; pelo amor, carinho e compreensão nesse
momento tão importante e, acima de tudo, por nunca terem deixado de acreditar em
mim.
À minha querida avó Thereza Muzitano de Carvalho pela sua dedicação sem limites
a nossa família, e ao seu amor incondicional.
Aos meus irmãos Alexandre Carvalho Teixeira e Pedro Paulo Carvalho Teixeira,
meus verdadeiros ídolos, meus amigos, meus incentivadores e sem dúvida maiores
referências ao longo da minha vida.
A minha namorada Aline de Jesus Alexandre, pelo apoio em todos os momentos,
estando sempre ao meu lado me incentivando e compreendendo com tanta
paciência e carinho.
Ao coordenador do curso de Mestrado em Implantologia Oral da UNIGRANRIO,
Guaracilei Maciel Vidigal Jr. e professores Nassim David Harari e Marcelo Corrêa
Manso, pelos sábios ensinamentos científicos e sugestões enriquecedoras.
Ao Professor Eduardo Seixas Cardoso, pelos ensinamentos, confiança, carinho e
amizade. Obrigado pelos conselhos, não apenas referentes à profissão, mas
também para a vida.
Ao Professor Edson Jorge Lima Moreira pela sua valiosa contribuição na realização
da análise estatística desse trabalho.
Ao meu amigo Humberto da Fontoura Carvalho, pelo incansável e fundamental
auxílio na utilização dos programas de computador e confecção de gráficos.
Aos meus queridos amigos e cirurgiões-dentistas, André Rautt Alves, Liliana
Sabrosa Borges da Silva, Paulo Borges Moreira de Carvalho, Rafael Metropolo
Moreira, Rodrigo Carvalho de Souza e Luiz Sergio Souza de Paiva, pela amizade e
companheirismo demonstrados não só nesta difícil fase, mas em todos os
momentos.
Aos meus colegas de turma, Carlos Magno dos Anjos, Camila Neves Campos,
Edecir Décio Bisognin, Márcio Macedo Soares, Marcelo Lievori Brandão, Thiago
Degli Espoti, pela convivência humana e profissional.
Enfim, a todos que, de um modo ou de outro, por suas atitudes e seus
ensinamentos, incentivaram-me a concluir este curso.
A todos, muito obrigado.
Ama-se o que se conquista com esforço.
Aristóteles
RESUMO
Os biomateriais à base de fosfato de cálcio são amplamente utilizados como
substitutos ósseos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial
osteocondutor de hidroxiapatitas com diferentes características físico-químicas, uma
com baixa cristalinidade (HA-1) e outra com alta cristalinidade (HA-2) inseridas em
defeitos ósseos de tamanho crítico na calvária de ratos. Foram utilizados 45 ratos,
sendo 15 enxertados com HA-1, 15 com HA-2 e 15 preenchidos apenas pelo
coágulo. O sacrifício dos animais (n=5 por grupo) ocorreu em 1, 3 e 6 meses após a
cirurgia e os procedimentos histotécnicos e histomorfométricos foram realizados
para se determinar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões
periférica, intermediária e central do defeito, nos três grupos. A primeira análise
comparou a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica,
intermediária e central entre os grupos. A segunda avaliou a dinâmica da
neoformação óssea em cada grupo isoladamente. Ao compararmos os grupos HA-1,
HA-2 e coágulo não existiram diferenças estatisticamente significante na densidade
de volume de osso neoformado nas três regiões estudadas, no intervalo de tempo
determinado. No entanto, analisando-se os grupos isoladamente houve diferença na
dinâmica da neoformação óssea. O grupo coágulo apresentou um aumento da
densidade de volume de osso neoformado na região intermediária aos 6 meses
após a cirurgia. Os grupos enxertados com HA-1 aos 3 e com HA-2 em 1 e aos 6
meses após a cirurgia apresentaram equivalentes densidade de volume de osso
neoformado nas regiões periférica, intermediária e central sem diferença
estatisticamente significante, demonstrando satisfatório potencial osteocondutor.
Palavras-chave: enxertos ósseos, hidroxiapatitas, regeneração óssea, ratos.
ABSTRACT
The biomaterials based on calcium phosphate are widely used as bone substitutes.
The purpose of this study was to evaluate the osteoconductive potential of
hydroxyapatites with different physicochemical characteristics, one with low
crystallinity (AH-1) and another with high crystallinity (HA-2) inserted into criticalsized bone defects of rat calvaria. A total of 45 rats being 15 grafted with HA-1, 15
with HA-2 and 15 completed only by the clot. The sacrifice of animals (n = 5 per
group) occurred in 1, 3 and 6 months after surgery and histotechnical and
histomorphometric procedures were performed to determine the volume density of
newly formed bone in the peripheral, intermediate and central regions of the defects
for the three groups. The first analysis compared the volume density of newly formed
bone in the three regions between the groups. The second evaluated the dynamics
of bone formation in each group separately. When comparing the groups HA-1, HA-2
and clot, did not exist statistically significant differences in the volume density of
newly formed bone between the peripheral, intermediate and central regions in the
periods analyzed. However, analyzing the groups separately, there was difference in
the dynamics of bone formation. The clot group presented an increase in the volume
density of newly formed bone in the intermediate region at 6 months after surgery.
The groups grafted with HA-1 at 3 months and HA-2 at 1 and 6 months after surgery
showed equivalent volume density of newly formed bone in the peripheral,
intermediate
and
central
regions
without
difference
statistically
demonstrating satisfactory osteoconductive potential.
Keywords: bone grafts, hydroxyapatite, bone regeneration, rats.
significant,
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BMPs
Proteínas ósseas morfogenéticas
BSP
Sialoproteína óssea
Ca(NO3)2
Nitrato de cálcio
Ca/P
Razão molar cálcio – fosfato
(CaPO4)
Fosfato de cálcio
(Ca10(PO4)6OH2)
Fórmula da hidroxiapatita
CBPF
Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas
CEEPA
Comissão de ética no ensino e pesquisa em animais
DFDBA
Enxerto de osso descalcificado congelado seco
DRX
Difração de raios-x
EDTA
Ácido diaminotetracético
ETO
Óxido de etileno
FDBA
Enxerto de osso mineralizado congelado seco
H+
Ácido
HA
Hidroxiapatita
HA-1
Hidroxiapatita com baixa cristalinidade
HA-2
Hidroxiapatita com alta cristalinidade
H/E
Hematoxilina-eosina
I300
Valor da intensidade do plano 300
IGF
Fator de crescimento da insulina
JCPDS
Joint Committee on Powder Diffraction Standards
KW
Kruskal-Wallis
H2PO4H2O
Monofosfato de sódio hidratado
NaHPO4 12H2O
Difosfato de sódio hidratado
(NH4)2 HPO4
Diamônio fosfato
OBM
Osso bovino misto
p
Probabilidade
PDGF
Fator de crescimento derivado de plaquetas
pH
Sigla de potencial hidrogeniônico
q.s.p.
Quantidade suficiente para
ROG
Regeneração óssea guiada
SNK
Student-Newman-Keuls
TGF- β
Fator de crescimento transformador β
V112/300
Vale no espectro de raios-X entre os planos (112) e (300)
Xc
Índice de cristalinidade da amostra
α
Nível de significância
β-TCP
β- fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2)
µm
Micrômetro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 15
2.1 O tecido ósseo .................................................................................................. 15
2.2 Mecanismos biológicos de formação óssea ...................................................... 18
2.2.1 Osteogênese .................................................................................................. 19
2.2.2 Osteoindução ................................................................................................. 19
2.2.3 Osteocondução .............................................................................................. 19
2.3 Classificação dos enxertos ósseos quanto à sua origem .................................. 19
2.3.1 Enxertos autógenos ....................................................................................... 20
2.3.2 Enxertos alógenos .......................................................................................... 20
2.3.3 Enxertos xenógenos ....................................................................................... 21
2.3.4 Enxertos aloplásticos ...................................................................................... 22
2.4 Biomateriais para enxertos ósseos ................................................................... 23
2.4.1 Materiais a base de fosfato de cálcio ............................................................. 24
2.4.2 Hidroxiapatita ................................................................................................. 25
2.5 Características físico-químicas dos biomateriais para enxertos ósseos ........... 26
2.6 Potencial osteocondutor dos biomateriais “in vivo” ........................................... 29
2.6.1 Estudos em animais ....................................................................................... 29
2.6.2 Estudos em humanos ..................................................................................... 32
3 PROPOSIÇÕES ................................................................................................... 35
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 36
4.1 Materiais ............................................................................................................ 36
4.2 Avaliação “in vivo” ............................................................................................. 38
4.2.1 Grupos experimentais .................................................................................... 38
4.2.2 Preparo dos animais e procedimentos de implantação .................................. 39
4.2.3 Obtenção das biópsias e preparo histotécnico ............................................... 41
4.2.4 Procedimento histotécnico ............................................................................. 41
4.2.5 Análise histomorfométrica .............................................................................. 42
4.2.6 Análise estatística .......................................................................................... 46
5 RESULTADOS ..................................................................................................... 47
5.1 Comparação das regiões entre os grupos ......................................................... 47
5.2 Análise das regiões de cada grupo .................................................................... 50
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 54
7 CONCLUSÕES .................................................................................................... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 61
APÊNDICE A .......................................................................................................... 70
APÊNDICE B .......................................................................................................... 71
12
1 INTRODUÇÃO
Os avanços técnico-científicos alcançados na Medicina e Odontologia têm
possibilitado o desenvolvimento de biomateriais que contribuem para uma melhoria
na qualidade de vida humana. Paralelamente, o aumento da expectativa de vida tem
demandado o projeto de biomateriais para aplicações biomédicas que permaneçam
implantados no corpo humano de maneira satisfatória e por períodos mais longos.
Um biomaterial por definição é uma substância ou associação de duas ou
mais substâncias, farmacologicamente inertes, de origem natural ou sintética,
utilizadas para substituir, aumentar ou melhorar, parcial ou integralmente tecidos e
órgãos (WILLIAMS, 1987).
Os biomateriais de enxerto ósseo podem ser utilizados na Odontologia para o
aumento ou reconstrução do rebordo alveolar, preenchimento de defeitos intraósseos e de alvéolos dentários, implantes imediatos após exodontias, elevação do
assoalho do seio maxilar, e tratamento de defeitos perimplantares (LEGEROS, 2002,
MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
A previsibilidade dos tratamentos para a regeneração do tecido ósseo perdido
depende da técnica cirúrgica utilizada, da assepsia, da topografia e extensão do
defeito ósseo, da vascularização e do biomaterial de enxerto utilizado (LINDHE et
al., 2005). O processo de incorporação dos enxertos está relacionado à sua
intimidade com o leito receptor e ao equilíbrio dos seguintes processos: (1)
proliferação das células osteogênicas; (2) diferenciação em osteoblastos; (3)
osteoindução; (4) osteocondução; e (5) propriedades biomecânicas dos enxertos
(BURCHARDT, 1983).
Defeitos ósseos extensos podem demandar um grande período de tempo
para o reparo, diminuindo as chances de sucesso. A tendência atual é desenvolver e
utilizar biomateriais que acelerem ou, ao menos, permitam o reparo normal e
completo do defeito ósseo, diminuindo o risco pós-operatório (BLANK & LEVY, 1999;
YOUNG et al., 1999).
Os biomateriais podem ser classificados de acordo com o seu mecanismo de
ação e origem.
O mecanismo de ação diz respeito às suas propriedades biológicas e à
interação com o leito receptor. São classificados como osteogênicos quando são
capazes de promover a formação óssea por carregarem consigo células ósseas;
13
osteoindutores quando são capazes de induzir a diferenciação de células
mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos com possibilidade de formação
óssea ectópica e osteocondutores quando sua estrutura serve de arcabouço ou
substrato estrutural favorável para a migração celular e deposição óssea oriunda das
imediações, desta forma, o biomaterial pode ser gradativamente reabsorvido e
simultaneamente substituído por novo tecido ósseo (URIST, 1984, NOVAES JR. et
al, 2000, URIST, 2002).
Com relação à sua origem, os biomateriais podem ser classificados como
autógenos, homógenos, xenógenos e aloplásticos (MURUGAN & RAMAKRISHNA,
2005).
Os enxertos autógenos são aqueles obtidos do próprio paciente, a partir de
sítios doadores intra ou extrabucais. Apresentam melhor previsibilidade, e são
considerados como o “padrão ouro” por possuírem propriedades osteogênicas,
osteocondutoras e osteoindutoras. A morbidade pós-operatória relacionada à
necessidade de coleta de uma área doadora, eventuais aumento de tempo e custos
de tratamento devido a procedimentos realizados em ambiente hospitalar, são visto
com alguma resistência por parte dos pacientes e por isso tem sua indicação
redimensionada (LYNCH et al., 1999).
Os homógenos, alógenos ou aloenxertos são obtidos de indivíduos da mesma
espécie, porém com diferentes genótipos (MISCH & DIETSCH, 1993). O material
pode provir tanto de cadáveres quanto de seres vivos que, por diferentes razões,
foram submetidos a amputações terapêuticas (CHIAPASCO & ROMEO, 2007). Os
três tipos de biomateriais homógenos mais citados na literatura são: osso congelado
(raramente utilizado em função dos riscos de rejeição e transmissão de doenças);
FDBA (osso seco e congelado), DFDBA (osso desmineralizado seco e congelado).
Os biomateriais xenógenos, provém de doadores de outra espécie, como por
exemplo o osso de origem bovina (BAUER & MUSCHLER, 2000). Sua resistência
biomecânica é similar a do osso humano e tratamentos adequados para a sua
obtenção podem evitar respostas imunológicas ou inflamatórias adversas (MISCH,
2000). A ausência de proteína torna segura a utilização em humanos, restringindo
seu uso apenas aos aspectos culturais e religiosos (BENKE et al., 2001). O Bio-oss®
(Geistlich Pharma, Wolhumsen, Suíça) é um exemplo de hidroxiapatita bovina com
cristalinidade e composição química semelhante ao osso humano (SU-GWAN et al.,
2001).
14
Os materiais aloplásticos são dispositivos de origem sintética. Esses
biomateriais cerâmicos a base de fosfato de cálcio podem ser porosos, cristalinos,
amorfos, granulados, porém, sobretudo, devem garantir a formação de ligações
estáveis com o osso neoformado, com o passar do tempo (LYNCH et al., 1999). São
exemplos de biocerâmicas as hidroxiapatitas (HA), fosfato tricálcico e os biovidros.
As propriedades físico-químicas de cada biomaterial, somadas ao ambiente
fisiológico, influenciam diretamente na neoformação óssea e como e quando
ocorrerá de forma equilibrada a sua biodegradação. As propriedades físicas dos
biomateriais são específicas à área de superfície ou formato (bloco, partícula), à
porosidade (denso, macro ou microporoso) e à cristalinidade (cristalino ou amorfo).
As propriedades químicas dizem respeito à composição química, à razão molar
cálcio/ fosfato, ao grau de impureza elementar e à substituição iônica na estrutura
atômica (MISCH, 2000, KARAGEORGIU & KAPLAN, 2005, YANG et al., 2005).
Existe um longo caminho entre o desenvolvimento de um novo biomaterial ou
técnica até a utilização em seres humanos. Para utilização na clínica, é mandatório
que os materiais e técnicas sejam testados in vitro e in vivo.
Espera-se de um biomaterial, biocompatibilidade, osteocondutividade, e que
ele seja gradualmente reabsorvido à medida que novo osso viável é formado.
O
objetivo
do
presente
trabalho
foi
avaliar
através
da
análise
histomorfométrica o potencial osteocondutor de grânulos de hidroxiapatita com
diferentes cristalinidades no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária
de ratos.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O tecido ósseo
O sistema esquelético é tão essencial à vida quanto qualquer outro sistema
orgânico, pois desempenha um papel imprescindível na homeostase mineral
(ROBBINS et al., 2000; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005). O tecido ósseo serve
de suporte para os tecidos mucosos e protege órgãos vitais, como os contidos nas
caixas craniana e torácica e no canal medular. Aloja e protege a medula óssea,
formadora das células sanguíneas. Proporciona apoio aos músculos esqueléticos,
transformando suas contrações em movimentos úteis, e constitui um sistema de
alavancas que amplia as forças geradas na contração muscular (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2004).
Apesar do aspecto aparentemente inerte, os ossos crescem, são remodelados
e se mantém ativos durante toda a vida do organismo. Quando lesados, como em
fraturas, são capazes de reparação, fenômeno que demonstra sua permanente
vitalidade. O processo pelo qual o tecido ósseo se desenvolve é denominado
ossificação ou osteogênese. Os ossos podem se originar de duas maneiras: no seio
de uma região condensada de natureza conjuntiva ou quando o tecido ósseo se
forma substituindo gradualmente um modelo cartilaginoso preexistente. Pelas suas
características, esses dois processos foram denominados, respectivamente,
ossificação intramembranosa e ossificação endocondral (LYNCH et al., 1999;
KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
O osso é um tipo especializado de tecido conjuntivo formado por células e
material extracelular calcificado, a matriz óssea (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Bioquimicamente é definido por uma mistura especial de matriz orgânica (35%) e
elementos inorgânicos (65%). O componente inorgânico, hidroxiapatita de cálcio
[Ca10(PO4)6OH2], é o mineral que confere força e resistência aos ossos, sendo o
armazém de 99% do cálcio, 85% do fósforo e 65% do sódio e magnésio corporais
(MISCH & DIETSH, 1993; ROBBINS et al., 2000; HERNÁNDEZ-GIL et al.,2006). No
osso maduro, a matriz orgânica contém 85% de colágeno do tipo I, que atua como
uma malha na qual minúsculos cristais de hidroxiapatita são embutidos e o restante
é composto de moléculas não colágenas e líquido intersticial. Os minerais não estão
diretamente ligados ao colágeno, e sim ligados às moléculas (proteínas) não
16
colágenas. As moléculas não colágenas constituem aproximadamente de 3 a 5% do
osso, e são as responsáveis pela promoção de sítios ativos para a biomineralização
e para a adesão celular. Alguns exemplos de moléculas não colágenas são:
fosfoproteínas, GLA-proteínas (osteocalcina), glicoproteínas acídicas (osteonectina),
osteopontina, sialoproteína óssea (BSP), proteoglicanas/ glicosaminoglicanas
(principalmente decorina, biglicana, osteoaderina e lumican), proteínas séricas e
alguns lipídios. Outro importante constituinte da matriz do tecido ósseo é o grupo
das proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), relacionadas à superfamília dos
fatores de crescimento (TGF-ß), que são encontradas durante o desenvolvimento de
vários órgãos, inclusive do esqueleto (KATCHBURIAN & ARANA, 2004; MURUGAN
& RAMAKRISHNA, 2005).
As células ósseas são os osteoblastos, os osteócitos e os osteoclastos.
Os osteoblastos são as células responsáveis pela formação do tecido ósseo,
sintetizam os componentes da matriz orgânica e controlam a mineralização dessa
matriz. Estas células são completamente diferenciadas e não apresentam
capacidade de migração e proliferação. Assim, para permitir que ocorra a formação
óssea em um sítio determinado, células progenitoras mesenquimais indiferenciadas
(células osteoprogenitoras) podem migrar para o sítio e proliferar para se tornar
então osteoblastos. A diferenciação e o desenvolvimento dos osteoblastos pelas
células osteoprogenitoras são dependentes da liberação das BMPs e de outros
fatores de crescimento tais como fatores de crescimento da insulina (IGF), fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento dos
fibroblastos (LYNCH et al., 1999; LINDHE et al., 2005). Os osteoblastos são capazes
de concentrar fosfato de cálcio, participando da mineralização da matriz e em fase
de síntese mostram as características ultra estruturais das células produtoras de
proteínas (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Os osteoblastos, além da produção dos componentes da matriz, funcionam
como transmissores de sinais para a remodelação. Vários fatores locais como
prostaglandinas, citocinas e interleucinas também agem em relação a sua
proliferação, diferenciação e atividade (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
Os osteócitos são as células aprisionadas no interior da matriz óssea
mineralizada, ocupando as lacunas das quais partem canalículos. Cada lacuna
contém apenas um osteócito. Dentro dos canalículos os prolongamentos dos
osteócitos estabelecem contatos através de junções comunicantes, por onde podem
17
passar pequenas moléculas e íons de um osteócito para o outro. Esse arranjo
permite aos osteócitos (1) participar na regulação da homeostasia do cálcio
sanguíneo e (2) perceber a carga mecânica e transmitir essa informação às outras
células dentro do osso. Os osteócitos são células com a forma estrelada, achatadas,
que exibem pequena quantidade de retículo endoplasmático rugoso, aparelho de
Golgi pouco desenvolvido e núcleo com cromatina condensada (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2004; LINDHE et al., 2005).
A atividade de formação óssea está consistentemente associada à reabsorção
óssea que é iniciada e mantida pelos osteoclastos. Os osteoclastos são células
móveis, gigantes, multinucleadas e extensamente ramificadas, observadas nas
superfícies ósseas que se originam da fusão de células da linhagem monócitofagocítica dos tecidos hematopoiéticos (LYNCH et al., 1999; KATCHBURIAN &
ARANA, 2004; LINDHE et al., 2005). Os osteoclastos possuem citoplasma
granuloso, algumas vezes com vacúolos, fracamente basófilo nos osteoclastos
jovens e acidófilos nos maduros. A zona clara é um local de adesão do osteoclasto
com a matriz óssea e cria um microambiente fechado, onde tem lugar a reabsorção
óssea. Os osteoclastos secretam para dentro desse microambiente fechado, ácido
(H+), colagenase e outras hidrolases que atuam localmente digerindo a matriz
orgânica e dissolvendo os cristais de sais de cálcio. A atividade dos osteoclastos é
coordenada por citocinas e por hormônios como a calcitonina, produzida pela
glândula tireóide, e o paratormônio, secretado pelas glândulas paratireóides
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; HERNÁNDEZ-GIL et al., 2006).
A matriz óssea mineralizada é coberta por duas membranas não calcificadas de
natureza conjuntiva, que, embora geralmente seja dito que a separam dos outros
tecidos, devem ser consideradas membranas que possibilitam uma gradual relação
entre um tecido mineralizado e o restante do organismo. São elas o periósteo e o
endósteo. O periósteo, mais externamente, é constituído de fibras colágenas e
fibroblastos, e na sua região mais interna, além de uma camada de células de
revestimento potencialmente osteogênica, possui células indiferenciadas. Já o
endósteo é constituído apenas por uma camada de osteoblastos ou de células de
revestimento e apresenta, em geral, mais atividade que o periósteo (KATCHBURIAN
& ARANA, 2004).
A associação da hidroxiapatita com fibras colágenas é responsável pela dureza
e resistência do tecido ósseo. Histologicamente existem dois tipos de tecido ósseo: o
18
imaturo ou primário, e o maduro, secundário ou lamelar. Os dois tipos possuem as
mesmas células e os mesmos constituintes da matriz. No tecido primário as fibras
colágenas se dispõem irregularmente, sem orientação definida. No lamelar, as fibras
se organizam em lamelas. O osso primário tem menor quantidade de minerais e
maiores proporções de osteócitos do que o lamelar. Este por sua vez possui fibras
colágenas organizadas em lamelas de três a sete micrômetros de espessura, que ou
ficam paralelas umas às outras, ou se dispõem em camadas concêntricas em torno
de canais com vasos, formando o sistema de Havers ou ósteons. Cada ósteon é um
cilindro, às vezes bifurcado, formado por quatro a 20 lamelas ósseas concêntricas.
No centro desse cilindro ósseo existe um canal revestido de endósteo, o canal de
Havers, que contém vasos e nervos. Os canais de Havers comunicam-se entre si,
com a cavidade medular e com a superfície externa do osso por meio de canais
transversais ou oblíquos, que atravessam as lamelas, os canais de Volkmann
(LYNCH
et
al.,
1999;
JUNQUEIRA
&
CARNEIRO,
2004;
MURUGAN
&
RAMAKRISHNA, 2005).
Em um osso maduro, geralmente dois tipos de tecido podem ser diferenciados
macroscopicamente: o osso esponjoso e o osso compacto. Entretanto em ambos a
estrutura é basicamente a mesma, sendo constituídos por sistemas lamelares e
existindo diferenças apenas na quantidade e disposição das lamelas e na existência
ou não de espaços entre os referidos sistemas. O osso esponjoso é formado por
lamelas, na sua maioria paralelas entre si. As lamelas formam delgadas trabéculas
que deixam, entre elas, amplos espaços preenchidos por tecido conjuntivo frouxo,
vasos sanguíneos e tecido hematopoiético, constituindo, portanto, parte da medula
óssea. O osso compacto é formado por numerosos sistemas de lamelas
concêntricas (KATCHBURIAN & ARANA, 2004).
2.2 Mecanismos biológicos de formação óssea
Os biomateriais utilizados como enxertos ósseos podem agir através de três
diferentes
mecanismos:
osteogênese,
osteoindução
e
osteocondução
(BURCHARDT, 1983; MISCH & DIETSH, 1993; GARG, 1999; GAROFALO, 2007).
19
2.2.1 Osteogênese
Osteogênese é a formação e desenvolvimento do osso. Neste mecanismo, os
biomateriais são capazes de promover a formação óssea por carregarem consigo
células ósseas. Células osteogênicas podem encorajar a formação óssea em tecidos
mucosos ou ativar rapidamente a neoformação nos sítios ósseos. O osso autógeno
intra-oral e extra-oral são exemplos de materiais de enxertos com propriedades
osteogênicas e são capazes de formar tecido ósseo mesmo na ausência de células
mesenquimais indiferenciadas (LINDHE et al., 2005).
2.2.2 Osteoindução
Osteoindução é o ato ou processo de estimular a osteogênese. Envolve a
formação de um novo tecido ósseo, pela diferenciação local das células
mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos, sob a influência de um ou mais
agentes indutores, como as proteínas ósseas morfogenéticas (BMP), presentes nos
enxertos (LINDHE et al., 2005).
2.2.3 Osteocondução
Na osteocondução o biomaterial funciona como uma matriz física ou arcabouço
para deposição de novo osso oriundo das imediações. É caracterizada por um
processo de crescimento e invasão de vasos sanguíneos, de tecidos perivasculares
e de células osteoprogenitoras do sítio receptor para o enxerto. O biomaterial é
gradativamente reabsorvido e simultaneamente substituído por novo tecido ósseo
(BAUER & MUSCHLER, 2000; CARVALHO et al., 2004).
2.3 Classificação dos enxertos ósseos quanto a sua origem
Com relação à sua origem, os biomateriais podem ser classificados em
autógeno, alógeno, xenógeno, e aloplástico.
20
2.3.1 Enxertos Autógenos
Os enxertos autógenos são aqueles obtidos do próprio paciente. Geralmente
indicados como a primeira escolha, são os biomateriais que apresentam melhor
previsibilidade, considerados como o “padrão ouro”, por possuírem propriedades
osteogênicas, osteocondutoras e osteoindutoras, além de evitar incompatibilidades
imunológicas. Sua eficácia baseia-se no transplante da matriz óssea autógena
contendo células ósseas vivas para a região receptora (MARX & SAUNDERS,
1986). Podem ser de osso cortical ou medular ou da associação de ambos. O
medular é o material mais eficiente na reconstrução de defeitos ósseos, pois fornece
uma maior quantidade de células osteogênicas (MISCH, 2000).
São utilizados na forma de blocos ou particulados quer seja de sítios doadores
intra ou extra-orais. Os intra-orais comumente utilizados são a tuberosidade maxilar,
o ramo mandibular, exostoses, e a sínfise mandibular, e os extra-orais são a crista
ilíaca, a calota craniana e a tíbia (GARG, 1999; MISCH, 2000). Com relação à
escolha do sítio doador, isso dependerá da quantidade em volume, e do tipo de
enxerto desejado para a cirurgia proposta. Entretanto, a morbidade pós-operatória
relacionada à necessidade de coleta de uma área doadora, e eventuais aumento de
tempo e custos de tratamento devido a procedimentos realizados em ambiente
hospitalar, têm sido vistos com alguma resistência por parte dos pacientes e por isso
tem sua indicação redimensionada (MISCH & DIETSH, 1993; LYNCH, 1999;
GAROFALO, 2007).
2.3.2 Enxertos Alógenos
Os enxertos alógenos ou homógenos são obtidos de indivíduos da mesma
espécie, porém com diferentes genótipos. O material pode provir tanto de cadáveres
quanto de seres vivos que, por diferentes razões, foram submetidos a amputações
terapêuticas (BUCK & MALININ, 1994; CHIAPASCO & ROMEO, 2007). Após um
específico processamento, que consiste de lavagem e desidratação, o material é
irradiado ou esterilizado em óxido de etileno (ETO) visando diminuir, ainda mais, seu
potencial osteogênico. A esterilização com óxido de etileno pode diminuir a
capacidade de indução do DFDBA e a exposição do material a altas temperaturas
pode desnaturar suas proteínas. Além disso, as formas de esterilização podem não
21
remover os resíduos formados durante o próprio processo (AMERICAN ACADEMY
OF
PERIODONTOLOGY,
POSITION PAPER,
2001).
Os
biomateriais
são
armazenados sob várias formas e tamanhos em bancos de ossos. Suas principais
vantagens são: a disponibilidade, a eliminação de um sítio doador no paciente, a
diminuição da quantidade de anestesia e do tempo cirúrgico, e a diminuição da
perda de volume sanguíneo. As desvantagens estão relacionadas principalmente ao
fato dos tecidos serem oriundos de outro indivíduo, com possibilidades de
transmissão de doenças infecciosas.
Os três tipos de biomateriais homógenos mais citados são: osso congelado,
raramente utilizado em função dos riscos de rejeição e transmissão de doenças;
FDBA (osso seco e congelado), DFDBA (osso desmineralizado, seco e congelado)
(MELLONIG & LEVEY, 1984; GARG, 1999; MISCH, 2000). O FDBA e o DFDBA
diferem no modo em que são processados, o DFDBA sofre uma remoção de seu
componente mineral (desmineralização) por meio de imersão em ácido clorídrico,
objetivando a exposição das proteínas ósseas morfogenéticas que induzirão a
diferenciação das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos.
O potencial osteoindutor do DFDBA pode ser perdido ou reduzido se houver
falha durante o processamento do material, ocasionando falta ou quantidade
insuficiente de proteína indutora ou, ainda, se a proteína estiver presente, porém
inativa (MISCH & DIETSH, 1993; AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY,
POSITION PAPER, 2001; URIST, 2002; GAROFALO, 2007).
Os enxertos alógenos induzem uma resposta imunológica no hospedeiro, com
possibilidade de serem rejeitados. A histoincompatibilidade antigênica está
provavelmente relacionada às proteínas ou glicoproteínas na superfície celular. A
rejeição do enxerto alógeno é histologicamente expressa pela descontinuidade dos
vasos, por um processo inflamatório caracterizado pela presença de linfócitos,
encapsulação fibrosa, reabsorção periférica do enxerto, não união e fratura por
fadiga (BURCHARDT, 1983).
2.3.3 Enxertos Xenógenos
Os biomateriais xenógenos provém de doadores de outra espécie, como
exemplo o osso de origem bovina. Sua resistência biomecânica é similar a do osso
humano e tratamentos adequados para a sua obtenção podem evitar respostas
22
imunológicas ou inflamatórias adversas. A ausência de proteína torna-o seguro para
a utilização em humanos, deixando como restrições ao seu uso apenas os aspectos
culturais e religiosos.
O Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Suíça) é um exemplo de
hidroxiapatita bovina, com cristalinidade e composição química semelhante ao osso
humano. De acordo com o fabricante encontra-se disponível em blocos ou triturado
em grânulos corticais ou esponjosos, com uma faixa granulométrica de 250µm a
1000 µm. Sua especial arquitetura porosa natural (75-80%) possibilita uma melhor
vascularização
e,
ainda,
mantém
um arcabouço
para
osteocondutividade,
aumentando a estabilização do coágulo e absorção sanguínea natural entre os
micros e macroporos (MISCH & DIETSH, 1993; PIATTELLI et al., 1999; GARG,
1999; MISCH, 2000).
Dentre as várias opções de biomateriais disponíveis o enxerto bovino tem se
mostrado como uma alternativa para as mais diversas modalidades, existindo uma
variedade de estudos que sustentam as suas indicações (BERGLUNDH & LINDHE,
1997; PIATTELLI et al., 1999; MAIORANA et al., 2005).
2.3.4 Enxertos Aloplásticos
Os materiais aloplásticos são dispositivos de origem sintética. Esses
biomateriais, bioinertes e bioativos, podem ser porosos, cristalinos, amorfos e
granulados, porém, sobretudo, devem garantir a formação de ligações estáveis com
o osso neoformado, com o passar do tempo.
Utilizados
para
reconstrução
de
defeitos ósseos e aumento do rebordo alveolar reabsorvido, funcionam através da
promoção de um arcabouço para a angiogênese e conseqüente neoformação óssea.
Em geral, estes materiais exibem boa resistência à compressão e pobre resistência
à tensão, similares ao osso humano. São exemplos de materiais aloplásticos, as
hidroxiapatitas (HA), o fosfato tricálcico e os biovidros.
A hidroxiapatita representa o componente inorgânico do tecido calcificado do
corpo humano, pode ser reabsorvível ou não reabsorvível, e possui uma proporção
de cálcio / fósforo de 10:6. Esta semelhança estrutural com a apatita óssea mineral
permite crescimento e contato quando implantado no tecido ósseo. O fosfato
tricálcico apresenta estrutura semelhante à HA, bioativo e com propriedades
23
osteocondutoras, possui capacidade de ser reabsorvido por dissolução química
(MISCH & DIETSH, 1993; GARG et al.,1999).
O crescimento ósseo no interior do biomaterial aloplástico poroso é dependente
da biocompatibilidade, das interconexões e dimensões da estrutura porosa
(SCHLIEPHAKE et al., 1991).
2.4 Biomateriais de enxerto ósseo
Biomateriais podem ser definidos como uma substância ou combinação de
duas ou mais substâncias, farmacologicamente inertes de origem natural ou
sintética, que são utilizados para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou
integralmente, tecidos e órgãos (WILLIAMS, 1987). A utilização de biomateriais para
enxerto ósseo apresentou um grande avanço nas últimas décadas com o
desenvolvimento destes para o tratamento de aumento ou reconstrução do rebordo
alveolar, preenchimento de defeitos intra-ósseos periodontais e de alvéolos
dentários, elevação do assoalho do seio maxilar, e tratamento de defeitos
perimplantares (BERGHLUNDH & LINDHE, 1997; FUGAZZOTTO & VLASSIS, 1998;
MAIORANA et al., 2005; ARTZI et al., 2005).
O
biomaterial
deve
ser
osteocondutor
e
susceptível
a
bioabsorção
osteoclástica para permitir substituição pelo osso do hospedeiro no espaço do
enxerto (FLECKENSTEIN et al., 2006).
Os biomateriais direcionam a forma geral e a estrutura do tecido a ser
substituído, promovem a adesão celular e subseqüente crescimento tecidual
permitindo a difusão de nutrientes e células através do seu arcabouço (ROSE et
al.,2004).
A biocompatibilidade dos biomateriais está intimamente relacionada ao
comportamento celular no contato e particularmente na adesão celular a sua
superfície. Para isso é importante uma apropriada topografia, química e energia de
superfície. Assim, a aproximação, a adesão e o “espraiamento” que ocorrem na
primeira fase da interação entre a célula e o biomaterial, e a qualidade desta
primeira fase influenciará a capacidade celular para proliferar e se diferenciar em
contato com o material enxertado. Isto é essencial para a eficácia dos enxertos no
sentido de se estabelecer uma interface mecanicamente sólida com completa fusão
24
entre a superfície do material e o tecido ósseo sem a presença de uma interface
fibrosa (ANSELME, 2000).
A regeneração óssea é um processo complexo e contínuo que objetiva uma
restauração anatômica e funcional. Inúmeros eventos ocorrem quando um
determinado biomaterial entra em contato com o ambiente biológico. Interações
moleculares e celulares influenciam as características teciduais ao redor dos
biomateriais. Na presença destes, fatores de crescimento são adsorvidos ou
umidecem a superfície dos substitutos ósseos, promovendo uma adequada
integração com o osso do hospedeiro. A função dos biomateriais é promover rápida
formação óssea. Assim, quando se estabelece uma total integração, uma gradual
substituição por novo osso ocorrerá (GAROFALO, 2007).
2.4.1 Materiais de enxerto ósseo a base de fosfato de cálcio
Os biomateriais à base de fosfato de cálcio utilizados como materiais de
enxerto ósseo ou no recobrimento de implantes dentários ou ortopédicos são
considerados materiais bioativos devido à sua capacidade de participar ativamente
no processo de cicatrização e/ou regeneração do tecido ósseo (MURUGAN &
HAMAKRISHNA, 2005).
A reatividade superficial é uma característica comum das cerâmicas ósseas
bioativas e consiste na habilidade da biocerâmica aderir ao osso, gerando grande
impacto na adesão, proliferação, diferenciação e mineralização das células ósseas
A adesão entre o biomaterial e o tecido ósseo e, o aumento do crescimento
ósseo são o resultado de múltiplas, paralelas e seqüenciais reações que ocorrem na
interface (DUCHEYNE & QIU, 1999).
Embora as cerâmicas inorgânicas não demonstrem osteoindução, elas
certamente possuem habilidades osteocondutoras, bem como uma notável
habilidade de se ligar diretamente ao osso (BURG et al., 2000).
Uma das vantagens das biocerâmicas à base de fosfato de cálcio, utilizadas
como enxertos ósseos, é que tanto os íons cálcio quanto os íons fosfato não
interferem na função celular e fisiológica dos tecidos adjacentes, proporcionando
uma resposta tecidual favorável ao tratamento. A liberação de cálcio e fosfato, por
parte das biocerâmicas, pode participar, dentro de certos limites, como
estimuladores da formação óssea, bem como na reprecipitação de uma camada de
25
apatita carbonatada sobre a superfície do biomaterial estabelecendo uma ligação
química com o osso neoformado (LEGEROS, 2002).
As apatitas e seus derivados, em particular a hidroxiapatita (HA), bem como o
fosfato tricálcio são os principais biomateriais de enxertos ósseos sintéticos que têm
sido investigados (TOTH et al., 1995; RODRIGUES-LORENZO et al., 2001).
2.4.2 Hidroxiapatita
A hidroxiapatita (HA) é o constituinte principal da fase mineral dos tecidos
calcificados, representando entre 30% e 70% da massa dos ossos e dentes,
respectivamente. Sua fórmula estequiométrica é [Ca10(PO4)6(OH)2], com a razão
Ca/P igual a 1,67 (MISCH, 2000).
Muitos métodos são utilizados para sintetizar a hidroxiapatita. O mais
convencional é a precipitação em meio aquoso utilizando como matéria-prima o
nitrato de cálcio [Ca (NO3)2] e o diamônio fosfato [(NH4)2HPO4]. No entanto a síntese
de uma hidroxiapatita pura por este método requer um controle de vários parâmetros
tais como: o pH da reação, o tempo, a temperatura, e a estequiometria da matéria
prima. Uma discreta variação destes parâmetros pode gerar drásticas variações na
composição do produto final (HORNEZ et al., 2007).
Tampieri et al. (2001) sugeriram ao estudarem hidroxiapatitas cerâmicas com
porosidade graduada como substitutos do osso natural, que pequenas variações na
geometria e propriedades físico-químicas poderiam causar significantes diferenças
na resposta biológica. Neste estudo as hidroxiapatitas exibiram forte adesão ao osso
com os poros contribuindo para uma interligação mecânica conduzindo a uma firme
fixação do material com o tecido ósseo.
Rosa et al. (2003) estudaram in vitro a diferenciação de osteoblastos oriundos
da medula óssea de ratos sobre hidroxiapatitas com diferentes topografias de
superfície avaliando: a adesão celular, a proliferação celular, a quantidade de
proteína total, a atividade de fosfatase alcalina e a formação de nódulos ósseos.
Seus resultados sugeriram que os eventos celulares iniciais, como por exemplo, a
adesão celular, não foi afetada pela topografia de superfície da hidroxiapatita.
Entretanto os eventos intermediários e finais testados foram favorecidos em
superfícies com uma topografia mais regular.
26
Dean-Mo Liu, (1996) fabricou e caracterizou grânulos de hidroxiapatita com 0,7
a 4 mm de diâmetro e com 24 a 76% do seu volume constituído de poros, com
tamanhos variando de 95 e 400 µm, simulando a estrutura porosa do osso humano.
Segundo o autor, geralmente os poros da superfície são menores em tamanho e em
quantidade, e mais estreitos do que nas regiões mais internas. Esta diferença na
característica do poro da superfície e das camadas interiores deve ser levada em
consideração clinicamente já que os poros da superfície podem em alguns casos
restringir a entrada de fluídos corpóreos através dos grânulos.
Um estudo em 2005 avaliou as características físico-químicas de seis grânulos
de hidroxiapatitas comumente utilizadas no mercado brasileiro e constatou
marcantes diferenças com relação à cristalinidade, área de superfície, e composição
de um fabricante para o outro ou em diferentes lotes de um mesmo fabricante. Estas
variações podem ser uma conseqüência da quebra do controle de qualidade no
processo de fabricação e podem afetar diretamente o resultado clínico esperado,
tornando um fator limitante para o uso de determinados biomateriais. Neste estudo,
apenas um dos biomateriais, uma hidroxiapatita bovina (Bio-oss® - Geistlich
Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) teve seus resultados perfeitamente de acordo
com a especificação do fabricante (CONZ et al., 2005).
2.5 Características físico-químicas dos biomateriais para enxertos ósseos
Inicialmente, os estudos in vitro sobre a interação entre os osteoblastos e o
biomaterial eram essencialmente preocupados com o efeito da resposta celular a
diversos tipos de materiais com pouca atenção sendo dada a influência da
caracterização físico-química (ROSA et al., 2003).
As propriedades físicas dos biomateriais são específicas à área de superfície
ou formato (bloco, partícula), a porosidade (denso, macro ou microporoso) e a
cristalinidade (cristalino ou amorfo).
O tamanho da partícula do biomaterial impacta diretamente no tamanho da
área da superfície disponível para reagir com células e fluído biológico. Quanto
maior o tamanho das partículas, maior será o tempo de reabsorção do biomaterial.
A porosidade melhora a conexão mecânica entre o biomaterial e o osso,
promovendo melhor estabilidade mecânica na interface. Dimensões adequadas de
poros favorecem o entrelaçamento do tecido com o biomaterial. Os biomateriais
27
macroporosos (> 50 µm) ou microporosos (< 50µm) possuem uma área de superfície
maior para a solução e a reabsorção mediada pelas células sob condições estáticas,
além disso, ocorre uma redução significativa na resistência à compressão e tensão.
O material poroso também oferece regiões adicionais para o crescimento interno e a
integração do tecido promovendo uma estabilização mecânica e, portanto, a
minimização do movimento e da deterioração dinâmica associada ao desgaste na
interface. Desta forma, poros com diâmetro de 100µm são necessários para a
migração e o transporte celular, entretanto poros maiores que 300µm permitem o
desenvolvimento de um sistema de capilares favorecendo a neoformação óssea.
O controle da macro e microporosidade é um fator de suma importância para a
eficiência do material enxertado no paciente. A colonização celular dos substitutos
ósseos depende das características de porosidade do biomaterial, em particular ao
tamanho e a distribuição dos poros e ao número e tamanho das interconexões entre
os macroporos. Estas interconexões formam uma espécie de sistemas de túneis os
quais permitem o acesso e o retorno dos fluídos biológicos e a entrada de células
ósseas que subseqüentemente irão facilitar a neoformação óssea no interior dos
macroporos do biomaterial.
Por outro lado, os poros também aumentam a área de superfície do material,
porém quanto maior a porosidade mais rápida será a dissolução do enxerto.
Um biomaterial cristalino possui uma organização atômica bem definida, ao
contrário de um material amorfo, que apresenta um formato de cristal irregular. A
cristalinidade é uma propriedade que altera o índice de dissolução do biomaterial e é
dependente da temperatura de sinterização. O uso de altas temperaturas (acima de
1000◦ C) por um período de no mínimo 6 horas, seguido de um resfriamento lento
durante o processo de síntese, resulta na mais perfeita forma do cristal e com isso
menor o grau de degradação.
A composição química, a razão molar cálcio/ fosfato, o grau de impureza
elementar e substituição iônica na estrutura atômica são propriedades químicas que
somadas ao ambiente mecânico influenciam o índice de dissolução do biomaterial
assim como na indicação ou restrição da sua aplicação clínica.
Acelerada reabsorção dos biomateriais ocorre quando impurezas são
observadas em sua estrutura (ex. carbonato de cálcio) e quando o ph do leito
receptor
diminui.
A
fórmula
da
hidroxiapatita
estequiométrica
(estável)
é
Ca10(PO4)6(OH)2, com sua razão molar cálcio/ fosfato igual a 1,67, um material que
28
possuir alteração em sua estrutura atômica, como por exemplo, o fosfato tricálcico
(Ca3(PO4)2) possuirá uma razão molar inferior (1,5), desta forma, sua velocidade de
reabsorção será mais rápida, ou seja, mais solúvel.
É de suma importância entender que as propriedades dos biomateriais
dependem primariamente da natureza e do processo de fabricação, além disso,
deve ser destacada a importância da caracterização levando-se em consideração as
propriedades físico-químicas relacionadas à composição química, morfologia,
cristalinidade, área superficial específica e expectativa de degradação (MISCH &
DIETSH, 1993; GARG, 1999; BURG et al., 2000; MISCH, 2000; TAMPIERI et al.,
2001; CONZ et al., 2005; DALAPÍCULA et al., 2006; HORNEZ et al., 2007).
O desempenho de um material sintético depende de parâmetros fundamentais
tais como: a composição química, a morfologia e a biodegradabilidade (TADIC &
EPPLE, 2004).
Se o tamanho do cristal é pequeno e/ou se existem incorporações de
carbonatos, a biodegradação é fortemente aumentada devido à alta solubilidade
(TADIC & EPPLE, 2004).
Accorsi-Mendonça et al., (2008) realizaram a caracterização físico-química de
dois xenoenxertos bovinos desproteinizados amplamente usados como enxertos
ósseos, o Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) e o Gen-Ox
(Baumer S.A., Brasil). Para a remoção da porção orgânica estes biomateriais
passam por um tratamento térmico específico, que no Bio-oss® gira em torno dos
300°C enquanto que no Gen-Ox este processo oscila entre 950°C a 1000°C. Os
resultados sugeriram que a presença de fases não cristalinas, provavelmente
material
orgânico
e
carbonatos,
identificados
no
Bio-oss®
através
da
termogravimetria, espectroscopia com infravermelho e difração de raio-x, geraram
um biomaterial de baixa cristalinidade e conseqüentemente mais propenso a
degradação. Assim, a temperatura do processamento pode ser um caminho para se
alterar as propriedades físico-químicas do biomaterial, produzindo materiais com
diferentes níveis de reabsorção.
Uma completa caracterização físico-química de 14 biomateriais utilizados
como substitutos ósseos à base de fosfato de cálcio foi realizada por Tadic & Epple.,
(2004) e pôde ser constatado que os biomateriais possuíam composição e
morfologia completamente diferentes. Ficou claro também que a mera definição
“cerâmica de fosfato de cálcio” não foi suficiente para caracterizar totalmente um
29
material. Por outro lado, esta diversidade de características cobre uma ampla
variedade de aplicações, desde enxertos permanentes a enxertos com rápida
biodegradabilidade.
2.6 Potencial osteocondutor dos biomateriais “in vivo”
Uma grande variedade de biomateriais de enxertos ósseos e implantes tem
sido avaliada “in vivo” em diferentes modelos animais, como ratos (SCHILIEPHAKE
et al., 2004; BRAZ et al., 2003; SILVA et al., 2005; ACCORSI MENDONÇA, 2008),
coelhos (THALLER, 1994), cães (BERGLUNDH & LINDHE, 1997; SU-GWAN et al.,
2001; SCHLEGEL et al., 2003) e macacos (McALLISTER et al., 1999). A escolha do
modelo animal para avaliar o reparo de defeitos ósseos utilizando biomateriais
geralmente envolve animais jovens com alto potencial para osteogênese (SCHIMITZ
& HOLLINGER, 1986).
2.6.1 Estudos em animais
Um estudo em 1997 analisou a cicatrização ao redor de implantes instalados
em defeitos ósseos tratados com Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser,
Switzerland) em cães. Após a análise histológica, foi observado que partículas de
Bio-oss® estavam claramente presentes nas áreas teste, porém com redução no
número de partículas entre 3 e 7 meses, e que o Bio-oss® tornou-se totalmente
integrado e subseqüentemente substituído por novo osso. Além disso, os implantes
instalados nas áreas enxertadas demonstraram após 4 meses, quantidade e
qualidade de osseointegração na interface osso-titânio, similares ao grupo controle,
em osso normal sem enxerto (BERGLUNDH & LINDHE, 1997).
Schlegel et al., (2003) ao compararem os resultados histológicos em cirurgias
de levantamentos de seio enxertados com osso autógeno versus Bio-oss® (Geistlich
Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) em dez cães beagles, com biópsias realizadas
após 90 e 180 dias constataram que o Bio-oss® não reabsorveu, no entanto o osso
natural neoformado estava integrado ao biomaterial penetrando no arcabouço e
formando camadas de osso vital sobre o trabeculado não vital da estrutura do Biooss® . Os poros intercomunicantes do biomaterial permitiram completa incorporação
deste corpo estranho e, as camadas de osso vital neoformado participaram do
30
turnover que envolve o processo de remodelamento. Os resultados deste estudo
sugeriram que o Bio-oss® pode ser utilizado com sucesso como material de enxerto
para levantamento de seio quando não se necessita de total regeneração óssea da
área enxertada e que o mesmo pode prevenir a indesejável reabsorção precoce que
freqüentemente ocorre nos seios submetidos aos procedimentos de aumento ósseo.
Em 18 meses de avaliação histológica e radiográfica de levantamentos de seio
maxilar com enxerto de osso bovino inorgânico em chimpanzés, foi constatado que o
osso bovino mineral mantinha evidência radiográfica de densidade e estabilidade do
seu tamanho, além de histologicamente suportar a hipótese de substituição por osso
vital (McALLISTER et al., 1999).
O potencial osteocondutor de biomateriais de enxertos tem sido amplamente
estudado utilizando tamanho de defeito crítico na calvária de ratos (DUPOIRIEUX et
al., 2001; BRAZ et al., 2003; SILVA et al., 2005; ACCORSI MENDONÇA, 2008;
FLECKENSTEIN et al., 2006). A calvária pode ser definida como a porção do crânio
que se estende do arco supra orbital até a protuberância occiptal externa, possuindo
uma origem embrionária intramembranosa. Anatomicamente, a calvária de ratos
apresenta duas camadas corticais paralelas separadas por um tecido esponjoso
com uma média de espessura de 0,68mm variando de 0,3 a 1,2mm (STRONG &
MOULTHTROP, 2000).
O menor defeito intra-ósseo em um determinado osso de uma espécie animal
que não se regenera espontaneamente por completo durante o período de vida do
animal é definido como tamanho de defeito crítico (SCHMITZ & HOLLINGER, 1986).
Um defeito de tamanho crítico de 8mm de diâmetro na calvária de ratos com 6
meses de idade, reduz para 5mm em 4 semanas e após esse período não ocorre
alteração no defeito, e a sua porção central cicatriza pela formação de um tecido
conjuntivo fibroso (URIST, 1984). Algumas vantagens para as pesquisas de enxertos
ósseos, utilizando defeitos críticos de 8mm na calvária de ratos são o custo baixo
dos animais, a necessidade de um espaço físico pequeno na manutenção, pequena
quantidade de material para realizar o estudo piloto e as partículas dos biomateriais
são inseridas com facilidade no defeito (SCHMITZ & HOLLINGER, 1986).
Um estudo realizado em defeitos críticos em calvárias de ratos onde o principal
objetivo era quantificar a neoformação óssea pela histomorfometria entre três
diferentes configurações de uma hidroxiapatita bifásica/ tricálcio fosfato, foi
observado que as diferenças na neoformação óssea estavam relacionadas ao
31
tamanho dos poros. Os macroporos medindo entre 150 e 500µm promoveram o
espaço necessário para a invasão vascular e subseqüente maior neoformação
óssea através do biomaterial (FLECKENSTEIN et al., 2006). Artzi et al., (2003)
analisaram em um primeiro estudo a histologia de defeitos ósseos experimentais
criados em mandíbulas de cães e constataram que em até 2 anos de observações
partículas de osso bovino mineral (Bio-oss®) dominavam os sítios sem substancial
reabsorção. O Bio-oss® provou ser um excelente biomaterial osteocondutor em todos
os sítios enxertados estando biologicamente incorporado ao tecido ósseo
neoformado e servindo de guia para a completa restauração dos defeitos intraósseos. Em um segundo estudo, seguindo a mesma metodologia, foi realizado uma
avaliação histomorfometrica da quantidade de osteocondutividade deste biomaterial
e a configuração final do sítio cicatrizado aos três, seis, 12 e 24 meses. As partículas
do osso bovino sofreram parcial atividade reabsortiva e biodegradação durante os
seis primeiros meses, o que foi validado pelos osteoclastos e a alta celularidade
presentes na proximidade das partículas. Entre seis e 24 meses discreta diminuição
da fração correspondente à área da partícula foi observada (ARTZI et al., 2003).
Em 2004, o mesmo grupo em outro estudo onde compararam a taxa de
reabsorção do osso bovino mineral (Bio-oss®) com o ß-fosfato tricálcico, também em
defeitos ósseos experimentais em cães, concluíram que ambos os materiais podem
ser de grande utilidade em cirurgias reconstrutivas, porém atenção deve ser dada às
características de biodegradabilidade de cada um, já que o ß-fosfato tricálcico
fosfato possui um padrão de reabsorção mais rápido do que o osso bovino mineral
(ARTZI et al., 2004). Estes estudos estão em concordância com as observações
feitas por Jensem et al. (2006), em um modelo de estudo similar, com análises
histológicas e histomorfométricas, em defeitos criados em mandíbulas de
miniporcos, onde os biomateriais estudados (Bio-oss® e ß-fosfato tricálcio) formaram
osso em um padrão mais lento do que o osso autógeno nas fases iniciais de
cicatrização (duas primeiras semanas). Ao final das oito semanas todos os defeitos
regeneraram com osso neoformado e um desenvolvido osso medular. Os
biomateriais demonstraram completa integração óssea, sugerindo sua utilização em
cirurgias reconstrutivas onde diferentes indicações clínicas requerem diferentes
padrões de biodegradabilidade.
O potencial osteocondutor de um osso bovino misto (OBM) em relação a dois
ossos bovinos inorgânicos medulares (Bio-Oss® e Gen-Ox®) inseridos em defeitos
32
de tamanho crítico na calvária de ratos foi analisado comparativamente após 1, 3, 6
e 9 meses. Na análise microscópica comparativa não se observou o completo
fechamento do defeito em quaisquer dos grupos estudados. No grupo controle a
ossificação ocorreu na borda do defeito, sendo a região central preenchida por
tecido conjuntivo fibroso. No grupo tratado com Bio-Oss ocorreu ossificação na
borda do defeito com denso fibrosamento ao redor das partículas. No grupo tratado
com Gen-Ox houve neoformação óssea ao redor das partículas do biomaterial e no
grupo tratado com OBM o infiltrado inflamatório persistiu no primeiro mês sendo
substituído por tecido conjunto fibroso ao redor das partículas (ACCORSI
MENDONÇA, 2008).
2.6.2 Estudos em humanos
Ozyuvaci
et
al.,
(2003)
através
de
avaliações
radiológicas
e
histomorfométricas de seios maxilares relataram que os sítios enxertados com
materiais aloplásticos (ß-fosfato tricálcico) reabsorveram mais do que aqueles
enxertados com biomaterial xenógeno, no entanto, ambos mostraram respostas
cicatriciais similares.
Em um estudo baseado em observações clínicas, o Bio-oss® (Geistlich
Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) foi utilizado sobre áreas enxertadas com bloco
autógeno. Devido as suas propriedades osteocondutoras, que compensaram a
reabsorção óssea natural e a invaginação de tecido mucoso, ocorreu a promoção de
uma ponte para nova formação óssea funcionando como uma barreira durante o
processo osteoclástico no período de cicatrização (MAIORANA et al., 2005).
Um estudo histológico de longo prazo de 20 casos de levantamentos de seio
em humanos avaliou as reações ósseas ao osso bovino inorgânico (Bio-oss® Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland). Neste estudo foram realizadas
biópsias após seis, nove, 18 meses e quatro anos. Os resultados indicaram alta
biocompatibilidade e osteocondutividade do Bio-oss®, no entanto, suas partículas
foram reabsorvidas muito lentamente e após quatro anos ainda se encontravam
presentes sendo facilmente reconhecidas (PIATTELLI et al., 1999).
Após 10 anos de acompanhamento de um caso de levantamento de seio
utilizando Bio-oss® (Geistlich Biomaterials, Wolhuser, Switzerland) com biópsias
realizadas após oito meses, dois e 10 anos para avaliação histomorfométrica, foi
33
observado que a comparação das médias de cada período demonstrou um aumento
significante na formação óssea associada à lenta reabsorção do biomaterial, já que
suas partículas estavam circundadas por osso lamelar neoformado (SARTORI et al.,
2003).
Com o objetivo de examinar a eficácia de uma nova hidroxiapatita bifásica
(hidroxiapatita e tricálcio fosfato) utilizada como substituto ósseo em combinação
com osso autógeno particulado em procedimentos de levantamento de seio em
humanos, Artzi et al., (2008) verificaram após 6 e 9 meses a presença de osso
neoformado altamente celular predominando ao redor das partículas. No entanto,
este crescimento ósseo ocorreu sem a significante remoção das partículas. O fato
da fração da área óssea e da fração da área da partícula não exibirem correlações
significantes sugeriram que os dois elementos alteraram independentemente.
Sabendo que a quantidade de osso neoformado é dependente do tipo e da
quantidade residual de material enxertado, um experimento relatou após análise
histológica de seios maxilares humanos 12 meses pós-aumento que o osso bovino e
o ß-fosfato tricálcico fosfato promoveram nova formação óssea, provando ser
materiais biocompatíveis, mas com valores significantemente maiores para os
enxertos
com
osso
bovino,
que
pareceu
possuir
melhores
propriedades
osteocondutoras. Assim, ficou evidente que a configuração das partículas do osso
bovino com seus macros e microporos resultaram em uma melhor propriedade
osteocondutora e que a presença contínua do material estabeleceu um maior
volume de tecido combinado pelo osso neoformado e o material enxertado,
funcionando como uma nova rede densa trabeculada (ARTZI et al., 2005).
Um estudo multicentro controlado analisou entre 6 e 8 meses os resultados
histomorfométricos de 48 cirurgias de levantamento de seio em 37 pacientes onde
foi utilizado um fosfato de cálcio bifásico (Straumann® Bone-Ceramic) em 25 seios.
O Bio-oss® foi utilizado na pesquisa como grupo controle em 23 seios. Os
parâmetros avaliados foram: (1) a fração da área do osso neoformado, tecido
conjuntivo e medular, e material de enxerto na região enxertada; (2) a fração da área
óssea, e tecido conjuntivo e medular no rebordo alveolar residual; (3) o percentual
da superfície de contato entre o biomaterial e o osso neoformado. Histologicamente
ambos os grupos demonstraram íntimo contato entre o osso neoformado e as
partículas do enxerto, sem diferenças estatisticamente significantes na quantidade
de osso mineralizado. O percentual de contato entre o Bio-oss® e o osso
34
neoformado foi de 48,2% e de 34% no Straumann® Bone-Ceramic. Quantidade
menor de partículas de enxerto foi observada no grupo teste aos 6 meses e uma
maior quantidade de tecido conjuntivo e medular, porém a quantidade de tecido
conjuntivo e medular em ambos os grupos não foi maior do que a encontrada no
rebordo alveolar residual (CORDARO et al., 2008).
Uma análise histomorfométrica do osso neoformado 10 meses após cirurgias
de levantamento de seio em 10 pacientes enxertados com uma combinação de osso
autógeno e DFDBA e com osso autógeno e uma hidroxiapatita revelou satisfatória
formação óssea em ambos os grupos na área enxertada, com 50,46% para o grupo
com DFDBA e 46,79% para a HA. A avaliação histológica revelou a presença de
osso maduro com áreas compactas e medulares em ambos os grupos. O infiltrado
inflamatório não foi significante com prevalência de mononucleares. Os resultados
indicaram que tanto o DFDBA quanto a HA associados ao osso autógeno foram
biocompatíveis e promoveram osteocondução, atuando como matrizes para a
neoformação óssea. No entanto, ambos os materiais continuavam claramente
presentes após 10 meses (BöECK-NETO et al., 2002).
Hallman et al., (2002) avaliaram clínica e histologicamente a integração de
implantes na região posterior da maxila após levantamento de seio com osso
autógeno, Bio-oss® ou uma mistura de autógeno com Bio-oss® em uma proporção
de 20:80. Os resultados indicaram uma resposta óssea similar e que a integração
dos implantes pôde ser vista nas três situações, pelo menos em uma perspectiva de
curto prazo, sem diferenças estatisticamente significantes. As partículas do Bio-oss®
permaneceram no tecido ósseo e foram vagarosamente embutidas em osso lamelar,
o que pôde resultar em maior densidade óssea, influenciando positivamente a
estabilidade do implante. Assim, a resistência do Bio-oss® à reabsorção e
degradação pode ser vantajosa para a manutenção das dimensões iniciais da área
enxertada.
35
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo desse trabalho foi avaliar por meio da análise histomorfométrica o
comportamento osteocondutor de hidroxiapatitas com diferentes características
físico-químicas no reparo de defeito ósseo de tamanho crítico na calvária de ratos.
Os objetivos específicos foram:
- Comparar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica,
intermediária e central de um grupo enxertado com uma hidroxiapatita de baixa
cristalinidade, um grupo enxertado com uma hidroxiapatita de alta cristalinidade e
um grupo preenchido pelo coágulo em 1, 3 e 6 meses após a cirurgia.
- Analisar a densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica,
intermediária e central de cada grupo (hidroxiapatita de baixa cristalinidade,
hidroxiapatita de alta cristalinidade e coágulo) isoladamente em 1, 3 e 6 meses após
a cirurgia.
36
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Dentre
os
procedimentos
relatados
a
seguir,
destaque-se
que
as
hidroxiapatitas utilizadas, os procedimentos cirúrgicos, o processamento histológico
e a análise histomorfométrica foram realizados e descritos por CONZ (2006).
4.1 Materiais
Foram produzidos dois diferentes grânulos de hidroxiapatita (HA-1 e HA-2),
com razão molar Ca/P igual a 1,60 e 1,67 respectivamente e cristalinidades
diferentes. As diferenças nas cristalinidades dos materiais de partida foram obtidas
por meio de um controle dos reagentes empregados, da temperatura e do tempo de
processamento.
Figura 1 - Difratogramas de raios-X dos grânulos das
hidroxiapatitas com diferentes cristalinidades, HA-1 e HA-2
(CONZ, 2006).
37
Os difratogramas dos grânulos produzidos com os pós HA-1 e HA-2 estão
apresentados na figura 1. Os espectros obtidos apresentaram os picos principais
referentes à hidroxiapatita sintética (JCPDS-ICDD cartão 9-432, 1992), podendo
destacar a presença dos picos nas intensidades de 100% correspondente ao plano
(211), o pico na intensidade de 60% correspondente ao plano (300) e o pico na
intensidade de 40% correspondente ao plano (002).
Na Tabela 1 estão apresentados os índices de cristalinidade dos pós de
hidroxiapatita e dos grânulos de hidroxiapatita após o processamento, determinado
pela técnica preconizada por Landi et al. (2000), onde a cristalinidade do material é
avaliada por meio dos espectros de raio-X aplicando a seguinte fórmula: Xc =1(V112/300/ I300)X 100, onde Xc é o índice de cristalinidade da amostra, V112/300
corresponde ao vale existente no espectro de raios-x entre os planos (112) e (300);
e I300 corresponde ao valor da intensidade do plano 300.
Tabela 1 - Índice de cristalinidade das amostras (CONZ, 2006).
Amostra
Antes do
Após o
processamento
processamento
dos grânulos (%) dos grânulos (%)
HA-1
≈ 28
≈ 28
HA-2
≈ 70
≈ 70
38
4.2 Avaliação “in vivo”
O experimento foi realizado no biotério da Faculdade de Odontologia de
Bauru (USP) em conformidade com os princípios e aprovado pela comissão de ética
no ensino e pesquisa em animais (CEEPA-proc. N0 18/2004).
Os animais foram mantidos durante o período experimental em boas condições de
alimentação, com ração e água ad libitum, temperatura, ciclo claro-escuro de 12
horas e higiene.
4.2.1 Grupos Experimentais
Um total de 45 ratos Wistar (Rattus norvegicus), machos adultos (5 meses de
idade e peso médio de 350g), foram divididos aleatoriamente em três grupos
experimentais com 15 animais cada. Nos períodos de 1, 3 e 6 meses após os
procedimentos cirúrgicos foram sacrificados 5 animais de cada grupo experimental
para a verificação do reparo ósseo nos defeitos desenvolvidos (Tabela 2).
Tabela 2 - Grupos Experimentais e materiais Utilizados (CONZ, 2006).
GRUPOS
(n=5animais/período)
PREENCHIMENTO
Experimental I
Coágulo
Experimental II
HA-1
Experimental III
HA-2
39
4.2.2 Preparo dos animais e procedimentos de implantação
Os animais foram submetidos à anestesia geral intramuscular, com uma
mistura de Ketamina 5% (Ketalar, Achë Laboratórios Farmacêuticos S.A,
Butantã,SP, Brasil), relaxante muscular e Xilazina 2% (Rompun, Bayer-S.A, São
Paulo, SP, Brasil), sedativo de uso animal, na proporção 1:1. A dose utilizada foi de
0,2 ml para cada 100g de peso. Após a anestesia foi realizada a tricotomia da região
frontoparietal da cabeça do animal com auxílio de tesoura e lâmina de barbear com
posterior assepsia vigorosa utilizando álcool iodado. Foi realizada uma incisão
mucoperiostal, com uma lâmina de bisturi n°10, em formato de meia-lua na calota
craniana e com auxílio de um periostómo de Molt e cinzel de Oshsenbein n°1
(SSWHITE), os retalhos de espessura total foram elevados expondo amplamente a
cortical óssea da região. A seguir, foi removido um fragmento da porção mediana
dos ossos parietais, com auxílio de um motor cirúrgico e um contra-ângulo redutor
16:1, por meio de uma broca trefina cirúrgica de 8 mm de diâmetro interno e 8,5 de
diâmetro externo (Wellfare S.A) sob irrigação abundante e contínua com solução
fisiológica. A dura-máter foi mantida íntegra. Após a remoção das tábuas corticais
externa e interna, os defeitos críticos transfixados com 8,5 mm de diâmetro foram
preenchidos apenas com coágulo, enquanto nos grupos experimentais os defeitos
foram preenchidos com os biomateriais HA-1 e HA-2 (Tabela 1). Os retalhos, a
seguir, foram reposicionados e suturados (Figura 2) com linha de seda preta n° 3-0
(Ethicon, Johnson & Johnson, São Paulo, SP, Brasil).
40
A
B
C
D
E
F
Figura 2 – Seqüência do procedimento cirúrgico dos animais experimentais. A)
Anestesia; B) Tricotomia; C) Incisão; D) Perfuração para remoção da cortical; E)
Colocação do biomaterial; F) Sutura (CONZ, 2006).
41
4.2.3 Obtenção das biópsias e preparo histotécnico
Os animais (n=5/período) foram sacrificados ao término dos períodos de 1, 3
e 6 meses após as cirurgias por dose excessiva de anestésico hidrato de cloral 10%.
Em seguida foram coletadas as calotas cranianas com a pele sobreposta com
auxílio de uma serra elétrica que posteriormente foram submetidas ao processo de
fixação em formol 10% tamponado1 durante uma semana.
4.2.4 Procedimento histotécnico
Em seguida, procedeu-se a desmineralização das peças em solução de
EDTA pH 7,2 (solução contendo 4,13% de Titriplex III Merck® e 0,44% de hidróxido
de sódio) a temperatura ambiente, por um período aproximado de cento e vinte dias
com trocas semanais da solução desmineralizadora. As peças foram submetidas ao
procedimento histotécnico padrão do laboratório de Histologia da UFF/RJ. Cortes
semi-seriados de 5µm de espessura, no sentido laterolateral da região mais central
do defeito ósseo (micrótomo Jung-Leica RM2045) e foram corados pela técnica da
Hematoxilina-Eosina - H/E (LUNA, 1968).
1 = Formol 10% Tamponado
Formaldeído 40%
Tampão Fosfato de Sódio*, pH 7,0
*
Tampão fosfato de sódio:
Monofosfato de sódio hidratado (NaH2PO4.H2O)
Difosfato de sódio hidratado (NaHPO4.12H2O)
Água destilada q.s.p.
10 ml
90 ml
4,02g
16,37g
1000ml
42
4.2.5 Análise histomorfométrica
A histomorfometria foi realizada com a finalidade de se medir a fração da área
de osso neoformado (i.e. a densidade volume de osso neoformado) no interior do
defeito da calvária. Foram capturadas imagens, em campos isolados, da secção
realizada no sentido latero-lateral da parte central do defeito crítico de cada animal
utilizando um microscópio ótico (Jenaval - Zeiss), com uma objetiva de 12,5 x (N.A
0,55). A intensidade da fonte de luz foi corrigida com um filtro (daylight) 80ª/Kodak.
As imagens foram digitalizadas com uma câmera fotográfica digital Sony cyber-shot
(P-83) operando em modo manual, com o tamanho de 1280 x 960 pixels. O aumento
final foi aferido utilizando uma lâmina milimetrada com espaçamento mínimo de 10
µm. Em cada corte foram capturados e analisados todos os campos possíveis, de
um lado ao outro do defeito, sem sobreposições das imagens (figura 3 A e B).
A
*
*
*
B
C
P
P
C
I
I
Figura 3 - (A) Secção histológica de um animal com 1X de aumento, onde se pode
visualizar de uma borda (*) a outra do defeito no sentido latero-lateral. (B) Mesma
secção com as regiões periférica (P), intermediária (I) e central (C) demarcadas.
43
O número de campos analisados variou de 4 a 6, por secção. Das 45
secções, 14 apresentaram 6 campos de análise (A, B, C, D, E e F), 24 apresentaram
5 campos (A, B, C, D e E) e 7 secções apresentaram 4 campos (A, B, C e D).
Para a avaliação do osso neoformado dos grupos experimentais foram
determinados para cada secção, uma região periférica (P), intermediária (I) e central
(C). A região periférica correspondeu aos campos situados na parte mais externa
das secções, próximos a borda do defeito. A região central foi formada pelos
campos situados no centro do defeito e, a região intermediária aos campos situados
entre a região periférica e a central.
Nas 14 secções que apresentaram 6 campos, a região periférica foi formada
pelos campos A e F, a região intermediária pelos campos B e E, e a região central
pelos campos C e D (Figura 4).
Nas 24 secções que apresentaram 5 campos, a região periférica foi formada
pelos campos A e E, a região intermediária pelos campos B e D, e a região central
pelo campo C (figura 5).
Nas 7 secções que apresentaram 4 campos, a região periférica foi formada
pelos campos A e D, e as regiões intermediária e central foram formadas pelos
campos B e C (Figura 6).
osso antigo
(borda do defeito)
Interior do defeito
Central
A
B
C
D
E
F
Intermediária
Periférica
Figura 4 – Representação das imagens capturadas pelo microscópio da secção
histológica com 6 campos para a análise. Observar a região periférica (A e F);
intermediária (B e E) e a central (C e D).
44
osso antigo
(borda do defeito)
Interior do defeito
Central
A
B
C
D
E
Intermediária
Periférica
Figura 5 – Representação das imagens capturadas pelo microscópio da secção
histológica com 5 campos para a análise. Observar a região periférica (A e E);
intermediária (B e D) e a central (C).
osso antigo
(borda do defeito)
interior do defeito
Intermediária = Central
A
B
C
D
Periférica
Figura 6 – Representação das imagens capturadas pelo microscópio da secção
histológica com 4 campos para a análise. Observar a região periférica (A e D);
intermediária e central (B e C).
As imagens obtidas foram editadas no programa Adobe Photosop 7.0, para a
coloração do tecido ósseo neoformado, biomaterial e tecido conjuntivo fibroso
(Figura 7 A e B). A histomorfometria foi realizada utilizando o programa Image Pro
Plus (Media cybernetics, L. P., Silver Spring, MD) e o tecido ósseo neoformado
45
presente foi caracterizado pela medida da área corada em cada campo de análise
(Figura 8). A densidade de volume de osso neoformado encontrado nos campos das
regiões periféricas, intermediárias e centrais de cada secção foi somado e a média
de cada região calculada.
A
B
100 µm
100µm
Figuras 7 - (A)-Imagem original de um campo com 12,5 X de aumento obtida do
corte histológico do grupo experimental. (B)-Imagem segmentada do corte
histológico (vermelho= hidroxiapatita, verde= osso neoformado e azul= tecido
conjuntivo) (CONZ, 2006).
46
Figura 8 - Programa Image Pro Plus (Media Cybernetics, L. P., Silver Spring, MD)
utilizado para determinar a densidade de volume de osso neoformado (CONZ,
2006).
4.2.6 Análise Estatística
A análise estatística dos escores foi realizada por meio de teste de
comparação de médias. Como os dados obtidos dos cortes histológicos nos grupos
testados, não apresentaram os requisitos de normalidade, esses foram analisados
estatisticamente pelos testes de Kuskal-Wallis (KW) com nível de significância de
5% (α=0,05). Quando a probabilidade (p) associada a cada teste foi menor do que o
nível de significância (p < 0,05) aplicou-se como complementação o teste de
comparações múltiplas Student-Newman-Keuls (SNK) entre os grupos.
47
5 RESULTADOS
A densidade de volume de osso neoformado das regiões periférica,
intermediária e central de cada animal dos três grupos experimentais para os
períodos de 1, 3 e 6 meses após a cirurgia podem ser visualizados nos apêndices A
e B.
5.1 Comparação das regiões entre os grupos
O gráfico 1 resume os resultados obtidos quanto a densidade de volume de
osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central dos grupos HA-1,
HA-2 e coágulo com 1 mês após a cirurgia.
Grupos Experimentais
Percentual Médio de Osso Neoformado
100
Coágulo
90
1 MÊS
HA-1
80
HA-2
70
60
50
40
30
20
10
0
P e rif e ria
Int e rm e diá ria
C e nt ra l
Gráfico 1 – Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões dos grupos coágulo, HA-1 e HA-2 com 1 mês após a cirurgia.
Foi possível constatar que com 1 mês após a cirurgia os três grupos
analisados apresentavam na periferia do defeito densidade de volume de osso
neoformado acima dos 30%, sem diferenças estatisticamente significante entre eles
(p=0,264). Na região intermediária do defeito, o grupo coágulo exibiu uma densidade
48
de volume de osso neoformado em torno de 8% e os grupos HA-1 e HA-2, 4% e
13%, respectivamente. No entanto não houve diferença estatisticamente significante
entre os grupos (p=0,213). Na região central, não foi verificado neoformação óssea
no grupo coágulo. Os grupos HA-1 e HA-2 apresentaram, respectivamente, 4,18% e
11,63% de osso neoformado nesta região, porém a análise estatística não revelou
diferença entre os três grupos nesta região do defeito (p=0,161).
O gráfico 2 resume os resultados obtidos quanto a densidade de volume de
osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central dos grupos HA-1,
HA-2 e coágulo com 3 meses após a cirurgia.
Percentual Médio de Osso Neoformado
100
Grupos Experimentais
90
Coágulo
3 MESES
HA-1
80
HA-2
70
60
50
40
30
20
10
0
P e rif e ria
Int e rm e diá ria
C e nt ra l
Gráfico 2– Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões dos grupos coágulo, HA-1 e HA-2 com 3 meses após a
cirurgia.
Nota-se, que com 3 meses após a cirurgia o grupo coágulo apresentava na
região periférica 40,56% de osso neoformado e os grupos HA-1 e HA-2, 44,16% e
39,42%, respectivamente, sem diferenças estatisticamente significante entre eles
(p=0,932). Na região intermediária do defeito, o grupo coágulo exibiu uma densidade
de volume de osso neoformado em torno de 2% e os grupos HA-1 e HA-2, 17% e
14%, respectivamente. No entanto não houve diferença estatisticamente significante
entre os grupos (p=0,314). Na região central, o grupo coágulo apresentou 2,01% de
49
osso neoformado, enquanto os grupos HA-1 e HA-2 apresentaram, respectivamente,
15,96% e 5,78%. A análise estatística não revelou diferença entre os três grupos
nesta região do defeito (p=0,609).
O gráfico 3 resume os resultados obtidos quanto a densidade de volume de
osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central dos grupos HA-1,
HA-2 e coágulo com 6 meses após a cirurgia.
Percentual Médio de Osso Neoformado
100
Grupos Experimentais
90
Coágulo
6 MESES
HA-1
80
HA-2
70
60
50
40
30
20
10
0
P e rif e ria
Int e rm e diá ria
C e nt ra l
Gráfico 3 – Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões dos grupos coágulo, HA-1 e HA-2 com 6 meses após a
cirurgia.
Foi possível observar que com 6 meses após a cirurgia o grupo coágulo
apresentava na região periférica 53,3% de osso neoformado e os grupos HA-1 e HA2, 43,5% e 53,3%, respectivamente, sem diferenças estatisticamente significante
entre eles (p=0,468). Na região intermediária do defeito, o grupo coágulo exibiu uma
densidade de volume de osso neoformado em torno de 23% e os grupos HA-1 e HA2, 12% e 19%, respectivamente. No entanto não houve diferença estatisticamente
significante entre os grupos (p=0,249). Na região central, o grupo coágulo
apresentou 10,09% de osso neoformado, enquanto os grupos HA-1 e HA-2
apresentaram, respectivamente, 4,45% e 16,78%. A análise estatística não revelou
diferença entre os três grupos nesta região do defeito (p=0,765).
50
5.2 Análise das regiões de cada grupo
O gráfico 4 resume os resultados obtidos quanto a densidade de volume de
osso neoformado nas regiões periférica, intermediária e central de cada grupo (HA1, HA-2 e coágulo) com 1 mês após a cirurgia.
Regiões do Defeito
100
Percentual Médio de Osso Neoformado
90
Periferia
1 MÊS
Intermediária
80
Central
70
60
50
40
30
20
10
0
C O Á G ULO
H A -1
H A -2
Gráfico 4 – Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões de cada grupo com 1 mês após a cirurgia.
Foi possível constatar que com 1 mês após a cirurgia no grupo coágulo a
densidade de volume de tecido ósseo neoformado na periferia do defeito foi pelo
menos cinco vezes maior do que na região intermediária (p=0,008). Na região
central não se observou formação óssea, no entanto, não houve diferença
estatisticamente significante entre esta e a região intermediária que apresentou
valores em torno de 8% de tecido ósseo neoformado (SNK: P>I=C). A densidade de
volume de tecido ósseo neoformado na região periférica no grupo experimental HA-1
foi pelo menos seis vezes maior do que nas regiões intermediária e central (p=
0,009). Entre as regiões intermediária e central não foi observada diferença
estatisticamente significante (SNK: P>I=C). No grupo HA-2, a região periférica
apresentou uma densidade de volume de osso neoformado em torno de 37%, a
51
região intermediária e a central, 13% e 12%, respectivamente. No entanto, não foi
observado diferença estatisticamente significativa entre estas regiões (p=0,08).
O gráfico 5 resume os resultados obtidos quanto ao percentual médio de
tecido ósseo neoformado nas regiões periférica, intermediária e central de cada
grupo (HA-1, HA-2 e coágulo) com 3 meses após a cirurgia.
Regiões do Defeito
Percentual Médio de Osso Neoformado
100
Periferia
3 MESES
90
Intermediária
80
Central
70
60
50
40
30
20
10
0
C O Á G ULO
H A -1
H A -2
Gráfico 5 - Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões de cada grupo com 3 meses após a cirurgia.
Foi observado que com três meses após a cirurgia, no grupo coágulo, a
região periférica apresentou uma densidade de volume de tecido ósseo neoformado
superior às demais regiões (p=0,004). Apesar de se observar uma pequena
quantidade de osso neoformado na região central, não se verificou diferença
estatística entre esta e a região intermediária (SNK: P>I=C). Com relação a HA-1, a
região periférica exibiu 44% de osso neoformado, e foi possível notar um
significativo aumento na densidade de volume de tecido neoformado tanto na região
intermediária (17%) quanto na região central do defeito (16%). No entanto, não
existiu diferença estatisticamente significante entre as três regiões (p=0,164). Já no
grupo experimental HA-2 observou-se que na periferia do defeito, a densidade de
52
volume de osso neoformado foi estatisticamente superior àqueles encontrados nas
regiões intermediária e central (p=0,03; SNK: P>I=C).
O gráfico 6 resume os resultados obtidos quanto a densidade de volume de
tecido ósseo neoformado nas regiões periférica, intermediária e central de cada
grupo (HA-1, HA-2 e coágulo) com 6 meses após a cirurgia.
Regiões do Defeito
Percentual Médio de Osso Neoformado
100
6 MESES
90
Periferia
Intermediária
80
Central
70
60
50
40
30
20
10
0
C O Á GULO
H A -1
H A -2
Gráfico 6 - Densidade de volume de tecido ósseo neoformado nas
regiões de cada grupo com 6 meses após a cirurgia.
Nota-se, ao se examinar o grupo coágulo com 6 meses após a cirurgia, que
apenas neste período do estudo foi possível verificar uma densidade de volume de
osso neoformado na região intermediária do defeito superior a região central,
estatisticamente significativa. A região periférica continuou apresentando valores
mais elevados que as demais (p=0,019; SNK: P>I>C). No grupo experimental HA-1,
a região periférica apresentou uma densidade de volume de tecido ósseo
neoformado pelo menos três vezes maior do que a região intermediária e nove
vezes maior do que a região central (p=0,012). Entre as regiões intermediária e
central não houve diferença estatisticamente significante (SNK: P>I=C). No grupo
53
HA-2, não foi observado diferença estatisticamente significativa entre as regiões
periférica, intermediária e central (p=0,105).
54
6 DISCUSSÃO
O controle na fabricação dos biomateriais osteocondutores tem uma grande
importância para o desenvolvimento de materiais para enxertos ósseos. As
características físico-químicas dos biomateriais como: composição química,
granulometria, cristalinidade, arquitetura dos poros e área de superfície estão
diretamente relacionadas com o seu comportamento “in vivo” (ARTZI et al., 2004,
MASTROGIACOMO et al., 2005, THORWARTH et al., 2005, YUNOKI et al., 2006,
BALASUNDARAM et al., 2006).
A otimização dos biomateriais objetiva facilitar o crescimento celular e tecidual
e pode envolver alterações na micro e macroarquitetura. As alterações na
microarquitetura estão relacionadas à microporosidade e a cristalinidade, enquanto
que as alterações na macroarquitetura dizem respeito ao tamanho e a
interconectividade dos poros (ROSE et al., 2004).
As características fisico-químicas dos grânulos de hidroxiapatita HA-1
produzidos no presente trabalho teve como referência o enxerto ósseo bovino
inorgânico particulado Bio-oss® (Osteohealth Co.). O Bio-oss® apresenta uma vasta
literatura científica sendo considerado um eficiente biomaterial de enxerto ósseo
(TADIC & EPPLE, 2004; CONZ et al., 2005). Os grânulos de hidroxiapatita da HA-2
apresentavam uma razão molar Ca/P de 1,67 e cristalinidade de aproximadamente
70%, enquanto que os grânulos da HA-1 apresentavam uma razão molar Ca/P de
1,60 e cristalinidade de aproximadamente 28% .
Os biomateriais com estruturas altamente cristalinas são quimicamente mais
estáveis e geram uma diminuição da adsorção de proteínas, interferindo na adesão
celular “in vitro” (YANG et al., 2005). Por outro lado, os materiais com menor
cristalinidade e não sinterizados são mais susceptíveis à dissolução em outras fases
cristalinas (AOKI, 1994; ARTZI et al., 2004).
Os princípios básicos para a regeneração óssea guiada são: exclusão dos
tecidos e células indesejáveis ao reparo do defeito, criação e manutenção do
espaço, proteção do coágulo sangüíneo e estabilização da membrana sobre o
defeito ósseo (LINDHE et al., 2005), além do suprimento sangüíneo adequado.
Neste estudo não foram utilizadas membranas como barreira física, portanto,
a proliferação de outros tipos celulares como células do tecido conjuntivo e epitelial
para o interior do defeito, provavelmente contribuiu para uma diminuição da
55
diferenciação das
células
mesenquimais indiferenciadas
(osteoprogenitoras),
essenciais para a regeneração óssea dos tecidos lesionados. Apenas o uso da
membrana pode ser suficiente para o fechamento completo ou parcial do defeito
crítico em crânio de ratos (DUPOIRIEUX et al. 2001).
Queiroz et al. (2006) avaliaram histologicamente o comportamento do enxerto
ósseo de origem bovina (Biograft®) recoberto por uma membrana óssea (Bioplate®)
no reparo de defeitos de 6 mm de diâmetro em calvárias de coelhos. Os autores
concluíram que após 60 dias a membrana serviu como barreira, impedindo a
migração de células do tecido conjuntivo adjacente, e o enxerto ósseo promoveu
uma osteocondução para o reparo do defeito.
As vantagens da utilização de barreiras nas técnicas de regeneração guiada
estão amplamente documentadas na literatura e indicam uma facilitação na
neoformação óssea bem como a reabsorção do biomaterial de enxerto (DAHLIN et
al., 1988; DAHLIN et al., 1989; DAHLIN et al., 1990; TARNOW et al., 2000;
WIKESJO et al., 2003). No entanto, em um estudo comparativo em cães, o uso
adicional de uma membrana em defeitos ósseos criados na mandíbula com 5 mm de
diâmetro e 4 mm de profundidade enxertados com osso bovino mineral, não resultou
em um benefício quando comparado aos defeitos preenchidos com o mesmo
material sem a utilização da barreira após 24 meses (ARTZI et al., 2003).
É de suma importância estudar e entender o microambiente do leito receptor
a fim de se obter uma integração efetiva do enxerto (GRONTHOS et al., 2008).
A importância dos modelos de defeito crítico se deve ao fato de não ocorrer
regeneração completa do mesmo na presença de coágulo, mas sim cicatrização de
grande parte por um tecido conjuntivo fibroso. Nesses modelos a eficácia dos
biomateriais é avaliada em função, primeiramente, da capacidade de induzir ou
promover maior quantidade de tecido ósseo em relação ao grupo controle com
coágulo. Sem o preenchimento, o defeito será ocupado com um tecido conjuntivo
fibroso preferivelmente do que com o tecido ósseo (FRAME, 1980). A limitada
capacidade regenerativa de um defeito na calvária pode ser devido ao pobre
suprimento sanguíneo e a uma relativa deficiência no osso medular (PROLO et al.,
1982).
Embora exista um grande progresso no uso dos biomateriais para enxertos
ósseos, os caminhos nos quais eles executam suas funções in vivo são diferentes
(MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2005).
56
Estudos em animais e em humanos frequentemente realizam uma avaliação
quantitativa da densidade de volume de tecido ósseo neoformado, tecido conjuntivo
e do biomaterial remanescente, através da análise histomorfométrica (VALENTINI et
al., 2000; YILDIRIN et al., 2000; NORTON et al., 2003; JOHN & WENZ, 2004; ARTZI
et al., 2004; CONZ, 2006; CORDARO et al., 2008). No entanto, estes estudos
avaliam o defeito ósseo como um todo, quantificando a média da área total do
defeito, sem individualizar as regiões periféricas, ou seja, aquelas próximas ao osso
residual, as regiões intermediárias e aquelas mais centrais. Esta avaliação
generalizada pode não representar a dinâmica da neoformação óssea no interior de
um defeito, pois é provável que existam diferenças entre as regiões.
Ao se examinar os resultados referentes a densidade de volume de osso
neoformado obtidos por Conz (2006), observa-se que aos 6 meses após a cirurgia
no grupo enxertado com a HA-1 e a HA-2 a densidade de volume de osso
neoformado na área total do defeito foi de 27,25% e 32,02%, respectivamente. A
comparação destes grupos com um grupo controle (coágulo), não revelou diferença
estatisticamente significativa.
No presente trabalho, ao dividirmos o defeito em
regiões, percebe-se que aos 6 meses após a cirurgia no grupo experimental HA-1 a
região periférica obteve 43,5% de osso neoformado, a região intermediária 11,99% e
a central 4,45%. No grupo enxertado com a HA-2 a região periférica apresentou
53,3%, a intermediária 19,23% e a central 16,78% de osso neoformado. No entanto,
a comparação da densidade de volume de osso neoformado nas regiões periférica,
intermediária e central entre os grupos não apresentou diferença estatisticamente
significante conforme a análise realizada por Conz (2006).
Ao analisarmos a dinâmica da neoformação óssea nos grupos isoladamente,
no grupo coágulo, a região periférica apresentou uma densidade de volume de
tecido ósseo neoformado maior do que nas regiões intermediária e central nos 3
períodos analisados, sendo este resultado estatisticamente significante. A
proximidade da região periférica a borda do defeito ósseo, local onde existe grande
vascularização, portanto, disponibilidade de células mesenquimais indiferenciadas
para migrarem e se diferenciarem em osteoblastos, favorece e justifica uma maior
quantidade de tecido ósseo na periferia ao longo dos seis meses de estudo. A não
utilização de um biomaterial que funcionasse como uma matriz para a angiogênese
e migração de células osteoprogenitoras, contribuiu para uma limitada neoformação
óssea nas regiões intermediárias e centrais, já que estas regiões se encontram mais
57
distantes da borda do defeito, ou seja, do osso nativo do animal. Isto é
especificamente importante, pois a quantidade de osso neoformado e enxerto
remanescente são dependentes da distância da área enxertada ao osso residual
(ARTZI et al., 2005).
Dumas et al. (2009) observaram em um estudo experimental em defeitos
críticos na calvária de ratos que com 8 semanas após a cirurgia, no grupo enxertado
apenas com um biomaterial xenógeno, o crescimento ósseo se limitou à periferia do
defeito, enquanto que a região central havia sido preenchida por um tecido
conjuntivo fibrovascular.
Um estudo em humanos analisou seios maxilares enxertados bilateralmente,
um lado com uma hidroxiapatita bovina (Bio-Oss®) e o outro com uma hidroxiapatita
sintética bifásica (Straumann® Bone Ceramic). Após um mínimo de 180 dias,
biópsias foram realizadas verticalmente, ou seja, do rebordo maxilar residual para o
seio maxilar e em ambos os lados foi demonstrado uma maior quantidade de osso
neoformado nas proximidades da crista residual quando comparado às outras
regiões da biópsia (CORDARO et al., 2008). Estes resultados contrastam com as
observações de um outro estudo de metodologia similar encontrado na literatura,
onde biópsias foram realizadas em uma direção horizontal, de bucal para palatina na
região da janela óssea lateral (ARTZI et al., 2005).
Aos 6 meses após a cirurgia, no grupo coágulo, foi possível observar uma
maior densidade de volume de osso neoformado na região periférica (53%), seguido
da região intermediária (23%) e central (10%), respectivamente. A ausência de um
biomaterial osteocondutor neste grupo provavelmente contribuiu para que a
densidade de volume de osso neoformado na região intermediária fosse maior do
que na região central do defeito.
O reparo de um defeito de tamanho crítico com 8mm de diâmetro na calvária
de ratos, com 6 meses de idade, reduz para 5mm em 4 semanas e após esse
período não ocorre alteração no defeito, enquanto que seu centro cicatriza pela
formação de tecido conjuntivo fibroso (URIST 1984).
O grupo experimental HA-1 (baixa cristalinidade) apresentou uma densidade
de volume de tecido ósseo neoformado na região periférica maior (p=0,009) do que
nas regiões intermediária e central, com 1 e 6 meses após a cirurgia. A HA-1
apresentou uma densidade de volume de osso neoformado equivalente nas regiões
periférica, intermediária e central com 3 meses após a cirurgia, não existindo
58
diferenças estatisticamente significativas. Este resultado demonstrou a capacidade
osteocondutora da HA-1, que aos três meses foi capaz de conduzir células e vasos
sanguíneos para as regiões intermediária e central, permitindo a cicatrização e
maturação do enxerto, sendo percebido uma satisfatória neoformação óssea nestas
regiões mais distantes da borda do defeito. Aos seis meses após a cirurgia ocorreu
uma estabilização na densidade de volume de osso neoformado nas regiões
intermediárias e centrais provavelmente pelo fato desta hidroxiapatita apresentar
baixa cristalinidade e consequentemente maior padrão reabsortivo. No entanto, a
região periférica, que está situada próxima ao osso nativo e, portanto, menos
dependente de um biomaterial osteocondutor, demonstrou maior neoformação
óssea (p=0,012).
O grupo experimental HA-2 (alta cristalinidade) apresentou uma quantidade
de tecido ósseo neoformado na região periférica maior (p=0,004) do que nas demais
regiões, com 3 meses após a cirurgia. A HA-2 apresentou densidade de volume de
osso neoformado equivalente nas regiões periférica, intermediária e central no 1° e
6° mês após a cirurgia, sem diferença estatisticamente significante.
Este resultado aos 6 meses após o enxerto, ratificou o potencial
osteocondutor deste grupo, porém, a necessidade um maior tempo para que o
processo ocorresse foi de certo modo compreensível, pelo fato, deste biomaterial
possuir uma alta cristalinidade, portanto, mais lenta degradação, menor bioatividade
e neoformação óssea.
Ao se analisar os resultados com 1 mês após a cirurgia, não foi observado
diferença estatisticamente significativa na densidade de volume de osso neoformado
entre as regiões periférica, intermediária e central. Isto pode ser atribuído ao fato de
neste grupo existir um elevado desvio padrão (Sd), uma vez que um dos animais do
grupo HA-2 apresentou substancial neoformação óssea nas três regiões.
Estudos “in vivo” e clínicos geralmente apresentam elevados desvios padrões
(HAMMERLE et al., 1998; VALENTINI et al., 2000; MEIJNDERT et al., 2005).
HAMMERLE et al. (1998), avaliaram o efeito do Bio-oss® associados a
procedimentos regenerativos em macacos e apresentaram resultados com um
desvio padrão variando de 9% até 41%. Essa variabilidade de resultados é inerente
às variações da resposta biológica de cada indivíduo. Considerando que os fatores
genéticos podem contribuir para a eficácia e a segurança de um medicamento, a
Farmacogenética vem sendo fomentada recentemente. Farmacogenética é a ciência
59
que estuda a variabilidade genética dos indivíduos com relação as drogas
específicas. Determinados indivíduos podem reagir diferentemente ao mesmo tipo
de medicamento. Embora a individualização terapêutica permaneça como um
desafio para o futuro, a farmacogenética poderá ser uma ferramenta útil no
desenvolvimento
de
novos
medicamentos
pelas
indústrias
farmacêuticas
(METZGER et al., 2006).
A reação do indivíduo na resposta aos biomateriais é um problema clínico
substancial e sofre influência do ambiente próprio de cada um. Assim, desconsiderar
as variações que se destacam durante a análise da resposta biológica aos
biomateriais pode resultar na eliminação de sinais potencialmente valiosos para o
entendimento dos processos.
60
7 CONCLUSÕES
-
Ao compararmos as regiões periféricas, intermediárias e centrais dos grupos
HA-1, HA-2 e coágulo, não existiram diferenças estatisticamente significante na
densidade de volume de osso neoformado nos períodos analisados.
- Houve diferença na dinâmica da neoformação óssea nos grupos analisados
isoladamente.
O grupo HA-1 apresentou uma densidade de volume de osso neoformado
equivalente nas três regiões aos 3 meses após a cirurgia.
O grupo HA-2 apresentou uma densidade de volume de osso neoformado
equivalente nas três regiões em 1 e aos 6 meses após a cirurgia.
O grupo coágulo apresentou um aumento da densidade de volume de osso
neoformado na região intermediária aos 6 meses após a cirurgia.
61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Accorsi-Mendonça T, Conz MB, Barros TC, Sena LA, Soares GA, Granjeiro JM.
Physicochemical characterization of two deproteinized bovine xenografts. Braz
Oral Res, 2008; 22(1): 5-10.
American Academy of Periodontology. Position Paper. Tissue banking of bone
allograft used in periodontal regeneration. J Periodontol, 2001; 72(6): 834-8.
Anselme K. Osteoblast adhesion on biomaterials. Biomaterials, 2000;21:667-681.
Aoki H. Medical application of hydoxyapatite. 1a edição, Tokyo, Ishiyaku, Euro
Americana, 1994.
Artzi Z, Givol N, Rohrer MD et al. Qualitative and quantitative expression of
bovine bone mineral in experimental bone defects. Part 2: Morphometric Analysis.
J Periodontol, 2003;74:1153-60.
Artzi Z, Weinreb M, Givol N et al. Biomaterial resorption rate and healing site
morphology of inorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate in the
canine: a 24-month longitudinal histologic study and morphometric analysis. Int J
Oral maxillofac Implants, 2004; 19(3):357-68.
Artzi Z, Kozlovsky A, Nemcovsky CE et al. The amount of newly formed bone in
sinus grafting procedures depends on tissue depth as well as the type and
residual amount of the grafted material. J Clin Periodontol, 2005; 32(2):193-9.
Artzi Z, Weinreb M, Carmeli G, Lev-Dor R, Dard M, Nemcovsky CE.
Histomorphometric assessment of bone formation in sinus augmentation utilizing
a combination of autogenous and hydroxyapatite/biphasic tricalcium phosphate
graft materials: at 6 and 9 months in humans. Clin. Oral Impl. Res, 2008;19:686692.
Balasundaram G, Sato M, Webster T J. Using hydroxyapatite nanoparticles and
decreased crystallinity to promote osteoblast adhesion similar to functionalizing
with RGD, Biomaterials, 2006;27:2798-2805.
Bauer T & Muschler GF. Bone Graft Materials. In: Clinical Orthopedics and
Related Research, 2000; 371: 10-27.
62
Benke D, Olha AE, Molher H. Protein-chemical analysis of bio-oss bone
substitute and evidence on its carbonated content. Biomaterials, 2001;22:100512.
Berglundh T, Lindhe J. Healing around implants placed in bone defects treated
with bio-oss®. An experimental study in the dog. Clin Oral Impl Res, 1997; 8:117124.
Blank BS & Levy AR. Combinated treatment of a large periodontal defect using
GTR and DFDBA. Int. J. Period. Res. Dent, 1999;19(5):481-7.
Boëck-Neto RJ, Gabrielli MFR, Lia RCC, Marcantonio E, Shibli JA, MarcantonioJúnior E. Histomorphometrical analysis of bone formed after maxillary sinus floor
augmentation by grafting with a combination of autogenous bone and
demineralized freeze-dried bone allograft or hydroxyapatite. J Periodontol,
2002;73:266-270.
Braz F, Rahal S, Rocha N et al. Emprego de matriz óssea orgânica bovina e
hidroxiapatita no reparo de defeito induzido em crânio de ratos. Act Cir. Bras,
2003;18;1-13.
Buck BE, Malinin TH. Human bone and tissue allograft. Clin Orthop, 1994; 303:
8-17.
Burchardt H. The Biology o Bone Graft Repair. Clin Orthop, 1983; 174: 28-42.
Burg KJL, Porter S, Kellam JF. Biomaterial development for bone tissue
engineering. Biomaterials, 2000;21:2347-2359.
Carvalho PSP, Bassi APF, Violin LA. Revisão e proposta de nomenclatura para
os biomateriais. Implantnews, 2004; 1(3): 255-259.
Chiapasco M, Romeo E. Cirurgia pré-implante nas atrofias dos maxilares.in:
Reabilitação oral com prótese implantossuportada para casos complexos. São
Paulo: Ed Santos, 2007;3:131-62
Conz MB, Granjero JM, Soares GA. Phisicochemical characterization of six
commercial hidroxiapatyte for medical-dental applications as bone graft. J Appl
oral Sci, 2005; 13(2): 136-40.
63
Conz MB. Análise histomorfométrica do reparo de defeito crítico na calvária de
ratos tratados com grânulos de hidroxiapatita com diferentes características
físico-químicas. [Tese de Doutorado]. Rio de Janeiro: Universidade Federal do
Rio de Janeiro; 2006.
Cordaro L, Bosshardt DD, Rao W, Serino G, Chiapasco M. Maxillary sinus
grafting with Bio-oss® or Straumann® Bone Ceramic: histomorphometric results
from a randomized controlled multicenter clinical trial. Clin Oral Impl Res,
2008;19:796-803.
Dalapícula SS, Vidigal Júnior GM, Conz MB et al. Características físico-químicas
dos biomateriais utilizados em enxertias ósseas. Uma revisão crítica.
Implantnews, 2006;3(5):487-91.
Dahlin C, Linde A, Gottlow J, Nyman S. Healing of bone defects by guided tissue
regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery, 1988;81:672–676.
Dahlin C, Sennerby L, Lekholm U, Linde A, Nyman S. Generation of new bone
around titanium implants using a membrane technique: an experimental study in
rabbits. The International Journal of Oral and Maxillofacial Implants, 1989;4:19–
25.
Dahlin C, Gottlow J, Linde A, Nyman S. Healing of maxillary and mandibular bone
defects using a membrane technique. An experimental study in monkeys.
Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery and Hand Surgery.
1990; 24:13–19.
Ducheyne P, Qiu Q. Bioactive ceramics: the effect of surface reactivity on bone
formation and bone cell function. Biomaterials, 1999; 20:2287-2303.
Dumas A, Moreau MF, Ghérardi RK, Baslé MF, Chappard D. Bone marrow
stromal cells for the repair of critical bone defects. J Biomed Mater Res 90A:
1218–1229, 2009.
Dupoirieux L, Pourquier D, Picot M, Neves M. Comparative study of three
different membranes for guided bone regeneration of rat cranial defects. Int. J.
oral maxillofacial surg, 2001;30:58-62.
Fleckenstein KB, Cuenin MF, Peacock ME, Billman MA, Swiec GD, Buxton TB,
Singh BB, McPherson JC. Effect of a hydroxyapatite tricalcium phosphate
alloplast on osseous repair in the rat calvarium. J Periodontol 2006; 77: 39-45.
64
Frame JW. A convenient animal model for testing bone substitute materials. J
Oral Surg 1980;38:176-80.
Fugazzotto PA, Vlassis J. Long-term success of sinus augmentation using
various surgical approaches and grafting materials. Int J Oral Maxillofac Implants
1998;13:52-58.
Garg AK. Grafting Materials in Repair and Restoration. In: Tissue EngineeringApplications in Maxillofacial Surgery and Periodontics. 1999;Cap.5; Quintessence
Books (Publishing).
Garofalo G S. Autogenous, allogenetic and xenogenetic grafts for maxillary sinus
elevation: literature review, current status and prospects. Minerva Stomatol,
2007; 56:373-392.
Gronthos S, Akintoye SO, Wang CY, Shi S. Células-tronco do estroma da
medulla óssea para a engenharia tecidual. Periodontologia 2000, 2008;15:18895.
Hallman M, Sennerby L, Lundgren S. A clinical and histologic evaluation of
implant integration in the posterior maxilla after sinus floor augmentation with
autogenous bone, bovine hidroxyapatite, or a 20:80 mixture. Int J Oral Maxillofac
Implants, 2002;17:635-643.
Hammerle CHF, Chiantella GC, Lang NP. The effect of deproteinized bovine
bone mineral on bone regeneration around titanium dental implants. Clin Oral
Impl Res, 1998;9:151-162.
Hernádez-Gil IF et al. Physiological bases of bone regeneration I. Histology and
physiology of bone tissue. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2006;11E:47-51.
Hornez JC, Chai F, Monchau F, Blanchemain N, Descamps M, Hildebrand HF.
Biological and physico-chemical assessment of hydroxyapatite (HA) with different
porosity. Biomol. Eng, 2007, 24:505-509.
Jensen SS, Broggini N, HjØrting-Hansen E et al. Bone healing and graft
resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A
histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clin Oral
Implants Res, 2006; 17(3): 237-43.
65
John HD & Wenz B. Histomorphometric analysis of natural mineral for maxillary
sinus augmentation. Int J Oral Maxillofac Implants, 2004;19:199-207.
Junqueira LC, Carneiro J. 2004, Histologia Básica, 10.ed. Rio de janeiro. Editora
Guanabara Koogan.
Karageorgiu V, Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.
Biomaterials, 2005;26;5474-5491
Katchburian E, Arana V. 2004, Histologia e Embriologia Oral, 2.ed. Rio de janeiro.
Editora Guanabara Koogan.
Landi E, Tampieri A, Celotti G, et al. Densification behavior and mechanisms of
synthetic hydroxyapatite. Journal of the European Ceramic Society,2000;20:23772387.
LeGeros RZ. Properties of Osteoconductive Biomaterials: Calcium Phosphates.
Clinical Orthopaedics and Related Research, 2002; 395:81–98.
Lindhe J, Karring T, Lang NP. Tratado de periodontia clínica e implantologia oral,
4. edição, São Paulo, Guanabara Koogan, 2005.
Liu DM. Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite granules.
Biomaterials, 1996;17:1955-1957.
Lynch SE, Genko R, Marx R. Grafiting materials in repair and restaurations.
Tissue engineering application in maxillofacial surgery and periodontics.
Quintessence, 1999;5:93-112.
Maiorana C, Beretta M, Salina S et al. Reduction of autogenous bone graft
resorption by means of Bio-Oss coverage: A prospective study. Int J Periodontics
Restorative Dent, 2005; 25: 19-25.
Marx RE & Saunders TS. Reconstruction and rehabilitation of cancer patients. In:
Reconstructive Oral and Maxillofacial Surgery. Philadelphia: WB Saunders
1986:347-428
66
Mastrogiacomo M, Scaglione S, Martinetti R, Dolcini L, et al. Role of scaffold
internal structure on in vivo bone formation in macroporous calcium phosphate
bioceramics. Biomaterials, 2006;27:3230-3237.
McAllister BS, Margolin MD, Cogan AG et al. Eighteen-month radiographic and
histologic evaluation of sinus grafting with anorganic bovine bone in the
chimpanzee. Int J Oral Maxillofac Implants, 1999; 14:36: 361-368.
Meijndert L, Raghoebar GM, Schüpbach P et al. Bone quality at the implant site
after reconstruction of a local defect of the maxillary anterior ridge with chin bone
or deproteinised cancellous bovine bone, Int. J. Oral Maxillofac. Surg,
2005;34:877-884.
Mellonig JT, Levey R. The effect of different sizes of freeze-dried bone allograft
on bone growth. J Dent Res 1984; 63: 222.
Metzger IF, Souza-Costa DC, Tanus-Santos JE. Farmacogenética: princípios,
aplicações e perspectivas. Medicina (Ribeirão Preto), 2006; 39 (4): 515-21.
Misch CE, Dietsh F. Bone-grafiting materials in implant dentistry. Implant.
Dent 1993; 2:158-167.
Misch CE. Biomateriais utilizados em implantes dentários. In : Misch CE, editor.
Implantes dentários contemporâneos. 2ª Ed. São Paulo: Ed. Santos; 2000: 271302.
Murugan R & Ramakrishna S. Development of nanocomposites for bone grafting.
Composites Science and Technology, 2005; 65:2385-2406.
Norton MR, Odell EW, Thompson ID, Cook R. Efficady of bovine bone mineral for
alveolar augmentation: a human histologic study. Clinical Oral Implant Research,
2003;14:775-783.
Novaes JR, et al. Recursos e soluções em implantes. In Periodontia/ Cirurgia/
Cirurgia para implantes. Artes médicas; 2000:447-66.
Ozyuvaci H, Bilgic B, Firatli E. Radiologic and histomorfometric evaluation of
maxilary sinus grafiting with alloplastic graft materials. J Periodontol, 2003; 74:
909-915.
67
Piattelli M, Favero GA, Scarano A, Orsini G, Piattelli A. Bone reactions to
anorganic bovine bone (Bio-oss) used in sinus augmentation procedures: A
histologic long-term report of 20 cases in humans. Int J Oral Maxillofac implants,
1999; 14:835-840.
Prolo DJ, Pedrotti PW, Burres KP, Oklund S. Superior osteogenesis in
transplanted allogenic canine skull following chemical sterilization. Clin Orthop,
1982;168:230-242.
Queiroz T, Hochuli-Vieira E, Gabrielli MAC, Cancian DCJ. Use of Bovine Bone
Graft and Bone Membrane in Defects Surgically Created in the Cranial Vault of
Rabbits. Histologic Comparative Analysis. Int J Oral Maxillofac Implants,
2006;21:29-35.
Robbins S, Cotran RS, Kumar V, Collins T. 2000, Patologia Estrutural e
Funcional, 6.ed. Rio de janeiro. Editora Guanabara Koogan.
Rodriguez-Lorenzo LM, Vallet-Regi M, Ferreira JMF. Fabrication of
hydroxyapatite bodies by uniaxial pressing from a precipitated power.
Biomaterials, 2001;22:583-588.
Rosa LA, Beloti MM, Noort RV. Osteoblastic differentiation of cultured rat bone
marrow cells on hydroxyapatite with different surface topography. Dent Mater
2003; 19:768-772.
Rose FR, Cyster LA, Grant DM, Scotchford CA, Howdle SM, Shakesheff KM.
Biomaterials, 2004; 25:5507-5514.
Sartori S, Sivestri M, Forni F, Cornaglia AI, Tesei P, Cattaneo V. Tem-year followup in a maxillary sinus augmentation using anorganic bovine bone (Bio-Oss). A
case report with histomorphometric evaluation. Clin. Oral Implant. Res,
2003;14:369-372.
Schmitz J & Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for
craniomandibulofacial nonunions. Clinical orthopaedics and related research,
1986; 205:299-308.
Schlegel KA, Fichtner G, Schultze-Mosgan S et al. Histologic findings in sinus
augmentation with autogenous bone chips versus a bovine bone substitute. Int J
Oral maxillofac Implants, 2003; 18:53-58.
68
Schliephake H, Gruber R, Dard M et al. Repair of calvarial defects in rats by
prefabricated hydroxyapatite cement implants. Journal of Biomedical Materials
Research, 2004; Part A, v. 69A, Issue 3, pp. 382-390.
Schliephake H, Neukam W, Klosa D. Influence of pore dimensions on bone
ingrowth into porous hydroxylapatite blocks used as bone graft substitutes. A
histometric study. Int. J. Oral Maxillofac. Surg, 1991; 20: 53-58.
Silva RV, Camilli JA, Bertran CA, Moreira NH. The use of hydroxyapatite and
autogenous cancellous bone grafts to repair bone defects in rats. J. Oral
Maxillofac. Surg, 2005;34:178-184.
Strong E & Moulthrop T. Calvarial bone graft harvest: a new technique.
Otolaryngology-head and neck surgery, 2000;November:547-552.
Su-Gwan K, Hak-Kyun K, Sung-Chul L. Combined implantation of particulate
dentine, plaster of Paris and a bone xenograft (bio-oss®) for bone regeneration in
rats. J Cranio-Maxillofac Surg, 2001; 29: 282-8
Tadic D, Epple M. A thorough physicochemical characterization of 14 calcium
phosphate-based bone substitution materials in comparison to natural bone.
Biomaterials, 2004;25:987-994.
Tampieri A, Celotti G, Sprio S, Delcogliano A, Franzese S. Porosity-graded
hydroxyapatite ceramics to replace natural bone. Biomaterials, 2001; 22:13651370.
Tarnow DP, Wallace SS, Froum SJ, Rohrer MD, Cho SC. Histologic and clinical
comparison of bilateral sinus floor elevations with and without barrier membrane
placement in 12 patients: part 3 of an ongoing prospective study. International
Journal of Periodontics and Restorative Dentistry, 2000;20:117–25.
Thaller SR. Repair of experimental calvarial defects with Bio-Oss particles and
collagen sponges in a rabbit model. J. Craniofac. Surg, 1994;5(4):242-246.
Thorwarth M, Schultze-Mosgau S, Kessler P, Scheleger KA. Bone regeneration in
osseous defects using a resorbable nanoparticular hydroxyapatite. J. Oral
Maxillofac Surg, 2005;63:1626-1633.
69
Toth JM, Lynch KL, Devine TR. Mechanical and Biological Characterization of
Calcium Phosphates for Use as Biomaterials. In: Encyclopedic Handbook of
Biomaterials Anal, 1995 v. I, part A, ed. Marcel, Dekka, N.Y., pp. 1465-1497.
Urist MR. New advances in bone research”. West.J. Med, 1984;14:71.
Urist MR. Bone: Formation by Autoinduction. Clin Orthop Relat Res, 2002;395: 410.
Valentini P, Abensur D, Wenz B, Peltz M, Schenk R. Sinus grafting with porous
bone mineral (Bio-Oss) for implant placement: A 5-year study on 15 patients. Int J
Periodontics Restaurative Dent, 2000;20:245-253.
Wikesjo UM, Lim WH, Thomson RC, Hardwick WR. Periodontal repair in dogs:
gingival tissue occlusion, a critical requirement for GTR? Journal of Clinical
Periodontology, 2003;30:655–64.
Willians DF. Definition in biomaterials. Amsterdam Elsevier. Progress in
biomedical engineering 1987;cap 4.
Yang Y, Dennison D, Ong JL. Protein Adsorption and Osteoblast Precursor Cell
Attachment to Hydroxyapatite of Different Crystallinities. Int J Oral Maxillofac
Implants, 2005; 20: 187-192.
Young C et al. A comparative study of anorganic xenogenic bone and autogenous
bone implants for bone regeneration in rabbits. Int. J. Oral Maxillofac. Implants,
1999;14(1):72-6.
Yildirim M, Spiekermann H, Biesterfeld S, Edelhoff D. Maxillary sinus
augmentation using xenogenic bone substitute material (Bio-Oss) in combination
with venous blood: a histologic and histomorphometric study in humans. Clin Oral
Implants Res, 2000;11:217-229.
Yunoki S, Ikoma T, Monkawa A, et al. Contol of pore structure and mechanical
property in hydroxyapatite/collagen composite using unidirectional ice growth.
Materials Letters, 2005;60:999-1002.
70
APÊNDICE A
71
APÊNDICE B