universidade federal de rondônia núcleo de saúde programa

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
NÚCLEO DE SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO E DOUTORADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
MARIA DO SOCORRO CALIXTO DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE
MICOBACTÉRIAS NÃO CAUSADORAS DE TUBERCULOSE (MNT) E
COMPARAÇÃO COM ISOLADOS AMBIENTAIS
PORTO VELHO
2015
COMPARAÇÃO COM ISOLADOS AMBIENTAIS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Biologia Experimental do Núcleo de Saúde da
Universidade Federal de Rondônia/UNIR, como
requisito para obtenção de título de Doutor em
Biologia Experimental.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura
Co-orientadores: Dr. Philip Noel Suffys
Drª. Cleoni Alves Mendes de Lima
PORTO VELHO
2015
NÚCLEO DE SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO E DOUTORADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
COMPARAÇÃO COM IS
OLADOS AMBIENTAIS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Biologia Experimental do Núcleo de Saúde
da Universidade Federal de Rondônia/UNIR, como requisito para obtenção de título de
Doutor em Biologia Experimental.
Aprovado em: 02 de Julho de 2015
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, pelo amor, carinho e estímulo,
dedico-lhes esta conquista como gratidão.
AGRADECIMENTOS
A Deus por andar sempre ao meu lado, por me encher de benções de dia e noite e por me
carregar no colo quando o fardo parece pesado demais.
À minha orientadora Profª. Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura, pela oportunidade,
confiança e paciência.
À Dra. Cleoni Alves Mendes de Lima, mais do que co-orientadora, uma amiga, sempre
presente, solícita e disposta a somar com seus conhecimentos. Obrigada pelo seu apoio
constante, carinho e orientação.
Ao meu co-orientador Dr. Philip Noel Suffys por suas importantes contribuições, parceria e
ensinamentos.
Aos meus irmãos, Valney, Vanuza, Vanúbia, Vanderley e Sônia Honora e à minha querida
sobrinha Ana Laura pelo amor e companherismo.
À minha família que mora no Ceará, em especial, minha avó Raimunda, obrigada por me
incentivarem nesta caminhada.
À minha família espiritual Igreja Batista Novo Éden, na pessoa do Pastor Luiz, agradeço a
todos pelas orações.
Ao meu namorado Juscelino, obrigada pelo carinho e incentivo ao longo destes anos.
Aos meus amigos Denise, Najla, Jefferson, Vulmar, Lene, Angela pelo apoio e incentivo. .
Ao Laboratório Central de Rondônia - LACEN na pessoa do Diretor Luiz A. A. Tagliani por
permitir que a pesquisa fosse realizada nesta Instituição.
À Agência de Vigilância Sanitária-AGEVISA, na pessoa da Diretora Dra. Arlete Baldez.
E aos demais colegas contribuidores, Anderson, Daniele, Liziane, Shirle, Nancy, Wilson e
principalmente à Luzinete e Ray, todos do LACEN-RO.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias – FIOCRUZ/
IOC/ RJ pela convivência e ensinamentos.
Fiz
o melhor que pude na corrida, cheguei até o fim, conservei a fé.
2 Tm 4:7
RESUMO
As micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) estão amplamente distribuídas no
ambiente, tendo sido isoladas na água, incluindo água canalizada, solo, animais,
equipamentos cirúrgicos e, inclusive em soluções desinfetantes. A capacidade das MNT em
produzir doença está claramente documentada na literatura e sua importância clínica vem
aumentando progressivamente. Neste contexto, foi realizado um estudo sobre a frequência e
caracterização genotípica das MNT a fim de determinar o perfil existente no Estado de
Rondônia. Além disso, foram isoladas espécies de MNT de amostras ambientais das
residências dos pacientes que adquiriram doença pulmonar por MNT. Os isolados clínicos
foram
cedidos
pelo
acervo do
Laboratório
de Tuberculose e outras
Micobactérias/LACEN/RO, provenientes de pacientes atendidos nas Unidades de Saúde dos
municípios do Estado de Rondônia. Em um total de 80 indivíduos sintomáticos respiratórios,
sendo, 21 pacientes segundo os critérios ATS com 76 isolados e 59 pacientes com 63 isolados
de cultura única, recebidos no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2013. As amostras
ambientais foram provenientes de 15 residências dos pacientes acometidos por doença
causada por MNT. Foram coletadas 33 amostras de água, 15 amostras de solo e 41 de
biofilmes. Para caracterização das espécies foi utilizado o método molecular PRA-hsp65
(PCR-restriction enzyme pattern analyses) e pelo sequenciamento dos genes RNAr 16S e
hsp65 em isolados não determinadas pela metodologia de PRA-hsp65 em amostras clínicas e
nas amostras ambientais foram utilizados ambos os métodos para identificação em nível de
espécie. Nas amostras clínicas, as espécies de MNT mais frequentemente identificadas foram
M. fortuitum 16 (21,3%) M. abscessus 13 (17,3%), M. intracellulare 9 (13.3%) e M. avium 7
(9,3%). Dos 45 isolados ambientais identificados em nível de espécie as mais frequentes
foram M. fortuitum 19 (41,3%), M. gordonae 6 (13%), MAC 4 (8,7%). Em 3 casos,
observamos a mesma espécie em amostras pulmonares e no ambiente (M.fortuitum e
M.gordonae). Desses, um caso de infecção mista foi analisado e observou-se 98% e 97% de
similaridade de M. fortuitum nas amostras clínica e ambiental, respectivamente, em relação à
cepa de referência. Enquanto que em relação ao M. gordonae foi observada 97% de
similaridade. Dos 80 pacientes estudados o maior número de indivíduos foram do sexo
masculino (66%) com uma faixa etária média de 51 anos. Este estudo demonstra a presença
generalizada de micobactérias patogênicas no ambiente (sistema de canalização, água e solo).
Sendo de grande relevância informações sobre a distribuição ambiental local de MNT diante
do risco potencial que elas possuem de causarem doenças. Com o aumento crescente nas
infecções causadas por MNT, faz-se necessária a correta e rápida identificação de espécie,
especialmente para direcionar o tratamento devido às diferenças de susceptibilidade a agentes
antimicrobianos.
Palavras chaves: Micobactérias não tuberculosas. Doença pulmonar. Isolados ambientais.
Caracterização genética. PRA. Sequenciamento.
ABSTRACT
Nontuberculous mycobacteria (NTM) are widely distributed in the environment and have
been isolated from water, including tap water, soil, animals, surgical equipment and even
from disinfectant solutions. Infections with nontuberculous mycobacteria (NTM) are
becoming more frequent around the world, including in Brazil. The ability of NTM to
produce disease is clearly documented in the literature and their clinical significance is
increasing steadily. In this context, a study was conducted on the frequency and genotypic
characterization of NTM to determine the existing profile in the state. In addition, NTM
species from environmental samples were isolated from the homes of patients who acquired
NTM disease. Clinical isolates were provided by the Tuberculosis Laboratory assets and other
Mycobacteria/LACEN/RO, from patients attended to in health units of the municipalities in
the state of Rondonia. Samples from a total of 80 individuals with respiratory symptoms, with
21 patients following ATS criteria with 76 isolates and 59 patients with 63 single culture
isolates, were recieved in the period from January 2008 to December 2013. Environmental
samples were collected from 15 residences of patients affected by disease caused by NTM. 33
water samples, 15 soil samples and 41 samples from biofilms were collected. For
characterization of the species the PRA-hsp65 molecular method (PCR-restriction enzyme
pattern analyses) was used along with sequencing of 16S rRNA and hsp65 genes, in isolates
not determined by the PRA-hsp65 methodology in clinical specimens and environmental
samples both methods were used for identification to the species level. In clinical samples, the
NTM species most frequently identified were M. fortuitum 16 (21.3%) M. abscessus 13
(17.3%), M. intracellulare 9 (13.3%) and M. avium 7 (9.3%). Of the 45 environmental
isolates identified at the species level, the most frequent were M. fortuitum 19 (41.3%), M.
gordonae 6 (13%), MAC 4 (8.7%). In three cases, we observed the same species in the lung
and environmental samples (M.fortuitum and M.gordonae). Of these, one case of mixed
infection was analyzed and it was observed 98 % and 97% similarity M. fortuitum in clinical
and environmental samples, respectively, compared to the reference strain .While in relation
to M. gordonae 97% similarity was observed. Of the 80 patients studied, a greater number of
individuals were male (66%) and there was a mean age of 51 years. This study demonstrates
the widespread presence of pathogenic mycobacteria in the environment (sewer systems,
water and soil). It is highly relevant information about the local environmental distribution of
NTM on the potential risk they have to cause disease. With the growing increase in infections
caused by NTM, it is necessary to have correct and rapid species identification, especially in
order to direct treatment due to susceptibility differences in antimicrobial agents.
Key words: nontuberculous mycobacteria. Lung disease. Environmental isolates. Genetic
characterization. PRA. Sequencing.
LISTA DE FIGURAS
Número
Legenda
Pag
Figura 1.
Morfologia das micobactérias
19
Figura 2.
Figura 3.
Modelo adaptado da constituição da
micobactérias.
Esfregaços de cultura de micobactérias
Figura 4.
Árvore filogenética das micobactérias
38
Figura 5.
Coleta e transporte das amostras ambientais
45
Figura 6.
Sistema de filtração a vácuo
47
Figura 7.
Locais de coleta de biofilme
48
Figura 8.
Colônias de micobactérias em meio LJ com cicloheximida
49
Figura 9.
Gel de agarose 2% demonstrando o fragmento de 441 pb obtido por
PCR.
Gel de agarose contendo perfis de PRA após digestão com as
enzimas de restrição BstE II e Hae III.
Páginas do site para análises de tamanho dos fragmentos
(PRASITE).
Municípios e números de amostras ambientais em que foram
realizadas coletas no estado de Rondônia.
Coloração por Ziehl Neelsen.
51
Figura 10.
Figura 11.
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
parede
celular
das 20
34
52
52
63
64
Números de cultura positiva para Micobactérias dos locais de 65
coletas.
Alinhamento das sequências no programa BioEdit das amostras 71
ambientais e clínicas.
Árvore filogenética ilustrando a análise da sequência parcial do 72
gene hsp65 reunindo as amostras ambientais e clínicas.
LISTA DE TABELAS
Número
Legenda
Tabela 1.
Classificação das espécies de MNT de acordo com a
patogenicidade.
Habitats das micobactérias oportunistas ambientais.
Distribuição dos casos notificados de infecção por micobactérias
de crescimento rápido associadas a procedimentos invasivos
segundo o estado de notificação entre 1998-2009.
Distribuição geográfica das espécies de MNT por doença
pulmonar.
Distribuição dos pacientes segundo a procedência.
Distribuição dos pacientes segundo o risco biológico de contrair
infecção por MNT de acordo com a atividade profissional.
Perfis gerados das espécies identificadas pelo PRA-hsp65 dos
pacientes ATS.
Isolados de cultura única identificados pelo PRA-hsp65 e
sequenciamento dos genes RNAr 16S e hsp65.
Frequência de Isolados de cultura única identificados pelo PRA e
sequenciamento.
Diversidade e frequência de MNT identificadas pelo PRA e/ ou
sequenciamento.
Tipo de amostras ambientais isoladas com micobactérias.
Tabela 2.
Tabela 3.
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6.
Tabela 7.
Tabela 8.
Tabela 9.
Tabela 10.
Tabela 11.
Tabela 12.
Tabela 13.
Tabela 14.
Tabela 15.
Pag
18
20
29
30
55
56
57
59
61
62
64
Identificação e origem da amostra, velocidade de crescimento, 67
resultado do PRA e sequenciamento dos genes hsp65 e RNAr 16S.
Poder discriminatório entre os genes RNAr 16S e hsp65
70
Origem dos isolados de micobactérias identificadas pelo 73
sequenciamento e PRA.
Micobactérias ambientais isoladas das residências, relacionadas 73
com as espécies dos pacientes infectados.
LISTA DE QUADROS
Número
Legenda
Pag
Quadro 2-
Classificação das micobactérias de acordo com tempo de 17
crescimento e pigmentação das colônias.
Principais espécies de MNT e seus sítios de acometimento.
25
Quadro 3-
Diagnóstico de doença pulmonar por MNT.
26
Quadro 4-
Provas de distinção entre CMTB e MNT.
35
Quadro 5-
Regimes de tratamento recomendados para as mais 40
frequentes micobactérias não tuberculosas associadas à
doença pulmonar.
Iniciadores para amplificação de fragmento de quatro genes 53
para posterior sequenciamento.
Quadro 1-
Quadro 6-
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATS
American Thoracic Society
BAAR
Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BstEII
Enzima isolada de Bacillus stearothermophilus
CMTB
Complexo Mycobacterium tuberculosis
DNA
Ácido desoxirribonucleico
dnaJ
Gene que codifica uma proteína de choque térmico de 40 KDa
erm
Erythromycin ribosome methyltransferase
gyrB
Gene que codifica a sub-unidade beta da DNA girasse
HaeIII
Enzima isolada de Haemophilus aegyptius
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
hsp65
Gene que codifica a proteína de choque térmico de 65 kDa
LJ
Löwenstein-Jensen
MAC
Complexo Mycobacterium avium
MCL
Micobactérias de crescimento lento
MCR
Micobactérias de crescimento rápido
mL
Mililitro
MNT
Micobactérias não tuberculosas
MS
Ministério da Saúde
pb
Pares de bases
PNB
Ácido para-nitrobenzoico
PRA
Análise dos fragmentos de restrição enzimática de produtos de PCR
recA
RNA
Gene com função na recombinação de DNA homólogo e reparo de
danos no DNA
Ácido ribonucleico
RNAr
Ácido ribonucleico ribossômico
RNAr 16S
Gene que codifica a proteína ribossômica 16S
rpoB
Gene que codifica a subunidade beta da RNA polimerase
secA
Gene que codifica componente da principal rota de secreção de proteínas
através da membrana citoplasmática
sodA
Gene que codifica a enzima superóxido dismutase
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 16
1.2 CARACTERISTICAS GERAIS DAS MICOBACTERIAS ........................................... 18
1.3 HABITAT DAS MNT ..................................................................................................... 20
1.4 BIOFILMES .................................................................................................................... 23
1.5 MICOBACTERIOSE ..................................................................................................... 24
1.6 EPIDEMIOLOGIA DAS INFECÇÕES CAUSADAS POR MNT ................................ 28
1.7 MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DAS MNT............................................................ 32
1.8 DIAGNOSTICO LABORATORIAL DAS MICOBACTERIAS .................................. 33
1.8.1 Identificação fenotípica ................................................................................................. 34
1.8.2 Identificação Molecular ................................................................................................ 35
1.9 TRATAMENTO DAS MNT ........................................................................................... 39
2 JUSTIFICATIVA...................................................................................................................41
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 42
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 42
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 42
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 43
4.1 AMOSTRAGEM ............................................................................................................. 43
4.2 ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA............................................................................. 43
4.3 ASPECTOS ÉTICO-LEGAIS ......................................................................................... 43
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ......................................................................................... 44
4.5 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ....................................................................... 44
4.5.1 Culturas de Micobactérias de Amostras Clínicas .......................................................... 44
4.5.2 Isolamento de Micobactérias de Amostras Ambientais ................................................ 45
4.5.3 Biofilmes ....................................................................................................................... 47
4.5.4 Identificação Fenotípica ................................................................................................ 48
4.5.5 Armazenamentos dos isolados ambientais .................................................................... 49
4.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR ................................................................................. 49
4.6.1 Extração e purificação de ácidos nucléicos micobacterianos........................................ 49
4.6.2 Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição enzimática do produto de PCR
de hsp65 (PRA-hsp65) ............................................................................................................. 50
RESULTADOS ........................................................................................................................ 55
5.1 ASPECTOS ESPIDEMIOLÓGICOS .............................................................................. 55
5.2 IDENTIFICAÇÃO DAS MNT ...................................................................................... 57
5.2.1 PRA-hsp65 e sequenciamento parcial dos genes RNAr 16S e hsp65 ......................... 57
5.3 ISOLADOS AMBIENTAIS ............................................................................................ 63
5.3.1 Identificação dos Isolados Ambientais.......................................................................... 65
5.3.2 Genes RNAr 16S, hsp65 e análise filogenética.............................................................70
5.4 COMPARAÇÃO DAS ESPÉCIES DE MNT ENTRE OS ISOLADOS CLÍNICOS E
AMBIENTAL...........................................................................................................................73
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 75
CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 91
PERSPECTIVAS ..................................................................................................................... 92
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 93
APÊNDICE A- Questionário Epidemiológico ....................................................................... 111
APÊNDICE B- Parecer Ético ................................................................................................. 115
APÊNDICE C- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .............................................. 117
16
INTRODUÇÃO
Historicamente, as infecções humanas por Mycobacterium se pensava que eram
provocadas sobretudo pelo Mycobacterium tuberculosis. O extenso impacto social desta
infecção é lendário, mas recentemente, outras espécies de micobactérias que causam doença
clínica semelhante foram identificadas e, em muitas regiões geográficas, se tornou mais
frequente e mais prejudicial do que a tuberculose. Estes organismos são denominados por
uma variedade de nomes: Micobactérias Não Tuberculosas (MNT), micobactérias atípicas ou
ainda micobactérias outras que não M. tuberculosis (MOTT) (JOHNSON & ODELL, 2014).
As MNT estão amplamente distribuídas no meio ambiente, tendo sido isoladas na
água, incluindo água canalizada, solo, animais, equipamentos cirúrgicos e, inclusive em
soluções desinfetantes. A infecção ocorre por inalação, inoculação ou ingestão de material
contaminado por micobactérias, podendo causar doenças pulmonares e infecções de feridas
cirúrgicas em diferentes tecidos, porém parece não ocorrer transmissão de pessoa a pessoa
(COWMAN et al., 2012; GÓMEZ, 2009).
O Brasil tem um amplo território, e uma considerável parte do país tem um clima
quente e úmido, condições estas favoráveis ao desenvolvimento de micobactérias (ROCHA et
al, 2002). Além disso, cada vez mais estão sendo identificadas espécies adaptadas a ambientes
com condições adversas (poucos nutrientes, baixo pH e temperaturas extremas) (De
GROOTE & HUITT, 2006).
1.1 CLASSIFICAÇÃO DAS MICOBACTÉRIAS
As micobactérias pertencem ao domínio Bacteria, Ordem Actinomycetales, subordem
Corynebacterineae, família Mycobacteriaceae e gênero Mycobacterium. A definição
taxonômica para este gênero se baseia em três critérios: álcool-ácido resistência, conteúdo de
guanina-citosina do seu DNA de 61-71% e síntese de ácidos micólicos.
Com os avanços das técnicas moleculares nos estudos taxonômicos, a partir da década
de 1990, um número crescente de novas espécies tem sido descrito. Atualmente o gênero
Mycobacterium é composto por 169 espécies e 13 subespécies (EUZÉBY, 2015; TORTOLI,
2006). O gênero Mycobacterium é composto pelo complexo M. tuberculosis (CMTB) que
compreende além do M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti, M.
caprae, M. canettii, M. pinnipedii, Mycobacterium mungi” (ALEXANDER et al., 2010;
17
INGEN, 2012; PANTEIX et al., 2010) e “Mycobacterium origys”(INGEN et al, 2012). Estas
últimas entre aspas, não aparecem na lista oficial de nomenclatura de bactérias pertencentes
ao complexo (http://www.bacterio.cict.fr). O gênero Mycobacterium é ainda composto pelo
M. leprae e outras espécies denominadas micobactérias não tuberculosas (MNT), estas com
diferentes características fenotípicas, genéticas e patogênicas (BRASIL/MS, 2008; TORTOLI,
2003; ZAMARIOLI et al., 2008).
Diversas classificações foram propostas para as micobactérias nos últimos 60 anos
baseadas em diferentes características como genótipo, tempo de crescimento, patogenicidade,
origem, relação agente-hospedeiro, habitat (RUNYON, 1959; TORTOLI, 2003).
No entanto, a classificação mais aceita atualmente foi proposta por Runyon (1959),
que separa as micobactérias pertencentes ao complexo M. tuberculosis das demais e divide as
não pertencentes a este complexo em quatro grupos baseados nos tempos de crescimento e
produção de pigmentos carotenoides (Quadro 1).
Quadro 1- Classificação das micobactérias de acordo com tempo de crescimento e
pigmentação das colônias
Grupo
I
Características da cultura
São as fotocromogênicas e produzem pigmentos (amarelo ou laranja) somente após a
exposição à luz (M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. genavense, M. asiaticum).
II
São as escotocromogênicas que produzem pigmento (amarelo ou laranja) no escuro
ou no claro (M. srofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. celatum, M. gordonae, M.
flavescens)
III
São as não-fotocromogênicas que não produzem pigmento em qualquer situação
(complexo M. avium-intracellulare, M. paratuberculosis, M. terrae, M. triviale, M.
shimoidae)
IV
Engloba todas as micobactérias de crescimento rápido com ausência ou aparecimento
tardio de pigmentação (M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. massiliense, M.
thermoresistible)
Fonte: Brasil/MS (2008).
As espécies que apresentam crescimento em meio sólido após sete dias são
classificadas como micobactérias de crescimento lento (MCL) e aquelas que apresentam
crescimento em menos de sete dias, micobactérias de crescimento rápido (MCR).
As micobactérias são também classificadas conforme sua capacidade de causar doença
no homem como potencialmente patogênicas e não patogênicas (Tabela 1).
18
Tabela 1-Classificação das espécies de MNT de acordo com a patogenicidade.
PATOGÊNICAS
M.leprae
M. avium
M.avium subsp.paratuberculosis
M. abscessus
M. asiaticum
M. agri
M. aichiense
M. alvei
M. aurum
M. brumae
M. austroafricanum
M. chitae
M. chubuense
M. confluentes
Fonte: Brasil/MS, 2008
M. tuberculosis
M. bovis
M. africanum
M. microti
M. caprae
POTENCIALMENTE PATOGÊNICAS
M branderi
M. genavense
M.malmoense
M. celatum
M. haemophilum
M. marinum
M. chelonae
M. intracellulare
M.peregrinum
M. fortuitum
M. kansasii
M.scrofulaceum
RARAMENTE PATOGÊNICAS
M. cooki
M. gordonae
M. phlei
M.diernhoferi
M. hassiacum
M. porcinum
M. duvalii
M. komossense
M. pulveris
M. fallax
M. lepraemurium
M. rhodesiae
M.farcinogenes M. mucogenicum
M. senegalense
M. flavescens
M.nonchromogenicm M. shimoidei
M. gadium
M. neoaurum
M. smegmatis
M. gastri
M. obuense
M. sphagni
M. gilvum
M. simiae
M. szulgai
M. ulcerans
M. xenopi
M. terrae
M.thermoresistible
M. tokaiense
M. triviale
M. vaccae
1.2 CARACTERISTICAS GERAIS DAS MICOBACTERIAS
O gênero Mycobacterium se caracteriza como bacilos retos ou ligeiramente curvos,
aeróbios, embora algumas espécies possam crescer em atmosfera com reduzido O2, imóveis e
não esporulados. Medem aproximadamente 0,2 a 0,6 x 1,0 a 10 μm, não apresentam cápsula
ou micélio aéreo (figura 1). A morfologia colonial varia conforme a espécie, variando de lisa
a rugosa e de não pigmentada a pigmentada. Esse pigmento pode ser amarelo, laranja ou,
raramente, róseo, normalmente devido aos pigmentos carotenoides (GOODFELLOW &
MAGEE, 1998; KUBICA & WAYNE, 1984; PFYFFER et al., 2003).
19
Figura 1 - Morfologia das micobactérias
Fonte: www.uct.ac.za/depts/mmi/lsteyn/cellwall.html
Uma característica partilhada entre as micobactérias e que as distingue das demais
bactérias refere-se à detenção de fucsina básica pela parede celular, mesmo após serem
submetidas à descoloração com álcool acidificado, conferindo-lhes a designação de bacilos
álcool-ácido resistente (BAAR) (WINN et al., 2008).
A temperatura ótima de crescimento conforme a espécie pode variar entre 30ºC a 45ºC
e o pH suportado é limitado entre 6 e 8, sendo o pH ótimo de 6,7 a 6,9 (PFYFFER, 2007). O
tipo de colônias que se originam é variável, podendo tratar-se de colônias arredondadas de
consistência mucoide, com superfície lisa ou irregular e aspecto seco ou húmido (WAYNE &
KUBICA, 1986).
As micobactérias são diferentes das demais bactérias em uma série de propriedades,
muitas das quais estão relacionadas com a quantidade e tipos de lipídeos complexos que
compõem
a
parede
celular
(glicolipídeos,
ácidos
micólicos,
arabinogalactano,
lipoarabinomananos - LAM, peptídeoglicano - N-glicolilmurâmico) (Figura 2). Esta estrutura
lipídica pode atingir até 60% do peso seco da célula e está associada a profundos efeitos
biológicos no hospedeiro. Essa proteção confere a resistência a antibióticos, pois a grande
maioria é incapaz de penetrar na parede celular. A presença de ácidos micólicos na parede
celular é responsável pela propriedade tintorial mais peculiar destas bactérias (CATTOIR et
al., 2004; PRIMM et al., 2004; WINN et al., 2008).
20
Figura 2 - Modelo adaptado da constituição da parede celular das micobactérias, proposto por McNeil &
Brennan (http://www.scielo.br/img/revistas/mioc/v101n7/v101n7a01f01.gif )
1.3 HABITAT DAS MNT
As micobactérias ambientais apresentam grande capacidade de sobreviver e
multiplicar-se sob diversas condições ambientais: são arilsulfatase e catalase positivas e
lisozima resistentes. São relativamente resistentes à dessecação, a álcali e a muitos
desinfetantes químicos, tornando-se difícil prevenir sua transmissão em instituições e em
meios urbanos em geral (DUCATI et al., 2004). Com grandes variações de temperatura,
variações de pH e grande resistência à desinfecção por cloro (LECLERC et al., 2002), o
crescimento dessas micobactérias em água doce, marinha e estuarina fica favorecido
(LECLERC et al., 2002) (Tabela 2).
Tabela 2. Habitats das micobactérias oportunistas ambientais
Habitats Gerais
Habitats Específicos
___________________________________________________________________________
Águas naturais
Lagos, lagoas, estuários, pântanos, rios
Águas potáveis
Sistemas de distribuição, sistemas dos edifícios
Biofilmes
Canos, tubagens, filtros
Solo
Solos, turfa, terra de vasos
Aerosóis
Gotículas de água, aerosóis em ambientes fechados,
poeiras
Fômites
Broncoscópios, catéteres
Edifícios
Paredes úmidas ou encharcadas
___________________________________________________________________________
Fonte: FALKINHAM, 2002
21
Os seres humanos são expostos a micobactérias transmitidas pela água através da
bebida, natação e no banho. Além disso, aerossóis gerados durante essas atividades podem ser
inalados, (FALKINHAM, 2003) resultando potencialmente na doença. Há relatos de que
indivíduos susceptíveis podem adquirir a infecção por água potável em suas próprias casas
(THOMSON, et. al., 2013b).
Tem ocorrido um aumento no número de espécies de micobactérias potencialmente
patogênicas cuja via de transmissão está associada à água. Em 1997, Hunter relatou que cerca
de oito espécies de micobactérias tinham sido associadas à transmissão por via aquática de
doenças humanas. As espécies relatadas foram M. avium, M. fortuitum, M. gordonae, M.
marinum, M. scrofulaceum, M. terrae, M. ulcerans, e M. xenopi. Ultimamente, a lista
continua a crescer, com a adição de M. chelonae, M. immunogenum, M. abscessus, M.
kansasii, M. ulcerans, M. szulgai, M. simiae, M. palstre e M. avium subsp. paratuberculosis.
Desde o início da década de 90, foi dado ênfase ao isolamento e contagem de M.
avium em águas devido ao grande número de infecções por essa bactéria em pacientes com
AIDS (JORDÃO JR., 2008; HORSBURGH JR, 1992). Tem sido demonstrado que isolados
de M. avium recuperados a partir de pacientes com AIDS foram clonalmente relacionados
com isolados recuperados a partir da água para o qual os pacientes tinham sido expostos
(VON REYN et al., 1994).
Tortoli (2003), estudando novas espécies de micobactérias desde o começo da década
de 1990, afirma que espécies como M. brumae, M. alvei, M. botniense, M. cookii, M.
genavense, M. tusciae, M. palustre, M. bohemicum podem ter como fontes naturais o solo e
águas provenientes de lagos, rios, e sistemas de distribuição. Sendo assim, essas espécies
pouco estudadas de microbactérias não tuberculosas podem ser potencialmente patogênicas
aos seres humanos.
As espécies M. kansasii e M. xenopi têm sido frequentemente isoladas em
abastecimento de águas e de esgotos, mas seu reservatório natural é desconhecido. Algumas
espécies são raramente encontradas em condições naturais, mas frequentemente encontradas
em ambiente artificial é o caso de M. marinum, M. chelonae e M. avium (LEÃO, et. al.,
2004).
A cloração é utilizada para desinfecção residual no sistema de abastecimento para
impedir a recontaminação da água e para manter os padrões microbiológicos. Todavia, com a
eliminação de microrganismos em água tratada, a competição é reduzida favorecendo o
crescimento de bactérias resistentes ao cloro como as do gênero Mycobacterium, sendo estas
frequentemente isoladas de águas tratadas e cloradas (GOMILA; RAMIREZ; LALUCAT,
22
2007; LEITE, 1991). Outro fator na sobrevivência da micobactéria é sua associação com
amebas de vida livre e outros protozoários (VAEREWIJCK, et al., 2005).
Solos também apresentam uma grande variedade e um elevado número de
micobactérias oportunistas ambientais, sendo que uma potencial fonte de micobactérias são os
vasos com terra. Foram observadas em amostras coletadas a partir de plantas envasadas
micobactérias com frequência de 89%, incluindo o M. avium (27%) e M. intracellulare (28%)
(FALKINHAM, 2002)
Além disso, foram identificadas espécies de M. fortuitum, e outras micobacterias de
crescimento rápido estreitamente relacionadas com esta espécie (HRUSKA & KAEVSKA,
2012) em isolados micobacterianos a partir do solo.
Estudos revelaram que solos na Finlândia, oriundos da floresta boreal ricos em turfa,
contém um elevado número de micobactérias (IVANAINEN, et al., 1997), e isso tem sido
associado com a alta frequência de infecção por micobactérias em pacientes com AIDS
(KATILA et al., 1995) e com o aumento do número anual de pacientes finlandeses
diagnosticados com infecções por M. avium, M. intracellulare e M. malmoense (RISTOLA, et
al., 1999).
Micobactérias de sedimentos do rio podem ser transferidas para o solo por inundações
ou pela ejeção de micro gotículas na formação de aerossóis (WHITE et al., 2010).
Estudos mostraram evidências da presença de MNT de crescimento rápido em solos
poluídos e sugerem que podem ser importantes agentes de mineralização de poluentes
(FALKINHAM, 2009; WANG et al., 2006;).
As micobactérias oportunistas ambientais também foram isoladas de animais
domésticos e selvagens, no entanto, ainda não está claro, quando a fonte é o animal ou o meio
ambiente (FALKINHAM, 2002). Isolados de MNT foram encontrados em edifícios úmidos e
bolorentos (ANDERSSON et al., 1997) e além disso, a presença de micobactérias em tecidos
vegetais tem sido uma preocupação devido à possível transmissão para animais e seres
humanos (KAZDA et. al., 2009).
Os chamados ambientes sintéticos são colonizados por um espectro considerável de
espécies de micobactérias, algumas das quais vivem quase exclusivamente em habitats
sintéticos (LEÃO et al., 2005).
23
1.4 BIOFILMES
Biofilmes microbianos são definidos como comunidades complexas formadas por
micro-organismos aderidos a superfícies sólidas ou semi-sólidas envolvidas por uma matriz
de polissacarídeos. A organização dos micro-organismos em biofilmes constitui uma forma de
proteção ao desenvolvimento e permite a sobrevivência em ambientes hostis. Biofilmes têm a
capacidade de formar-se em qualquer superfície úmida, sendo ela biótica ou abiótica
(DAVEY & O’TOOLE, 2000).
As MNT podem formar biofilmes em condições de baixa quantidade de nutrientes,
tornando as superfícies dos sistemas de distribuição de água potável em um ambiente para o
seu crescimento e possível disseminação (HALL-STOODLEY; KEEVIL E LAPPIN-SCOTT.
1999). A alta hidrofobicidade da micobactéria permite a formação de biofilmes em diversas
superfícies orgânicas, como exemplo os plásticos, silicone, celulose e borracha e superfícies
inorgânicas como o cobre e o vidro (FALKINHAN, 2002; SCHUZLE-ROBBECKE et al.,
1992).
A relação das micobactérias com biofilmes tem sido observada há décadas em
amostras clinicas e ambientais. A presença de micobactérias ambientais nesses biofilmes pode
causar impactos na saúde humana e podem ser responsáveis por infecções e surtos de
doenças, devido a problemas de contaminação (SENNA et al., 2008).
A detecção de micobactérias em biofilmes oriundos de diferentes sistemas hídricos
tem sido relatada, embora a identificação das espécies não tenha sido alcançada em todos os
casos. Espécies de crescimento rápido, como M. fortuitum e M. chelonae, têm sido descritos
como parte desses biofilmes polimicrobianos, onde micobactérias de crescimento lento
também foram isoladas. Segundo o estudo de Esteban et al. (2008), 15 espécies testadas
obtidas de coleções internacionais de culturas (ATCC) de micobactérias de crescimento
rápido (MCR) (M. fortuitum , M. chelonae, M. abscessus, M. peregrinum, M. mucogenicum,
M. septicum, M. immunogenum, M. mageritense , M. porcinum , M. senegalense, M.
elephantis, M. smegmatis, M. goodie, M. alvei, e M. brumae ) revelaram habilidade em formar
biofilmes in vitro, sendo a composição química do meio capaz de influenciar o tempo
necessário para o desenvolvimento do biofilme.
O mecanismo de formação de biofilme por micobactérias não é totalmente
compreendido e só recentemente foram estudados (VAEREWIJCK et al., 2005). As
micobactérias podem alcançar espalhamento em superfícies por um mecanismo de
24
deslizamento. Esta forma de mobilidade é susceptível de desempenhar um importante papel
na colonização da superfície no ambiente bem como no hospedeiro (MARTINEZ, TORELLO
& KOLTER, 1999).
Considerando que os sistemas de distribuição de águas potáveis possuem milhares de
quilômetros de canos, assume-se que o número de micobactérias em suspensão não é mantido
pela introdução de águas do exterior, mas sim pela grande quantidade de biofilmes
(FALKINHAM, 2002).
1.5 MICOBACTERIOSE
As MNT podem causar uma variedade de doenças, chamadas micobacterioses, que
podem afetar humanos e animais e que diferem em gravidade e importância para a saúde
pública de acordo com a sua virulência. Este grupo é responsável por um amplo espectro de
manifestações, que incluem infecções de pele e tecidos moles, infecções pulmonares crônicas
e progressivas, infecções gastrointestinais, linfadenites em crianças e, especialmente em
pacientes imunodeprimidos, infecções disseminadas (KATOCH, 2004; JHONSON et al.,
2008; SALEEB & OLIVIER, 2010). O quadro 2 apresenta as principais MNT associadas a
infecções em humanos e seus sítios mais comuns de acometimento (GENTRY, 2005).
25
Quadro 2. Principais espécies de MNT e seus sítios de acometimento
MNT (crescimento
lento)
Complexo M. avium
M. genavense
M. haemophilum
Sítios mais comuns
Sítios menos comuns
Pulmões,
linfonodos,
infecção Pele
disseminada
Gastrointestinal, infecção disseminada Pulmões
M. kansasii
Linfonodos (cervicais), pele, pulmões, Intraocular
ossos,
articulações,
infecção
disseminada.
Pulmões, infecção disseminada.
Pele, linfonodos
M. malmoense
Pulmões
M. marinum
Pele
M. scrofulaceum
Linfonodos (cervicais)
M. ulcerans
Pele
M. xenopi
Pulmões
MNT (crescimento
rápido)
M. chelonae
M. abscessus
Sítios mais comuns
Linfonodos, pele, ossos,
articulações,
infecção
disseminada
Linfonodos,
espaço
articular,
infecção disseminada
Pulmões, pele, infecção
disseminada
Infecção disseminada
Linfonodos,
espaço
articular,
Sítios menos comuns
Pele, cateter, infecção disseminada
Pulmões
Pele, ossos, articulações, cateter, Pulmões
M. fortuitum
Pele, cateter
M. massiliense
Pele, articulações
Pulmões,
ossos,
olhos
Pulmões
linfonodos,
articulações,
Fonte: Gentry (2005)
Recentemente, a notificação de doenças causadas pelas MNT se tornou obrigatória
somente para casos de infecção após procedimentos cirúrgicos realizados em serviços de
saúde, levando à falta de registros oficiais para que se possa estimar sua prevalência
(BRASIL/MS, 2008; UEKI et al., 2005).
A doença pulmonar por MNT geralmente ocorre em pacientes com doença pulmonar
crônica como pneumoconiose, doença pulmonar obstrutiva crônica, tuberculose pré-existente,
bronquite crônica, bronquiectasia e doença esofágica associada à aspiração crônica de
material alimentar pelas vias aéreas (HADAD et al., 2005 KATOCH, 2004;). Os sinais e
26
sintomas do comprometimento pulmonar são inespecíficos, incluindo tosse crônica,
expectoração e fadiga. No entanto, na maioria das vezes, a sintomatologia clínica se
assemelha à evolução crônica da tuberculose (GRIFFITH et al., 2007). Nas formas mais
avançadas da doença o mal-estar, dispneia, febre, hemoptise e perda de peso podem surgir
(CAMPOS, 2000; GRIFFITH et al., 2007; HADAD et al., 2005). Pelo menos 40 espécies de
MNT estão associadas à doença pulmonar (DALEY & GRIFFITH, 2010).
Segundo a American Thoracic Society (ATS), o diagnóstico das formas pulmonares
deve ser baseado em critérios clínicos, microbiológicos e radiológicos (Quadro 3). Devido à
ampla distribuição das MNT no meio ambiente, é necessário mais de um isolamento pela
possibilidade de contaminação da amostra.
Quadro 3- Diagnóstico de doença pulmonar por MNT
Critérios clínicos e radiológicos
1.Sintomas respiratórios associados a opacidades nodulares ou cavidades na radiografia e/ou bronquiectasia e
múltiplos pequenos nódulos na tomografia computadorizada de tórax.
e
2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente a tuberculose.
Critérios microbiológicos
1. Cultura positiva em duas amostras diferentes de escarro
ou
2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado broncoalveolar (LBA)
ou
3. Biópsia pulmonar: processo inflamatório granulomatoso crônico e/ou BAAR no tecido associado â cultura
positiva em tecido, escarro ou LBA.
Fonte: Griffith et al.(2007)
As doenças causadas por MNT na pele ou tecidos moles geralmente apresentam sinais
e sintomas de inflamação como dor, aumento de temperatura, eritema, nódulos e ou
abscessos, podendo evoluir com drenagem de secreção, fístulas ou deiscências de suturas. O
período de incubação pode variar de uma semana a dois anos (HADAD et al., 2005). As
lesões dermatológicas após perfuração e trauma, comumente, são causadas por MCR como,
M. fortuitum, M. abscessus ou M. chelonae (DUARTE et al., 2009; WALLACE et al., 1983).
As MNT também são responsáveis por doenças que acometem pacientes que ficam
expostos ou em contato prolongado com ambientes aquáticos, causando ferimentos ou microtraumas na pele. Casos de granulomas na pele foram descritos em pacientes infectados pelo
27
M. marinum através da manipulação com peixes e águas contaminadas (STAMM &
BROWN, 2004).
A úlcera de Buruli (BU) é uma doença bacteriana necrotizante da pele causada por M.
ulcerans que produz uma toxina, chamado micolactona (ML), que é essencial para a
virulência bacteriana. A doença tem sido documentada em mais de 30 países em todo o
mundo, embora a maioria dos casos ocorra na África Ocidental, principalmente Benin, Costa
do Marfim e Ghana (WALSH; PORTAELS; MEYERS et al., 2011).
A linfadenite cervical localizada, causada por MNT, é mais comum na infância e com
pico de incidência entre um e cinco anos de idade (CABRIA, et al., 2002; HAZRA, 1999;
WOLINSKY, 1995). Na ausência de infecção por HIV, a linfadenite raramente afeta adultos
(GRIFFITH et al., 2007).
Doença disseminada causada por M. avium ocorre em situações de imunodepressão
severa, em 90% dos casos em pacientes HIV positivos e mais raramente têm sido relatadas em
pacientes imunodeprimidos com insuficiência renal crônica, transplantes cardíacos, uso de
corticoide crônico e leucemias (GRIFFITH et al., 2007).
A presença de MNT em amostras de água de hospital tem sido associada a surtos
nosocomiais (PHILIP & VON REYN, 2001).
Em relação a micobacterioses em animais, a maioria das infecções por M. avium e M.
intracellulare em gado são detectadas no momento do abate e as lesões são mais restritas em
gânglios linfáticos perto do aparelho digestivo. O potencial zoonótico de infecções pelo
complexo M. avium (MAC) é mal compreendido (FREITAS et al., 2001). Doenças são mais
comuns em agricultores (FALKINHAM, 1996), possivelmente como resultado do contato
com animais ou seus produtos. Ao contrário da infecção por M. avium em aves selvagens e
domésticas, a infecção por M. avium em mamíferos ocorre apenas esporadicamente e
raramente é transmissível (THOREL et al., 2001).
Com o aumento crescente nas infecções causadas por MNT, faz-se necessária a correta
e rápida identificação de espécie, especialmente para direcionar o tratamento devido às
diferenças de susceptibilidade a agentes antimicrobianos, dependendo da espécie de MNT
(SHIN et al, 2009), representando uma emergência clínica que não pode ser subestimada (WU
et al, 2009).
28
1.6 EPIDEMIOLOGIA DAS INFECÇÕES CAUSADAS POR MNT
Ao longo das últimas três décadas, tem sido observado que tanto a incidência,
isolamento no laboratório e a prevalência das doenças por MNT estão aumentando. Esta
mudança tem sido atribuída, em parte, a melhoria das técnicas de cultivo, juntamente com a
maior consciência da doença. As infecções por MNT, ao contrário de tuberculose, não
necessitam de notificação pelos órgãos públicos (a não ser pós-cirúrgicas), o que dificulta
uma compreensão exata da epidemiologia (JOHNSON & ODELL, 2014).
No Brasil, observamos uma diversidade de espécies de MNT nas diferentes regiões do
país, a maioria dos casos associadas à doença pulmonar e extrapulmonar. Essa diversidade
ocorre, possivelmente, devido a diferentes condições ambientais que podem favorecer seu
predomínio (LIMA, 2014).
No trabalho realizado por Mello et al. (2013) no estado do Rio de Janeiro, as espécies
mais frequentes encontradas foram a M. kansasii e micobactérias do complexo MAC
enquanto em estudo realizados por Zamarioli et. al., (2008) em São Paulo, 13 espécies foram
associadas à infecção pulmonar, com maior número de isolamentos por M. kansasii (16%) e
M. fortuitum (11,2%). Na região Norte, estudos realizados no Estado do Pará por da Costa
(2012) mostraram que as espécies predominantes nas formas pulmonares, entre os anos de
1999 a 2010 foram M. massiliense, M. simiae complex, M. intracellulare e M. avium, e a
maioria destes casos haviam feito tratamento anterior para tuberculose. Além disso, o mesmo
grupo de estudos (da COSTA, et. al., 2013) analisando pacientes com infecções pulmonares
durante o período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011 relatou que M. massiliense foi
novamente a espécie mais encontrada, com 44,8% dos casos. Em Rondônia, estudos
realizados por Mendes de Lima et al. (2013), detectou infecção pulmonar por MNT em
16,9% dos sintomáticos respiratorios, sendo as espécies mais frequentes M. abscessus (32%),
M. avium (17,3%) e M. fortuitum (12%).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária em 2011, divulgou o relatório com o
número de casos que foram notificados durante o período de 1998 a 2009, observando-se
2.520 casos de infecções pós-cirúrgicas por micobactérias de crescimento rápido incluindo M.
fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. massiliense, distribuídas predominantemente em
hospitais privados do país de vários estados brasileiros (Tabela 3). A maioria dos casos foram
procedimentos invasivos cirúrgicos, sendo as cirurgias abdominais o principal procedimento
envolvido (ANVISA, 2011).
29
Tabela 3-Distribuição dos casos notificados de infecção por micobactérias de
crescimento rápido associadas a procedimentos invasivos, segundo o estado de notificação
entre 1998-2009
Estado
Rio de Janeiro
Espirito Santo
Pará
São Paulo
Paraná
Rio Grande do Sul
Goiás
Mato Grosso
Distrito Federal
Minas Gerais
Piauí
Bahia
Ceará
Santa Catarina
Sergipe
Pernambuco
Alagoas
Tocantis
Roraima
Rio Grande do Norte
Paraíba
Amazonas
Acre
Total
N° de casos
1.107
363
327
193
149
115
95
50
33
31
11
11
9
6
5
5
3
2
1
1
1
1
1
2.520
Fonte: Anvisa (2011)
Nos Estados Unidos, na década de 1980, a prevalência de doenças causadas por estes
organismos era de 1,6 a 1,8 por 100.000 habitantes, mas em estudos recentes mostrou uma
prevalência muito mais elevada de 14,1 por 100.000 habitantes (MARRAS et. al., 2007).
Estudos mostram que há uma variabilidade geográfica marcante tanto na prevalência
quanto na distribuição das espécies responsáveis pelas doenças causadas por MNT
(KATOCH,2004).
Uma compilação de dados epidemiológicos recentes de doença pulmonar por MNT a
partir de avaliações dos melhores estudos disponíveis por regiões do globo terrestre foram
realizados por Prevots & Marras (2015) e estão apresentados na Tabela 4.
30
Tabela 4- Distribuição geográfica das espécies de MNT por doença pulmonar
Região (ano)
N
espécies mais comuns
América do Norte
New York (USA)
2000-2004
Oregon (USA)
2005-2006
81
MAC (80%)
M.abscessus/chelonae
(13%)
(13%)
M. fortuitum (8%)
M.xenopi (6%)
407
MAC (80%)
California, Persilvania,
Colorado e Washington
255
MAC (80%)
(13%)
Toronto, Canada
255
MAC (69%)
M. xenopi (21%)
Ontario, Canada
1294
MAC (80%)
(13%)
Sudeste Irlanda (19872000)
França (2001-2003)
17
MAC (82%)
M. malmoense (12%)
M. abscessus (6%)
263
MAC (48%)
M. xenopi (25%))
M. kansasii (13%)
M. abscessus (9%)
Dinamarca (1997-2008)
335
MAC (57%)
M. malmoense (8,1%)
M. xenopi (12,5%)
M. abscessus (6,9%)
Londres, Inglaterra
(2000-2007)
Lisboa, Portugal (20082009)
Nápoles, Italia (20062009)
Croácia (2006-2010)
57
M. kansasii (70%)
MAC (40%)
M. malmoense (9%)
M. xenopi (7%)
58
MAC (22,4%)
M. fortuitum (13,8%)
M. kansasii (10,3%)
16
M. kansasii (31,3%)
167
M. intracellulare
(43,8%)
M. xenopi (28,1%)
M.
gordonae
(12,1%)
M. xenopi (12,5%)
M. gordonae (20,4%)
MAC (19,8%)
M. fortuitum (9%)
Creta, Grécia (20002009)
38
MAC (40%)
M. kansasii (26%)
M. abscessus (8%)
M. fortuitum, M. chelonae,
M. gordonae (cada, 5%)
M.kansasii (5%)
MCR (7%)
Europa
M. fortuitum (6,3%)
M. gordonae (5,4%)
M. chelonae (8,6%)
31
Cont.
Nijmegen-Arnhem,
53
MAC (49%)
M. kansasii (23%)
M. szulgai (7,5%)
M. xenopi (5,6%)
Holanda (1999-2005)
Região (ano)
N
espécies
comuns
mais
Austrália
Autrália (2000)
107
MAC (67,3%)
M. kansasii (19,6%)
M.
(6,5%)
M.
(5,4%)
abscessus
Quensland (1999-2005)
130
MAC (73,8%)
M kansasii (7,7%)
Nova Zelândia (2004)
47
MAC (83%)
M. abscessus (9%)
Turquia (2004-2009)
31
MAC (42%)
M. abscessus (16%)
M. kansasii (16%)
Israel (2004-2010)
Arábia Saudita (20092010)
India (2005-2008)
45
49
M. xenopi (29%)
M. abscessus (30,6%)
M. kansasii (20%)
M. fortuitum (28,6%)
MAC (18%)
MAC (16,3%)
M. fortuitum (9%)
M. kansasii (8,2%)
67
MAC (34%)
M. abscessus (22%)
M. simiae (22%)
M. fortuitum (12%)
M. fortuitum (2,3%)
M. kansasii (2,0%)
M. kansasii (11,1%)
M. fortuitum (9,5%)
abscessus
Oriente Médio e
Sudesta da Asia
Leste da Asia
Seul, Sudeste Coreia
651
MAC (76,2%)
(2002-2010)
Seul, Sudeste Coreia
345
MAC (62,9%)
(2006-2010)
Taipei, Norte Taiwan
252
MAC (39,7%)
M.chelonae-M.abscessus
(2007-2009)
(30,2%)
Nota:MAC- complexo M. avium, MCR-micobactéria de crescimento rápido.
Fonte Prevots & Marras (2015).
32
1.7 MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DAS MNT
As amostras clínicas consideradas contaminadas (escarro, urina, secreções, lavado
brônquico, lavado gástrico e fragmentos de tecido cutâneo), necessitam passar pelo processo
de pré-tratamento de descontaminação. Os agentes descontaminantes (ácidos, bases) eliminam
outros microrganismos. A eliminação destes proporciona o crescimento das micobactérias
sem a competição pelos nutrientes contidos nos meios de cultura (BRASIL/MS, 2008).
As micobactérias são caracterizadas pela sua taxa de crescimento mais lenta do que
outras bactérias (KAMALA et al., 1994). Portanto, dificuldades são encontradas para
isolamentos dessas micobacterias a partir de amostras ambientais, tais como solo e água, que
são igualmente ricos em outros microrganismos. Muitos métodos diferentes de
descontaminação para isolamento de micobactérias de amostras ambientais tem sido
estudadas (KAMALA et al, 1994; PARASHAR et. al 2004; PORTAELS, MUINCK, SYLLA,
1988), no entanto, é muito difícil criar uma regra específica de isolamento devido aos
diferentes tipos de amostras, diferentes meios de cultura para o primeiro isolamento e
diferentes distribuições geográficas das micobactérias (FALKINHAM, 2002). Esses
tratamentos se baseiam na resistência parcial das micobactérias aos ácidos, bases ou
detergentes. Contudo métodos não rigorosos utilizados para o isolamento podem resultar em
crescimento excessivo de contaminantes, enquanto um método muito rigoroso poderia resultar
em perdas de micobactérias (KAMALA et al., 1994).
No isolamento de micobacterias do solo, poeira e turfa as dificuldades encontradas de
isolamento aumentam. Estes materiais contêm um alto número de microorganismos de
multiplicação rápida que podem formar colônias sobrepondo e mascarando as colônias de
micobactérias (FALKINHAM, 2002) e as micobactérias aderem-se fortemente às partículas
do solo (BROOKS et al., 1984).
É possível a realização do cultivo direto de micobactérias, sem a descontaminação das
amostras com baixas contagens microbianas como, por exemplo, águas de bebida
(FALKINHAM et al., 1980; FALKINHAM et al., 2001) e aerossóis (WENDT et al., 1980).
33
1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOBACTÉRIAS
No Brasil, o diagnóstico laboratorial das micobactérias é da competência do serviço
público de saúde, sendo coordenados em cada Estado pelos Laboratórios de Referência
Estadual – Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACEN).
Os métodos microbiológicos de baciloscopia e cultura são as técnicas empregadas na
rede de laboratórios para o diagnóstico das micobactérias no Brasil. Também é realizada a
identificação fenotípica da espécie através de testes bioquímicos e características de
crescimento (BRASIL/MS, 2008).
O exame microscópico é um procedimento rápido, econômico, fácil de executar,
fornece informações preliminares importantes sobre a possível presença de micobactérias,
mas não é útil para identificar as micobactérias em nível de espécie, sendo a sua sensibilidade
menor que a da cultura (HASHIMOTO et al., 1996; WU et al., 2009). São necessários entre
5.000 a 10.000 bacilos por mililitros, para se obter um resultado positivo (BRASIL/MS, 2008;
CHEN et al, 2012; ULRICHS, 2005), além de não ser capaz de os diferenciar
morfologicamente, podendo levar a um diagnóstico equivocado das doenças causadas por
MNT, sendo muitas vezes o paciente notificado erroneamente como portador de tuberculose
(GRIFFITH et al., 2007).
A cultura é um método de diagnóstico altamente sensível que permite a detecção de
um mínimo de 10 a 100 bacilos viáveis no volume do material cultivável. Além disso, permite
a posterior identificação da espécie de micobactéria isolada e o teste de sensibilidade aos
antimicrobianos. Como o tempo de crescimento bacilar varia de duas a seis semanas, a cultura
apresenta como desvantagem o tempo necessário para a liberação do resultado (BRASIL/MS,
2008).
Com o aumento da ocorrência de micobacterioses, houve a necessidade do
desenvolvimento de métodos mais sensíveis e rápidos para a identificação das espécies de
micobactérias como: testes bioquímicos (provas bioquímicas para identificação), testes
químicos (cromatografias) e testes genotípicos (metodologias moleculares de identificação).
34
1.8.1 Identificação fenotípica
Os métodos fenotípicos de identificação de MNT incluem um conjunto de testes
baseados em características da cultura e bioquímicos, tais como: tempo e temperatura de
crescimento, pigmentação, capacidade de crescimento em meios seletivos e testes
enzimáticos.
Os métodos tradicionais utilizados na separação das espécies do Complexo M.
tuberculosis (CMTB) das MNT é feita pelos seguintes testes: análise microscópica e
macroscópica da cultura, inibição do crescimento em meio contendo ácido ρ-nitrobenzóico
(PNB) e teste de produção de niacina.
A análise microscópica é útil na avaliação da pureza da cultura, da presença de BAAR
e da presença de fator corda. As espécies do CMTB apresentam a formação de aglomerados
lineares com aspecto de corda, que podem ser observados em esfregaços corados pelo método
de Ziehl-Neelsen, enquanto que a maioria das MNT não forma corda, exceto algumas
espécies como, M. kansassi, M. fortuitum e M. chelonae (BRASIL/MS, 2008) (Figura 3).
Figura 3- Esfregaços de cultura de micobactérias
a) M. tuberculosis
b) MNT
Fonte: BRASIL/MS, 2008
Em relação à análise macroscópica, as colônias do CMTB são acromógenas,
geralmente de cor creme, e rugosas; já as colônias das MNT são pigmentadas ou
acromógenas, lisas ou rugosas. A habilidade de crescimento das micobactérias em meios
contendo agentes inibidores seletivos é utilizada como ferramenta para diferenciação de MNT
do complexo M.tuberculosis. O crescimento das micobactérias pertencentes ao complexo M.
tuberculosis é inibido em meios contendo 500μg/mL de ácido para-nitrobenzoico (PNB), o
que não ocorre com as MNT, exceto para M. kansasii, M. xenopi e M. gastri. A avaliação da
produção ou ausência de niacina é útil também para a diferenciação, na qual M. tuberculosis e
35
M. africanum, do complexo M. tuberculosis, e M. simiae, M chelonae e M. marinum
produzem quantidades detectáveis pelo teste in vitro (Quadro 4) enquanto em outras
micobactérias está ausente. (BRASIL/MS, 2008; WINN et al., 2008).
Quadro 4- Provas de distinção entre CMTB e MNT.
Características
CMTB
MNT
Pigmentação
Ausente
Variável
Fator corda
Positivo
Negativo
Crescimento em LJ-PNB
Ausente
Presente
Produção de niacina
Positivo
Negativo
Nota: CMTB: Complexo M.tuberculosis, MNT: Micobactérias não tuberculosas, LJ: Lowenstein-Jensen, PNB:
ácido para-nitrobenzóico.
Fonte: BRASIL/MS (2008).
No entanto, outros testes fenotípicos para a identificação das diferentes espécies de
MNT também podem ser realizados como o crescimento a 25 °C, crescimento a 45 °C,
inibição de crescimento em meio com NaCl 5%, hidrólise do tween 80, produção de βgalactosidase, redução do telurito de potássio, redução do nitrato, produção de uréase, e
pirazinamidase (BRASIL/MS, 2008).
1.8.2 Identificação Molecular
1.8.2.1 Identificação pelo método PCR- Restriction Enzyme Analysis (PRA)
O método molecular mais difundido mundialmente para a identificação de espécies de
MNT foi desenvolvido por Telenti et al. (1993) denominado PRA (PCR-restriction enzyme
pattern analyses). Nesta técnica, é feita por PCR da sequência do gene hsp65, que codifica a
proteína de choque térmico (heat shock protein) de 65-kDa. Esse gene é altamente conservado
entre as espécies de micobactérias, mas também apresenta regiões hipervariáveis usadas para
a identificação das diferentes espécies (TORTOLI et al., 2003). O fragmento de 441 pb é
submetido à digestão com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII (TELENTI et al., 1993). Os
produtos da digestão quando separados por eletroforese em gel de agarose a 3% apresentam
perfis específicos de cada espécie de micobactéria (TORTOLI et al., 2003). O procedimento é
rápido, e identifica um grande número de espécies de micobactérias em um único
experimento e com um custo compatível com a realidade dos laboratórios clínicos (ROCHA
et al., 2002, HÄFNER et al., 2004; KIM et al., 2005; LEÃO et al., 2005; WANG et al., 2005).
36
Os padrões observados na PCR podem ser comparados aos padrões reportados no
PRASITE, um site desenvolvido pelo Instituto de Microbiologia do Hospital Universitário de
Lausanne, Suíça (CHUV), Instituto Pasteur na França, Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP), Instituto Adolfo Lutz de São Paulo (IAL-SP) e Centro Nacional da Suíça para
Micobactérias. Neste site estão disponíveis diferentes perfis de clivagem referentes a cada
espécie de micobactérias. No PRASITE estão disponíveis para consulta um total de 178
padrões, referentes a 118 espécies. Além disso, podem-se encontrar, também, perfis que
foram descritos por Chimara et al. (2008). Entretanto, algumas espécies de MNT apresentam
perfil compartilhado por mais de uma espécie e, ainda, é possível verificar que uma mesma
espécie pode apresentar mais de um perfil de restrição.
Muitas pesquisas empregam o sequenciamento genético com diferentes alvos para auxiliar
a identificação. Esta metodologia possibilita a confirmação dos resultados obtidos no PRA e a
identificação de novas espécies.
1.8.2.2 Sequenciamento do DNA
O sequenciamento é considerado “padrão-ouro” dentre os métodos de biologia
molecular para identificação das espécies de micobactérias.
Os genes mais comumente
usados para diferenciação das micobactérias são RNAr 16S, o espaçador entre 16S e 23S
(rRNA internal transcribed spacer-ITS) e o hsp65 (DAI et al., 2011).
O sequenciamento do gene RNAr 16S é o gene mais amplamente usado para análises
filogenéticas em bactérias. A região RNAr 16S constitui uma sequência de cerca 1.500
nucleotídeos codificados pelo DNA ribossomal 16S (rDNA), que é um gene cuja
característica é a sua alta capacidade de manter-se conservado, com regiões comuns a todos os
organismos (regiões conservadas) e também áreas onde os nucleotídeos apresentam variações
(regiões variáveis). Para fins de identificação de micobactérias, a análise da sequência enfoca
duas sequências hipervariáveis, conhecidas como as regiões A e B. A sequência da região A é
geralmente suficiente para identificar a maioria das espécies de MNT, a região B pode ser
considerada confirmatória (TORTOLI, 2003). No entanto o uso deste gene tem suas
limitações.
Apesar de ser considerado como referência para identificação, em algumas
situações as sequências desse gene apresentam poucas variações nucleotídicas entre as
espécies do gênero Mycobacterium, o que revela a necessidade de utilização de outros alvos
mais variáveis.
As micobactérias de crescimento lento contêm uma cópia do gene rRNA 16S,
entretanto as espécies de crescimento rápido, exceto o M. abscessus e o M. chelonae, têm
37
duas cópias (TORTOLI, 2003). No gênero Mycobacterium a similaridade interespécies deste
alvo molecular varia de 94 a 100%, e assim, algumas espécies possuem alto grau de
similaridade ou possuem sequências idênticas, como M. kansasii e M. gastri, M. chelonae e
M. abscessus, M. marinum e M. ulcerans, entre outras (ADEKAMBI et al., 2004;
ADEKAMBI et al., 2006; DEVULDER et al., 2005;), dificultando ou mesmo impedindo a
distinção entre as mesmas usando este alvo molecular.
O sequenciamento do ITS (Internal transcribed spacer) representa um complemento
da sequência do gene RNAr 16S na diferenciação de espécies intimamente relacionadas. Estas
sequências ITS, entre o RNAr 16S e o RNAr 23S, são conservadas na mesma espécie e
apresentam polimorfismos inter-espécie, o que as torna um alvo molecular para a
identificação (ROTH et al., 1998). O sequenciamento parcial do gene rpoB, que codifica a
subunidade β da RNA polimerase bacteriana, tem sido utilizado como uma ferramenta
complementar ao sequenciamento do gene RNAr 16S. Estudo de Adekambi et al., (2003)
verificou que as sequências de rpoB são mais variáveis que as do gene do RNAr 16S nas
micobactérias de crescimento rápido, sugerindo que rpoB pode aumentar a discriminação
molecular entre as espécies deste grupo. Kim et al. (1999) concluíram que o sequenciamento
do gene rpoB pode ser utilizado eficientemente para identificar isolados clínicos de
micobactérias e como complemento à análise do gene rRNA 16S.
O sequenciamento do gene hsp65 é um dos mais utilizados para a identificação. Este
método pode ser utilizado para confirmar e refinar o resultado obtido pelo PRA (ITOH et al.,
2003). O gene é composto por aproximadamente 1.600 pares de bases (SHINNICK, 1987),
mas não é capaz de diferenciar os membros do complexo M. tuberculosis (com exceção do M.
africanum) nem subespécies dentro do complexo M.avium e M. fortuitum (Figura 4) (DAI et
al., 2011a).
38
Figura 4-Árvore filogenética das micobactérias. Filogenia por verossimilhança máxima de 149
espécies e subespécies de micobactérias baseada na análise do gene hsp65. Micobactérias de
crescimento lento em vermelho e de crescimento rápido em azul. Uso da Nocardia farcinica como
grupo externo. Escala equivalente a 0,02 substituições/sítio. Fonte: Dai et al., 2011b
Outros genes também têm mostrado grande utilidade para análises filogenéticas, como
marcadores filogenéticos de identificação de espécies, incluindo gyrB, dnaJ, recA, sodA, secA
39
(SOINI, BÖTTGER & VILJANEN, 1994; SOINI & VILJANEN, 1997 apud SENNA, 2008;
TAKEWAKI et al., 1993; ZOLG & PHILIPPI-SCHULZ, 1994).
1.8.2.3 Métodos comerciais
Foram desenvolvidos sistemas comerciais baseados em sondas genéticas e hibridação
reversa. Esses sistemas são rápidos, porém de alto custo. Os principais sistemas que estão
disponíveis são o AccuProbe® (Gen-Probe Inc., USA) e o INNO-LiPA Mycobacterium®
(Innogenetics NV, Bélgica) os quais são alternativas importantes para o laboratório de
diagnóstico, mas caracterizam um número limitado de espécies (PIERSIMONI et. al., 2001;
SCARPARO et. al., 2001; SUFFYS et.al., 2001; TORTOLI et. al., 2001). Além disso, existe
o sistema de sonda GenoType® Mycobacterium CM (Hain LifeScience®), que permitem a
identificação de várias espécies de micobactérias: M. avium, M. chelonae, M.abscessus, M.
fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrafulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M.
malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M. xenopi e CMT (COUTO et al.,
2010; RICHTER et. al., 2006) e mais recentemente, o Kit de detecção de micobactérias
(Speed-oligo Mycobacteria, Vircell) que é um método baseado em PCR para região ITS 16S23S acoplado a um dispositivo de vareta de medição que permite uma rápida, sensível e alta
detecção específica do género Mycobacterium e 12 espécies diferentes de micobactérias:
complexo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum), complexo
M. avium-intracellulare-scrofulaceum, M. chelonae-abscessus, M. kansasii, M. fortuitum e M.
gordonae.
1.9 TRATAMENTO DAS MNT
A American Thoracic Society (ATS/USA) e a Infectious Diseases Society of America
(IDSA/USA) elaboraram, em 2007, diretrizes referentes ao diagnóstico, tratamento,
prevenção de doenças causadas por MNT e trazem recomendações para o monitoramento e a
duração do tratamento, que deve ser continuado por no mínimo 12 meses após a obtenção de
resultado negativo na cultura (GRIFFITH et al., 2007). Alguns regimes de tratamento são
apresentados no Quadro 5.
40
Quadro 5. Regimes de tratamentos recomendados para as mais frequentes micobactérias não
tuberculosas associadas à doença pulmonar
Espécies
M. malmoense
MAC
M. xenopi
M. kansasii
M. gordonae
M. chelonae
M. fortuitum
M. abscessus
Tratamento
RIF, INH e EMB ± macrolídeo ± quinolona
RIF, EMB e macrolídeo. Incluir aminoglicosídeo para doença
cavitária. Se houver resistência ao macrolídeo, usar RIF, INH,
EMB e AMC/STR (primeiros 3-6 meses).
Administrar 3 vezes por semana para doença limitada e
diariamente para as formas mais extensas
CLA, RIF, INH, EMB ± STR (primeiros 3-6 meses)
RIF, INH e EMB. Se houver resistência a RIF, usar INH,
EMB, STX, + AMC/STR (primeiros 3-6 meses)
2 agentes com susceptibilidade in vitro
CLA + agente adicional (susceptibilidade in vitro)
2 agentes com susceptibilidade in vitro
Macrolídeo + 1-2 agentes adicionais ± ressecção se a doença
for limitada
Notas: rif: rifampicina, inh: isoniazida, emb: etambutol, amc: amicacina, str: estreptomicina, cla: claritromicina,
stx: sulfametoxazol.
Fonte: traduzido de Mcgrath, Mccabe e Anderson (2008) apud da Costa (2012).
Igualmente ao tratamento da TB, devem ser combinados pelo menos dois fármacos,
visando evitar a seleção de cepas resistentes. Muitos são os esquemas utilizados para o
tratamento das MNT, entretanto, ainda são poucos os estudos randomizados relacionados a
este tema para grande parte das espécies. Sabe-se que para alguns fármacos e espécies, não há
correlação da susceptibilidade in vitro com a resposta efetiva aos antibióticos in vivo
(GRIFFITH, 2010).
O tratamento dos pacientes com MNT representa um desafio maior que o da
tuberculose devido ao longo período de tratamento, maior custo, maior toxicidade e maior
possibilidade de falência. Fatores que contribuem para este cenário são a correlação variável
entre os testes de sensibilidade, a resposta in vivo e resistência induzida aos macrolídeos no
M. abscessus e MAC (GRIFFITH & AKSAMIT, 2012).
As reações adversas são comuns devido ao grande número de antibióticos utilizados
no tratamento (JENKINS et al., 2008). Caso seja possível, regimes mais simples são
recomendados como a administração de antimicrobianos três vezes por semana na tentativa de
minimizar estes efeitos (COWMAN et al., 2012).
Algumas MNT (exemplo: M. abscessus) são intrinsicamente resistentes a diversos
fármacos, e a cura pode não ser possível. Procedimentos cirúrgicos pulmonares podem ser
considerados em pacientes que apresentem resistência a antimicrobianos ou aqueles que não
41
respondem ao tratamento. Em pacientes debilitados, com múltiplas co-morbidades, uma
abordagem mais conservadora pode ser apropriada (COWMAN et al., 2012).
2 JUSTIFICATIVA
As micobactérias não tuberculosas têm surgido como microorganismos importantes
relacionados a doenças respiratórias e outras doenças oportunistas.
No Brasil, a maioria dos trabalhos realizados com MNT estão concentrados na região
Sudeste (São Paulo e Rio de Janeiro), são poucos os centros hospitalares e de pesquisa que
realizam identificação de MNT. Na região Norte, não há um serviço de referência na
identificação e caracterização de MNT.
Para identificação destas micobactérias, os testes fenotípicos são amplamente
utilizados nos laboratórios de Saúde Pública, mas não possibilitam a definição precisa da
espécie, assim os recursos convencionais têm deixado lacunas importantes no que se refere à
determinação de infecções por micobactérias.
Após o conhecimento da diversidade de espécies de MNT em Rondônia de isolados
clínicos (MENDES DE LIMA et al, 2013), resolvemos estudar isolados ambientais das
residências dos pacientes infectados por MNT e correlacionar com os isolados clínicos desses
pacientes, para identificar uma possível fonte de infecção em seu ambiente. Não conhecemos
quais espécies predominam nas tubulações dos sistemas de distribuição de água potável das
residências, quais micobactérias no solo que os pacientes têm contato, uma vez que a maioria
possue quintais em suas residências, trabalha ou trabalhou no contato com solo (agricultura) e
qual a integridade da sua água de consumo, já que muitos utilizam poços, igarapés e rios
comuns para abastecimento das residências e ou atividades de lazer.
Levando em conta esses fatores, foi proposta a realização de um estudo sobre a
frequência e caracterização genotípica a fim de determinar o perfil de MNT existentes no
Estado. Além disso, foram isoladas espécies de MNT de amostras ambientais das residências
dos pacientes que adquiriram infecção. Com este estudo será possível determinar quais as
espécies mais comuns de MNT que circulam em Rondônia, correlacionando os isolados
identificados no ambiente e sua potencial patogenia.
42
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Descrever a diversidade das espécies de micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT)
em casos com doença pulmonar e associar com isolados de micobactérias ambientais a fim de
avaliar qual a possível fonte de infecção em Rondônia.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar as espécies de Mycobacterium em casos de doença pulmonar e selecionar
residências para realizar o estudo.
-Isolar e identificar micobactérias em amostras de água e solo próximo da residência dos
mesmos.
-Aplicar o PRA-hsp65 como metodologia de identificação molecular.
- Realizar o sequenciamento parcial dos genes RNAr 16S e hsp65 em isolados não
determinados pela metodologia de PRA-hsp65.
- Verificar se existe correlação entre os isolados clínicos e ambientais.
43
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 AMOSTRAGEM
No período de janeiro de 2008 a dezembro de 2013 foi realizado um estudo com 139
isolados de 80 indivíduos sintomáticos respiratórios. Desses, 76 isolados foram provenientes
de 21 pacientes conforme os critérios da American Thoracic Society (ATS) e 63 isolados de
59 pacientes com cultura única.
Os isolados foram cedidos pelo acervo do Laboratório de Tuberculose e outras
Micobactérias/LACEN/RO, provenientes de pacientes atendidos nas Unidades de Saúde dos
municípios do Estado de Rondônia.
Os dados clínico-demográficos dos pacientes foram coletados através de um
questionário (Apêndice A).
Os dados foram obtidos através da ficha preenchida para
solicitação de cultura para micobactérias e prontuários de atendimento dos pacientes.
As amostras ambientais foram coletadas durante o período de fevereiro a outubro de
2014, provenientes de 15 residências, sendo 13 residências dos 21 pacientes segundo critérios
da ATS (2007) e duas residências de pacientes com cultura única. Foram coletadas 33
amostras de água, 15 amostras de solo e 41 de biofilmes.
Os experimentos foram realizados no Laboratório Central de Rondônia com a
colaboração do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias do Instituto
Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro (FIOCRUZ) e o Laboratório de Bacteriologia e Micologia do
Instituto Evandro Chagas/PA.
4.2 ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA
Todos as culturas para obtenção dos isolados micobacterianos foram executados em
nível de biossegurança 2, em cabine de segurança biológica classe II/B. Os procedimentos
laboratoriais seguiram as normas conforme o Manual de Bacteriologia da Tuberculose, com
equipamentos de proteção individual como luvas, respirador N95, avental descartável, etc.
4.3 ASPECTOS ÉTICO-LEGAIS
O presente trabalho teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos da Universidade Federal de Rondônia em 14 de outubro de 2011, sob o FR 456278
CAAE: 0023.0.047.000-11 (Apêndice B).
44
Após contato telefônico, 13 dos pacientes com culturas positivas para MNT, segundo
critérios da ATS e dois pacientes com uma cultura positiva foram localizados e autorizaram
uma visita para coleta de amostras ambientais de suas residências. Todos os pacientes que
participaram da coleta ambiental assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido
(Apêndice C).
4.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídas todas as amostras de pacientes com infecção por MNT segundo a
ATS, pacientes com cultura única e pacientes com isolados suspeitos para MNT.
4.5 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
4.5.1 Culturas de Micobactérias de Amostras Clínicas
As amostras clínicas no LACEN/RO foram submetidas à baciloscopia para pesquisa
de BAAR pelo método Ziehl-Nielsen e ao cultivo para o isolamento das micobactérias. O
método de descontaminação foi por Lauril Sulfato de Sódio e/ou Hidróxido de Sódio,
conforme o meio de cultura utilizado Lowenstein Jensen (LJ) e/ou pelo método Ogawa Kudoh
de acordo com as orientações do Ministério da Saúde (BRASIL/MS, 2005, 2008).
Os
isolados foram incubados a 37° C por um período de uma a oito semanas. A distinção
presuntiva entre MNT e complexo M. tuberculosis foi realizada através do teste de inibição de
crescimento em meio LJ com PNB (0,5 mg/mL), no qual todas as espécies do complexo M.
tuberculosis não crescem. A avaliação fenotípica foi baseada na observação dos aspectos das
colônias (morfologia, pigmentação e tempo de crescimento) (BRASIL/MS, 2008).
Para identificação das MNT os isolados com duas culturas positivas do mesmo
paciente, segundo recomendações da ATS, 2007, foram enviados para o Centro de Referência
Prof. Hélio Fraga/FIOCRUZ/RJ (CRPHF) como rotina no Serviço de Laboratório de Saúde
Pública, por fazer parte de uma rede hierarquizada, por grau de complexidade das atividades
relacionadas ao Programa Nacional de Tuberculose/Ministério da Saúde, conforme nota
técnica 02/2009/CRPHF/MS.
Para compor o banco de cepas-LACEN/RO, todos os isolados micobacterianos são
armazenados em criotubos contendo duas alças de crescimento bacteriano em 1 mL de meio
liquído (meio líquido 7H9 com OADC e 10% de glicerol), conforme protocolo (BRASIL/MS,
2008). Além disso, duas alças de crescimento bacteriano são armazenadas em 400µL de TE.
45
As cepas são conservadas em condições ótimas para gerar novas culturas ou para a extração
de DNA e mantidas a -70º C de temperatura.
4.5.2 Isolamento de Micobactérias de Amostras Ambientais
4.5.2.1 Descontaminação e cultivo de micobactérias
Foram utililizadas duas metodologias de descontaminação: Para isolamento de
micobacterias do solo foi usado o método de descontaminação segundo Parashar et al.,
(2004) e para isolamento de amostras de água foi utilizada a técnica de descontaminação
disponível no Standard Methods for the Examination of Water & Wasterwater (2005).
Foram coletadas cinco gramas de solos e um litro de água, todas colhidas em frascos
de plásticos estéreis (Figura 5), sendo que nos frascos para coleta das amostras de água foi
colocado 1 mL de tiossulfato de sódio a 10%. As amostras foram transportadas a 4°C para o
Laboratório Central de Rondônia–LACEN/RO e processadas até 24 horas.
Figura 5- Coleta e transporte das amostras ambientais
46
No processamento das amostras de solo (PARASHAR et al., 2004), foram utilizadas
cinco gramas de solo em seguida foi acrescentado 20 mL de água destilada e homogeneizado
lentamente por 60 seg, depois foi centrifugado em 600Xg por 5min para obtenção de 10 mL
do sobrenadante, logo após as amostras foram centrifugadas em 8000Xg por 15min para
obtenção do pellet. Em seguida, o pellet foi ressuspenso em 20 mL da solução de tratamento
SDS 3% (Dodecil Sulfato de Sódio) e NaOH 4%. Essa solução homogeneizante foi dividida
em duas partes: Parte “A” foi incubada em temperatura ambiente por 15min. e a Parte “B”
incubada em temperatura ambiente por 30min. Depois foi centrifugada por 8000Xg por 15min
para obtenção do pellet. O pellet foi tratado com 20 mL de cetrimide 2%. Logo após, a Parte
“A” foi incubada em temperatura ambiente por 5min; A parte “B” em temperatura ambiente
por 15 min. Em seguida, centrifugada 8000Xg por 15min, suspendido o pellet em 20 mL de
água destilada, foi homogeinizado em vortex e centrifugado novamente por 15 min; A etapa
de suspensão em água destilada, vortex e centrifugação foram repetidas 3 vezes. Depois o
pellet foi ressuspenso em 0,5 mL de água destilada e 0,1 mL dessa suspensão foi semeado em
dois tubos contendo meio de cultura LJ e incubados em temperatura de 30°C e 37°C por 60
dias.
Para o processamento das amostras de água, o material foi tratado por um sistema de
filtração (Figura 6), utilizando membrana filtrante de nitrocelulose de 47 mm de diâmetro e
porosidade de 0,45 µm (Millipore). Em seguida, as membranas foram transferidas
assepticamente para um tubo cônico de 50 mL de polipropileno contendo pérolas de vidro
estéreis, adicionado 5 mL de água destilada estéril e agitado com auxílio das pérolas de vidro
por 5min em agitador mecânico (vortex). O volume obtido foi transferido para um novo tubo.
Sendo adicionado 10 mL de NaOH 1M por 2min, seguido de centrifugação a 8600Xg a 4°C
por 15min. O sobrenadante foi desprezado e adicionado 5 mL de ácido oxálico 5% por 20min.
Centrifugado novamente, o sobrenadante foi desprezado e adicionado 30 mL de água
destilada para neutralização. Agitou-se no vortex, centrifugou-se novamente e ressuspenso em
0,7 mL de água destilada. Foi acrescentada a solução indicadora (vermelho de fenol + NaOH
4%) até ao aparecimento da cor rósea. Em seguida foi utilizado 0,1 mL da alíquota deste
material e semeado em dois tubos com meio de cultura LJ com cicloheximida 500µg/ml e
incubados em temperatura de 30°C e 37°C, respectivamente, por 60 dias.
47
Figura 6- Sistema de Filtração a vácuo
4.5.3 Biofilmes
As amostras de biofilmes foram coletadas (Figura 7) e processadas pelo método
Ogawa-Kudoh. Este método é também conhecido como “New swab culture method”,
(KUDOH e KUDOH, 1974) e adaptado por Jordão Júnior (2008). Um swab estéril foi usado
para remover uma camada de biofilmes pré-existente nos encanamentos. Em seguida o swab
foi colocado em um tubo tipo falcon cônico com 2 mL de água destilada e logo após colocado
em caixa térmica e mantido sob refrigeração até o Laboratório do LACEN sendo processado
até 12h após a coleta. Na cabine de fluxo laminar, os swabs foram deixados por 2 min em
NaOH 4% para eliminar outras bactérias contaminantes, que não as do gênero
Mycobacterium, sensíveis a esta solução. O excesso da solução foi retirado pela compressão
do swab contra a parede do tubo, e semeado, em duplicata no meio de cultura Ogawa-Kudoh
e submetidos à incubação nas temperaturas de 30 e 37ºC, respectivamente, com observação
semanal.
48
Figura 7-Locais de coleta de biofilmes
A
B
D
C
A) chuveiro B) mangueira C) torneira cozinha D) torneira banheiro
4.5.4 Identificação Fenotípica
Os tubos incubados foram verificados semanalmente quanto à formação ou não de
colônias (Figura 8). Após o crescimento, foram obtidos esfregaços das colônias para
realização de leitura pela técnica de Ziehl-Neelsen (Z.N.). As culturas positivas suspeitas de
micobactérias, quando em crescimento com outros microrganismos foram descontaminadas
pelo Método de Petroff (BRASIL/MS, 2008) e as que apresentavam culturas mistas foram
separadas e em seguida foram novamente semeadas em tubos com meio de cultura LJ/OgawaKudoh e incubadas nas respectivas temperaturas de crescimento primário (30°C ou 37°C),
para obtenção de quantidades consideráveis de colônias puras. Posteriormente, foram
mantidas sob refrigeração até a caracterização e identificação.
49
Figura 8- Colônias de micobacterias em meio LJ com cicloheximida
A
B
A-colônia rugosa acromógena; B-colônia lisa cromógena.
As micobactérias isoladas foram identificadas quanto à resistência por álcool-ácido(BAAR), aspectos como temperatura, velocidade de desenvolvimento da colônia, morfologia
colonial e pigmentos (BRASIL/MS, 2008).
4.5.5 Armazenamentos dos isolados ambientais
Os isolados foram armazenados em criotubos contendo duas alças de crescimento
bacteriano, 1 mL de meio liquído (meio líquido 7H9 com OADC e 10% de glicerol),
conforme protocolo no Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras
Micobactérias. (BRASIL/MS, 2008). Foram conservadas em condições para gerar novas
culturas, mantidas à temperatura de -70ºC.
Para procedimentos de biologia molecular, foram retiradas duas alças de crescimento
bacteriano colocadas em criotubos com 400 µl de TE (tampão Tris/EDTA) e mantidas em
temperatura a -20º até o momento da extração do DNA bacteriano.
4.6 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
4.6.1 Extração e purificação de ácidos nucléicos micobacterianos
O protocolo de extração utilizado seguiu as condições estabelecidas por Chimara et al.
(2004). Os isolados de micobactérias (clínicos e ambientais) que estavam armazenados em TE
50
foram descongelados e agitados em vórtex. Em seguida foram submetidos ao banho-maria a
99°C por 20 min. Depois do banho-maria as amostras foram congeladas a -20°C no período
de 12 a 14 horas. No momento do uso foram descongeladas e submetidas à centrifugação 12
000 rpm por 60 seg. Em seguida 200µl do sobrenadante (DNA) foi submetido a purificação
pelo kit QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany). Resumidamente, foi adicionado 20
μL de proteinase K (Qiagen) a 20mg/mL e 200 μL de tampão AL (Qiagen), seguindo-se
incubação a 56ºC durante 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 200 μL de etanol absoluto e
a solução foi homogeneizada, sendo então transferida para a coluna QIAamp, seguindo-se a
lavagem com os tampões AW1 e AW2 (Qiagen). O DNA foi posteriormente eluído, através
da adição de 200 μL de tampão AE (Qiagen), incubação à temperatura ambiente por 5
minutos, seguido de centrifugação a 8000 rpm durante 1 minuto. O DNA foi armazenado
para ser utilizado em todos os estudos moleculares.
4.6.2 Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição enzimática do produto de
PCR de hsp65 (PRA-hsp65)
4.6.2.1 Amplificação do fragmento de 441pb do gene hsp65
O PRA-hsp65 foi utilizado como método molecular preconizado pelo Ministério da
Saúde para identificação de MNT (BRASIL/MS,2008). Inicialmente, um fragmento de 441 pb
do gene hsp65, fragmento de Telenti, foi amplificado com os oligonucleotídeos TB11 (5’
ACCAACGATGGTGTGTCCAT 3’) e TB12 (5’ CTTGTCGAACCGCATACCCT 3’), como
descrito previamente (TELENTI et al, 1993). M. tuberculosis H37Rv foi incluído como
controle positivo das reações.
Para cada amostra foram utilizados 12,5 μL de mistura reativa (MIX - Kapa
Biosystems), 2μL de cada iniciador e 4 μL de DNA (template). O DNA foi submetido a
desnaturação a 94°C por 5 minutos, seguido de 45 ciclos de 94°C por 1 minuto, 60°C por 1
minuto e 72°C por 1 minuto. O último passo foi uma extensão do DNA a 72°C por 7 minutos,
realizada em termociclador (Applied Biosystems).
Os produtos amplificados na PCR foram submetidos à eletroforese (100V) por 1 h em
gel de agarose 2% preparado com TBE 1X, corado com brometo de etídio e visualizados no
transluminador de UV. Utilizou-se o marcador de peso molecular 100pb (Invitrogen) como
referência. O produto amplificado, depois de comprovado o tamanho do fragmento de 441pb,
foi submetido à digestão por enzimas de restrição (Figura 9).
51
Figura 9-Gel de agarose 2% demonstrando o fragmento de 441 pb obtido por PCR
441 pb
100pb
4.6.2.2 Digestão Enzimática
Foram utilizadas as enzimas de restrição BstEII (5’-G↓GTNACC-3’ e 3’CCANTG↑G-5) e a HaeIII (5’-GG↓CC-3’ e 3’-CC↑GG-5’) (Promega). Duas alíquotas de 10
μL do material amplificado foram digeridas pelas enzimas para a identificação da espécie
micobacteriana. As reações enzimáticas de restrição HaeIII e BstEII aconteceram durante 12
horas a 37ºC e 60ºC, respectivamente.
4.6.2.3 Eletroforese
Um total de 15 µL do produto de restrição foi submetido a eletroforese em gel de
agarose 4% a 5V/cm. Para o cálculo do número e do tamanho dos fragmentos, foi usado como
referência os marcadores moleculares de 25pb e 50pb, respectivamente, nas bordas e no
centro do gel (Figura 10).
Após a eletroforese, os produtos foram visualizados e registrados no sistema de
detecção BioImaging Systems (UVP, EUA). Os perfis de PRA foram analisados por simples
comparação visual com os marcadores de peso molecular, sendo interpretados com algoritmos
publicados disponíveis no PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html) (Figura 11).
52
Figura 10- Gel de agarose 4% contendo perfis de PRA após digestão com as enzimas de
restrição BstE II e Hae III
M
M
BstE II
M
BstE II
M
Hae III
M
M
Hae III
Figura 11 – Páginas do site para análises do tamanho dos fragmentos (PRASITE)
Fonte: http://app.chuv.ch/prasite/index.html
4.6.3 Sequenciamento de DNA
O sequenciamento foi realizado no laboratório de Bacteriologia e Micologia do
Instituto Evandro Chagas/PA e Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a MicobactériaFiocruz/RJ.
53
4.6.3.1 Amplificação dos alvos moleculares
Para amplificação dos alvos RNAr 16S e hsp65 foram utilizados os iniciadores
descritos no Quadro 6. Os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose D-1
Low EEO 1% (Pronadisa, Madri, Espanha), corado com SyberSafe (Invitrogen). Após a
eletroforese, os produtos foram recortados do gel e purificados com o sistema S.N.A.P.TM
Gel Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, EUA). Os procedimentos foram realizados no
Laboratório de Bacteriologia e Micologia do Instituto Evandro Chagas/PA.
Quadro 6. Iniciadores dos genes de sequenciamento
Marcadores
Sequências (5’
3’)
Tamanho dos
produtos (pb)
Referências
~ 919
16S-27f (AGA GTT TGA TGG CTC AG)
DNAr 16S
Lane et al., 1991
16S-907r (CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT)
644
HSPF3 (ATC GCC AAG GAG ATC GAG CT)
hsp65
Kim et al., 2005
HSPR4 (AAG GTG CCG CGG ATC TTG TT)
hsp65
441
TB11F ( ACCAACGATGGTGTGTCCAT )
Telenti et al., 2003
TB12R (CTTGTCGAACCGCATACCCT )
4.6.3.2 Sequenciamento nucleotídico e análise de sequências
Os produtos de amplificação foram diretamente sequenciados, utilizando 3,4 pmol/uL
de cada iniciador utilizando BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, conforme
recomendação do fabricante (Applied Biosystems). Posteriormente, os produtos foram
purificados em BigDye® XTerminatorTM Purification Kit, ambos de acordo com as
recomendações do fabricante (Applied Biosystems), e submetidos a eletroforese capilar no
analisador genético ABI3130 (Applied Biosystems).
As sequências geradas foram alinhadas pelo método hierárquico de múltiplos
alinhamentos
(ClustalW)
no
programa
BioEdit
[http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]).
As
(versão
7.0.9;
similaridades
com
Tom
Hall
sequências
relacionadas obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) foram analisadas
no programa MegAlign (versão 7.0; DNAStar [http://www.dnastar.com]).
Para a sequência de identificação do gene hsp65 das micobactérias não tuberculosas,
os pesquisadores consideram que a identificação pode ser confiável quando a comparação
entre a sequência da amostra e da cepa tipo apresentarem identidade superior a 97%, segundo
54
critérios padronizados (MCNABB et al., 2004). Para as avaliações das sequências de
identificação do gene RNAr 16S espera-se identidade igual ou superior a 99% entre a amostra
avaliada e a cepa de referência (COSTA et al., 2010; TORTOLI, 2010). Estes valores foram
considerados e aplicados nas análises dos resultados do sequenciamento genético do DNA das
micobactérias isoladas do ambiente e de amostras respiratórias.
A árvore filogenética foi construída baseadas no método de neighbour-joining (NJ)
utilizando
o
programa
BioEdit
(versão
7.0.9;
Tom
Hall
[http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]). Foi utilizado o gênero Tsukamurella
tyrosinosolvens como grupo externo e o M. tuberculosis como espécie intimamente
relacionada com as MNT.
55
RESULTADOS
5.1 ASPECTOS ESPIDEMIOLÓGICOS
Dos 80 pacientes avaliados, 53 (66%) foram do sexo masculino com idade variando
dos 14 aos 88 anos enquanto 27 (34%) pacientes eram do sexo feminino com idade variando
entre 18 a 76 anos. A média de idade do grupo estudado foi de 51 anos. Dos 21 pacientes, de
acordo com as normas ATS, 14 (67%) eram do sexo masculino e 7 (33%) do sexo feminino,
com a média de idade de 57 anos. A análise da procedência da população estudada está
demonstrada na tabela 5.
Tabela 5- Distribuição dos pacientes segundo a procedência da amostra
Municipios
N
%
Porto Velho
45
56,2
Ji Paraná
11
14
Ariquemes
6
7,5
Cacoal
3
4,0
Ouro Preto do Oeste
2
2,5
Pimenta Bueno
2
2,5
Vale do Paraíso
2
2,5
Alvorada
1
1,25
Candeias do Jamari
1
1,25
Cerejeira
1
1,25
Cujumbim
1
1,25
Guajará Mirim
1
1,25
Machadinho do Oeste
1
1,25
Nova Mamoré
1
1,25
Rolim de Moura
1
1,25
São Miguel do Guaporé
1
1,25
Total
80
100
Dos 80 pacientes analisados, 49 (61,2%) apresentaram história prévia de TB.
Considerando os 21 pacientes (ATS), 19 (90,5%) realizaram tratamento prévio para
tuberculose com diagnóstico baseado na baciloscopia do escarro. Em média, os pacientes
receberam dois tratamentos para tuberculose antes do diagnóstico de MNT.
56
Quanto ao encerramento do tratamento pelos pacientes, 4 (19%) tiveram alta por cura;
5 (24%) pacientes continuavam em tratamento até ao final da coleta de dados do estudo; 3
(14,3%) pacientes haviam abandonado o tratamento; 1 (5%) paciente não fez tratamento para
MNT , dois (9,5%) pacientes não contava informações sobre o encerramento e 7 (33%) foram
a óbito.
Foi avaliada a atividade profissional desses pacientes conforme o risco de contato
oferecido com fontes potencialmente reconhecidas como reservatório de MNT (solo e fontes
de águas naturais ou tratadas de diversas fontes) segundo os estudos de Falkinham III (1996).
As profissões foram então incluídas em dois grupos: os pacientes pertencentes ao grupo 1
foram considerados expostos ao risco biológico de contrair MNT enquanto no grupo 2 foram
incluídos os pacientes sem risco biológico (Tabela 6).
Tabela 6- Distribuição dos pacientes segundo o risco biológico de contrair infecção por MNT
de acordo com a atividade profissional
Grupo 1
Grupo 2
Atividade com risco biológico
Atividade sem risco biológico
Profissão
N°
Profissão
N°
Do lar
11
Estudante
3
Atividades Rurais
21
Presidiário
6
Morador de rua
1
Aposentado
8
Garimpeiro
1
Motorista
2
Catador de lixo
2
Comerciante
1
Eletricista
3
Soldador
1
Pedreiro
1
Funcionário Público
1
Cobrador de linhas rurais
1
Engenheiro
1
Subtotal
41
23
Sem registros
16
Total
80
A tabela 6 mostra a distribuição dos pacientes conforme o risco biológico. Quarenta e
um (64%) pacientes exerciam atividade profissional com risco biológico de contrair MNT.
Vinte e três (35%) pacientes não apresentaram risco de contrair MNT nas atividades
profissionais desenvolvidas. Dezesseis (20%) pacientes não foram observados registro das
profissões nas suas fichas.
57
5.2 IDENTIFICAÇÃO DAS MNT
5.2.1 PRA-hsp65 e sequenciamento parcial dos genes RNAr 16S e hsp65
Os isolados dos 21 pacientes que atendiam os critérios de diagnóstico da ATS foram
enviados pelo LACEN/RO para serem identificados pelo Centro de Referencia Prof. Helio
Fraga (CRPHF/Fiocruz) como rotina para diagnóstico. Os isolados foram submetidos à
metodologia PRA-hsp65, método esse também recomendado pelo Ministério da Saúde
(BRASIL/MS, 2008). No entanto, apesar da identificação ser realizada pela técnica PRA, o
CPFRH não enviou para o LACEN/RO o perfil de PRA desses isolados. Neste estudo, para
obtenção do perfil de PRA, um isolado de cada paciente do grupo ATS foi novamente
submetido à técnica PRA para obtenção dos perfis (Tabela 7).
Tabela 7 - Perfis gerados das espécies identificadas pelo PRA-hsp65 dos pacientes ATS
Espécie
BstEII
HaeIII
N°isolados
M.abscessus 2
235 210
200 70 60 50
30
M.abscessus 1
235 210
145 70 60 55
11
M.avium 3
235 210
145 130
10
M.avium 1
235 210
130 105
8
M.fortuitum 1
235 120 85
145 120 60 55
6
M.asiaticum 1
235 205
110 105
5
M. intracellulare 1
235 120 100
145 130 60
2
M.gilvum 1
440
180 145
2
M. gordonae 2
235 120 85
215 210
1
M.szulgai 1
440
130 105 100
1
Total
76
O sequenciamento foi realizado em um caso com a espécie M. avium 3 em que o PRAhsp65 apresentou o mesmo padrão para 7 espécies O isolado mostrou 99,75% de identidade
com M. avium ATCC 25291 (GQ153289.1).
Dos 63 isolados de cultura única que se encontravam no banco de cepas no
LACEN/RO, 28 isolados já se encontravam identificados em nível de espécie e 35 isolados
estavam sem identificação.
Os 35 isolados foram submetidas à identificação pelo PRA e sequenciamento parcial
dos genes RNAr 16S e hsp65 (Tabela 8).
Desses, 34 (85,7%) foram identificados em nível de espécie. Um isolado não
amplificou, impossibilitando a realização da técnica. A técnica PRA hsp65 identificou 10
(28,6%) isolados em nível de espécie, enquanto que o sequenciamento identicou 33 (94,2%)
isolados. Dos 24 isolados não identificados pela técnica PRA-hsp65, em 11(45,3%) cepas não
58
ocorreu a digestão quando foram submetidas às enzimas BstE II e Hae III, 5 (20,3%)
apresentaram digestão parcial, 1(4,1%) isolado quando submetidos a PCR não amplificou,
enquanto, 4(16,6%) apresentaram perfis diferentes que não se enquadram com os disponíveis
no PRASITE.
59
Tabela 8. Isolados de cultura única identificados pelo PRA-hsp65 e sequenciamento dos genes RNAr 16S e hsp65
Amostras
BstE II
Hae III
106613
320 115
140 65 60
60213
230 120 100
69813
Perfil compatível com
Sequenciamento por RNAr 16S *
Sequenciamento por hsp65*
M.mucogenicum 1
Mycobacterium (98%)
M. mucogenicum (99%)
130 115
M. gordonae 3
-
M. gordonae (99%)
320 115
140 90 60
M. mucogenicum 3
Mycobacterium (96%)
84011
235 120 100
145 105 80
M.malmoense 1
não realizado
não realizado
161508
235 120 85
145 120 60 55
M.fortuitum 1
M. fortuitum (97%)
-
87310
235 120 85
145 120 60 55
M.fortuitum 1
-
M. fortuitum (97%)
97010
235 120 85
145 120 60 55
M.fortuitum 1
-
M.fortuitum (97%)
52113
440
145 130
M.lentiflavum 1
-
M.lentiflavum (99%)
94909
235 120 85
145 120 60 55
M. fortuitum 1
-
M. fortuitum (99%)
47012
440
175 115 90
-
-
Nocardia sp (97%)
2512
235 120 85
130 85 60 50
perfil diferente
M. intracellulare (98%)
-
17508
320 115
145 130
perfil diferente
-
M.avium (99%)
88510
235 120 85
175 130
perfil diferente
-
M.gordonae (99%)
73511
320 115
130 115
perfil diferente
-
M.gordonae (98%)
0612
235 e 210
-
Digestão parcial
-
M.abscessus (100%)
23612
235 210
-
Digestão parcial
-
M. massiliense (100%)
50211
235 120 85
-
Digestão parcial
M. fortuitum (99%)
M. fortuitum (98%)
86713
-
150 130
Digestão parcial
Mycobacterium (99%)
Mycobacterium like M. neoaurum
45212
235 210
-
Digestão parcial
-
M. like kansasii (93%)
1313
-
-
sem digestão
Mycobacterium (98%)
Mycobacterium like M. celatum
60
Cont.
Sequenciamento RNAr 16S *
sem digestão
Tsukamurella tyrosinosolvens (98%)
Tsukamurella tyrosinosolvens (99%)
-
sem digestão
M. asiaticum (99%)
-
-
-
Sem digestão
M. terrae (98%)
Mycobacterium like M. terrae (93%)
71611
-
-
Sem digestão
-
Nocardia sp (99%)
74413
235 120 100
115 130
M. gordonae 3
-
M. gordonae (99%)
85011
-
-
sem digestão
M. brisbanense (98%)
M. fortuitum (98%)
49012
-
-
sem digestão
-
M. tuberculosis (98%)
100209
-
-
sem digestão
M. fortuitum 99%
-
91710
-
-
sem digestão
-
M.intracellulare (100%)
16412
-
-
sem digestão
-
15110
-
-
sem digestão
-
81310
-
-
sem digestão
-
17610
-
-
sem digestão
-
145909
-
-
sem digestão
-
123909
-
-
PCR não amplificou
-
-
Amostras
BstE II
Hae III
27513
-
-
28813
-
5112
Nota:
*
Perfil compatível com
(Similaridade (%) com sequências obtidas na base de dados do GenBank)
61
Dos 63 isolados de 59 pacientes de cultura única identificados, apresentaram as
seguintes espécies: 16 (25,4%) M. fortuitum, 9 (14,3%) M. intracellulare, 5 (8%) M.
gordonae 4 (6,3%) M. avium, 4 (6,3%) M.abscessus, 2 (3,2%) M. mucogenicum, 2 (3,2%)
M.tuberculosis,
1(1,6%)
M.
asiaticum,
1
(1,6%)
M.
boenickei,
1
(1,6%)
M.boucherdethonense, 1 (1,6%)M. chimaera, 1 (6,6%) Mycobacterim like M. celatum, 1
(1,6%) M. holsaticum, 1 (1,6%) M. kansasii, 1 (1,6%)M.lentiflavum, 1 (1,6%) M. malmoense,
1 (1,6%) M. massiliense 1 (1,6%) M. novocastrense, 1 (1,6%) Mycobacterim like M.
neonarum, 1 (1,6%) M. parmense, 1 (1,6%)M. sherisii, 1 (1,6%)M. simiae, 1
(1,6%)Mycobacterium like M. terrae, 1 (1,6%)M. tusciae. Além disso, foram identificadas
três espécies de bactérias que não fazem parte do gênero Mycobacterium, sendo: 2 (3,2%)
Nocardia sp, 1 (1,6%) Tsukamurella tyrosinosolvens e ainda 1 (1,6%) isolado sem
identificação (Tabela 9).
Tabela 9- Frequência de Isolados de cultura única identificados pelo PRA e
sequenciamento
Espécie
M.fortuitum
M. intracellulare
M.gordonae
M. avium
M. abscessos
M. mucogenicum
M. tuberculosis
M. asiaticum
M. boenickei
M.boucherdethonense
M. chimaera
Mycobacteriu.like M. celatum
M. holsaticum
M. kansasii
M. lentiflavum
M. malmoense
M. massiliense
M. novocastrense
Mycobacterium like M neonarum
M. parmense
M. sherisii
M. simiae
M. tusciae
Mycobacterium like M. terrae
Nocardia sp
Tsukamurella tyrosinosolvens
Sem identificação
Total
N° isolados
16
9
5
4
4
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
63
62
Dos 74 pacientes que tiveram isolados identificados para MNT as espécies mais
frequentes foram M. fortuitum observada em 16 (21,3%) pacientes, M. abscessus em 13
(17,3%) pacientes, M. intracellulare em 10 (13,3%) pacientes, M. avium em 7 (9,3%) e M.
gordonae em 5 (6,6%) pacientes (Tabela 10).
Tabela 10- Diversidade e frequência de MNT nos pacientes estudados (N=74)
identificadas pelo PRA e/ ou sequenciamento
MNT identificada
M. fortuitum
M. abscessos
M. intracellulare
M. avium
M. gordonae
M. asiaticum
M. mucogenicum
M. bouchedurhonense /M.fortuitum
M. fortuitum/M.abscessus
M. fortuitum/M.szulgai/M.gordonae
M. simiae tipo 2/M.avium
M. chimaera/M.intracellulare
M. boenickei
M. like kansasii
M. massiliensi
M. sherrisii
M. lentiflavum
M. like terrae
M. tusciae
M. like neonarum
M. parmense
M. novocastrense
M. holsaticum
M. malmoense
M.like celatum
M. gilvum
Total
N° de
Pacientes
16
13
9
7
5
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
74
%
21,34
17,34
13,34
9,34
6,68
4,00
2,68
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
1,33
100
De acordo com o tempo de crescimento, 17 espécies de crescimento lento (MCL) e 8
espécies de crescimento rápido (MCR) foram observadas.
Neste estudo a diversidade de espécie foi representada por 25 espécies de MNT, sendo
que o município de Porto Velho apresentou maior variabilidade com 19 (77%) espécies,
sendo 8 pacientes do grupo ATS e 32 pacientes cultura única, representando 66 isolados. As
63
espécies mais frequentes no município foram 19 (28,7%) M. abscessus, 12 (18,2%) de M.
avium, 11(16,6%) M. fortuitum, 5 (7,6%) M. intracellulare, 3 (4,5%) M. gordonae, 2 (3%) M.
asiaticum e 2 (3%) M. gilvum.
5.3 ISOLADOS AMBIENTAIS
Foram coletadas 89 amostras ambientais em 15 residências de pacientes, treze
residências dos pacientes segundo os critérios ATS e em duas residências de dois pacientes
com cultura única. Os pacientes são residentes dos municípios de Cacoal, Candeias do Jamari,
Jaru, Ji Paraná, Pimenta Bueno, Porto Velho e Rio Crespo (Figura 12).
As amostras ambientais foram provenientes de biofilmes do sistema de canalização
das residências, água e solo.
Figura 12- Municípios e números de amostras ambientais em que foram realizadas coletadas
no estado de Rondônia
10
6
40
2
13
9
9
Fonte: http://mapasblog.blogspot.com.br/2012/01/mapas-de-rondonia.html
Foram utilizados três métodos de descontaminação para o processamento das amostras
ambientais (biofilme, água e solo), porém, o método Ogawa-Kudoh foi utilizado somente nas
amostras de biofilmes – adaptado por Jordão Júnior, (2008). Após realização da
descontaminação independentemente do método utilizado, as 89 amostras foram semeadas
64
nos meios de cultura LJ com cicloheximida/e ou Ogawa Kudoh. Os esfregaços foram
realizados utilizando a técnica de coloração Ziehl Neelsen (Figura 13), após visualização de
crescimento das colônias.
Figura 13- Coloração de Ziehl Neelsen
A
B
A - Positivo; B - Negativo
Foram coletadas 33 amostras de água, 15 amostras de solo e 41 de biofilmes. Dentre
as 89 amostras, 40(44,9%) amostras apresentaram culturas positivas para micobactérias,
33(37%) culturas negativas, 14 (15,7%) contaminaram e 2 (2,2%) amostras apresentaram
bactérias que não fazem parte do gênero mycobacterium. Das 40 amostras, 6(15%)
apresentaram culturas mistas, totalizando 46 isolados de micobactérias, 3 isolados de
Nocardia sp, 1 isolado do gênero Kocuria sp.
Os 46 isolados de micobactérias, 25 (54,3%) foram isolados provenientes de
biofilmes, 10 (22%) isolados de água e 11 (24%) de solo. Destes, 27 (58,7%) apresentaram
crescimento rápido e 19 (41,3%) apresentaram crescimento lento (Tabela 11).
Tabela 11- Tipo de amostras ambientais isoladas com micobacteria
Amostras
N° de amostras N° de isolados
MCR
MCL
Biofilme
41
26
19
7
Água
33
10
3
7
Solo
15
10
5
5
Total
89
46
27
19
Os maiores números de culturas positivas para micobactérias foram obtidas a partir de
biofilmes, sendo 9 isolados de torneiras de banheiro, 7 isolados de chuveiros e 7 isolados
65
torneiras de cozinha, 2 isolados de mangueira e 1 isolado de torneira da lavanderia (Figura
14).
Figura 14- Número de culturas positivas para Micobactérias em relação aos locais de coleta
Foi analisado o percentual de crescimento de acordo com a temperatura de incubação.
Dos 46 isolados, 21 (45,6%) apresentaram crescimento na temperatura de 37°C, 11 (23,9%)
isolados apresentaram crescimento na temperatura 30°C e 14 (30,4%) cresceram em ambas as
temperaturas de incubação.
Dos 27 isolados de micobacterias que apresentaram crescimento rápido, 16 (59,2%)
apresentaram crescimento na temperatura a 37°C, 4 (14,8%) na temperatura de 30°C e 7
(25,9%) apresentaram crescimentos em ambas as temperaturas.
Dos 19 isolados micobacteriano que apresentaram crescimento lento, 5 (26,3%) na
temperatura a 37°C, 7 (36,8%) apresentaram crescimento na temperatura de 30°C, e 7
(36,8%) apresentaram crescimento em ambas as temperaturas.
5.3.1 Identificação dos Isolados Ambientais
Os isolados ambientais foram submetidos ao método PRA e ao sequenciamento de
parte dos genes RNAr 16S e hsp65 para identificação da espécie.
Dos 46 isolados ambientais, 45 (97,8%) foram identificadas em nível de espécie pelo
sequenciamento utilizando os genes hsp65 e RNAr16S. As espécies de MNT identificadas
66
foram M. fortuitum (n=19; 41,3%), M. gordonae (n=6;13%), MAC (n=4; 8,7%), Complexo
simiae (n=2;4,3%), M. mucogenicum (n=2;4,3%), Complexo terrae (n=2;4,3%), M.
cosmeticum (n=2; 4,3%), M. lentiflavum (n=2;4,3%), M. colombiense (n=2;4,3%), M.
heraklionense (n=1;2,2%), M. peregrinum (n=1;2,2%), M. ainchiense (n=1; 2,2%), M. szulgai
(n=1;2,2%) e Mycobacterium sp (n=1;2,2%).
Dos 46 isolados, a técnica PRA-hsp65 identificou 11(24%) em nível de espécie,
1(2,3%) isolado apresentou perfil compartilhado com várias espécies, 7(15,2%) apresentaram
padrão que não se encontra disponível no prasite (http://app.chuv.ch/prasite/index.html),
13(28,2%) isolados apresentaram digestão parcial das enzimas BstEII e/ou Hae III e em 14
(30,4%) isolados não ocorreu digestão das enzimas.
Os resultados de PRA-hsp65, bem como a comparação com o sequenciamento, estão
demonstrados na Tabela 12.
67
Tabela 12- Identificação e origem da amostra, velocidade de crescimento, resultado do PRA e sequenciamento dos genes hsp65 e RNAr 16S.
Registro
Residência
Local
Amostra
Crescimento
BstE II
Hae III
Identificação
Sequenciamento por RNAr16S*
0114
1
mangueira-Poço
Biofilme
rápido
-
140 120 100
digestão parcial
M. fortuitum (99%)
M. bribanense 95%
34 A14
1
poço
Água
rápido
235 120 85
145 135 85 55
perfil diferente
M.fortuitum (96%)
-
34B14
1
poço
Água
Lento
235 120 100
150 130 70
perfil diferente
M. gordonae (99%)
M. gordonae 99%
3114
2
chuveiro
Biofilme
rápido
-
145 130
digestão parcial
M.fortuitum (96%)
-
05A14
2
torn.coz
Biofilme
rápido
320 115
140 110 60
perfil diferente
M. mucogenicum( 98%)
05B14
2
torn.coz
Biofilme
rápido
-
-
-
-
Nocardia nilgatensis (99%)
1014
2
torn.coz.
Água
Lento
320 115
-
digestão parcial
32A14
2
Poço
Água
Lento
235 120 85
-
digestão parcial
Complexo terrae (97%)
-
32B14
2
poço
Água
Lento
235 120 100
-
digestão parcial
mycobacterium (98%)
M.lentiflavum (100%)
1314
3
torn.cozinha
biofilme
rápido
-
-
sem digestão
-
M. cosmeticum (80%)
1514
3
torneira
Biofilme
rápido
235 130 85
145 125 70 60
perfil diferente
M.fortuitum ( 99% )
Mycobacterium (99%)
MAC (95%)
MAC (99%)
banheiro
1414
3
torn.lavanderia
Biofilme
rápido
235 115
130 115 60
perfil diferente
M.fortuitum (98%)
-
1214
3
chuveiro
Biofilme
rápido
235 120 85
145 120 60 55
M.fortuitum 1
-
Nocardia
nigatensis/Mycobacterium sp
4014
3
Poço
Água
rápido
235 120 85
145 120 60 55
M. fortuitum 1
M. fortuitum (99%)
Mycobacterium (96%)
2914
4
horta
Solo
Lento
-
-
sem digestão
M. avium (97%)
-
3014
4
galinheiro
Solo
rápido
235 210
-
digestão parcial
M.peregrinum(98%)
Mycobacterium (97%)
2314
4
torneira cozinha
Biofilme
rápido
440 320
140 120 85
-
-
Kocuria sp. (99%)
3614
5
mangueira
Biofilme
rápido
235 120 85
-
digestão parcial
M. fortuitum (99%)
Mycobacterium (96%)
3914
5
plantações
Solo
rápido
320 115
145 130
M. lentiflavum 2
M. lentiflavum (96%)
-
4414
6
torn. banheiro
Biofilme
rápido
-
-
sem digestão
M. fortuitum (99%)
-
Nota:*similaridade (%) com sequências obtidas na base de dados do GenBank
68
Cont.
Registro
Residência
Local
Amostra
Crescimento
BstE II
Hae III
Identificação
45A14
7
chuveiro
biofilme
rápido
235120 85
145 120 60 55
M. fortuitum 1
M.fortuitum (97%)
-
45B14
7
chuveiro
biofilme
rápido
235 120 100
125 110 70
perfil diferente
M. gordonae (99%)
-
4714
7
torn.coz.
biofilme
Lento
235 120 100
130 115
M. gordonae 3
M. gordonae (98%)
-
5314
8
poço
Água
rápido
235 120 85
-
digestão parcial
M.fortuitum (99%)
mycobacterium (99%)
4814
8
Chuveiro
Biofilme
Lento
235 120 100
130 115
M. gordonae 3
M. gordonae (98%)
-
50A14
8
torn coz.
Biofilme
rápido
320 115
-
digestão parcial
M.mucogenicum (99%)
mycobacterium (99%)
50B14
8
torn.coz.
Biofilme
rápido
235 120 85
145 120 60 55
M. fortuitum 1
M. fortuitum (96%)
Mycobacterium (99%)
4914
8
torn.ban.
biofilme
Lento
235 120 100
130 115
M. gordonae 3
M. gordonae (98%)
M. gordonae (99%)
5814
9
torn. cozinha
biofilme
rápido
-
-
sem digestão
M.fortuitum (98%)
-
57A/14
9
torn.banheiro
biofilme
rápido
320 115
-
digestão parcial
MAC (95%)
-
57B14
9
torn.banheiro
biofilme
rápido
-
-
sem digestão
-
Mycobacterium (100%)
57C14
9
torn.banheiro
biofilme
rápido
sem digestão
M. aichiense (98%)
mycobacterium (99%)
56B14
9
chuveiro
biofilme
rápido
-
-
-
M.fortuitum (95%)
-
6114
9
quintal
Solo
Lento
-
-
sem digestão
ComplexoM. simiae (99%)
Complexo M. simiae (99%)
6214
9
solo ponte
Solo
Lento
235 120 85
145 130 70
perfil diferente
M.fortuitum (99%)
-
5914
9
igarapé casa
Água
Lento
235 210
140 90 80
sem digestão
-
M.heraklionense
6014
9
igarapé ponte
Água
Lento
-
-
sem digestão
-
M. szulgai
6414
10
mangueira
biofilme
rápido
-
-
-
-
Nocardia sp.(99%)
6314
10
chuveiro
biofilme
rápido
235 120 85
145 120 60 55
M. fortuitum 1
M.fortuitum (100%)
M.fortuitum (99%)
7314
10
quintal
Solo
Lento
235 210
-
digestão parcial
M.colombiense (99%)
M.colombiense (99%)
6614
12
torn.banheiro
biofilme
Lento
235 120 100
130 115
M.gordonae 3
M.gordonae (99%)
-
6814
12
chuveiro
biofilme
Lento
-
-
sem digestão
ComplexoM.simiae (97%)
Complexo M. simiae (99%)
76A14
13
torn.ban
biofilme
rápido
235 120 85
-
digestão parcial
M. fortuitum (99%)
Mycobacterium (99%)
69
Cont.
-
Nocardia nigatensis (99%)
sem digestão
MAC (96%)
MAC (99%)
-
sem digestão
MAC (99%)
M. colombiense (100%)
235 120 85
145 125 60 55
M.fortuitum 1
M.fortuitum (99%)
-
Lento
320 115
-
digestão parcial
-
Complexo M. terrae (99%)
biofilme
rápido
-
-
sem digestão
-
M. cosmeticum (99%)
Solo
rápido
-
-
sem digestão
M. fortuitum (97%)
-
Registro
Residência
Local
Amostra
Crescimento
BstE II
Hae III
76B14
13
torn.ban
biofilme
rápido
-
-
8014
13
horta
Solo
Lento
-
-
8114
13
quintal
Solo
Lento
-
8314
14
quintal
Solo
rápido
8214
14
rio
Água
8714
15
torn.banheiro
8914
15
quintal
Identificação
70
5.3.2 Genes RNAr 16S, hsp65 e análise filogenética
Em nove isolados o gene RNAr 16S identificou apenas o gênero mycobacterium,
enquanto o hsp65 identificou 10 isolados em nível de espécie. Entretanto, o gene RNAr 16S
em 2 isolados alcançou um maior poder discriminatório com 100% de identidade para as
espécies M.colombiense e M. lentiflavum, respectivamente (tabela 13).
Tabela 13- Poder discriminatório entre os genes RNAr 16S e hsp65
Registro
Espécie
Identidade(%)
hsp65
99
Espécie
0114
M.fortuitum
32B14
Mycobacterium
99
M.lentiflavum
99
1514
M. fortuitum
99
Mycobacterium
99
4014
M. fortuitum
99
M.fortuitum
96
3014
M.peregrinum
98
Mycobacterium
97
3614
M. fortuitum
99
Mycobaterium
96
5314
M.fortuitum
99
Mycobaterium
99
50 A14
M. mucogenicum
99
Mycobaterium
99
50B14
M.fortuitum
96
Mycobaterium
99
57C14
M.aichiense
98
Mycobaterium
99
76 A14
M.fortuitum
99
Mycobaterium
99
8114
MAC
99
M.colombiense
100
M.brisbanense
Identidade(%)
RNAr16S
95
Anteriormente as sequências foram alinhadas a partir do BioEdit através do software
de múltiplos alinhamentos (ClustalW) . A construção da árvore filogenética seguiu o método
do “critério otimizado” (máxima parcimônia-MP e máxima probabilidade (likelihood)-ML),
já que se trabalhou com caracteres discretos (sequências nucleotídicas), e Neighbor Joining
(NJ), utilizando o software Bootstrap em 1000 vezes. O método MP escolhe a árvore que
requer as menores mudanças evolutivas, e o ML, escolhe a árvore que, de todas, é a que mais
comumente produziu o dado observado. O NJ é um algoritmo usado para construir a árvore
mais curta (mínima evolução). A Figura 15 mostra as sequencias alinhadas e abaixo a figura
16 ilustra a árvore mostrando a relação entre as amostras ambientais e as clínicas.
Figura 15- Alinhamento das sequências no programa Bioedit das amostras ambientais e clínicas
71
72
Figura 16 -Árvore filogenética ilustrando a análise da sequência parcial do gene hsp65
reunindo as amostras ambientais e clínicas
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Nota: (*) amostras clínicas
Os isolados provenientes de coleta do ambiente tiveram as seguintes distribuições em
nível de espécies: Biofilmes: M. fortuitum (13), M. gordonae (5), M. cosmeticum (2), M.
mucogenicum (2), complexo M. simiae (1), M. aichiense (1) e mycobacterium sp (1). Isolados
provenientes de água: M. fortuitum (3), complexo M. terrae (2), MAC (1), M. gordonae (1),
M. lentiflavum (1), M. heracklionense (1), M. szulgai (1). Isolados de solo: M. fortuitum (3),
73
MAC (3), M. lentiflavum (1), M. colombiense (1), M. peregrinum (1) e complexo M. simiae
(1) (Tabela 14).
Tabela 14- Origem dos isolados de Micobactérias identificadas pelo PRA e sequenciamento
Espécies
Água
Solo
Biofilme
Total
M. fortuitum
3
3
13
19
M. gordonae
1
-
5
6
MAC
1
3
1
5
M.cosmeticum
-
-
2
2
M. mucogenicum
-
-
2
2
M. lentiflavum
1
1
-
2
Complexo terrae
2
-
-
2
Complexo simiae
-
1
1
2
M. aichiense
-
-
1
1
M. colombiense
-
1
-
1
M. heraklionense
1
-
-
1
M. peregrinum
-
1
-
1
M. szulgai
1
-
-
1
Mycobacterium sp
-
-
1
1
Total
10
10
26
46
5.4 COMPARAÇÃO DAS ESPÉCIES DE MNT ENTRE OS ISOLADOS CLÍNICOS E
AMBIENTAIS
Nas 15 residências onde foram realizadas coletas ambientais, 3 (15%) residências
apresentaram as mesmas espécies de MNT tanto no ambiente quanto na infecção do paciente.
Na residência 2: M. fortuitum; residência 6: M. fortuitum; residência 7: M. fortuitum
(chuveiro) e M. gordonae (dois locais) (Tabela 15).
Tabela 15- Micobactérias isoladas das residências relacionadas com as espécies de infecção
dos pacientes infectados
Residência
Isolados Ambientais
Isolados Clinicos-Pacientes
2
6
M. fortuitum (1), mucogenicum (1), M. intracellulare
(1), M. terrae (1), M.lentiflavum (1), Nocardia sp
(1).
M. fortuitum (1)
7
M.fortuitum (1), M. gordonae (2)
M.fortuitum(1),M. bouchedurhonense
(1)
M.abscessus subsp. bolleti (3), M.
fortuitum (2)
M.fortuitum (2) M.szulgai (1)
M.gordonae (1)
74
Analisando os isolados da residência 7, em relação ao M. fortuitum, na comparação
das sequências do isolado clínico com a cepa de referência InDRE Guerrero 538DT65
observou-se 98% e 97%, respectivamente, de similaridade. No entanto, em relação ao M.
gordonae foi observada 96% de identidade no isolado do chuveiro, 97% no isolado da
torneira da cozinha e 100% de identidade em relação à cepa de referência FJ09022. Foi
aplicada a técnica PRA nesses isolados, os perfis gerados foram iguais para M. fortuitum tipo
1 nos isolados ambientais e clínicos, em relação a M.gordonae, os perfis apresentado nos
isolados ambientais foram M.gordonae tipo 3 e clínico M.gordonae tipo 2.
75
DISCUSSÃO
6.1 ASPECTOS CLÍNICOS E EPIDEMIOLÓGICOS
Com o crescente aumento da importância clínica das MNT surgiu a necessidade de
aprimorar a identificação e estudar a taxonomia deste gênero. Muitos trabalhos têm sido
realizados para melhorar o entendimento da epidemiologia das infecções causadas por
micobactérias e o conhecimento do nicho ecológico. Uma vez que cada espécie de MNT
apresenta um perfil específico de susceptibilidade aos antimicrobianos, a identificação da
espécie de micobactéria é fundamental, visando a adoção de conduta terapêutica adequada
(GRIFFITH et al., 2007; TORTOLI, 2009).
A capacidade das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) em produzirem
doenças está claramente documentada na literatura e a sua importância aumentou
progressivamente, com isolamentos cada vez mais frequentes, de espécies de MNT em
pacientes (FALKINHAM, 2003).
O Estado de Rondônia possui 52 municípios, desconhecemos a situação
epidemiológica dos casos de infecção por micobactérias na maioria dos municípios. Há
registros de poucos municípios que enviam amostras de escarro para cultura de micobactérias
no LACEN/RO.
Em relação à tuberculose, no estado de Rondônia, ainda não é rotina solicitar cultura
para os pacientes sintomáticos respiratórios que apresentam baciloscopia negativa em duas ou
mais amostras e ou baciloscopia positiva para identificação de espécie. É comum iniciar o
tratamento em casos que apresentam baciloscopia positiva, sem confirmação de espécie,
tratando pessoas para tuberculose com chances de apresentarem infecção por MNT
(MENDES DE LIMA, 2012), no entanto, essa situação não difere da maioria das outras
regiões do país. Em Rondônia o maior número de casos de infecção por MNT, está vinculado
ao sítio pulmonar (MENDES DE LIMA et al, 2013).
Por apresentarem sintomas semelhantes ao da TB, o diagnóstico de MNT pulmonar
está associado ao diagnóstico da tuberculose. O Programa Nacional de Controle da
Tuberculose (PNCT) considera o controle da doença como responsabilidade dos municípios
brasileiros, como competência da Atenção Básica à Saúde. Sendo assim, atribui aos gestores
municipais dar garantia de acesso ao diagnóstico laboratorial de qualidade e tratamento da
doença para a população (BRASIL/MS, 2010).
76
Neste estudo trabalhou-se com 80 pacientes, sendo 21 pacientes que atendem aos
critérios da American Thoracic Society (ATS) e 59 pacientes que não atendem.
Após
identificação dos isolados, seis pacientes de cultura única apresentaram isolados que não são
do grupo das MNT. Sendo, dois isolados do Complexo M. tuberculosis e quatro isolados são
de bactérias que podem também provocar doença pulmonar.
O município de Porto Velho apresentou o maior número de isolados (n=70, 50.3%),
representando 50% dos isolados. Isto se deve provavelmente ao fato de ser a capital e receber
pacientes de todo estado de Rondônia, oferecendo uma maior cobertura de exames.
Entretanto, é relevante ressaltar que os municípios com maior população, como Ji-Paraná,
Cacoal e Guajará Mirim possuem laboratório de cultura para micobactérias e, além disso,
podem estar atendendo os municípios vizinhos ampliando assim a cobertura de exames no
interior do Estado.
Os 53 pacientes que apresentaram cultura única para MNT, 40 (75%) não enviaram a
segunda amostra para confirmação de infecção por MNT. Dos 57 isolados desses pacientes,
39 (68,4%) isolados apresentaram espécies do grupo de micobactérias potencialmente
patogênicas. As espécies mais frequentes foram 16 (28%) M. fortuitum, 9 (15,8%) M.
intracellulare, 5 (8%) M. gordonae, 4 (7%) M. avium e 4 (7%) M.abscessus.
Segundo o PNCT, os municípios através do Programa Municipal de Controle da
Tuberculose devem realizar a “busca de sintomáticos respiratórios” - busca ativa permanente
na unidade de saúde e/ou no domicílio por meio do Programa Saúde da Família
(BRASIL/MS,2010). Neste estudo verificamos que todos os casos de MNT confirmados em
Rondônia foram por infecção pulmonar, deste modo as ações do Programa Municipal de
Controle da Tuberculose são importantíssimas para identificação dos casos de MNT, já que os
sintomas são semelhantes para as duas infecções (TB e MNT).
Estudos têm evidenciado a associação de MNT com doenças pulmonares estruturais
como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), bronquiectasias, fibrose cística,
tuberculose prévia, pneumoconioses e proteinose alveolar (PREVOTS et al., 2010;
WINTROP et al 2010). Considerando que 33 (62,2%) dos 53 pacientes do grupo de cultura
única desse estudo apresentaram histórico prévio de doença pulmonar ou realizaram
tratamento para tuberculose, podemos sugerir que esses indivíduos são susceptíveis a
desenvolverem infecção pulmonar por MNT. No entanto, não sabemos qual o desfecho e a
real situação desses pacientes, além disso, é importante ressaltar que os maiores números de
isolados foram de espécies de MNT que não são comuns fazerem parte da colonização
transitória no trato respiratório ou contaminação de amostra, exceto para M. gordonae que
77
foram isolados em cinco pacientes. É importante que o Programa de Controle de Tuberculose
dos municípios realize busca ativa de sintomáticos respiratórios e também a equipe do
programa estejam atentos e busquem também os casos em que os pacientes comparecem
somente com uma amostra na Unidade de Saúde. Diante dos fatos o que se pode inferir é que
o número de casos de doença por MNT no Estado pode estar subestimado.
No entanto, a presença de MNT no ambiente implica que isolados cultivados a partir
de um local do corpo não estéril, tal como o trato respiratório, pode resultar de contaminação
ou a presença ocasional de MNT em uma amostra. Por isso, é importante distinguir a
contaminação da doença verdadeira por MNT. American Thoracic Society (ATS) publicou
diretrizes para ajudar nessa distinção.
Considerando os 21 pacientes que atendem os critérios da ATS, 18(85,7%) realizaram
tratamento prévio para tuberculose com diagnóstico baseado na baciloscopia do escarro. Em
média, os pacientes receberam dois tratamentos para tuberculose antes do diagnóstico de
MNT. Semelhantemente, no Estado do Pará, da Costa et al. (2012) observou que a maioria
dos pacientes no período de 1999-2010 realizaram tratamento para tuberculose. O mesmo
grupo relata que no Brasil, era comum até 2009, quando não era observada nenhuma melhora
durante o primeiro tratamento da TB, iniciar tratamento de segunda linha para tuberculose
sem realizar exame de cultura para MNT. Castro (2012) afirma que o desconhecimento pelos
profissionais de saúde sobre este tipo de infecção leva ao atraso no diagnóstico e ao não
reconhecimento do problema.
Quanto ao encerramento dos pacientes segundo critérios ATS, um elevado número de
pacientes foi a óbito, 7 (33%) sendo que 4 (57%) apresentavam doença pulmonar causada por
M.abscessus. De acordo com estudos realizados por Andreják et al. (2010), na Holanda,
verificaram uma taxa de mortalidade de 40% em 5 anos em pacientes portadores de MNT na
forma pulmonar, como também estudos relatam que pacientes portadores de doença pulmonar
por M. abscessus, a taxa de mortalidade ficou em torno de 15% (GRIFFITH; GIRARD;
WALLACE, 1993; JARAND et al. ,2011).
Dos 74 pacientes com isolados para MNT, maior número de indivíduos foram do sexo
masculino (66%) e faixa etária média de 50 anos. Dos 21 pacientes segundo critérios ATS, a
média de idade foi de 57 anos e 66% foram do sexo masculino. Semelhantemente, estudos
realizados nos estados da Bahia, Rio de Janeiro e São Paulo mostraram maior prevalência em
homens, com 68%, 62% e 76,1% dos casos, respectivamente (MATOS et al, 2004; MELLO
et al, 2013; UEKI et al., 2005). Entretanto, recentes estudos apontam para maior frequência de
MNT em mulheres (CASSIDY et al., 2009; da COSTA et al., 2012; PREVOLTS et al., 2010).
78
Nos Estados Unidos a infecção pulmonar por MNT está aumentando, especialmente em
mulheres com mais de 50 anos de idade (MIRSAEIDI et al., 2014).
Dois pacientes (2,7%) apresentaram co-infecção com HIV. Sendo um paciente do
grupo ATS e um paciente de cultura única. Os dois casos apresentaram co-infecção com M.
avium e foram a óbito dentro do período de estudo. Entre os pacientes imunocomprometidos,
o MAC (M.avium e M. intracellulare) é um patógeno oportunista de grande preocupação
(WHILEY et al., 2012). Nos países desenvolvidos, em adultos HIV positivo a infecção por
MAC é a mais comum das bactérias oportunistas, com uma frequência anual de 10-20%
(KARAKOUSIS et al., 2004).
Atividades profissionais ou de lazer relacionadas ao solo e água foram pesquisadas nos
80 pacientes, sendo relatadas por 51 % dos pacientes. Do grupo segundo critérios ATS, 81%
exerciam atividades com fontes potencialmente reconhecidas como reservatório de MNT
(FALKINHAM, 1996; FALKINHAM, 2015). Em 2006, De Groote demonstrou que a terra
utilizada em atividades de jardinagem contém um número relativamente grande de MNT e seu
manuseio produz partículas inaláveis, suficientemente pequenas, capazes de atingir os
alvéolos (DE GROOTE et al, 2006). Atividades relacionadas ao solo também aumentaram o
risco relativo de infecção por micobactérias do complexo MAC, detectado através de testes
cutâneos (REED et al, 2006). Adicionalmente, a água é um importante reservatório desses
organismos, sendo que a transmissão pode ocorrer através da inalação de gotículas de água
contendo MNT (FALKINHAM, 2011; VON REYN et al, 1993). O principal grupo dos
indivíduos neste estudo exerce ou exerceu atividades relacionados à área rural (52%). De
acordo, com estudo no estado do Ceará, Castro (2012), encontrou trinta e sete (62,7%)
pacientes que exerciam atividade profissional com risco biológico de contrair MNT, além de
Barretto (2013) no Pará, 63% dos 27 pacientes analisados exerciam tais atividades.
6.2 ISOLADOS CLÍNICOS
Considerando os 133 isolados de MNT dos 74 pacientes, durante o período de estudo
(2008-2013), a diversidade de espécie foi representada por 25 espécies de MNT. As espécies
com maior frequência foram M. fortuitum observada em 16 (21,6%) pacientes, M. abscessus
em 13 (17,5%) pacientes, M. intracellulare em 9 (12,1%) pacientes, M. avium em 7 (9,4%) e
a espécie M. gordonae foi isolada em 5(6,7%) pacientes. Neste estudo, Rondônia mostrou
uma grande variedade de espécies. No Brasil, observou-se que existe diversidade de espécies
com diferentes frequências entre os diferentes Estados. Na região sudeste, Zamarioli et al.
79
(2008) encontraram em São Paulo 13 espécies em 194 isolados, associadas à infecção
pulmonar, com um maior número de isolamentos para M. kansasii, M. avium e M. fortuitum.
Na Baixada Santista (São Paulo) M. kansasii e M. fortuitum foram detectadas em indivíduos
HIV negativos, enquanto que M. avium foi mais frequente em HIV-positivos (PEDRO et al.,
2008). No estado do Rio de Janeiro, quatro espécies de micobactérias foram responsáveis por
85,6% das infecções por MNT: M. kansasii, 59 casos (33,9%), M.avium 53 (30,4%), M.
abscessus 23 (13,2%) e M. fortuitum 14 (8%) (MELLO et al, 2013).
Na região Norte do país, DA COSTA et al. (2012), no estado do Pará, descreveram
que as espécies mais frequentes nos casos pulmonares foram M. massiliense, M. simiae
complex, M. intracellulare e M. avium, no período de 1999 a 2010. Outro estudo, também
realizado por DA COSTA et. al., (2013) entre 2010 e 2012, oito espécies de MNT foram
identificados a partir dos 29 pacientes, obedecendo aos critérios da ATS, sendo, M.
massiliense (n = 13; 44,8%), M. avium (n = 3; 10,3%), M. intracellulare (n = 3; 10,3%), M.
abscessus (n = 2; 6,9%), M. bolletii (n = 1; 3,4%), M. moriokaense (n = 1; 3,4%), M.
fortuitum (n = 1; 3,4%), M. celatum (n = 1;3,4%) e M. kansasii (n = 1; 3,4%). Na região
Nordeste, no estado do Ceará, CASTRO (2012) estudando 59 pacientes com doença pulmonar
por MNT observou que as espécies mais frequentes foram M. abscessus 28,5% (17/59); M.
lentiflavum 18,6% (11/59) e M. avium, 16,6% (10/59). Ainda no Nordeste, no estado de
Pernambuco, LIMA (2014) identificou seis espécies de MNT a partir do isolamento em
cultura de amostras clínicas pulmonares de acordo com os critérios da ATS (2007), sendo 12
(57,1%) M. kansasii, 2 (9,5%) M. intracellulare, 2 (9,5%) M. abscessus subsp abscessus, 2
(9,5%) M. abscessus subsp bolleti, 2 (9,5%) M. fortuitum e 1 (4,8%) M. asiaticum.
No estado do Pará em seus estudos com micobactérias, DA COSTA (2009) sugere que
as diferentes frequências de espécies em relação à região sudeste podem estar associadas a
fatores ambientais, como por exemplo o solo que exerce importante influência na distribuição
geográfica de espécies, como relatado por Portaels (1995).
Dos 21 pacientes segundo os critérios ATS, 10 (48%) apresentaram infecção por M.
abscessus e entre os 53 pacientes com cultura única 4 (7,5%) apresentaram M. abscessus. A
classificação taxonômica da espécie M. abscessus ainda não está definida (GRIFFITH, 2015).
Considerando a última taxonomia proposta por LEÃO et al. (2011), definiu M. abscessus
subsp. abscessus como padrão PRA, M. abscessus tipo 1 e o M. abscessus subsp. bolletii
referente ao padrão PRA como M. abscessus tipo 2. Das 14 cepas identificadas, 10 (71,43%)
apresentaram M. abscessus subsp. bolletii (M. abscessus tipo 2) e quatro apresentaram M.
abscessus subsp. abscessus (M.abscessus tipo 1).
80
O M. abscessus é um bacilo de difícil tratamento, pois é altamente resistente a agentes
antimicrobianos e geralmente requer tratamento prolongado (> seis meses) com medicamento
intravenoso e antibiótico oral combinado. A infecção é muitas vezes implacável, apesar do
tratamento, e se o mesmo é aparentemente eficaz, a recaída é comum (THOMSON et al.,
2013a). Durante a coleta dos dados, foi observado que três pacientes com doença pulmonar
por M.abscessus não respondiam aos tratamentos. Dois desses pacientes fazem tratamento
para MNT há de mais de seis anos. Observamos que nos prontuários dos três pacientes foi
comum a presença do macrolídeo claritromicina, dentre as drogas prescritas para o
tratamento.
Estudos relatam que as espécies M fortuitum e M abscessus são frequentemente
resistentes a macrolídeos por causa da presença do gene ERM (erythromycin ribosome
methyltransferase) (GRIFFITH & AKSAMIT, 2012; NASH et al., 2005; VAN INGHEN,
2012). Os genes ERM representam uma família de genes codificadores de metilases, que
adicionam um ou mais grupos metil à adenina na posição 2058 do RNAr 23S. Essa
modificação impede a ligação dos macrolídeos ao ribossomo, o que reduz a atividade
inibitória desse agente antimicrobiano (ROBERTS et al., 2008). Outros mecanismos de
resistência do M. abscessus incluem enzimas que inativam ou modificam antibióticos e
bombas de efluxo de antibióticos (NESSAR et al. 2012).
Estudos realizados por JEON et al (2009) na Coreia do Sul analisando
retrospectivamente 65 pacientes com M. abscessus, observou negativação inicial do escarro
em 72% dos pacientes. Porém, a taxa de recaída foi de 19%. Em 28% dos casos, as culturas
continuaram positivas.
Nos Estados Unidos, o M. abscessus é responsável por mais de 80% de todas as
infecções pulmonares, dentro do grupo das micobactérias de crescimento rápido (MCR) e está
associada com uma taxa de mortalidade muito mais elevada do que qualquer outra (MCR)
(RIPOLL et al., 2009). Neste estudo, já foi citado que o maior número de pacientes que
evoluíram para óbito apresentavam doença pulmonar por M. abscessus.
Isolados de M. fortuitum foram os mais frequentes neste estudo nos pacientes de
cultura única. Essa espécie pode provocar infecções de pele, tecidos moles, pulmões e
articulações (BROWN-ELLIOTT & WALLACE, 2010; GRIFITH et al., 2007; SETHI et al.,
2014) em imunocompetentes e imunossuprimidos. Doenças cutâneas ocorrem por meio de
inoculação direta do meio ambiente e estão tipicamente associadas com procedimentos
médicos ou lesões traumáticas da pele. Casos recentes de M. fortuitum foram encontrados em
pós-operatórios, pós-injeções, cateteres intravenosos de longo prazo, e pós-lipoaspirações.
81
(BROWN-ELLIOTT & WALLACE, 2010; GRIFITH et al., 2007). No Brasil, surtos de M.
fortuitum em infecções cirúrgicas têm sido reportados, e um dos mais recentes ocorreu na
cidade de Campinas, em pacientes submetidas à mamoplastia de aumento (PADOVEZE et al.,
2007; SAMPAIO et al., 2006). Em Rondônia, os registros conhecidos de casos por M.
fortuitum provem todos do sitio pulmonar.
Neste estudo, as espécies M. avium e M. intracellulare estão entre as mais frequentes.
O M. avium foi a segunda espécie mais presente nos pacientes segundo o critério ATS. Entre
este grupo diversificado de organismos,
o
complexo
M. avium, que consiste
predominantemente de M. avium e M. intracellulare são agente etiológicos das espécies de
MNT mais comum em doenças, especialmente pulmonar (LAI et al., 2010; KIM et al., 2014),
e que afeta muitos países sobretudo pacientes imunocomprometidos (HAN, et al., 2005).
Dentre os isolados clínicos sem identificação e cultura única, duas espécies de
bactérias não pertencentes ao grupo das MNT foram identificadas pelo sequenciamento:
Tsukamurella tyrosinosolvens e Nocardia spp. Vários estudos comprovam a patogenicidade
dessas bactérias que também afetam o sitio pulmonar.
Quanto ao gênero Tsukamurella algumas espécies são bactérias comensais
encontradas no ambiente, tanto em solo quanto em água, e são bactérias oportunistas em
pacientes com infecção pulmonar crônica ou em pacientes imunodeprimidos (ALCAIDE;
ESPINOZA; ABBO, 2004)
O gênero Nocardia spp. são mais frequentes em doentes imunocomprometidos.
Alguns relatos indicam que mais de dois terços dos pacientes com diagnóstico de nocardiose
pulmonar foram inicialmente diagnosticados como tendo tuberculose e cerca de 5% dos
pacientes com tuberculose pulmonar comprovada apresentavam co-infecção com Nocardia
(PINTADO, et. al., 2003).
6.3 ISOLADOS AMBIENTAIS
Neste estudo, além das amostras clínicas de pacientes foram coletadas amostras
ambientais das residências dos pacientes que foram infectados por MNT com o objetivo de
identificar possíveis fontes de infecções, já que as MNT são habitantes normais das águas na
natureza, águas potáveis e do solo, trabalho pioneiro na região.
82
No Brasil, ainda não há relatos de estudos com isolados ambientais de micobactérias
das residências de pacientes infectados por MNT, não conhecemos quais as espécies
predominam no ambiente dos pacientes e sua relação com a infecção.
As coletas das amostras ambientais foram realizadas em 15 residências, sendo treze
residências de pacientes que atendem os critérios da ATS e duas residências de pacientes com
cultura única.
No presente estudo os 46 isolados ambientais de MNT, apresentaram 13 espécies
diferentes: M. fortuitum, M. gordonae, MAC, Complexo simiae, Complexo terrae, M.
mucogenicum, M. cosmeticum, M. lentiflavum, M. colombiense, M. heraklionense, M.
peregrinum, M. ainchiense e M. szulgai.
No Brasil, relatos sobre a diversidade de isolados ambientais é limitado, no entanto,
no estado de São Paulo, estudos ambientais com MNT foram realizados em sistemas de
distribuição de água potável. KANAI (2006) no sistema de abastecimento urbano na cidade
de São Carlos/SP, isolou várias espécies de MNT, dentre elas, M. lentiflavum, M. gordonae,
M. marinum, M. avium, M. abscessus, M. nonchromogenicum, mas a espécie predominante
foi M. lentiflavum representando 47,5% dos isolados. Outro estudo realizado por GASPARGRILLO (2012), no sistema de distribuição de água da cidade de Araraquara, isolou nove
espécies de MNT utilizando a técnica PRA-hsp65. As espécies foram M. lentiflavum, M.
parafortuitum, M. genavense, M. gordonae, M. fortuitum, M. confluentis, M.duvalii, M. avium
subespécie paratuberculose e M. szulgai.
Na região Norte do País, temos relatos de um estudo realizado por RESTREPO et al.
(2009) na cidade de Manaus-AM, utilizando a técnica PRA na identificação de isolados de
águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas utilizadas nas etapas dos procedimentos
cirúrgicos, observando M. celatum tipo 2, M. gordonae tipo 3, M. gordonae tipo 6, M.
intracellulare tipo 1, M. lentiflavum tipo 3 e M. mucogenicum tipo 1.
Neste trabalho M. fortuitum foi a espécie mais comum com 19 isolados ambientais. É
uma espécie comumente isolada a partir de água tratada (VAEREWIJCK, et al., 2005), foi
encontrada fazendo parte de biofilmes em diversos sistemas hídricos (ESTEBAN et al., 2008),
afirmação que está em concordância com nossos resultados onde a maioria dos isolados de M.
fortuitum foram provenientes de biofilmes dos sistemas de canalização de água tratadas. As
MNT se adaptam perfeitamente em sistemas de encanamento de águas de edifícios, hospitais,
apartamentos e casas, compartilhando o mesmo ambiente com os seres humanos. Os
biofilmes em canalização se tornam uma fonte de infecção (FALKINHAM, 2015).
83
O M. fortuitum tem sido isolado de diferentes materiais clínicos e sua disseminação
no ambiente é um dos principais fatores que contribuem para infecções causadas por este
microrganismo. Em uma clínica especializada em cuidados de pacientes HIV positivos foram
contaminados 47 pacientes, e após investigação foi comprovado que os isolados pertenciam a
um mesmo grupo clonal, e que a fonte de contaminação era uma máquina de gelo (GEBO et
al., 2002).
Surtos têm ocorrido também em procedimentos não médicos, a exemplo de um surto
de infecção em mais de 100 clientes de um salão de beleza. Todas as pacientes haviam sido
submetidas a hidromassagem dos membros inferiores após procedimentos de pedicure e ou
depilação (SNIEZEK et al., 2003).
Das infecções cutâneas causadas por micobactérias de crescimento rápido M.
fortuitum é responsável por 60% das infecções causadas nos indivíduos imunocompetentes,
sendo que raramente causa doença pulmonar (SILVA et al., 2009).
A segunda espécie mais frequente nos isolados ambientais é o M. gordonae,
encontrado em biofilmes da torneira do banheiro, torneira da cozinha, chuveiro e em água de
poço. Esta micobactéria está amplamente disseminada no solo e na água (LALANDE, et al.,
2001). Além disso, é conhecida como “escotocromógeno de água de torneira” por ser muito
frequente nos sistemas de água de abastecimento e distribuição (VAEREWIJCK et al., 2005).
São comuns tanto em ambientes naturais como sintéticos (LEÃO et. al., 2005), além de
possuirem alta resistência ao cloro (PEDLEY et al, 2004). Na França, LALANDE et al.,
(2001) obtiveram isolados de M. gordonae em 69% das águas de refrigeração nas amostras de
um hospital. Estudos semelhantes realizados no Brasil, por JORDÃO JUNIOR et al. (2008),
no estado de São Paulo, com água de uma fazenda produtora de leite de búfala, isolou M.
gordonae em 82% de suas amostras colhidas no córrego, torneiras e biofilmes.
Apesar de ser considerada uma micobactéria raramente patogênica, já foi indicada
como
agente
etiológico
de
casos
de
surtos
de
micobacterioses
em
pacientes
imunocomprometidos (ECKBURG, et al., 2000). Além disso, recentemente, foi registrada na
Itália infecção de pele por M. gordonae em uma paciente imunocompetente (FOTI et al.,
2009). É importante salientar que em imunocomprometidos pode infectar os pulmões, sangue
e outros órgãos (FOTI et al., 2009; WEINBERGER et. al., 1992;). Diante dos resultados desse
estudo e outros relatos semelhantes de isolados ambientais de M. gordonae, seu isolamento do
ambiente das residências é um alerta para pacientes com sistema imunológico comprometido
para que evitem contato prolongado com fontes de infecção de suas próprias residências.
84
O complexo Mycobacterium avium (MAC) foi encontrado em isolados de 5
residências em ambientes como água e solo (SCHLOSSBERG, 2006; PFYFFER, 2006). Este
complexo agrupa as subespécies M. avium subsp. avium, subsp. silvaticum, subsp.
hominissuis, e subsp. paratuberculosis, bem como as espécies M. intracellulare, M.
arosiense,
M.
chimaera,
M.
colombiense,
M.
marseillense,
M.
timonense,
M.
bouchedurhonense e M. ituriense (FALKINHAM III, 2013).
Compreende micobactérias de crescimento lento, capazes de causar infecções em
diversas espécies de seres vivos, incluindo aves, suínos e humanos. Podem apresentar-se
como assintomáticas, clinicamente significantes e, em alguns casos, fatais (BROOKS et al.,
1984; SMOLE et al., 2002). O complexo M. avium é a causa mais comum de infecções
clinicamente significativas em países desenvolvidos (WHILEY et al., 2012).
Em 2007, foi realizado um estudo no Japão com objetivo de investigar a presença de
MAC nas casas dos pacientes ambulatoriais infectados. Foram investigados 29 banheiros
residenciais de pacientes com doença pulmonar. Desses, 15 (52%) foram positivos para MAC,
incluindo amostras de banheiras e de chuveiros. Dos 15 isolados, sete (47%) tiveram perfis
moleculares idênticos quando comparados com os seus respectivos isolados clínicos
(NISHIUCHI, 2009). Igualmente, MAC foi isolado do chuveiro na casa de uma mulher
americana infectada. A mulher não apresentava fator de risco conhecido para a infecção por
MAC. Os resultados demonstraram que o MAC isolado a partir de biofilme do chuveiro tinha
uma relação clonal com o MAC isolado da paciente (FALKINHAM et al. 2008). Outros dois
estudos semelhantes foram realizados nos EUA com o sistema de distribuição de água dos
hospitais e isolados de pacientes com AIDS, através das técnicas de RFLP e PFGE.
Comparando os isolados clínicos com os isolados ambientais os cientistas observaram uma
forte semelhança da cepa MAC isolado de pacientes e os isolados recuperados do
abastecimento de água do hospital, onde se concluiu que o sistema de abastecimento de água
do hospital era a fonte mais provável da infecção nosocomial por MAC (ARONSON et al.,
1999; TOBIN-D'ANGELO et al., 2004).
O complexo M. simiae foi identificado em dois isolados ambientais. O nicho dessa
micobacteria é conhecido como sendo aquático (CRUZ et al., 2007), entretanto, neste estudo,
os isolados foram provenientes de solo e biofilmes. Este estudo demonstra a capacidade dessa
micobactéria de formar biofilmes e de estar presente em solos, mostrando que esses ambientes
também são habitats dessas micobactérias consideradas patogênicas. Estudos realizados por
CONGER et al. (2004) relataram que cepas de M. simiae foram isoladas a partir de amostras
de água de um hospital e chuveiros das casas de pacientes. Houve uma associação entre a
85
água do hospital e as amostras pulmonares positivos para a M. simiae. Dois pacientes
apresentaram M. simiae indistinguível da água da torneira para o qual foram rotineiramente
expostos. A maioria dos casos de infecção relatados pelo complexo M. simiae foram em
pacientes infectados pelo HIV. São frequentes em doenças disseminadas como também ño
envolvimento do sistema pulmonar (CDC, 2002). Em adultos imunocompetentes
manifestações pulmonares são mais comuns, além de linfadenopatia, e lesões de pele
(RYNKIEWICZ et al., 1998.).
O M. lentiflavum é uma micobactéria estreitamente relacionada com M. simiae
(SPRINGER et al., 1996; NIOBE, et al., 2001). Nesse estudo foram encontrados dois isolados
dessa espécie em água das residências dos pacientes. Inicialmente, M. lentiflavum foi
considerada de baixo risco à saúde humana associada à sua baixa virulência (TORTOLI, et
al., 2005). Entretanto atualmente o M. lentiflavum sabe-se que está envolvido em várias
infecções como pneumonia, linfadenite cervical, bacteremia (FALKINHAN, 2003, LEAO et
al., 2004). Trabalho realizado por TORVINEN et al. (2004) mostraram que 90% das
micobactérias isoladas de amostras da água pertenciam à espécie Mycobacterium lentiflavum
nos 16 sistemas estudados em oito localidades da Finlândia. Recentemente, na Austrália
foram isolados do sistema de distribuição de água potável, cepas de M. lentiflavum que
estavam altamente relacionadas aos encontrados nos pacientes (THOMSON, et al., 2013c).
O M. mucogenicum, foi identificado em dois isolados de biofilmes. Infecções
clinicamente significativas (local ou sistêmica) com biofilmes formados em cateteres estão
relacionadas a casos por este patógeno (ADEKAMBI, 2009). HELOU et al. (2013)
identificaram entre pacientes com câncer, 116 casos de infecção por MNT. Os pacientes que
estavam usando cateter desenvolveram bacteremia em 39% dos pacientes. Em 2009, na
cidade do México, foram identificados M. mucogenicum em molhos de pimenta
comercializados por vendedores de rua (CERNA-CORTÉS et al., 2009).
Dois isolados de biofilmes apresentaram M. cosmeticum, um grupo de micobactérias
de crescimento rápido. É um organismo ambiental recuperado de água, incluindo água potável
doméstica, foi isolada também em água coletada em um salão de beleza (COOKSEY et al.,
2004; PEREZ-MARTINEZ, et al., 2013). M. cosmeticum é um patógeno oportunista mais
frequentemente implicado em lesões granulomatosas cutâneas, como nos procedimentos de
mesoterapia (BEER & WAIBEL, 2009; COOKSEY et al., 2004).
O complexo terrae foi identificado em três isolados ambientais. São considerados não
patogênicos. No entanto, estes organismos são ocasionalmente identificados em laboratórios
86
clínicos no cenário de doença clínica das articulações, tendões, pulmão, trato gastrointestinal,
e trato geniturinário (ABEDALTHAGAFI et al., 2014; SMITH et al., 2000).
As espécies M. peregrinum, M.aichiense e M. szulgai foram encontradas em apenas
um isolado. A espécie M.peregrinum pertence ao complexo M. fortuitum. Trabalho realizado
por NAGÃO et al., (2009) relatou infecção pulmonar, cutânea, infecção cirúrgica em cateter
por M. peregrinum.
Isolados de M.szulgai já foram recuperados a partir de várias fontes ambientais,
incluindo um caracol, água de aquário, água de piscinas, e peixes tropicais (VAN IGEN et al.,
2008). M. szulgai está relacionada com infecções pulmonares e cutâneas (SINGH et al.,
2015).
Um grande de número de micobactérias patogênicas foi isolado de biofilmes dos
sistemas de canalização das residências. De acordo com estudos já realizados, consideram que
a existência de micobactérias nos sistemas de abastecimentos de água pode ser a forma de
infectividade do ser humano (LE DANTEC et al., 2002). Este fato está relacionado com a
capacidade que a MNT possui de formar biofilmes. Além disso, como esses microrganismos
geralmente estão aderidos ao material da tubulação, muitas vezes torna-se difícil a
identificação deles na água (WALLACE et al., 1989). Assim, indivíduos debilitados, estariam
mais expostos a adquirir micobacterioses através do sistema de distribuição de água
contaminado por micobactérias ambientais.
Foi observado que mesmo morando na cidade os pacientes possuem quintais em suas
residências. Ao fazer limpeza nesses quintais, partículas de poeiras são geradas e podem ser
inaladas por esses pacientes. Os isolados provenientes dos solos deste estudo identificaram
micobactérias com capacidade de provocar doenças principalmente pulmonares. Importante
destacar que os pacientes inclusos neste estudo são indivíduos com doença pulmonar. O que
tornam suceptíveis a adquirirem uma reinfecção. Estudos realizados por DE GROOTE et al
(2006) com isolados de solos fornecidos pelos pacientes com infecção pulmonar por MNT e
isolados clínicos, encontrou isolados ambientais estritamente relacionado com isolados
clínicos dos pacientes.
No Estado de Rondônia é comum obter-se água no domicilio através de poços
comuns, semi-artesianos, artesianos, “fontes/mina”, entre outras. Esses métodos são quase
todos praticados por grande parte da população dos munícipios (http://www.jiparana.ro.gov.br). Águas de fonte subterrâneas representou 9/15 (60%) das residências
visitadas, dessas, foram isoladas micobactérias em cinco residências. Quanto à água de rios e
87
igarapés, das quatro coletas, três (75%) residências apresentaram positividade para
micobactérias.
Falkinham, (2011) afirma que casas com uma fonte de água subterrânea (poço) as
MNT são menos frequentemente encontradas, tal raridade de MNT em água subterrânea
provavelmente reflete a filtração da água e a retenção das partículas associadas à MNT nos
espaços menores e poros. Neste estudo, ao contrário, houve isolamento de micobactérias em
55% das amostras de água poços comuns e 50% dessas espécies são patogênicas. Entretanto,
foi observado durante a coleta a falta de limpeza em torno dos poços e grande parte não tinha
tampa de proteção apropriada para o fechamento. Podemos inferir que os possíveis meios de
contaminação do poço podem ser por infiltração de água da superfície através do terreno,
atingindo a parede e o interior do poço. Escoamento de água da superfície e enxurradas
através da abertura do poço para seu interior. Segundo Fusconi (1999) ao mesmo tempo em
que a água subterrânea se torna cada vez mais importante como recurso para a grande
exigência de água para uso doméstico, agrícola e industrial, sua qualidade está sendo
ameaçada; a falta de monitoramento em locais onde há potencial para contaminação, e a
ausência de uma análise abrangente da qualidade da água em milhares de poços, não
possibilitam uma determinação confiável dos riscos para a saúde da população (FUSCONI,
1999).
Das 15 residências que foram realizadas coletas ambientais, duas (13,33%) não
possuíam sistema de canalização para distribuição de água no interior de suas residências, no
entanto, era abastecida de água por mangueira que estava conectada ao poço/e ou “mina
d’agua”. Das mangueiras dessas residências foram isolados biofilmes com micobacterias.
Os seres humanos são expostos à água potável rotineiramente e regularmente, é
provável que a mais importante fonte de exposição MNT para os seres humanos é a água
potável, em comparação com águas naturais e solos (FALKINHAM, 2010).
6.4 COMPARAÇÕES ENTRE OS ISOLADOS CLÍNICOS E AMBIENTAIS
Neste estudo, três pacientes segundo critérios ATS que apresentaram isolados de M.
fortuitum desenvolveram doença pulmonar e desses, dois pacientes foram encontrados
isolados ambientais de M. fortuitum em suas residências. Vale ressaltar que um desses
pacientes apresentou infecção mista com 2 isolados clínicos para M. fortuitum, 1 isolado para
M.gordonae e 1 isolado para M. szulgai. Enquanto que em sua residência foram isolados do
chuveiro as espécies M. fortuitum e M.gordonae, e na torneira da cozinha M. gordonae.
88
Estudos relatam que o chuveiro é um emissor de aerossóis e já comprovaram infecção por
MNT durante o banho (PHILIP & VON REYN, 2001; SHIN et al., 2007; FALKINHAM et
al., 2008). Embora se tivesse encontrado o mesmo perfil e sequências comparativas
semelhantes nesses isolados ambientais e clínicos, mais estudos precisam ser realizados para
verificar se as micobactérias que estão no ambiente infectaram realmente o paciente.
Dos pacientes que não atendem os critérios ATS, foram realizadas coletas ambientais,
em duas residências. Desses, em uma residência foi isolada uma espécie de MNT ambiental
da mesma espécie do isolados clínico de M. fortuitum do chuveiro do paciente. No entanto,
por problemas na amplificação do DNA, o isolado clínico não foi possível comparar as
sequencia para as analises de similaridade. Vale acrescentar que desse paciente também foram
isoladas em amostras respiratórias a espécie M. boucherdethonense e da água de torneira da
cozinha foi isolada a M.intracellulare que faz parte do mesmo complexo do isolado clínico M.
boucherdethonense. São espécies estritamente relacionadas e pertencem ao Complexo M.
avium que são organismos mais frequentemente associados à doença pulmonar
(FALKINHAM III, NORTON, LECHEVALLIER, 2001; JOHNSON & ODELL, 2014;
SALAH, et al., 2009;). Ressaltamos que esse paciente por não atender os critérios ATS, não
obteve tratamento para MNT.
Recentemente, foram realizados ensaios semelhantes a este estudo com amostras
clínicas e ambientais de pacientes moradores de subúrbios de Tehran, Iran. As cinco espécies
de MNT ambiental mais frequentes foram M. farcinogens (12,1%), M. fortuitum (8,3%),
M.senegalense (6,7%), M. kansasii (6,2%), e M. simiae (5,3%). No total, 62,5% das amostras
positivas foram isoladas a partir de micobactérias de água e apenas 37,4% foram isoladas a
partir de amostras de solo. As MNT mais frequentes nas amostras clínicas foram M. simiae
(29.1%), M. kansasii (14.8%), M. chelonae (16%), M. fortuitum (7.4%). Os autores sugerem
uma possível ligação de transmissão, mas isso não se aplica para todas as espécies de MNT
ambientais e confirmam uma tendência crescente de MNT e que isolamentos de amostras
clínicas precisam ser melhor investigadas (VELAYATI et al.,2014).
Em trabalho publicado por FALKINHAM (2011) nos Estados Unidos e Canadá, foi
realizada coleta de amostras de água, solo, swab na torneira e chuveiro, nos domicílios de
pacientes portadores de micobacteriose. Foram encontradas MNT em 59% dos domicílios,
desses, 46% pertencia à mesma espécie dos pacientes infectados, sendo que em 41% desses
pacientes, utilizando o método rep-PCR para genotipagem, constataram que os isolados eram
geneticamente relacionados à cepa do doente.
89
Apesar da maioria dos pacientes apresentarem infecção por M. abscessus, no presente
estudo, M. abscessus não foi encontrado no ambiente. Estudos realizados por THOMSON et
al. (2013a) relatam a dificuldade de encontrar na literatura nos últimos dez anos relatos de
isolamento de M.abscessus do ambiente. No entanto, o mesmo grupo, realizando estudo com
água potável em Brisbane, Austrália, no período entre 2007 e 2009, isolaram onze cepas de
M. abscessus e compararam genotipicamente com isolados clínicos, utilizando a técnica repPCR (DiversiLab), encontraram um elevado grau de semelhança entre cepas de M. abscessus
de água potável e os isolados clínicos de pacientes da mesma área geográfica, reforçando a
possibilidade de que a água potável pode ser a fonte de infecção nestes pacientes
(THOMSON et al., 2013c).
Diante do elevado número de M. fortuitum encontrados nos sistemas de canalização
analisados e o predomínio da espécie M. fortuitum em isolados clínicos de cultura única
podemos inferir que provavelmente os pacientes estão se infectando com M. fortuitum dentro
das suas próprias residências, no entanto, é difícil prever seu adoecimento, por ser
consideradauma espécies oportunista dependendo, assim, da susceptibilidade de cada
indivíduo.
6.5 PRA e genes RNAr 16S, hsp65
Nas últimas décadas surgiram novos métodos de identificação não comerciais e a
metodologia PRA tem sido a mais utilizada para identificar as espécies de MNT. Este
procedimento foi descrito por TELENTI et al. (1993) e desde então são utilizados os mesmos
iniciadores que amplificam uma região conservada de 441pb do gene hsp65, em todas as
espécies do gênero Mycobacterium (TELENTI et al., 1993).
Para identificação das espécies de MNT, no presente estudo, foi escolhida a mesma
metodologia. No entanto, após a utilização dessa metodologia neste estudo concordou-se com
HAFNER et al., (2004) que o PRA apresenta alguns fatores críticos para a sua utilização
como: padrões confusos por falta de uma padronização na determinação; variação nas
distâncias das bandas após a corrida no gel e frequentes descrições de novos padrões para
novas espécies e variados padrões para as espécies polimórficas que dificultam a
interpretação.
Além disso, de acordo com DA COSTA (2009) que afirma ser uma questão intrínseca
a diversidade de espécies encontradas em nossa área geográfica e que, portanto, ao se
considerarem as peculiaridades regionais, não devemos eleger o PRA-hsp65 como
90
metodologia única em laboratórios de referência para a identificação molecular de MNT
envolvidas em infecções pulmonares.
Neste estudo todos os 46 isolados de micobactérias ambientais foram submetidas ao
sequenciamento parcial dos genes RNAr 16S e hsp65, os mais frequentemente utilizados para
identificação de micobactérias (MCNABB et al., 2004; RINQUET et al., 1999; TURENNE et
al., 2001). Apesar das dificuldades de trabalhar com isolados ambientais devido ao grande
número de culturas mistas foi possível identificar em nível de espécie 45 (97,8%) isolados de
micobactérias. Na comparação entre os dois genes utilizados na identificação, em 12 isolados,
os resultados não apresentaram o mesmo nível de identificação. O hsp65 foi mais eficiente
que o RNAr 16S para identificação em 10 desses isolados e apenas 2 isolados foram melhor
identificadas pelo gene RNAr 16S.
O gene hsp65 apresentou um maior poder discriminatório com 83,3% em relação ao
RNAr 16S. Estes resultados estão de acordo com outros estudos (da COSTA et al 2012; KIM
et al., 2005; SENNA et al., 2008, SHIN et al, 2006).
Este estudo mostrou um bom resultado da análise filogenética através do
sequenciamento do gene hsp65. Houve uma boa separação das espécies, mostrando que o
gene pode servir de separação filogenética entre as diferentes espécies.
Mostrou ainda a bactéria Tsukamurella sp. e Nocardia sp como grupos externos e
reuniu as micobacterias que pertencem à mesma espécie dentro do mesmo grupo, mostrando
assim que o sequenciamento foi realizado com êxito.
91
CONCLUSÃO
- Identificamos micobactérias patogênicas nos ambientes (sistema de canalização, água e
solo) dos pacientes infectados por MNT.
- Isolamos em três residências a mesma espécie de infecção dos pacientes. Em isolados de um
paciente foi encontrado o mesmo perfil e sequência comparativa semelhante tanto no
ambiente quanto clínico. No entanto, mais estudos precisam ser realizados para verificar se as
micobactérias que estão no ambiente infectaram realmente o paciente.
- Houve o predomínio das espécies M. fortuitum e M.abscessus nos isolados clínicos enquanto
que nos isolados ambientais M. fortuitum e M.gordonae.
- Ressaltamos a importância do isolamento de micobactérias patogênicas em poços comuns,
pelo fato que parte da população do Estado utiliza água de poço para o consumo humano.
- Um total de 78,2% das MNT ambientais não pôde ser identificada pelo PRA-hsp65, o que
limita o uso deste método como ferramenta isolada para identificação de MNT,
principalmente pela diversidade genética das espécies.
- O gene hsp65 apresentou um maior poder discriminatório em relação ao RNAr 16S. No
entanto, para a identificação de MNT é necessária a utilização de mais de um marcador
molecular.
-Na construção da àrvore filogenética através do gene hsp65 houve uma boa separação das
espécies, mostrando que o gene pode servir de separação filogenética entre as diferentes
espécies.
92
PERSPECTIVAS
Será importante a realização de estudos em água potável, sistemas de canalização
urbana em todas as regiões do Brasil, para um melhor conhecimento da diversidade de
possíveis micobacterias patogênicas do ambiente, identificação de fontes de infecção,
realização de um acompanhamento contínuo de investigação micobacteriana nos sistemas de
água potável e assim se propor medidas de diminuição à exposição a esses microrganismos
diante do risco potencial para a saúde humana.
93
REFERÊNCIAS
ABEDALTHAGAFI M, ROSENBERG O, MILLER S. First report of tenosynovitis in a
immunocompetent person caused by Mycobacterium heraklionense. J.Med. Microbiol. Case
Rep. 2014.
ADEKAMBI T, COLSON P, DRANCOURT M. rpoB-based identification of nonpigmented
and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology. v.41,
n.12, p.5699-708, 2003.
ADEKAMBI, T. & M. DRANCOURT. Dissection of phylogenetic relationships among 19
rapidly growing Mycobacterium species by 16S rRNA, hsp65, sodA, recA and rpoB gene
sequencing. Int J Syst Evol Microbiol v.54(Pt 6), p. 2095-2105, 2004.
ADEKAMBI, T. et al. rpoB gene sequence-based characterization of emerging nontuberculous mycobacteria with descriptions of Mycobacterium bolletii sp. nov.,
Mycobacterium phocaicum sp. nov. and Mycobacterium aubagnense sp. nov. Int J Syst Evol
Microbiol v.56(Pt 1): p.133-143, 2006.
ADEKAMBI, T. Mycobacterium mucogenicum group infections: a review .Clinical
Microbiology and Infection, v.15, n. 10, 2009.
ALEXANDER K.A et al. Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M.
mungi.Emerg Infect Dis., v. 16, p.1296–9, 2010.
ALCAIDE M.L, ESPINOZA L, ABBO L. Cavitary pneumonia secondary to Tsukamurella in
an AIDS patient. First case and a review of the literature. The Journal of infection, v 49, n.1,
p.17-9, 2004.
ANDRÉJAK, C. et al. Nontuberculous Pulmonary Mycobacteriosis in Denmark Incidence
and Prognostic Factors. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, v.
181, n. 5, p. 514-521, 2010
APHA, STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND
WASTEWATER. American Water Works Association, Water Environment Federation. 21st
ed. 2005.
ANDERSSON, M.A.et al. Bacteria, molds, and toxins in water-damaged building materials.
Appl. Environ. Microbiol., v.63, n.2, p.387-393, 1997.
ANVISA. Relatório Descrito de Investigação de Casos de Infecções por Micobactérias
Não Tuberculosas de Crescimento Rápido (MCR) no Brasil no Período de 1998 a 2009.
In: Unidade de Investigação e Prevenção das Infecções e dos Eventos Adversos. Gerência
Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde - GGTES, 2011.
94
ARONSON T. et al. Comparison of large restriction fragments of Mycobacterium avium
isolates recovered from AIDS and non-AIDS patients with those of isolates from potable
water. J Clin Microbiol., v. 37, p.1008–12, 1999.
BARRETTO, A.R. Micobacteriose não tuberculosa pulmonar em hospital de referência
no Estado do Pará: espécies mais frequentes, apresentação radiológica e evolução
clínica. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da
Saúde, Programa de Pós-Graduação em Oncologia e Ciências Médicas, Belém, 2013.
BEER K, WAIBEL J. Disfiguring scarring following mesotherapyassociated Mycobacterium
cosmeticum infection. J. Drugs Dermatol. v. 8, p.391–393, 2009.
BILLINGER, M.E. et al. Nontuberculous mycobacteria-associated lung disease in
hospitalized persons, United States, 1998–2005. Emerg Infect Dis v.15, p.1562–1569, 2009
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância em Saúde. Manual de Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e
outras Micobactérias. 1ª edição, Brasília, 2008.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância em Saúde. Manual de Recomendações para o Controle da Tuberculose no
Brasil. ª edição, Brasília, 2010.
BROOKS, R.W.B.C. et al. Epidemiology of infection by nontuberculous
mycobacteria. V. Numbers in eastern United States soils and correlation with soil
characteristics. Am. Rev. Respir. Dis., v.130, p.630-633, 1984.
BROWN-ELLIOTT B.A, WALLACE R.J, Jr. Clinical and taxonomic status of pathogenic
nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology
Reviews. v.15, n. 4, p. 716-46, 2002.
BROWN-ELLIOTT B &, WALLACE RJ Jr.: Infections due to nontuberculous mycobacteria
other than mycobacterium aviumintracellulare.In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds.
Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Vol 2.
Philadelphia: Churchill Livingstone. p.3191-3198. 2010
BRYANT J.M, et al. Whole-genome sequencing to identify transmission of Mycobacterium
abscessus between patients with cystic fibrosis: aretrospective cohort study. Lancet, v.381,
p.1551–1560, 2013.
CABRIA, F. et al. Cervical lymphadenitis caused by Mycobacterium lentiflavum. Pediatr.
Infect. Dis. J. v. 21, p.574-575, 2002.
CAMPOS, H.S. Manejo da doença micobacteriana não- tuberculosa. Bol. pneumol. sanit., v.
8, p. 2, 2000.
CASSIDY P.M. Nontuberculous mycobacterial disease prevalence and risk factors: a
changing epidemiology. Clin Infect Dis., v. 15, p.124-9,2009.
95
CASTRO, E.S. Micobactérias não tuberculosas: aspectos clínicos e epidemiológicos e
análise de espécies identificadas pela metodologia PRA ,2012. 202 f. Tese (Doutorado) Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Faculdade de Medicina Universidade Federal
do Ceará, Fortaleza, 2012.
CATTOIR, V. Molecular identification of mycobacteria and detection of antibiotic resistance.
An. Biol. Clin., v.62, n.4, p.405-413, 2004.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Disseminated infection with
Simiae-Avium group mycobacteria in persons with AIDS—Thailand and Malawi, 1997.
Morb. Mortal. Wkly. Rep. v.51, p.501. 2002
CERNA-CORTES J.F. et al. Isolation of Mycobacterium mucogenicum from street-vended
chili sauces: a potential source of human infection. J Food Prot , vol. 72, p. 182-184, 2009.
CHEN, P.; SHI, M.; ZHAO, G. A Highly Efficient Ziehl-Neelsen Stain: Identifying De Novo
Intracellular Mycobacterium tuberculosis and Improving Detection of Extracellular M.
tuberculosis in Cerebrospinal Fluid. J. Clin. Microbiol. v. 50, n.4, p.1166, 2012.
CHIEN, J-Y. et al.
Pulmonary Infection and Colonization with Nontuberculous
Mycobacteria, Taiwan, 2000–2012. Emerging Infectious Diseases. v. 20, n. 8, 2014.
CHIMARA,E. et al, Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction
enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based
extended algorithm of PRA-hsp65 patterns. BMC Microbiology, v.8, n.48, p. 1-12, 2008.
CHIMARA, E. et al. Molecular characetrization of Mycobacterium kansasii isolates in the
state of São Paulo between 1995-1998. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v.99, p.739-43, 2004.
CICILIONI, O.J. et al. Mycobacterium fortuitum Infection following Reconstructive Breast
Surgery: Differentiation from Classically Described Red Breast Syndrome. Plast Reconstr
Surg Glob. v.1, n.7, 2013.
COLOMBA C. et al. Probable disseminated Mycobacterium abscessus subspecies bolletii
infection in a patient with idiopathic CD4+ T lymphocytopenia: a case report Journal of
Medical,
Case
Reports
6:
277,
2012.
Disponível
em:
<http://www.jmedicalcasereports.com/content/6/1/>. Acesso em 15 dez 2014.
CONGER, N. G., R. J. O’CONNELL, V. L. LAUREL, K. N. OLIVIER, E. A. Graviss, N. WilliamsBouyer, Y. Zhang, B. A. Brown-Elliott, and R. J. Wallace, Jr.. Mycobacterium simae outbreak
associated with a hospital water supply. Infect. Control Hosp. Epidemiol.,v. 2, p.1050–1055, 2004.
COOKSEY R.C et al. Mycobacterium cosmeticum sp. nov., a novel rapidly growing species
isolated from a cosmetic infection and from a nail salon. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. v.54,
p. 2385–2391. 2004
COUTO I. et al. Identification of nontuberculous mycobacteria in clinical samples using
molecular methods: a 3-year study. Clinical Microbiology and Infection.. v.16, n.8, p. 11614, 2010.
96
COWMAN, S., WILSON, R., LOEBINGE, M.R. Opportunistic mycobacterial diseases.
Infection. v.40, n.6, p. 346-348, 2012.
CRUZ, A.T; GOYTIA, V.K; STARKE, J.R. Mycobacterium simiae Complex Infection in an
Immunocompetent Child. journal of clinical microbiology, v. 45. p. 2745–2746, 2007.
DA COSTA CRUZ, J. C. Mycobacterium fortuitum: um novo bacilo ácido-resistente
patogênico para o homem (New acid fast bacillus pathogenic for man) Acta Med. v. 1, p.
298-301, 1938.
da COSTA A.R.F. et al. Molecular identification of rapidly growing mycobacteria isolates
from pulmonary specimens of patients in the State of Para, Amazon region, Brazil. Diagn
Microbiol Infect Dis., v. 65, n.4, p. 358–64, 2009.
da COSTA A.R.F et al. Molecular identification of nontuberculous mycobacteria isolates in a
brazilian mycobacteria reference laboratory. Diagnostic microbiology and infectious
disease, v. 68, p. 390-394. 2010.
da COSTA A.R.F. et al. Occurrence of Nontuberculous Mycobacterial Pulmonary Infection in
an Endemic Area of Tuberculosis. PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 7:23-40, 2013.
da COSTA, A.R.F. et al. Pulmonary Nontuberculous Mycobacterial Infections in the
State of Para, an Endemic Region for Tuberculosis in North of Brazil. INTECH Open
Access Publisher, 2012. Disponível: http://www.intechopen.com/books/pulmonaryinfection/pulmonary-nontuberculousmycobacterial. Acesso em 22 de maio de 2013.
DAI J. et al. Multiple-genome comparison reveals new loci for Mycobacterium species
identification. Journal Clin Microb. v. 49, n. 1; p. 144–153, Jan 2011(a).
DAI J, CHEN Y, LAUZARDO M. Web-Accessible Database of hsp65 sequences from
Mycobacterium reference strains. Journal Clin Microb. v. 49, n. 6, p. 2296–2303, 2011(b).
DALEY C.L & GRIFFITH D.E. Pulmonary non-tuberculous mycobacterial infections. Int J
Tuberc Lung Dis. v.14, n. 6, p.665–671, 2010.
DAMARAJU, D. et al. Isolation of non-tuberculous mycobacteria among patients with
pulmonary tuberculosis in Ontario, Canada. Int J Tuberc Lung Dis., vol. 17, n.5, p.676–681,
2013.
DAVEY, M.E.; O’TOOLE, G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 64, n. 4, p.847-867, 2000.
DE GROOTE, M.A. et al. Relationships between Mycobacterium Isolates from Patients with
Pulmonary Mycobacterial Infection and Potting Soils. Applied and environmental
microbiolog., v. 72, n.12, p. 7602–7606, 2006.
DE GROOTE M.A & HUITT G. Infections due to rapidly growing mycobacteria. Clin Infect
Dis.,v.42, n.12, p.1756-63, 2006.
97
DEVULDER, G. et al, "A multigene approach to phylogenetic analysis using the genus
Mycobacterium as a model." Int J Syst Evol Microbiol., v.55, p. 293-302, 2005.
DUARTE R.S et al. Epidemic of post-surgical infections caused by Mycobacterium
massiliense. J Clin Microbiol. v.47, n.7, p. 2149-55, 2009.
DUCATI, R.G. Micobactérias. In: Luiz Rachid Trabulsi; Flavio Alterthum. Microbiologia. 4
ed. São Paulo: Atheneu, v. 1, p. 409-421, 2004.
ECKBURG P.B. et Clinical and chest radiographic findings among persons with sputum
positive for Mycobacterium gordonae. Chest, v.117: p. 96–102, 2000.
EL SAHLY, H. M. et al. GravissMycobacterium simiae pseudo-outbreak resulting from a
contaminated hospital water supply in Houston, Texas. Clin. Infect. Dis., v. 35, p.802–807.
2002.
ESTEBAN J. et al. Biofilm development by potentially pathogenic non-pigmented rapidly
growing mycobacteria. BMC Microbiology, v. 8, p. 184, 2008.
EUZÉBY, J. P. List of bacterial names with standing in nomenclature: a folder available
on the Internet. Disponível em: <http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html>
Acesso em: 29 jan. 2015.
FALKINHAM, J.O., III Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria.
Clin.Microbiol. Revs. v. 9, p.177—215, 1996.
FALKINHAM 3rd., J.O. Nontuberculous mycobacteria in the environment. Clin. Chest.
Med., v.23, n.3, p. 529-551, 2002.
FALKINHAM, J.O III: Mycobacterial aerosols and respiratory diasease. Emerg Infect Dis.,
v.9, p. 763-7, 2003.
FALKINHAM, J. O III. The biology of environmental mycobacteria: Minireview
Environmental Microbiology Reports. v. 1, n. 6, p.477-487, 2009.
FALKINHAM, J. O.; NORTON, C. D.; LE CHEVALLIER, M. W. Factors influencing
numbers of mycobacterium avium, mycobacterium intracellulare and other mycobacteria in
drinking water distribution systems. Appl. Environ. Microbiol., v. 67, p. 1225-1231, 2001.
FALKINHAM, J.O 3rd. PARKER, B.C.; GRUFT, H. Epidemiology of infection by
nontuberculous mycobacteria. I. Geographic distribution in the eastern United States. Am.
Rev. Respir. Dis., v.121, p.931-937, 1980.
FALKINHAM J.O III .Nontuberculous Mycobacteria from Household Plumbing of Patients
with Nontuberculous Mycobacteria Disease. Emerging Infectious Diseases, v. 17, n.3,
p.419-424, 2011.
FALKINHAM J.O, 3rd. Ecology of nontuberculous mycobacteria-where do human infections
come from? Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. v. 34, n.1, p.95-102,
2013.
98
FALKINHAM J.O III, et al. Mycobacterium avium in a shower linked to pulmonar disease. J
Water Health. v.6: p.209–13, 2008.
FALKINHAM J.O III. Environmental Sources of Nontuberculous. Clin Chest Med., v.36
p.35–41, 2015.
FALKINHAM, J.O. Impact of human activities on the ecology of nontuberculous
mycobacteria. Future Microbiol, v. 5, n.6, p.951-60, 2010.
FOTI, C. Cutaneous manifestations of Mycobacterium gordonae infection described for the
first time in Italy: a case report Cases Journal, v.2, p. 682-8,2009.
FREITAS, J. et al. Mycobacterium avium complex in water buffaloes slaughtered for
consumption. Rev. Saude Publica, v.35, p.315—317, 2001.
FUSCONI, R. Isolamento e caracterização de linhagens bacterianas provenientes das
águas subterrâneas adjacentes ao antigo aterro controlado da cidade de São Carlos
(SP): estudos de linhagens produtoras de exopolissacarídeos, 1999, 143 f. Dissertação
(Mestrado em ecologia e recursos naturais), Universidade Federal de São Carlos, São Carlos,
1999.
GARCIA-AGUDO, L. et al. Assessment of in vitro susceptibility to antimicrobials of rapidly
growing mycobacteria by E-test. Rev Med Chil, v. 137, n. 7, p. 912-7, 2009.
GASPAR-GRILLO, J.A. et al. Isolamento e identificação de micobactérias em águas tratadas
provenientes do sistema de abastecimento de Araraquara-SP. Alim. Nutr., v. 23, n. 1, p. 147155, 2012.
GEBO, K. A. et al. Pseudo-outbreak of Mycobacterium fortuitum on a Human
Immunodeficiency Virus Ward: transient respiratory tract colonization from a contaminated
ice machine. Clin Infect Dis, v. 35, n. 1, p. 32-8, 2002.
GENTRY, C. A. Atypical Mycobacteria. In: SCHUMOCKV, G.T.; BRUNDAGE, D.;
CHESSMAN, K.; DUNSWOTH, T.; FAGAN, S.; KELLY, W.; RATHBURN, R.; RICHIE,
D.; SEMLA, T.; VASQUEZ, E.; ZAROWITZ, B. Pharmacotherapy Sel-Assessment Program
– Infectious Diseases II. 5.ed. Kansas City: American College of Clinical Pharmacy, 2005.
GOODFELLOW, M.; MAGEE, J.G. Taxonomy of Mycobacteria. In: GANGADHARAM,
P.R.J.; JENKINS, P.A. Mycobacteria: basic aspects. New York: Chapman & Hall,v.1, 1-71p.
1998 (Chapman & Hall Medicall Microbiology Series).
GÓMEZ, N. A. Micobacterias notuberculosas: una infección emergente? Na. Pediatr., v.71,
suppl. 3, p. 185-188, 2009.
GOMILA, M; RAMIREZ, A; LALUCAT. J. Diversity of Environmental Mycobacterium
isolates from Hemodialysis water as Shown by a Multigene Sequencing Approach. Appl.
Environ. Microbiol.v.73, p. 3787-3797, 2007.
99
GRIFFITH D.E et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention
of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med., v.175: p.367–416,
2007.
GRIFFITH, D.E. Nontuberculous mycobacterial lung disease. Current opinion in Infectious
Diseases, v.23, p. 185-190, 2010.
GRIFFITH D.E & AKSAMITB, T.R. Therapy of refractory nontuberculous mycobacterial
lung disease. Curr Opin Infect Dis, v.25, p. 218–227. 2012.
GRIFFITH, D.E. Mycobacterium abscessus: Pleased to Meet You, Hope You Guess My
Name...Ann Am Thorac Soc.. v.12, n. 3:436-9, 2015.
GRIFFITH, D.E.; GIRARD W. M.; WALLACE R. J. Clinical features of pulmonary disease
caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review
of Respiratory Disease, v. 147, n. 5, p. 1271-1278, 1993.
HADAD, D.J. et al. Micobacterioses: Recomendações para o diagnóstico e tratamento. São
Paulo: Secretaria Estadual da Saúde de São Paulo, 2005.
HALL-STOODLEY, L., C. W. KEEVIL, AND H. M. LAPPIN-SCOTT. Mycobacterium
fortuitum and Mycobacterium chelonae biofilm formation under high and low nutrient
conditions. J. Appl. Microbiol. v.85, p.60S–69S, 1999.
HAN X.Y et al. M. Clinical significance andepidemiologic analyses of Mycobacterium avium
and Mycobacterium intracellu-lare among patients without AIDS. J Clin Microbiol. v. 43, p.
4407–12, 2005.
HÄFNER, B. et al. O. Different molecular methods for the identification of rarely isolated
non-tuberculous mycobacteria and description of new hsp65 restriction fragment length
polymorphism patterns. Mol. Cell. Probes, v.18, n.1, p.59-65; 2004.
HASHIMOTO, A. et al. Rapid detection and identification of mycobacteria by combined
method of polymerase chain reaction and hybridization protection assay. The Journal of
Infection, v.33, n.2, p.71-77, 1996.
HAZRA, R. et al. Lymphadenitis due to nontuberculous mycobacteria in children:
presentation and response to therapy. Clin. Infect. Dis. v. 28, p.123-129, 1999.
HELOU, E.I et al. Management of Rapidly Growing Mycobacterial Bacteremia in Cancer
Patients. Clinical Infectious Diseases. v. 56, n.6, p.843–6, 2013.
HENRY, M. T.et al. Nontuberculous mycobacteria in non-HIV patients: epidemiology,
treatment and response. Eur. Respir. J., v. 23, p.741, 2004.
HORAN, K.; CANGELOSI, G.A. Drug resistance by non-tuberculous mycobacteria. Infect.
Dis., p. 917-927, 2009.
HORSBURGH JR, C.R. Epidemiology of mycobacterial disease in AIDS. Res. Microbiol.,
v.143, p.372-377, 1992.
100
HORSBURGH, C. R., Jr, e R. M. Selik.. The epidemiology of disseminated nontuberculous
mycobacterial infection in the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Am. Rev.
Respir. Dis. v. 139, p.4-7, 1989.
HITOMI L. et al. Detecção de micobactérias em águas subterrâneas que abastecem a cidade
de São Carlos – SP. In:. Simpósio de Ecologia, 2008.
HRUSKA, K; KAEVSKA, M. Mycobacteria in water, soil, plants and air: a review.
Veterinarni Medicina, v.57, n.12, p. 623–679, 2012.
HUNTER, P. Waterborne Disease: Epidemiology and Ecology. New York, Wiley, 1997.
HUSSEIN, Z., LANDT, O., WIRTHS, B. & WELLINGHAUSEN, N.,. Detection of nontuberculous mycobacteria in hospital water by culture and molecular methods. International
Journal of Medical Microbiology, v. 299, n.4, p.281-90, 2009.
IVANAINEN E. et al. Mycobacteria in boreal coniferous forest soils. FEMS Microbiol Ecol;
v.23: p. 325–32, 1997.
INGEN J. V. et al. Characterization of Mycobacterium orygis as M. tuberculosis Complex
Subspecies. Emerging Infectious Diseases, v. 18, No. 4,-653-655. 2012.
ITOH S.et al. Heterogeneity of RNA polymerase gene (rpoB) sequences of Mycobacterium
gordonae clinical isolates indetified with a DNA probe kit and by conventional methods. J.
Clin. Microbiol. v.41, n.1656-63, 2003.
JARAND, J. et al. Clinical and microbiologic outcomes in patients receiving treatment for
Mycobacterium abscessus pulmonary disease. Clinical Infectious Disease, v. 52, n. 5, p. 565571, 2011.
JENKINS, P.A. et al. Clarithromycin vs ciprofloxacin as adjuncts to rifampicin and
ethambutol in treating opportunist mycobacterial lung diseases and an assessment of
Mycobacterium vaccae immunotherapy. Thorax., v.63, p.627, 2008.
JEON, K. et al. Antibiotic treatment of Mycobacterium abscessus lung disease. A
retrospective analysis of 65 Patients. American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine, v. 180, n. 9, p. 896-902, 2009.
JHONSON, M.; WALLER, E. A.; LEVENTHAL, J. P. Nontuberculous mycobacterial
pulmonary disease. Current Opinion in Pulmonary Medicine, v.14, n.3, p. 203-210, 2008.
JOHNSON, M & ODELL, J.A. Nontuberculous mycobacterial pulmonary infections. Journal
of Thoracic Disease, v. 6, n. 3, 2014.
JORDÃO JUNIOR, C.M. Ocorrência de micobactérias e outros microorganismos nas
águas de uma propriedade produtora de leite de búfalas, na região de São Carlos,
Estado de São Paulo. 2008. 111f. Tese (Doutorado),Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara, 2008.
KAMALA T. et al. Mycobacteria from Soil and Water. Applied and environmental
microbiology, v. 60, n. 3. p. 1021-1024, 1994.
101
KANAI, K.Y. Detecção e identificação de micobacterias em corpos de água destinados a
captação para abastecimento urbano da cidade de São Carlos-SP.2006. 88f. Dissertação
de Mestrado, Faculdade Ciências Ambientais, Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, São Paulo, 2006.
KARAKOUSIS, P.C., MOORE, R.D. AND CHAISSON, R.E. Mycobacterium avium
complex in patients with HIV infection in the era of highly active antirretroviral
therapy.Lancet Infect Dis., v.4, 557–565,2004.
KATILA, M.L. et al. Isolation of potentially pathogenic mycobacteria in the Finnish
environment. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. v. 98, p.9–11.10,1995.
KATOCH, V. M. et al.Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM). Indian J Med
Res. v.120, p. 290–304, 2004.
KASAI, H.; EZAKI, T. & HARAYAMA S. Differentiation of phylogenetically related slowly
growing mycobacteria by their gyrB sequences. J. Clin. Microbiol., v. 38, p. 301-308, 2000.
KAZDA J, PAVLIK I, FALKINHAM III JO, HRUSKA K (Eds.): The Ecology of
Mycobacteria: Impact on Animal‘s and Human‘s Health. Springer, 1st ed.2009., xviii+522
pp.
disponivel em: http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4020-9413-2/page/1.
Acesso: 23 jan. 2014.
KIM, H. et al. Differentiation of Mycobacterium species by analysis of the heat-shock protein
65 gene (hsp65). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., v.55, pt.4, p.1649–1656, 2005.
KIM, B.J. et al. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of
the RNA polymerase gene (rpoB). Journal of Clinical Microbiology, v. 37, n.6, p. 17141720, 1999.
KIM H.S et al. Recent trends in clinically significantnontuberculous Mycobacteria isolates at
a Korean general hospital. Ann LabMed., v. 34, p.56–9, 2014.
KOH, W. JUNG; K, O JUNG E LEE, KYUNG S. Nontuberculous mycobacterial pulmonary
diseases in immunocompetent patients. Korean J. Radiol., v.3, n.3, p.145-157, 2002.
KUBICA, G.P.; WAYNE, L.G. The Mycobacteria: A sourcebook. 15ed. New Yok:Marcel
Dekker, part A, 177-193p. 1984.
KUDOH, S.; KUDOH, T. A simple technique for culturing tubercle bacilli. Bull. World. Org.,
Santé, v. 51, p. 71-82, 1974.
LAI C.C et al. Increasing inci-dence of nontuberculous mycobacteria, Taiwan, 2000–2008.
Emerg Infect Dis., v.16, p.294–6, 2010.
LALANDE V. et al. Pseudo-outbreak of Mycobacterium gordonae associated with water
from refrigerated fountains. Journal of Hospital Infection, v.48, p. 76–79, 2001.
102
LANE, D.J. 16S/23S rRNA sequences. In:__ Stackebrandt and Goodfellow Ed. Nucleic acid
techniques in bacterial systematics. John Wiley, Chichester, p. 115-176, 1991.
LEÃO S.C. et al. Pratical handbook for phenotypic and genotypic identification of
Mycobacteria. p.9-147,2004. Disponível em: http://www.esmycobacteriology. Acesso em 10
ago 2013.
LEÃO, S.C. et al. Multicenter evaluation of mycobacteria identification by PCR restriction
enzyme analysis in laboratories from Latin America and Caribbean. J Microbiol Methods.,
v.61, n.2, p. 193- 199, 2005.
LEÃO, S.C, TORTOLI, E., EUZEBY, J.P,, GARCIA, M.J: Proposal that Mycobacterium
massiliense and Mycobacterium bolletii be united and reclassified as Mycobacterium
abscessus subsp. bolletii comb. nov., designation of Mycobacterium abscessus subsp.
abscessus subsp. nov. and emended description of Mycobacterium abscessus. Int J Syst Evol
Microbiol.,v.61, p.2311–3, 2011.
LEÃO, S.C.; MARTIN, A.; MEJIA, G.I.M.; PALOMINO, J.C.; ROBLEDO, J.R.; TELLES,
M.A.S.; PORTAELS, F. Practical Handbook for the Phenotypic And Genotypic
Identification of Mycobacteria, 2004.
LECLERC, H.; SCHWARTZBROD, L.; DEI-CAS, E. Microbial agents associated with
waterborne diseases. Crit. Rev. Microbiol. v.28, p.371-409, 2002.
LE DANTEC, C. et al. Occurrence of mycobacteria in water treatment lines and in water
distribution systems. Appl Environ Microbiol, v. 68, n. 11, p. 5318-25, 2002.
LEITE, C.Q.F. Estudo epidemiológico das micobactérias das águas de algumas regiões do
Est. de São Paulo. 1991. 106p. Tese (Livre docência) –Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 1991.
LIMA, A.S. Fatores e espécies de micobactérias não tuberculosas associadas aos casos de
micobacterioses pulmonar e extrapulmonar no Estado de Pernambuco. 2014. 78 p Tese
(Doutorado em saúde pública) - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo
Cruz, Recife, 2014.
MCNABB, A. et al. Assessment of partial sequencing of the 65-kilodalton heat shock protein
gene (hsp65) for routine identification of Mycobacterium species isolated from clinical
sources. J.Clin. Microbiol., v.42, p.3000-3011, 2004.
MARRAS T.K, CHEDORE P, YING A.M, JAMIESON F. Isolation prevalence of pulmonary
non-tuberculous mycobacteria in Ontario, 1997- 2003. Thorax, v.62, p.661–666, 2007.
.
MARRAS, T.K; DALEY, C. Epidemiology of human pulmonary infection with
nontuberculous mycobacteria. Clinic in Chest Medicina, v.23, p. 553-567, 2002.
MARINHO, A. et al. Micobactérias atípicas em doentes sem síndroma de imunodeficiência
adquirida. Revista Portuguesa de Pneumologia, v.14, n.3, p. 323-337, 2008.
103
MARTINEZ, A., TORELLO, S. AND KOLTER, R. Sliding motility in mycobacteria. J.
Bacteriol. v.181, p.7331–7338., 1999.
MATOS, E. D. et al. Nontuberculosis mycobacteria at a multiresistant tuberculosis reference
center in Bahia: Clinical Epidemiological Aspects. The Brazilian Journal of Infectious
Diseases, v. 8, n. 4, p. 296-304, 2004.
MELLO, K.G. et al. Clinical and therapeutic features of pulmonary nontuberculous
mycobacterial disease, Brazil, 1993–2011. Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 19, n.
3, p. 393-399, 2013.
MENDES DE LIMA, C.A. et al. Nontuberculous mycobacteria in respiratory samples from
patients with pulmonary tuberculosis in the state of Rondônia, Brazil. Mem Inst Oswaldo
Cruz, v. 108, n.4, p.457-462, 2013.
MENDES DE LIMA, C.A. Estudo da Variabilidade Genética Mycobacterium
tuberculosis e Outras micobactérias no Estado de Rondônia .2012. Tese (Doutorado em
Biologia Experimental)- Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2012.
MIRSAEIDI M. et al. Nontuberculous Mycobacterial Disease Mortality in the United States,
1999–2010: A Population-Based Comparative Study. Herrmann JL, ed. PLoS ONE.v. 9. n.3,
2014.
MIGUEL, A.L.C.S.F . Aplicação da técnica de PCR na pesquisa de bactérias patogénicas
em biofilmes de condutas e reservatórios de água do sistema de distribuição da EPAL.
Lisboa, 2007. 107p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biológicas) – Universidade
Tecnica de Lisboa, 2007.
NISHIUCHI, Y. Mycobacterium avium complex organisms predominantly colonize in the
Bathtub Inlets of patients’ bathrooms. J Infect Dis. v. 62, p.182, 2009.
NAGAO M. et al. Surgical site infection due to Mycobacterium peregrinum: a case report and
literature review. Int J Infect Dis. v.13, p.209–11, 2009.
NASH, K.A, ZHANG, Y. BROWN-ELLIOTT, B.A, et al. Molecular basis of intrinsic
macrolide resistance in clinical isolates of Mycobacterium fortuitum. J Antimicrob
Chemother, v.55, p.170–7, 2005.
NESSAR, R. et al. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy, v. 67, n. 4, p. 810-818, 2012.
NISHIUCHI Y. et, al. The recovery of Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC)
from the residential bathrooms of patients with pulmonary MAC. Clin. Infect. Dis. vol.45, p.
347–351, 2007.
NIOBE S.N, et al. Disseminated Mycobacterium lentiflavum Infection in a Human
Immunodeficiency Virus-Infected Patient. Journal of Clinical Microbiology, v. 39, n.5,
p.2030-32, 2001.
104
NWUBA C. et al. Nocardiosis-an emerging complication in the clinical management of
HIV/AIDS patients in Africa. J Int Aids Soc. v.15, n.6, 2012.
NUNES, L.S et al. Outbreaks due to Mycobacterium abscessus subsp. bolletii in southern
Brazil: persistence of a single clone from 2007 to 2011. J Med Microbiol.v. 63. 2014.
PADOVEZE, M. C. et al. Outbreak of surgical infection caused by non-tuberculous
mycobacteria in breast implants in Brazil. J Hosp Infect, v. 67, n. 2, p. 161-7, 2007.
PANAGIOTOU, M. et al. Pulmonary The Epidemiology of Pulmonary Nontuberculous
Mycobacteria: Data from a General Hospital in Athens, Greece, 2007–2013, Medicine. v.
vol. 2014, Article ID 894976, 9 pages, 2014.
PANTEIX, G.; GUTIERREZ, M. C.; GODREUIL, S. Pulmonary tuberculosis due to
Mycobacterium microti: a study of six recent cases in France. J. Med. Microbiol. v.59, p.
984–989, 2010.
PARK, S. et al. Clinical significance of Mycobacterium fortuitum isolated from respiratory
specimens. Respiratory Medicine, v. 102, p. 437–442, 2008.
PARASHAR, D.et al. Optimization of Procedures for Isolation of Mycobacteria from Soil
and Water Samples Obtained in Northern India. Appl. Environ. Microbiol. v.70, n.6, p.3751.
2004.
PEDLEY, S. et al. Pathogenic Mycobacteria in Water. Cornwall: World Health
Organization (WHO). 227 p. 2004.
PEDRO H.S.P et al. Isolamento de micobactérias não-tuberculosas em São José do Rio Preto
entre 1996 e 2005. J Bras Pneumol., v.34, n.11, p.950-955.
PEREZ-MARTINEZ et al. Occurrence of potentially pathogenic nontuberculous
mycobacteria in Mexican household potable water: a pilot study. BMC Research Notes 2013,
6:531. http://www.biomedcentral.com/1756-0500/6/531 acesso: 15 set 2014.
PFYFFER GE. Mycobacterium: general characteristics, laboratory detection and staining
procedures. In: Murray PR, Barron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, (eds). Manual
of clinical Microbiology. 9th ed. Washington DC: American Society for Microbiology. p
543–572, 2007.
PFYFFER, G. E. Mycobacterium: general characteristics, laboratory detection, and staining
procedures. Manual of clinical microbiology. v. 1, p. 543-572, 2006.
PHILIP, M.S & VON REYN, C.F. Infections Due to Nontuberculous Mycobacteria. Clin
Infect Dis. v.33, n.8, p.1363-1374, 2001.
PIERSIMONI C. et al. Comparison of MB/Bact alert 3D system with radiometric BACTEC
system and Lowenstein-Jensen medium for recovery and identification of mycobacteria from
clinical specimens: a multicenter study. Journal of Clinical Microbiology, v.39, n.2, p.6517. 2001.
105
PINTADO V, et al. Nocardial infection in patients infected with the human
immunodeficiency virus. Clin Microbiol Infect. v.9, n.7, p.716–20, 2003.
PORTAELS, B.F, MUYNCK A, SYLLA M.P. Selective Isolation of Mycobacteria from Soil:
a Statistical Analysis Approach. Journal of General Microbiology, v.134, p.849-855, 1988.
PORTAELS, F. Epidemiology of Mycobacterial Diseases. Clinics in Dermatology, v. 13, p.
207-222, 1995.
PREVOTS D.R. et al. Nontuberculous mycobacterial lung disease prevalence at four
integrated healthcare delivery systems. Am J Respir Crit Care Med. v. 182, p. 970–976,
2010.
PREVOTS, D.R & MARRAS, T.K. Epidemiology of Human Pulmonary Infection with
Nontuberculous Mycobacteria A Review. Clin Chest Med., v.36, p. 13-34, 2015.
PRIMM T.P, LUCERO C.A, FALKINHAM J.O. Health impacts of environmental
mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews, v.17, n.1, p.98-106, 2004.
REED, C. et al. Environmental risk factors for infection with Mycobacterium avium complex.
American Journal of Epidemiology, Baltimore, v. 164, n. 1, p. 32-40, July 2006
RESTREPO, A.V. et al. Pesquisa de Micobactérias Ambientais em água de torneira, luvas e
soluções utilizadas em procedimentos cirúrgicos no Hospital Universitário Getúlio Vargas Manaus/AM. ACTA AMAZONICA. vol. 39, n.4, p.889-900, 2009.
RICHTER E, RUSCH-GERDES S, HILLEMANN D. Evaluation of the GenoType
Mycobacterium Assay for identification of mycobacterial species from cultures. Journal of
Clinical Microbiology. v.44, n.5, p.1769-75, 2006.
RINGUET, H. et al. hsp65 sequencing for identification of rapidly growing mycobacteria.
Journal of Clinical Microbiology, v. 37, n. 3, p. 852-857, 1999.
RIPOLL F. et al. Non Mycobacterial Virulence Genes in the Genome of the Emerging
Pathogen Mycobacterium abscessus. Ahmed N, ed. PLoS ONE, v.4, n.6: e5660, 2009.
RISTOLA, M.A. et al.. High rates of disseminated infection due to non-tuberculous
mycobacteria among AIDS patients in Finland. J. Infect. v. 39, p.61–67, 1999.
RUNYON, E.H. Anonymous mycobacteria in pulmonary disease. Med. Clin. North Am.
v.43, p.273–290, 1959.
ROBERTS, M.C. Update on macrolide-lincosamidestreptogramin, ketolide,
oxazolidinone resistance genes. FEMS Microbiol. Lett., v.282, p. 147–59, 2008.
and
ROCHA A.S. et al. Novel allelic variants of mycobacteria isolated in Brazil as determined by
PCR-restriction enzyme analysis of hsp65. J Clin Microbiol.v. 40, p.4191-96, 2002.
106
ROTH, A. et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria
based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. v.36,
p.139-47, 1998.
RUIZ-ARAGON, J. et al. [Susceptibility to antimicrobial agents of rapidly growing
mycobacteria]. Rev Esp Quimioter, v. 20, n. 4, p. 429-32, 2007.
RYNKIEWICZ, D. L. Clinical and microbiological assessment of Mycobacterium simiae
isolates from a single laboratory in southern Arizona. Clin. Infect. Dis. v. 26, p.625–630,
1998.
SALEEB, P.;OLIVIER, K.N. Pulmonary Nontuberculous Mycobacterial Disease: New
Insights into Risck Factors for Susceptibility, Epidemiology, and Approaches to Management
in Immunocompetent and Immunocompromised Patientes. Current Infectious Disease
Reports, v.12,n.2, p. 198-203, 2010.
SALAH B. et al . Mycobacterium marseillense sp. nov., Mycobacterium timonense sp. nov.
and Mycobacterium bouchedurhonense sp. nov., members of the Mycobacterium avium
complex. Iskandar International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.
v. 59, p.2803–2808, 2009.
SAMPAIO, J. L. et al. Application of four molecular typing methods for analysis of
Mycobacterium fortuitum group strains causing post-mammaplasty infections. Clin
Microbiol Infect, v. 12, n. 2, p. 142-9, 2006.
SCHLOSSBERG D. Tuberculosis & Nontuberculous Mycobacterial Infections. 5th ed.
Philadelphia: McGraw-Hill. p 413-494, 2006.
SCARPARO C, et al. Direct identification of mycobacteria from MB/BacT alert 3D bottles:
comparative evaluation of two commercial probe assays. Journal of Clinical Microbiology,
v.39, n.9, p.3222-7, 2001.
SCHULZE-RÖBBECKE, R.; JANNING, B.; FISCHEDER, R. Occurrence of mycobacteria
in biofilm samples. Tubercle Lung Dis.,v.73, p. 141-144, 1992.
SENNA S.G. et al. Sequencing of hsp65 Gene for Identification of Mycobacterium species
isolated from environmental and clinical sources in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol.
v.46, n.11, p. 3822-3825, 2008.
SNIEZEK, P. J. et al. Rapidly growing mycobacterial infections after pedicures. Arch
Dermatol, v. 139, n. 5, p. 629-34, 2003.
SETHI S, ARORA S, GUPTA V, KUMAR S. Cutaneous Mycobacterium fortuitumInfection:
Successfully Treated with Amikacin and Ofloxacin Combination.Indian Journal of
Dermatology, v. 59, n. 4, p.383-384, 2014.
SHIN J.H, CHO E.J, LEE J.Y, Y.U J.Y. Novel diagnostic algorithm using tuf gene
amplification and restriction fragment length polymorphism is promising tool for
identification of nontuberculous mycobacteria. J Microbiol Biotechnol. v.19, n.3, p. 323330, 2009.
107
SHIN J.H. et al. Prevalence of non-tuberculous mycobacteria in a hospital environment. J
Hosp Infect. v.65, n.2, p.143-8, 2007.
SHINNICK T.M. The 65-Kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Journal of
Bacteriology, v. 169, n. 3, p. 1080-1088, 1987.
SILVA, C. F. et al. Hsp65 PCR: restriction enzyme analysis (PRA) for identifi cation of
mycobacteria in the clinical laboratory. Rev. Inst. Med. Trop.,v. 43, p. 25-28, 2001.
SINGH, A.K.R.S.K. et al. Mixed Cutaneous Infection Caused by Mycobacterium
szulgai and Mycobacterium intermedium in a Healthy Adult Female: A Rare Case
Report,” Case Reports in Dermatological Medicine, Article ID 607519, 4 p. 2015.
SMITH, D.S. Mycobacterium terrae: Case Reports, Literature Review, and In Vitro
Antibiotic Susceptibility Testing, Clinical Infectious Diseases, v. 30, p.444–53, 2000.
SMOLE, S.C. et al. Clinical and Epidemiological Correlates of Genotypes within
the Mycobacterium Avium Complex Defined by Restriction and Sequence Analysis
of hsp65. Journal of Clinical Microbiology, v.40, n.9, p.3374–3380, 2002.
SNIEZEK, P. J. et al. Rapidly growing mycobacterial infections after pedicures. Arch
Dermatol, v. 139, n. 5, p. 629-34, 2003.
SPRINGER B. et al. Isolation and characterization of a unique group of slowly growing
mycobacteria: description of Mycobacterium lentiflavum sp. nov.J Clin Microbiol., v. 34,
n.5, p.1100-7, 1996.
STAMM L.M.L & BROWN EJ. Mycobacterium marinum: the generalization and
specialization of a pathogenic mycobacterium. Microb Infect. v.6, p.1418-1428, 2004.
SUFFYS P.N. et al. Rapid identification of Mycobacteria to the species level using INNOLiPA Mycobacteria, a reverse hybridization assay. Journal of Clinical Microbiology, v. 39,
n.12, p.4477-82, 2001.
TAKEWAKI, S.; OKUZUMI, K.; ISHIKO, H.; NAKAHARA, K.; OHKUBO, A.; NAGAI,
R. Genusspecific polymerase chain reaction for the mycobacterial dnaJ gene and speciesspecific oligonucleotide probes. J. Clin. Microbiol., v.31, p.446-50, 1993.
TANG, S.S. et al. Rapidly growing mycobacteria in Singapore, 2006–2011 Clin Microbiol
Infect. 2014 .
TELENTI A. et al. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase
chain reaction and restriction enzyme analysis. Journal of Clinical Microbiology. v31, n.2,
p.175-8, 1993.
THOMSON, R. et al. Mycobacterium abscessus isolated from municipal water - a potential
source of human infection. BMC Infectious Diseases v.13, p. 241. 2013a. Disponivel em:
http://www.biomedcentral.com/1471-2334/13/241. Acesso em: 13 out 2014.
108
THOMSON, R. et al. M. Isolation of Nontuberculous Mycobacteria (NTM) from Household
Water and Shower Aerosols in Patients with Pulmonary Disease Caused by NTM. Journal of
Clinical Microbiology, v.5, n. 9, p. 3006–3011, 2013b.
THOMSON, R. et al. Factors associated with the isolation of Nontuberculous mycobacteria
(NTM) from a large municipal water system in Brisbane, Australia. BMC Microbiology,
v. 13:89, 2013c.
THOREL, M.F., HUCHZERMEYER, H.F., AND MICHEL, A.L. Mycobacterium avium and
Mycobacterium intracellulare infection in mammals. Rev. Sci. Tech. v.20, p.204—218.
2001.
TOBIN-D’ANGELO, M.J. et al. Hospital water as a source of Mycobacterium avium
complex isolates in respiratory specimens. J Infect Dis, v.189, p.98–104, 2004.
TORTOLI, E. The newmycobacteria: an update. FEMS Immunol. Med. Microbiol., v. 48, p.
159–178, 2006.
TORTOLI, E. Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria
of the 1990s. Clin Microbiol Rev, v.16, p.319–354, 2003.
TORTOLI E. et al. Performance assessment of new multiplex probe assay for identification of
mycobacteria.Journal of Clinical Microbiology. v.39, n.3 p.1079-84. v.41 n.4 p.1447-53.
2001.
TORTOLI, E. Clinical manifestations of nontuberculous mycobacteria infections. Clinical
Microbiology and Infections, v.15, p. 906-910, 2009.
TORTOLI E. Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria
of the 1990. Clin Microbiol Rev. v.16, n.2, p. 319-54, 2003.
TORTOLI, E.; MATTEI, R.; RUSSO, C.; SCARPARO, C. Mycobacterium lentiflavum, an
emerging pathogen? J. Infect. p.1-3, 2005.
TORTOLI E. Standard operating procedure for optimal identification of mycobacteria using
16s Rrna gene sequences. Standarts In Genomic Sciences, v. 3, p.145-152, 2010.
TORVINEN, E. et al. Mycobacteria in Water and Loose Deposits of Drinking Water
Distribution Systems im Finland. Applied and Environmental Microbiology, v. 70, p. 19731981, 2004.
TURENNE, C. Y.; TSCHETTER, L.; WOLFE, J.; KABANI, A. Necessity of QualityControlled 16S rRNA Gene Sequence Databases: Identifying Nontuberculous Mycobacterium
Species. Journal of Clinical Microbiology, v. 39, p. 3637-3648, 2001.
UCHIYA K. et al. Comparative Genome Analysis ofMycobacterium avium Revealed Genetic
Diversity in Strains that Cause Pulmonary and Disseminated Disease. Neyrolles O, ed. PLoS
ONE, v.8, n.8, 2013.
109
UEKI, S.Y.M. et al. Micobactérias não-tuberculosas: diversidade das espécies no estado de
São Paulo. J. Bras. de Patol. e Med. Lab., v.41, n.1,p.1-8, 2005.
ULRICHS, T. et al. Modiﬁed immunohistological staining allows detection of Ziehl–Neelsennegative Mycobacterium tuberculosis organisms and their precise localization in human tissue
J Pathol. v.205, p. 633–640, 2005.
VAEREWYCK, M.J.M.; et al. Mycobacteria in drinking water distribution systems: ecology
and significance for humam health. EEMS Microbiol. Rev, v. 29, p.911-934, 2005.
VAN INGEN J. Diagnosis of nontuberculous mycobacterial infections. Seminars in
Respiratory and Critical Care Medicine, v. 34, n.1, p.103-9, 2013.
VAN INGEN, J. et al. In vitro synergy between clofazimine and amikacin in treatment of
nontuberculous
mycobacterial
disease.
Antimicrobial
Agents
and
Chemotherapy,Amsterdam, v. 56, n.12, p. 6324-6327, 2012.
VAN IGEN, J. et al. “Clinical relevance of Mycobacterium szulgai in
Netherlands,” Clinical Infectious Diseases, vol. 46, n. 8, p. 1200–1205, 2008.
The
VELAYATI, A.A et.al. Molecular Epidemiology of Nontuberculous Mycobacteria Isolates
from Clinical and Environmental Sources of a Metropolitan City. PLOS ONE, v.9, 2014.
VON REYN, C.F. et al. Persistent colonisation of potable water as a source of
Mycobacterium avium infection in AIDS. Lancet, 343, p.1137–1411, 1994.
WALSH DS, PORTAELS F, MEYERS WM. Buruli ulcer: Advances in understanding
Mycobacterium ulcerans infection. Dermatol Clin, v. 29, p.1-8, 2011.
WALLACE Jr, R. J. et al. Spectrum of disease due to rapidly growing mycobacteria. Rev.
Infect. Dis., Chicago, v. 5, p.657–679, 1983.
WALLACE, R.J., MUSSER, J.M., HULL, S.I., SILCOX, V.A., STEELE, L.C.,
FORRESTER, G.D., LABIDI, A. AND SELANDER, R.K. Diversity and sources of rapidly
growing mycobacteria associated with infections following cardiac surgery. Journal of
Infectious Disease, v. 159, p. 709-716, 1989.
WANG, Y. et al. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping
site and landfills in Japan. Microbiol Immunol, v.50, p.513–524, 2006.
WANG, S.X.; TAY, L.; SNG, L.H. Rapid identification of pathogenic rapidly growing
mycobacteria by pcr-restriction endonuclease analysis. An. Acad. Med. Singapore, v. 34,
n.1, p.137-140, 2005.
WAYNE L.G, KUBICA, G.P. Family Mycobacteriaceae: Genus Mycobacterium. In: Sneath
PH, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG, (eds). Bergey’s manual of systematic bacteriology.
Baltimore: Williams &Wilkins. vol II, p.1436-1457, 1986.
110
WEINBERGER M. et al. Disseminated infection with Mycobacterium gordonae: report a case
and critical review of the literature. Clin Infect Dis., v. 14, p. 1229-1239, 1992.
WENDT, S.L. et al. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. III. Isolation
of potentially pathogenic mycobacteria from aerosols. Am. Rev. Respir. Dis., v.122, p.259263, 1980.
WHILEY H. et al. Mycobacterium avium complex – the role of potable water in disease
transmission. Journal of Applied Microbiology, v. 113, p.223–232, 2012.
WHITE C.I. et.al. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in freeliving amoebae
isolated from fields not used for grazing. Veterinary Record, v,166, p.401–402, 2010.
WINN J.W. et al. Micobactérias. In: ____. Koneman, diagnóstico microbiológico: texto e
atlas colorido. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
WINTHROP K.L et al. Pulmonary nontuberculous mycobacterial disease prevalence and
clinical features: an emerging public health disease. Am J Respir Crit Care Med, v.182, n.7,
p. 977-82, 2010.
WOLINSKY, E. Mycobacterial lymphadenitis in children: a prospective study of 105
nontuberculous cases with long-term follow-up. Clin. Infect. Dis, v. 20, p.954-963, 1995.
WU, T., LU, C. & LAI, H. Current Situations on Identification of Nontuberculous
Mycobacteria. Journal of Biomedical Laboratory Sciences, v.21, n,1, p.1-6, 2009.
YAJKO, D.M. et al. Mycobacterium avium complex in water, food, and soil samples
collected from the environment of HIV-infected individuals. J. Acquir. Immune Defic.
Syndr. Hum. Retrovirol. v.9, p. 176–182, 1995.
ZAMARIOLI L. A. et al. Estudo descritivo da freqüência de micobactérias não tuberculosas
na Baixada Santista (SP). J. Bras. Pneumol, Brasília, v. 34, suppl. 8, p. 590-595, 2008.
ZOLG, J.W. & PHILIPPI-SCHULZ, S. The superoxide dismutase gene, a target for
detection and identification of mycobacteria by PCR. J. Clin. Microbiol., v.32, p. 2801–
2812, 1994.
111
APÊNDICE A- Questionário Epidemiológico
112
Data
_/___/_____
Ficha n°______
NÚCLEO DE SAÚDE
CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA
QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
1)Nome Completo:____________________________________________________________________
2)Endereço Residencial: ____________________________________________________
Bairro: ___________________________ Cidade:____________________________
Telefone: (______) (______) __________________________________
3) Data de Nascimento: _____/_____/_____
4) Gênero:
(
) Masc
(
(
(
) IGN
) IGN
) Fem
5) Estado Civil: ( ) casado ( ) solteiro ( ) viúvo
( )separado/Divorciado/Desquitado ( )IGN
6) Raça/Cor: ____________
7) Profissão:_________________
8) Escolaridade
(
) 1o grau completo
(
) 2o grau completo
(
) 3o grau completo
( ) IGN
(
) 1o grau incompleto
(
(
( )S/ Esc
9) Fatores Preditivos Positivos
a) Tosse
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
b) Escarro
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
c) Hemoptise
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
d) Emagrecimento
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
e) Dor torácica
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
f) Dispnéia
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
g) Anorexia
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
h) Febre
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
i) Calafrios
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
113
10) Fatores de risco associados a doenças pulmonares:
a) Uso de cigarro
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
b) Hepatopatias
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
c) Diabetes Mellitus (DM)
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
d) Neoplasia maligna
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
i) Uso de Corticóide ou imunossupressores
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
m) Desnutrição (perda >15% do peso corporal)
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
n) Alcoolismo
(
) Sim
(
) Não
(
) IGN
j) Exposição a sílica, fuligem pó de carvão,
cimento, telhas de amianto
11) Presença de co-morbidades:
SIM (
)
NÃO ( )
Tipos de co-morbidades:
( ) Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)
(
) HIV
(
) Tuberculose
(
) Fibrose cística
(
) Outras:____________
12) Tratamento:
(
) Sim
Data do início do tratamento: _____/_____/_____
Data do encerramento: ____/____/____
Motivo: ______________
13) Foi submetido a tratamento anterior?
(
) Sim
Qual?______
( )Não
(
) Não
114
14) Situação de moradia
(
) Área alagada
(
14.1 Casa própria:
) Esgotos abertos (
) Saneamento básico adequado
( ) sim
(
) não
14.2 Tempo de residência:
14.3 Número de pessoas que residem na casa:
14.4 Sistema de abastecimento de água:
(
) Rede de abastecimento pública ( ) poço comum
(
) Rio ( ) Outros.Quais__________
14.5 Armazenamento de água para alimentação
(
) pote
(
) Recipientes em geladeira ( ) Outros
14.6 Presença de quintal na casa
( ) Sim
(
) Não
15) Realiza atividades freqüentes com terra ou água?
Especificar______________________________
Responsável pelo preenchimento da ficha:__________________________
115
APÊNDICE B- Parecer Ético
116
117
APÊNDICE C- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
118
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Você está sendo convidado para participar da pesquisa: AVALIAÇÃO DA
FREQUÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE MICOBACTÉRIAS NÃO
CAUSADORAS DE TUBERCULOSE(MNT) E COMPARAÇÃO COM ISOLADOS
AMBIENTAIS.
Você foi selecionado a tomar parte da pesquisa e sua participação não é obrigatória. A
qualquer momento você poderá desistir de participar e retirar seu consentimento.
Sua recusa não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador ou com a instituição.
O objetivo deste estudo é descrever quais as espécies mais comuns de MNT que
circulam em Rondônia, sua patologia e a variabilidade genética e comparação com cepas de
outras regiões do Brasil e de outros países, além disso será isoladas amostras ambientais de
agua e solo das residências dos pacientes infectados com essas micobactérias.
Sua participação nesta pesquisa consistirá em responder um questionário e permitir a
coleta de amostras de água e solo de sua residência. Não há riscos relacionados com sua
participação, não irá assinar nenhum compromisso.
Os benefícios relacionados com a sua participação é conhecer seu problema de saúde,
entender o mecanismo de infecção das micobacterias, já que são habitantes de uma ampla
variedades de reservatórios ambientais, além disso , os resultados do estudo serão
encaminhados para a Secretaria Estadual de Saude/RO.
119
As informações obtidas através dessa pesquisa serão confidenciais e asseguramos o sigilo
sobre sua participação.
Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e o endereço institucional do
pesquisador principal e do CEP, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação,
agora ou a qualquer momento.
______________________________________
MSc. Maria do Socorro Calixto de Oliveira
120
Maria do Socorro Calixto de Oliveira
Doutoranda em Biologia Experimental/UNIR
Campus - BR 364, Km 9,5
CEP: 76801-059 - Porto Velho - RO
FONE: 9227-9327
[email protected]
Maria Manuela da Fonseca Moura
CIBEBI/UNIR Campus - BR 364, Km 9,5
CEP: 76801-059 - Porto Velho - RO
Tel. 8496-3044
[email protected]
Cleoni Alves Mendes de Lima
LACEN/RO
Rua Anita Garibaldi, 4130. Costa e Silva
CEP: 76803-620 Porto Velho-RO
Tel/FAX: 32165300
[email protected]
Declaro que entendi os objetivos de minha participação na pesquisa e concordo em participar.
_________________________________________
Sujeito da pesquisa

universidade federal de rondônia núcleo de saúde programa

Transcrição

Documentos relacionados

Microbactérias de Crescimento Rápido e Procedimentos Estéticos

Micobactérias

Mycobacterium fortuitum in implantation of breast prosthesis

Informativo da D Mnt - Diretoria de Material

RE/MAX Mongolia

NOTA TÉCNICA CONJUNTA Nº 01/2009 - lacen

Teste IGRA – Interferon Gamma Release Assay para auxílio

Informativo de Janeiro de 2008

Transferir este ficheiro PDF - Acta Farmacêutica Portuguesa

Penetrox-A - macroluzconectores.com.br