Estabelecimento in vitro DE Campomanesia

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS
FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E AMBIENTAIS
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE Campomanesia
adamantium (CAMBESS.) O. BERG
THALITA MARTINHÃO DE SOUSA AZAMBUJA
DOURADOS
MATO GROSSO DO SUL
2013
Engenheira Agrônoma
Orientadora: Profª. Drª. CLÁUDIA ROBERTA DAMIANI
Dissertação apresentada à Universidade Federal da
Grande Dourados como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral –
Bioprospecção, para a obtenção do título de Mestre.
Dourados
Mato Grosso do Sul
2013
Dissertação apresentada como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título
de MESTRE EM BIOLOGIA GERAL
Aprovada em:
_____________________________
___________________________
Profª. Drª. Cláudia Roberta Damiani
Profª. Drª. Maria do Carmo Vieira
(Orientadora – UFGD)
(UFGD)
____________________________
Prof. Dr. Clevison Luiz Giacobbo
(UFFS)
Aos meus queridos pais,
Francisco e Leonilda,
pelo amor incondicional,
que fez com que eu chegasse até aqui
OFEREÇO
A Deus,
por me dar mais essa vitória.
Ao meu marido Luiz,
e à minha filha Carolina,
pelo amor, paciência e compreensão,
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A DEUS, pelas bênçãos derramadas, coragem e por me ajudar até aqui, Amém.
À Profª Drª Cláudia Roberta Damiani, pela orientação, ensinamentos, compreensão,
amizade, confiança em mim depositada e por toda a contribuição para o meu
crescimento pessoal e profissional.
Aos professores membros da Banca Examinadora, por aceitarem fazer parte desse
trabalho e contribuir com seus conhecimentos.
À Universidade Federal da Grande Dourados, pela oportunidade de aprendizado.
À FUNDECT e CNPq pelo apoio financeiro e a CAPES pelo fornecimento da bolsa
de estudo que garantiu o sustento financeiro necessário para a realização deste
trabalho.
Ao secretário do Programa de Pós Graduação Biologia Geral/Bioprospecção, pelo
profissionalismo excelente.
A Taiza e Daniele, alunas do curso de Biotecnologia, que me auxiliaram no
desenvolvimento deste trabalho.
Aos técnicos dos Laboratórios de Botânica e Multiuso-FCBA (Marquinhos, Tati,
Fabi, Mara, Lívia e Jú), pela colaboração e por sempre estarem dispostos a me ajudar.
Às minhas irmãs (brothers) Nayara e Cris, pelo companheirismo e amizade sincera.
Aos meus amigos queridos, pelo carinho, incentivo e por todos os momentos
agradáveis.
Aos meus irmãos Thiago e Thais, meus cunhados Priscila e Cleber, minha sobrinha
Isadora em especial (a tia te ama) e a todos meus familiares, pelo amor e apoio.
A todas as pessoas que colaboraram de forma direta ou indireta, para a realização
deste trabalho.
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................................09
ABSTRACT...............................................................................................................11
INTRODUÇÃO GERAL...........................................................................................13
REFERÊNCIAS.........................................................................................................22
ARTIGO.................................................................................................................... 29
RESUMO................................................................................................................... 30
ABSTRACT................................................................................................................32
INTRODUÇÃO..........................................................................................................34
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 36
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 41
CONCLUSÕES...........................................................................................................56
CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................... 57
REFERÊNCIAS........................................................................................................ 58
ANEXOS....................................................................................................................65
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A) Porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana, B) Porcentagem de
oxidação dos explantes, e, C) Porcentagem de explantes estabelecidos in
vitro de guavira (Campomanesia adamantium) ao final de 56 dias de
cultivo in vitro. UFGD, Dourados, MS, 2013........................................... 42
.
cultivo in vitro, utilizando diferentes concentrações de rifampicina no meio
de cultura. UFGD, Dourados, MS, 2013................................................... 46
cultivo in vitro, tratados com diferentes agentes antimicrobianos. UFGD,
Dourados, MS, 2013.................................................................................. 50
vitro de guavira (Campomanesia adamantium) tratados com diferentes
concentrações de cloreto de mercúrio (HgCl2), aos 56 dias de cultivo in
vitro. Dourados, MS, 2013........................................................................ 53
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. A) Plantas matrizes de Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg do
Horto de Plantas Medicinais (FCA); B) Ramos vegetativos de C.
adamantium utilizados para a retirada dos segmentos nodais durante o
estabelecimento in vitro. UFGD, Dourados, MS, 2013. ........................... 66
Anexo 2. Explantes de guavira (Campomanesia adamantium) tratados com cloreto de
mercúrio durante o estabelecimento in vitro, aos 56 dias de cultivo in vitro.
UFGD, Dourados, MS, 2013. ................................................................... 67
RESUMO
A Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg (guavira) é uma espécie nativa do
Cerrado, com potencial para a exploração sustentável, devido à qualidade nutricional
e a diversidade nas formas de exploração dos frutos e propriedades medicinais da
planta. Naturalmente a guavira é propagada por sementes, porém com limitações,
atribuídas principalmente à recalcitrância e à perda de viabilidade germinativa após a
sua retirada dos frutos. Devido à dificuldade de propagação sexuada, o
desenvolvimento de uma técnica avançada de propagação assexuada da cultura
fornecerá uma via alternativa para a obtenção de mudas da espécie, superando as
limitações do processo germinativo. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi
estabelecer um protocolo de assepsia e estabelecimento in vitro de explantes
caulinares de guavira. O material vegetal utilizado foi coletado de plantas cultivadas
no Horto de Plantas Medicinais, da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA). Os
experimentos foram desenvolvidos nos laboratórios da Faculdade de Ciências
Biológicas e Ambientas (FCBA) da Universidade Federal da Grande Dourados
(UFGD), Dourados-MS, nos períodos de setembro de 2011 a março de 2012 e de
setembro a novembro de 2012. Para atingir os objetivos propostos foram avaliados
diferentes agentes antimicrobianos em tratamentos e delineamentos experimentais
distintos. Experimento 1: Efeito dos agentes químicos (hipoclorito de sódio e
hipoclorito de cálcio a 2,5%), em diferentes tempos de exposição (5 e 10 minutos).
Experimento 2: Pré-tratamento dos ramos vegetativos com ácido ascórbico (100 mg
L-1) seguido da inoculação dos explantes em meio de cultura contendo diferentes
concentrações do antibiótico rifampicina (0 - controle, 10; 20; 30 e 40 µg mL-1).
Experimento 3: Efeito do tratamento por imersão dos ramos vegetativos préestabelecimento com os agentes antimicrobianos tetraciclina (0,3 g L-1), carbendazim
(1,8 g L-1), tetraciclina + carbendazim (nas respectivas concentrações) e controle
(ausência de agente antimicrobiano). Experimento 4: Efeito do cloreto de mercúrio
(HgCl2) em diferentes concentrações: 0 – controle (hipoclorito de sódio a 2,5%);
0,025; 0,050; 0,075 e 0,100%. A partir dos resultados obtidos verificou-se que a
desinfestação dos explantes com hipoclorito de cálcio e hipoclorito de sódio
independente do tempo de desinfestação, 5 ou 10 minutos, não foi eficiente no
controle das contaminações. Porém o tratamento dos explantes com hipoclorito de
cálcio por 5 minutos favoreceu o desenvolvimento de brotações. A imersão dos
ramos vegetativos em solução com ácido ascórbico (100 mg L-1) por 18 horas foi
ineficiente no controle da oxidação dos explantes. Concentrações acima de 30 µg mL1
de rifampicina no meio de cultura controlaram a contaminação por bactérias, no
entanto, inibiram completamente o estabelecimento in vitro de guavira. O tratamento
com a combinação de carbendazim (1,8 g L-1) + tetraciclina (0,3 g L-1) diminuiu a
contaminação por bactérias durante o estabelecimento in vitro. Explantes tratados
com cloreto de mercúrio na concentração 0,064% por 15 minutos apresentaram
redução significativa da contaminação bacteriana, porém não controlou a
contaminação fúngica.
Palavras-chave: guavira, micropropagação, cultura de tecidos, contaminação in
vitro.
ABSTRACT
Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg („Guavira‟) is a species native to the
Brazilian Cerrado bioma. It shows great potential for sustainable exploration due to
its nutritional quality, variation in fruit use and plant medicinal properties. „Guavira‟
is naturally propagated by seeds; however, there is some limitations related to
recalcitrance and loss of viability (germinative capacity) of the seeds after removing
from the fruits. Concerning to the restrictions of sexual propagation, the development
of an advanced technique of asexual propagation will provide a securely alternative to
propagate plants. Therefore, this experiment aimed to establish a protocol for asepsis
and in vitro establishment of stem explants of „guavira‟. The plant material used was
collected from cultivated plants at the Horto de Plantas Medicinais da Faculdade de
Ciências Agrárias (FCA) and trials were carried out in the laboratories belonging to
the Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientas (FCBA) da Universidade Federal
da Grande Dourados (UFGD), Dourados-MS, during september 2011 to march 2012
and september to november 2012. In order to achieve the results it was evaluated
different antimicrobial agents through treatments and distinct experimental design.
Experiment 1: Effect of chemical agents (sodium hypochlorite and calcium
hypochlorite at 2.5%), at different exposition periods (5 to 10 minutes). Experiment
2: Pre-treatment of plant stems with ascorbic acid (100 mg L-1) followed by explant
inoculation in culture medium containing different concentrations of rifampicin
antibiotic (0 - control, 10, 20, 30 and 40 µg mL-1). Experiment 3: Effect of the
immersion treatment of the pre-established stem with the antimicrobials tetracycline
(0.3 g L-1), carbendazin (1.8 g L-1), tetracycline + carbendazin (same respective
concentrations) and control (no antimicrobial agent). Experiment 4: Effect of mercury
chloride (HgCl2) in different concentrations: 0 – control (sodium hypochlorite at
2.5%); 0.025; 0.050; 0.075 and 0.100%. Asepsis of the explants with calcium
hypochlorite for 5 minutes showed higher efficiency in controlling fungal and
bacterial contamination whether comparing to sodium hypochlorite. It also reduced
the oxidation percentage of the explants which resulted in higher percentage of
established explants. The immersion of plant stems in ascorbic acid solution (100 mg
L-1) for 18 hours was apparently inefficient in controlling explant oxidation.
Concentrations above 30 µg mL-1 of rifampicin in the culture medium controlled
efficiently the bacterial contamination; however it completely inhibited in vitro
establishment of „guavira‟. Combining carbendazin (1.8 g L-1) plus tetracycline (0.3 g
L-1) seemed to diminish bacterial and fungal contamination comparing to control and
did not cause explant contamination during in vitro establishment. Mercury chloride
explants-treated showed higher percentages of establishment than sodium
hypochlorite explants-treated at 2.5% (control). Whereas, using the 0.025%
concentration for 15 minutes there was a significative decrease in bacterial.
Keywords: „guavira‟, micropropagation, tissue culture, in vitro contamination.
13
1.
INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Aspectos gerais do Cerrado
O Cerrado, termo utilizado para designar o conjunto de ecossistemas (savanas,
matas, campos e matas de galeria) que ocorrem no Brasil central, é o segundo maior
bioma brasileiro, sendo superado em área, apenas pela Amazônia (EITEN, 1977).
Esse bioma, encontrado predominantemente no planalto central brasileiro, ocupa
mais de 200 milhões de hectares, o que, equivalente a cerca de 20% do território
nacional, distribuídos principalmente nos Estados de Minas Gerais, Goiás, Mato
Grosso, Mato Grosso do Sul, Tocantins, Bahia, Piauí, Maranhão e Distrito Federal. O
Cerrado faz ligações com outros biomas existentes no país como o Pantanal, a
Floresta Amazônica, a Caatinga e a Mata Atlântica, constituindo-se em um elo entre
eles (SCIAMARELLI, 2005; PARTELLI et al., 2010). O Cerrado é considerado a
última fronteira agrícola do planeta (BORLAUG, 2002) e de acordo com Klink e
Machado (2005) possui a mais rica flora dentre as savanas do mundo.
Nas últimas quatro décadas, o Cerrado passou a ser a maior fonte brasileira de
grãos de soja e pastagens, além de significativo produtor de arroz, milho e algodão,
passando ainda a suportar o segundo maior rebanho de gado do país. A exploração do
bioma para a atividade agropecuária resultou em uma extensa conversão e
fragmentação dos espaços naturais. Cerca de 80% da área original já foi alterada de
alguma forma, restando apenas 20% de área natural (PREVEDELLO e CARVALHO,
2006; DOMINGOS, 2008).
Atualmente, órgãos de pesquisa, ensino, proteção ambiental e extensão rural
da região têm estudado e divulgado o potencial de utilização das espécies do Cerrado,
14
além de investir na conscientização dos agricultores quanto à importância de
preservá-las e utilizá-las de forma racional e sustentável (AVIDOS e FERREIRA,
2003).
Os frutos das espécies nativas do Cerrado oferecem alto valor nutricional,
além de atrativos sensoriais como cor, sabor, aromas peculiares e intensos, ainda
pouco explorados comercialmente. O uso sustentável dos frutos nativos pode ser uma
excelente opção para melhorar a saúde da população, além de agregar valores aos
recursos naturais disponíveis no Cerrado, melhorando a renda das pequenas
comunidades rurais e favorecendo a preservação das espécies (AGOSTINI-COSTA e
VIEIRA, 2004). Dentre as diversas formas de uso, os frutos, em geral, são
consumidos in natura ou na forma de sucos, licores, sorvetes, geléias e doces
diversos (ALMEIDA, 1998; SILVA et al., 2001; SILVA et al., 2008). Os frutos do
Cerrado apresentam sabores sui generis e elevados teores de açúcares, proteínas, sais
minerais, ácidos graxos (SILVA et al., 2001), vitaminas do complexo B e
carotenóides (AGOSTINI-COSTA e VIEIRA, 2004).
As espécies frutíferas do Cerrado estão adaptadas aos solos locais e
praticamente não necessitam de insumos químicos, apresentando baixo custo de
implantação e manutenção do pomar. Além de serem usadas na formação de pomares
domésticos e comerciais, as espécies frutíferas nativas do Cerrado podem ser
utilizadas com sucesso na recuperação de áreas desmatadas ou degradadas; no plantio
intercalado com reflorestas; no enriquecimento da flora; no plantio em parques e
jardins; no plantio em áreas acidentadas, para controle de erosão e no plantio de áreas
de proteção ambiental. Além destas características, muitas espécies fazem parte da
15
flora apícola do Cerrado e suas folhas e cascas são empregadas na medicina popular
(SILVA et al., 2001; VIEIRA et al., 2010). Baseando-se na importância nutricional e
na conservação das espécies frutíferas nativas do Cerrado, fica claro, que há um
grande campo com potencial a ser explorado para a inserção destas espécies em
sistemas produtivos. Neste contexto, sabendo-se que a exploração da grande maioria
de frutíferas nativas é essencialmente extrativista, torna-se imprescindível estudo
sobre técnicas de cultivo e propagação para o desenvolvimento de mudas destas
espécies, e a seleção de genótipos superiores para viabilizar o início do
desenvolvimento de um novo cultivo.
1.2. Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg
A guavira, Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg, também
conhecida como gabiroba, guabiroba, guabiroba-do-campo, guariroba, guabiroba-docerrado, guabiroba-lisa, guabiroba-branca, pertencente à família Myrtaceae
(LORENZI, 1998), é uma das diversas frutas nativas do Cerrado, que apresenta
potencial de exploração sustentável em curto prazo (VIEIRA et al., 2010).
A C. adamantium é um arbusto decíduo que pode atingir até 2,0 m de altura.
As folhas são subcoriáceas, glabras quando adultas com cerca de 4 cm de
comprimento e 2 cm de largura. Suas flores são solitárias, andróginas, formadas de
setembro a outubro e os frutos amadurecem nos meses de novembro e dezembro
(DURIGAN et al., 2004; LORENZI et al., 2006). É uma espécie pouco exigente
quanto ao tipo de solo e cresce naturalmente em solos pobres em nutrientes. Seus
frutos apresentam formato redondo, de coloração que varia do verde-escuro ao verdeclaro e amarelo, com aroma adocicado e bastante agradável (VALLILO, 2006).
16
A guavira é uma espécie com potencial para cultivo comercial devido as suas
características agronômicas desejáveis, como alto rendimento e elevados teores de
sólidos solúveis (brix) (MELCHIOR et al., 2006)
Os frutos coletados em diferentes estádios de amadurecimento apresentam
potencial para serem utilizados in natura, na indústria de alimentos e como
flavorizantes na indústria de bebidas, devido à elevada acidez, ácido ascórbico
(vitamina C), minerais, fibras alimentares e hidrocarbonetos monoterpênicos (αpineno, limoneno e β-(z) ocimeno), presentes em maior quantidade no óleo volátil
dos frutos, e que lhes conferem o aroma cítrico (VALLILO et al., 2006).
Para muitas comunidades rurais do Mato Grosso do Sul, o comércio dos frutos
de guavira é uma fonte de renda. De forma extrativista, os frutos são coletados e
vendidos às margens das rodovias e em feiras, mas, sem um manejo adequado, o
extrativismo pode ter impactos negativos para a espécie. Incentivar o cultivo é uma
maneira de preservar a espécie através da exploração sustentável, e uma alternativa
para melhorar a qualidade de vida dessas comunidades.
O cultivo agrícola, no entanto, só será possível se houver conhecimento das
espécies no que se refere às formas de propagação, aspectos fisiológicos, nutricionais
e outros (MELCHIOR, 2006). Com relação à propagação da guavira, naturalmente é
propagada por sementes (PORTO e GULIAS, 2006), porém, sua propagação sexuada
apresenta algumas limitações, devido principalmente às suas sementes apresentarem
recalcitrância, não suportando armazenamento a baixas temperaturas e sendo
intolerante à dessecação (MELCHIOR et al., 2006). Devido a curta viabilidade das
17
sementes, o semeio deve ser feito imediatamente após a colheita dos frutos (AVIDOS
e FERREIRA, 2003).
Dentre os primeiros trabalhos realizados para avaliar à propagação da espécie,
destaca-se o de Carmona et al. (1994), onde os autores verificaram um baixo
percentual de germinação de sementes e atribuem esse fato à presença de substâncias
inibidoras do processo germinativo presentes na mucilagem encontrada em torno das
sementes.
Melchior et al. (2006) estudaram o comportamento de sementes de guavira em
relação ao ponto de colheita, armazenamento e implicações na germinação e
verificaram uma relação entre a maturidade dos frutos e a germinação, sendo
necessária a colheita dos frutos com mínimo de 15,65° Brix. Os autores também
classificaram as sementes como recalcitrantes, por não suportarem armazenamento a
baixa temperatura e nem dessecação. Contudo, a semeadura deve ser feita logo após a
extração dos frutos.
Scalon et al. (2009) avaliaram o potencial germinativo das sementes de
Campomanesia adamantium e o crescimento inicial das plantas e observaram que a
germinação das sementes aos três dias após a retirada do fruto é elevada e não varia
em função do processamento e temperatura de incubação, no entanto, quando
mantidas no fruto as sementes perdem a qualidade fisiológica, confirmando a perda
da viabilidade e vigor das sementes.
Dresch et al. (2012) ao avaliarem a influência da temperatura e da umidade do
substrato na germinação das sementes de Campomanesia adamantium, verificaram
que as sementes recém-processadas apresentaram maior germinação e vigor em
18
relação às sementes secas e armazenadas e que a redução do grau de umidade para
27% e o armazenamento prejudicaram a qualidade fisiológica das sementes.
1.3. A cultura de tecidos
A cultura de tecidos vegetais possibilita a multiplicação de plantas em
condições fitossanitárias ideais, em ambiente controlado e espaço reduzido,
independente da influência de fatores ambientais, sazonais e geográficos, ampliando
as perspectivas de exploração econômica dessas espécies (BONGAERTS, 1998;
SATO e YAMADA, 2008). É iniciada a partir da inoculação sob condições
assépticas, de pequenos propágulos ou de fragmentos de tecidos e órgãos vegetais
denominados explantes, em meio nutritivo sólido ou líquido, constituído,
principalmente, de sais minerais, vitaminas e fitorreguladores (GEORGE et al.,
2008). Os explantes podem regenerar órgãos vegetais ou plantas completas idênticas
à planta matriz, ou ainda dar origem a massas celulares denominadas calos, que
também podem regenerar plantas (por organogênese indireta), porém são sistemas
mais indicados à produção de substâncias in vitro. Essa regeneração fundamenta-se
na característica de totipotência da célula vegetal, a qual permite manifestar a
capacidade de iniciar a formação de novo indivíduo (TORRES et al., 2000).
Uma das técnicas mais utilizadas na cultura de tecidos vegetais é a propagação in
vitro ou micropropagação. Trata-se de um método rápido e eficiente para a
multiplicação em larga escala de plantas livres de patógenos, geneticamente
uniformes, viabilizando a produção vegetal quando há dificuldades nos mecanismos
naturais de reprodução, ou nos casos de espécies ameaçadas de extinção. É o único
recurso da cultura de tecidos vegetais que tem documentado de forma efetiva a
19
possibilidade de se produzir espécies de interesse em larga escala, permitindo a
manutenção de coleções ativas ou de base de germoplasma vegetal (HONDA et al.,
2001; WALIA et al., 2003; GIRI et al., 2004; HIREGOUDAR et al., 2005).
O sucesso da regeneração in vitro depende do controle da morfogênese, que é
influenciada por diversos fatores, tais como o tipo e a idade do explante, o genótipo, o
estado fisiológico da planta matriz, os componentes do meio de cultura, os
reguladores de crescimento e as condições físicas da cultura. A interação entre todos
estes fatores leva à indução e expressão de um modo específico de diferenciação e
desenvolvimento celular (GAJ, 2004; GIRI et al., 2004).
1.4. A contaminação in vitro
Contaminações são um dos maiores problemas da cultura de células e tecidos
de plantas (LEIFERT e CASSELLS, 2001). O elevado grau de contaminação e a
localização sistêmica de microrganismos são responsáveis, em alguns casos, pelo
insucesso da implantação de culturas in vitro, prejudicando inclusive a condução de
experimentos em função do reduzido número de explantes obtidos (PASQUAL,
2001). Os contaminantes podem ser introduzidos com os explantes, por ocasião do
seu estabelecimento in vitro (CAMARA, WILLADINO e ALBUQUERQUE, 2010).
A princípio todas as espécies de fungos, leveduras e algumas bactérias
representam risco severo para a cultura de tecidos de plantas, porque elas crescem
bem nos meios de cultura para tecidos vegetais e podem matar os explantes, por
causa da redução do pH do meio, da produção de metabólitos tóxicos e da
competição por nutrientes (LEIFERT e WAITES, 1994). Por isso o estabelecimento
20
de um protocolo de esterilização superficial dos explantes é essencial no cultivo in
vitro de plantas.
Geralmente a assepsia dos explantes é realizada por meio de etanol e
alvejantes comerciais à base de cloro como o hipoclorito de sódio (NaOCl) e de
cálcio (CaOCl2) com teor de cloro ativo que pode variar de 2,0% a 2,5%. Um
espalhante adesivo é utilizado a exemplo do Tween 80 (1 a 2 gotas/100 mL) nas
soluções à base de cloro para aumentar a penetração dos agentes desinfestantes no
tecido vegetal (PASQUAL, 2001). No entanto, esse processo convencional de
assepsia pode não ser suficiente para eliminar completamente os micro-organismos
contaminantes, nesse caso outros agentes antimicrobianos podem ser utilizado, como
antibióticos, fungicidas, cloreto de mercúrio, cloreto de benzalcônio e peróxido de
hidrogênio.
Os agentes antimicrobianos podem ser utilizados de maneira associada ou
não, adicionado ao meio de cultura ou em soluções preparadas para a imersão dos
explantes (MARTINS-CORDER e BORGES JR, 1999; SCHERWINSKI-PEREIRA
e COSTA, 2010). As concentrações e o tempo de exposição dos agentes
antimicrobianos podem variar muito (MONTARROYOS, 2000), sendo necessária a
adequação de acordo com a espécie e a sensibilidade do tecido a ser desinfestado
(ERIG e SCHUCH, 2003).
1.5. A oxidação fenólica
Na micropropagação, outro fator que deve ser levado em consideração além
da contaminação in vitro é a oxidação fenólica. A ocorrência de oxidação pode
dificultar o estabelecimento inicial do cultivo in vitro (BASSAN, et al., 2006).
21
No cultivo in vitro, o processo de oxidação pode ser desencadeado por injúrias
causadas aos tecidos vegetais, como o corte dos explantes com bisturi (CID e
TEIXEIRA, 2010) ou devido à utilização de agentes químicos na esterilização
superficial. O tecido lesionado libera compostos fenólicos que em contato com as
enzimas polifenoloxidases oxidam os polifenóis formando as quinonas. As quinonas
são substâncias altamente ativas e, posteriormente à sua produção, polimerizam e ou
oxidam proteínas para formar compostos melânicos, os quais são responsáveis pelo
escurecimento das partes excisadas dos explantes e do meio de cultura (GEORGE e
SHERRINGTON, 1984). O acúmulo de polifenóis e de produtos da oxidação
modificam a composição do meio e a absorção de metabólitos (ANDRADE, 2000),
inibindo o crescimento e podendo causar a morte dos explantes (SATO et al., 2001).
22
REFERÊNCIAS
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29
ARTIGO
ESTERILIZAÇÃO SUPERFICIAL E ESTABELECIMENTO IN VITRO DE
EXPLANTES CAULINARES DE Campomanesia adamantium (CAMBESS.) O.
BERG
30
ESTERILIZAÇÃO SUPERFICIAL E ESTABELECIMENTO IN VITRO DE
EXPLANTES CAULINARES DE Campomanesia adamantium (CAMBESS.) O.
BERG
RESUMO
O objetivo com este trabalho foi estabelecer um protocolo para assepsia e
estabelecimento in vitro de explantes caulinares de Campomanesia adamantium
(Cambess.) O. Berg (guavira). O material vegetal utilizado foi coletado de plantas
cultivadas no Horto de Plantas Medicinais da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA).
Os experimentos foram desenvolvidos nos laboratórios da Faculdade de Ciências
Biológicas e Ambientas (FCBA) da Universidade Federal da Grande Dourados
(UFGD), Dourados-MS, nos períodos de setembro de 2011 a março de 2012 e de
setembro a novembro de 2012. Para atingir os objetivos propostos foram avaliados
diferentes agentes antimicrobianos em tratamentos e delineamentos experimentais
distintos. Experimento 1: Efeito dos agentes químicos (hipoclorito de sódio e
hipoclorito de cálcio a 2,5%), em diferentes tempos de exposição (5 e 10 minutos).
Experimento 2: Pré-tratamento dos ramos vegetativos com ácido ascórbico (100 mg
L-1) seguido da inoculação dos explantes em meio de cultura contendo diferentes
concentrações do antibiótico rifampicina (0 - controle, 10; 20; 30 e 40 µg mL-1).
Experimento 3: Efeito do tratamento por imersão dos ramos vegetativos préestabelecimento com os agentes antimicrobianos tetraciclina (0,3 g L-1), carbendazim
(1,8 g L-1), tetraciclina + carbendazim (nas respectivas concentrações) e controle
(ausência de agente antimicrobiano). Experimento 4: Efeito do cloreto de mercúrio
31
(HgCl2) em diferentes concentrações: 0 – controle (hipoclorito de sódio a 2,5%);
0,025; 0,050; 0,075 e 0,100%. A partir dos resultados obtidos verificou-se que a
desinfestação dos explantes com hipoclorito de cálcio e hipoclorito de sódio
independente do tempo de desinfestação 5 ou 10 minutos, não foi eficiente no
controle das contaminações. Porém o tratamento em explantes com hipoclorito de
cálcio por 5 minutos favoreceu o desenvolvimento de brotações. A imersão dos
ramos vegetativos em solução com ácido ascórbico (100 mg L-1) por 18 horas foi
ineficiente no controle da oxidação dos explantes. Concentrações acima de 30 µgmL-1
de rifampicina no meio de cultura controlaram a contaminação por bactérias, no
entanto, inibiram completamente o estabelecimento in vitro de guavira. O tratamento
com a combinação de carbendazim (1,8 gL-1) + tetraciclina (0,3 g L-1) diminuiu a
contaminação por bactérias durante o estabelecimento in vitro. Explantes tratados
com cloreto de mercúrio na concentração 0,064% por 15 minutos apresentaram
redução significativa da contaminação bacteriana, porém não controlou a
contaminação fúngica.
Palavras-chave: guavira, micropropagação, cultura de tecidos, contaminação in
vitro.
32
ABSTRACT
This experiment aimed to establish a protocol for asepsis and in vitro establishment
of stem explants of Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg („guavira‟). The
plant material used was collected from cultivated plants at the Horto de Plantas
Medicinais da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA) and trials were carried out in
the laboratories belonging to the Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientas
(FCBA) da Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD), Dourados-MS,
during 2011-2012. In order to achieve the results it was evaluated different
antimicrobial agents through treatments and distinct experimental design. Experiment
1: Effect of chemical agents (sodium hypochlorite and calcium hypochlorite at 2.5%),
at different exposition periods (5 to 10 minutes). Experiment 2: Pre-treatment of plant
stems with ascorbic acid (100 mg L-1) followed by explant inoculation in culture
medium containing different concentrations of rifampicin antibiotic (0 - control; 10;
20; 30 and 40 µg mL-1). Experiment 3: Effect of the immersion treatment of the preestablished stem with the antimicrobials tetracycline (0.3 g L-1), carbendazin (1.8 g L1
), tetracycline + carbendazin (same respective concentrations) and control (no
antimicrobial agent). Experiment 4: Effect of mercury chloride (HgCl2) in different
concentrations: 0 – control (sodium hypochlorite at 2.5%); 0.025; 0.050; 0.075 and
0.100%. Asepsis of the explants with calcium hypochlorite for 5 minutes showed
higher efficiency in controlling fungal and bacterial contamination whether
comparing to sodium hypochlorite. It also reduced the oxidation percentage of the
explants which resulted in higher percentage of established explants. The immersion
of plant stems in ascorbic acid solution (100 mg L-1) for 18 hours was apparently
33
inefficient in controlling explant oxidation. Concentrations above 30 µg mL-1 of
rifampicin in the culture medium controlled efficiently the bacterial contamination;
however it completely inhibited in vitro establishment of „guavira‟. Combining
carbendazin (1.8 g L-1) plus tetracycline (0.3 g L-1) seemed to diminish bacterial and
fungal contamination comparing to control and did not cause explant contamination
during in vitro establishment. Mercury chloride explants-treated showed higher
percentages of establishment than sodium hypochlorite explants-treated at 2.5%
(control). Whereas, using the 0.025% concentration for 15 minutes there was a
significative decrease in bacterial contamination and explants oxidation.
Keywords: „guavira‟, micropropagation, tissue culture, in vitro contamination.
34
INTRODUÇÃO
O Cerrado constitui o segundo maior bioma do país e apresenta uma flora, que
é considerada a mais rica dentre as savanas do mundo, estimando-se um número entre
4 mil a 10 mil espécies de plantas vasculares (SOUZA et al., 2002; PEREIRA, 1997),
podendo-se dar destaque às espécies frutíferas.
As características dos frutos do Cerrado são os aromas e os sabores peculiares
muito apreciados pelos consumidores. Os frutos são comercializados, as margens de
rodovias, em feiras urbanas e até mesmo em centrais de abastecimento (CEASAs),
com preços que competem com as frutas tradicionais. O pouco conhecimento sobre
as espécies frutíferas do Cerrado faz com que sua única forma de exploração seja
extrativista e predatória, o que vem despertando o interesse de diversos segmentos da
sociedade por serem espécies com elevado potencial para a exploração sustentada a
médio e curto prazo (VIEIRA, 2010).
A Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg (Myrtaceae), conhecida
como guavira ou gabiroba é uma das diversas frutas nativas do bioma Cerrado com
boas perspectivas de produção comercial. Apresenta características desejáveis, como
a qualidade nutricional dos seus frutos, precocidade para o início da produção e
grande aceitação no mercado (VIEIRA, 2010), porém ainda são poucos os estudos
sobre o seu cultivo.
Os frutos da guavira são suculentos, ácidos e levemente adocicados, podendo
ser consumidos in natura, ou na forma de sucos, doces, sorvetes, matéria-prima para
licores (PORTO e GULIAS, 2006), bem como flavorizante na indústria de bebidas
35
(VALLILO et al., 2006). É também considerada uma planta medicinal, possuindo
propriedades antidiarréicas (PARTELLI et al., 2010).
A propagação da guavira é realizada naturalmente por meio de sementes. No
entanto, um fator limitante da propagação sexuada nesta espécie encontra-se na perda
do poder germinativo das sementes, as quais necessitam ser semeadas logo após a sua
extração dos frutos (CARMONA et al., 1994; MELCHIOR et al., 2006; SCALON et
al., 2009). O comportamento das sementes de guavira indica que a espécie pode ser
classificada como recalcitrante, por não suportar armazenamento à baixa temperatura
e ser intolerante à dessecação (MELCHIOR et al., 2006).
Considerando os entraves encontrados para a obtenção de mudas de guavira
por meio da propagação sexuada, uma alternativa viável seria a micropropagação in
vitro. Em comparação às técnicas de propagação tradicional, a micropropagação
apresenta significativas vantagens, entre as quais, a possibilidade de propagar
rapidamente em larga escala novos genótipos, obter plantas livres de doenças e
propagar vegetativamente espécies difíceis de serem propagadas por outros métodos
(DAMIANI e SCHUCH, 2008). Não foram encontrados na literatura consultada
trabalhos sobre a micropropagação de guavira.
A obtenção de mudas por micropropagação depende do sucesso na fase de
estabelecimento in vitro. Em espécies lenhosas, como a maioria das frutíferas, de
acordo com Schuch e Erig (2005), o estabelecimento in vitro apresenta dois
problemas principais: a contaminação e a oxidação, além da origem do material
utilizado como matriz. Na ausência de um jardim clonal ou plantas matrizes
cultivadas em condições controladas, os ramos vegetativos para o estabelecimento in
36
vitro da cultura devem ser obtidos diretamente de plantas oriundas do campo, o que
geralmente resulta em maior grau de contaminação e baixo percentual de
sobrevivência. De acordo com Pasqual et al. (2010), plantas matrizes oriundas do
campo ficam expostas a intempéries e insetos, que provocam ferimentos na planta,
tornando-as mais susceptíveis a entrada de micro-organismos patogênicos. A
utilização de matrizes com qualidade fitossanitária é de extrema importância. A
contaminação por microrganismos compromete o crescimento e desenvolvimento dos
explantes, uma vez que, fungos e bactérias, normalmente, competem com as plantas
pelos nutrientes e vitaminas do meio de cultura, afetando o normal desenvolvimento
destes, podendo levá-los inclusive, à morte (SCHERWINSKI-PEREIRA e COSTA,
2010).
Desta forma, o objetivo com este trabalho foi obter um protocolo de
estabelecimento in vitro, avaliando o efeito de diferentes tratamentos com agentes
antimicrobianos, visando principalmente controlar e diminuir os índices de
contaminação durante o estabelecimento in vitro de guavira.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram desenvolvidos quatro experimentos nos Laboratórios de Botânica e
Multiuso, da Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais, da Universidade
Federal da Grande Dourados, Dourados – MS, nos períodos setembro de 2011 a
março de 2012 e de setembro a novembro de 2012.
O material vegetal utilizado foi obtido de ramos vegetativos jovens de guavira
(Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg, coletados de plantas cultivadas
37
(Anexo 1A) no Horto de Plantas Medicinais, da UFGD. No laboratório, os ramos
coletados foram lavados em água corrente e suas folhas retiradas (Anexo 1B). Para
todos os experimentos, o preparo dos explantes consistiu na secção dos ramos
vegetativos em segmentos nodais com aproximadamente 2 cm contendo duas gemas
laterais, excluindo os segmentos, apical e basal, e, inoculados em tubos de ensaio
contendo 7 mL de meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o WPM (Wood
Plant Medium, LLOYD e MCCOWN, 1980), acrescido de 5,0 mg L-1 de BAP (6benzilaminopurina), 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de mio-inositol e 6 g L-1 de
ágar, sendo o pH ajustado para 5,8 antes da adição do ágar. O meio de cultura foi
autoclavado a 121°C e 1,5 atm por 20 minutos. Os tubos com os explantes foram
mantidos em câmara de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2°C e
submetidos a um período de escuro por 7 dias. Após este período ficaram sob
luminosidade com densidade de fluxo de fótons de 45 µmol m-2 s-1 e fotoperíodo de
16 horas.
Experimento 1: Efeito dos desinfestantes e tempo de desinfestação
Os fatores estudados foram o tempo de desinfestação (5 e 10 minutos) e o tipo
de desinfestante (hipoclorito de sódio e hipoclorito de cálcio a 2,5% de cloro ativo),
obtendo-se um fatorial 2x2, no delineamento inteiramente casualizado. Cada
tratamento constituído de quatro repetições e cada repetição constituída de oito tubos
de ensaio com um explante cada.
A esterilização superficial dos ramos vegetativos foi realizada em câmara de
fluxo laminar com álcool 70% por 1 minuto e posteriormente realizaram-se os
tratamentos com a adição de 1 gota de Tween 80 para cada 500 mL de solução de
38
hipoclorito, seguido da lavagem do material vegetal por três vezes com água estéril.
Após o processo de esterilização superficial os explantes foram preparados e
inoculados em meio de cultura.
As avaliações foram realizadas aos 56 dias após a inoculação. As
características analisadas foram contaminação fúngica e bacteriana, explantes
oxidados, e, explantes estabelecidos, sendo considerados estabelecidos aqueles que
emitiram brotações. Durante as avaliações os tubos com contaminações e com
explantes totalmente oxidados foram descartados.
Os dados obtidos em porcentagem foram transformados em arco seno da raiz
quadrada de X/100, onde X foi o valor obtido, e, submetidos à análise de variância.
As médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan
(P<0,05), por meio do programa estatístico Winstat (MACHADO et al., 1999).
Experimento 2:
Tratamento com ácido ascórbico e avaliação de diferentes
concentrações de rifampicina no meio de cultura
Após a coleta, os ramos vegetativos foram imersos em solução de ácido
ascórbico (100 mg L-1) e mantidos durante dezoito horas antes dos procedimentos de
esterilização superficial e estabelecimento in vitro.
A esterilização superficial foi realizada por lavagem em álcool 70% (1
minuto) e imersão em solução de hipoclorito de cálcio (2,5%) contendo 1 gota de
Tween 80 para cada 500 mL de solução de hipoclorito, por 10 minutos, sob agitação.
Posteriormente, o material vegetal foi lavado por três vezes em água estéril.
Após a esterilização superficial, os explantes foram preparados e inoculados
em meio de cultura contendo diferentes concentrações do antibiótico rifampicina (0 -
39
controle, 10; 20; 30 e 40 µg mL-1). Os cinco tratamentos foram arranjados no
delineamento inteiramente casualizado, sendo cada tratamento constituído de quatro
repetições e cada repetição constituída de oito tubos de ensaio com um explante cada.
As médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente por regressão
polinomial (P<0,05), por meio do programa estatístico Winstat (MACHADO et al.,
1999).
Experimento 3: Efeito do tratamento com carbendazim e tetraciclina
Os tratamentos consistiram de imersão dos ramos em solução de tetraciclina
(0,3 g L-1), carbendazim (1,8 g L-1), tetraciclina + carbendazim e controle (ausência
de agente antimicrobiano, usando somente água destilada). Os quatro tratamentos
foram arranjados no delineamento inteiramente casualizado, sendo cada tratamento
constituído de quatro repetições e cada repetição constituída de oito tubos de ensaio
com um explante cada.
Os ramos vegetativos foram mantidos em imersão nos respectivos tratamentos
por 18 horas e, ao final deste período, o material foi esterilizado superficialmente
com álcool 70% por 1 minuto, seguido da imersão em hipoclorito de cálcio (2,5 %)
40
contendo 1 gota de Tween 80 para cada 500 mL de solução de hipoclorito, por 5
minutos, sob agitação. Posteriormente, o material vegetal foi lavado por três vezes em
água estéril, seguido do preparo e inoculação dos explantes em meio de cultura.
Os dados obtidos em porcentagem foram transformados em arcoseno da raiz
As médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan
(P<0,05), por meio do programa Winstat (MACHADO et al., 1999).
Experimento 4: Efeito de diferentes concentrações no tratamento com cloreto de
mercúrio
Os tratamentos consistiram da esterilização superficial dos ramos em solução
de cloreto de mercúrio (HgCl2) nas seguintes concentrações: 0,0 (controle hipoclorito de sódio a 2,5%); 0,025; 0,050; 0,075 e 0,100 %. Os cinco tratamentos
foram arranjados no delineamento inteiramente casualizado, sendo cada tratamento
constituído de quatro repetições e cada repetição constituída de oito tubos de ensaio
com um explante cada.
Para cada 500 mL de solução foi adicionado uma gota de Tween 80. Os ramos
foram mantidos em agitação por 15 minutos nos respectivos tratamentos e
posteriormente lavados com água estéril por três vezes para a retirada dos resíduos.
41
Após o processo de esterilização superficial, prepararam-se os explantes, mantendo
duas gemas laterais, seguido da inoculação em meio de cultura.
As médias dos tratamentos foram comparadas estatisticamente por regressão
polinomial (P<0,05), por meio do programa estatístico Winstat (MACHADO et al.,
1999).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento 1: Efeito do desinfestante e tempo de desinfestação
De acordo com a análise de variância os diferentes agentes desinfestantes e o
tempo de desinfestação não apresentaram diferenças significativas para todas as
características avaliadas. No entanto, mesmo o resultado não sendo significativo e
não havendo interação entre os fatores estudados, explantes tratados com hipoclorito
de cálcio apresentaram menores índices de contaminação bacteriana (Figura 1A), bem
como, menor porcentagem de oxidação (Figura 1B) quando comparado aos explantes
tratados com hipoclorito de sódio. O tratamento dos explantes com hipoclorito de
cálcio por 5 minutos reduziu de maneira satisfatória a contaminação fúngica (Figura
42
1A) e favoreceu o desenvolvimento de brotações (37,5%) em comparação com o
hipoclorito de sódio durante o mesmo tempo de desinfestação (12,5%) (Figura 1C).
100
90
A
Hipoclorito de sódio
Hipoclorito de cálcio
Contaminação in vitro (%)
80
Aa
70
Aa
60
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
50
40
Aa
30
20
10
0
5
10
5
10
Fungos
Bactérias
Tempo de desinfestação dos explantes (min)
90
Oxidação dos explantes (%)
80
B
Aa
100
Aa
90
Aa
Aa
70
60
50
40
30
Estabelecimento in vitro (%)
100
80
70
60
50
Aa
40
30
20
20
10
10
0
C
Aa
Aa
Aa
0
5
10
5
10
oxidação dos explantes, e, C) Porcentagem de explantes estabelecidos in vitro de
guavira (Campomanesia adamantium) ao final de 56 dias de cultivo in vitro. UFGD,
Dourados, MS, 2013. Médias com letras iguais (maiúsculas entre desinfestantes e
minúsculas entre tempos de desinfestação) não diferem entre si pelo teste de Duncan
(P<0,05).
43
Geralmente, o processo de assepsia dos explantes é realizado com álcool 70%
e agentes à base de cloro, como o hipoclorito de cálcio ou de sódio, variando as
concentrações de cloro ativo (2% a 10%) e o tempo de exposição dos explantes a
esses agentes (de 5 a 40 minutos). Um processo de desinfestação eficaz é aquele que
combina uma baixa taxa de contaminação e de oxidação com a menor exposição
possível ao agente descontaminante (TORRES et al., 1998). O menor tempo de
exposição aos agentes à base de cloro é vantajoso por reduzir os danos causados aos
tecidos dos explantes. Segundo Pasqual et al. (2002) o cloro, principal componente
do hipoclorito, quando liberado em meio aquoso produzem ácido hipocloroso, o qual
tem como característica, elevado poder oxidante, por tanto, quanto menor a exposição
ao hipoclorito, menor a oxidação dos explantes. De acordo com Pierik (1990) e
Grattapaglia e Machado (1998), o hipoclorito de cálcio quando utilizado em tecidos
mais sensíveis e em concentrações variando de 3,5% a 10% pode ser mais eficiente,
pois tem a vantagem de ser menos tóxico aos tecidos vegetais.
A oxidação fenólica é outro fator que pode inviabilizar a micropropagação. A
oxidação é atribuída à polifenoloxidase, uma enzima que catalisa a reação de ortodifenóis para orto-diquinonas causando o escurecimento do meio de cultura e dos
explantes. Tal reação é desencadeada no processo de senescência das plantas ou por
injúrias nos tecidoscomo, por exemplo, o corte do explante ou a utilização de agentes
químicos no processo de desinfestação dos explantes (CID e TEIXEIRA, 2010).
Porém a oxidação não influenciou no baixo percentual de explantes estabelecidos
verificados nesse experimento. O fator determinante para o baixo estabelecimento in
vitro foi o alto índice de contaminação.
44
O alto índice de contaminação pode estar relacionado à origem dos explantes.
O êxito do estabelecimento in vitro dos explantes depende inicialmente da fonte de
onde foram retirados (MROGINSKI et al., 1996). Quando os explantes tem origem
de plantas matrizes oriundas do campo, seu estado fisiológico e do material que será
utilizado como explante é dependente das condições ambientais. As condições
ambientais influenciam no grau de contaminação microbiana dos tecidos vegetais. E
mesmo a planta aparentando ser saudável, quando o tecido fica exposto ao meio de
cultura, o ambiente torna-se ideal para o crescimento desses micro-organismos
contaminantes (GHOLAMHOSEINPOUR ANVARI et al., 2012).
Durante o estabelecimento in vitro de Ulmus minor, Conde et al. (2008) em
testes preliminares verificaram que a utilização de explantes coletados de plantas
matrizes oriundas do campo apresentaram contaminações elevadas (85% a 100%),
enquanto que em explantes coletados de plantas matrizes cultivadas em casa de
vegetação as contaminações foram nulas ou baixas (0% a 10%).
Almeida et al. (2010) avaliaram a utilização do hipoclorito de sódio e
hipoclorito de cálcio no processo de desinfestação durante o estabelecimento in vitro
de Mussaenda erythrophylla cv. Rosea (Rubiaceae), bem como, a influência na
indução de calos. Os mesmos autores verificaram que explantes tratados com
hipoclorito de cálcio apresentaram maior número de calos em comparação com os
explantes tratados com hipoclorito de sódio. No entanto, pelo fato dos explantes
terem sido coletados de uma planta localizada em uma residência, aos 50 dias após a
inoculação, 55,82% apresentavam contaminação, tanto para o tratamento com o
hipoclorito de cálcio ou de sódio.
45
Experimento 2: Pré-tratamento com ácido ascórbico e avaliação de diferentes
concentrações de rifampicina no meio de cultura
O tratamento dos ramos vegetativos com ácido ascórbico na concentração de
100 mg L-1 antes do estabelecimento in vitro, independentemente da adição de
rifampicina no meio de cultura, foi ineficiente no controle da oxidação, obtendo
média de 98,7% de explantes oxidados (Figura 2B).
Estudos recentes conduzidos por Coutinho et al. (2008) demonstraram que o
extrato das folhas de guavira apresenta elevada atividade antioxidante provavelmente
associada a presença de alto teor de compostos fenólicos. A produção abundante de
compostos fenólicos é comum em plantas frutíferas pertencentes à família Myrtaceae
(FACHINELLO et al., 2005). No entanto, durante a preparação dos explantes para o
estabelecimento in vitro, o corte causa a liberação destes compostos, os quais, em
contato com o meio, são oxidados pelas enzimas polifenases produzindo substâncias
tóxicas e inibindo o crescimento dos explantes (OLIVEIRA et al., 2007). A oxidação
dos polifenóis leva a produção de substâncias de composição complexa, como as
quinonas, as quais, de acordo com Teixeira et al. (2001), podem se ligar a proteínas
das membranas ou enzimas, acarretando toxidez e morte da célula. Estes dados
contribuem para explicar o elevado percentual de oxidação e o baixo estabelecimento
in vitro verificados neste trabalho (Figura 2C).
46
100
A
Bactérias y =
90
Contaminação dos explantes (%)
Fúngos
4,2414x2
- 37,013x + 93,134 R² = 0,8352
ns*
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10
20
30
Concentração de rifampicina (µg mL-1 )
ns*
B
0
0
10
20
30
40
Concentração de rifampicina (µg mL-1)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
40
C
y = -3,125x + 13,751 R² = 0,893
0
10
20
30
40
Concentração de rifampicina (µg mL-1)
guavira (Campomanesia adamantium) ao final de 28 dias de cultivo in vitro,
utilizando diferentes concentrações de rifampicina no meio de cultura. UFGD,
Dourados, MS, 2013.
Observou-se comportamento linear decrescente da contaminação bacteriana
com o aumento da concentração de rifampicina no meio de cultura, obtendo-se
valores próximos a 5,6% na concentração de 40 µg mL-1. Com o aumento da
47
concentração do antibiótico verificou-se redução significativa do número de
explantes estabelecidos, chegando a zero nas concentrações de 30 e 40 µg mL-1
(Figura 2C). Embora a rifampicina tenha controlado a contaminação bacteriana, nas
concentrações acima de 30 µg mL-1, observou-se que o antibiótico adicionado ao
meio inibiu o desenvolvimento das gemas laterais e, por consequência, o
estabelecimento in vitro.
A rifampicina é um antibiótico que possui amplo espectro de ação ativo contra
bactérias gram-positivas e negativas, sendo também pouco ou não tóxica aos cultivos
in vitro (KONEMAN et al., 2001). Mesmo assim o controle bacteriano na fase de
estabelecimento in vitro é problemático.
De alguma forma os tecidos vegetais podem interferir no controle, seja
destoxificando essas substâncias ou servindo como hábitat para os contaminantes que
se translocam pelos tecidos das plantas. Dessa forma, é comum que as concentrações
dos antibióticos devam ser mais elevadas quando estes são adicionados ao meio
juntamente com o cultivo (SCHERWINSKI-PEREIRA e COSTA, 2010). O aumento
da concentração do antibiótico pode inibir o desenvolvimento dos explantes. O ideal
para se utilizar o tratamento com antibiótico é identificar os micro-organismos
contaminantes para fazer o uso do antibiótico específico garantindo a eficiência do
tratamento.
Estudos com micropropagação de outras espécies em que foi utilizado o
antibiótico rifampicina para o controle de contaminação bacteriana, foram realizados
e também apresentaram resultados semelhantes. Santos et al. (2005), utilizaram o
antibiótico rifampicina adicionado ao meio de cultura em concentrações elevadas (0,5
48
e 1,0 g L-1), no controle de bactérias contaminantes em explantes de helicônia e
verificaram que as bactérias contaminantes apresentaram sensibilidade ao antibiótico,
porém os explantes não desenvolveram. Durante o estabelecimento in vitro de
bananeira (Musa AAA cv. Caipira), Lima e Moraes (2006) avaliaram o efeito do
tratamento dos explantes por imersão em solução de rifampicina antes da inoculação
e tratamento por imersão, seguido da inoculação dos explantes em meio de cultura
contendo o mesmo antibiótico. Os mesmos autores observaram uma redução de 66%
da contaminação por bactérias quando tratados por imersão em solução com
rifampicina (0,3 g L-1 por 20 minutos) seguido da adição de 100 mg L-1 de
rifampicina no meio de cultura. No entanto, houve redução do número de explantes
estabelecidos in vitro (Figura 2C).
Conforme observado a rifampicina é eficiente no controle da contaminação
bacteriana, porém não exerce nenhuma atividade no controle de fungos, justificando a
contaminação por este micro-organismo (Figura 2A). Entretanto, observa-se que o
processo de desinfestação dos explantes com álcool 70% e a imersão em hipoclorito
de cálcio a 2,5% por 10 minutos manteve a contaminação fúngica em 33,1% ao final
dos 28 dias de cultivo. O fato de o material vegetal ser coletado diretamente de
plantas no campo, apenas o processo de desinfestação dos explantes não é suficiente
para eliminar completamente os micro-organismos. De acordo com Rodríguez et al.
(2007) em trabalho realizado com Pinus, além do uso do antibiótico rifampicina na
concentração 25 mg L-1, para uma desinfestação eficiente, é necessário a imersão em
solução com o fungicida benomyl na concentração 6 g L-1.
49
Experimento 3: Efeito do tratamento com carbendazim e tetraciclina
De acordo com a análise dos dados obtidos nos diferentes tratamentos, não
houve efeito significativo no controle da contaminação fúngica (47,6%) (Figura 3A),
oxidação dos explantes (65,6%) (Figura 3B) e estabelecimento in vitro (1,6%)
(Figura 3C). No entanto, os tratamentos foram significativos no controle da
contaminação bacteriana (Figura 4A). A combinação do antibiótico tetraciclina e do
fungicida carbendazim foi o tratamento com menor porcentagem de explantes
contaminados (9,3%). Em explantes onde o processo de assepsia foi realizado
somente com álcool 70% e hipoclorito de cálcio observou-se maior contaminação
bacteriana (37,5%). Os explantes tradados somente com antibiótico ou somente com
fungicida, foram intermediários, verificando-se porcentagem de contaminação de
aproximadamente 20% (Figura 3A).
As contaminações na micropropagação constituem as principais causas de
perdas de material vegetal (SCHERWINSKI-PEREIRA et al., 2003), além do
prejuízo econômico, pois quando o material é contaminado deve ser descartado. Por
isso muitos estudos tem se concentrado para desenvolver protocolos eficientes na
descontaminação das culturas in vitro. No processo de desinfestação dos explante é
comum a utilização de antibióticos e fungicidas em associação com o tratamento
asséptico feito com álcool 70% e hipoclorito de sódio ou de cálcio a 2,5%. A
combinação de vários agentes antimicrobianos pode controlar as contaminações,
porém em muitos casos prejudica o desenvolvimento dos explantes, pelo efeito tóxico
dessas substâncias ou causando injúrias nos tecidos que agravam a oxidação e
consequentemente
influenciando
no
desenvolvimento
dos
explantes
e
no
50
estabelecimento in vitro. Contudo, a contaminação fúngica foi o fator limitante para o
baixo estabelecimento verificado neste experimento foi (Figura 3A).
100
A
90
Fúngos
80
Bactérias
70
A
60
A
A
50
A
a
40
30
ab
ab
20
b
10
0
Controle
Tetraciclina
Carbendazim
Tetraciclina +
Carbendazim
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
B
A
A
A
A
Tratamentos
100
C
90
80
70
60
50
40
30
20
10
A
A
A
A
0
Controle
Tetraciclina Carbendazim Tetraciclina +
Carbendazim
Tratamentos
Controle
Tetraciclina Carbendazim Tetraciclina +
Carbendazim
Tratamentos
guavira (Campomanesia adamantium) ao final de 28 dias de cultivo in vitro, tratados
com diferentes agentes antimicrobianos. UFGD, Dourados, MS, 2013. Médias com
letras iguais não diferem entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).
51
Devido a grande quantidade de micro-organismos contaminantes estarem
associados às plantas, principalmente se essas são mantidas no campo, qualquer tipo
de abertura seja natural (estômatos, flores) ou por ferimentos causados
mecanicamente (ataque de insetos) pode favorecer a entrada desses micro-organismos
na planta. A entrada desses contaminantes nos tecidos das plantas pode protegê-los
durante o processo de esterilização superficial. E mesmo que se faça a combinação de
antimicrobianos no processo de esterilização superficial, não é garantia de êxito no
controle desses micro-organismos contaminantes (SCHERWINSKI-PEREIRA e
ALTERTHUM, 2010).
Resultados semelhantes foram verificados por Donini et al. (2008) durante o
estabelecimento in vitro de oliveira, em que foram realizadas pulverizações com
antibiótico e fungicida nas plantas matrizes mantidas em casa de vegetação e os
explantes foram esterilizados superficialmente com álcool 70% e hipoclorito de sódio
a 2,5%, porém a taxa de contaminação foi alta influenciando no estabelecimento dos
explantes. Rodrigues et al. (2003) durante o estabelecimento in vitro de várias
cultivares de Prunus sp., mesmo com as aplicações periódicas de antibiótico e
fungicida nas plantas matrizes e a desinfestação dos explantes com álcool 70% e
hipoclorito de sódio a 1,5%, o índice de contaminação fúngica foi elevado (67% a
92%), dependendo da cultivar. Os autores atribuem a alta contaminação, às condições
fitossanitárias do material vegetal coletado, visto que as plantas são mantidas em
pomares e não em condições controladas (telados e casas de vegetação).
52
Experimento 4: Efeito de diferentes concentrações no tratamento com cloreto de
mercúrio
De acordo com os resultados obtidos neste experimento, o tratamento dos
explantes com cloreto de mercúrio em diferentes concentrações não teve efeito
significativo para contaminação fúngica (73,1%) (Figura 4ª), oxidação (32,5%)
(Figura 4B) e estabelecimento in vitro (5,6%) (Figura 4C), apenas para contaminação
bacteriana os tratamentos foram significativos. Por meio da análise de regressão
obteve-se a contaminação bacteriana mínima 13,4% na concentração 0,064% (Figura
4A).
No entanto, reduzir a contaminação bacteriana não foi o suficiente para
garantir o estabelecimento dos explantes. O alto índice de contaminação fúngica, que
foi a principal causa de perdas de explantes e por isso o baixo índice de
estabelecimento in vitro, demonstra que o tratamento com cloreto de mercúrio não foi
eficiente para controlar esses contaminantes.
53
Bactérias y = 7,1429x2 - 50,983x + 104,38
100
Fungos
90
A
R² = 0,85
ns*
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,025
0,05
0,075
Concentração de mercúrio (%)
B
100
90
80
70
60
50
ns*
30
20
10
C
100
90
40
0,1
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ns*
0
0
0,025
0,05
0,075
0,1
Concentração de cloreto de mercúrio (%)
0
0,025
0,05
0,075
0,1
Concentração de cloreto de mercúrio (%)
guavira (Campomanesia adamantium) tratados com diferentes concentrações de
cloreto de mercúrio (HgCl2), aos 56 dias de cultivo in vitro. Dourados, MS, 2013.
A ineficiência do tratamento no controle da contaminação fúngica pode estar
relacionada ao fato do material vegetal utilizado ser oriundo de plantas mantidas no
campo. A presença de microrganismos endofíticos é muito comum em plantas no seu
54
ambiente natural. Geralmente esses microrganismos não causam danos aparentes nas
plantas (MOMESSO, 2008), porém em condições in vitro eles passam a competir
com os explantes pelos nutrientes do meio de cultura impedindo seu desenvolvimento
e por excretarem substâncias tóxicas que acabam matando os explantes
(SCHERWINSKI-PEREIRA, 2010). Esses microrganismos podem escapar do
processo de esterilização superficial, principalmente pela permanência em biofilmes,
formados pela água depositada sobre os tecidos (CASSELS e DOYLE, 2006). Para
garantir a eficiência da esterilização superficial é necessário aumentar a concentração
do agente desinfestante utilizado ou prolongar o tempo de exposição dos explantes ao
desinfestante.
Quando se utiliza material vegetativo diretamente do campo, os tratamentos
desinfestantes devem ser mais criteriosos, em virtude de os explantes apresentarem
maiores níveis de contaminação (SOUZA e JUNGHANS, 2006). A manutenção da
planta matriz em ambiente mais limpo, como uma casa de vegetação, é uma forma de
reduzir ao máximo os estresses e a contaminação quando do estabelecimento in vitro,
além de permitir a brotação mais intensa e, consequentemente, o aumento do
rendimento de explantes por planta matriz (PASQUAL et al., 2010).
Em explantes de teca (Tectona grandis L.f.), coletados de plantas matrizes
oriundas do campo, tratados por 15 minutos com cloreto de mercúrio a 0,1%,
Fermino Júnior et al. (2009) obtiveram redução nas contaminações fúngica e
bacteriana próximos a 25%, porém a porcentagem de explantes sobreviventes foi de
apenas 10%. Os mesmos autores relatam que para a propagação in vitro utilizando
55
material vegetativo coletado diretamente do campo,
as porcentagens de
contaminações são elevadas e a sobrevivência reduzida.
Ribas et al. (2005) durante a micropropagação de peroba-rosa (Aspidosperma
polyneuron), testaram dois tipos de desinfestantes, hipoclorito de sódio e cloreto de
mercúrio e verificaram que o tratamento dos explantes pré-estabelecimento com
cloreto de mercúrio a 0,1% durante 10 minutos foi mais eficiente, possibilitando uma
taxa de sobrevivência dos explantes mais elevada (84,1%). Os autores utilizaram
material vegetativo coletado de plantas matrizes mantidas em casa de vegetação, onde
foram realizadas pulverizações periódicas com fungicida benlate.
Durante a micropropagação de Ocimum gratissimum L. (Lamiaceae), Saha et
al. (2012) utilizou explantes de segmentos nodais, coletados de plantas oriundas do
campo e no processo de assepsia dos explantes os autores avaliaram o tempo de
exposição dos explantes (1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 minutos) ao agente desinfestante
cloreto de mercúrio a 0,1% e constataram que os explantes expostos ao cloreto de
mercúrio a 0,1% de 4 a 6 minutos não apresentaram contaminação após 15 dias de
cultivo e desenvolveram brotações normalmente.
O cloreto de mercúrio é um agente desinfestante eficiente no combate aos
microrganismos contaminantes da cultura de tecidos de plantas e tem sido
relativamente usado no processo de esterilização superficial de explantes, porém pode
ser tóxico para os tecidos das plantas de espécies e genótipos sensíveis (GEORGE,
1993; SEDLÁK e PAPRŠTEIN, 2007).
56
CONCLUSÕES
Nas condições em que os experimentos foram conduzidos, pode-se concluir:

Os agentes desinfestantes hipoclorito de sódio e hipoclorito de cálcio,
independente do tempo de desinfestação 5 ou 10 minutos, não controlaram as
contaminações, porém o tratamento com hipoclorito de cálcio por cinco minutos
favoreceu o desenvolvimento de brotações.

A imersão dos ramos vegetativos em ácido ascórbico não foi eficiente no controle
da oxidação dos explantes.

A rifampicina adicionada ao meio de cultura diminui a contaminação bacteriana,
no entanto em concentrações acima de 30 µg mL-1 inibe o desenvolvimento dos
explantes.

A imersão dos ramos vegetativos em solução com a combinação tetraciclina (0,3
mg L-1) + carbendazim (1,8 g L-1) reduz a contaminação bacteriana in vitro.

A desinfestação com cloreto de mercúrio na concentração 0,064% controla a
contaminação bacteriana, porém nenhuma das concentrações foi eficiente no
controle da contaminação fúngica.
57
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em todos os experimentos a oxidação ocorreu com maior frequência, porém o
principal entrave para o estabelecimento de um protocolo de micropropagação de
guavira foi o elevado percentual de contaminação fúngica. São necessários novos
estudos para avaliar a utilização de outros agentes antifúngicos, ou mesmo testar
outras concentrações dos fungicidas já estudados nesse trabalho.
Em relação ao hipoclorito de cálcio, para a desinfestação de explantes de
guavira, sua utilização pode ser mais vantajosa, do que o hipoclorito de sódio,
geralmente utilizado em cultivos in vitro. Contudo, outras concentrações de
hipoclorito de cálcio e o tempo de desinfestação devem ser avaliados.
Outros fatores a serem considerados em trabalhos futuros visando o controle
da contaminação in vitro, seria a manutenção das plantas matrizes em ambiente
protegido (telados, ou casa de vegetação). Realizar o controle fitossanitário com
aplicações periódicas de fungicidas e bactericidas, além de adubações e aplicação de
soluções nutritivas, para se obter brotações mais vigorosas e sadias. O isolamento e
identificação dos micro-organismos contaminantes são de fundamental importância,
para que se possa fazer um tratamento fitossanitário específico.
58
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65
Anexos
66
Anexo 1
A
B
A) Plantas matrizes de Campomanesia adamantium (Cambess.) O. Berg do Horto de
Plantas Medicinais (FCA);
B) Ramos vegetativos de C. adamantium utilizados para a retirada dos segmentos
nodais durante o estabelecimento in vitro. UFGD, Dourados, MS, 2013.
67
Anexo 2
Explantes de guavira (Campomanesia adamantium) tratados com cloreto de mercúrio
durante o estabelecimento in vitro, aos 56 dias de cultivo in vitro. UFGD, Dourados,
MS, 2013.

Estabelecimento in vitro DE Campomanesia

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