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Transcrição

ELOIZA HELENA CAMPANA
Freqüência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases
AmpC Plasmidiais Isoladas em Infecção de Corrente
Sangüínea
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
SÃO PAULO
2009
Freqüência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases AmpC Plasmidiais
Isoladas em Infecção de Corrente Sangüínea
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP
Este
trabalho
foi
realizado
com
auxílio
financeiro fornecido pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP
(2006/58267-9 e 2008/10287-7).
SÃO PAULO
2009
CAMPANA, Eloiza Helena
Frequência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases AmpC
Plasmidiais Isoladas em Infecção de Corrente Sangüínea - Eloiza Helena
Campana - São Paulo, 2009.
xviii, 138f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título
em
inglês:
Frequency
of
Plasmid-mediated
Enterobacteriaceae isolated from Bloodstream Infections
AmpC
in
1. Enterobactérias 2. Resistência 3. β-lactamases 4. AmpC plasmidial 5.
Infecção de corrente sangüínea
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Ricardo Sobieh Diaz
SÃO PAULO
2009
iii
Freqüência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases AmpC Plasmidiais
Isoladas em Infecção de Corrente Sangüínea
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Profa. Dra. Elsa Mazae Mamizuka
Titular: Profa. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
Titular: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Suplente: Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques
Aprovada em: 26/05/2009
iv
Dedico esse trabalho ao meu falecido Pai,
José Argemiro Campana que me presenteou
com
muito
amor,
carinho
e
apoio
incondicional. E que sempre acreditou em
todos os meus sonhos.
v
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, muito obrigada pela excelente
orientação, pelo apoio, pelos ensinamentos e paciência. Muito obrigado por ter
confiado em mim, reconhecido minha dedicação e por me proporcionar várias
oportunidades de crescimento profissional. Você é um exemplo de ética, caráter e
dedicação.
À minha mãe Gilda e minha irmã Mayla, por todo amor, apoio e carinho inestimáveis.
Obrigada por estarem sempre ao meu lado e me apoiarem incondicionalmente
sempre.
Às queridas amigas e companheiras de laboratório Adriana Nicoletti, Lorena
Fehlberg, Paula Peraro e Raquel Girardello, que me ajudaram muito na realização
deste trabalho e o tornaram muito mais fácil e agradável. Obrigada pela amizade e
carinho. Sem vocês não chegaria onde estou.
À Dra. Mariana Castanheira, que apesar do curto tempo de convivência me ensinou
muito.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari meu respeito e admiração.
Às minhas grandes amigas Beatriz Balducci Coelho, Francielli M. Vasconcellos,
Nancy R. Guetti e Sarita S. Rossato, pelo incondicional companheirismo, incentivo e
por acreditar tanto na minha vitória.
Ao meu grande amigo e companheiro de laboratório Danilo E. Xavier, obrigado pela
sua incrível personalidade, sinceridade e companheirismo. Você me proporcionou
muitos momentos alegres.
Aos queridos amigos do Laboratório ALERTA, Anderson Fernandes, Andréia
Penteado, Cecília Godoy, Paula Ignez, Renata Picão e Vitor Marguti, dos quais
vi
jamais esquecerei. Obrigada pela ajuda, conselhos, momentos de convívio e de
descontração.
A todos os amigos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC),
Adryella Luz, Alinne Guimarães, Amilton Mouro, André Doi, Andrea Pereira, Anna
Carolina Rockskroh, Cynthea Zanetti, Fernanda Inoue, Fernanda Marques, Jéssica
Sanches, Jussimara Monteiro, Karen Bauab, Kátia Kiyota, Kelly Santiago, Liana
Carballo, Loren Paschoal, Maria Cecília Novella, Martha Rivero, Paulo Bispo,
Roberto Chirotto, Rodrigo Cayô, Rosana Capecce, Soraya Sgambatti, Thaís Ávila,
Thomas Chagas Neto, Vinicius Gomes e Marco Zonta por todo apoio, convivência e
também pelas alegres conversas. Adoro todos vocês.
À minha amiga, vizinha, colega de laboratório e companheira de corrida Talita
Trevizani por compartilhar todos os momentos de alegria e dificuldade, por toda a
ajuda e pelo carinho e amizade.
Ao Ivo Marguti e toda a família Marguti por todos os momentos de convívio e todo
carinho. Obrigada por dividirem comigo muitos momentos importantes nesses
últimos anos.
Aos autores George A. Jacoby, Eva Tzelepi e Ronald N. Jones por terem fornecido
as amostras controles utilizadas neste estudo.
A todas as pessoas que participaram direta ou indiretamente do meu trabalho, o
meu muito obrigado.
Aos professores e funcionários da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias
da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP e do Instituto Paulista de Doenças
Infecciosas e Parasitárias, especialmente ao Charlys, pela ajuda e apoio em todos
os momentos necessários.
vii
“Poderíamos dizer que a descoberta
científica consiste freqüentemente em,
mais do que introduzir uma idéia
revolucionária,
pensar
de
maneira
diferente os conceitos existentes”
Michel de Pracontal
viii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS.................................................................................................. vi
ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................... xiii
ÍNDICE DE TABELAS .............................................................................................. xiv
ÍNDICE DE QUADROS ............................................................................................. xv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................. xvi
RESUMO ................................................................................................................ xviii
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 5
2.1 β-Lactamases do Tipo AmpC ................................................................... 8
2.1.1 β-Lactamases do tipo AmpC, cujo genes codificadores são
carregados por plasmídeos ............................................................................... 11
CMY .......................................................................................................... 14
MIR ........................................................................................................... 17
MOX .......................................................................................................... 17
LAT ........................................................................................................... 18
FOX........................................................................................................... 18
DHA .......................................................................................................... 19
ACT ........................................................................................................... 20
ix
ACC .......................................................................................................... 20
CFE ........................................................................................................... 21
Epidemiologia no Brasil ................................................................................ 24
2.1.1.1 Localização e mobilização dos genes codificadores de pAmpC....... 25
2.1.1.2 Detecção fenotípica e genotípica de β-lactamases do Tipo AmpC
plasmidiais ............................................................................................................ 26
3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 31
3.1 Objetivo principal .................................................................................... 31
3.2 Objetivos secundários ............................................................................ 31
4 MATERIAL E METÓDOS ...................................................................................... 32
4.1 Amostras bacterianas ............................................................................. 32
4.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ........... 32
4.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβL .................... 34
4.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação ........................................ 35
4.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC ................. 36
4.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado ............ 36
4.4.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado ..................... 38
4.4.3 Confirmação da produção de β-lactamases pAmpC por métodos
moleculares ....................................................................................................... 40
x
4.4.3.1 Identificação dos genes por reação da polimerase em cadeia (PCR)
multiplex ............................................................................................................ 40
.......................................................................................................................... 42
4.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados ........ 44
4.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC ................ 45
4.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC ..................................... 45
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 48
5.1 Amostras bacterianas ............................................................................. 48
5.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ........... 48
5.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβL .................... 52
5.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação .................................... 52
5.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC ................. 55
5.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado ............ 55
5.4.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado ..................... 56
moleculares ....................................................................................................... 58
multiplex ............................................................................................................ 58
xi
.......................................................................................................................... 59
5.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados ........ 60
5.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC ................ 60
5.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC ..................................... 60
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 61
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................... 74
8 ANEXOS................................................................................................................ 76
9 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 90
ABSTRACT ............................................................................................................ 109
APÊNDICE ............................................................................................................. 110
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos principais grupos de β-lactâmicos............................6
Figura 2. Representação esquemática da interligação da via de indução das βlactamases AmpC e a reciclagem da mureina.............................................................9
Figura 3. Representação esquemática da estrutura da enzima AmpC de E. coli
ligada a uma molécula de ceftazidima.......................................................................11
Figura 4. Placa modelo de disco aproximação utilizada para a detecção fenotípica
da produção de ESβL.................................................................................................36
Figura 5. Placa modelo do teste tridimensional utilizada para a detecção fenotípica
da produção de AmpC................................................................................................38
Figura 6. Placa modelo do teste de Hodge utilizada para a detecção fenotípica da
produção de AmpC.....................................................................................................39
Figura 7. Porcentagem de sensibilidade das amostras de enterobactérias..............50
Figura 8. Detecção fenotípica por disco aproximação para detecção de ESβL........53
Figura 9. Teste tri-dimensional..................................................................................56
Figura 10. Teste de Hodge........................................................................................57
Figura 11. PCR multiplex para detecção de pAmpC.................................................58
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de amplificação
para o gene blaCMY-2...................................................................................................59
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Cronologia da identificação e similaridade com a AmpC cromossomal das
β-lactamases pAmpC.................................................................................................13
Tabela 2. Triagem para ESβL segundo o CLSI.........................................................34
Tabela 3. Iniciadores utilizados para amplificação dos genes codificadores de βlactamases AmpC pela PCR multiplex.......................................................................41
Tabela 4. Iniciadores utilizados para reações de PCR e sequenciamento neste
estudo.........................................................................................................................43
Tabela 5. Distribuição dos isolados de acordo com a espécie..................................48
Tabela 6. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras estudadas.....49
Tabela 7. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras estudadas
dividido por espécie....................................................................................................51
Tabela 8. Distribuição dos isolados fenotipicamente detectados como produtores de
ESβL de acordo com a espécie bacteriana...............................................................54
xiv
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1. Substrato preferencial de cada espécie...................................................55
xv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Cuture Collection
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute
DNA - Ácido desoxidoribonucléico
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético
ESβL - Extended Spectrum β-Lactamase
EUA – Estados Unidos da América
HSP - Hospital São Paulo
IMP - Imipenemase
IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência a Saúde
IS - Insertion Sequence
ITU – Infecção do Trato Urinário
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
MβL - Metalo-β-Lactamase
NNIS - National Nosocomial Infection Surveillance System
OMP - Outer Membrane Protein
OXA - Oxacilinase
pAmpC – AmpC plasmidial
PBP - Penicillin Binding Protein
PCR - Polymerase Chain Reaction
TBE - Tris-Borato-EDTA
TSB - Tryptone Soya Broth
xvi
UFC - Unidade formadora de colônia
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
UV - Ultravioleta
VIM - Verona Imipenemase
xvii
RESUMO
As cefaloporinas de amplo espectro, geralmente, representam a principal opção
terapêutica contra as infecções causadas por enterobactérias. Em nosso meio, a
resistência às cefalosporinas de amplo espectro em enterobactérias tem sido
associada à produção de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL). Porém, nos
últimos anos, a produção de cefalosporinases do tipo AmpC mediadas por genes
plasmídiais (pAmpC) também tem sido responsabilizada pela resistência a essas
drogas. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de pAmpCs entre amostras de
enterobactérias isoladas de pacientes internados no Hospital São Paulo que
apresentaram infecção de corrente sangüínea, entre janeiro e julho de 2006. Foram
estudadas 133 amostras de enterobactérias identificadas como K. pneumoniae (65
amostras), K. oxytoca (5 amostras), E. coli (41 amostras), P. mirabilis (18 amostras)
e Salmonella spp. (4 amostras). O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
selecionados foi avaliado pela técnica de diluição em ágar, segundo as
recomendações do CLSI. A detecção fenotípica da produção de pAmpC foi realizada
pelos testes tri-dimensional e de Hodge modificado. Adicionalmente, foi realizada a
detecção fenotípica da produção de ESβL. A pesquisa e identificação dos genes que
codificam pAmpC foram realizados pela técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR) e seqüenciamento. Entre os antimicrobianos testados, imipenem (99,2%)
apresentou a maior taxa de sensibilidade, seguido pela cefoxitina (80,5%). De forma
geral, os isolados de K. pneumoniae apresentaram alto grau de resistência aos βlactâmicos e os isolados de P. mirabilis apresentaram a menor taxa de sensibilidade
para ciprofloxacino (27,8%). Entre as 133 amostras estudadas, 59 (44,4%) foram
xviii
classificadas fenotipicamente como produtoras de ESβL pela metodologia de disco
aproximação. Foi observada discordância entre os resultados dos testes fenotípicos
para detecção de pAmpC. A produção de pAmpC foi observada em seis isolados de
acordo com o teste tri-dimensional, enquanto, o método de Hodge modificado
classificou 19 isolados como possíveis produtores de pAmpC. Além disso, resultados
duvidosos foram observados em ambas as técnicas. Um único isolado de K.
pneumoniae foi identificado como produtor de CMY-2. Este isolado foi corretamente
identificado como produtor de pAmpC por ambos métodos fenotípicos empregados.
xix
1
Introdução
1 INTRODUÇÃO
Bacilos Gram negativos pertencentes à família das enterobactérias são
importantes causas de infecções do trato urinário, infecções de corrente sanguínea,
pneumonias tanto comunitárias como hospitalares e várias infecções intraabdominais (145). As cefalosporinas de amplo espectro, como ceftriaxona,
ceftazidima e cefepima, são consideradas alternativas úteis para o tratamento das
infecções causadas por bacilos Gram-negativos. No entanto, nos últimos anos o
isolamento de bactérias Gram-negativas resistentes também a essas drogas tem se
tornando mais comum (90). O aumento da prevalência de multirresistência entre os
bacilos Gram negativos isolados no ambiente hospitalar é um problema que tem se
mostrado cada vez mais freqüente em todo o mundo (51;161).
O mecanismo de resistência aos β-lactâmicos mais importante em bactérias
Gram-negativas é a produção de β-lactamases. Nos anos 80, foram introduzidos βlactâmicos com grande estabilidade frente a essas enzimas, tais como as
cefalosporinas, os carbapenens e os monobactâmicos. Contudo, a utilização desses
agentes favoreceu o surgimento e a seleção de bactérias resistentes produtoras de
β-lactamases com maior espectro hidrolítico, as β-lactamases de espectro ampliado
(ESβL) (150).
As β-lactamases do tipo AmpC classificadas no grupo 1 de Bush, Jacoby e
Medeiros (38) e classe C de Ambler (7) são cefalosporinases capazes de hidrolisar
vários β-lactâmicos, incluindo às penicilinas de amplo-espectro; os α-methoxi-β-
2
Introdução
lactâmicos, como cefoxitina; as cefalosporinas de 1ª, 2ª e 3ª gerações; e aztreonam.
Estas enzimas são fracamente inibidas pelos inibidores de β-lactamases disponíveis
clinicamente. Entretanto, hidrolisam pobremente as cefalosporinas de quarta
geração, como, cefepima e cefpiroma, e os carbapenens (86;139).
Os
genes
que
codificam
as
cefalosporinases
do
tipo
AmpC
são
constitutivamente encontrados no cromossomo de vários membros da família das
enterobactérias, incluindo Enterobacter spp., Shigella spp., Providencia spp.,
Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens e Escherichia coli. Na
maioria dessas espécies a expressão das AmpCs é induzível, exceto em E. coli e
Shigella spp., nas quais a expressão ocorre em baixos níveis (47).
Na última década, houve um aumento nos relatos de enzimas derivadas dos
genes AmpC cromossomais de microrganismos Gram-negativos, como C. freundii,
Enterobacter cloacae e Aeromonas spp. que foram mobilizados por plasmídios e
transferidos para cepas de enterobactérias naturalmente desprovidas de AmpC
cromossomais, como Klebsiella pneumoniae e K. oxytoca, Salmonella spp. e
Proteus mirabillis (6;13;18;48;114;136;154). Algumas dessas enzimas também têm
sido encontradas em amostras de E. coli e Shigella spp. (31;78;82). Desde o
primeiro relato de pAmpC, ocorrido em 1989, a partir de uma amostra de K.
pneumoniae isolada na Coréia, essas enzimas vem sendo reportadas em todo o
mundo com uma freqüência cada vez maior (15).
Em E. coli, K. pneumoniae e P. mirabilis, os genes codificadores de AmpC
estão, geralmente, localizados em plasmídios de tamanhos variados que geralmente
carregam
determinantes
de
resistência
a
outros
antimicrobianos,
como
3
Introdução
aminoglicosídeos,
cloranfenicol,
tetraciclina,
trimetoprim
e
quinolonas
(19;20;34;40;142). Além disso, isolados clínicos frequentemente produzem outras βlactamases, como OXA e SHV (73;113), aumentando, assim, a dificuldade na
detecção e tratamento de infecções causadas por essas bactérias. Alguns estudos
sugerem, que a associação de pAmpC com perda de porinas determinam a
resistência aos carbapenens (24;34;169).
A maioria das pAmpCs são expressas constitutivamente, entretanto, algumas
pAmpCs carregam o gene regulador ampR assim como o gene ampC, por isso
podem ser induzíveis. As enzimas DHA-1 e DHA-2, derivadas da AmpC
cromossomal de M. morganii e ACT-1, derivada de E. cloacae, são exemplos de
AmpCs plasmidiais induzíveis (13;61;158). Recentemente, foi descrita pela primeira
vez uma pAmpC, denominada CMY-13, oriunda de C. freundii com um gene ampR.
(122).
Embora existam vários relatos de surtos causados por organismos produtores
de pAmpC, a descrição da epidemiologia e das características clínicas associadas a
essas infecções ainda é escassa (139), principalmente no Brasil, onde até o
momento há apenas dois relatos de isolados com cefalosporinases do tipo pAmpC.
Os genes blaFOX-5 e blaCMY-2 foram detectados em isolados de E. coli em duas
regiões distintas do país (40;147).
Isolados produtores de pAmpC podem parecer sensíveis in vitro a algumas
cefalosporinas
e
aztreonam,
deixando
de
responder
se
esses
agentes
antimicrobianos são utilizados na terapêutica (173). Assim, a detecção laboratorial
de cepas produtoras de pAmpC é de extrema importância, visando a instituição da
4
Introdução
terapia adequada ao tratamento das infecções, bem como a implementação de
medidas que visem reduzir a disseminação deste mecanismo de resistência no
ambiente hospitalar.
5
Revisão Bibliográfica
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os β-lactâmicos representam a classe de antimicrobianos mais variada e
amplamente utilizada na prática médica para o tratamento de infecções hospitalares
e comunitárias causadas por bacilos Gram negativos (33). Os antibióticos deste
grupo, que inclui as penicilinas, as cefalosporinas de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª gerações, os
monobactâmicos e os carbapenens, possuem em comum uma estrutura central
contendo um anel β-lactâmico (Figura 1). A resistência a esses agentes dificulta o
tratamento e aumenta a morbidade/mortalidade dos pacientes e os custos
hospitalares (41). A resistência bacteriana aos β-lactâmicos pode ser devida à: I produção de β-lactamases; II - falta e/ou expressão reduzida das proteínas de
membrana externa ou pela hiperexpressão de bombas de efluxo; III - alteração do
sítio alvo (PBPs) (10).
De modo geral, as β-lactamases são a principal causa de resistência
bacteriana aos β-lactâmicos e tem sido objeto de extensas investigações
microbiológicas, bioquímicas e genéticas (38).
As β-lactamases, são enzimas que catalisam a hidrolise do anel β-lactâmico,
impossibilitando assim exercer a sua função. Nas bactérias Gram-negativas, as βlactamases encontram-se estrategicamente situadas no espaço periplásmatico,
podendo alcançar maiores concentrações e agir de modo mais eficaz sobre os
antimicrobianos β-lactâmicos, que estão atravessando o espaço periplásmatico para
alcançar as PBPs (110).
6
Adaptado de Babic et al., 2006 (10)
Figura 1. Estrutura química dos principais grupos de β-lactâmicos.
Algumas β-lactamases utilizam íons de zinco (Zn2+) como cofatores
enzimáticos, entretanto, a maioria das β-lactamases opera via produção de ésteres
de serina (110). Por esta razão, de modo prático, as β-lactamases são classificadas
como serino-β-lactamases e metalo-β-lactamases.
A capacidade ou não da β-lactamase conferir resistência irá depender da
quantidade de enzima produzida, da habilidade dessa enzima em hidrolisar o
antimicrobiano em questão e da velocidade com que o β-lactâmico penetra pela
membrana celular externa na célula (109). O gene para a codificação das β-
7
lactamases pode estar localizado no DNA cromossômico ou extracromossômico,
como plasmídios e transposons (110).
Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de
estabelecer um sistema de classificação para essas enzimas foram propostas ao
longo dos anos. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de
maior importância: a de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (7;38). A
classificação proposta por Ambler em 1980 foi desenvolvida com base na estrutura
molecular das β-lactamases, de acordo com a seqüência de aminoácidos que as
constituiam. Somente quatro classes moleculares principais de β-lactamases foram
descritas: A) ESβLs, penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases
(MβLs); C) cefalosporinases cromossomais e D) oxacilinases.
A classificação das β-lactamases mais aceita e utilizada atualmente é aquela
proposta por Bush, Jacoby e Medeiros (38), que é uma versão mais atualizada da
classificação proposta na década de 80 por Bush (37). Essa classificação baseia-se
na atividade das enzimas contra penicilina, oxacilina, carbenicilina, cefaloridina,
cefalosporinas de amplo espectro, aztreonam e imipenem e na sua inibição pelos
inibidores de β-lactamases e pelo ácido etilenediaminotetraacético (EDTA). Além de
estabelecer a correlação entre estas propriedades enzimáticas às classes
moleculares de Ambler.
8
2.1 β-Lactamases do Tipo AmpC
As β-lactamases do tipo AmpC pertencem ao grupo 1 de Bush (38) e à classe
molecular C de Ambler (7), sendo encontradas tanto no cromossomo bacteriano
como em plasmídeos. As enzimas cromossomais pertencentes a este grupo já foram
descritas em uma variedade de microrganismos, principalmente nos membros do
grupo CESP (C. freundii, Enterobacter spp., S. marcescens, Providencia stuartii,
Pseudomonas aeruginosa e M. morganii), podendo ser induzíveis ou não. Na
ausência de β-lactâmicos, AmpC é normalmente produzida em níveis basais, mas
na presença de β-lactâmicos indutores, como, por exemplo, cefoxitina e imipenem,
sua produção pode aumentar até 1000 vezes (90;150).
Três proteínas (AmpD, AmpG, e AmpR) foram descritas no mecanismo de
indução das β-lactamases cromossomais do tipo AmpC (85;99;134) como pode ser
observado na Figura 2. A AmpD é uma recente N-acetilmuramil-L-alanina amidase
que participa na reciclagem intercelular dos fragmentos de peptídeoglicano (76;84).
A AmpD degrada o tripeptídeo 1,6-anhidro-N-acetilmurâmico (tripeptídeo 1,6anhMurNac) para liberar o tripeptídeo L-Ala-D-Glu-meso-ácido diaminopimélico
(meso-DAP) para direta utilização na construção de novos peptídeoglicanos (84;85).
A mutação no gene ampD que resulta na expressão de β-lactamases, mesmo na
ausência de um indutor, coincide com o acúmulo do tripeptídeo 1,6-anhMurNac (85).
A inativação da proteína AmpD leva a uma hiperprodução semi-constitutiva ou
hiperinduzida de AmpC em E. cloacae subespécie cloacae (58). Por outro lado,
mutantes de AmpD com níveis elevados de expressão de β-lactamases mostram um
9
dos três fenótipos conhecidos (hiperinduzido, desreprimido, e parcialmente
desreprimido), os quais estão associados com diferentes mutações ou, talvez,
dependam da regulação de genes desconhecidos (168).
Adaptado de Jacoby et al., 1997 (83)
Figura 2. Representação esquemática da interligação da via de indução das βlactamases AmpC e a reciclagem da mureina.
AmpG é uma proteína transmembrana envolvida na permeabilidade do
tripeptídeo
N-acetilglucosamina(GluNac)-1,6-anhMurNac.
Esta
proteína
primariamente afeta o D-pentapeptídeo (pentapeptídeo dissacarídico; GluNac-1,6-
10
anhMurNac-L-Ala–D-Glu-meso-Dap-D-Ala-D-Ala), um muropeptídeo periplasmático
que é convertido em uma molécula sinalizadora citoplasmática para indução da βlactamases AmpC (52). Sem o gene ampG, nem a indução e nem os altos níveis de
expressão de β-lactamases seria possível (53;98).
A proteína AmpR atua como um ativador transcricional pela ligação na
regiões do DNA localizada imediatamente à montante da região promotora do gene
ampC (83). Na ausência de um β-lactâmico indutor, AmpR reprime a síntese de βlactamases em 2,5 vezes, enquanto que a expressão é induzida de 10 a 200 vezes
na presença do β-lactâmico indutor (106).
Tanto S. sonnei e E. coli carregam o gene ampC (23), mas o gene regulatório
ampR está ausente nestas espécies. Assim o gene ampC é normalmente expresso
em baixas quantidades.
As β-lactamases do tipo AmpC são serino-β-lactamases, ou seja, enzimas
que apresentam em seu sítio ativo um resíduo serina que se liga diretamente ao
anel β-lactâmico. Essas enzimas possuem a seqüência Serina-X-X-Lisina (onde X
representa qualquer aminoácido) nos resíduos de 64-67. Outros resíduos têm sido
identificados como importantes no ataque ao anel β-lactâmico em AmpC, como:
Lys67, Tyr150, Asn152, Lys315 e Ala318. Substituições desses resíduos resultam
em diminuição da atividade hidrolítica enzimática (42). A estrutura dessas enzimas é
similar às β-lactamases da classe A, exceto pelo sítio de ligação que é mais flexível
nas enzimas da classe C, refletindo sua grande habilidade para acomodar as
cadeias laterais volumosas das cefalosporinas (86).
11
Adaptado de Jacoby, 2009 (86)
Figura 3. Representação esquemática da estrutura da enzima AmpC de E. coli
ligada a uma molécula de ceftazidima. A alça R2 no topo da molécula e os resíduos
conservados Ser64, Lys67, Tyr150, Asn152, Lys315 e Ala318 estão representados
em amarelo. As fitas β estão marcadas em dourado e a α-hélice está em verde.
2.1.1 β-Lactamases do tipo AmpC, cujo genes codificadores são carregados
por plasmídeos
As pAmpCs são provavelmente originárias das AmpCs cromossomais de
certas espécies bacterianas Gram-negativas, e que, posteriormente, foram
mobilizadas por plasmídeos para outras espécies bacterianas (86).
12
Em 1976, Bobrowski e colaboradores (30) descreveram uma β-lactamase
codificada por um gene plasmidial que era indistinguível da AmpC de E. coli em um
isolado de P. mirabilis. Estudos moleculares não foram realizados e o plasmídeo
desse isolado foi perdido. Posteriormente, em 1983, Knothe e colaboradores (95)
reportaram a transferência da resistência à cefoxitina de um isolado de S.
marcescens para P. mirabilis e Salmonella spp., porém a resistência não foi
transferida para E. coli. Entretanto, estudos bioquímicos e moleculares não foram
realizados e o plasmídeo não foi analisado.
No fim da década de 80, isolados clínicos de K. pneumoniae e E. coli
produtores de pAmpC começaram a surgir (16;142;185). Inicialmente, a produção
destas β-lactamases foi considerada como relatos isolados, mas o crescimento no
número de estudos descrevendo novas enzimas do grupo pAmpC podem indicar
que essas enzimas possam ser um mecanismo de resistência que esteja surgindo
ou se disseminando com maior frequência.
Desde então, as pAmpC vem sendo descritas em todo o mundo, sendo
encontradas principalmente em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella spp., P.
mirabilis e E. coli. As pAmpCs apresentam o mesmo espectro de ação das AmpC
cromossomais. Até o momento, já foram descritas nove famílias: CMY (43
variantes), FOX (7 variantes), LAT (4 variantes), ACC (4 variantes), MIR (4
variantes), DHA (3 variantes), ACT (3 variantes), MOX (3 variantes) e CFE-1 (86);
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide).
Inicialmente, a nomenclatura das pAmpCs era confusa e inúmeros critérios
foram adotados para sua denominação, como por exemplo: (i) o fenótipo de
13
resistência conferido pela enzima (cefamicinas - CMY, cefoxitina - FOX, moxolactam,
MOX, e latomoxefe – LAT), (ii) pelo tipo de β-lactamase produzida (AmpC
betalactamase - ACT, Ambler Class C betalactamase – ACC), ou ainda, (iii) de
acordo com o hospital onde havia sido isolada (Miriam Hospital em Providence –
MIR, Dhahran Hospital na Arábia Saudita – DHA). Atualmente, a classificação
dessas enzimas é baseada na homologia da seqüência de aminoácidos que
codificam a pAmpC com àquela da AmpC cromossomal, gerando uma classificação
baseada em características genéticas e não fenotípicas (Tabela 1). Por essa
classificação, as pAmpCs podem ser classificadas em cinco grupos: provenientes de
C. freundii, de Enterobacter spp., de M. morganii, de Hafnia alvei e de Aeromonas
spp. (15;150).
Tabela 1. Cronologia da identificação e similaridade genética com a AmpC
cromossomal das β-lactamases pAmpC.
Fonte do gene
Similaridade
AmpC
(%)
K. pneumoniae
A. hydrophila
82
1996
K. pneumoniae
C. freundii
96
EUA
1990
K. pneumoniae
E. cloacae
99
MOX-1
Japão
1993
K. pneumoniae
A. hydrophila
80
LAT-1
Grécia
1993
K. pneumoniae
C. freundii
95
FOX-1
Argentina
1994
K. pneumoniae
A. caviae
99
DHA-1
Arábia Saudita
1997
S. enteriditis
M. morganii
99
ACT-1
EUA
1997
K. pneumoniae
E. asburiae
98
ACC-1
Alemanha
1999
K. pneumoniae
H. alvei
99
CFE-1
Japão
2004
E. coli
C. freundii
99
AmpC
País de
Ano da
Plasmidial
Origem
Publicação
CMY-1
Coréia do Sul
1989
CMY-2
Grécia
MIR-1
Fonte: Jacoby, 2009 (86)
Espécie
14
CMY
Apesar de receberem a mesma nomenclatura, as variantes de CMY-1 (CMY1, -8, -9, -10, -11 e -19) e de CMY-2 (CMY-2, -3, -4, -5, -7, -12, -13, -14, -15, -16, -18,
-20, -21, -23 e -24, -26,-31, -36, -37 e -41) estão relacionadas ancestralmente a
diferentes microrganismos (86).
O primeiro relato de uma pAmpC foi em um isolado de K. pneumoniae da
Coréia do Sul e essa enzima recebeu a denominação de CMY-1. Este isolado, bem
como o seu transconjugante, apresentaram resistência a cefoxitina, a cefotetan, as
penicilinas, as cefalosporinas e aos monobactamicos (16). Mais tarde, enzimas da
família CMY-1 foram encontradas em isolados de E. coli (140).
A primeira descrição de uma pAmpC em um isolado de E. aerogenes ocorreu
em 2003 (104). A presença da enzima designada CMY-10 neste isolado foi
interessante já que essa espécie carrega naturalmente um gene que codifica uma
AmpC cromossomal.
Análises da família CMY-1 demonstraram que os genes blaCMY-10 e blaCMY-11
diferem em uma e duas mutações simples do gene blaCMY-1, respectivamente (105).
Os genes blaCMY-8 e blaCMY-9 apresentam 98,6 e 97,8% de similaridade,
respectivamente, com o gene blaCMY-1 (54;191).
Devido a uma substituição de um amino ácido na região da hélice H-10, a
pAmpC CMY-19, recentemente identificada em um isolado de K. pneumoniae,
confere baixo grau de resistência à cefepime (CIM, 4µg/mL) (179).
15
A β-lactamase CMY-2 e suas variantes estão relacionadas com a AmpC
cromossomal de C. freundii. A β-lactamase CMY-2 foi descrita pela primeira vez em
um isolado de K. pneumoniae na Grécia (18). É a enzima mais prevalente e
amplamente distribuída geograficamente, tendo sido relatada na Argélia, França,
Alemanha, Grécia, Índia, Paquistão, Taiwan, Turquia, Reino Unido, Estados Unidos,
Espanha, Argentina, Noruega, Singapura, Suiça e Brasil (15;86;150).
O gene blaCMY-2 já foi encontrado em isolados de Salmonella spp., (96), K.
oxytoca, P. mirabilis, E. coli (130), E. aerogenes (172) e C. koserii (155). CMY-2
também foi responsável pela resistência a ceftriaxona em S. sonnei em um surto em
Taiwan (82) e em S. flexneri na Argentina (156).
A β-lactamase CMY-2 é uma importante causa de resistência aos βlactâmicos em isolados de Salmonella não tifóide, Typhimurium e Newport em
muitos países (14;57;60;69;120;182).
As variantes de CMY-2 foram descritas em vários microrganismos, como a
CMY-3, que foi identificada em um isolado clínico de P. mirabilis (36), CMY-4 em
isolados de P. mirabilis (177), E. coli (169), K. pneumoniae (49), Salmonella spp.
(14) e K. pneumoniae (127), CMY-5 em um isolado de K. oxytoca (187), CMY-7 em
isolados de Salmonella spp. (73;81) e E. coli (70), CMY-12, -14, -15 e -16 em P.
mirabilis (48;49;107), CMY-18, -20, -21, -23 e -24 em E. coli (78;97;102;111;123),
CMY-31 em K. pneumoniae (2) e Salmonella spp. (195), CMY-36 em K. pneumoniae
(195), e CMY-38 em P. mirabilis (107). Em 2007, Ahmed e colaboradores (4)
descreveram uma nova variante de CMY-2, a CMY-26 em um isolado de K. oxytoca
16
proveniente de uma gralha. Recentemente, no Egito foi descrita pela primeira vez a
CMY-41, em uma amostra de queijo (71).
Alguns genes que codificam enzimas da família CMY-2 estão inseridos no
cromossomo
bacteriano, entre elas
a CMY-3,
-4,
-12, -14,
-15
e
-16
(36;48;49;107;177). Interessantemente, estas enzimas foram descritas em isolados
de P. mirabilis. Em 2008, Zioga e colaboradores (195) descreveram um isolado de
Salmonella spp. produtor de CMY-2. O gene blaCMY-2 possuía uma cópia tanto no
DNA cromossomal quanto DNA plasmidial.
CMY-13 foi a primeira pAmpC originada de C. freundii induzível (122). Está
enzima foi isolada de uma E. coli na Grécia e possui o gene ampR funcional.
Foi descrita a associação de CMY-2 (103;108;137) e CMY-4 (39;169) com
perda ou alteração da permeabilidade da membrana externa causando a diminuição
da sensibilidade ao imipenem em isolados clínicos de K. pneumoniae, E. coli e
Salmonella spp.
Uma nova β-lactamase do tipo AmpC, designada CMY-37, foi descrita em um
isolado de C. freundii. O gene blaCMY-37 era cromossomal e não estava associado
com o elemento de inserção ISEcp1, relacionado à mobilização de algumas
pAmpCs. A análise filogenética mostrou que a CMY-37 é derivada de enzimas
cromossomais de C. freundii (97% de similaridade). De acordo com a análise
filogenética, CMY-37 é mais estreitamente relacionada à CMY-13 (5).
17
MIR
Em 1990, Papanicolaou e colaboradores (142) descreveram uma enzima
(MIR-1) que era codificada por um gene localizado em um plasmídeo de uma K.
pneumoniae, com propriedades bioquímicas das β-lactamases da classe 1 e 99% de
similaridade genética com o gene ampC de E. cloacae. Mais recentemente, foi
descrita a variante MIR-4 em E. coli, com quatro substituições de amino ácidos
quando comparada com a seqüência de MIR-1 (181).
MOX
A enzima MOX-1 foi isolada e descrita de um isolado de K. pneumoniae
proveniente do Japão, no ano de 1993 (79). Outras três variantes desta enzima
foram então descritas, em K. pneumoniae na Grécia (MOX-2), em Aeromonas spp.
(MOX-3; EU515248) e em Vibrio fluvialis (MOX-4; FJ262599) (dados não
publicados).
18
LAT
A primeira enzima da família LAT foi descrita em 1993 por Tzouvelekis e
colaboradores (176) em um isolado de K. pneumoniae na Grécia. As outras três
variantes descritas dessa família também foram relatadas na Grécia em isolados de
K. pneumoniae (LAT-2), E. aerogenes (LAT-2) e E. coli (LAT-2, -3 e -4) (64).
As enzimas da família LAT têm uma origem semelhante e posteriormente foi
verificado que a seqüência de DNA da enzima LAT-2 era idêntica àquela de CMY-2,
a de LAT-3 idêntica à CMY-6, e a de LAT-4 idêntica a de LAT-1. Assim, com isso,
LAT-1 é a única enzima representante desta família (11).
FOX
As enzimas da família FOX tem uma relação ancestral com a AmpC
cromossomal de Aeromonas caviae. FOX-1 foi descrita em um isolado de K.
pneumoniae na Argentina. Este isolado apresentou duas variantes moleculares de
FOX-1 com ponto isoelétrico (pI) de 6.8 e 7.2 (68). A segunda variante descrita,
FOX-2, foi detectada na Guatemala em um isolado de E. coli. Esta variante
apresentava similaridade de 96,9%, 74,9% e 67,7% com as enzimas FOX-1, CMY-1
e MOX-1, respectivamente (20). Três outras variantes já foram descritas, FOX-3 em
isolados de K. oxytoca e K. pneumoniae na Itália (114), FOX-4 em E. coli na
Espanha (31) e FOX-5 em K. pneumoniae nos EUA (154). Os plasmídeos que
19
carregam os genes codificadores da família FOX geralmente carregam também
genes de resistência para as fluoroquinolonas (117).
DHA
As enzimas da família DHA (DHA-1, -2 e -3) parecem ser originadas a partir
da AmpC de M. morganii, já que apresentam uma similaridade entre 98,2 e 100%
com a mesma. As enzimas desta família foram isoladas de Salmonella enteritidis
(62) e K. pneumoniae (61;186). Isolados de K. pneumoniae e E. aerogenes
produtores de DHA-1 também já foram relatados (172;180;189).
Com algumas exceções, a expressão das pAmpCs não é induzível. DHA-1 foi
a primeira pAmpC induzível descrita. As outras duas β-lactamases da família DHA
também são induzíveis, pois o gene regulador ampR foi mobilizado junto com o gene
ampC, do cromossomo bacteriano para o plasmideo (13;61;186). A similaridade do
gene ampR plasmidial das três β-lactamases do tipo DHA com o gene ampR
cromossomal de M. morganii é de 98%.
Em 2007, foi descrita pela primeira vez a associação de DHA-1 com alteração
da permeabilidade das OmpK35 e OmpK36, determinando a resistência a imipenem
em isolados clínicos de K. pneumoniae (103).
20
ACT
A enzima ACT-1 foi descrita em isolados de K. pneumoniae, nos quais o gene
codificador de ACT-1 encontrava-se em plasmideos. Porém, em E. coli, o gene
blaACT-1 encontrava-se no cromossomo (34). Reisbig e Hanson demonstraram que o
gene blaACT-1, descrito em um isolado de K. pneumoniae, era induzível (158).
Isolados de K. pneumoniae resistentes a imipenem estavam associados a
perda da proteína de membrana externa de 42kDa com associação da AmpC
plasmidial ACT-1 (34).
ACC
A pAmpC ACC-1 foi descrita em isolados de K. pneumoniae, E. coli e P.
mirabilis, assim como ACC-4 foi descrita em E. coli. Excepcionalmente, estas
enzimas não conferem resistência às cefamicinas, constituindo assim uma exceção
no grupo das pAmpCs (17;67;126).
Em 2005, Bidet e colaboradores (24) descreveram a associação de ACC-1
com a perda da OmpK36 em um isolado de K. pneumoniae, causando uma
diminuição da sensibilidade ao imipenem.
21
CFE
A enzima CFE-1 foi a última família de pAmpC descrita. CFE-1 foi isolada de
uma E. coli no Japão. Apesar do gene blaCFE-1 ter sido mobilizado juntamente com o
gene ampR para o plasmídeo, a produção desta enzima não é induzível (128).
β-lactamases pAmpC têm sido descritas por todo o mundo, mas ainda são
menos comuns que as ESβLs. Essas enzimas já foram reportadas na África (Algeria,
Tunísia), Ásia (Índia, Japão, Paquistão, Coréia do Sul), Europa (França, Alemanha,
Grécia, Itália, Suécia, Inglaterra), Oriente Médio (Arábia Saudita), América do Norte
(Estados Unidos, Canadá, México) e América do Sul e Central (Argentina, Brasil,
Guatemala) (86).
O relato de isolados produtores de pAmpC parece ser esporádico, mas surtos
de infecções hospitalares causadas por K. pneumoniae produtores de MIR-1, CMY1, ACC-1, ACT-1 e DHA-1 (34;94;125;126;136;142;189), E. coli produtora de CMY-2
(113), P. mirabilis produtores de CMY-16 (48) têm sido relatados em todo o mundo.
Plasmídeos
que
carregam
os
genes
das
β-lactamases
pAmpC
freqüentemente carregam também outros determinantes de resistência, incluindo
genes para resistência a aminoglicosídeos, cloranfenicol, quinolonas, sulfonamidas,
tetraciclina e trimetoprim. Foram descritos isolados que carregavam além do gene da
pAmpC outros genes de β-lactamases, como blaTEM-1, blaPSE-1 (6), blaCTX-M-3,
(9;43;184;193), blaSHV-2,
-5, -9, -12
e
-27
-14 e -15
(9;63;73;113;125;160;193), blaOXA-9 e
-30
(73;74), blaVIM-1 (121) e blaIMP-1 (125). Os genes bla podem estar localizados em
diferentes plasmídeos, mas muitas vezes ocorrem em um mesmo plasmídeo.
22
Exceto por alguns isolados de Salmonella e ocasionais isolados de K.
pneumoniae e E. coli (60;89;164;182;194), a maioria dos isolados produtores de
pAmpC foram isolados de pacientes após vários dias de internação em hospital. No
entanto, recentemente, alguns isolados foram recuperados de pacientes em asilos,
centros de reabilitação e ambulatórios (8;72;118).
No que diz respeito à produção de pAmpC em enterobactérias há apenas
alguns estudos avaliando os fatores de risco e o desfecho clínico, embora haja
relatos de vários surtos hospitalares e uma crescente prevalência destas infecções.
Os fatores de risco para as infecções por pAmpC são similares aos fatores de risco
para a infecção por K. pneumoniae produtoras de ESβL (139).
Os fatores de risco para infecções de corrente sangüínea causadas por
isolados de K. pneumoniae produtores de pAmpC incluem: longa permanência
hospitalar, internação em UTI, cateter venoso central ou arterial, cateter urinário e a
administração prévia de antibióticos, especialmente as cefalosporinas de amplo
espectro e combinações de inibidores de β-lactamases (139;190). Doenças de base
como, leucemia e câncer (80;113;139;169), e pacientes submetidos a transplante de
orgãos (113) também têm um maior risco de adquirir estas infecções. Em um estudo
realizado por Park e colaboradores (143), verificou-se que um fator de risco
independente para infecções por isolados produtores de pAmpC, é a utilização de
cefalosporinas de 3ª geração até um mês antes da infecção.
Isolados produtores de pAmpC são freqüentemente resistentes a múltiplos
antimicrobianos, dificultando a escolha de um antibiótico eficaz para o tratamento de
infecções causadas por esses isolados. As combinações de inibidores de β-
23
lactamases e penicilinas devem ser evitadas devido a resistência in vitro a estas
drogas.
O uso de cefepima para o tratamento de infecções causadas por pAmpC é
incerto e necessita cautela. Cefepima é um pobre indutor de AmpC, penetra
rapidamente através da membrana celular externa, e é pouco hidrolizado pelas
enzimas pAmpC (131;165), de modo que muitos isolados produtores de pAmpC são
sensíveis in vitro a cefepima. No entanto, se um inóculo 100 vezes maior for
utilizado, a CIM aumenta dramaticamente para alguns isolados (92;152). Alguns
isolados podem ser francamente resistentes à cefepima (135).
Em um modelo de pneumonia utilizando cobaias, cefepima, imipenem e
meropenem foram igualmente eficazes contra uma cepa de K. pneumoniae
produtora de FOX-5 com associação de perda de porina (151). Além disso, em outro
modelo de pneumonia em rato, a terapia com imipenem, meropenem, ertapenem ou
cefepima foi equivalente no tratamento desta infecção por uma cepa K. pneumoniae
produtora ACT-1 e deficiente na produção de porinas (138). Um modelo de peritonite
em rato demonstrou que a terapia com cefepima e imipenem, em infecções
causadas por E. coli produtora de FOX-1 e LAT-1 com alto inóculo, foi efetiva (178).
No entanto, em um modelo com uma cepa de K. pneumoniae produtora CMY-2
associada à perda de porina, a sobrevida dos ratos tratados com cefepima não foi
maior que àquela dos ratos não tratados e significativamente inferior à dos ratos
tratados com imipenem (152). Barlow e Hall (12) avaliaram a evolução in vitro da
resistência a cefepima em um isolado de E. coli produtor de CMY-2. Neste estudo os
24
autores demonstraram a potencial capacidade de este isolado desenvolver
resistência à cefepima.
A antibioticoterapia que utilizada os carbapenens tem sido geralmente eficaz
para o tratamento de infecções causadas por cepas produtoras de pAmpC (139),
mas também tem sido seguida pelo aparecimento de isolados resistentes ou com
sensibilidade reduzida aos carbapenens (CIM de 8 a 32 µg/mL) como citado
anteriormente (3;9;24;34;39;91;103;108;137;169). Tigeciclina é outra opção no
tratamento destas infecções. Em um estudo realizado no Reino Unido, apresentou
boa atividade in vitro contra 88% dos isolados de E. coli, Enterobacter spp.,
Klebsiella spp. e Citrobacter spp. produtores de AmpC (77).
Epidemiologia no Brasil
A epidemiologia de infecções causadas por bactérias produtoras de pAmpC
ainda é desconhecida no Brasil, apenas dois relatos de isolados produtores destas
enzimas foram feitos no país.
Em 2006, Castanheira e colaboradores (40) descreveram uma cepa de E.
coli isolada em Porto Alegre que além do gene qnr carregava no mesmo plasmídeo
o gene blaFOX-5. Em 2007, foi publicado o primeiro trabalho que avaliava a freqüência
de AmpC plasmidial em nosso meio. Entretanto, nenhum isolado produtor de pAmpC
foi encontrado. Foi observado apenas a possível hiperexpressão da AmpC
cromossomal em cinco isolados de E. coli (166).
25
Em 2008, Pavez e colaboradores (147) descreveu quatro isolados de E. coli
resistentes aos carbapenens, provenientes de um mesmo paciente. Estes isolados
eram produtores da enzima CMY-2 associada à perda de Omp36. O gene carregado
por essa amostra apresentou 99% de similaridade genética com a seqüência do
gene blaCMY-2 descrito.
2.1.1.1 Localização e mobilização dos genes codificadores de pAmpC
A natureza exata da mobilização dos genes ampC cromossomais é
desconhecida, mas a captura dos genes ampC é provavelmente seguida pela
inserção destes em plasmídeos e transposons.
Os genes para as pAmpCs estão inseridos em plasmídeos de tamanhos
variados (7-180 kb) (80;169). Alguns dos plasmídeos não são conjugáveis, mas são
transferidos por transformação (142;187).
Uma variedade de elementos genéticos têm sido relacionados à mobilização
das pAmpCs. A seqüência de inserção ISEcp1 está associada com muitas enzimas
CMY, incluindo CMY-2 (66;70;93), CMY-4 (127), CMY-5 (187), CMY-7 (70;81), CMY
-12, -14 e -15 (107), CMY-16 (48), CMY-21 (78), CMY-31 e -36 (195), bem como
ACC-1 (55;144) e ACC-4 (141). ISEcp1 está envolvido na transposição dos genes
adjacentes (153) e tem se mostrado capaz de mobilizar genes cromossomais para
plasmídeos (100). Esse elemento de inserção pode também fornecer um eficiente
promotor para uma expressão dos genes vizinhos em alto grau.
26
O gene blaFOX-5, está relacionado com a seqüência de inserção ISAS2 (154) e
o gene blaMOX-2, com a seqüência IS186 (157). O gene blaCMY-13 e o gene ampR são
delimitados por uma repetição direta, IS26, elementos constituídos por uma
transposase (tnpA) com segmentos terminais repetidos e invertidos (IR), assim como
a enzima CFE-1 (122;128).
Alguns genes blaAmpC são encontrados adjacentes a uma região comum da
seqüência de inserção (ISCR1) envolvida na mobilização de gene em integrons de
classe 1 (175). As variantes de CMY-1 (CMY-8, -9, -10, -11 e -19), DHA-1 e MOX-1
estão relacionadas com esse elemento (179). Estes genes, assim como o blaFOX-4
estão associados aos integrons de classe I do tipo sul, In6 e In7 (31).
2.1.1.2 Detecção fenotípica e genotípica de β-lactamases do Tipo AmpC
plasmidiais
A resistência e/ou níveis intermediários de resistência à cefoxitina pode ser
um indício da produção de pAmpC. Esta triagem pode ser útil, mas não é específica,
já que uma redução na permeabilidade da membrana externa pode também conferir
resistência a cefoxitina (86).
Não existe uma recomendação específica do Clinical Laboratory Standards
Institute para a detecção de pAmpCs. No entanto, vários métodos fenotípicos para a
detecção da produção destas enzimas foram descritos.
Um teste amplamente utilizado para a detecção fenotípica de pAmpC é o
teste tri-dimensional, descrito por Coudron e colaboradores (47). Este teste foi
27
desenvolvido inicialmente por Thomson & Sanders (174) para detectar a produção
de ESβL. Para a realização deste teste, uma placa de ágar Müeller-Hinton é
inoculada com uma bactéria sensível à cefoxitina, como por exemplo a cepa de E.
coli ATCC 25922, e um extrato bruto de β-lactamases da cepa teste é adicionado a
uma fenda formada no ágar. A distorção da zona de inibição indica um teste positivo,
já que a cefoxitina seria hidrolisada pela presença de uma pAmpC na amostra teste.
Modificações deste teste foram propostas, como o teste de Hodge modificado
(192). Onde, a cepa teste é inoculada diretamente sobre a superfície da placa de
Müeller-Hinton a partir do disco de cefoxitina em direção à periferia da placa ao
invés do extrato protéico bruto da amostra teste. No entanto, este teste falhou na
detecção de alguns isolados produtores de CMY-2 e DHA-1 (101). Outra variação do
teste tri-dimensional foi proposta por Nasin e colaboradores (129). Neste ensaio, a
placa Müeller-Hinton onde a cepa sensível é inoculada contém 4 µg/mL de
cefoxitina. O extrato bruto de β-lactamases da cepa teste é adicionado em poços
feitos no ágar. Após a incubação, o crescimento em torno do poço indica a presença
de uma pAmpC. Este método parece ser tão sensível e específico como o teste tridimensional para detecção de pAmpC, sendo também de mais fácil execução, e
permitindo que um número maior de amostras sejam testadas.
Recentemente foi descrito um novo método, o AmpC disk test, no qual se
utiliza um disco de papel impregnado com Tris-EDTA, para aumentar a
permeabilidade (27). Este teste apresentou 100% e 98% de sensibilidade e
especificidade, respectivamente, na detecção de isolados produtores de pAmpC. No
28
entanto, isolados produtores de carbapenemases podem apresentar resultados
falso-positivos.
Outra abordagem para detecção AmpC é o uso de um inibidor destas βlactamases, análogo ao uso de ácido clavulânico no teste de confirmação para a
detecção de enzimas da classe A ESβLs. Os β-lactâmicos LN-2-128, Ro 48-1220 e
Syn 2190 foram avaliados para esse fim. As combinações de cefotetan e LN-2-128 e
Ro 48-1220 foram adequadas para a detecção de isolados produtores de pAmpC,
demonstrando uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 90%. No
entanto, os melhores resultados parecem ser da combinação de cefotetan e Syn
2190, que foi 100% específica e teve uma sensibilidade de 91% na detecção de
pAmpC
(28;29).
Infelizmente,
esses
inibidores
não
estão
disponíveis
comercialmente.
O ácido borônico tem sido há muito tempo conhecido como inibidor de AmpC
(21). Diversos derivados do ácido borônico têm sido adicionados a discos em
branco e posicionados próximos de discos de β-lactâmicos ou adicionados aos
discos de β-lactâmicos e o halo de inibição do crecimento bacteriana comparados
àqueles produzidos por discos sem impregnação (46). Brenwald e colaboradores
(35) utilizaram um derivado do ácido borônico em associação com discos de
cefoxitina e cefopodoxima. Os autores também associaram ao teste cloxacilina e
ácido clavulânico. Os discos de cefoxitina-cloxacilina, cefoxitina-ác. borônico,
cefpodoxima- ácido borônico e cefpodoxima- ác. borônico-ácido clavulânico
detectaram corretamente 57 (86,4%), 59 (89,4%), 64 (97%) e 66 (100%) dos
isolados produtores de pAmpC, respectivamente. Os discos de cefoxitina não são
29
capazes de detectaram isolados produtor de ACC-1 e o disco de cefpodoximaácído borônico não foi capaz de detectar dois isolados que eram co-produtores de
ESβL.
Yagi e colaboradores (188) constataram uma potencialização do ensaio
quando utilizado um aumento ≥5 mm na zona de inibição do halo de ceftazidima ou
cefotaxima quando 300 µg de ácido boronico foi adicionado ao meio de cultura.
Todas as variantes de pAmpC testadas foram detectadas e o teste resultou
negativo para possíveis interferentes, como cepas produtoras de ESβL e
carbapenemases. Em 2007, outro estudo utilizou um aumento ≥ 5 mm na zona de
inibição do halo de cefoxitina ou cefotetan com o ácido borônico como porte de
corte para interpretação de um teste positivo para a produção de pAmpC. Neste
estudo os discos de cefoxitina-ácido borônico detectaram 97,7% dos isolados
produtores de pAmpC enquanto os discos de cefotetan- ácido borônico detectaram
apenas 81,4% dos isolados produtores de pAmpC (167). Nenhum isolado produtor
de ESβL e não-produtor de pAmpC apresentou resultado positivo com os discos.
O E-test® para AmpC tem se mostrado um teste sensível para a detecção
destas enzimas. Esta fita possui uma das extremidades impregnada com cefotetan
ou cefoxitina e, a extremidade oposta, com cefotetan ou cefoxitina associado à
cloxacilina numa concentração constante. São consideradas produtoras de AmpC
as amostras que apresentarem uma redução de três diluições na concentração
inibitória mínima (CIM) da cefamicina ou formação de zona fantasma na presença
da cloxacilina (59). Em um ensaio com aproximadamente 500 isolados, o E-test®
apresentou sensibilidade e especificidade de 88 a 93%, respectivamente.
30
Estes testes fenotípicos não distinguem entre as diversas famílias de pAmpC
e podem não diferenciar entre uma pAmpC e uma AmpC cromossomal.
O padrão-ouro para detecção da produção de pAmpC é o PCR multiplex
desenvolvido por Pérez-Pérez & Hanson (149). Nesta técnica se utiliza seis pares de
iniciadores para a detecção da maioria das famílias de AmpC plasmidial. Esta
técnica não contempla a detecção da pAmpC CFE-1.
31
Objetivos
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo principal
•
Avaliar a freqüência de enterobactérias produtoras de pAmpC isoladas em
infecção de corrente sangüínea de pacientes internados no Hospital São
Paulo/UNIFESP.
3.2 Objetivos secundários
•
Avaliar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos entre as amostras de
enterobactérias estudadas;
•
Detectar fenotipicamente a produção de β-lactamases de espectro ampliado
(ESβL) nas amostras estudadas;
•
Detectar fenotipicamente a produção de pAmpC nas amostras estudadas;
•
Identificar os genes blaCMY, blaMIR, blaACC, blaACT, blaMOX, blaLAT, blaFOX e
blaDHA que codificam as pAmpCs;
•
Confirmar a localização e possível transferência dos genes codificadores de
pAmpC.
32
Material e Métodos
4 MATERIAL E METÓDOS
4.1 Amostras bacterianas
Foram selecionadas para o estudo 140 amostras consecutivas de
enterobactérias, entre elas, 66 K. pneumoniae, 5 K. oxytoca, 46 E. coli, 19 P.
mirabilis e 4 Salmonella spp., isoladas de hemocultura de pacientes internados no
Hospital São Paulo/UNIFESP, entre janeiro e junho de 2006, que se encontravam
armazenadas no banco de microrganismos do Laboratório Especializado em
Microbiologia Clinica (LEMC). As amostras estavam armazenadas em caldo tríptico
de soja (TSB – Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) com glicerol a 15% a – 20°C.
Somente uma amostra por paciente foi estudada. As amostras foram retiradas do
banco de microrganismos e subcultivadas por duas vezes em ágar sangue antes da
realização dos testes, para a garantia da pureza e viabilidade das amostras.
4.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos
O perfil de sensibilidade das amostras foi determinado pela técnica de ágar
diluição, de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) (44). Os agentes antimicrobianos testados e as respectivas
concentrações (µg/mL) foram: aztreonam (1-256 µg/mL), ceftazidima (1-256 µg/mL),
cefepima (1-256 µg/mL), cefoxitina (1-256 µg/mL), ceftriaxona (1-512 µg/mL),
ciprofloxacino (0,12-32 µg/mL), imipenem (0,5-128 µg/mL). Para o controle de
qualidade, foram incluídas nos testes de sensibilidade, amostras de E. coli American
33
Material e Métodos
Type Culture Collection (ATCC) 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e K.
pneumoniae ATCC 700603.
Foram preparadas soluções estoque dos antimicrobianos a serem utilizados,
que foram armazenadas a -70°C (NCCLS, 2003). A partir da concentração da
solução estoque, foram realizadas diluições seriadas do respectivo antimicrobiano
em tubos contendo 19 mL de ágar Müeller-Hinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra)
fundidos e estabilizados em banho-maria a 56oC. Uma vez estabilizada a
temperatura, 1 mL de uma solução de antimicrobiano com concentração 20 vezes
superior a ser testada, foi adicionado nos 19 mL de ágar Müeller-Hinton. Após
homogeneização, o conteúdo foi vertido em placas de Petri de 90 x 15 mm,
descartáveis e previamente identificadas.
Para cada amostra uma suspensão contendo aproximadamente 108 Unidades
Formadoras de Colônias (UFC)/mL (escala 0,5 de MCFarland) foi preparada em
solução salina (NaCl – Sigma, St. Louis, MO). Essa solução foi, então, diluída com
água destilada estéril na proporção de 1:10 mL, resultando em um inóculo de
aproximadamente 107 UFC/mL. Trezentos microlitros dessa suspensão bacteriana
foi transferido para a base do inoculador de Steers. Desse modo, 2 a 3 µL da
suspensão bacteriana de cada amostra foi inoculado simultaneamente na superfície
do ágar obtendo um inóculo final de 104 UFC/mL.
As placas foram deixadas em temperatura ambiente até a absorção do
inóculo pelo ágar. A leitura foi realizada após incubação por 18 horas a 35°C e a
concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como sendo a menor concentração
de cada antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano.
34
Material e Métodos
As amostras foram classificadas como sensíveis (S), intermediárias (I) ou
resistentes (R) aos antimicrobianos testados de acordo com os critérios
estabelecidos pelo CLSI para Enterobacteriaceae (45).
4.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβ
βL
O CLSI recomenda a utilização de alguns antimicrobianos para a triagem de
amostras produtoras de ESβL em isolados de E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca e
P. mirabilis (Tabela 2).
Tabela 2. Triagem para ESβL segundo o CLSI.
E. coli, K. pneumoniae e K. oxytoca
CIM
≥2 µg/mL para cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima
ou aztreonam e
≥8 µg/mL para cefpodoxima
Halo (disco-difusão)
≤17 mm para cefpodoxima,
≤22 mm para ceftazidima,
≤25 mm para Ceftriaxona e
≤27 mm para cefotaxima ou aztreonam
P. mirabilis
CIM
≥2 µg/mL para
ceftazidima
cefpodoxima,
Halo (disco-difusão)
≤22 mm para cefpodoxima, ceftazidima e
≤27 mm para cefotaxima
cefotaxima
ou
35
Material e Métodos
4.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação
O teste confirmatório de detecção fenotípica da produção de ESβL foi
realizado de acordo com a metodologia descrita por Jarlier e colaboradores em 1988
(87). Foi preparada uma suspensão bacteriana em caldo Müeller-Hinton (Oxoid®,
Basingstoke, Inglaterra), com turbidez correspondente a 0,5 da escala de
McFarland. Após homogeneização, a suspensão foi semeada em uma placa de ágar
Müeller-Hinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) utilizando um swab estéril. Em
seguida foram dispensados os discos de aztreonam (30µg), ceftriaxona (30µg),
ceftazidima (30µg), cefepima (30µg) com 20 mm (centro a centro) de distância de
um disco de amoxacilina/ácido clavulânico (30µg/10µg) colocado no centro da placa,
conforme ilustrado na Figura 4. As placas foram incubadas por 18 a 24 horas, em
temperatura de 35°C. Após esse período, foi verificada a presença de uma zona de
inibição entre os discos contendo os substratos e aquele contendo o inibidor de βlactamase. O teste foi considerado positivo para a produção de ESβL quando houve
o aparecimento de deformações do halo de inibição ou o de uma zona fantasma
entre o substrato e o inibidor, para pelo menos um dos substratos testados. Para o
controle de qualidade, foi incluída nos testes de detecção fenotípica a cepa de K.
pneumoniae ATCC 700603, produtora de ESβL e a cepa de E. coli ATCC 25922
como controle negativo.
36
Material e Métodos
CRO
CAZ
AMC
FEP
20 mm
ATM
Figura 4. Placa modelo de disco aproximação utilizada para a detecção fenotípica
da produção de ESβL. CAZ, ceftazidima; CRO, ceftriaxona; FEP, cefepima; ATM;
aztreonam; AMC, amoxacilina/ácido clavulânico.
4.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC
4.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado
O teste tri-dimensional modificado para detecção de pAmpC foi primeiramente
proposto por Coudron e colaboradores (47), como uma adaptação do teste descrito
previamente para a detecção de ESβLs.
Para a obtenção do extrato bruto de β-lactamases, 10 colônias bacterianas
foram inoculadas em 10 mL de caldo TSB com 20 µg/mL de ampicilina. Os tubos
foram incubados a 37°C, durante a noite, sob agitação. A suspensão bacteriana foi
transferida para um tubo cônico que foi centrifugado por 15 minutos a 3000 rpm. Em
37
Material e Métodos
seguida, o sobrenadante foi desprezado e o centrifugado ressuspenso em 1 mL de
tampão de amostra (Tris-HCl 1mM e ZnSO4 1mM). Essa suspensão bacteriana foi,
então, ultrasonicada por quatro vezes. O produto sonicado foi transferido para tubo
de microcentrífuga e centrifugado novamente por 3 minutos a 4ºC e 13000 rpm. O
sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as amostras foram mantidas no
gelo até o momento do ensaio.
Para o teste tri-dimensional, uma placa de Müeller-Hinton (Oxoid®,
Basingstoke, Inglaterra) foi inoculada com a cepa de E. coli ATCC 25922, de acordo
com a metodologia preconizada pelo CLSI (44), para o teste de disco difusão. Um
disco de cefoxitina 30 µg (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) foi colocado no centro da
placa e, com o auxílio de uma lâmina de bisturi estéril, o ágar foi cortado começando
5 mm após a extremidade do disco até a periferia da placa. Nesse corte foi pipetado
de 25 a 30 µL do extrato bruto de β-lactamases, iniciando pela área próxima ao
disco em direção à periferia da placa, como mostrado na Figura 5. As placas foram
incubadas por 18 a 24 horas a 35°C. O teste foi considerado positivo quando houve
o crescimento da amostra ATCC 25922 na área de encontro do corte no ágar com o
halo de inibição da cefoxitina, indicando, dessa maneira, hidrólise da cefoxitina e a
possível produção de AmpC.
38
Material e Métodos
FOX
Figura 5. Placa modelo do teste tridimensional utilizada para a detecção fenotípica
da produção de AmpC. FOX, cefoxitina.
4.4.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado
Para a realização do teste de Hodge modificado (101), uma placa de MüellerHinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) foi inoculada com a cepa de E. coli ATCC
25922, de acordo com a metodologia preconizada pelo CLSI para o teste de disco
difusão (44). Um disco de cefoxitina 30 µg (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) foi
colocado no centro da placa. As amostras bacterianas foram cultivadas em ágar
nutriente contendo 50 µg/mL de ampicilina. Duas ou três colônias bacterianas foram
estriadas sob a placa de Müeller-Hinton (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) com uma
alça começando 5 mm após a extremidade do disco até a periferia da placa,
39
Material e Métodos
conforme ilustrado na Figura 6. As placas foram incubadas por 18 a 24 horas a
35°C. O teste foi considerado positivo, quando houve o crescimento da amostra
ATCC 25922 na área de encontro da bactéria teste com o halo de inibição da
cefoxitina, indicando, a hidrólise da cefoxitina e assim, possivelmente a produção de
pAmpC.
FOX
Figura 6. Placa modelo do teste de Hodge utilizada para a detecção fenotípica da
produção de AmpC. FOX, cefoxitina.
A leitura dos testes fenotípicos foi realizada por dois observadores
independentes e realizada anteriormente à realização da confirmação genotípica da
produção de pAmpC.
40
Material e Métodos
moleculares
multiplex
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex foi empregada
para a detecção dos genes cmy, mir, acc, act, mox, lat, fox e dha de acordo com a
técnica descrita por Pérez-Pérez e Hanson (149).
As amostras bacterianas foram cultivadas em ágar nutriente (Oxoid®,
Basingstoke, Inglaterra) contendo 50 µg/mL de ampicilina. Uma colônia de cada
amostra foi inoculada em 5 mL caldo de TSB. Os tubos foram incubados a 37°C por
12 horas, sob agitação. Um mililitro e meio da suspensão bacteriana foi transferido
para um tubo de microcentrífuga, o qual foi centrifugado por 5 minutos a 13000 rpm.
Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o centrifugado ressuspenso em 500
µL de água deionizada. As células foram, então, lisadas por aquecimento a 95°C por
10 minutos. Os debris celulares foram removidos por centrifugação a 13000 rpm por
5 minutos. O sobrenadante foi utilizado para reação de PCR. Em fluxo laminar, foi
preparada uma solução mãe contendo: H2O deionizada, solução tampão com MgCl2
1,5 mM, KCl 50 mM e Tris-HCl 20 mM [pH 8,4], 0,2 mM de desoxinucleotídeo
trifosfato (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 0,6 mM dos iniciadores MPCMY1-F,
MPCMY1-R, MPCMY2-F, MPCMY2-R, MPDHA-F e MPDHA-R; 0,5 Mm dos
iniciadores MPACC-F, MPACC-R, MPMAC-F E MPMAC-R; 0,4 mM dos iniciadores
MPFOX-F e MPFOX-R e 1,25 unidades/L de Taq DNApolimerase. A solução mãe foi
41
Material e Métodos
mantida em aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação, 48 µL
dessa solução foi transferido para cada tubo de amplificação, contendo 2 µL do DNA
alvo. Na Tabela 3 estão descritos os iniciadores utilizados para detecção dos genes
blacmy, blamox, blamir, blaacc, blaact, blalat, blaFox e bladha.
Tabela 3. Iniciadores utilizados para amplificação dos genes codificadores de βlactamases AmpC pela PCR multiplex (149).
Iniciadores
Seqüência (5’-3’)
MPCMY-1F
GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT
MPCMY-1R
MPCMY-2F
Gene Alvo
blaMOX1-2, blaCMY1,
CACATTGACATAGGTGTGGTGC
blaCMY8-11, blaCMY19
TGGCCAGAACTGACAGGCAAA
blaCMY2-7, blaCMY12-16,
Tamanho do
amplicon
520
blaCMY18, blaCMY21-24,
blaCMY26-33, blaCMY36-37,
MPCMY-2R
TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC
MPDHA-1F
AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT
blaLAT1-4
blaDHA-1-3
MPDHA-1R
CCGTACGCATACTGGCTTTGC
MPACC-F
AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA
MPACC-R
TTCGCCGCAATCATCCCTAGC
MPMAC-F
TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG
MPMAC-R
CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT
MPFOX-F
AACATGGGGTATCAGGGAGATG
MPFOX-R
CAAAGCGCGTAACCGGATTGG
462
blaACC1-2
405
346
blaMIR1-4, blaACT1-3
302
blaFOX1-7
190
42
Material e Métodos
As condições de termociclagem foram: denaturação inicial a 94ºC por 3
minutos, seguida por 25 ciclos de denaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento
a 64ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto. Após o último ciclo, houve
uma extensão final a 72ºC por 7 minutos. Após a amplificação do DNA, a revelação
do produto amplificado foi feita com eletroforese em gel de agarose a 2% e
visualização sob luz ultravioleta.
Foram utilizadas cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais como
controles positivos. Entre elas: E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1, E. coli
transconjugante 200 blaFOX-5, E. coli transconjugante C600 R96D blaMIR-1, Morganela
morganii blaDHA-1 e Hafnia Alvei A7.307 blaAAC. As cepas de E. coli ATCC 25922 e K.
pneumoniae ATCC 700603 foram utilizadas como controles negativos.
A confirmação da presença do gene blaCMY-2 pela técnica de PCR foi realizada
na amostra detectada genotipicamente pelo PCR multiplex como produtora de
pAmpC.
A amostra bacteriana foi cultivada em ágar nutriente contendo 50 µg/mL de
ampicilina. Uma suspensão de colônias da amostra foi preparada em um tubo de
microcentrífuga contendo 200 µL de água deionizada. Essa suspensão foi utilizada
diretamente para reação de PCR. Em fluxo laminar, foi preparada uma solução mãe
contendo: H2O deionizada, solução tampão com MgCl2 1,5 mM, NH4 50 mM e Tris-
43
Material e Métodos
HCl 10 mM [pH 9,0], 2 µL de desoxinucleotídeo trifosfato (0,5 µl de cada um: dATP,
dTTP, dGTP e dCTP), iniciadores e 2,5 unidades/L de Taq DNApolimerase. A
solução mãe foi mantida a aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve
agitação, 45 µL foi transferido para o tubo de amplificação, contendo 5 µL da
suspensão celular. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado
foi feita por eletroforese em gel de agarose a 1% e visualização sob luz ultravioleta.
Os iniciadores e as condições de termociclagem utilizados para detecção do
gene cmy-2 estão listados na Tabela 4.
Tabela 4. Iniciadores utilizados para reações de PCR e seqüenciamento neste
estudo.
Iniciadores
Seqüência (5’-3’)
CMY-2F
TCGTTATGCTGCGCTCTG
Condições de
termociclagem
Gene Alvo
blaCMY2-7,
CMY-2Fint
CMY-2R
ACTGGCAGCCGCAATGG
GGACAGGGTTAGGATAGC
Denaturação: 94ºC –
10’
Denaturação: 94ºC – 1’
Anelamento: 52ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
35 ciclos
Extensão final: 72ºC 10’
blaCMY12-16,
blaCMY18,
blaCMY21-24,
blaCMY26-33,
blaCMY36-37,
blaLAT1-4
Referências
X91840, Y15130,
Y17716, AJ011293,
AJ011291, Y16785,
AY339625, AJ555825,
AJ555823, AJ781421,
AY743434, DQ139328,
DQ256079, DQ438952,
EF415650, AB300358,
EF622224, EF561644,
EF685371, EF685372,
EF622224, EU496815,
EU496816, EU331426,
AB280919, X78117,
X97039, Y15411,
Y15412
44
Material e Métodos
Foi utilizada a cepa E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1 como controle
positivo. As cepas de E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603 foram
utilizadas como controles negativos.
4.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados
Os produtos de PCR foram purificados a partir do gel de agarose com o kit
QIAquick Gel Extraction, conforme as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden,
Alemanha). O DNA obtido foi quantificado utilizando o espectrofotômetro Biomate 5
UV-Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra) e, então, quantidades
necessárias foram submetidas à reação preparatória para o seqüenciamento com o
kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ao
término da reação de PCR, o produto foi precipitado para a eliminação dos d-dNTPs
marcados não incorporados à reação. Após a precipitação e lavagem com etanol, o
produto foi ressuspenso em polímero TSR e colocado no aparelho ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, CA).
As seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas foram
analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR,
Madison, WI) e, então, submetidas à comparação com bases de dados de
nucleotídeos disponíveis na Internet FASTA e BLAST (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
45
Material e Métodos
4.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC
As metodologias de transformação e conjugação foram utilizadas para avaliar
a capacidade de transferência da resistência bacteriana da célula doadora para
cepas receptoras de linhagens laboratoriais. As técnicas de conjugação e
transformação foram realizadas de acordo com metodologia descrita por Sambrook
e Russel (163). Linhagens receptoras de E. coli (derivados de K12 - resistentes à
estreptomicina - e DH5α) foram utilizadas para os experimentos de conjugação e
transformação, respectivamente. A seleção dos possíveis conjugantes foi realizada
em placas de ágar nutriente contendo 4 µg/mL de cefoxitina e 500 µg/mL de
estreptomicina e a seleção dos possíveis transformantes foi realizada em placas de
ágar nutriente contendo 4 µg/mL de cefoxitina. A confirmação da transferência dos
genes foi realizada através de amplificação pela técnica da PCR.
4.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC
Para determinação da localização dos genes cmy-2 seria utilizado o DNA total
e o DNA plasmidial. Essa conduta seria tomada devido a diversos relatos de
pAmpCs
que
passaram
a
ser
inseridas
no
cromossomo
bacteriano
(36;48;49;107;177).
O DNA plasmidial seria extraído com o kit QIAprep Spin Midi prep para
obtenção de material genético em quantidade e qualidade necessárias, segundo as
instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). Enquanto que, o DNA total da
46
Material e Métodos
amostra seria extraído com a técnica de brometo de cetiltrimetilamônio - CTAB. Após
o isolamento, o microrganismo seria cultivado em ágar nutriente e incubado a 37°C.
O crescimento bacteriano seria coletado com auxílio de alça descartável e
ressuspenso em tubo cônico (50 mL) com 9,5 mL de tampão TE. Seria adicionado
500 µL de uma solução a 10% de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e 100 µL de
Proteinase K (20 mg/mL). A solução seria homogeneizada e após ter sido incubada
por 1 hora a 37°C, 1,8 mL de cloreto de sódio (5M) seria foi adicionado. A amostra
seria incubada por 10 minutos em temperatura ambiente e após esse período de
incubação seriam adicionados 1,5 mL de solução de CTAB/NaCl previamente
aquecida a 65°C. A amostra seria incubada por 20 minutos a 65°C. Seria adicionado
um volume igual de uma solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) sendo o
tubo invertido para homogeneização. A amostra seria centrifugada por 10 minutos a
7000 rpm, em temperatura ambiente. O sobrenadante obtido seria, então, transferido
para um no tubo cônico e adicionado 0.6 volume de isopropanol. A solução seria
homogeneizada lentamente até a precipitação do DNA. O DNA seria transferido com
o auxílio de uma alça descartável para um tubo de microcentrífuga e, após secagem,
o DNA seria ressuspenso em água deionizada.
Alíquotas de DNA cromossomal e DNA plasmidial da amostra avaliada seriam
submetidas à eletroforese em gel de agarose 8%. Posteriormente, o material
genético seria transferido para uma membrana de nylon (Hybond-N+, Amershan
Biosciences, Uppsala, Suécia) pela técnica de Southern blot. Essa membrana seria
submetida a uma reação de hibridização com o Kit ECL Direct Nucleic Acid Labelling
and Detection Systems segundo as especificações do fabricante (Amershan
47
Material e Métodos
Biosciences, Uppsala, Suécia). O fragmento de DNA utilizado como sonda seria
obtido por amplificação de um fragmento interno dos genes blaCMY-2 presente em
amostras controles, da qual esses genes foram descritos. Para amplificação seria
utilizado os pares de iniciadores listados na Tabela 4. A sonda seria preparada com
o kit ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems segundo as
instruções do fabricante (Amershan Biosciences, Uppsala, Suécia).
48
Resultados
5 RESULTADOS
5.1 Amostras bacterianas
As amostras bacterianas estudadas foram recuperadas do banco de
microrganismos do LEMC. Sete amostras não foram viáveis e, assim, foram
excluídas do estudo. A nova distribuição dos isolados de acordo com a espécie
bacteriana encontra-se na Tabela 5.
Tabela 5. Distribuição dos isolados de acordo com a espécie.
Microrganismo
Total de amostras
K. pneumoniae
66
Total de amostras
recuperadas
65
K. oxytoca
5
5
E. coli
46
41
P. mirabilis
19
18
Salmonella spp.
4
4
5.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos
A sensibilidade das amostras de enterobactérias aos diversos antimicrobianos
foi avaliada pela técnica de ágar diluição. Na Tabela 6, podemos observar o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos testados de todas as amostras estudadas, assim
como, a menor concentração de cada antimicrobiano que inibiu o crescimento de
50% e 90% das amostras (CIM50 e CIM90), respectivamente.
49
Resultados
Tabela 6. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras estudadas.
CIM (µg/mL)
Agentes
Antimicrobianos
Sensibilidade
Resistência
CIM50
CIM90
(%)
(%)
Aztreonam
≤1
128
61,7
33,9
Ceftazidima
≤1
64
66,2
26,4
0,25
>32
51,9
45,9
Ceftriaxona
2
>512
54,9
39,1
Cefepima
≤1
64
57,9
39,1
Cefoxitina
4
32
80,5
12,9
Imipenem
≤0,5
≤0,5
99,2
0
Ciprofloxacino
Entre os antimicrobianos testados, o imipenem foi o agente antimicrobiano
que exibiu maior potência in vitro (CIM50 ≤0,5) e a maior taxa de sensibilidade entre
os microrganismos testados (99,2%), seguido pela cefoxitina (80,5%). Somente um
isolado de K. pneumoniae apresentou redução da sensibilidade a imipenem (CIM, 8
µg/mL). Esta amostra foi isolada de um paciente internado na UTI geral do HSP.
Esta amostra não foi caracterizada fenotipicamente como produtora de ESβL ou
pAmpC.
As taxas de sensibilidade variaram conforme as espécies estudadas (Figura
7). Somente os isolados de Salmonella spp. apresentaram 100% de sensibilidade
para todos os antimicrobianos testados.
50
Resultados
120
100
80
K. pneumoniae
P. mirabilis
60
E. coli
Salmonella spp.
40
K. oxytoca
20
0
ATM
CAZ
CIP
CRO
FEP
FOX
IPM
Figura 7. Porcentagem de sensibilidade das amostras de enterobactérias. ATM,
aztreonam; CAZ, ceftazidima; CIP, ciprofloxacino; CRO, ceftriaxona; FEP, cefepima;
FOX, cefoxitina e IPM, imipenem.
Com exceção do imipenem, alto
a grau de resistência aos
os β-lactâmicos
β
pode
ser observado entre as amostras de K. pneumoniae.. Ceftazidima (CIM50, 32 µg/mL)
e cefepima (CIM50, 32 µg/mL)
µg/ ) exibiram a mesma atividade in vitro contra as
amostras de K. pneumoniae,
pneumoniae porém, a taxa de resistência à ceftazidima foi superior
(66,2%) aquela apresentada pela cefepima (57,9%). Ceftazidima (CIM50, 32 µg/mL)
foi 8 vezes mais potente in vitro que a ceftriaxona (CIM50, 256 µg/mL)
µg/
frente a esses
isolados. O antimicrobiano mais potente para esses isolados foi o imipenem (CIM
(
50,
≤0,5).
51
Resultados
A resistência à cefoxitina foi maior entre os isolados de K. pneumoniae
(23,1%), seguido por P. mirabilis (5,6%). Os isolados de P. mirabilis apresentaram a
menor taxa de sensibilidade para ciprofloxacino (27,8%).
Entre os isolados de E. coli pode-se observar uma alta sensibilidade aos βlactâmicos: aztreonam (87,8%), ceftazidima (100%), ceftriaxona (85,4%), cefepima
(92,7%) e cefoxitina (95,1%) e a ciprofloxacino (82,9%). Na Tabela 7 podemos
observar a menor concentração de cada antimicrobiano que inibiu o crescimento de
50% e 90% das amostras separadas por espécie (CIM50 e CIM90), respectivamente e
a taxa de sensibilidade.
Tabela 7. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras estudadas
dividido por espécie.
K. pneumoniae
(n=65)
MIC(ug/mL)
% Sensibilidade
MIC50
MIC90
Aztreonam
64
256
32,3
Ceftazidima
32
64
32,3
Ciprofloxacino
16
>32
33,8
Ceftriaxona
256
>512
35,4
Cefepima
32
64
36,9
Cefoxitina
8
32
66,2
Imipenem
≤0,5
≤0,5
98,5
P. mirabilis
(n=18)
MIC(ug/mL)
% Sensibilidade
MIC50
MIC90
Aztreonam
≤1
8
94,4
Ceftazidima
≤1
8
100,0
Ciprofloxacino
4
16
27,8
Ceftriaxona
32
512
38,9
Cefepima
32
128
38,9
Cefoxitina
2
8
94,4
Imipenem
≤0,5
1
100,0
52
Resultados
E. coli
(n=41)
MIC(ug/mL)
% Sensibilidade
MIC50
MIC90
Aztreonam
≤1
16
87,8
Ceftazidima
≤1
2
100,0
≤0,12
32
82,9
Ceftriaxona
≤1
32
85,4
Cefepima
≤1
4
92,7
Cefoxitina
4
8
95,1
Imipenem
≤0,5
≤0,5
100,0
Ciprofloxacino
Salmonella spp.
(n=4)
MIC(ug/mL)
% Sensibilidade
MIC50
MIC90
Aztreonam
≤1
≤1
100,0
Ceftazidima
≤1
≤1
100,0
≤0,12
≤0,12
100,0
Ceftriaxona
≤1
≤1
100,0
Cefepima
≤1
≤1
100,0
Cefoxitina
2
2
100,0
Imipenem
≤0,5
≤0,5
100,0
Ciprofloxacino
K. oxytoca
(n=5)
MIC(ug/mL)
% Sensibilidade
MIC50
MIC90
Aztreonam
≤1
128
80,0
Ceftazidima
≤1
32
80,0
≤0,12
32
80,0
Ceftriaxona
≤1
>512
80,0
Cefepima
≤1
128
80,0
Cefoxitina
2
32
80,0
Imipenem
≤0,5
≤0,5
100,0
Ciprofloxacino
5.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβ
βL
5.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação
Das 133 amostras estudadas 76 (57,1%) foram triadas como possíveis
produtoras de ESβL pela recomendação do CLSI e 59 (44,4%) foram confirmadas
53
Resultados
como produtoras de ESβL pela metodologia de disco aproximação. Cinco isolados
de K. pneumoniae e onze de E. coli apresentaram CIM ≥2 para aztreonam e/ou
ceftazidima e/ou ceftriaxona, mas não foram confirmadas fenotipicamente como
c
produtoras de ESβL. Apenas um isolado de P. mirabilis apresentou CIM ≥2 para
ceftazidima e/ou ceftriaxona,
ceftriaxon como preconiza o CLSI, mas não foi confirmado como
produtor de ESβL (Figura 8).
8
aproximação para detecção de ESβL.
ES
A) P.
Figura 8. Detecção fenotípica por disco aproximação
mirabilis A24.763, B) K. oxytoca A23.122, C) E. coli A25.395
25.395 e D)
D K. pneumoniae
A23.761.
Nenhuma amostra de Salmonella spp. foi identificada como produtora de
ESβL. O número de amostras classificadas fenotipicamente como produtoras de
ESβL, de acordo com a espécie bacteriana está demonstrada na Tabela 8.
54
Resultados
Tabela 8. Distribuição dos isolados fenotipicamente detectados como produtores de
ESβL de acordo com a espécie bacteriana.
Espécie
(n° de amostras)
N (%) de amostras com
fenótipo ESβL
K. pneumoniae (65)
43 (66,2)
K. oxytoca (5)
1 (20)
E. coli (41)
4 (9,8)
P. mirabilis (18)
11 (61,1)
Como esperado, os substratos β-lactâmicos preferenciais variaram de acordo
com a espécie bacteriana. Houve também variação do substrato entre amostras
pertencentes à mesma espécie bacteriana. Dos 11 isolados de P. mirabilis, apenas
um isolado apresentou um perfil de substrato diferente. Os isolados de E. coli
apresentaram dois perfis distintos de substrato preferencial.
43,1% das amostras de K. pneumoniae apresentaram os quatro β-lactâmicos
como substrato preferencial. Os resultados estão no Quadro 1.
55
Resultados
Quadro 1. Substrato preferencial de cada espécie.
Substrato preferencial
Aztreonam/ Cefepima/Ceftazidima/Ceftriaxona
Aztreonam/ Cefepima/Ceftazidima
Aztreonam/Cefepima/Ceftriaxona
Aztreonam/Cefepima
Cefepima/Ceftazidima
Cefepima/Ceftriaxona
Cefepima
Número de isolados
3 E. coli
28 K. pneumoniae
1 K. oxytoca
3 K. pneumoniae
1 E. coli
3 K. pneumoniae
1 P. mirabilis
7 K. pneumoniae
1 K. pneumoniae
10 P. mirabilis
1 K. pneumoniae
5.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC
5.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado
Das 133 amostras estudadas, 119 (89,5%) foram detectadas fenotipicamente
como não produtoras de pAmpC. Seis amostras de K. pneumoniae foram detectadas
fenotipicamente como possíveis produtoras de pAmpC. Resultados duvidosos foram
observados em oito amostras, sendo duas amostras de P. mirabilis e seis de K.
pneumoniae (Figura 9).
56
Resultados
Figura 9. Teste tri-dimensional.
dimensional. A) K. oxytoca A23.313, B) E. coli transconjugante
200 blaFOX-5, C) K. pneumoniae A24.155, D) P. mirabilis A24.763..
dimensional apresentou uma boa sensibilidade (100%) e
O teste tri-dimensional
especificidade (96%). Quando analisadas somente as amostras resistentes a
cefoxitina houve uma queda significativa na especificidade (75%).
.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado
5.4.2
Dentre as 133 amostras estudadas, 104 (78,2%) apresentaram resultado
negativo. Dezenove amostras foram detectadas fenotipicamente como possíveis
produtoras de pAmpC,, sendo 15 eram K. pneumoniae e 4 E. coli.
coli Dez isolados
apresentaram resultados duvidosos (Figura 10).
57
Resultados
Figura 10. Teste de Hodge. A)
A E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1, B) E. coli
transconjugante 200 blaFOX-5, C) E. coli transconjugante C600 R96D blaMIR-1, D)
Morganela morganii blaDHA-1,
DHA E) K. pneumoniae A24.155, F) K. pneumoniae A24.396,
G) K. oxytoca A25.506,, H) E. coli A23.258.
Os valores de sensibilidade e especificidade para o teste de Hodge
modificado foram 100%
% e 85%, respectivamente.. Quando analisadas somente as
amostras resistentes a cefoxitina a sensibilidade do teste se manteve em 100%;
porém, houve uma queda significativa na especificidade do teste (40%).
Uma grande discrepância entre os resultados dos testes fenotípicos para
detecção de pAmpC
AmpC foi observada entre as amostras estudadas. Apenas uma
amostra de P. mirabilis e 8 de K. pneumoniae apresentaram resultados
concordantes entre os dois testes fenotípicos
fenotípicos empregados para a detecção de
pAmpC.
58
Resultados
moleculares
multiplex
A identificação dos genes que codificam as pAmpCs foi realizada para todas
as amostras pela técnica de PCR multiplex. O gene blaCMY-2 foi detectado em
somente uma das amostras avaliadas, isolado A24.155 de K. pneumoniae (Figura
11). Este isolado foi detectado fenotipicamente como produtor de pAmpC por ambas
as metodologias empregadas neste estudo.
λ 2
3 4 5 6 7 8 9 10 11 λ
Figura 11. PCR multiplex para detecção de AmpC plasmidial. Linha 1, marcador de
peso molecular; Linha 2, amostra PM A13304; linha 3, amostra KPN A24155; linha
4, amostra EC A13306; linha 5, E. coli transconjugante C600 R96D blaMIR-1; linha 6,
E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1; linha 7, Hafnia Alvei A7.307 blaAAC; linha 8,
Morganela morganii blaDHA-1; linha 9, E. coli transconjugante 200 blaFOX-5; linha 10, E.
59
Resultados
coli transconjugante C600 blaMIR-1; linha 11, amostra A13305; linha 12, marcador de
peso molecular.
A presença do gene blaCMY-2 foi confirmada pela técnica de PCR
convencional, a qual originou um produto de amplificação de aproximadamente 1000
pb, quando foram utilizados os iniciadores CMY-2F, CMY-2Fint e CMY-2R (Figura
12).
λ
2 3
4
5
6
7
8
9
10
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose mostrando o produto de amplificação
para o gene blaCMY-2. Linha 1, marcador de peso molecular; Linha 1, amostra
A13304; linha 2, amostra A13305; linha 3, amostra A13306; linha 4, amostra
A13307; linha 5, amostra A24155; linha 6, amostra KPN A24155; linha 7, amostra
A13310; linha 8, amostra A13310; linha 9, E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1;
linha 10, controle negativo da reação.
60
Resultados
5.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados
O produto de amplificação do gene blaCMY-2 da amostra K. pneumoniae
A24.155 foi utilizado para seqüenciamento.
A seqüência de aminoácidos, obtido a partir do produto de reação de
amplificação, do gene cmy-2 demonstrou uma homologia de 99% com a seqüência
descrita para CMY-2 por Bauerfeind e colaboradores (18), exceto pela deleção da
base timina na posição 1062.
5.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC
Após sucessivas tentativas de transferência do gene de resistência por
conjugação, utilizando-se como doadora a amostra de K. pneumoniae produtora da
pAmpC CMY-2 (A24.155) e como receptora a amostra de E. coli K12, nenhuma
colônia transconjugante foi obtida.
5.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC
A amostra de K. pneumoniae (A24.155) foi submetida à extração do DNA
cromossomal e plasmidial. Nessa etapa do estudo foi observado que houve a perda
do plasmídeo que carregava o gene blaCMY-2 pela amostra bacteriana.
61
Discussão
6 DISCUSSÃO
Os membros da família Enterobacteriaceae são importantes causas de
infecções do trato urinário (ITUs), da corrente sanguínea, pneumonias e infecções
intra-abdominais. Dos membros dessa família, E. coli é freqüentemente isolada
em ITUs, enquanto Klebsiella spp. e Enterobacter spp. são importantes agentes
etiológicos de pneumonias. Além disso, microrganismos como Salmonella spp. estão
relacionados com gastroenterites e, em alguns pacientes, com infecção invasiva
(146).
O desenvolvimento das cefalosporinas de amplo espectro, no início da
década de 80, foi considerado uma grande adição ao arsenal terapêutico na luta
contra os organismos produtores de β-lactamases. Porém, o aumento da
prevalência das infecções causadas por enterobactérias, bem como nas taxas de
resistência aos antimicrobianos, comprometeu gravemente a eficácia desses
antibióticos.
No presente estudo, altas taxas de resistência aos agentes antimicrobianos
avaliados foram detectadas entre as amostras clínicas de K. pneumoniae, isoladas
no complexo do Hospital São Paulo. Esses achados reforçam a dificuldade para a
seleção da terapia antimicrobiana adequada para o tratamento dessas infecções.
De acordo com o relatório do National Nosocomial Infections Surveillance
(NNIS), no ano de 2003, 20,6% de todos os isolados de K. pneumoniae de pacientes
em unidades de terapia intensiva (UTIs) nos Estados Unidos foram resistentes às
cefalosporinas de terceira geração (1). Isso representou um aumento de 47% em
62
Discussão
comparação às taxas de resistência no período de 1998 a 2002. Nesse mesmo
estudo, a resistência às cefalosporinas de terceira geração foi observada em 5,8%
dos isolados de E. coli de pacientes em UTI nos Estados Unidos. Infelizmente, não
existem relatos atuais dessas taxas no sistema National Healthcare Safety Network
(56) (NHSN - nova denominação do NNIS), dos hospitais americanos participantes
dessa rede.
Um estudo realizado pelo Programa de vigilância SENTRY, revelou que as
taxas de sensibilidade para os isolados de K. pneumoniae, E. coli e Proteus spp., no
Brasil e América Latina, no ano de 2001(162), foram maiores que as obtidas neste
estudo, com amostras de 2006. Esse fato, provavelmente, deve estar relacionado
com a disseminação de mecanismos de resistência em enterobactérias em nosso
meio, principalmente as ESβL.
Nossos resultados diferem daqueles obtidos nos Estados Unidos e Canadá,
no período de 1997-2002, onde elevadas taxas de sensibilidade à ceftazidima, à
cefepima e ao ciprofloxacino foram encontradas, entre isolados clínicos de K.
pneumoniae de infecção de corrente sanguínea. Entretanto, as taxas de
sensibilidade para os isolados de E. coli foram semelhantes para as três drogas
quando comparamos nossos resultados com os obtidos neste trabalho (25).
As taxas de sensibilidades em isolados de P. mirabilis no presente estudo
contrastam com as taxas observadas em Taiwan para ceftriaxona (95% versus
38,9%), cefepima (98% versus 38,9%) e ciprofloxacino (60% versus 27,8%) (88).
Esses dados podem indicar a disseminação de um clone produtor de ESβL nos
isolados de P. mirabilis do Hospital São Paulo.
63
Discussão
A taxa de resistência a cefoxitina no presente estudo foi de 23,1% entre
isolados de K. pneumoniae e 5,6% em isolados de P. mirabilis.
Nenhum dos
isolados de E. coli avaliados apresentou resistência a esta droga. Um estudo
realizado na Inglaterra e na Irlanda, entre 2001-2002, reportou que a taxa de
resistência à cefoxitina foi de 19,2% em isolados de K. pneumoniae, 9,9% em
isolados de E. coli e 0,7% em isolados de P. mirabilis (159).
Embora a maioria dos isolados de Salmonella spp. permaneçam sensíveis a
muitos antimicrobianos, incluindo a maioria dos β-lactâmicos, fluoroquinolonas e
aminoglicosídeos, recentemente, isolados de Salmonella spp. com fenótipo
sugestivo de produção de ESβL, de pAmpC e também resistentes as
fluoroquinolonas tem surgido no mundo (26;170). No presente estudo. os isolados
de Salmonella spp. apresentaram 100% de sensibilidade para todos os
antimicrobianos testados. Isso, provavelmente, indica que as amostras estudadas
foram isoladas de infecções invasivas, mas que haviam sido adquiridas na
comunidade.
Neste estudo também foi identificado altas taxas de resistência a
ciprofloxacino em isolados clínicos de Enterobacteriaceae. Estes achados podem
ser decorrentes da ampla utilização de quinolonas para o tratamento de infecções
comunitátias, como por exemplo, as ITUs. Este estudo não teve por objetivo avaliar
o modo de aquisição das infecções de corrente sanguínea.
Infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), causadas por bactérias
produtoras de ESβL, representam um sério problema em nosso meio e tem sido
relatada com maior freqüência em diversos países (112;116;171). Geralmente,
64
Discussão
essas infecções apresentam morbi-mortalidade elevada e freqüentemente atingem
pacientes com estado geral comprometido (32). A produção de enzimas do tipo
ESβLs constitui, até o momento, a maior causa de resistência aos β-lactâmicos em
enterobactérias (148).
O CLSI (45) recomenda que isolados de E. coli, K. pneumoniae e K. oxytoca
que apresentarem CIM ≥ 2 µg/mL para ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima ou
aztreonam e ≥ 8 µg/mL para cefpodoxima e isolados de P. mirabilis que
apresentarem CIM ≥ 2 µg/mL para cefpodoxima, ceftazidima ou cefotaxima sejam
considerados como possíveis produtoras de ESβL (45). Essa identificação não é
específica e, quando esse critério for utilizado, deve-se realizar testes confirmatórios
para a correta identificação de um isolado produtor de ESβL. Se for detectada a
produção de ESβL em isolados de Klebsiella spp., E. coli ou P. mirabilis, o CLSI
recomenda que o laboratório reporte resistência a todas as penicilinas,
cefalosporinas e aztreonam, independentemente do resultado do teste de
sensibilidade.
No presente estudo, 57,1% e 44,4% dos isolados foram classificados como
possíveis produtores de ESβL, de acordo com as recomendações do CLSI e pela
técnica de disco aproximação, respectivamente. Resultados similares foram
observados em um estudo realizado por Bell e colaboradores (22) na Ásia e
Pacífico, onde 3% e 3,1% dos isolados de E. coli e K. pneumoniae, respectivamente,
foram triados como possíveis produtores de ESβL pelas recomendações do CLSI,
mas não foram confirmadas por outras metodologias disponíveis.
Nogueira e colaboradores (132), em um estudo no sul do país, reportaram
65
Discussão
que 24% das enterobactérias estudadas eram produtoras de ESβL. Nesse estudo, a
maior freqüência do fenótipo ESβL foi encontrada entre amostras de K. pneumoniae
(57,4%), seguida por K. oxytoca (21,4%) e E. coli (7,2%). No presente estudo, a
prevalência de amostras fenotipicamente detectadas como produtoras de ESβL foi
superior àquela detectada por Nogueira e colaboradores, principalmente, entre as
amostras de P. mirabilis (61,6% versus 8%). Outro estudo realizado em nosso país
relatou a incidência de ESβL em isolados da comunidade, no período de 2000-2002.
A incidência de ESβL foi de 11,6% e 0,6%, em isolados de K. pneumoniae e E. coli,
respectivamente, provenientes de ITU (119).
Vários estudos demonstram que a prevalência de cepas produtoras de ESβL,
principalmente, em K. pneumoniae e E. coli, é muito mais alta na América Latina,
quando comparada a outras regiões do mundo (25;162).
Em um período de seis anos (1997-2002), amostras de Klebsiella spp.
exibindo o fenótipo ESβL foram isoladas em
42,7% das infecções de corrente
sangüínea na América Latina. Taxas inferiores a esta foram observadas entre
isolados coletados na Europa (21,7%) e América do Norte (5,8%) (25). Em outro
estudo, Winokur e colaboradores (183) reportaram que, no período de 1997-1999, a
prevalência do fenótipo ESβL entre amostras de K. pneumoniae era maior na
América Latina (45,4%), seguida pela região do Pacífico Ocidental (24,6%), Europa
(22,6%), Estados Unidos (7,6%) e Canadá (4,9%).
No presente estudo, a freqüência de isolados produtores de ESβL foi maior do
que o encontrado em isolados em Taiwan, onde a taxa foi de 26% e 13% em
isolados de K. pneumoniae e P. mirabilis, respectivamente. No entanto, entre os
66
Discussão
isolados de E. coli a freqüência em Taiwan foi maior (14%) (88).
As atuais orientações do CLSI para detecção de ESβL abrangem K. oxytoca,
que normalmente tem uma β-lactamase cromossômica da classe A, que foi
anteriormente designada de K1, mas que podem ser agrupadas em dois grupos
OXY-1 e OXY-2 (65) A maioria dos isolados de K. oxytoca produzem baixos níveis
dessa enzima cromossômica, conferindo resistência somente à ampicilina e às
carboxipenicilinas. No entanto, a produção da enzima K1 pode ser induzida na
presença de um β-lactâmico e sua hiperprodução leva à resistência à cefpodoxima,
à ceftriaxona e ao aztreonam. Além disso, essas enzimas são inibidas pelos
inibidores de β-lactamases. Esses fatos fazem com que essas bactérias sejam,
erroneamente, classificadas fenotipicamente como produtoras de ESβL. Moland e
colaboradores (124) recomendam que testes fenotípicos para a detecção de ESβL
em isolados produtores de enzimas do grupo OXY empreguem também ceftazidima,
já que, diferentemente das ESβLs, essa cefalosporina não seria hidrolisada por
enzimas K1.
Dos cinco isolados de K. oxytoca deste estudo, apenas um apresentou
resultado positivo na detecção fenotípica de ESβL. Esse isolado era resistente a
todas as cefalosporinas, inclusive ceftazidima, se tratando, provavelmente, de um
isolado de K. oxytoca verdadeiramente produtor de ESβL e não apenas a
hiperprodução da enzima K1.
Neste estudo, observamos ainda uma discreta variação nos resultados de
detecção fenotípica de ESBL, dependendo do substrato empregado no teste. Este
67
Discussão
achado é possivelmente decorrente de diferentes tipos de ESβL produzidas pelas
amostras bacterianas (32).
A porcentagem de amostras produtoras de ESβL é alta em muitos hospitais
brasileiros (162) e os carbapenens constituem a droga de escolha para o tratamento
destas infecções. No entanto, os relatos de amostras clínicas de enterobactérias
também resistentes a esses agentes são cada vez mais freqüentes (50;133). Por
outro lado, os resultados deste estudo nos permitiu visualizar que no Hospital São
Paulo, as taxas de resistência aos carbapenens ainda são baixas. Apenas um
isolado de K. pneumoniae apresentou redução da sensibilidade ao imipenem. Entre
os principais estão relacionados à resistência adquirida aos carbapenens nesse
microrganismo, estão incluídos a produção de carbapenemases e/ou a associação
de ESβL e/ou pAmpC aos mecanismos de impermeabilidade, como a perda de
porinas (10). Porém, esse isolado de K. pneumoniae teve resultado negativo para a
detecção fenotípica de ESβL, assim como apresentou resultado negativo para a
pesquisa de genes codificadores de MβBL. Portanto, outros experimentos devem ser
realizados para a elucidação do mecanismo de resistência ao imipenem nesta
amostra.
Em 1989, as primeiras pAmpCs, CMY-1 e MIR-1, foram detectadas em
isolados de K. pneumoniae resistentes à cefoxitina (16;142). Após esses relatos,
várias pAmpCs foram identificadas em diversas regiões do mundo (150).
As
pAmpCs se tornaram uma grande preocupação clínica, uma vez que conferem
resistência a todos os β-lactâmicos, exceto cefepima, cefpiroma e carbapenens.
Embora os carbapenens não estejam incluídos no espectro hidrolítico das pAmpC,
68
Discussão
muitos estudos tem demonstrado que a associação dessas enzimas a mecanismos
de impermeabilidade conferem resistência também a estes agentes (86).
Adicionalmente, uma vez que os genes que codificam tais enzimas estão inseridos
em elementos móveis, como, transposons e plasmídeos, sua disseminação pode ser
favorecida, inclusive para espécies não relacionadas. Sendo assim, a detecção de
isolados produtores de pAmpC é considerada crítica para estudos epidemiológicos e
controle de infecção hospitalar (149).
É difícil fazer a distinção entre aqueles isolados que produzem ESβLs e os
que produzem pAmpC, pelo teste de sensibilidade. A resistência à cefoxitina poderia
indicar a possibilidade da produção de pAmpC, mas, em E. coli, pode ocorrer
também, devido à hiperprodução da AmpC cromossomal ou alteração e/ou
diminuição na permeabilidade da membrana externa (115). Em K. pneumoniae, a
resistência à cefoxitina pode ser conseqüente à alteração e/ou diminuição na
permeabilidade da membrana externa (75).
A distinção entre estes dois tipos de mecanismos poderia interferir na seleção
da melhor opção terapêutica. Para infecções graves, causadas por ESβL, há contraindicação para o tratamento com o uso de cefalosporinas de amplo espectro,
enquanto que, a indicação do uso de cefepima no tratamento das infecções graves
causadas por pAmpC é controversa e necessita cautela. Apesar de a cefepima ser
um pobre indutor de AmpC e pouco hidrolisado pelas enzimas pAmpC (131), alguns
isolados podem ser verdadeiramente resistentes à cefepima (135).
Alguns testes fenotípicos estão disponíveis para ajudar a distinguir isolados
resistentes a cefoxitina não-produtores de pAmpC daqueles produtores. Entre os
69
Discussão
testes fenotípicos estão: o teste tri-dimensional (47), o método do ágar-cefoxitina
(129), o teste de Hodge modificado (192), o AmpC disk test (27), E-test® para AmpC
(59) e inibição pelo ácido borônico (167;188). No entanto, nenhum desses testes
apresenta boa sensibilidade e especificidade para serem considerados padrão-ouro
para a detecção de pAmpC. Além disso, são demasiado laboriosos para serem
empregados por laboratórios de microbiologia clínica de rotina.
Yong e colaboradores (192), em 2002, propuseram uma modificação do teste
de Hodge para a detecção de pAmpC. Nesse estudo, foram testados apenas
isolados produtores de CMY-1 e os resultados comparados com os obtidos pelo
teste tri-dimensional. A sensibilidade e especificidade do teste de Hodge foram
100% e 94,9%, respectivamente, quando considerada uma distorção ≥ 3
mm. Entretanto, pequenas distorções (≤ 3 mm para o teste de Hodge e ≤ 2 mm para
o teste tri-dimensional) foram notadas em 8 e 3 isolados resistentes à cefoxitina,
respectivamente, porém, esses não eram produtores de CMY-1. A capacidade de
detecção da produção de pAmpC foi semelhante entre os dois testes.
O teste tri-dimensional para a detecção de pAmpC, proposto por Coudron e
colaboradores (47), demonstrou ser um teste sensível, porém laborioso. Todas as 16
amostras produtoras de pAmpC foram corretamente detectadas pelo teste e apenas
um isolados apresentou resultado falso-positivo. Esse isolado era produtor de duas
ESβLs do tipo SHV.
Em um estudo realizado na Coréia, isolados de E. coli e K. pneumoniae
resistentes à cefoxitina foram avaliados pelo teste de Hodge modificado. O teste
detectou a produção de CMY-10 entre todos os isolados. No entanto, inicialmente,
70
Discussão
foram detectados apenas 25 dos 39 (64,1%) isolados produtores de CMY-2. Porém,
quando as amostras foram empurradas com uma lâmina de bisturi no ágar, foram
obtidos resultados positivos para 13 dos 14 isolados inicialmente negativos. Entre os
103 isolados produtores de DHA-1, apenas 59 (57,3%) foram detectados como
produtores de pAmpC pelo teste de Hodge modificado. Entre os isolados de E. coli
pode-se observar 25,9% de resultados falso-positivos, já entre os isolados de K.
pneumoniae essa taxa caiu para 3,8%. A sensibilidade e especificidade nesse
estudo foram de 71,5% e 81,3%, respectivamente (101).
A variação dos resultados nos diferentes trabalhos pode também estar
relacionada à sensibilidade do método, dependendo do tipo de pAmpC produzida
pelas bactérias estudadas e se amostras representativas de um mesmo clone
haviam sido testadas repetidas vezes.
Silva e colaboradores (166), em 2008, no Rio de Janeiro, avaliaram 71
isolados de enterobactérias pelos métodos de Hodge modificado, teste tridimensional e PCR multiplex. Apenas cinco isolados de E. coli foram identificados
fenotipicamente como produtores de AmpC, mas a presença de nenhum gene
codificador de pAmpC foi identificado nessas amostras, pela técnica de PCR
multiplex. No presente estudo, as amostras bacterianas foram submetidas a duas
metodologias diferentes para a detecção fenotípica da produção de pAmpC, o teste
de Hodge modificado e o teste tri-dimensional. A sensibilidade e especificidade dos
testes foram 100%/85% e 100%/96%, respectivamente. Porém, esses valores
podem ter sido influenciados pelo fato de somente uma amostra ser positiva na
coleção avaliada. Na prática, tanto o teste de Hodge modificado quanto o teste tri-
71
Discussão
dimensional são interpretados por análise visual, o que é subjetivo e depende da
experiência de quem os avalia. Não foi objetivo desse estudo avaliar a
especificidade e sensibilidade de métodos fenotípicos para a detecção da produção
de pAmpC, entretanto, quando somente as amostras resistentes à cefoxitina foram
avaliadas, a sensibilidade desses testes permaneceu a mesma (100%), porém,
houve redução significativa na especificidade dos mesmos. Na tentativa de reduzir a
subjetividade da leitura do teste, esses foram lidos por dois observadores
independentes e previamente à detecção molecular dos genes codificadores de
pAmpC.
Pode-se crer que a prevalência mundial de pAmpC é subestimada, em parte,
porque não existe nenhum método fenotípico com boa acurácia para identificação
destas amostras. O desenvolvimento de métodos de detecção fenotípica simples é
necessário para que os laboratórios clínicos possam detectar organismos produtores
dessas enzimas e a real importância clínica desse mecanismo. O fato de, um
método fenotípico padronizado para o rastreio e detecção deste tipo de resistência
não existir, faz da vigilância e caracterização desse mecanismo, um problema em
laboratórios.
Relatos de falhas terapêuticas tem sido reportadas com a utilização de
ceftriaxona e de ceftazidima para tratar infecções causadas por bactérias produtoras
de pAmpC, que se apresentavam como sensíveis in vitro a essas drogas
antimicrobianas (139). A correta identificação de microrganismos produtores de
pAmpC é necessária para uma opção terapêutica adequada. Muitos microrganismos
72
Discussão
produtores de pAmpC são também resistentes aos aminoglicosídeos, ao trimetoprim,
à tetraciclina e, especialmente, às fluorquinolonas.
A PCR multiplex descrita por Pérez-Pérez e Hanson em 2002 (149) é uma
técnica bastante útil para a detecção dos genes responsáveis pela codificação das
pAmpC, conhecidas até o momento. Entretanto, o seu elevado custo e a
necessidade de técnicos especializados limita a utilização dessa técnica na rotina de
um laboratório de microbiologia. Além disso, ela só pode ser empregada para a
detecção de genes já conhecidos, não podendo ser empregada, por exemplo, na
detecção da enzima CFE, que foi descrita posteriormente à padronização dessa
metodologia.
A pAmpC CMY-2, foi primeiramente reportada na Grécia em 1996, em um
isolado de K. pneumoniae (18). CMY-2 é uma das pAmpC mais prevalentes e mais
amplamente distribuídas mundialmente, tendo sido encontrada em vários países.
No entanto, na América Latina, CMY-2 foi descrita pela primeira vez em 2007,
em isolados de S. flexneri, na Argentina (155). Ainda na Argentina, em 2008,
Rapoport e colaboradores (156) descreveram essa mesma enzima em isolados de
K. pneumoniae. No Brasil, o único relato de isolados produtores de CMY-2 foi feito
em 2008 por Pavez e colaboradores (147). Os autores descreveram uma cepa E.
coli resistente a carbapenem, devido à produção de CMY-2 associada à perda de
porina.
Apesar de existirem vários relatos de surtos causados por organismos
produtores de pAmpC e um número crescente de descrições dessas enzimas, a
descrição da epidemiologia e implicações clínicas associadas a essas infecções não
73
Discussão
é totalmente conhecida (139), principalmente no Brasil onde existem poucos relatos
desse mecanismo de resistência. No presente estudo, foi detectado apenas um
isolado produtor de pAmpC, no entanto, a vigilância desse mecanismo deve ser
realizada, devido ao crescente relato dessas enzimas em todo o mundo.
Infelizmente, não foi possível estudar a mobilização do gene blaCMY-2, pois a
cepa que carregava esse gene perdeu o plasmídeo durante a realização do estudo.
A resistência bacteriana aos antimicrobianos é atualmente um dos mais
relevantes problemas em relação às doenças infecciosas. O principal impacto clínico
das bactérias resistentes está relacionado à dificuldade da escolha de tratamentos
empíricos que, quando inadequado, está associado a uma maior mortalidade,
especialmente em infecções graves.
Enquanto aguardamos
o desenvolvimento de i) novos β-lactâmicos
resistentes à hidrólise das enzimas conhecidas e ii) a descoberta de uma "segunda
geração" de inibidores de β-lactamases, o controle de infecção se mostra uma
ferramenta indispensável para o desenvolvimento de protocolos e estratégias que
reduzam o crescimento da resistência bacteriana, tais como a racionalização do uso
e o rodízio de antimicrobianos, e o controle da disseminação horizontal (pacientepaciente) de bactérias resistentes.
Essas medidas são fundamentais para qualquer instituição. Para isso, fazemse necessários mais estudos para elucidar quais os mecanismos estão envolvidos
na resistência bacteriana, bem como, na diminuição da sensibilidade aos
antimicrobianos. Devido ao grande número de variáveis envolvidas é importante que
as medidas de controle de infecção sejam baseadas em estudos locais.
74
Conclusões
7 CONCLUSÕES
• A freqüência de enterobactérias produtoras de pAmpC isoladas de
pacientes com infecção de corrente sanguínea no HSP durante o primeiro semestre
de 2006 foi baixa (0,75%), sendo identificado somente o gene blaCMY-2 em uma
amostra de K. pneumoniae;
• Altas taxas de resistência aos agentes antimicrobianos avaliados foram
detectadas entre as amostras clínicas de K. pneumoniae, demonstrando que os
carbepenens constituem a melhor opção terapêutica para esses isolados;
• Uma amostra de K. pneumoniae com sensibilidade reduzida à imipenem
(CIM 8 µg/mL) foi detectada. Este isolado não era produtor de pAmpC, ESβL ou
MβL;
• A produção de ESβL pareceu ser o mecanismo de resistência as
cefalosporinas de amplo espectro mais freqüente entre as amostras estudadas (44,4
%) no HSP, principalmente entre os isolados de K. pneumoniae (66,2%) e P.
mirabilis (61,1%);
• Os testes fenotípicos para a detecção da produção de pAmpC foram
capazes de identificar a produção de CMY-2 pela amostra de K. pneumoniae,
entretanto, ambas as metodologias apresentaram resultados falso-positivos.
75
Conclusões
• O desenvolvimento de métodos de detecção fenotípica simples e com boa
acurácia é necessário para que haja uma vigilância desse mecanismo de resistência
devido ao crescente relato dessas enzimas em todo o mundo. Infelizmente, não foi
possível confirmar a localização plasmidial do gene blaCMY-2 porque houve a perda
do plasmídeo durante a realização do estudo.
76
Anexos
8 ANEXOS
77
Anexos
Anexo 1. Resultados da determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
aos antimicrobianos testados das 133 amostras de enterobactérias.
Amostras
Espécie
ATM
CAZ
FEP
FOX
CIP
CRO
IPM
23.944
Salmonella spp.
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.106
Salmonella spp.
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.908
Salmonella spp.
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
25.707
Salmonella spp.
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.110
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.112
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.237
P. mirabilis
≤1
≤1
8
≤1
8
≤1
≤0,5
23.427
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
23.554
P. mirabilis
≤1
2
32
2
2
256
≤0,5
23.575
P. mirabilis
2
4
128
2
8
32
≤0,5
23.841
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
2
4
4
≤0,5
24.086
P. mirabilis
8
8
64
8
>32
64
1
24.177
P. mirabilis
≤1
2
128
2
8
32
≤0,5
24.285
P. mirabilis
≤1
≤1
32
2
8
16
≤0,5
24.763
P. mirabilis
≤1
≤1
128
2
8
32
≤0,5
24.765
P. mirabilis
≤1
2
32
4
2
512
1
24.885
P. mirabilis
≤1
2
128
2
16
128
1
25.007
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
25.064
P. mirabilis
≤1
≤1
32
8
4
512
1
25.310
P. mirabilis
≤1
≤1
16
2
2
512
1
25.330
P. mirabilis
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
1
25.629
P. mirabilis
16
8
128
>256
4
512
1
23.122
K. oxytoca
128
32
128
32
32
>512
≤0,5
23.313
K. oxytoca
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.641
K. oxytoca
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
25.063
K. oxytoca
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
25.506
K. oxytoca
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
23.116
E. coli
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
78
Anexos
Anexo 1. Continuação.
Amostras
Espécie
ATM
CAZ
FEP
FOX
CIP
CRO
IPM
23.183
E. coli
16
4
≤1
16
0,25
2
≤0,5
23.258
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.298
E. coli
≤1
≤1
≤1
8
>32
≤1
≤0,5
23.320
E. coli
8
2
16
4
0,5
32
≤0,5
23.321
E. coli
8
2
4
4
≤0,12
32
≤0,5
23.407
E. coli
2
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.409
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.410
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
32
≤1
≤0,5
23.411
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
32
≤1
≤0,5
23.618
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.619
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.620
E. coli
8
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.682
E. coli
≤1
≤1
≤1
8
≤0,12
≤1
≤0,5
23.683
E. coli
8
2
8
4
≤0,12
64
≤0,5
23.726
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
32
≤1
≤0,5
23.727
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.760
E. coli
2
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.803
E. coli
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
23.879
E. coli
4
≤1
≤1
4
≤0,12
32
≤0,5
23.915
E. coli
4
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
24.405
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.463
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
24.536
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
24.642
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.644
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
0,25
≤1
≤0,5
24.773
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.864
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
24.868
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.915
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
25.071
E. coli
≤1
2
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
25.213
E. coli
32
8
32
16
>32
128
≤0,5
79
Anexos
Amostras
Espécie
ATM
CAZ
FEP
FOX
CIP
CRO
IPM
25.214
E. coli
16
≤1
2
4
4
≤1
≤0,5
25.376
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
25.395
E. coli
64
8
128
8
32
256
≤0,5
25.417
E. coli
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
2
≤0,5
25.658
E. coli
16
4
≤1
4
1
≤1
≤0,5
25.661
E. coli
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
2
≤0,5
25.709
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
25.753
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
25.811
E. coli
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.035
K. pneumoniae
256
128
128
8
>32
>512
≤0,5
23.117
K. pneumoniae
128
64
32
8
>32
256
≤0,5
23.177
K. pneumoniae
256
256
16
8
>32
256
≤0,5
23.194
K. pneumoniae
128
64
64
16
>32
>512
≤0,5
23.196
K. pneumoniae
64
32
64
8
>32
512
≤0,5
23.259
K. pneumoniae
2
≤1
≤1
8
≤0,12
≤1
≤0,5
23.266
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.285
K. pneumoniae
256
32
64
8
32
>512
≤0,5
23.288
K. pneumoniae
32
16
64
4
32
>512
≤0,5
23.289
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
23.309
K. pneumoniae
128
256
2
8
≤0,12
8
≤0,5
23.311
K. pneumoniae
128
32
64
32
>32
>512
≤0,5
23.312
K. pneumoniae
64
32
64
32
>32
>512
≤0,5
23.319
K. pneumoniae
64
32
64
32
>32
>512
≤0,5
23.333
K. pneumoniae
128
64
64
32
>32
>512
≤0,5
23.383
K. pneumoniae
128
16
64
16
16
>512
≤0,5
23.418
K. pneumoniae
128
16
64
8
>32
>512
≤0,5
23.420
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
8
≤0,12
≤1
≤0,5
23.476
K. pneumoniae
64
32
64
8
32
512
≤0,5
23.494
K. pneumoniae
64
16
32
8
32
256
≤0,5
23.571
K. pneumoniae
≤1
≤1
8
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.573
K. pneumoniae
64
16
32
32
≤0,12
>512
≤0,5
80
Anexos
Amostras
Espécie
ATM
CAZ
FEP
FOX
CIP
CRO
IPM
23.626
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.628
K. pneumoniae
64
32
64
32
32
>512
≤0,5
23.666
K. pneumoniae
64
32
64
32
>32
>512
≤0,5
23.729
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.761
K. pneumoniae
128
32
32
16
>32
512
≤0,5
23.796
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
≤1
≤0,12
≤1
≤0,5
23.839
K. pneumoniae
256
64
128
16
32
>512
≤0,5
23.872
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
23.901
K. pneumoniae
≤1
≤1
4
4
≤0,12
≤1
≤0,5
23.928
K. pneumoniae
128
128
32
4
≤0,12
8
≤0,5
23.930
K. pneumoniae
16
64
≤1
32
≤0,12
64
≤0,5
24.021
K. pneumoniae
64
64
32
≤1
≤0,12
>512
≤0,5
24.085
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.152
K. pneumoniae
256
64
256
8
32
>512
2
24.155
K. pneumoniae
>256
>256
32
128
4
>512
≤0,5
24.286
K. pneumoniae
128
64
≤1
4
≤0,12
8
≤0,5
24.287
K. pneumoniae
64
32
64
8
32
512
≤0,5
24.333
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
24.396
K. pneumoniae
64
64
256
32
16
>512
4
24.397
K. pneumoniae
64
16
32
8
32
>512
≤0,5
24.398
K. pneumoniae
64
32
32
64
16
256
≤0,5
24.485
K. pneumoniae
64
32
32
8
16
256
≤0,5
24.528
K. pneumoniae
128
16
64
64
>32
512
≤0,5
24.529
K. pneumoniae
128
64
64
8
16
>512
≤0,5
24.547
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
64
>32
≤1
≤0,5
24.647
K. pneumoniae
128
32
64
8
16
512
≤0,5
24.768
K. pneumoniae
256
64
>256
64
>32
>512
8
24.770
K. pneumoniae
128
32
64
8
16
>512
≤0,5
25.044
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
81
Anexos
Amostras
Espécie
ATM
CAZ
FEP
FOX
CIP
CRO
IPM
25.047
K. pneumoniae
≤1
16
32
32
32
256
≤0,5
25.060
K. pneumoniae
256
256
16
4
8
64
≤0,5
25.215
K. pneumoniae
64
32
32
8
16
256
≤0,5
25.337
K. pneumoniae
≤1
4
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
25.338
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
8
0,25
≤1
≤0,5
25.393
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
4
>32
≤1
≤0,5
25.411
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
>32
≤1
≤0,5
25.425
K. pneumoniae
16
4
8
4
4
32
≤0,5
25.442
K. pneumoniae
≤1
≤1
≤1
2
≤0,12
≤1
≤0,5
25.505
K. pneumoniae
≤1
4
8
2
>32
4
≤0,5
25.538
K. pneumoniae
256
64
64
16
4
512
≤0,5
25.606
K. pneumoniae
64
16
32
16
32
512
≤0,5
25.633
K. pneumoniae
128
64
32
4
>32
512
≤0,5
25.650
K. pneumoniae
128
16
32
16
32
256
≤0,5
ATM, aztreonam; CAZ, ceftazidima; FEP, cefepima; FOX, cefoxitina; CIP, ciprofloxacino; CRO,
ceftriaxona; e IPM, imipenem.
ESβL (substrato preferencial)
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
Salmonella spp.
Salmonella spp.
Salmonella spp.
Salmonella spp.
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
Amostras
23.944
24.106
24.908
25.707
23.110
23.112
23.237
23.427
23.554
23.575
23.841
24.086
24.177
24.285
24.763
24.765
24.885
25.007
25.064
negativo
negativo
negativo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
duvidoso
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Tri-dimensional
Anexo 2. Resultados dos testes fenotípicos para detecção de ESβL e pAmpC das 133 amostras de enterobactérias.
Anexos
82
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
P. mirabilis
P. mirabilis
P. mirabilis
K. oxytoca
K. oxytoca
K. oxytoca
K. oxytoca
K. oxytoca
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Amostras
25.310
25.330
25.629
23.122
23.313
24.641
25.063
25.506
23.116
23.183
23.258
23.298
23.320
23.321
23.407
23.409
23.410
23.411
23.618
23.619
Anexos
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Tri-dimensional
83
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
Amostras
23.620
23.682
23.683
23.726
23.727
23.760
23.803
23.879
23.915
24.405
24.463
24.536
24.642
24.644
24.773
24.864
24.868
24.915
25.071
25.213
Anexos
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Tri-dimensional
84
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Cefepima/Ceftazidima
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
Amostras
25.214
25.376
25.395
25.417
25.658
25.661
25.709
25.753
25.811
23.035
23.117
23.177
23.194
23.196
23.259
23.266
23.285
23.288
23.289
23.309
Anexos
negativo
negativo
positivo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
duvidoso
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
Hodge modificado
negativo
negativo
duvidoso
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Tri-dimensional
85
Aztreonam/Cefepima
Aztreonam/Cefepima
Negativo
Negativo
Negativo
Aztreonam/Cefepima
Negativo
Negativo
Aztreonam/Cefepima
Negativo
Negativo
Espécie
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
Amostras
23.311
23.312
23.319
23.333
23.383
23.418
23.420
23.476
23.494
23.571
23.573
23.626
23.628
23.666
23.729
23.761
23.796
23.839
23.872
23.901
Anexos
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
duvidoso
negativo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
duvidoso
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
duvidoso
duvidoso
duvidoso
negativo
negativo
positivo
positivo
Tri-dimensional
86
Negativo
Negativo
Negativo
Aztreonam/Cefepima
Cefepima
Negativo
Aztreonam/Cefepima
Aztreonam/Cefepima
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
Amostras
23.928
23.930
24.021
24.085
24.152
24.155
24.286
24.287
24.333
24.396
24.397
24.398
24.485
24.528
24.529
24.547
24.647
24.768
24.770
25.044
Anexos
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
duvidoso
negativo
negativo
positivo
negativo
duvidoso
negativo
positivo
negativo
negativo
positivo
positivo
negativo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
Tri-dimensional
87
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Espécie
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
K. pneumoniae
Amostras
25.047
25.060
25.215
25.337
25.338
25.393
25.411
25.425
25.442
25.505
25.538
25.606
25.633
25.650
Anexos
positivo
negativo
positivo
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
positivo
Hodge modificado
negativo
negativo
negativo
positivo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Tri-dimensional
88
89
Anexos
Anexo 3. Alinhamento genético do gene blaCMY-2 (18) e o isolado de K. pneumoniae
24.155.
G A A A A A A A C C T T G G C A T C G T G A T G C X X X X X
Majority
------------------+-------------------+-------------------+1060
1070
1080
------------------+-------------------+-------------------+1051
G A A A A A A A C C T T G G C A T C G T G A T G C T G G C A
CMY-2
1011
G A A A A A A A C C T - G G C A T C G T G A T G C
KPN 24.155
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Majority
------------------+-------------------+-------------------+1090
1100
1110
------------------+-------------------+-------------------+1081
A A C A A A A G C T A T C C T A A C C C T G T C C G T G T C
1034
CMY-2
KPN 24.155
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Majority
------------------+-------------------+-------------------+1120
1130
1140
------------------+-------------------+-------------------+1111
G A G G C G G C C T G G C G C A T T C T T G A A A A G C T G
1034
CMY-2
KPN 24.155
X X X X X X
Majority
------------
-----------1141
1034
C A A T A A
CMY-2
KPN 24.155
90
Referências
9 REFERÊNCIAS
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Abstract
ABSTRACT
The
broad-spectrum
cephalosporins
are
the
main
therapeutic
options
to
Enterobacteriaceae infections and the resistance to these agents has been
associated to ESβL production. However, plasmid-mediated AmpC β-lactamases
(pAmpC) have been associated with this resistance phenotype. The aim of this study
was to determine the occurrence of pAmpC among clinical isolates recovered from
bloodstream from patients hospitalized at a Brazilian teaching hospital, collected
between January and July 2006. A total of 133 non-repetitive Enterobacteriaceae per
patients (65 K. pneumoniae, 41 E. coli, 18 P. mirabilis, 05 K. oxytoca and 04
Salmonella spp.) were studied. The antimicrobial susceptibility profile was
determined by CLSI agar dilution method. ESβL phenotype was detected by doubledisk diffusion method while pAmpC production was evaluated by two phenotypic
methods: modified three-dimensional and modified Hodge tests and the presence of
pAmpC genes was confirmed by PCR and sequencing. Among tested antimicrobial,
imipenem showed the highest susceptibility rate (99.2%), followed by cefoxitin
(80.5%). K. pneumoniae presented high resistance to β-lactams. P. mirabilis isolates
showed the lower susceptibility rate to ciprofloxacin (27.8%). Fifty-nine (44.4%) of
studied isolates were phenotypically classified as ESβL producers. Modified threedimensional and Hodge methods classified 06 and 19 Enterobacteriaceae strains as
pAmpC producers, respectively. Discordant results were observed between
phenotypic pAmpC detection methods. Of those, a single K. pneumoniae isolate was
confirmed as CMY-2 producer.
Apêndice
APÊNDICE

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