Apresentação neurotransmissores 1 2016
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Apresentação neurotransmissores 1 2016
Prof. Martin Metzger Sala 240, ICB 1 Tel. 30918044 [email protected] Neurotransmissores e seus receptores: Introdução 1. Definição e classificação dos neurotransmissores 2. Métodos para demonstrar e quantificar neurotransmissores Definição dos neurotransmissores: Os neurotransmissores são substâncias químicas produzidas pelos neurônios e são usadas para transmitir informação entre eles. Estes são libertados por um neurônio pré-sináptico para a fenda sináptica, no espaço extra-celular e causam uma alteração na membrana póssináptica. Esta célula receptora, pode ser um neurônio com receptores especificas para os neutransmissores, sofrendo uma alteração de potencial, porém, também pode ser uma célula muscular ou uma célula glandular. Define-se por neurotransmissão a conversão de um evento elétrico num evento químico e posteriormente noutro evento elétrico. Sinapses: A sinapse é um local por onde a informação é transmitida de uma célula a outra. A informação pode ser transmitida por mecanismo elétrico (sinapses elétricas) ou químico (sinapses químicas). Historia 1873 Camilo Golgi (Itália): Técnica Golgi para impregnar neurônios. de 1890 William James (Estados Unidos): Introduziu o termo plasticidade 1893 Eugenio Tanzi (Itália): Hipertrofia de elementos neurais consequente de aprendizagem. 1894 Ramón y Cajal (Espanha): Doutrina neural, dinamismo, plasticidade, exercícios neurais: Mudanças atividade-dependentes de conexões neurais. 1897 Charles Scott Sherrington Britânia: Sinapse como a entre dois neurônios. 1948 Jerzy Konorski (Polônia): de novas sinapses (Grãjunção Formação Sinapse elétrica Sinapse química Sinapse elétrica: Sinapses Químicas: Nas sinapses químicas, a informação é transmitida, através da fenda sináptica, por meio de neurotransmissor, uma substância que é liberada pela terminação pré-sináptica e que se fixar a receptores na terminação pós-sinaptica. A seguinte seqüência de etapas ocorre nas sinapses químicas. Um potencial de ação, na célula pré-sináptica faz com que canais de Ca2+ se abram. Ocorre influxo de Ca2+ para a terminação pré-sináptica, provocando a liberação do neurotransmissor por excocitose. O neurotransmissor se difunde pela fenda sínaptica, fixa-se a receptores na membrana pós-sínaptica, produzindo variação do potencial de membrana na célula pós-sináptica. Neurotransmissores: A transmissão da informação, nas sinapses químicas; envolve a liberação de um neurotransmissor pela célula pré-sináptica, difusão através da fenda sináptica e fixação do neurotransmissor a receptores específicos na membrana pós-sináptica para produzir variação do potencial de membrana. Os seguintes critérios são usados para designar, formalmente, uma substância como neurotransmissor: 1. A substância deve ser sintetizada na célula pré-sináptica 2. A substância deve ser liberada pela célula pré-sináptica, quando estimulada 3. Se a substância for aplicada exogenamente à membrana pós-sináptica, na concentração fisiológica apropriada, a resposta da célula pós-sináptica deve ser semelhante à resposta in vivo 4. Existe um mecanismo especifico para remover a substância do sitio da ação (a fenda sináptica) Otto Loewi (1873-1961) Ganhador do prêmio Nobel em 1936 junto com Henry Dale para suas descobertas sobre a neurotransmissão química em particular a acetilcolina. 1921: Otto Loewi, em Viena: Terminais nervosos simpáticos ou parassimpáticos podem conter substâncias químicas que poder ser liberadas pela estimulação e que por sua vez, poderiam também transmitir impulsos nervosos para seus respectivos órgãos efetores Reciclagem do glutamato pelas células gliais: Classificação dos neurotransmissores: Aminas Biogênicas: Dopamina Adrenalina Noradrenalina Serotonina Histamina Acetilcholina (Ach) Agentes gasosas: Óxido Nítrico Monóxido de carbono Aminoácidos: Glutamato + Aspartato Ácido y-aminobutírico (GABA) – Glicina Neuropeptídeos: Substância P Vasopressina Peptídeo Inibidor Vasoactivo VIP Endorfinas Dinorfina Ocitocina Neurotensina Métodos para demonstrar e quantificar neurotransmissores e seus receptores em tecidos e “in vivo”. 1. Imunohistoquímica 2. Hibridização “in situ” 3. Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) 4. Microdiálise “in vivo” 5. Imunoeletrônica 6. Auto-radiografia de receptores 7. Imunoblotting 8. Ensaios genéticos Definition of immunohistochemistry: Immunohistochemistry can be considered as the demonstration of antigens in tissue sections by the use of specific antigen-antibody interactions which culminate in the attachment of a marker to the antigen. Antigen: Serotonin Primary antibody: Rabbit anti-serotonin Secondary antibody: Biotinylated anti-rabbit Tertiary antibody: Avidin-biotin peroxidase Complex Chromogen: Diaminobenzidine (DAB) Marcação de dopamina pela técnica de imunoperoxidase na substância negra: Marcação de tirosina hidroxilase (TH) pela técnica de imunoperoxidase no córtex pré-frontal: Síntese das catecolaminas: Marcação de noradrenalina pela técnica de Falck-Hillarp (tratamento com formol). Marcação de noradrenalina pela técnica de imunoperoxidase: Marcação de noradrenalina pela técnica de imunoperoxidase: Marcação dupla de imunofluorescência: Estudos de co-localização: Estudos de co-localização: Um ou dois neurotransmissores principais ? The DR is a highly heterogeneous structure with distinct subregions differentially involved in stress paradigms and affective disorders (Lowry et al. 2008; Hale & Lowry (2011). Material & Métodos: Técnicas de rastreamento neural Incorporação do traçador pelos terminais axônicos e transporte retrógrado para os corpos celulares: Incorporação do traçador pelos corpos celulares e transporte anterógrado para os axônios: Métodos combinados: Imunohistoquímica/rastreamento retrógrado: Métodos combinados: Imunohistoquímica/rastreamento anterógrado: Imunohistoquímica: Vantagens: Especificidade (dependendo do anticorpo primário) Facilidade da combinação com outras técnicas Facilidade de marcações múltiplas Desvantagem: Difícil de quantificar In situ hybridization: In situ hybridization, as the name suggests, is a method of localizing and detecting specific mRNA sequences in morphologically preserved tissues sections or cell preparations by hybridizing the complimentary strand of a nucleotide probe to the sequence of interest. Normal hybridization requires the isolation of DNA or RNA, separating it on a gel, blotting it onto nitrocellulose and probing it with a complimentary sequence. Probe types: DNA (double strand) DNA (single strand) RNA Oligunucleotide Probe labeling: Radioactive (32P, 35S, 3H) Biotin Digoxigenin Fluorescence Hibridização “in situ” Vantagem: Especificidade Hibridização “in situ” para o receptor kappa mRNA versus protein localization Hybridizations with 35S-radiolabeled GAD67 probe combined with immunhistochemical detection of CTb From: Sego et al. (2014) Hybridizations with 35S-radiolabeled VGLUT2 probe combined with immunhistochemical detection of CTb Explorando o Sistema Serotonérgico On-Line http://mouse.brain-map.org/brain/Tph2/71378535/thumbnails.html?ispopup=1 Hibridização “in situ” Desvantagem: Resolução celular From: Metzger et al., 2006) Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) “In vivo” brain microdialysis: Microdialysis is a technique to monitor the chemistry of the extracellular space in living tissue. The technique has been extensively used in the neurosciences to monitor neurotransmitter release. The basic principle is to mimic the function of a capillary blood vessel by perfusing a thin dialysis tube implanted into the tissue with a physiological liquid. The perfusate is analysed chemically and reflects the composition of the extracellular fluid with time due to the diffusion of substances back and forth over the membrane. Microdialysis is thus a technique whereby substances may be both recovered from and supplied to a tissue. “In vivo” brain microdialysis: What is Voltammetry? • As an applied potential is changed over time a current is measured • Reduces ions in the electrode • Commonly uses three electrodes – Working Electrode (WE) – Auxiliary Electrode (AE) – Reference Electrode (RE) Fast-scan cyclic voltammetry (FSCV): Analytical Methods • Chromatography – Large amounts of materials used – Not very sensitive • Voltammetry – Extremely sensitive – Few components used – Wide range of concentrations Imunoeletrônica: From: Metzger et al. (2002) Cryo-immunogold EM labeling of marker proteins in uninfected and prion-infected hippocampus. Godsave S F et al. J. Neurosci. 2008;28:12489-12499 ©2008 by Society for Neuroscience Localização extra-sináptica de receptores de dopamina D1: Junção neuromuscular: A sinapse entre o axônio do motoneurônio e a fibra muscular é chamada junção neuromuscular. Um potencial de ação nesse axônio produz um potencial de ação em todas as fibras musculares que inerva. Neurotransmissão volumétrica – Volume transmission From: Zoli et al., 1999 Receptores de Neurotransmissores: Receptor nicotínico de Acetilcolina: Exemplo de um receptor ionotrópico Ações de neurotransmissores em receptores acoplados a proteínas G: Auto-radiografia de receptores: Uso de radioligantes (antagonistas radioativas como [3H]SCH23390 para o receptor de dopamina do tipo D1. Vantagem: Dar uma boa impressão da distribuição geral. Quantificação simples Desvantagem: Nenhuma resolução celular Among all AMPA-type glutamate receptor subunits, the GluR2/3 subunit shows the most robust expression in the mPFC . Serotonin 5-HT2A imunohistochemistry: The dopamine receptor family: AMPA receptors mediate the majority of the fast excitatory synaptic transmission. Kainate receptors contribute to the postsynaptic responses at excitatory synapses and can also modulate presynaptic neurotransmitter release at some synapses, whereas NMDA receptors are crucial for the induction of specific forms of synaptic plasticity and play important roles in several neuropsychiatric disorders . Table from: Kew & Kemp (2005) AMPA-type receptors: AMPA receptors are tetrameric heteromeric complexes of four homologous subunits GluR1 to GluR4, which combine in different stoichiometries to form distinct receptor subtypes. Each subunit has a large N-terminal extracellular domain, three transmembrane domains and a C-terminal intracellular domain. Most AMPA receptors contain the GluR2 subunit, which confers the properties of Ca2+ impermeability and linear-rectification, characteristic of the majority of AMPA receptors. Scheme from: Song & Huganir (2002) Métodos de imunoblotting: Vantagem: Fácil e exato de quantificar Absolutamente critico: Disseção do material Neurônios dopaminérgicos na substância negra: GENETIC APPROACHES: Green fluorescent protein (GFP) Camundongos Cre que expressam uma proteína fluorescente (tdTomato) em populações neuronais distintas: Estudos de co-localização em camundongos geneticamente modificados ChR2-mCherry expression in raphe obscurus neurons and their axonal projections. DePuy S D et al. J. Neurosci. 2011;31:1981-1990 ©2011 by Society for Neuroscience Positron emission tomography (PET) = use of raditracers with short lived positronemmiting isotopes.
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