MIA FORA NGS v2.0 Software Quick Guide

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Guia de Referência Rápida
sobre o Software
Para utilização com o Kit de Tipagem IMMUCOR® MIA FORA NGS HLA
Para utilização em diagnósticos in vitro
Immucor Transplant Diagnostics, Inc.
550 West Avenue
Stamford, CT 06902, EUA
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Copyright © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Todos os direitos reservados.
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Este manual foi produzido para utilização com o software MIA FORA NGS
SR-790-00017
Por favor envie todas as dúvidas, comentários e pedidos de cópias adicionais para a morada abaixo
indicada.
Representante autorizado:
Immucor Medizinische Diagnostik GmbH
Adam-Opel-Strasse 26A
Rodermark 63322 Alemanha
Tel.: (+49) 6074-84 20 -0
Assistência técnica na Europa: +32/3 385 47 91
IMMUCOR® é uma marca registada da Immucor, Inc.
MIA FORA™ é uma marca registada da Sirona Genomics, Inc.
illumina® é uma marca registada da Illumina, Inc.
MiSeq® é uma marca registada da Illumina, Inc.
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Utilização prevista
O kit de tipagem MIA FORATM NGS HLA destina-se à amplificação e sequenciação de genes
HLA, nomeadamente HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 e -DPB1, na
plataforma de sequenciação Illumina NGS. O software MIA FORA destina-se a ser utilizado
como guia na determinação do tipo HLA a partir dos dados gerados com o kit de biblioteca MIA
FORA NGS HLA. O teste destina-se a ser utilizado num laboratório habilitado a manipular ADN
para amplificação e sequenciação.
Acerca deste guia
O presente guia fornece instruções elementares para a utilização do software MIA FORA NGS
SR-790-00017 em conjunto com os seguintes kits:
Kit de tipagem MIA FORA™ NGS HLA
SR-800-10377 (marcação CE para
IVD (diagnóstico in vitro) apenas na União Europeia)
Para mais informações, por favor consulte o Manual do Utilizador do software MIA FORA NGS.
Este guia não se destina a substituir o manual do utilizador.
Documentação relacionada
Os documentos a seguir indicados contêm mais informações relacionadas com este guia, ou
nele referenciadas.
Manual do Utilizador do software MIA FORA NGS (LC1619)
Folheto informativo do kit de tipagem MIA FORA NGS HLA (LC1618CE)
Limitações
Por favor consulte a documentação relacionada para mais informações sobre as limitações.
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Criar um projeto e analisar uma amostra:
1. Crie um Ficheiro de Código de Barras da Amostra (um ficheiro CSV Windows separado por
vírgulas) com nomes das amostras e atribuições de código de barras. Inclua o Nome do Projeto e
as posições dos poços. Estes dados serão utilizados na análise das sequências.
a. Abra o Software MIA FORA e navegue até ao separador Projects. Clique no botão New
Project (projeto novo) no canto inferior direito da página principal.
b. Introduza o nome de projeto (Project Name) desejado, número de lote do Kit MIA FORA
NGS, data de receção e nome do Operador. Clique em Browse (procurar) para carregar
o ficheiro do código de barras da amostra (Sample Barcode File (CSV)).
Nota: O nome do projeto não deverá exceder os 30 carateres. Podem ser utilizados os
carateres traço e traço inferior, mas não devem ser utilizados carateres especiais pois serão
eliminados.
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c. Clique Next (seguinte) para navegar até à folha Sample Barcode (código de barras das
amostras) e clique em YES para confirmar que os nomes das amostras estão corretos.
d. Clique Finish (concluir) para criar o projeto novo (New Project).
2. Consulte Anexo A para instalar MiSeq Run e atribuir um nome aos Ficheiros FASTQ utilizando o
Illumina Experiment Manager.
3. O projeto novo está pronto para carregar ficheiros FASTQ quando a primeira seta ficar
alaranjada.
a. Clique o botão verde de reproduzir debaixo de Next Step para iniciar o assistente de
ficheiros FASTQ.
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b. Navegue para carregar os ficheiros FASTQ. Mantenha premida a tecla CTRL antes de
selecionar ambos os ficheiros.
NOTA: Os nomes dos ficheiros FASTQ têm de começar pelo nome do projeto para que o
software possa reconhecer os ficheiros.
c. Clique em Finish (concluir) para começar a carregar os ficheiros FASTQ.
4. Clique em Project name (nome do projeto) para selecionar o projeto para análise e revisão de
dados
Nota: A lista de Projetos tem os projetos mais recentes listados no topo da lista.
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5. Clique no separador Statistics (dados estatísticos) para rever a qualidade da sessão.
a. Reveja o Piechart (gráfico circular)
i. As leituras válidas devem ser >85%. As leituras não válidas devem ser <10%.
b. Selecione Insert Distribution (distribuição de insertos)
i. A dimensão do inserto deve situar-se dentro do intervalo 150-400
c. Reveja Read Distribution Among Samples/Barcode (Distribuição de leituras entre
Amostras / Código de Barras)
d. Reveja Nucleotide Distribution Along Each Position (Distribuição de Nucleótidos ao
longo de cada Posição)
i. A partir da posição 20, o gráfico deve mostrar percentagens idênticas para cada
base
e. Reveja Quality Score Distribution Along Each Position (Distribuição da Pontuação de
Qualidade ao longo de cada Posição)
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6. Clique no separador Review (Rever) para rever os dados
FIG. 1 – Janela Review (Janela de revisão) (A) Menu de lista pendente de Amostras e Locus (B)
Genótipos selecionados para a amostra (C) Tabelas SNP (polimorfismo de um único nucleótido)
e de Sugestão de LD (desequilíbrio de ligação) (D) Tabela de alelos candidatos computados (E)
Gráficos de cobertura e browsers de alinhamento (F) Browser de alinhamento para contigs de
novo
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a. Verifique todos os dados utilizando o Smart Flagging System (sistema de etiquetas
inteligente) para detetar anomalias, dados insuficientes e pontos de interrogação.
b. Navegue através dos menus de lista pendente Sample (amostra) e Locus (locus) para
rever os dados (FIG 1 (A)).
c. Reveja os alelos na tabela Candidate (candidato) (FIG 1 (D)),
i. Considere a coluna de cobertura mínima de cDNA (ADN complementar) (quinta
coluna) e a coluna de cobertura mínima de central reads (leituras centrais) de
cDNA (sexta coluna).
d. Para as chamadas homozigóticas (aparece um único alelo por locus na lista), reveja a
informação LD suggestion (sugestão de desequilíbrio de ligação), a zona de sombra
cinzenta no gráfico de cobertura, e o separador Candidate Pairs (pares candidatos) para
analisar os indícios sobre os alelos que não aparecem (FIG 1 (C)).
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e. Para visualizar os Coverage Plots (gráficos de cobertura), destaque os alelos candidatos
na tabela dos candidatos e selecione Coverage (cobertura) (FIG 1 (E)).
f.
O painel da esquerda mostra Coverage along the cDNA (cobertura ao longo das
sequências de referência do cDNA); o painel da direita mostra Coverage along the
Genomic (cobertura ao longo das sequências de referência genómicas). As barras
vermelhas (# cardinais) acima das curvas de cobertura indicam posições que são
diferentes entre os alelos de referência selecionados. A zona sombreada a cinzento
destaca a diferença entre a cobertura total para o gene subjacente e a soma das
coberturas dos alelos selecionados.
g. Para confirmar/rever a chamada atribuída automaticamente, selecione o alelo chamado
e um alelo da sua escolha. Clique no botão Consensus Alignment (alinhamento de
consenso) e compare com o Contig com maior grau de correspondência.
h. Navegue através das diferentes características de alinhamento para comparar os alelos
e confirmar ou alterar a chamada atribuída automaticamente.
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i.
Utilize as ferramentas SNP e LD Suggestion para ajudar a fazer as melhores chamadas.
i. A tabela SNP mostra a lista de sítios polimórficos dos contigs reunidos de novo e
os blocos de fases e a frequência de nucleótidos em cada sítio polimórfico. Se a
proporção de frequências de nucleótidos em Contig1 vs Contig2 for diferente da
proporção média, as células correspondentes serão destacadas em cor
alaranjada.
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ii. O painel LD Suggestion mostra os dados introduzidos na base de dados de
desequilíbrio de ligação que contêm os alelos listados na tabela de genótipo da
amostra. Cada fila representa alelos que se observou estarem associados um
com o outro. O painel de sugestão LD é apenas informativo; o LD não é utilizado
para calcular genótipos de amostra computados.
j.
Se tiverem sido feitas alterações à chamada, clique no botão Refresh acima da tabela de
genótipo. Se todas as chamadas estiverem corretas, clique no botão de aprovar e vá
para a amostra seguinte. Só os revisores com estatuto de técnico ou diretor de
laboratório podem anular a chamada computada.
k.
Uma vez aprovada a amostra, só um utilizador com funções de diretor pode alterar o
resultado clicando em ReAnalysis (reanálise).
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7. Clique no separador Summary (Resumo) para rever o genótipo de todas as amostras antes de
gerar o relatório (Report).
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8. Clique no botão Report e escolha o formato pretendido (PDF, PDF sem comentário, XML)
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ANEXO A
Nota: É necessário criar uma folha de amostras (Sample Sheet Creation) para realizar uma sessão com
MiSeq®
1. Faça o download do Illumina® Experiment Manager utilizando o link seguinte.
https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloa
ds.html
2. Abra o software e clique em Create Sample Sheet (Criar folha de amostra)
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3. Selecione MiSeq Instrument e clique Next (seguinte).
4. Em Select Category (selecionar categoria) escolha Other (outro) e em Select Application
(selecionar aplicação) escolha FASTQ Only e selecione Next (seguinte).
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5. Preencha os Workflow Parameters (parâmetros do fluxo de trabalho) e selecione Next
(seguinte)
a. Campo Reagent Cartridge barcode (Código de barras do cartucho de reagente): Introduza o
número do código de barras do cartucho de reagente do MiSeq.
O número do código de barras encontra-se no rótulo do cartucho.
b. Sample Prep Kit (Kit de preparação de amostras): Selecione TruSeq HT
c. Index Reads (Leituras de índice): Selecione 0
d. Experiment name (Nome da experiência): Tem de se começar pelo Nome de Projeto que
acabou de ser criado no Software MIA FORA (isto é: Training_06Jan16_QUAIL) Nota: Copie o
nome da Experiência e cole-o no campo Sample ID (identificação da amostra) no 6.º Passo.
e. Investigator Name (Nome do investigador): Nome da pessoa que está a fazer a experiência
f. Description (Descrição): Qualquer informação adicional
g. Date: Data da sessão
h. Read Type (Tipo de leitura): Selecione “Paired End”
i. Cycles Read 1/2 (Ciclos de leituras 1/2) Ambos devem ser 151
j. FASTQ Only Workflow-Specific Settings (Definições específicas apenas para o fluxo de
trabalho): Desassinale todas as caixas
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6. No ecrã Sample Sheet (folha da amostra), só é necessária 1 fila. Cole o nome da experiência
(Experiment Name) utilizado no 5.º Passo no campo “Sample ID” (identificação da amostra).
Selecione Finish (terminar). Será atribuído ao ficheiro FASTQ o nome de acordo com a entrada
no campo “Sample ID” (isto é: Training_06Jan16_QUAIL).
7. Guarde o ficheiro CSV com o nome do Projeto e guarde num local apropriado para ser utilizado
no MiSeq.
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