ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES

Transcrição

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM
DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO
BASIDIOCARPO
FRANCIELLY MOURÃO
UMUARAMA
2008
FRANCIELLY MOURÃO
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus...
Reservado
Biblioteca
(30mm)
DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO
BASIDIOCARPO
FRANCIELLY MOURÃO
UMUARAMA
2008
UNIVERSIDADE PARANAENSE
FRANCIELLY MOURÃO
DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO
Dissertação apresentada como parte das
exigências para a obtenção do grau de mestre
no Programa de Mestrado em Biotecnologia
Aplicada à Agricultura da Universidade
Paranaense – UNIPAR, sob orientação do Prof.
Dr. Nelson Barros Colauto.
UMUARAMA
2008
M929a
Mourão, Francielly
Atividade biológica de Agaricus brasiliensis em diferentes fases
de maturação do basidiocarpo / Francielly Mourão. – Umuarama:
Universidade Paranaense – UNIPAR, 2008.
73p.; Il.
Orientador: Prof. Dr. Nelson Barros Colauto.
Dissertação
(Mestrado)
–
Universidade
Biotecnologia Aplicada à Agricultura, 2008.
Paranaense,
1. Agaricus blazei ss. Heinemann. 2. Antioxidante. 3. Antineoplásica. 4.
Basidiocarpo. 5. Glucanas. I. Universidade Paranaense – UNIPAR. II. Título.
(21 ed) CCD: 579.6
Elaborado pela Bibliotecária Inês Gemeli
CRB – 9/966
Termo de aprovação
FRANCIELLY MOURÃO
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES FASES DE
MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO
Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre no
programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade
Paranaense, pela seguinte banca examinadora:
______________________________________
Prof. Dr. Nelson Barros Colauto (presidente)
______________________________________
Prof.a Dr.a Giani Andrea Linde Colauto (Titular interno)
______________________________________
Prof.a Dr.a Luzia Doretto Paccola-Meirelles (Titular externo)
Umuarama, 25 de agosto de 2008.
Aos meus pais Lúcia e Adelino.
As minhas irmãs Huliana e
Anniely.
Pelo
carinho,
apoio
e
compreensão.
Mas,
principalmente, por estarem
presentes em minha vida, como
uma família da qual eu me
orgulho de fazer parte!
Amo muito vocês!
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre ao meu lado e por permitir que esse sonho se realizasse;
A todos que participaram, de alguma forma, da elaboração deste trabalho, em
especial:
Aos meus pais, por me proporcionarem a oportunidade de me dedicar aos estudos e
também por sempre torcerem por minhas vitórias;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Nelson Barros Colauto pela orientação, pelos
ensinamentos, dedicação, correções e pelas cobranças que me fizeram ser uma
pesquisadora mais dedicada e esforçada;
Aos professores Dr.a Giani Andrea Linde Colauto e MSc. Emerson Luiz Botelho
Lourenço pelas conversas (científicas e descontraídas!), pelos ensinamentos e
sugestões;
As alunas de iniciação científica, Suzana Humeo e Tatiane Domingos, por aceitar
fazer um trabalho em conjunto, pela dedicação, esforço, por estar sempre atenta aos
nossos ensinamentos e pelas conversas amigas;
A Huliana e Anniely, queridas irmãs pelas palavras amigas, sempre me incentivando
e não me deixando desistir;
Ao Arquimedes, meu namorado, pelo amor, companheirismo, pela disposição em
me ajudar sempre que precisei, pelos ensinamentos, pelos abraços apertados e
reconfortantes; pelas longas conversa de incentivo e por tentar entender e
acompanhar meu raciocínio e minhas explicações;
Às amigas Talita Mantovani, Keiko Nakamura, Liliana Manetti, Miria Bertelli grandes
companheiras nos congressos, nos momentos alegres e também nos momentos de
desespero!
A Universidade Paranaense-UNIPAR por ceder espaço físico;
A minha turma de mestrado, da qual sempre lembrarei com carinho de todos os
momentos bons e momentos difíceis que passamos;
"Creio que o triunfo é resultado de esforço
inteligente, que não depende da sorte, de
magia, de amigos, companheiros duvidosos
ou de um chefe; creio que tirarei da vida
exatamente o que nela colocar" (Gandhi).
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES FASES DE
MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO
RESUMO GERAL
Agaricus brasiliensis Wasser et al. (Agaricus blazei ss. Heinemann), popularmente
conhecido no Brasil como Cogumelo Medicinal, Cogumelo-do-sol, é um fungo de
cultivo expressivo no país devido às suas propriedades medicinais, evidenciadas em
diversos trabalhos científicos, que vem ganhando importância em outros países,
principalmente para uso nutracêutico. Os nutracêuticos obtidos de cogumelos
minimamente
suplementos
processados
dietéticos.
e
São
encapsulados
utilizados
podem
ser
principalmente
consumidos
devido
ao
como
potencial
terapêutico como imunomodulatório e anti-tumoral. As frutificações de A. brasiliensis
são colhidas no Brasil principalmente no estágio imaturo, quando o píleo ainda está
fechado, atendendo aos padrões morfológicos pré-estabelecidos e é nesse estágio
que se obtém maior valor comercial para exportação. A atividade biológica desse
cogumelo é dependente da composição química das frutificações que pode variar
com a maturação, particularmente em relação ao conteúdo de β-D-glucanas que
constituem a parede celular do fungo. No presente estudo, foram utilizadas
frutificações de diferentes linhagens de A. brasiliensis colhidas em diferentes
estágios de maturação – imaturas (basidiocarpo fechado), maduras (basidiocarpo
aberto), a fim de avaliar a atividade antioxidante, atividade sobre a migração celular
em processo inflamatório e atividade antineoplásica. Para a avaliação da atividade
antioxidante foram utilizadas dez linhagens de A. brasiliensis em duas fases de
maturação do basidiocarpo (aberto e fechado). Foram estudadas condições de
extração de solventes (DMSO (dimetilsufóxido), etanol, metanol ou água),
temperatura (15, 30, 45 ou 60 °C) e tempo (15, 30, 45 ou 60 min). A atividade
seqüestradora de radicais foi calculada pela percentagem da descoloração do 1,1difenil-2-picrilhidrazil (DPPH). Para cada 0,1 ml de extrato bruto foi adicionado 2,9 ml
de solução metanólica de DPPH (60 µM), preparado no momento do uso. A leitura
foi realizada após 30 min. A absorvância foi medida a 515 nm usando
espectrofotômetro. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de
Tukey (p≤0,05). Para a avaliação da atividade de A. brasiliensis sobre a migração
celular em processo inflamatório foi utilizado ratos Wistar macho, de maneira que a
indução da resposta inflamatória foi induzida através da formação de bolsa de ar no
dorso dos animais adicionados de solução aquosa de carragenina (2%), foram
realizados coletas do sangue exsudato em diferentes etapas do experimento (antes
do tratamento, 8 dias após o tratamento, 18 dias de tratamento 6 h após a indução
da resposta inflamatória), sendo determinados a contagem total em câmara de
Newbauer e diferencial das células através de extensões sanguíneas coradas pelo
método clássico de coloração de May Grunwald-Giemsa. Para a avaliação da
atividade antineplásica de A. brasiliensis foram utilizados camundongos fêmeas as
quais foram inoculados com células de Sarcoma 180 no tecido subcutâneo dos
animais, após sete dias da inoculação os animais foram tratados com extratos de A.
brasiliensis. Após 30 dias do início dos experimentos os animais sofreram eutanásia
através de administração de excesso de anestésico, onde foram retirados o baço e a
massa tumoral a fim de serem medidos e calculados. O tumor foi medido por régua
milimetrada e seu volume calculado. A inibição foi calculada considerando o volume
do tumor do grupo Controle como 100%. Os resultados obtidos neste trabalho
demonstram que o cogumelo A. brasiliensis em diferentes linhagens e estágios de
maturação são uma fonte natural de antioxidantes, sendo a linhagem ABL99/29A,
basidiocarpo fechado, aquela que apresentou maior atividade antioxidante. Os
basidiocarpos fechados apresentaram atividade antioxidante, em média, 24% ± 2%
maior
quando
comparados
aos
basidiocarpos
abertos.
Nossos
resultados
demonstraram que o extrato aquoso obtido de A. brasiliensis ABL99/25 apresentou
atividade inibitória sobre a infiltração de leucócitos para o foco da lesão. Esta
inibição foi mais acentuada quando foram utilizados basidiocarpos fechados. Foi
constatado efeito antineoplásico do extrato aquoso de A. brasiliensis, porém não foi
observada diferença significativa em função do estágio de crescimento do
basidiocarpo para a linhagem ABL97/11 de Agaricus brasiliensis, sendo a atividade
antineoplásica média dos basidiocarpos de 89,22%.
Palavras chave: Antioxidante, antineoplásica, basidiocarpo, glucanas.
BIOLOGICAL ACTIVITY OF Agaricus brasiliensis ON DIFFERENT BASIDIOCARP
MATURATION STAGES
ABSTRACT
Agaricus brasiliensis Wasser et al. (Agaricus blazei ss. Heinemann), popularly known
in Brazil as Medicinal Mushroom, Sun Mushroom, is a fungus cultivated because of
its medicinal properties, highlighted in several scientific papers, and are gaining
importance in several countries, mainly because of its functional use. The
mushrooms are minimally processed and encapsulated to be consumed as dietary
supplements. They are used mainly due to the potential therapeutic as
immunomodulatory and antitumor activity. The fructifications of A. brasiliensis are
collected in Brazil mainly in the immature stage, when the pileus is still closed, to
attend commercial standard patterns. The biological activity of the mushroom is
dependent on the chemical composition of fructifications, particularly in relation to the
content of β-D-glucan which are the cell wall of the fungus. In this study, it was used
basidiocarps of different collected stages of maturity – immature basidiocarp (closed
pileus), mature basidiocarp (opened pileus) from different strains of A. brasiliensis to
evaluate the antioxidant activity (ABL99/26, ABL99/28, ABL99/29 and ABL99/26 and
ABL99/29A closed basidiocarp, ABL99/28, ABL99/29, ABL99/30 and 99/29A opened
basidiocarp), cell migration in acute inflammatory process activity (ABL99/25, opened
and closed basidiocarp), induced by agent phlogistic, and antineoplastic activity
(ABL97/11, opened and closed basidiocarp). The data obtained in this work shows
that the mushroom of A. brasiliensis strains, on different stages of maturation, can be
included as a natural source of antioxidant food, being the strain ABL99/29A, closed
basidiocarp, the strain with the highest antioxidant activity. Closed basidiocarps have
an average of 24% ± 2% higher antioxidant activity when compared to opened
basidiocarps. It was observed antitumor effect of aqueous extract of A. brasiliensis,
but no significant difference was observed according to the maturation stage of the
basidiocarp for the strain ABL97/11 of Agaricus brasiliensis, and the basidiocarp
average antineoplastic activities were of 89.22%. Our results showed that the
aqueous extract obtained from A. brasiliensis (ABL99/25) presented important
inhibitory activity on the infiltration of leukocytes to the outbreak of the injury, and the
mushroom with closed basidiocarp showed more activity that the opened
basidiocarp.
Key words: Antioxidant, antineoplastic, basidiocarpo, glucans.
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Efeito das variáveis de extração sobre a atividade antioxidante 23
do basidiocarpo fechado de Agaricus brasiliensis
Capítulo 2
TABELA 1- Efeito do tratamento com extrato de basidiocarpos aberto e 45
fechado de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário antes do estímulo
inflamatório
TABELA 2- Análise diferencial dos leucócitos demonstrando o efeito do 47
tratamento com A. brasiliensis sobre o perfil dos polimorfonucleares antes e
após estímulo inflamatório com carragenina em ratos.
Capítulo 3
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Avaliação do desenvolvimento de neoplasia em camundongos 61
Swiss inoculados com células de sarcoma 180 tratados extrato aquoso de
basidiocarpo de Agaricus brasiliensis Fechado ou Aberto
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
FIGURA 1: Atividade antioxidante de A. brasiliensis em diferentes fases de 27
maturação do basidiocarpo
Capítulo 2
FIGURA 1: Esquema do protocolo de indução e acompanhamento da
resposta inflamatória em ratos.
42
FIGURA 2: Efeitos do tratamento com extrato de basidicarpos aberto e 46
fechado de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário total.
FIGURA 3: Efeitos dos tratamentos com extratos de A. brasiliensis sobre a 49
mobilização de leucócitos para o tecido subcutâneo inflamado (modelo da
bolsa de ar).
LISTA DE ABREVIAÇÕES
µ
micro
β
beta
α
alfa
µM
micromolar
g/m2
grama por metro quadrado
°C
graus Celsius
g
grama
g
força centrífuga relativa
h
hora
min
minutos
ml
mililitros
kg
kilograma
mm3
milímetro cúbico
mm
milímetro
π
pi
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO GERAL
1. Atividade antioxidante de dois estágios de maturação do basidiocarpo de
Agaricus brasiliensis
17
19
2. Atividade de Agaricus brasiliensis na migração celular em processo 38
inflamatório
3. Atividade antineoplásica de Agaricus brasiliensis em diferentes fases de 57
maturação do basidiocarpo
CONCLUSÕES GERAIS
71
REFERÊNCIAS GERAIS
72
APÊNDICE(S)
73
17
1. INTRODUÇÃO GERAL
Os representantes do gênero Agaricus pertencem à ordem Agaricales, a
qual é conhecida pela grande variedade na morfologia dos indivíduos e por reunir
os cogumelos propriamente ditos. Os termos cogumelo, basidioma e basidiocarpo
são sinônimos e referem-se à estrutura de reprodução dos indivíduos desse grupo
(corpo de frutificação) (LOPES, 1999).
Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann)
(WASSER et al., 2002), A. subrufescens Peck segundo Kerrigan (2005), é um
Basidiomiceto coloquialmente denominado cogumelo-do-sol, cogumelo piedade,
“kawahiratake”, “himematsutake”, champignon do Brasil entre outros. O Brasil tem
se destacado no cultivo de A. brasiliensis, devido às condições climáticas
favoráveis, sendo mais cultivado nos Estados de São Paulo, Paraná e Minas
Gerais. Outros países produtores são China, Japão e Coréia (EIRA, 2003). A.
brasiliensis tem sido empregado na dieta, principalmente em pratos japoneses,
chineses e até mesmo nos países ocidentais devido à sua forte fragrância
adocicada e por sua excelente textura. Também tem sido utilizado em forma de
chá, no combate ao estresse físico e emocional, estimulante do sistema
imunológico, melhora da qualidade de vida de diabéticos, redução de colesterol,
combate às doenças como úlcera gástrica, osteoporose, além de apresentar um
possível efeito anticarcinogênico e antimutagênico (BELLINI et al., 2003; MENOLI
et al., 2001).
Podemos caracterizar dois estágios importantes no crescimento de
basidiocarpos de fungos que possuem véu, antes e após o rompimento do véu.
Este é o momento que ocorrem as principais mudanças bioquímicas no
basidiocarpo. Antes de romper o véu o basidiocarpo é imaturo e os esporos estão
em fase de desenvolvimento, caracterizado como “cogumelo fechado”. Após o
rompimento do véu o basidiocarpo atinge a maturidade e em seguida inicia o
estágio de senescência, sendo os esporos dispersos. Portanto, após o
rompimento do véu inicia-se o processo de maturação dos esporos (CAMELINI et
al., 2005).
18
As frutificações de A. brasiliensis são colhidas no Brasil principalmente no
estágio imaturo, quando o píleo ainda está fechado, atendendo a padrões
morfológicos comerciais pré-estabelecidos. No entanto, essas frutificações
imaturas ainda não atingiram máxima eficiência da biomassa fúngica, mas é
nesse estágio que se obtém maior valor comercial para exportação. Cada estágio
de crescimento do basidiocarpo apresenta diferenças bioquímicas em relação à
fase de maturação dos esporos e de senescência do basidiocarpo. Basidiocarpos
em diferentes estágios de crescimento da linhagem UFSC 51 de A. brasiliensis
apresentaram aumento da concentração de proteínas e de β-D-glucanas,
consideradas responsáveis pelo efeito biológico (CAMELINI et al., 2005). As β-Dglucanas são constituintes naturais da parede celular de bactérias, fungos e
plantas, diferindo entre si pelo tipo de ligações e ramificações, características que
lhes conferem estruturas específicas e ações biológicas distintas, sendo, portanto,
a característica estrutural um fator fundamental para a ação das β-D-glucanas
(BETA GLUCAN RESEARCH, 2003; JONG, 2002).
Algumas propriedades e atividades biológicas de A. brasiliensis foram
avaliadas através de bioensaios in vivo e ensaios in vitro visando levantar
informações que dêem suporte à utilização do referido cogumelo na medicina
popular. Esta dissertação de mestrado é composta de três partes que foram
executadas de forma seqüencial. Primeiramente para avaliar a atividade
antioxidante utilizou-se o método espectrofotométrico de inibição do radical livre
de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) (MOLYNEUX, 2004). Todos os dados
referentes a estas avaliações são descritos no capítulo 1. No segundo capítulo
são apresentados os resultados sobre a atividade de Agaricus brasiliensis na
migração celular em processo inflamatório. No terceiro capítulo são apresentados
os resultados sobre a atividade antineoplásica de A. brasiliensis em diferentes
fases de maturação do basidiocarpo. O artigo resultante deste experimento foi
recentemente submetido à revista Brazilian Journal of Microbiology para
publicação e encontra-se escrito segundo as normas deste importante periódico
internacional.
19
CAPÍTULO 1
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM DOIS ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO
BASIDIOCARPO Agaricus brasiliensis
RESUMO
Os radicais livres são compostos químicos oxidantes que aceleram o
envelhecimento celular e estão envolvidos com o aparecimento de doenças
degenerativas como o câncer, as cardiopatias e a depressão do sistema
imunológico. Os antioxidantes são substâncias que podem retardar estes
processos oxidativos. O Agaricus brasiliensis é um cogumelo funcional que tem
despertado a atenção da comunidade científica devido as suas características
terapêuticas. A determinação da atividade antioxidante do Agaricus brasiliensis é
importante para verificar seu potencial de uso como fonte de antioxidante na
alimentação humana e animal. Fatores genéticos e fases de maturação do
basidiocarpo podem afetar diretamente a quantidade de antioxidantes produzidos,
basidiocarpo imaturos, sem rompimento do véu, tem sido comercialmente
utilizados para uso humano. O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições de
extração dos princípios ativos antioxidantes de A. brasiliensis em dois estágios de
maturação do basidiocarpo. Foram estudados para a extração os solventes
(DMSO (dimetilsufóxido), etanol, metanol ou água), temperatura (15, 30, 45 ou 60
°C) e tempo (15, 30, 45 ou 60 min) em 10 linhagens de A. brasiliensis. A atividade
seqüestradora de radicais livres foi calculada pela percentagem da descoloração
do DPPH. Concluiu-se que a melhor condição para extração dos princípios ativos
antioxidantes pelo método DPPH é o metanol, 60 min, a 60 °C. Linhagens com
basidiocarpo fechado possuem maior atividade antioxidante. Os basidiocarpos
fechados apresentaram em média uma atividade antioxidante 24% ± 2% maior
que a atividade antioxidante dos basidiocarpos abertos.
Palavras-Chave: Absorvância, Atividade biológica, Basidiomiceto, Agaricus
blazei.
20
ABSTRACT
Free radicals are chemical compounds oxidants that accelerate the aging cell and
are involved with the onset of degenerative diseases such as cancer, heart
disease and depression of the immune system. Antioxidants are substances that
can slow these processes oxidative. The Agaricus mushroom brasiliensis is a way
that has attracted the attention of the scientific community because their
characteristics therapies. The determination of the antioxidant activity of Agaricus
brasiliensis is important to ascertain their potential for use as a source of
antioxidant in food and feed. Variations between lines and stages of maturation of
the basidiocarp may directly affect the amount of antioxidant produced and is the
main commercial consumption in the immature stage of basidiocarp with the veil
not broken. The objective of this study was to determine the conditions for the
extraction of active ingredients antioxidant in two stages of maturation of the
basidiocarp of Agaricus brasiliensis. We used nine strains of A. brasiliensis in two
stages of maturation of the basidiocarp (open and closed). We studied conditions
of the solvent extraction (DMSO, ethanol, methanol or water), temperature (15, 30,
45 or 60 C) and time (15, 30, 45 or 60 min). The activity of radical scavengin was
calculated by the percentage of discoloration of DPPH. It was concluded that the
best condition to extract the active ingredients antioxidants by DPPH method is the
methanol, 60 min, 60 ° C. Linhagens with basidiocarp have closed higher
antioxidant activity. The basidiocarps on average had closed an antioxidant activity
24% ± 2% higher than the antioxidant activity of basidiocarps open.
Keywords: Absorvância, biological activity, Basidiomycets, Agaricus blazei.
21
INTRODUÇÃO
Os radicais livres são espécies químicas que possuem um elétron
desemparelhado no último orbital, gerando um processo oxidativo. Neste estado,
o radical livre é extremamente instável podendo reagir com estruturas celulares,
afetando o funcionamento do metabolismo celular (ABDALLA, 2002; BIANCHI;
ANTUNES, 1999). Os radicais livres aceleram o envelhecimento celular e estão
envolvidos com o aparecimento de doenças degenerativas como o câncer, as
cardiopatias e a depressão do sistema imunológico. Os antioxidantes são
substâncias que podem retardar estes processos oxidativos, pois reagem com os
radicais livres inibindo a etapa de propagação da reação de oxidação
(BARREIROS et al., 2006, TAKAHASHI et al., 1978; WITSCHI; LOCK, 1978). Tais
agentes antioxidantes tornam-se cada vez mais necessários na prevenção de
doenças, uma vez que têm se ampliado as condições ambientais que ocasionam
maior exposição das pessoas aos efeitos deletérios dos agentes oxidantes.
Antioxidantes
sintéticos
como
hidroxibutilanisol
(BHA)
e
o
butilhidroxitolueno (BHT) são normalmente utilizados nas indústrias de óleos e
derivados lipídicos. Entretanto, estes compostos podem apresentar efeitos
nocivos à saúde como hemorragias diversas e mudanças bioquímicas, podendo
atuar inclusive como agente promotor de desenvolvimento de adenoma
(TAKAHASHI et al., 1978; WITSCHI e LOCK, 1978). Desta forma, nos últimos
anos ocorreu uma busca por substâncias naturais que tenham a mesma função e
eficiência dos antioxidantes sintéticos (MILLAUSKAS et al., 2003; PASSOTTO et
al., 1998).
O Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann),
considerado A. subrufescens por Kerrigan (2005), é um cogumelo funcional que
tem despertado a atenção da comunidade científica. A funcionalidade deste
cogumelo tem sido atribuída, principalmente, as β-D-glucanas, que possuem
atividade antitumoral (TAKASHI et al., 1990), estimulam o sistema imunológico
(LIU et al., 2007; NAKAJIMA et al., 2002) e têm propriedade antidiabética (KIM et
al., 2005), antinfecciosa (BERNARDSHAW et al., 2005), anticarcinogênica (ITO et
al., 1997; KIMURA et al., 2004; MIZUNO et al., 1990ab; OSHIMAN et al., 2002),
22
antimutagênica (AHN et al., 2004; DELMANTO et al., 2001; MENOLI et al., 2001;
SOUZA-PACCOLA et al., 2004), antimetastática (KIMURA, 2004) e antioxidante
(KER et al., 2005). Outros compostos presentes no A. brasiliensis podem atuar de
forma isolada ou sinérgica com as β-D-glucanas, sendo os principais compostos
proteínas (CHO et al., 2004), ergosterol (HIROTANI et al., 2000ab; 2002ab; 2005;
CAMELINI et al., 2005) e lipídeos (CAMELINI et al., 2005). As proteínas
demonstraram atividade regulatória sobre células e ativação de macrófagos e
linfócitos (HO et al., 2004). O ergosterol faz parte da fração lipídica e está
presente na membrana celular de diversos fungos, com ação antiangiogênica,
além de precursor de ergocalciferol (Vitamina D), sendo possíveis que estes
compostos atuem também como agentes antioxidantes (TAKAKU et al., 2001).
A determinação da atividade antioxidante do Agaricus brasiliensis é
relevante para verificar seu potencial como alimento funcional, tanto para a
alimentação humana como animal. Entretanto podem ocorrer variações na
atividade antioxidante em função da linhagem e fases de maturação do
basidiocarpo, já que os estágios de maturação caracterizam-se por mudanças
bioquímicas no basidiocarpo, principalmente pela formação dos esporos. Em
geral, basidiocarpos de A. brasiliensis em diferentes estágios de crescimento
apresentam variação na concentração de proteínas e de β-D-glucanas,
consideradas importantes na atividade biológica (CAMELINI et al., 2005).
Camelini et al. (2005) descreveram o aumento das (1-3)-β-D-glucanas em
frutificações maduras e que as (1-6)-β-D-glucana não sofrem alterações de suas
quantidades. É importante enfatizar que a cadeia linear (1-6)-β-D-glucana extraído
de Penicillium isladicum não apresentou bioatividade, como, descrito por Ohno et
al. (1986). No entanto, as ramificações (1-3)-β-D-glucanas são estruturalmente
importantes e responsáveis pelo aumento da atividade imunomodulatória destes
polissacarídeos (DONG et al., 2002).
Além da possível variação da atividade biológica em função do estágio de
maturação, o mercado consumidor é exigente quanto aos padrões morfológicos
da frutificação, particularmente o estágio de maturação das frutificações,
valorizando frutificações com píleos fechados, ou seja, frutificações ainda
23
imaturas por serem menos frágeis e pela sua maior rigidez; características que
facilitam manter sua estrutura morfológica até o consumidor.
Assim para ampliar o conhecimento desta área e dar suporte ao uso de
alimentos funcionais e comerciais, o objetivo deste trabalho foi determinar as
condições de extração dos princípios ativos antioxidante em dois estágios de
maturação do basidiocarpo do Agaricus brasiliensis e verificar a atividade
antioxidante de linhagens de A. brasiliensis em dois estágios de maturação do
basidiocarpo (aberto e fechado).
MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento foi executado no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Paranaense – Campus Sede Umuarama-PR. Primeiramente foi
realizado a padronização da extração dos princípios ativos antioxidantes do A.
brasiliensis. Para tanto foi utilizado a linhagem ABL99/30, basidiocarpo fechado.
Para avaliação da atividade antioxidante do A. brasiliensis em diferentes fases de
desenvolvimento do basidiocarpo foram utilizados as linhagens ABL99/26,
ABL99/28, ABL99/29, ABL99/29A e ABL99/30 com basidiocarpo com o véu
rompido (aberto) e antes do rompimento do véu (fechado), codificado como 26A,
28A, 29A, 29AA e 30A (basidiocarpo aberto) e 26F, 28F, 29F, 29AF, 30F
(basidiocarpo fechado). Todas as linhagens foram provenientes do Departamento
de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, BotucatuSP. Os corpos de frutificação foram produzidos pelo método de compostagem
(BRAGA et al., 1998), colhidos, lavados, desidratados em estufa com circulação
de ar a 60 oC, moídos em moinho de facas e armazenado a -70 ◦C.
Padronização do preparo do extrato do basidiocarpo moído
Após desidratação e moagem do basidiocarpo fechado, da linhagem
ABL99/30, 1 g foi homogeneizado com 5 mL de diferentes solventes (metanol,
etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e água) e mantido em diversos tempos (15, 30,
45 e 60 min) e temperaturas (15, 30, 45 e 60 °C). Neste trabalho foi padronizada
temperatura máxima de 60 ºC, pois mostrou-se mais adequada por estar abaixo
do ponto de ebulição do metanol (65 ºC). Após a extração, a mistura foi resfriada
24
imediatamente em banho de gelo por 15 min e centrifugada a 4410 g por 5 min a
5 °C. O sobrenadante foi considerado extrato bruto e utilizado na avaliação da
atividade
antioxidante
pelo
método
de
1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH)
(SHIMADA et al., 1992).
Após a padronização da metodologia foi avaliada a atividade antioxidante
do basidiocarpo em duas fases de desenvolvimento do basidiocarpo (aberto e
fechado). Os extratos foram preparados de acordo com o melhor resultado obtido
na padronização da extração.
Avaliação da atividade antioxidante
O método de DPPH foi adaptado para a medida da capacidade
seqüestradora de radicais livres para todas as linhagens do fungo com
basidiocarpo aberto e fechado. Para cada 0,1 ml de extrato bruto foi adicionado
2,9 ml de solução metanólica de DPPH (60 µM), preparado no momento do uso
(MENSOR et al., 2001). A leitura foi realizada após 30 min. A absorvância foi
medida a 515 nm usando espectrofotômetro (FEMTO 700 plus). Todos os testes
foram realizados em triplicata, sendo um controle preparado somente com
solvente. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de Tukey
(p≤0,05). A atividade seqüestradora de radicais foi calculada pela percentagem da
descoloração do DPPH usando a equação: %= [(ADPPH _ Aamostra)/ADPPH] x 100
(BARROS et al., 2008). A inibição de radicais DPPH (Shimada et al., 1992) é um
dos métodos mais utilizados para determinação da atividade antioxidante. Este
método é prático, rápido e estável (MOLYNEUX, 2004), sendo muito utilizado
para avaliar a capacidade seqüestradora de radicais livres de produtos naturais
(DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
25
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1: Efeito das variáveis de extração sobre a atividade antioxidante do
basidiocarpo fechado de Agaricus brasiliensis. Letras diferentes indicam
diferenças significativas (p≤0,05).
Solvente
Tempo
Temperatura
% Atividade
Desvio- Estatística
(1:5)
(minutos)
(oC)
antioxidante
padrão
DMSO
60
60
-34,98
16,51
b
Etanol
60
60
30,61
16,94
a
Metanol
60
60
31,53
2,26
a
Água
60
60
-12,69
2,63
c
Metanol
60
15
15,27
6,67
C
Metanol
60
30
22,28
10,45
CB
Metanol
60
45
28,22
5,36
B
Metanol
60
60
35,93
3,23
A
Metanol
15
60
80,56
5,81
µ
Metanol
30
60
82,38
3,68
β
Metanol
45
60
87,52
3,87
α
Metanol
60
60
82,77
2,51
α
26
Dentre os solventes de extração testados o metanol foi o que apresentou o
melhor resultado (p≤0,05) (Tab. 1). Observa-se ainda que o metanol expressou
maior versatibilidade na extração dos princípios ativos antioxidantes de A.
brasiliensis, uma vez que os valores obtidos foram mais homogêneos quando
comparados com os demais solventes utilizados neste experimento (Tab. 1). Este
comportamento para o metanol pode estar associado à maior solubilidade em
água e a alta afinidade por lipídeos (BADOLATO; DURAN, 2000). Os lipídeos por
sua vez estão intimamente ligados as β-D-glucanas dos fungos, sendo
glicoproteínas da membrana que apresentam diversas atividades biológicas
(BROWN; GORDON, 2001; BETA GLUCAN RESEARCH, 2003). Shibata e
Demiate (2003) relatam uma expressiva fração de apolares, dentre elas os
lipídeos, no basidiocarpo de A. brasiliensis. Outro composto presente na
membrana plasmática é o ergosterol que possui atividade antiangiogênica e
antitumoral (NYLUND; WALLANDER, 1992; WANG et al., 1995), sendo, desta
forma, uma importante região para a presença de princípios ativos. Estas
estruturas possuem áreas polares para interação com a água e regiões apolares
para a interação com os lipídeos de membrana. Assim em função da polaridade
dos solventes utilizados é possível extrair diferentes compostos ativos. Devido a
maior atividade antioxidante do extrato metanólico (p≤0,05) é possível que a
fração de apolares tenha importante ação antioxidante, outra hipótese seria a
maior extração das β-glucanas por interagirem com os lipídeos.
Entre as temperaturas de extração estudadas (15, 30, 45 ou 60 °C), a
temperatura de 60 °C foi a que extraiu maior quantidade de compostos ativos
(p≤0,05) de Agaricus brasiliensis (Tab. 1). Este comportamento pode estar
relacionado com a vibração molecular das estruturas químicas responsáveis pela
atividade antioxidante do fungo. Sabe-se que o aumento da temperatura provoca
o aumento da vibração molecular e consequentemente dos choques entre o
solvente e os solutos, resultando em aumento da extração dos princípios ativos.
Sabe-se também que a temperatura pode ter efeito sinérgico na extração de
compostos ativos, pois pode potencializar sua extração pelo aumento da vibração
molecular, aumentando as passagens dos compostos ativos para o solvente e
velocidade das reações. Entretanto quando muito elevada pode promover a
27
quebra das ligações das moléculas devido ao excesso de vibração molecular
refletindo em redução de sua atividade (DELMANTO et al., 2001). Neste trabalho
observamos que o aumento da vibração molecular é positivo para a extração dos
princípios ativos do cogumelo e que os biocompostos apresentaram resistência
vibracional para esta temperatura. A escolha da temperatura de extração dos
princípios ativos para este trabalho foi em função da temperatura de evaporação
do solvente e da relação entre o aumento do número de choques e da ineficiência
da energia liberada em cada choque para a quebra das moléculas. Temperaturas
mais elevadas (70, 80 e 90 °C) mostraram-se ineficientes, pois ultrapassaram o
ponto de ebulição do solvente metanol (65 °C), provocando assim o desajuste da
concentração do extrato, desta forma padronizou-se temperatura máxima de 60
°C (dados não apresentados).
Entre os tempos de extração avaliados 60 min foi o que apresentou os
maiores resultados (p≤0,05) (Tab. 1). Observa-se ainda que os tempos de
extração menores evidenciam uma extração heterogênea enquanto os tempos de
60 min promovem valores de atividade antioxidante mais homogêneos (Tab. 1).
Este comportamento pode estar associado ao tempo prolongado de ação do
solvente sobre membrana do fungo, promovendo além da maior extração do
princípio ativo maior homogeneidade de extração. Aparentemente, ocorrem
alterações ao nível de parede ou membrana celular que possibilitam, após certo
tempo, a liberação do princípio ativo.
Atividade
antioxidante
de
A.
brasiliensis
em
diferentes
fases
de
desenvolvimento do basidiocarpo.
A atividade antioxidante do A. brasiliensis variou entre as linhagens do
cogumelo e entre as diferentes fases de desenvolvimento do basidiocarpo (Fig.
1). Apesar de haver variabilidade da atividade, todas as linhagens de A.
brasiliensis testadas apresentaram atividade antioxidante. As linhagens com
maiores atividades foram a 26F e 29AF para o cogumelo fechado e a 29AA para o
cogumelo aberto. A bioatividade dos cogumelos pode ser afetada em função de
algumas variáveis como, substrato, temperatura, luminosidade, variações de pH,
microrganismos presentes em diferentes habitats. Estas variáveis podem interagir
28
e/ou modificar aspectos físico-químicos do cogumelo que irá refletir na variação
de seus produtos metabólicos (SILVA et al., 2004).
Nossos resultados demonstraram diferença da atividade antioxidante entre
as linhagens, apesar de Colauto et al. (2002) relatarem baixa variabilidade
genética para estas mesmas linhagens. É provável que este comportamento seja
reflexo de alterações decorridas por variações ambientais do local de cultivo
original, devido ao baixo controle ambiental de cultivo, principalmente quando o
método de cultivo é no solo ao ar livre, conferindo, dessa forma, características
variáveis sobre sua bioatividade.
Entre as fases de desenvolvimento avaliadas os cogumelos com
basidiocarpo fechado apresentaram melhores resultados (p≤0,05). O grupo
composto por cogumelos fechados apresentou em média uma atividade
antioxidante 24% ± 2% maior que a atividade média do grupo composto por
cogumelos abertos. Bellini et al. (2003) relataram que a redução dos danos
cromossômicos com extrato de A. blazei na fase jovem de desenvolvimento foi
maior que na fase esporulada. Dentre as substâncias ativas dos fungos as
glicoproteínas, principalmente as β-D-glucanas, são os principais responsáveis
pela atividade biológica (BETA GLUCAN RESEARCH, 2003; JONG, 2002). As βD-glucanas são constituintes naturais da parede celular diferindo entre si pelo tipo
de ligações e ramificações, características que lhes conferem estruturas
específicas e ações biológicas distintas, sendo, portanto, a característica
estrutural um fator fundamental para sua ação (BETA GLUCAN RESEARCH,
2003; JONG, 2002). É importante ressaltar que existem relatos demonstrando
maior potencial para bioatividade nas β-D-glucanas que dispõem de ramificações
na cadeia principal e elevada massa molecular (CHIARA et al.,1970; MIZUNO,
1999; SAITÔ et al., 1977). O grau dessas ramificações também pode ser um
modulador da bioatividade como demonstrado para Sacharomyces cereviseae
que aumentou a atividade das células do sistema imunológico proporcionalmente
ao aumento no grau de ramificações (CLEARY; GRAHAM; HUSBAND, 1999).
Minato et al. (2001) verificaram nas espécies medicinais de cogumelos como
Lentinula edodes e Grifola frondosa que as concentrações de β-D-glucanas
aumentaram durante a maturação das frutificações, seguida de diminuição ao
29
final da maturação. Também para A. brasiliensis foi demonstrado um aumento no
rendimento das β-Dglucanas durante a maturação das frutificações (CAMELINI et
al., 2005). No estágio maduro houve aumento de (1-3) –β-D-glucana e diminuição
nos cogumelos com basidiocarpo fechado. Segundo Dong et al. (2002) e Mizuno
et al. (1990a), o principal efeito terapêutico do A. blazei está relacionado aos
polissacarídeos,
principalmente
(1→6)-(1→3)-β-D-glucanas.
Entretanto,
Kawagishi et al. (1989) e Mizuno et al. (1990b), demonstraram que o
polissacarídeo solúvel na fração alcalina com maior atividade é o composto
(1→6)-β-D-glucana-proteína. No entanto, Ohno et al. (2001) demonstraram que o
polissacarídeo responsável pela atividade anti-tumoral possuiu cadeia principal
(1→6)-β-D-glucana com ramificações (1→3)-β-D-glucanas.
Nossos resultados relatam que cogumelos com basidiocarpos fechados
apresentaram melhor atividade antioxidante comparado com os cogumelos com
basidiocarpo aberto. Esse dado sugere que a bioatividade das β-D-glucanas
isoladas (somente ramificações) é menor que no seu estado bruto (cadeia
principal com suas ramificações). Sugere-se ainda a ação de outros compostos
(vitaminas,
ergosterol,
lipídeos)
que
somados
as
β-D-glucanas
atuam
sinergicamente potencializando sua bioatividade. No caso de A. blazei, foi
demonstrada a atividade anti-angiogênica nas frações lipídicas contendo
ergosterol, administradas por via oral resultando na redução do crescimento
(volume) de tumores em camundongos portadores do tumor Sarcoma-180 Takaku
et al. (2001).
30
% Atividade antioxidante
0,6
cb
0,5
0,4
b
b
b
26A
30F
ac
ac
ac
a
a
29AA
28F
29F
26F
29AF
c
0,3
0,2
0,1
0
29A
28A
30A
Figura 1: Atividade antioxidante de A. brasiliensis em diferentes fases de
maturação do basidiocarpo (metanol, 60 min, 60 °C). Letras diferentes indicam
diferenças significativas (p≤0,05) pelo teste de Tukey.
CONCLUSÃO
Os dados obtidos neste trabalho demonstram que o A. brasiliensis é uma
fonte natural de antioxidantes. Para extração dos compostos antioxidantes o
metanol possui a melhor capacidade de extração dos princípios ativos
antioxidantes do basidiocarpo desidratado moído de A. brasiliensis a temperatura
de 60 °C por 60 min, as linhagens de A. brasiliensis ABL99/26 e ABL99/29A com
basidiocarpo fechado e ABL29A com basidiocarpo aberto tiveram maiores
atividade antioxidante, basidiocarpos fechados possuem em média 24% ± 2%
atividade antioxidante maior que os abertos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Universidade Paranaense, Fundação Araucária e CNPq
pelo apoio financeiro.
31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDALLA, D. S. P. Estresse oxidativo e alimentação. In:___. Nutrição:
fundamentos e aspectos atuais. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2002. p. 179-199.
BRAGA, G. C.; EIRA, A. F.; CELSO, P. G.; COLAUTO, N. B. Manual do cultivo
de Agaricus blazei Murril “Cogumelo-do-sol”. Botucatu: FEPAF, 1998. 44 p.
AHN, W. S.; KIM, D. J.; CHAE, G. T.; LEE, J. M.; BAES, S. M.; SINS, J. I.; KIM, Y.
W.; NAMKOONG, S. E.; LEE, I. P. Natural killer cell activity and quality of life were
improved by consumption of a mushroom extract, Agaricus blazei Murril Kyowa, in
gynecological cancer patients undergoing chemotherapy. International Jornal of
Gynecological Cancer, v. 14, n. 4, p. 589-594, 2004.
BADOLATO, E., S., G.; DURAN, M. C. Risco de intoxicação por metanol pela
ingestão de bebidas alcoólicas. Revista de Psiquiatria Clínica índice, v. 27, n. 2,
2000.
BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P. Estresse oxidativo: relação
entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29,
n. 1, p. 113-123, 2006.
BARROS, L.; FALCÃO, S.; BAPTISTA, P.; FREIRE, C.; VILAS-BOAS, M.;
FERREIRA, C., F., R., I. Antioxidant activity of Agaricus sp. mushrooms by
chemical, biochemical and electrochemical assays, Food Chemistry, v. 111, p.
61-66, 2008.
BERNARDSHAW, S.; JOHNSON, E.; HETLAND, G. An extract of the mushroom
Agaricus blazei Murril administered orally protects against systemic Streptococcus
pneumoniae infection in mice. Scandinavian Journal of immunology, v. 62, p.
393-398, 2005.
BETA GLUCAN RESEARCH. Review year 2003: Beta glucan Research Papers,
Patents and Patent Application. Disponível em: <http://www.betaglucan.org>.
Acesso em: 23 de agosto de 2003.
BIANCHI, M. L; ANTUNES, L. M. G. Radicais Livres e os Principais Antioxidantes
da dieta. Revista de Nutrição, v.12, n. 2, p. 123-130, 1999.
32
BROWN, G. D; GORDON, S. A new receptor for β-glucans. Nature, v. 413, p. 36–
37, 2001.
CAMELINI, C. M.; MARASCHIN, M.; MENDONÇA, M. M.; ZUCCO, C.;
FERREIRA, A. G.; TAVARES, L. A. Structural characterization of β-glucans of
Agaricus brasiliensis in different stages of fruiting body maturity and their use in
nutraceutical products. Biotechnology Letters, v. 27, p. 1295-1299, 2005.
CHIARA, G.; HAMURO, J.; MAEDA, Y. Y.; ARAI, Y.; FUKUOKA, F. Fractionation
and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially
Lentinan, from Lentinus edodes (Berk.) Sing. (an edible mushroom). Cancer
Research, v. 30, p. 2776-2781,1970.
CHO, S. M.; JANG, K. Y.; PARK, J. S. Analyses of chemical constituints of
Agaricus blazei <http://www.mushworld.com>. Acesso em: 01 de agosto de
2008.
CLEARY, J. A.; GRAHAM, G. E.; HUSBAND, A. J. The effect of molecular weight
and β-1,6-linkages on priming of macrophage function in mice by (1,3)-β-D-glucan.
Immunology and Cell Biology, v. 77, p. 395-403, 1999.
COLAUTO, N., B.; DIAS, E., S.; GIMENES, M., A.; EIRA, A., F. Genetic
characterization of isolates of the basisiomycetes Agaricus blazei by RAPD.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, p. 131-133, 2002.
DELMANTO, R. D.; DE LIMA, P. L.; SUGUI, M. M.; DA EIRA, A. F.; SALVADORI,
D. M.; SPEIT, G.; RIBEIRO, L. R. Antimutagenic effect of Agaricus blazei Murrill
mushroom on the genotoxicity induced by cyclophosphamide. Mutation
Research, v. 1, n. 496, p. 15-21, 2001.
DUARTE-ALMEIDA, J. M. MAURÍCIO, J.; SANTOS, R. J.; GENOVESE, M. I.
Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistema B-caroteno)ácido linoléico e
método de seqüestro deradicais DPPH. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.
26, n. 2, p. 446-452, 2006.
33
HIROTANI, M.; HIROTANI, S.; YOSHIKAWA, T. Blazeispirol X and Y, two novel
carbon skeletal sterols from the cultured mycelia of the fungus Agaricus blazei.
Tetrahedron Letters, v. 41, p. 5107-5110, 2000a.
HIROTANI, M.; KANEKO, A.; ASADA, Y.; YOSHIKAWA, T. Biosynthesis of
blazeispirol A, an unprecedented skeleton from the cultured mycelia of the fungus
Agaricus blazei. Tetrahedron Letters, v. 41, p. 6101-6104, 2000b.
HIROTANI, M.; SAI, K.; HIROTANI, S.; YOSHIKAWA, T. Blazeispirols B, C, E and
F, des-A-ergostane-type compounds, from the cultured mycelia of the fungus
Agaricus blazei. Phytochemical, v. 59, p.571-577, 2002a.
HIROTANI, M.; SAI, K.; KANEKO, A.; YOSHIHISA, A.; YOSHIKAWA, T.
Biosynthetic studies on blazeispirane and protoblazeispirane derivates from the
cultured mycelia of the fungus Agaricus blazei. Tetrahedron Letters, v. 58, p.
10251-10257, 2002b.
HIROTANI, M.; MASUDA, M.; SUKEMORI, A.; HIROTANI S.; SATO, N.;
YOSHIKAWA, T. Agariblazeispirol C from the cultured mycelia of the fungus,
Agaricus blazei, and the chemical conversion of blazeispirol A. Tetrahedron
Letters, v. 61, p. 189-194, 2005.
ITO, H.; SHIMURA, K.; ITOH, H.; KAWADE, M. Antitumor effects of a new
polysaccharide-protein complex (ATOM) prepared from Agaricus blazei (Iwade
strain 101) “Himematsutake” and its mechanisms in tumor-bearing mice.
Anticancancer Research, v.17, p. 277-284, 1997.
JONG, C. S. Fungal cell wall glycans In: VANDAMME, E. J.; DE BAETS, S.;
STEINBÜCHEL, A. Biopolymers: Polysaccharides II – Polysaccharides from
eukaryotes.Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH., 2002. v. 6. p. 159-178. 636 p.
KER, Y. B.; CHEN, K. C.; CHYAU, C. C.; CHEN, C. C.; GUO, J. H.; HSIEH, C. L.;
WANG, H. E.; PENG, C. C.; CHANG, C. H.; PENG, R. Y. Antioxidant capability of
polysaccharides fractionated from submerge-cultured Agaricus blazei mycelia.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, p. 7052-7058, 2005.
34
KERRIGAN, R. W. Agaricus subrufescens, a cultivated edible and medicinal
mushroom and its synonyms. Mycologia, v. 97, p. 12-24, 2005.
KIM, Y. W.; KIM, K. H.; CHOI, H. J.; LEE, D. S. Anti-diabetic activity of β-glucans
and their enzymatically hydrolyzed oligosaccharides from Agaricus blazei.
Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 27, p. 483-487, 2005.
KIMURA, Y.; KIDO, T.; TAKAKU, T.; SUMIYOSHI, M.; BABA, K. Isolation of an
anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: its antitumor and
antimetastatic actions. Cancer Science, Tokyo, v. 95, n. 9, p. 758-64, 2004.
LIU, Y.; FUKUWATARI, Y.; OKUMURA, K.; TAKEDA, K.; ISHIBASHI, K, I.;
FURUKAWA, M.; OHNO, N.; MORI, K.; GAO, M.; MOTOI, M. Immunomodulating
activity of Agaricus brasiliensis KA21 mice and in human volunteers. eCam
advance, v. 10, n. 16, p. 1-5, 2007.
MENOLI, R. C. R. N.; MANTOVANI, M. S.; RIBEIRO, L. R.; SPEIT, G.; JORDAO,
B. Q.; Antimutagenic effects of the mushroom Agaricus blazei murril extracts on
v79 cells. Mutation Research, v. 496, p. 5-13, 2001.
MENSOR, L. L.; MENEZES, F, S.; LEITÃO, G. G.; REIS, A. S.; SANTOS, T. C.;
COUBE, C. S.; LEITÃO, S. G.; Screening of Brazilian plant extract for antioxidant
activity by use of the DPPH free radical method. Phytotherapy Research, v. 15,
p. 127-30, 2001.
MINATO, K.; MIZUNO, M.; KAWAKAMI, S.; TATSUOKA, S.; DEMPO, Y.;
TOKIMATO, K.; TSUCHIDA, H. Changes in immunomodulating activities and
content of antitumour polysaccharides during growth of two mushrooms, Lentinus
edodes (Berk..) Sing and Grifola frondosa (Dicks;Fr) S.F. Gray. International
Journal of Medicinal Mushrooms, v. 3, p. 1 - 7, 2001.
MIZUNO, T. The extraction and development of antitumor-active polysaccharides
from medicinal mushrooms in Japan (review). International Journal of Medicinal
Mushrooms, v.1, p. 9–29, 1999.
35
MIZUNO, T.; HAGAWARA, T.; NAKAMURA, T.; ITO, H.; SHIMURA, K.; SUMIYA,
T.; & ASAKURA, A. ASAKURA, A. Antitumor activity and some properties of
water-soluble polysaccharides from "Himematsutake", the fruiting body of Agaricus
blazei Murill. Agricultural of Biology and Chemical, v. 54, n. 11, p. 2889-2896,
1990a.
MIZUNO, T.; INAGAKI, R.; KANAO, T.; HAGIWARA, T.; NAKAMURA, T.; ITO, H.;
SHIMURA, K.; SUMIYA, T.; ASAKURA, A. Antitumor activity and some properties
of waterinsoluble polysaccharides from “Himematsutake”, the fruiting body of
Agaricus blazei Murill. Agricultural Biologycal Chemistry, v. 54, n. 11, p. 28972905, 1990b.
MOLYNEUX, P. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)
for
estimating
antioxidant
activity.
Songklanakarin
Journal
Science
Technologic, v. 26, n. 2, p. 211-219, 2004.
NAKAJIMA, A.; ISHIDA, T,; KOGA, M.; TAKEUCHI, T.; MAZDA, M.; TAKEUCHI,
M. Effect of hot water extract from Agaricus blazei Murril on antibody-producing
cells in mice. Internation Immunopharmacology, n. 2, p. 1205-1211, 2002.
NYLUND, J. E.; WALLANDER, H. Ergosterol analyses as a means of quantifying
mycorrhizal biomass. Methods in Microbiology, v. 23, p. 77-88, 1992.
OHNO, N.; FURUKAWA, M.; MIURA, N.N.; ADACHI, Y.; MOTOI, M. &
YADOMAE, T. Antitumor β–glucan from the cultured fruit body of A. blazei.
Biological Pharmaceutical Bulletin, v. 24, n. 7, p. 820-828, 2001.
OHNO, N.; HAYASHI, M.; IINO, K.; SUZUKI, I.; OIKAWA, S.; SATO, K.;
YADOMAE, T. Effect of glucans on the antitumor activity of Grifolan. Chemical
Pharmaceutical Bulletin, v. 34, 2149-2154, 1986.
OSHIMAN, K.; FUJIMIYA, Y.; EBINA, T.; SUZUKI, I.; NOJI, M. Orally administered
beta-1,6-D-polyglucose extracted from Agaricus blazei results in tumor regression
in tumor-bearing mice. Planta Medica, Stuttgart, v. 68, n. 7, p. 610-614. 2002.
36
SAITÔ, H.; OHKI, T.; YOSHIOKA, Y.; FUKUOKA, F. A 13C nuclear magnetic
resonance study of a gel-forming branched (1→3)-β-D-glucan from Pleurotus
ostreatus (fr.):determination of side-chains and conformation of the polymer-chain
in relation to gel-structure. FEBS Letters, v. 68, n.1, p. 15-18, 1977.
SHIBATA, C., K., R.; DEMIATE, I., M. Cultivo e análise da composição química do
Cogumelo do Sol (Agaricus blazei Murril). Ciência, biotecnologia e Saúde, v. 9,
n. 2, p. 21-32, 2003.
SHIMADA, K.; FUJIKAWA, K.; YAHARA, K.; NAKAMURA, T. Antioxidative
properties of Xanthan on the autoxidantiom of soybean oil in cycylodextrin
emulsion. Journal Agriculture and Food Chemistry, v. 40, 945-948, 1992.
SILVA, V., A.; ALMEIDA, E., G.; SOUSA, M., V., F.; DIAS, E., S. Microrganismos
presentes no composto pós-pasteurização para cultivo de Agaricus blazei
Murril. In: XIII Congresso dos Pós-Graduandos da UFLA, Lavras-MG. 2004.
SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C.
B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and
Agaricus
blazei
on
Aspergillus
nidulans
conidia.
Brazilian
Journal
of
Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.
TAKAHASHI, O., HIRAGA, K. Dose-response study of hemorrhagic death by
dietary butylated hydroxy toluene (BHT) in male rats. Toxicology and Applied
Pharmacology, New York, v. 43, p. 399-406, 1978.
TAKAKU, T.; KIMURA, Y.; OKUDA, H. Isolation of an antitumor compound from
Agaricus blazei Murill and its mechanism of action. Journal of Nutrition, v. 131,
p. 1409-1413, 2001.
TAKASHI, M.; HAGIWARA, T.; NAKAMURA, T.; ITO, H.; SHIMURA, K.; SUMIYA,
T.; ASAKURA, A. Antitumor activity and some properties of water-soluble
polysaccharides from “himematsutake” the fruiting body of Agaricus blazei Murril.
Agriculture Biology Chemical, v. 54, n. 11, p. 2889-2896, 1990.
37
WANG, Z.; CHEN, T.; GAO, Y.; BREUIL, C. & HIRATSUKA, Y. Biological
degradation of resin acids in wood chips by wood-inhabiting fungi. Applied and
Environmental Microbiology, v. 61, n. 1, p. 222-225, 1995.
WASSER, S. P.; DIDUK, M. Y.; AMAZONAS, M. A. L. A.; NEVO, E.; STAMETS,
P.; EIRA, A. F. Is a widely cultivated culinary-medicinal royal sun Agaricus (the
himematsutake mushroom) indeed Agaricus blazei Murril? International Journal
of Medicinal Mushrooms, v. 4, p. 267-290, 2002.
WITSCHI, H.; LOCK, S. Toxicity of butylated hydroxy toluene in mouse following
oral administration. Toxicology Shannon, v. 9, p. 137-46, 1978.
38
Capítulo 2
ATIVIDADE DE Agaricus brasiliensis NA MIGRAÇÃO CELULAR EM
PROCESSO INFLAMATÓRIO
RESUMO
Agaricus brasiliensis é um cogumelo nativo no Brasil, conhecido popularmente
como Cogumelo-do-Sol. Este fungo tem sido amplamente consumido em
diferentes partes do mundo, devido às suas propriedades terapêuticas. Entre as
atividades já relatadas a propriedade antiinflamatória carece de comprovação
científica, visando dar suporte ao uso deste cogumelo na promoção da saúde.
Neste sentido, o presente trabalho avaliou o efeito do extrato aquoso de A.
brasiliensis, colhido em duas fases de maturação (aberto e fechado), na migração
celular durante processos inflamatórios em ratos. Foi utilizada a linhagem ABL
ABL99/25, com basidiocarpo aberto e fechado. O extrato foi preparado utilizando
25 g do cogumelo em pó misturado em 500 mL de água destilada mantido em
banho-maria a 60ºC por 60 min. Os animais foram divididos em cinco grupos:
grupo controle tratados com salina, dois grupos tratados na dose de 55 mg/kg e
110 mg/kg de extrato do cogumelo aberto ou fechado com 11 animais em cada
grupo. O tratamento ocorreu por 18 dias. Após o 8° dia de tratamento foi realizada
a formação da bolsa de ar no tecido subcutâneo dos animais, decorridos 10 dias
foi injetado agente flogístico na bolsa de ar. Para a avaliação da migração celular
nos diferentes momentos do experimento a coleta de sangue foi realizada antes
do tratamento, no 8°, e 18° dias. A coleta do exsudato da bolsa de ar previamente
formada, também foi realizada ao final do experimento. Os animais tratados com
os extratos de A. brasiliensis, nas diferentes doses e fases de maturação do
basidiocarpo, não alteraram o número de leucócitos no sangue periférico após o
estímulo com carragenina (2%). Entretanto o extrato inibiu (p≤0,05) a migração
celular para o foco da lesão nas doses de 55 e 110 mg/kg para o basidiocarpo
fechado e 110 mg/kg para basidiocarpo aberto, comprovando maior atividade do
basidiocarpo fechado. Estes resultados indicam que o A. brasiliensis apresenta
importante atividade inibitória sobre a infiltração de leucócitos para o foco da
39
lesão, sugerindo uma possível atividade moduladora da resposta antiinflamatória
no modelo utilizado.
Palavras-chave: A. blazei, basidiomiceto, células sanguíneas, atividade biológica.
40
ABSTRACT
A. brasiliensis mushroom is a native Brazil, popularly known as mushroom-of-Sun.
This fungus has been widely consumed in different parts of the world, due to its
therapeutic properties. Among the activities already reported the ownership
antiinflammatory lacks scientific proof, to support use of this mushroom in
promoting health. Accordingly, the present study assessed the effect of aqueous
extract of A. brasiliensis, collected at different stages of maturity (open and
closed), in cell migration during inflammatory processes in mice. It was used to
line ABL99/25, with basidiocarp opened. The treatement was prepared using 25
grams of mushroom powder mixed in 500 ml of distilled water held in water bath at
60 º C for 60 min. The animals were divided into five groups: control group treated
with saline, two groups treated at a dose of 55 mg / kg of extract open or closed
and two groups treated with 110 mg / kg of extract open or closed with 11 animals
in each group. The treatment was for 18 days. After the 8 th day of treatment was
carried out the formation of exchange of air in the subcutaneous tissue of animals,
within 10 days was injected phlogistic agent in exchange of air. For the evaluation
of cell migration in the various moments of the trial the collection of blood was
performed before treatment, in 8, and 18 days, the collection of exudation was
also held at the end of the experiment. The animals treated with the extracts of A.
brasiliensis, in doses and different stages of maturation of the basidiocarp, did not
alter the number of leukocytes in peripheral blood after stimulation with
carrageenan (2%). However the extract inhibited (p≤0.05) cell migration to the
outbreak of the injury at doses of 55 and 110 mg/kg for basidiocarp closed and
110 mg/kg for basidiocarp open, showing increased activity of basidiocarp closed.
These results indicate that A. brasiliensis presents important inhibitory activity on
the infiltration of leukocytes to the outbreak of the injury, suggesting a possible
modulation response antiinflammatory activity in the model used.
Keywords: basidiomycets, leukocytes, antiinflammatory activity, exudation.
41
INTRODUÇÃO
A inflamação é um processo de defesa do organismo contra uma lesão
tecidual, causada por agentes físicos, químicos, ou biológicos. Neste processo,
células imunologicamente competentes migram para o local agredido para
destruir o agente invasor e remover substâncias irritantes. Apesar de necessário,
este processo de defesa pode ocasionar uma resposta excessiva, que pode
causar lesão tecidual progressiva (ZANINI; OGA,1994). Em tais casos, fármacos
antiinflamatórios ou imunossupressores podem ser necessários para modular o
processo antiinflamatório, diminuindo ou até mesmo inibindo a migração celular
para o local agredido. No entanto, tais fármacos exibem efeitos colaterais
indesejáveis
como
reações
cutâneas,
distúrbios
renais,
hepáticos
e
gastrointestinais (RANG et al., 2007).
Dentro deste contexto, a população tem grande interesse pelo uso de
substâncias naturais que possuem efeitos biológicos e que ofereceram menores
efeitos colaterais. Dessa maneira o interesse por produtos naturais com
propriedades medicinais vem aumentando ao longo dos anos, e muitos destes
produtos têm sido frequentemente utilizados na dieta alimentar, particularmente
os cogumelos, incluindo o Agaricus blazei Murrill (LOHAMN et al., 2001). O
Agaricus brasiliensis Wasser et al. (=A. blazei Murrill ss. Heinemann) (WASSER et
al., 2002), considerado A. subrufescens Peck por Kerrigan (2005) é um
Basidiomiceto, freqüentemente utilizado como alimento ou na forma de chás, que
tem sido alvo de vários estudos em relação a sua atividade antitumoral (BRAGA
et al., 1998; KAWAGISHI et al., 1990; MIZUNO et al., 1990), imunomoduladora
(NAKAJIMA et al., 2002; AHN et al., 2004), antidiabética (KIM et al., 2005),
antiinfecciosa (BERNARDSHAW et al., 2005), anticarcinogênica (ITOH et al.,
1997; KIMURA et al., 2004; MIZUNO et al., 1990; OSHIMAN et al., 2002),
antimutagênica (AHN et al., 2004; MENOLI et al., 2001; SOUZA-PACCOLA et al.,
2004), antimetastática (KIMURA, 2004) e antioxidante (KER et al., 2005).
Entre os constituintes químicos presentes no A. brasiliensis destacam-se
os polissacarídeos e as glicoproteínas, ambos presentes principalmente na
parede celular (ASPINALL, 1982). O desenvolvimento do corpo frutífero do A.
42
brasiliensis pode influenciar na composição química e estrutura de seus
polissacarídeos. De maneira geral, a maior parte dos polissacarídeos presentes
são β-D-(1-6) glucanas; já a quantidade de glucanas β-D-(1-3) é pequena em
corpos frutíferos imaturos (basidiocarpo fechado) e aumenta durante sua
maturação (basidiocarpo aberto) (CAMELINI et al., 2005). A partir do extrato do
corpo frutífero verificou-se também a presença de cadeias β-D-(1-4) nos
polissacarídeos (KAWAGISHI et al., 1990; MIZUNO et al., 1990 a,b; MIZUNO et
al., 1995; ITO et al., 1997; MIZUNO et al., 1999a,b; GONZAGA et al., 2005). As βD-(1-3) glucanas são relatadas como importantes na atividade biológica do A.
brasiliensis (DONG et al., 2002), desta forma a fase de desenvolvimento do
basidiocarpo pode afetar a atividade biológica do cogumelo, já que basidiocarpos
abertos possuem maior quantidade de β-D-(1-3) glucanas. Por outro lado,
basidiocarpos fechados são mais valorizados no mercado devido a facilidade de
manuseio e os supostos potencializadores da atividade biológica (CAMELINI et
al., 2005; BELLINI et al., 2003).
Segundo Ereno (2004) as propriedades farmacológicas do A. brasiliensis
ainda estão sendo estudadas para a comprovação dos relatos populares sobre os
benefícios proporcionados pela utilização deste cogumelo. Assim, apesar da
quantidade de informações presentes na literatura, não foram encontrados relatos
sobre a atividade do A. brasiliensis na modulação da resposta inflamatória sobre a
migração celular, e nem sobre o efeito da fase de desenvolvimento do
basidiocarpo sobre esta atividade. A atividade modulatória de produtos naturais é
comumente realizada através da utilização da carragenina, um polissacarídeo
polissulfatado, cujo efeito fisiológico inclui a indução de um processo inflamatório
(HAMBLETON et al., 1989; SATO, et al., 1980; SEDGWICH et al., 1986).
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar em ratos, o efeito do tratamento
com extrato aquoso de A. brasiliensis, com basidiocarpo aberto e fechado, sobre
a migração celular ocorrida em processos inflamatórios induzido por carragenina.
43
Preparação do extrato aquoso de A. brasiliensis
A. brasiliensis, linhagem ABL99/25, com basidiocarpo aberto e fechado foi
obtido da Micoteca do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade
Paranaense – Campus Sede – Umuarama – PR. O corpo de frutificação do A.
brasiliensis por compostagem foi previamente desidratado em estufa com
circulação de ar a 60 oC, moído em moinho de facas e armazenado a -70 oC.
O extrato foi preparado pela mistura do pó desidratado de A. brasiliensis
(25 g à água destilada (500 mL) e mantido em banho-maria a 60 ºC por 60 min
(BARBISAN, 2002). Em seguida, a mistura foi filtrada (papel filtro Qualy, 80 g/m2,
espessura 205 µm, porosidade 14 µm) e armazenado em alíquotas de 10 mL em
freezer a -70 °C.
Tratamento dos ratos com o extrato aquoso de A. brasiliensis
Foram utilizados ratos Wistar machos com quatro meses de idade, com
massa média de 207 g ± 20 g, provenientes do Biotério da Universidade
Paranaense – UNIPAR – Umuarama -PR. Os animais foram adaptados ao local
do experimento por sete dias, e mantidos em caixas plásticas convencionais a 22
°C ± 2 °C, no biotério setorial do Laboratório de Farmacologia, com ciclo de 12 h
claro/escuro e com livre acesso à ração e água. Os animais foram divididos em
cinco grupos de 11 animais: grupo controle (Ctl), tratado com solução salina 0,9%
e os grupos experimentais A55, F55, A110 e F110 tratados na dose de 55 e 110
mg/kg de extrato aberto ou fechado, respectivamente. Durante 18 dias foi
administrado diariamente por gavagem 1 mL dos extratos ou da solução salina. A
massa corpórea dos animais foi registrada antes e após os tratamentos, conforme
Fig. 1.
44
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
-Início dos
- Indução da bolsa
- Reforço
- Aplicação do
tratamentos
de ar (20 mL)
da bolsa de
agente
ar (20 mL)
flogístico
- Coleta de sangue
Coleta de
sangue e
exsudato
Figura 1. Esquema do protocolo de indução e acompanhamento da resposta
inflamatória em ratos.
Resposta inflamatória no tecido subcutâneo
A resposta inflamatória no tecido subcutâneo foi desenvolvida conforme
descrito por Edward et al. (1981). No 8º dia de tratamento foram injetados 20 mL
de ar estéril no tecido subcutâneo do dorso depilado dos animais, formando uma
bolsa de ar para indução do processo inflamatório. No 15º dia, a bolsa de ar foi
reforçada com a injeção de mais 20 mL de ar estéril.
A indução da migração celular foi realizada no 18º de tratamento. Para tanto
nos animais, previamente anestesiados com Tiopental 50 mg/kg, foi injetado na
bolsa de ar 1,0 mL de solução aquosa de carragenina 2%. Após seis horas, os
animais foram novamente anestesiados e sacrificados por dose letal de Tiopental
(150 mg/kg). A bolsa de ar foi aberta com auxílio de bisturi e o exsudato foi lavado
com 5 mL de tampão fosfato-salina (PBS) pH 7,2 (NaCl = 137 mmol, KCl = 2,7
mmol e tampão fosfato = 10 mmol) e recolhido com auxílio de pipeta Pasteur. O
exsudato foi centrifugado a 177 g por 10 min, sendo o sobrenadante desprezado.
O precipitado foi ressuspenso em 1,0 mL de PBS e realizada a contagem total de
leucócitos.
45
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Envolvendo Experimentação Animal (CEPEEA) da Universidade Paranaense –
Umuarama – PR.
Análises de sangue e exsudato
Para avaliar a resposta do tratamento com os extratos de A. brasiliensis
sobre a migração celular foi realizado a contagem do número de leucócitos totais
presentes no sangue circulante antes e após o tratamento com extratos de A.
brasiliensis (antes da formação da bolsa de ar). Da mesma forma, com a intenção
de avaliar se, sob estímulo inflamatório (injeção de solução aquosa de
Carragenina 2%), o tratamento experimental interferiria com a capacidade de
mobilização das células brancas, dos compartimentos de reserva para a
circulação, foi determinado o número de leucócitos totais presentes no sangue
circulante no 18° dia de tratamento 6 h após a injeção do agente flogístico
(carragenina 2%) na bolsa de ar previamente formada. A coleta de sangue foi
realizada do plexo orbital, local mais acessível para coleta em roedores, com
auxílio de capilares de vidro embebidos em EDTA (10%), para tanto os animais
foram anestesiados com Tiopental (50 mg/kg).
A contagem de leucócitos totais foi realizada em câmara de Neubauer,
utilizando-se líquido de Turk 1:20 (LIMA et al., 1997). Para avaliar o tipo celular
predominante no sangue periférico, após a indução do estímulo inflamatório no
18° dia de tratamento 6 h após a injeção do agente flogístico (carragenina 2%), foi
realizada a contagem diferencial das células do sangue circulante. O número
diferencial de leucócitos foi determinado com a preparação de extensões
sangüíneas preparadas após a coleta do sangue e coradas pelo método clássico
de coloração de May Grunwald-Giemsa (ROSENFELD, 1947).
Análise estatística
Os resultados foram expressos como a média ± e.p.m. (erro padrão da
média). A significância estatística foi determinada através do teste “t” de Student e
foram considerados estatisticamente significantes valores de p≤0,05. Os gráficos
46
foram elaborados com o programa Prisma for Windows versão 4.0 (GraphPad
Software, San Diego, CAN, USA).
O período de tratamento adotado no presente estudo foi determinado com
base na cinética da produção e maturação para a série granulocítica, pois neste
estudo foi enfocada a capacidade da migração celular após o tratamento com A.
brasiliensis em diferentes fases de maturação do basidiocarpo onde os
polimorfonucleares são participantes do processo. Os granulócitos humanos são
produzidos na medula óssea e passam por diferentes etapas de maturação que
se prolongam por cerca de 14 dias. A partir de então, já maduros, os
polimorfonucleares são mobilizados para o sangue periférico. Nesta localização
circulam por 6 a 7 h, e migram, subseqüentemente, para tecidos adjacentes, onde
permanecem por aproximadamente dois dias e em seguida, são fagocitados por
células competentes no interstício (macrófagos e células dendríticas) (RYAN,
2001a,b).
Os animais dos diferentes grupos experimentais não mostraram variações
significativas na medida da massa corporal após 18 dias de tratamento (dados
não apresentados). É importante considerar que os tratamentos não provocaram
danos aparentes aos animais, uma vez que não foram verificados prejuízos no
ganho de massa corporal e/ou alterações comportamentais.
A realização do leucograma mostrou que o número total de leucócitos entre
o início dos experimentos e no 8º dia de tratamento não apresentou variações
significativas (Tabela 1). Este dado é positivo, pois, demonstra que o extrato
aquoso de A. brasiliensis não provoca alterações na produção nem na migração
de células sanguíneas. Apesar de haver aumento do valor médio dos leucócitos,
não houve diferença significativa. Este pequeno aumento ocorreu devido à
variabilidade do número de leucócitos totais que são diferentes de um animal para
outro.
47
Tabela. 1 - Efeito do tratamento com extrato de basidiocarpos aberto e fechado
de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário antes do estímulo inflamatório. (n=11)
Tratamento
Número células
(mm3)
Ctl(AT) Controle no dia zero, antes do início do tratamento
Ctl(DT) Controle após 8 dias de tratamento com solução
5475 ± 1131
6850 ± 887,6 NS
salina
A55
Após 8 dias de tratamento com extrato de
7357 ± 1153 NS
basidiocarpo aberto (55 mg/kg)
A110
8036 ± 1202 NS
basidiocarpo aberto (110 mg/kg)
F55
7421 ± 1105 NS
basidiocarpo fechado (55 mg/kg)
F110
8264 ± 1352 NS
basidiocarpo fechado (110 mg/kg)
Legenda: NS= Não significativo em relação ao Ctl(AT) Controle antes do
tratamento; Ctl(DP) Controle depois do tratamento.
Na Figura 2 são apresentados os resultados dos leucócitos circulantes
antes e após o estímulo inflamatório. Pode-se observar que os animais tratados
com os extratos de A. brasiliensis, nas diferentes doses e fases de maturação do
basidiocarpo, não alteraram o número de leucócitos no sangue periférico após o
estímulo com carragenina (2%), quando comparados aos valores basais (sem
estímulo). Entretanto, o grupo controle tratado apenas com solução salina,
apresentou um aumento significativo de leucócitos em decorrência da resposta
inflamatória induzida pela carragenina. Vale ressaltar que o incremento no
48
número de leucócitos circulantes, predominantemente de polimorfonucleares
(PMN), é evento característico em respostas inflamatórias agudas induzidas por
diferentes agentes flogísticos (SASSON et al., 1998; ORDENEZ et al., 2000).
Apesar de haver uma tendência no aumento dos leucócitos circulantes (Figura 2)
não houve diferença significativa. Mais uma vez, esse pequeno aumento é
decorrente da variabilidade do número total de leucócitos que são diferentes entre
os animais. Este dado ressalta o efeito benéfico da utilização do cogumelo A.
brasiliensis em processos inflamatórios, uma vez que a resposta celular
exacerbada pode provocar prejuízos severos e irreversíveis ao indivíduo (ZANINI;
OGA,1994).
Dia 0 – Antes do estímulo inflamatório
12500
*
10000
7500
5000
2500
0
11
F
55
F
0
11
A
55
A
(A
EI
C
tl
S
al
in
a
tl
(A
C
)
0
T)
Leucócitos totais (mm3)
Dia 18 - Após o estímulo inflamatório
Figura. 2 - Efeitos do tratamento com extrato de basidicarpos aberto e fechado de
A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário total. *Diferença significativa pelo teste t
de Student. Ctl(AT)= Controle antes do tratamento; Ctl(AEI)= Controle tratado
com salina após o estímulo inflamatório.
A Tabela 2 apresenta os resultados da análise diferencial dos leucócitos
antes e após o estímulo inflamatório. A análise diferencial de leucócitos mostrou
que, após a indução da resposta inflamatória houve aumento de leucócitos
segmentados no sangue periférico, tanto no grupo controle quanto nos grupos
49
experimentais (Tabela 2). Esse resultado reflete a maior mobilização de leucócitos
segmentados nas fases finais de maturação na medula óssea. Interessantemente
não foi verificado comprometimento na produção dessas células, pois em nenhum
momento foi visualizada a presença de células imaturas (bastonetes, blastos).
Este dado demonstra que o aumento de leucócitos segmentados observado em
ambos os grupos (tratados e não tratados) foi em decorrência da resposta
inflamatória aguda induzida pela carragenina, evento característico. E que os
extratos de A. brasiliensis não exercem interferência na produção e maturação
dessas células na medula óssea. Da mesma forma, não foram observadas
variações significativas no número de células mononucleares após 18 dias de
tratamento (dados não mostrados), pois, o mecanismo de defesa mediado pelas
células mononucleares é evento tardio presentes em processos inflamatório
crônico, diferente do protocolo utilizado nesse experimento (AL-SARIREH;
EREMIN, 2000).
Tabela 2. Análise diferencial dos leucócitos demonstrando o efeito do tratamento
com A. brasiliensis sobre o perfil dos polimorfonucleares antes e após estímulo
inflamatório com carragenina em ratos.
POLIMORFONUCLEARES
Tratamento
Número
células
(mm3)
Ctl(AT)
Controle no dia zero, antes do início do tratamento
Ctl(AEI) Controle ao final do experimento com solução salina,
1876 ± 344
3326 ± 660*
após o estímulo inflamatório
A55
Final do experimento com extrato de basidiocarpo
2871 ± 387*
aberto (55 mg/kg)
A110
aberto (110 mg/kg)
3513 ±497**
50
F55
F110
4251 ±
fechado (55 mg/kg)
393***
4112 ± 576**
fechado (110 mg/kg)
Legenda: Ctl(AT) Controle antes do tratamento; Ctl(AEI)=Controle após estímulo
inflamatório.
Os dados apresentados na Figura 3 mostram a variação do influxo
leucocitário para o tecido subcutâneo inflamado em animais tratados com o
extrato aquoso de A. brasiliensis nas diferentes doses e estágio de
desenvolvimento do basidiocarpo em relação ao controle. Pode-se observar que
em relação ao grupo controle, os animais tratados com extrato de A. brasiliensis
apresentaram redução (p≤0,05) na migração celular, enquanto que os grupos
tratados com extrato com basidiocarpo aberto na dose de 55 mg/Kg não
apresentaram redução. Os valores obtidos demonstraram que o tratamento com
A. brasiliensis alterou a capacidade de migração de leucócitos para o foco da
lesão, uma vez que o número total de células foi menor (p≤0,05) nos animais
tratados com os extratos de A. brasiliensis em relação aos animais controle
(tratados com salina). Esse dado reforça mais uma vez a importância da utilização
do A. brasiliensis nos processos inflamatórios, pois além de atenuar a migração
leucocitária dos compartimentos de reserva para o espaço vascular (corrente
circulatória) os extratos de A. brasiliensis também demonstraram capacidade
inibitória sobre a migração celular para o local da lesão, não permitindo que a
resposta celular exacerbada ofereça prejuízos ao indivíduo.
Os constituintes químicos majoritários do A. brasiliensis (glucanas) podem
ser diferentes segundo a fase de maturação do cogumelo, refletindo assim em
sua atividade biológica. Sugere-se que o princípio ativo responsável pela inibição
da mobilização celular do A. brasiliensis encontra-se em maior quantidade nas
fases imaturas do cogumelo (basidiocarpo fechado). Fato que justifica a razão do
51
extrato com basidiocarpo aberto em sua menor concentração (55 mg/kg) não
15000
10000
*
*
5000
*
0
11
F
55
F
0
11
A
C
tl
(s
A
55
0
al
in
a)
Células exsudato (mm3)
provocar inibição da migração celular após indução da resposta inflamatória.
Figura 3 - Efeitos dos tratamentos com extratos de A. brasiliensis sobre a
mobilização de leucócitos para o tecido subcutâneo inflamado (modelo da bolsa
de ar). *Diferença significativa pelo teste t de Student.
O tratamento com A. brasiliensis acarretou uma diminuição significativa da
migração dos leucócitos para o exsudato em relação ao controle (salina), assim,
os resultados obtidos neste estudo sugerem uma atividade moduladora na
resposta inflamatória por atenuar a migração celular para o foco da lesão,
entretanto, a afirmativa de uma cabal resposta antiinflamatória não pode ser
confirmada com exatidão, pois outros eventos presentes nos processos
inflamatórios (dor, formação de secreção, edema) necessitariam ser avaliados
para comprovar tal atividade. Neste sentido, a participação de moléculas de
adesão no efeito observado pode ser postulada, pois drogas antiinflamatórias
clássicas (glicocorticóides) reduzem a migração celular para o foco da inflamação
interferindo com a externalização ou a expressão destas moléculas (VINEGAR et
al., 1979). Da mesma forma, um provável efeito inibitório sobre a vasodilatação
mediada por prostaglandinas poderia contribuir para este efeito, pois os extratos
52
empregados neste estudo apresentaram uma atividade de maneira similar à
observada por Vigil et al. (2008) com a utilização da indometacina, um clássico
inibidor da síntese de prostaglandinas.
Pesquisas adicionais se mostram necessárias para o melhor entendimento
dos processos envolvidos na resposta inflamatória em ratos tratados com extratos
de A. brasiliensis. Estudos que envolvam diferentes etapas do tratamento, além
dos mediadores inflamatórios envolvidos na mobilização e resposta celular
observada seriam importantes para o esclarecimento do papel dos compostos
presentes no extrato aquoso de A. brasiliensis. Desta forma, o entendimento dos
mecanismos envolvidos na resposta imunológica de animais tratados com extrato
aquoso de A. brasiliensis se mostra de grande importância e indispensável para a
garantia da eficácia e segurança do uso do cogumelo na terapêutica.
CONCLUSÃO
O presente trabalho sugere que o extrato aquoso obtido de A. brasiliensis
apresenta um ou mais constituintes químicos capazes de modular significamente
a resposta inflamatória inibindo o influxo de leucócitos para o sítio da lesão, sem
mostrar sinais agudos e subcrônicos de toxicidade. A inibição da migração celular
para o foco da lesão foi diferente em fase da maturação do basidiocarpo, sendo
que a fase imatura apresentou melhores resultados. Assim, estudos posteriores
podem confirmar a atividade aqui relatada possibilitando o uso seguro e eficaz
deste cogumelo no tratamento de processos inflamatórios, evidenciando, inclusive
os mecanismos moleculares envolvidos nesta resposta.
AGRADECIMENTOS
53
AHN, W. S.; KIM, D. J.; CHAE, G. T.; LEE, J. M.; BAES, S. M.; SINS, J. I.; KIM, Y.
W.; NAMKOONG, S. E.; LEE, I. P. Natural killer cell activity and quality of life were
improved by consumption of a mushroom extract, Agaricus blazei Murril Kyowa, in
gynecological cancer patients undergoing chemotherapy. International jornal of
Gynecological Cancer, v. 14, n. 4, p. 589-594, 2004.
AL-SARIREH, B. & EREMIN, O. Tumor-associated macrophages (TAMs):
Disordered function, immune suppression and progressive tumor growth. Journal
of the RoyalCollege of Surgeons of Edinburg, v. 45, n. 1, p. 1-16, Feb. 2000.
ASPINALL, G. O. General introduction In: The polysaccharides. New York:
Academic Press, Inc., 1982. v. 1. p. 1-18.
BARBISAN, L.F.; MIYAMTO, M.; SCOLASTICI, C.; SALVADORI, D. M. F.;
RIBEIRO, R. L. R.; EIRA, A. F.; CAMARGO, J. L. V. Influence of aqueous extract
of Agaricus blazei on rat liver toxicity induced by different doses of
diethylnitrosamine. Journal of Ethnopharmacology, n.83, p. 25-32, 2002.
BELLINI, M.,F.; GIACOMINI, N. L.; EIRA, A. F; RIBEIRO, L. R.; MANTOVANI, M.
S. Anticlastogenic effect of aqueous extracts of Agaricus blazei on CHO-k1 cells,
studying different developmental phases of the mushroom. Toxicology in Vitro, v.
17, p. 465–469, 2003.
BERNARDSHAW, S.; JOHNSON, E.; HETLAND, G. An extract of the mushroom
Agaricus blazei Murril administered orally protects against systemic Streptococcus
pneumoniae infection in mice. Scandinavian Journal of immunology, v. 62, p.
393-398, 2005.
CAMELINI, C. M.; MARASCHIN, M.; MENDONÇA, M. M.; ZUCCO, C.;
FERREIRA, A. G.; TAVARES, L. A. Structural characterization of W-glucans of
Agaricus brasiliensis in different stages of fruiting body maturity and their use in
nutraceutical products. Biotechnology Letters, v. 27, p. 1295-1299, 2005.
DELMANTO, R. D.; DE LIMA, P. L. A.; SUGUIA, M. M.; SALVADORI, D. M. F.; DA
EIRA, A. F.; SPEIT, G.; RIBEIRO, L.R. Antimutagenic effect of Agaricus blazei
Murril mushroom on the genotoxicity induced by vyvlophosphamide.Mutation, n.
496, p. 15-21, 2001.
EDWARDS, J. C.; SEDWICK, A. D.; WILLOUGHBY, D. A. The formation of a
structure with the features of synovial lining by subcutaneous injection of air: in
vivo tissue culture system. Journal Pathology, v.134, n. 2, p. 147-156, 1981.
54
ERENO, D. Pequenos e poderosos. Pesquisa Fapesp, v. 100, p. 138-141, 2004
GONZAGA, M. L. C.; RICARDO, N. M. P. S.; HEATLEY, F.; SOARES, S. A.
Isolation and characterization of polysaccharides from Agaricus blazei Murill.
Carbohydrat Polymers, v. 60, p. 43-49, 2005.
HAMBLETON, P.; MILLER, P. Studies on carrageenan air pouch inflammation in
the rat. Brazilian of Journal Pathology , v. 70, p. 425-433,1989.
ITO, H.; SHIMURA, K.; ITOH, H.; KAWADE, M. Antitumor effects of a new
polysaccharide-protein complex (ATOM) prepared from Agaricus blazei (Iwade
strain 101) “Himematsutake” and its mechanisms in tumor-bearing mice.
Anticancancer Research, v.17, p. 277-284, 1997.
KAWAGISHI, H.; INAGAKI, R.; KANAO, T.; MIZUNO, T. Fractionation and
antitumor activity of the water-insoluble residue of Agaricus blazei fruiting bodies.
Carbohydrat Research, v. 186, p. 267-273, 1990.
KER, Y. B.; CHEN, K. C.; CHYAU, C. C.; CHEN, C. C.; GUO, J. H.; HSIEH, C. L.;
WANG, H. E.; PENG, C. C.; CHANG, C. H.; PENG, R. Y. Antioxidant capability of
polysaccharides fractionated from submerge-cultured Agaricus blazei mycelia.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 53, p. 7052-7058, 2005.
KERRIGAN, R. W. Agaricus subrufescens, a cultivated edible and medicinal
mushroom and its synonyms. Mycologia, v. 97, p. 12-24, 2005.
KIM, Y. W.; KIM, K. H.; CHOI, H. J.; LEE, D. S. Anti-diabetic activity of β-glucans
and their enzymatically hydrolyzed oligosaccharides from Agaricus blazei.
Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 27, p. 483-487, 2005.
KIMURA, Y.; KIDO, T.; TAKAKU, T.; SUMIYOSHI, M.; BABA, K. Isolation of an
anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: its antitumor and
antimetastatic actions. Cancer Science, Tokyo, v. 95, n. 9, p. 758-64, 2004.
LIMA, A. O.; SOARES, J. B.; GRECO, J. B.; GALIZZI, J.; CANÇADO, J. R.
Métodos de laboratório aplicados à clínica. 5a ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1997.
LOHMAN, P. H. M.; GENTILE, J. M.; GENTILE, G.; FERGUSON, L. R.
Antimutagenesis /anticarcinogenesis 2001: screening, methods and biomarkers.
Mutation Research, n. 496, p.1-4, 2001.
MENOLI, R. C. R. N.; MANTOVANI, M. S.; RIBEIRO, L. R.; SPEIT, G.; JORDAO,
B. Q.; Antimutagenic effects of the mushroom Agaricus blazei murril extracts on
v79 cells. Mutation Research, v. 496, p. 5-13, 2001.
MIZUNO, T. Bioactive biomolecules of mushroom: food function and medicinal
utilization. Food Reviews International, v. 11, p.7-21, 1995.
MIZUNO, T.; HAGIWARA, T.; NAKAMURA, T.; ITO, H.; SHIMURA, K.; SUMIYA,
T.; ASAKURA, A. Antitumor activity and some properties of water-soluble
55
polysaccharides from “Himematsutake”, the fruiting body of Agaricus blazei Murill.
Agricultural and Biological Chemistry, v. 54, p. 2889-2896, 1990a.
MIZUNO, T.; INAGAKI, R.; KANAO, T.; HAGIWARA, T.; NAKAMURA, T.; ITO, H.;
SHIMURA, K.; SUMIYA, T.; ASAKURA, A. Antitumor activity and some properties
of water-insoluble hetero-glycans from “Himematsutake”, the fruiting body of
Agaricus blazei Murill. Agricultural and Biological Chemistry, v.54, p. 28972905, 1990b.
MIZUNO, M.; MINATO, K.; ITO, H.; KAWADE, M.; TERAI, H.; TSUCHIDA H. Antitumor polysaccharide from the mycelium of liquid cultured Agaricus blazei Mill.
Biochemistry e Molecular Biology International, v. 47, n. 4, p. 707-714, 1999a.
NAKAJIMA, A.; ISHIDA, T,; KOGA, M.; TAKEUCHI, T.; MAZDA, M.; TAKEUCHI,
M. Effect of hot water extract from Agaricus blazei Murril on antibody-producing
cells in mice. Internation Immunopharmacology, n. 2, p. 1205-1211, 2002.
ORDONEZ, C. L.; SHAUGHNESSY, T. E.; MATTHAY, M. A.; FAHY, J. V.
Incresased neutrophil numbers and IL-8 levels in airway secreations in acute
severe asthma. Americam Journal Respiration. Crit. Care. Med., v. 161, p.
1185-1190, 2000.
OSHIMAN, K.; FUJIMIYA, Y.; EBINA, T.; SUZUKI, I.; NOJI, M. Orally administered
beta-1,6-D-polyglucose extracted from Agaricus blazei results in tumor regression
in tumor-bearing mice. Planta Medica, Stuttgart, v. 68, n. 7, p. 610-614, 2002.
RANG, H. P.; DALE, M. M.; RITLER, J. M.; FLOWER, R. J. Rang & Dale
Farmacologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007, p. 232-233.
ROSENFELD, G. Método rápido de coloração de esfregaços de sangue: noções
básicas sobre corantes pancrômicos e estudo de diversos fatores. Memórias do
Instituto Butantan, v. 20, p. 315-328, 1947.
RYAN, D. H. Examination of the blood. In: BUTLER, E.; LICHTMAN, M. A.;
COLLER, B. S.; KIPPS, T. J.; SELIGSOHN, V. Eds. Williams Hematology, 6th ed.,
Nova York: McGraw-Hill, 2001. p. 15-52a.
RYAN, D. H. Examination of the marrow. In: BUTLERM E.;LICHTMAN, M.A.;
COLLER, B. S.; KIPPS, T. J.; SELIGSOHN, V. Eds. Williams Hematology, 6th ed.,
Nova York: McGraw-Hill, 2001. p. 52-86b.
SASSON, Y.; ZELTER, D.; ROGOWSKI, O.; KASSIRER, M.; MAHARSHAK, N.;
NISSENKORN, A.; LEIBOVITZ, E.; HALPERIN, P.; SHARVIT, D.; SORKINE, P.;
ARBER, N.; BERLINER, S. Neutrophilia of infection/inflammation: are we really
dealing with “inflamed” leukocytes? Journal of Medical, v. 29, n.3/4, p. 217-229,
1998.
SATO, H.; HASHIMOTO, M.; SUGIO, K.; OHUCHI, K.; TSURUFUJI, S.
Comparative study between steroidal and non-esteroidal anti-inflammatory drugs
on the mode of their action on vascular permeability in rat carrageenan air pouch
inflammation. Journal Pharmacobiodyn, v. 3, p. 345-352, 1980.
56
SEDGWICH, A. D.; LEES, P.; A. Comparison of air pouch sponge and pleurisy
models of acute carrageenan inflammation in the rat. Agents Actions, v., 18, p.
439-446, 1986.
SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C.
B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and
Agaricus blazei on Aspergillus nidulans conidia. Brazilian Journal of
Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.
VIGIL, S., V., G.; LIZ, R. D.; MEDEIROS, Y., S.; FRODE, T., S. Efficacy of
tacrolimus in inhibiting inflammation caused by carrageenan in a murine of air
pouch. Transplant immunology, v. 19, p. 25-29, 2008.
VINEGAR, R.; TRUAX, J. F.; SELPH, J. L.; JOHNSTON, P. R. Antagonism of pain
and hyperalgesia. Anti-inflammatory Drugs. In: VANE, J. R.; FERREIRA, S.H.
(Ed.). Handbook of Experimental Pharmacology, Berlin: Springer Verlag, 50, 2,
208–222, 1979.
ZANINI, A.C.; OGA, S. Farmacologia aplicada. 5.ed. São Paulo: Atheneu, 1994.
p.161-162.
WASSER, S. P.; DIDUK, M. Y.; AMAZONAS, M. A. L. A.; NEVO, E.; STAMETS,
P.; EIRA, A. F. Is a widely cultivated culinary-medicinal royal sun Agaricus (the
himematsutake mushroom) indeed Agaricus blazei Murril? International journal
Medicinal of Mushrooms, v. 4, p. 267-290, 2002.
57
CAPÍTULO 3
ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE BASIDIOCARPOS DE Agaricus brasiliensis
EM DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO
RESUMO
O fungo Agaricus brasiliensis é um Basidiomiceto estudado em relação às suas
substâncias imunomoduladoras e antitumorais. O objetivo deste trabalho foi verificar a
atividade antineoplásica in vivo de Agaricus brasiliensis, em diferentes estágios de
maturação do basidiocarpo, em camundongos implantados com células de Sarcoma 180.
Após sete dias da implantação das células tumorais, os camundongos foram tratados via
oral, diariamente, no grupo um, com solução salina 0,18% (controle), no grupo dois, com
extrato de basidiocarpo com píleo fechado e no grupo três, com extrato de basidiocarpo
com píleo aberto. Após 30 dias do início do tratamento os animais sofreram eutanásia,
sendo o baço utilizado para determinação do índice esplênico e o tamanho da massa
tumoral mensurada. Concluiu-se que não há diferença significativa de inibição do
crescimento tumoral em função da maturação do basidiocarpo para a linhagem de Agaricus
brasiliensis, sendo a atividade antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos de 89,22%.
Palavras chave: corpo de frutificação, princípio ativo, antitumor, extrato fúngico.
58
ABSTRACT
The fungus Agaricus brasiliensis is a Basidiomycete studied because of its
immunomodulation and/or antitumor substances. The objective of this research was to
verify the antineoplasic activity in vivo of Agaricus brasiliensis in different basidiocarp
maturation phases on mice implanted with Sarcoma 180 cells. Sarcoma cells were
implanted in Swiss mice and after seven days mice were divided in three groups. Control
group was treated with saline solution, a second group was treated with opened basidiocarp
extract solution and a third group was treated with closed basidiocarp extract solution.
After 30 days of being daily orally treated with these three solutions all animals suffered
euthanasia. It was determined the esplenic rate of the spleen and measured the volume of
the tumor size. It was concluded that there is no significant differences of the tumor growth
inhibition in function of the different basidiocarp maturation phases for the Agaricus
brasiliensis strain, being the in vivo basidiocarp antineoplasic activity average of 89.22%.
Key words: Agaricus blazei, basidiome, active principle, antitumor, fungus extract.
59
INTRODUÇÃO
Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann) (25), que é A.
subrufescens Peck segundo (10), é um Basidiomiceto que tem sido alvo de vários estudos
em relação às suas substâncias antitumorais (2, 9, 16). Estudos demonstraram que a
utilização do extrato aquoso do basidiocarpo de Agaricus blazei promoveu a indução da
produção de células citotóxicas específicas, como linfócitos T e natural killer, bem como
interferon-gama, com conseqüente inibição do crescimento do tumor em roedores (22, 27).
Menoli et al. (14) relataram a redução da freqüência micronuclear na presença do extrato
aquoso do A. blazei e Rodrigues et al. (21) relataram a ação bioantimutagênica do fungo,
sugerindo uma ação sobre um ou mais sistemas de reparo de danos do DNA. Liu et al. (12)
realizaram estudo sobre a atividade imunoestimulatória de extrato do corpo de frutificação
de A. brasiliensis em voluntários humanos e verificaram ação estimulatória sobre o sistema
imunológico nos pacientes, o que evidencia que os modelos de atividade antineoplásica
utilizados em roedores são adequados para este fungo.
A capacidade antineoplásica do A. brasiliensis, para o modelo de células tumorais
de Sarcoma 180, tem sido relatada como proveniente tanto do micélio (16), quanto do
basidiocarpo (18). Entretanto é natural haver variações entre linhagens da mesma espécie
de fungo e entre diferentes fases de crescimento do basidiocarpo de uma mesma linhagem.
Cada estágio de crescimento do basidiocarpo apresenta diferenças bioquímicas, sendo que
basidiocarpos de diferentes linhagens de A. brasiliensis, em diferentes estágios de
crescimento apresentaram modificações da concentração de proteínas e de β-D-glucanas,
consideradas as responsáveis pelo efeito antineoplásico (4).
Durante as fases de maturação do basidiocarpo de fungos, com ausência de véu
universal e presença de véu interno, podemos verificar duas fases distintas e importantes:
60
antes e após o rompimento do véu interno. Este é o momento que ocorrem as principais
mudanças bioquímicas no basidiocarpo. Antes de romper o véu interno o basidiocarpo está
imaturo, com esporos em fase de formação, sendo o basidiocarpo caracterizado como
“cogumelo fechado”. Após o rompimento do véu interno o basidiocarpo está maduro, com
esporos formados e prontos para serem dispersos, iniciando a senescência do corpo de
frutificação (4, 15).
Comercialmente os basidiocarpos desidratados são colhidos antes do rompimento
do véu (cogumelo fechado) devido principalmente às características sensoriais e a maior
firmeza do basidiocarpo que facilita a colheita e reduz fragmentação durante o
processamento (2). Além disto, basidiocarpos colhidos antes do rompimento do véu têm
um visual mais agradável para o consumidor devido a sua coloração mais clara, pois os
esporos do A. brasiliensis têm uma coloração escura dando aparência de sujo ao
basidiocarpo. No entanto Camelini et al. (4) e Firenzuoli et al. (7) sugerem que cogumelos
com basidiocarpo aberto possuem uma melhor atividade biológica por possuírem maior
concentração e diversidade de glucanas e proteínas.
Enquanto que os princípios ativos de alguns Basidiomicetos são extraídos de
micélio ou basidiocarpos imaturos, como o Lentinula edodes (8), Pleurotus ostreatus (1) e
o Agaricus blazei (4), outros como o Ganoderma lucidum são extraídos principalmente de
esporos onde há maior concentração do princípio ativo (13). Pinheiro et al. (20) avaliaram
a quimioprevenção de basidiocarpos moídos de A. blazei, com píleo aberto e fechado, em
células de fígado de ratos e relataram que a atividade quimiopreventiva estava relacionada
à linhagem e ao estágio de crescimento do basidiocarpo. Entretanto, não há relatos
conclusivos sobre a eficiência antineoplásica de basidiocarpos de A. brasiliensis, em
diferentes fases de maturação, sobre o sarcoma 180.
61
Desta forma, devido à importância funcional deste fungo e a ausência de trabalhos
comparando a atividade biológica in vivo do fungo em diferentes fases de maturação do
basidiocarpo para o sarcoma 180, o objetivo deste trabalho foi verificar a atividade
antineoplásica de Agaricus brasiliensis em diferentes estágios de maturação do
basidiocarpo em camundongos implantados com células de sarcoma 180.
O cogumelo utilizado para o experimento foi o Agaricus brasiliensis (Agaricus
blazei ABL97/11) do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense. O
cogumelo foi colhido em diferentes fases de crescimento do basidiocarpo: antes de romper
o véu interno (cogumelo fechado) e após rompimento do véu interno (cogumelo aberto).
Os cogumelos foram lavados com água corrente com auxílio de esponja e desidratados em
estufa com circulação de ar a 65 oC. Em seguida o cogumelo foi moído em moinho de
facas, ensacado em plástico duplo de polipropileno, fechado com termoseladora e mantido
em freezer a -70 °C.
Uma mistura de cogumelo moído com água ultra-pura na proporção de 1 : 10 foi
mantida em frasco de vidro com tampa de rosca fechada, imerso à 90 °C, durante 12 h.
Após este período a solução foi filtrada em papel filtro de gramatura 80 g/m2, espessura
205 µm, porosidade 14 µm da marca Qualy. A solução filtrada foi armazenada em
alíquotas diárias em geladeira (4 °C).
As células de sarcoma murino, linhagem TG180, foram obtidas do peritôneo de
camundongos previamente inoculados, mantidos por dez dias, conforme Desmonts e
Remington (5). A concentração de células foi determinada por contagem em câmara de
Newbauer, sendo ajustada para 106 ml-1com solução salina isotônica (NaCl 0,18%).
62
Camundongos Swiss, fêmeas, com 21 dias de idade e 25 g ± 5 g, oriundas do
biotério da UNIPAR – Campus Umuarama, foram inoculadas por via subcutânea, no
dorso, com 106 ml-1células de sarcoma 180. Os roedores foram mantidos em caixas
plásticas convencionais, em sala com controle de temperatura de 24 oC ± 2 oC, sob regime
alternado de 12 h de luz e 12 h de escuro. Após sete dias os roedores foram divididos em
três grupos: o grupo “Controle” com oito camundongos que receberam solução de NaCl
0,18%; grupo “Fechado” com oito camundongos que receberam solução do extrato do
cogumelo “fechado” e o grupo “Aberto” com oito camundongos que receberam solução do
extrato do cogumelo aberto. As soluções foram retiradas diariamente da geladeira e
permaneceram em temperatura ambiente (cerca de 26 °C) por 30 minutos antes do uso.
Diariamente administrou-se oralmente 0,1 mL de cada solução por camundongo
diariamente.
Após 30 dias do início do tratamento os animais sofreram eutanásia pela
administração de excesso de anestésico em câmara saturada de vapor de éter, sendo o baço
(para determinação do índice esplênico) e a massa tumoral retirados e mensurados. O
volume do tumor foi medido por régua milimetrada e calculado considerando seu diâmetro
mínimo (a) e o máximo (b) (volume do tumor = 4/3 π (a2 b)/2). A inibição foi calculada
considerando o volume do tumor do grupo Controle como 100% (11). O índice esplênico
foi calculado considerando a massa do baço pela massa corporal dos animais. Os grupos
foram testados entre si pela Análise de Variância e a diferença entre as médias determinada
pelo Teste de Tukey, considerando um nível de significância de 0,05. Os experimentos
foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Experimentação Animal
(CEEPA) da Universidade Paranaense em reunião realizada em 07/06/2004.
63
Um camundongo do grupo Fechado e dois do grupo Aberto não apresentaram
formação de massa tumoral subcutânea, sendo os dados destes animais desconsiderados na
verificação de inibição de crescimento tumoral. Os resultados do índice esplênico, massa,
largura, comprimento e volume tumoral são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Avaliação do desenvolvimento de neoplasia em camundongos Swiss inoculados
com células de sarcoma 180, tratados via oral com solução salina 0,18% (Controle) ou
extrato de basidiocarpo de Agaricus brasiliensis Fechado ou Aberto (n= 8).
Medidas do tumor
Controle
Fechado
Aberto
Índice esplênico
0,0134a ± 0,0033
0,0064a ± 0,0004
0,0108a ± 0,0014
Massa (g)
3,0400a ± 1,1492
0,2180b ± 0,0557
0,9333b ± 0,4228
Largura (mm)
1,4400a ± 0,2298
0,7200b ± 0,0567
0,7017b ± 0,0744
Comprimento (mm)
2,3286a ± 0,3519
1,1040b ± 0,0793
1,3667ab ± 0,2297
13,9248a ± 5,0425
1,2804b ± 0,2953
1,7213b ± 0,7219
Volume (mm3)
*Valores de médias seguidos de letras diferentes indicam diferenças significativas do teste
de Tukey (p ≤ 0,05) entre os grupos na horizontal.
64
Não houve diferença significativa do índice esplênico entre os grupos
experimentais (Tabela 1). Isto sugere que o baço não teve participação na atividade
antineoplásica. O baço é o maior órgão linfóide do organismo e principal local de resposta
imune a antígenos presentes no sangue. Este órgão apresenta grandes quantidades de
linhagens mono-macrofágicas, envolvidas na endocitose e degradação de moléculas
estranhas, quando ocorre aumento de sua atividade (28).
O volume tumoral nos grupos Fechado e Aberto, tratados com extratos de A.
brasiliensis, foi significativamente (p ≤ 0,05) menor que o grupo Controle, porém não
houve diferença significativa entre os grupos Aberto e Fechado (Tabela 1). O grau de
inibição do crescimento tumoral em comparação ao grupo Controle foi de 90,80% no
grupo Fechado e de 87,64% no grupo Aberto, com média entre estes dois grupos de
89,22%. Isto evidencia que a opção comercial de colheita de cogumelos mais jovens
(fechado) é indiferente em relação à eficiência do princípio ativo, prevalecendo outras
vantagens comercias relacionados às características sensoriais e de processamento.
Outro aspecto relevante é que se não há diferença entre cogumelo aberto e fechado,
isto sugere que a maior concentração dos princípios ativos não se encontram nos esporos,
como ocorre com o Ganoderma lucidum (13). Isto sugere que outros estudos sobre a
produção de micélio, por meio líquido, seja avaliada para a produção de princípios ativos,
ao invés de basidiocarpos.
Camelini et al. (4) e Firenzuoli et al. (7) relatam diferenças nas quantidades de
glucanas e proteínas de A. brasiliensis, conforme o estágio de crescimento do basidiocarpo
(Aberto ou Fechado), sugerindo que cogumelos com píleo aberto teriam maiores
quantidades de princípio ativo e, provavelmente, maior atividade antineoplásica.
Entretanto, segundo nossos resultados as diferenças de maturação do basidiocarpo não
65
foram suficientes para afetar in vivo a atividade antineoplásica do fungo (Tabela 1). Isto
sugere que a beta-glucana, mesmo em maior quantidade em basidiocarpos abertos (4), não
seja a principal responsável pela atividade biológica do fungo. É possível que outros
fatores possam desempenhar papel concomitante quer ajudando ou interferindo as
substâncias responsáveis pela atividade antitumor de A. brasiliensis.
Zang et al. (26) relatam que a presença de proteína ou de manose implica em maior
ação imunomoduladora contra neoplasias de sarcoma 180. Mizuno et al. (17), Wang et al.
(24) e Eo et al. (6) relatam que diversos compostos biologicamente ativos de fungos como
polissacarídeos, glicoproteínas e glicopeptídeos atuam sinergicamente na atividade
imunomoduladora. Ainda Walton et al. (23) relatam que basidiocarpos do gênero Agaricus
apresentam a substância Agaritine, com potencial ação cancerígena quando extraída por
infusão a frio, porém sem relatos desta substância no micélio vegetativo.
Camelini et al. (4) relatam que há maior quantidade e diversidade estrutural de
glucanas quando o basidicarpo esta aberto, sendo que a estrutura química das glucanas
fúngicas esta relacionada à atividade biológica no sistema imune (3, 19), sugerindo que
cogumelos abertos seriam mais indicados para encontrar glucanas com maior atividade
antineoplásica. Entretanto, segundo Mizuno et al. (16) a atividade antitumor esta
relacionada a maior quantidade de glucanas solúveis em água, sendo que este aspecto não
esta necessariamente relacionado a uma determinada fase de maturação do basidiocarpo.
Conforme nossos resultados não foi possível confirmar uma melhor atividade
antineoplásica in vivo em função da maior maturidade do basiodiocarpo para o tumor
estudado (Tabela 1). Aparentemente há uma tendência contrária de diminuição da
atividade antineoplásica em basidiocarpos abertos, diferentemente do que sugere Camelini
et al. (4) e Firenzuoli et al. (7). Desta forma, sugere-se que novos estudos sejam realizados
66
para verificar a associação entre a atividade biológica in vivo e a quantidada de betaglucana, proteína e outras substâncias como triterpenos, em diferentes estágios de
maturação do basidiocarpo e diferentes linhagens de A. brasiliensis, ampliando os estudos
nesta área.
Em conclusão, nossos resultados sugerem que não existem diferenças significativas
de inibição do crescimento tumoral, em função das diferentes fases de maturação do
basidiocarpo para a linhagem ABL97/11 de Agaricus brasiliensis, sendo a atividade
antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos de 89,22%. Estes resultados contribuirão
para o desenvolvimento de novas pesquisas sobre a atividade biológica de linhagens de
Agaricus brasiliensis.
AGRADECIMENTOS
1. Alarcón, J.N.; Águila, S.; Avila-Arancibia, P.; Fuentes, O.; Zamorano-Ponce, E.;
Hernández, M. Production and purification of statins from Pleurotus ostreatus
(Basidiomycetes) strains. Z. Naturforsch, 58: 62-64, 2003.
2. Braga, G.C.; Eira, A.F.; Celso, P.G.; Colauto, N.B. Manual do cultivo de Agaricus
blazei Murril “Cogumelo-do-sol”, FEPAF, Botucatu, 1998.
67
3. Brown, G.; Gordon, S. Fungal β-glucans and mammalian immunity. Immunity,
19(3): 311-315, 2003.
4. Camelini, C.M.; Maraschin, M.; Mendonça, M.M.; Zucco, C.; Ferreira, A.G.;
Tavares, L.A. Structural characterization of β-glucans of Agaricus brasiliensis in
different stages of fruiting body maturity and their use in nutraceutical products.
Biotechnol. Lett., 27: 1295-1299, 2005.
5. Desmonts, G.; Remington, J.S. Direct agglutination test for diagnosis of
Toxoplasma infection: method for increasing sensitivity and specificity. J. Clin.
Microbiol., 11(6): 562-568, 1980.
6. Eo, S.K.; Kim, Y.S.; Lee, C.K.; Han, S.S. Possible mode of antiviral activity of
acidic protein bound polysaccharide isolated from Ganoderma lucidum on herpes
simplex viruses. J. Ethnopharmacol., 72(3): 475-481, 2000.
7. Firenzuoli, F.; Gori, L.; Lombardo, G. The medicinal mushroom Agaricus blazei
Murril: review of literature and pharmaco-toxicological problems. Evid. Based
Complement. Alternat. Med., 5(1): 3-15, 2008.
8. Hassegawa, R.H.; Kasuya, M.C.M.; Vanetti, C.D. Growth and antibacterial activity
of Lentinula edodes in liquid media supplemented with agricultural wastes.
Electron. J. Biotechnol., 8(2): 94-99, 2005.
9. Kawagishi, H.; Kanao, T.; Inagaki, R.; Mizuno, T.; Shimura, K.; Ito, H.;
Hagiwaram, T.; Nakamura, T. Formolysis of a potent antitumor (1->6) – D –
glucan – protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor
activity of the resulting products. Carbohydr. Polym., 12: 393-403, 1990.
10. Kerrigan, R.W. Agaricus subrufescens, a cultivated edible and medicinal
mushroom and its synonyms. Mycologia, 97: 12-24, 2005.
68
11. Lee, Y.L.; Kim, H.J.; Lee, M.S.; Kim, J.M.; Han, J.S.; Hong, E.K.; Kwon, M.S.;
Lee, M.J. Oral administration of Agaricus blazei (H1 strain) inhibited tumor growth
in a Sarcoma 180 inoculation model. Exp. Anim., 52: 371-375, 2003.
12. Liu, Y.; Fukuwatari, Y.; Okumura, K.; Takeda, K.; Ishibashi, K.I.; Furukawa, M.;
Ohno, N.; Mori, K.; Gao, M.; Motoi, M. Immunomodulating activity of Agaricus
brasiliensis KA21 mice and in human volunteers. Evid. Based Complement.
Alternat. Med., 5:205-219, 2007.
13. Lu, Q.Y.; Sartippour, M.R.; Brooks, M.N.; Zhang, Q.; Hardy, M.; Go, V.L.; Li,
F.P.; Heber, D. Ganoderma lucidum spore extract inhibits endothelial and breast
cancer cells in vitro. Oncol. Rep., 12(3): 659-662, 2004.
14. Menoli, R.C.R.N.; Mantovani, M.S.; Ribeiro, L.R.; Speit, G.; Jordão, B.Q.
Antimutagenic effects of the mushroom Agaricus blazei Murril extracts on V79
cells. Mutat. Res., 496: 5-13, 2001.
15. Miles, P.G.; Chang, S.T. Mushroom biology: concise basics and current
development. World Scientific, London, 1997.
16. Mizuno, T.; Hagiwara, T.; Nakamura, T.; Ito, H.; Shimura, K.; Sumiya, T.;
Asakura,
A.
Antitumor
activity and
some
properties
of
water-soluble
polysaccharides from “himematsutake,” the fruiting body of Agaricus blazei
Murril. Agric. Biol. Chem., 54(11): 2889-2896, 1990.
17. Mizuno, T.; Suuzki, E.; Maki, K.; Tamaki, H. Fractionation, chemical modification
and antitumor activity of water-soluble polysaccharides of the fruiting body of
Ganoderma lucidum. Nippon Nogeikagaku Kaishi, 59(11): 1143-1151, 1985.
18. Ohno, N.; Furukawa, M.; Miura, N.N.; Adachi, Y.; Motoi, M.; Yadomae, T.
Antitumor beta-glucan from the cultured fruit body of Agaricus blazei. Biol.
Pharm. Bull., 24(7): 820-828, 2001.
69
19. Pelosi, L.; Imai, T.; Chanzy, H.; Heux, L.; Buhler, E.; Bulone, V. Structural and
morphological diversity of (1→3)-β-D-glucans synthesized in vitro by enzymes
from Saprolegnia monoïca. Comparison with a corresponding in vitro product from
blackberry (Rubus fruticosus). Biochemistry, 42(20): 6264-6274, 2003.
20. Pinheiro, F.; Faria, R.R.; Camargo, J.L.V.; Spinardi-Barbisan, A.L.T.; Eira, A.F.;
Barbisan, L.F. Chemoprevention of preneoplastic liver foci development dietary
mushroom Agaricus blazei Murril in the rat. Food. Chem. Toxicol., 41: 1543-1550,
2003.
21. Rodrigues, S.B.; Jabor, I.A.S.; Marques-Silva, G.G.; Rocha, C.L.M.S.C. Avaliação
do potencial antimutagênico do cogumelo do sol (Agaricus blazei) no sistema
MethG1 em Aspergillus (=Emericella) nidulans. Acta Sci., 25(2): 513-517, 2003.
22. Takimoto, H.; Wakita, D.; Kawaguchi, K.; Kumazawa, Y. Potentiation of cytotoxic
activity in naive and tumor-bearing mice by oral administration of hot-water
extracts from Agaricus blazei fruiting bodies. Biol. Pharm. Bull., 27(3): 404-406,
2003.
23. Walton, K.; Coombs, M.M.; Catteral, F.S.; Ioanides, C. (1997) Bioactivation of the
mushroom hydrazine, agaritine, to intermediates that bind covalently to proteins
and induce mutations in the Ames test. Carcinogenesis, 18(8): 1603–1608, 1997.
24. Wang, H.X.; Liu, W.K.; Ng, T.B.; Ooi, V.E.; Chang, S.T. Immunomodulatory and
antitumor activities of a polysaccharide-peptide complex from a mycelial culture of
Tricholoma sp., a local edible mushroom. Life Sci., 57(3): 269-281, 1995.
25. Wasser, S.P.; Diduk, M.Y.; Amazonas, M.A.L.A.; Nevo, E.; Stamets, P.; Eira, A.F.
Is a widely cultivated culinary-medicinal royal sun Agaricus (the himematsutake
mushroom) indeed Agaricus blazei Murril? Int. J. Med. Mushrooms, 4: 267-290,
2002.
70
26. Zhang, M.; Cui, S.W.; Cheung, P.C.K.; Wang, Q. Antitumor polysaccharides from
mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and
antitumor activity. Trends Food Sci. Technol., 18: 4-19, 2007.
27. Zhong, M.; Tai, A.; Yamamoto, I. In vitro augmentation of natural killer activity an
interferon gama production in murine spleen cells with Agaricus blazei fruiting
body fractions. Biosci. Biotechnol. Biochem., 60(12): 2466-2469, 2005.
28. Zareie, M.; Singh, P., K.; Irvine, E., J.; Sherman, P., M.; Mckay, D., M; Perdue M.,
H. Monocyte/macrophage activation by normal bacteria and bacterial products.
Implications for altered epithelial function in Crohn’s disease. American Journal of
Pathol., (158): 1101-1109, 2001.
71
4. CONCLUSÕES GERAIS
Este trabalho comprovou importantes informações sobre a otimização de
extração dos princípios ativos e atividades biológicas atribuídas ao cogumelo A.
brasiliensis.
O metanol possui a melhor capacidade de extração dos princípios ativos
antioxidantes do cogumelo A. brasiliensis, sendo a temperatura de 60 °C e o
tempo de 60 minutos em banho as condições ideais de extração.
Houve diferença entre as fases de desenvolvimento do basidiocarpo sobre
a atividade antioxidante.
As
linhagens
ABL26
e
ABL20A
apresentaram
maiores
atividade
antioxidante do grupo dos cogumelos com basidiocarpo fechado.
A linhagem ABL29A apresentou maior atividade antioxidante do grupo dos
cogumelos com basidiocarpo aberto.
Houve diferença entre as fases de desenvolvimento do basidiocarpo sobre
a migração celular em processos inflamatórios para a linhagem ABL99/25.
Extrato do cogumelo com basidiocarpo fechado de A. brasiliensis mostrou
maior capacidade de inibição da migração celular para o foco da lesão.
Não houve diferença significativa para a inibição do crescimento tumoral
em função do estágio de crescimento do basidiocarpo para a linhagem ABL97/11.
A atividade antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos foram de
89,22%.
72
REFERÊNCIAS GERAIS
BELLINI, M. F.; GIACOMINI, N.L.; EIRA, A.F.; RIBEIRO, L.R.; MATOVANI, M.S.
Anticlastogenic effect of aqueous extracts of Agaricus blazei on CHO-kl cells,
studying different developmental phases of the mushroom. Toxicology in Vitro, v.
17, n. 4, p. 465-469, 2003.
COLAUTO, N. C.; DIAS, E. S.; GIMENES, M. A.; EIRA, A. A. Genetic
characterization of isolates of the basidiomycete Agaricus blazei by RAPD.
Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 33, n. 2, p. 131-133, Apr./June
2002.
LOPES, S. Bio. São Paulo: Editora Saraiva, 1999.
MENOLI, R. C. R. N.; MANTOVANI, M. S.; RIBEIRO, L. R.; SPEIT, G.; &
JORDÃO, B. Q. Antimutagenic effects of the mushroom Agaricus blazei
MurrillextractsonV79 cells. Mutation Research, v. 496, p. 5-13, 2001.
PIERO, D.M.R. Potencial dos cogumelos Lentinula edodes (SHIITAKE) e
Agaricus blazei (COGUMELO-DO-SOL) no controle de doenças em plantas de
pepino, maracujá e tomate, e a purificação parcial de compostos
biologicamente ativos. São Paulo: Tese apresentada à Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, 2003.
TAKATU, T.; KIMURA. Y; OKUDA, H. Isolation of an antitumor compound from
Agaricus blazei Murill and its m echanism of action. Journal Nutrition, 131(5):
1409-1413, 2001.
WASSER, S. P.; DIDUKH, M.Y.; AMAZONAS, M. A. L.; NEVO, E.; STAMETS. P.;
EIRA, A. F. Is a Widely Cultivated Culinary-Medicinal Royal Sun Agaricus (the
Himematsutake Mushroom) Indeed Agaricus blazei Murrill? International Journal
of Medicinal Mushroom, v.4, p.297-90, 2002.
ZENI, G.; PENDRAK, I.P. Bionconversão de celulose em proteína utilizando a
levedura Cândida utillis e o fungo Pleurotus ostreatus. Ponta Grossa: Trabalho
de conclusão de curso apresentado á Universidade Federal Tecnológica do
Paraná, 2006.
73
APÊNDICE

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES

Transcrição

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