Avaliação dos efeitos do clodronato na

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
CENTRO DE ORTODONTIA E ORTOPEDIA FACIAL
PROF. JOSÉ ÉDIMO SOARES MARTINS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CLODRONATO NA MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA E
REABSORÇÃO RADICULAR EM RATTUS NORVEGICUS
Ana Maria Telles Pinheiro
C.D.
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal da Bahia,
como parte dos requisitos para obtenção do
Título de Especialista em Ortodontia e Ortopedia
Facial.
Salvador, 2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
CENTRO DE ORTODONTIA E ORTOPEDIA FACIAL
PROF. JOSÉ ÉDIMO SOARES MARTINS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CLODRONATO NA MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA E
REABSORÇÃO RADICULAR EM RATTUS NORVEGICUS
Ana Maria Telles Pinheiro
C.D.
ORIENTADOR: PROF. DR. MICKELSON RIO LIMA DE OLIVEIRA COSTA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS ANDRÉ VANNIER DOS SANTOS
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal da Bahia,
como parte dos requisitos para obtenção do
Título de Especialista em Ortodontia e Ortopedia
Facial.
Salvador, 2006
P654
Pinheiro, Ana Maria Telles
Avaliação dos efeitos do clodronato na movimentação dentária e reabsorção
radicular em Rattus norvegicus / Ana Maria Telles Pinheiro – Salvador, 2006.
93 f.
Orientador: Prof. Dr. Mickelson Rio Lima de Oliveira Costa
Co-Orientador: Prof..Dr. Marco André Vannier dos Santos
Dissertação (especialização em ortodontia) – Universidade Federal da
Bahia. Faculdade de Odontologia. 2006
1. Clodronato. 2. Reabsorção radicular. 3. Movimentação dentária. I. Costa,
Mickelson Rio Lima de Oliveira (Orientador). II. Santos, Marco André Vannier
dos. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Odontologia. IV. Título
CDU:616.314-089.23
A meu marido,
André Pinheiro,
ponto de equilíbrio e co-responsável pelas grandes conquistas da minha
vida...
Dedico.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A meus pais,
Mariângela e Justino Telles,
“os fazedores de sonhos” da minha vida;
e a meu filho, Victor, que, antes mesmo de nascer, já participou desta
conquista...
AGRADECIMENTOS
A Deus, que sempre abençoa todos os meus projetos,
Aos meus irmãos, Fernando e Luciana e cunhados-irmãos, Cláudia e Bruno,
por participarem de todos os meus grandes momentos,
Aos meus sobrinhos, Fernando e Bernardo, por serem sinônimo de ternura,
alegria e pureza para quem quer que os conheça,
À tia Vanda e tio Miguel por terem servido de meio para que Deus colocasse
André na minha vida,
Ao meu orientador, Prof. Dr. Mickelson Costa, pela paciência, dedicação e,
acima de tudo, por ter, verdadeiramente, me guiado dentro de um mundo até então
para mim desconhecido, o do trabalho experimental, de forma tão tranqüila,
À Prof. Myrela Galvão por ter colaborado de forma tão desapegada para a
execução deste projeto, tornando os momentos experimentais mais prazerosos,
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Marcos André Vannier dos Santos, pelo
exemplo de simplicidade e pela total disponibilidade que sempre demonstrou ter
para com o nosso trabalho, abrindo as portas da FIOCRUZ-Ba e viabilizando toda a
nossa pesquisa,
A Diego, grande amigo que conheci nesta fase da minha vida, cuja ajuda foi
inestimável durante todas as etapas deste trabalho e que vai ficar para mim como
um dos grandes “saldos positivos”,
À toda a equipe da FIOCRUZ-Ba, em especial à Srª. Cristina dos Santos
Vasconcelos, técnica do Departamento de Anatomia Patológica da FIOCRUZ-Ba,
por ter simplificado, por muitas vezes, o nosso trabalho,
À Srª. Maria de Lourdes, técnica em histopatologia da UFBA, por ter dado
mais celeridade na fase final de processamento histológico do material coletado,
À Profª. Drª. Luciana Ramalho, pela paciência e pelo carinho que sempre teve
comigo e pelo exemplo de seriedade que dá em tudo o que faz,
À Profª. Drª. Cristina Cangussu que nos faz entrar no turbilhão de idéias
matemáticas da estatística de maneira segura e consciente,
Aos meus professores do curso de especialização em Ortodontia da
Universidade Federal da Bahia: Profª. Drª. Telma Martins de Araújo; Prof. Rogério
Ferreira; Prof. Fernando Habib; Prof. Dr. Marcos Alan Vieira Bittencourt; Profª.
Fernanda Catharino; Prof. Márcio Sobral; Profª. Mayra Seixas; Profª. Myrela Galvão;
Prof. Marcelo Castelucci; Prof. Rivail Brandão; Profª. Luciana Gomes; Prof. Roberto
Costa Pinto e Prof. Dr. Mickelson Costa, por terem me introduzido no fascinante
caminho desta especialidade,
Aos meus colegas de turma: Daniel Bill; Indira Maia; Inêssa Barbosa; Mônica
Corbacho e Valmir Dall´orto e aos contemporâneos da segunda turma (Aline Cruz;
Aline Freitas; Gustavo Maciel; Lívia Marianetti; Paloma Nunes e Ricardo Lavenere) e
da quarta (Adriana Libório; Débora Rosseti; Érica Guanaes; Cristiane Becker; Mauro
Henrique; Thiago Vinhas), pelos dois anos de convivência intensa, pontilhados de
momentos especialmente inesquecíveis,
À D. Lúcia, André, Damião e D. Ginalva por dividirem os momentos
“estressantes” com nós, alunos,
Ao Dr. Joélio Ribeiro que, com o simples exemplo, me fez ver as grandes
realizações profissionais que a Ortodontia poderia me trazer,
Aos amigos: Adriana Sicupira, Alexandre Moreira, Cláudia Embiruçu, Eduardo
Batalha, Emerson da Silva, Eugênio Arcadinos Leite, Fernanda Muitinho, Flávia
Cabral, Ianderlei Souza, Luiz Gustavo Cavalcanti Bastos, Priscila Pinheiro Lima da
Silva, Vagner Mendes, por terem sempre acreditado em mim e no meu potencial.
À Semp Toshiba, pela inestimável ajuda ao Centro de Ortodontia e Ortopedia
Facial Professor José Édimo Soares Martins.
A todos que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste
trabalho.
RESUMO
O presente trabalho buscou avaliar a efetividade e o mecanismo de ação do
clodronato na diminuição da reabsorção radicular e sua influência na taxa de
movimentação dentária induzida ortodonticamente. Portanto, seu objetivo foi testar a
hipótese desse medicamento inibir de maneira seletiva tal processo, com pouca ou
nenhuma influência nesse movimento.
Dezoito ratos foram distribuídos em três grupos: CONTROLE, com 6 animais;
GRUPO I, com 5 animais (clodronato administrado nos dias 0, 2, 4 e 6); GRUPO II,
com 7 animais (clodronato administrado no 5º dia). Todos foram submetidos à
movimentação dentária ortodôntica e sacrificados no sétimo dia do experimento,
quando as peças foram removidas, fixadas, descalcificadas, incluídas em parafina e
coradas em hematoxilina e eosina para análise em microscopia de luz.
Comparando-se as taxas de movimentação foi encontrada diferença
estatisticamente significante entre os grupos CONTROLE e I, o que não ocorreu
entre o CONTROLE e o GRUPO II. Durante a análise histológica semi-quantitativa o
GRUPO CONTROLE apresentou concentração de osteoclastos bem mais
expressiva que o GRUPO II (83% e 43%, respectivamente, para o grau moderadointenso). A reabsorção óssea nesses dois grupos, por sua vez, não apresentou
diferenças marcantes (50% e 57%, respectivamente, para o grau moderado-intenso),
enquanto que a reabsorção radicular foi maior no GRUPO CONTROLE do que nos
grupos I e II (respectivamente 67%, 20% e 57% para o grau moderado-intenso).
A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária
sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir a
reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária induzida
ortodonticamente.
ABSTRACT
This experimental study was motivated and performed in order to better
elucidate the mechanisms underlying on the action of clodronate on root resorption.
We tested the hypothesis that this compound may selectively inhibits root resorption
without significant influence on tooth movement. Sample consisted of three
experimental groups of 18 rats, CONTROL (n=6), GROUP I (n=5, clodronate
administered subcutaneously in days 0, 2, 4 and 6) and GROUP II (n=7, clodronate
administered subcutaneously in days 5). First upper molars were moved using ni-ti
closed coil spring for 7 days. The animals were sacrificed and the tissue fragments of
the moved teeth and adjacent alveolar region were fixed, decalcified, included in
paraffin and HE stained for light microscopy. Taken together the results suggest that
subcutaneous injection of clodronate in the fifth day of tooth movement in rats may
decrease root resorption without significant influence on tooth movement rate.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
%
Percentagem
P-C-P
Ponte de dois átomos de fosfato ligados a um de Carbono
ATP
Adenosina trifosfato
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
TM
Trade mark (marca registrada)
g
Grama
mo
Movimento ortodôntico
S
Sacrifício
C
Aplicação de clodronato
N
Número de animais por grupo
mL
Mililitro
Kg
Kilograma
NiTi
Níquel-titânio
®
Marca registrada
1º M
Primeiro molar
nº
Número
”
Polegadas
mg
Miligrama
M
Molaridade
EDTA
EthyleneDiamineTetrAcetic acid (Ácido etilenodiaminotetra-acético)
µm
Micrômetro
HE
Hematoxilina e Eosina
ANOVA
Análise de Variância
p
p valor
<
Menor
mm
Milímetro
=
Igual
pH
Pondus hidrogenii (nível de acidez)
F
Furca
LP
Ligamento periodontal
RO
Reabsorção óssea
NO
Neoformação óssea
D
Superfície mesial da raiz distal
LRRA
Lacuna de reabsorção radicular ativa
UFBA
Universidade Federal da Bahia
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Pesagem do animal
29
Figura 2 Adaptação cervical do conjunto amarrilho-mola de NiTi ao
primeiro molar superior esquerdo: a. fio de amarrilho metálico 0.08”
(Dental Morelli) sendo introduzido na região entre 1º e 2ºmolares
superiores esquerdos com o auxílio de uma pinça Mathiew; b. fio
de amarrilho após passar pelo ponto de contato; c. fio de amarrilho
envolvendo o 1ºM com a respectiva mola de Níquel-Titânio; c.
amarração do conjunto mola-fio de amarrilho com o auxílio da
Mathiew à cervical do 1ºM.
31
Figura 3. a e b. confecção do orifício entre os incisivos superiores com
broca esférica nº2 (KG Sorensen).
31
Figura 4. a. Animal posicionado em dispositivo de acrílico ligeiramente
inclinado, em decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo;
b. peso de chumbo de 45g preso ao amarrilho fixado à extremidade
anterior da mola de NiTi, distendendo-a, produzindo força
equivalente.
32
Figura 5. a. Fotopolimerização da resina na região anterior; b. desgaste
dos incisivos inferiores com fresa do tipo roda (KG Sorensen) e c.
aparelho montado.
Figura 6. OSTAC – Solução injetável.
33
34
Figura 7. a. Avaliação da distância entre a face mesial do primeiro molar
superior esquerdo e um orifício criado na vestibular dos incisivos
superiores, utilizando paquímetro de precisão (Beerendonk Caliper
78532 - AESCULAP); b. espaço criado na distal do primeiro molar
pelo deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação
de força (seta).
Figura 8. Osso maxilar osteotomizado.
35
35
LISTA DE QUADROS
Página
Quadro 1 Identificação dos grupos: mo (movimento ortodôntico), S
(sacrifício); C (aplicação de clodronato) e N (número de animais por
grupo).
30
Quadro 2 Representação esquemática dos referenciais numéricos
utilizados.
Quadro 3 Representação da tabela utilizada para registro dos dados
36
37
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO
16
2 PROPOSIÇÃO
27
3 ABORDAGEM EXPERIMENTAL
28
4 DESENVOLVIMENTO SEQUENCIAL DA PESQUISA
38
4.1 ARTIGO 1
38
4.1 ARTIGO 2
66
5 CONCLUSÃO
83
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
84
7 ANEXO
93
16
1 INTRODUÇÃO
O cemento radicular é um tecido conjuntivo mineralizado e avascular que
recobre as raízes anatômicas dos dentes, composto por 45-50% de substância
inorgânica e 50-55% de matéria orgânica e água. A porção inorgânica é composta
basicamente por hidroxiapatita e a orgânica é constituída por colágeno tipo I e
proteoglicanas. Suas células, cementoblastos e cementócitos, são similares aos
osteoblastos e osteócitos, respectivamente, e sua nutrição se dá por meio de
difusão, através do ligamento periodontal. Sua principal função é inserir as fibras
deste ligamento à superfície radicular e vedar os túbulos dentinários (LINDHE &
KARRING, 1997; CATE, 1998; KATCHBURIAN & ARANA, 1999)
Este tecido pode ser dividido em: primário ou acelular, formado durante o
processo de desenvolvimento radicular e irrupção dentária; e secundário ou
celular, formado após o dente ter irrompido e em resposta às demandas
funcionais. Este último apresenta uma composição muito semelhante a do tecido
ósseo, todavia não possui vasos sanguíneos, linfáticos e inervação (LINDHE &
KARRING, 1997; CATE, 1998). É passível de reabsorção e neoformação numa
intensidade muito menor que a do osso (KATCHBURIAN & ARANA, 1999), além
17
de se depositar continuamente ao longo da vida, o que constituem aspectos
clínicos importantes (LINDHE & KARRING, 1997).
A resistência aumentada do cemento à reabsorção em relação ao osso
torna viável o movimento dentário ortodôntico. Entretanto, mesmo quando as
radiografias não revelam alterações visíveis na superfície radicular, acredita-se
que a maioria dos dentes movidos ortodonticamente sofra uma reabsorção
radicular, seguida de reparo. Na área reabsorvida, observam-se lacunas criadas
por odontoclastos, rapidamente reparadas, ainda que de maneira incompleta, pela
formação de novo cemento capaz de reinserir as fibras do ligamento periodontal e
promover o restabelecimento dos demais tecidos (CATE, 1998; GU et al., 1999).
Durante o tratamento ortodôntico, a compressão dos vasos sanguíneos, à
medida que a pressão no ligamento periodontal aumenta, provoca obliteração dos
mesmos e necrose estéril de áreas deste tecido, conhecidas como zonas de
hialinização. Esta alteração tecidual impede a movimentação dentária até que
tanto o tecido necrótico quanto o osso adjacente sejam removidos pelos
osteoclastos (RODY Jr. et al., 2001; PROFFIT & FIELDS Jr., 2002). Logo, a
compressão do ligamento periodontal constitui um fator de risco diferenciado para
o movimento dentário (KING et al., 1998) e está intimamente associada com a
indução osteoclástica (YOKOYA et al., 1997). Esta última, por sua vez, ocorre
inicialmente nos canais vasculares do osso alveolar e no ligamento periodontal,
no lado de pressão (YOKOYA et al., 1997).
Os odontoclastos aparentam compartilhar características semelhantes com
os osteoclastos no que diz respeito à estrutura celular (formação das bordas em
escova e complexo de Golgi bem desenvolvido vizinho ao núcleo), assim como à
função celular (reabsorção das matrizes mineralizadas). Todavia, diferente dos
18
osteoclastos que podem ser comumente observados no osso, os odontoclastos
apresentam-se de forma temporária e restrita aos locais onde está ocorrendo
reabsorção radicular. Portanto, os primeiros seriam regulados por hormônios
sistêmicos e fatores locais, enquanto que os segundos seriam controlados
basicamente por fatores locais e estresse mecânico (WATANABE et al., 2000).
A transferência de forças ortodônticas para os tecidos periodontais envolve
mecanismos biológicos que resultarão em reabsorção óssea e radicular. Apesar
da relação entre esta degradação e a força não estar clara, tem sido demonstrado
que fatores sistêmicos podem regular tal atividade (SAITO et al., 1991;
ALHASHIMI et al., 2001).
Há estudos que relacionam o início da reabsorção radicular às áreas
adjacentes à zona de tecido hialinizado, ocorrendo em casos de compressões
maiores e mais duradouras (REITAN, 1974; BRUDVIK & RYGH, 1993; ADACHI et
al., 1994; CATE, 1998; GU et al., 1999; BREZNIAK & WASSERSTEIN, 2002),
podendo ser evidenciada ainda nos casos em que uma reativação seja realizada
durante o pico da expansão do número de osteoclastos, ou seja, no quarto dia após
a ativação inicial (GU et al., 1999). Desta forma, pequenas lacunas de reabsorção,
algumas das quais envolvendo dentina, podem ser observadas após quatro dias de
movimentação dentária experimental em ratos (BRUDVIK & RYGH, 1993).
Num estudo desenvolvido por Rody Jr. e colaboradores, em 2001, a cinética
osteoclástica foi observada, tendo sido constatado que o número de osteoclastos no
dia 3 encontra-se significativamente maior no osso alveolar e no ligamento
periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico ocorre no dia 7,
evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em momentos
distintos (RODY Jr. et al., 2001).
19
Os dados conseguidos a partir de uma ativação simples de aparelhos
ortodônticos montados em ratos sugerem que o período entre o estímulo e o
aumento detectável na população de osteoclastos é de aproximadamente três
dias, sendo este o intervalo mínimo para que a remodelação óssea alveolar
apareça nesses animais (um e quatro dias após a ativação inicial) (BARON et al.,
1986; KING et al., 1998; GU et al., 1999). Foi constatado ainda que o número e o
tamanho destas células, além do perímetro da erosão atingem o seu pico no
quinto dia de movimentação dentária ortodôntica experimental, sendo a superfície
mesial radicular (lado de pressão) a mais atingida (KING et al., 1991).
Num estudo desenvolvido por Noxon e colaboradores, em 2001, com 96
ratos submetidos à movimentação ortodôntica durante sete dias, os autores
observaram que as maiores porcentagens de apoptose encontravam-se entre os
dias 5 e 7, o que coincide com o período em que o número de osteoclastos está
voltando para o seu normal. Este processo, por sua vez, foi detectado de forma
percentualmente mais significativa na superfície óssea e no ligamento periodontal.
(NOXON et al., 2001).
Os osteoclastos são células multinucleadas que produzem um ambiente
extracelular ácido, promovendo, por conseguinte, a solubilização dos minerais
ósseos. Portanto, o requisito básico para que o movimento dentário ortodôntico
ocorra é a chegada destas células aos sítios de compressão, promovendo a
remodelação óssea (NOXON et al., 2001). Esse turnover ósseo na região alveolar
interdental é caracterizado por períodos de reabsorção ativa e formação, ocorrendo
tanto nos sítios de pressão como nos de tensão, sendo controlado pela quantidade
de osso perdido ou formado de cada lado (KING et al., 1991).
20
A condição do tecido cementóide e a sua interação com as células da
membrana periodontal adjacente são de extrema importância para a reabsorção
radicular ortodonticamente induzida (BRUDVIK & RYGH, 1993).
A remoção do tecido hialinizado juntamente com cementóide, fibras
colágenas e osteóide ocorre antes e durante o restabelecimento do ligamento
periodontal. Com isto, algumas áreas da superfície radicular tornam-se menos
protegidas e, portanto, mais susceptíveis à reabsorção radicular. Tais áreas são
prontamente atacadas por odontoclastos ou osteoclastos, posto que podem ser
consideradas
células
da
mesma
linhagem,
apresentando
morfologia
e
propriedades similares. Uma vez criadas as lacunas de reabsorção, o cemento é
removido da sua superfície de maneira gradativa (RYGH, 1977; BREZNIAK &
WASSERSTEIN, 2002).
A reabsorção óssea é um processo complexo que envolve outros fatores, tais
como: capacidade de reabsorção óssea individual dos osteoclastos; sua adesão à
superfície óssea; o transporte de íons de hidrogênio; e a secreção enzimática.
Aspectos não relacionados aos osteoclastos também podem desempenhar papéis,
incluindo mobilidade dentária aumentada e redução da resistência secundária ao
movimento dentário ortodôntico; o aumento da vascularização do ligamento
periodontal; e a redução na densidade óssea (GU et al., 1999).
Por muitos anos, ortodontistas e biólogos vêm tentando entender melhor este
processo para otimizar o tratamento ortodôntico. A solução seria prevenir tanto a
formação de tecido hialinizado, como acelerar a sua remoção pelos osteoclastos. Tal
solução é difícil de ser alcançada na clínica por requerer pressões muito baixas
(abaixo do nível em que ocorre colapso das arteríolas), além de um controle preciso
dos sítios de compressão (RODY Jr. et al., 2001; KAMENYAMA et al., 2003).
21
Considerando que a reabsorção e o encurtamento radiculares são
conseqüências
indesejáveis
do
tratamento
ortodôntico,
estudos
têm
sido
desenvolvidos ao longo dos anos com o objetivo de diminuir a reabsorção radicular
sem comprometer a movimentação dentária. Os bisfosfonados apresentam-se como
uma alternativa provável para o controle dessa reabsorção, uma vez que funcionam
como bloqueadores ou inibidores da ação dos osteoclastos (IGARASHI et al., 1994;
LIU et al., 2004).
Após a descoberta de que podem controlar de maneira eficiente a formação e
dissolução de fosfato de cálcio in vitro, assim como a mineralização e a reabsorção
óssea in vivo, os bisfosfonados foram desenvolvidos e usados no tratamento de
desordens ósseas como a doença de Paget, a hipercalcemia maligna e a
osteoporose (RODAN & FLEISCH, 1996; BUKOWSKI et al., 2005). Cada
bisfosfonado deve ser considerado um complexo isolado, cujas estruturas os tornam
específicos para o tecido ósseo ou outros tecidos mineralizados (SHINODA et al.,
1983).
Estes compostos são análogos dos pirofosfatos, nos quais a ponte de
oxigênio foi deslocada por um carbono com várias cadeias laterais (P-C-P) (SATO et
al., 1991; KIM et al., 1999; RODAN & FLEISCH, 1996; ITO et al., 2001; BUKOWSKI
et al., 2005). Ambos ligam-se fortemente à hidroxiapatita, o que explica sua ação
farmacológica específica nos tecidos mineralizados, em especial nos ossos
(ADACHI et al., 1994; RODAN & FLEISCH, 1996; IGARASHI et al., 1996; FLEISCH,
1998; KIM et al., 1999; RUSSEL & ROGERS, 1999). De fato, eles se depositam
preferencialmente em locais de reabsorção osteolcástica ativa, sendo liberados
quando o osso sobre o qual ele se encontra depositado é novamente reabsorvido,
inibindo tal processo (RODAN & FLEISCH, 1996; MURAD et al., 1997; BREZNIAK &
22
WASSERSTEIN, 2002; BUKOWSKI et al., 2005; LEU et al., 2005). Essa inibição
levaria a um aumento na maturação óssea, o que traria como conseguinte uma
maior resistência à reabsorção daquele osso mais mineralizado (GRIER & WISE,
1998).
O grupo P-C-P, uma estrutura comum dos bisfosfonados, é resistente à
hidrólise enzimática, o que explica porque os bisfosfonados não são metabolizados
no corpo, sendo excretados de forma inalterada pelos rins, em parte por um
processo de secreção tubular ativa. Apresentam baixa absorção no intestino, o que
pode ser atribuído ao tamanho e carga do grupo atuando como agentes limitantes
da sua penetração na membrana celular. A concentração destes compostos será
maior para o osso medular e menor para o osso cortical (ADACHI et al., 1994;
RODAN & FLEISCH, 1996; FLEISCH, 1998; RUSSEL & ROGERS, 1999). Deve-se
considerar ainda que sua meia-vida óssea situa-se entre três meses e um ano
(KOIVUKANGAS et al., 2001).
Cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características
químicas, físico-químicas e biológicas (IGARASHI et al., 1994; RODAN & FLEISCH,
1996; FLEISCH, 1998; ITO et al., 2001; HORIE et al., 2003), sendo elas dosedependentes (HUGHES, et al., 1995; BREZNIAK & WASSERSTEIN, 2002; LIU et
al., 2004).
Os mecanismos de ação destes fármacos podem ser considerados em três
níveis: tecidual, celular, e molecular. Em nível tecidual, a ação de todos os
bisfosfonados aparenta ser semelhante: redução da renovação óssea (RODAN &
FLEISCH, 1996; FLEISCH, 1998).
Em nível celular, os osteoclastos constituem o alvo dos bisfosfonados.
Estas células podem ter sua ação reduzida através: da inibição do seu
23
recrutamento para a superfície óssea; da inibição da sua atividade na superfície
óssea; ou da diminuição do seu ciclo celular, uma vez que, após desligarem-se da
superfície óssea, tais osteoclastos sofreriam um processo de apoptose (ADACHI
et al.,1994; RODAN & FLEISCH, 1996; MURAD et al., 1997; RUSSEL &
ROGERS, 1999; ITO et al., 1999; ITO et al., 2001).
Uma vez que os odontoclastos apresentam características semelhantes
aos osteoclastos, estudos revelam que também estes últimos sofrem apoptose
após a administração de bisfosfonado, apresentando alterações citológicas,
incluindo atividade reabsortiva reduzida (IGARASHI et al., 1994; WATANABE et
al., 2000).
Em nível molecular, a cadeia de eventos que leva à inativação
osteoclástica ou à sua formação diminuída, decorrente da exposição direta ou
indireta a determinado bisfosfonado ainda não foi completamente elucidada. As
possibilidades incluem tanto a sua ação direta num receptor da superfície celular
e/ou a sua fagocitose pelo osteoclasto no interior do qual ele interage com uma
enzima ou outra molécula afetando o metabolismo celular (RODAN & FLEISCH,
1996).
O mecanismo através do qual o bisfosfonado penetra no osteoclasto pode
ser tanto a difusão passiva como durante a reabsorção, graças às características
endocíticas destas células (SAHNI et al., 1993, IGARASHI et al., 1996). Estes
processos são creditados às suas bordas em escova, apesar de alguns autores
sugerirem a existência de uma outra via de captação destes compostos (ITO et
al., 2001).
Os efeitos positivos de tais compostos podem ser aplicados à clínica
ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área.
24
A exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de
bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica dentária
como a recidiva podem ser evitadas. Isto sugere que tais substâncias podem ser
úteis no reforço de ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico
(IGARASHI et al., 1994; KIM et al., 1999; LIU et al., 2004). Além disso, a
administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas
de reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica
(IGARASHI et al., 1994).
Acredita-se que o período de maior concentração de osteoclastos na
superfície radicular não coincide com o de máxima atividade destas células na
superfície óssea e, conseqüentemente, com o de movimentação ortodôntica mais
intensa. De fato, este pico de concentração de osteoclastos na raiz ocorre
posteriormente (IGARASHI et al., 1996; RODY Jr et al., 2001; NOXON et al.,
2001). Tal consideração pode viabilizar a utilização de bisfosfonados para diminuir
o risco de reabsorção radicular sem comprometer a taxa de movimentação
dentária.
Estudos sobre a relação existente entre a estrutura e a atividade dos
bisfosfonados indicam que a sua potência e o seu mecanismo de ação variam de
acordo com a cadeia lateral ligada ao átomo de carbono na molécula de P-C-P.
Baseado na diferença da estrutura desta cadeia lateral, eles podem ser divididos em
duas classes: os que contêm uma molécula de Nitrogênio e os que não a contêm.
Essas duas classes de medicamento também diferem no seu mecanismo de ação
molecular. Investigações recentes revelaram que aqueles bisfosfonados que
apresentam um átomo de Nitrogênio na cadeia lateral, tais como o alendronato, são
mais potentes do que os que não o apresentam, inibindo a reabsorção por bloquear
25
a penetração de proteínas nos osteoclastos (DUNFORD et al., 2001; FRITH &
ROGERS, 2003; LIU et al., 2004; BUKOWSKI et al., 2005). Os bisfosfonados que
não contêm o átomo de Nitrogênio podem ser incorporados a análogos do ATP e
atuar inibindo a síntese de proteínas e induzindo a apoptose nos osteoclastos
(FRITH & ROGERS, 2003; BUKOWSKI et al., 2005).
O clodronato, por sua vez, encontra-se no grupo dos bisfosfonados que não
apresentam o átomo de Nitrogênio (LIU et al., 2004). Ao invés disso, contém dois
átomos de Cloro na cadeia lateral, apresentando propriedades físico-químicas
semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica (PLOSKER &
GOA, 1994; FRITH & ROGERS, 2003; LIU et al., 2004).
Somada a atividade anti-reabsortiva, tem sido relatada a associação deste
tipo de bisfosfonado com uma função antiinflamatória (LIU et al., 2004). Uma vez
que as citocinas e os mediadores do processo inflamatório desempenham
importante papel na resposta biológica à simulação mecânica ortodôntica, incluindo
reações adversas como dor (NGAN et al., 1994) e reabsorção radicular (BRUDVIK &
RYGH, 1994), o clodronato pode ser considerado em estudos que envolvam o
controle da movimentação ortodôntica (LIU et al., 2004).
O clodronato é um bisfosfonado de segunda geração de potência baixa
quando comparado com as drogas mais recentes, mas tem sido bem estudado e já
se encontra comercialmente disponível (KAASTAD et al., 1997; LIU et al., 2004).
Uma característica importante associada ao clodronato é que sua atividade
anti-reabsortiva não prejudica a mineralização óssea e, além disso, ele tem sido
associado à prevenção de perda óssea decorrente de imobilização em pacientes
paraplégicos (KAASTAD et al., 1997).
26
Estudos mostram que a administração de clodronato por períodos longos em
dosagem terapêutica apresenta alguns efeitos benéficos e nenhum efeito colateral
sobre o desenvolvimento ósseo normal (KOIVUKANGAS et al., 2001).
Num estudo desenvolvido por LIU e colaboradores, em 2004, constatou-se
que a administração local do clodronato não causa qualquer tipo de reação
inflamatória significativa no local da aplicação ou efeito colateral sistêmico, tais como
perda de apetite ou alteração no peso dos animais. Além disso, os autores
concluíram que essa droga inibe a movimentação dentária induzida pelo estresse
ortodôntico (HAYASHI et al., 2002; LIU et al., 2004).
A necessidade de maiores esclarecimentos acerca da efetividade e do
mecanismo através do qual o clodronato diminui a reabsorção radicular motivou a
realização desse estudo experimental, cujo objetivo é testar a hipótese do clodronato
inibir de maneira seletiva tal processo, com pouca ou nenhuma influência na taxa de
movimentação dentária induzida ortodonticamente.
27
2 PROPOSIÇÃO
Após o exposto, o autor se propõe a:
1. Avaliar a ação de dois regimes de aplicação do clodronato no periodonto
de inserção de ratos (Rattus norvegicus) durante uma semana de
movimentação dentária ortodôntica;
2. Comparar as taxas de movimentação dentária nesta mesma condição
experimental;
3. Testar a viabilidade do uso deste medicamento para diminuição da
reabsorção radicular induzida ortodonticamente.
28
3 ABORDAGEM EXPERIMENTAL
Esta pesquisa consistiu na utilização de Rattus norvegicus, tendo seguido as
normas de conduta de experimentação animal do Centro de Pesquisa Gonçalo
Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba) e foi realizada de acordo com as
Normas para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais, recomendadas
pela Lei 6638 de 08 de maio de 1979 (Anexo).
3.1 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS
Os animais foram fornecidos e mantidos no biotério do Centro de Pesquisa
Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba), em temperatura
ambiente e com iluminação dia e noite, alimentados com ração Purina LabinaTM e
água ad libitum e pesados quando da montagem do aparelho e no dia da sua morte,
com o objetivo de se observar quaisquer alterações de peso relacionadas à
alimentação e/ou às condições experimentais (Figura 1).
29
Figura 1. Pesagem do animal
3.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Foram
utilizados
dezoito
ratos
(Rattus
norvegicus),
machos,
com
aproximadamente 300g e dois meses de vida.
De acordo com a proposição deste trabalho, os animais foram aleatoriamente
distribuídos em três grupos: CONTROLE, com seis animais submetidos à
movimentação dentária ortodôntica; GRUPO I, com cinco animais tratados com
administração do clodronato por via subctânea nos dias 0, 2, 4 e 6 do experimento e
submetidos à movimentação dentária ortodôntica; e GRUPO II, com sete animais
tratados com administração de clodronato por via subcutânea no dia 5 e submetidos
à movimentação dentária ortodôntica. Todos foram mortos no dia 7 do experimento
(Quadro 1).
Os animais foram alimentados diariamente, acompanhados in loco e a
serragem das gaiolas trocada a cada 48 horas. Estas foram identificadas com o
nome do pesquisador, data da montagem do aparelho e da morte e grupo
experimental.
30
Grupo / Dia
CONTROLE
GRUPO I
GRUPO II
0
1
2
3
4
5
6
7
N
mo
mo
mo
mo
mo
mo
mo
S
06
C mo
mo
C mo
mo
C mo
mo
C mo
S
05
mo
mo
mo
mo
mo
C mo
mo
S
07
Quadro 1.Identificação dos grupos a serem estudados. mo (movimento ortodôntico), S (sacrifício); C
(aplicação de clodronato) e N (número de animais por grupo).
3.3 MANIPULAÇÃO DA AMOSTRA
3.3.1 Anestesia
Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia geral, obtida pela
associação de 1,33 mL/kg de cloridrato de quetamina e 0,67 mL/kg de xilazina por
via subcutânea.
3.3.2 Montagem do Aparelho
Maxila – O aparelho consistiu na utilização de fio de aço inoxidável de 0.08”
(fio de amarrilho) da marca Dental Morelli para adaptação cervical do primeiro molar
superior esquerdo. A este amarrilho foi adaptada uma mola fechada de níquel-titânio
(NiTi) da TP Orthodontics®, presa na sua extremidade anterior a fio de amarrilho de
mesmo calibre e marca (Figura 2). Este, por sua vez, foi introduzido em orifício
criado entre os incisivos superiores, no terço cervical, com broca esférica nº2 (KG
Sorensen), montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico BLM 600
(Driller) (Figura 3).
31
a
b
c
d
Figura 2. Adaptação cervical do conjunto amarrilho-mola de NiTi ao primeiro molar superior
esquerdo: a. fio de amarrilho metálico 0.08” (Dental Morelli) sendo introduzido na
região entre 1º e 2ºmolares superiores esquerdos com o auxílio de uma pinça Mathiew;
b. fio de amarrilho após passar pelo ponto de contato; c. fio de amarrilho envolvendo o
1ºM com a respectiva mola de NiTi; d. amarração do conjunto mola-fio de amarrilho
com o auxílio da Mathiew à cervical do 1ºM.
a
b
Figura 3. a e b. Confecção do orifício entre os incisivos superiores com broca esférica nº2 (KG
Sorensen).
A força desenvolvida pela mola foi de 45g. Para proceder à ativação do
aparelho, os animais foram posicionados num dispositivo de acrílico ligeiramente
32
inclinado, em decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo. Foi preso ao
amarrilho fixado à extremidade anterior da mola de NiTi um peso de chumbo de 45g
que ficou suspenso, criando uma distensão na mola produzindo força equivalente
(Figura 4a e b). O amarrilho envolveu os incisivos e foi fixado à sua superfície
vestibular, previamente atacada com ácido fosfórico a 37% (Vigodent), sendo
coberto por resina composta fotopolimerizável (Vigodent), removendo-se o excesso
de fio de amarrilho com alicate de corte específico (Unitek- 3M) (Figura 5a e c).
a
b
Figura 4. a. Animal posicionado em dispositivo de acrílico ligeiramente inclinado, em decúbito
dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo; b. peso de chumbo de 45g preso ao
amarrilho fixado à extremidade anterior da mola de NiTi, distendendo-a, produzindo
força equivalente.
O movimento dentário ortodôntico ocorreu durante sete dias, ao término dos
b
quais os ratos foram mortos.
Mandíbula – Os procedimentos na mandíbula limitaram-se à extração do
primeiro molar esquerdo, realizada com o auxílio de pinça mosquito (Quinelato); e ao
desgaste dos incisivos para evitar danos o aparelho, realizado com fresa do tipo
33
roda (KG Sorensen), montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico
BLM 600 (Driller) (Figura 5b).
a
b
c
Figura 5. a. Fotopolimerização da resina na região anterior; b. desgaste dos incisivos
inferiores com fresa do tipo roda (KG Sorensen)e c. aparelho montado.
3.3.3 Administração do Clodronato
O clodronato utilizado foi o Ostac® (sal sódico do ácido clodrônico) em
solução injetável (Figura 6). Sua administração ocorreu por via subcutânea numa
concentração de 10 mg/Kg. A solução de clodronato foi preparada diluindo-o em
água destilada, até alcançar uma concentração de 2x10-3M, sendo o seu pH
ajustado a 7,4.
34
Figura 6. OSTAC – Solução
injetável.
Os animais do Grupo I receberam a medicação nos dias 0, 2, 4 e 6 em dose
única e horário pré-estabelecido; e os animais do Grupo II receberam o bisfosfonado
em dose única no quinto dia, também em horário pré-estabelecido.
3.3.4 Avaliação da quantidade de movimento dentário
A avaliação clínica da movimentação dentária consistiu na realização de
medidas iniciais e finais do período experimental, feitas duas vezes por um mesmo
examinador, previamente calibrado, com o auxílio de paquímetro de precisão
(Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP). Foram utilizadas como referências a face
mesial do primeiro molar superior esquerdo e um orifício criado na resina localizada
na face vestibular dos incisivos superiores. Considerou-se como taxa de
movimentação dentária a diferença entre as medidas iniciais e finais (Figura 7).
35
a
b
Figura 7. a. Avaliação da distância entre a face mesial do primeiro molar superior esquerdo e
um orifício criado na vestibular dos incisivos superiores, utilizando paquímetro de
precisão (Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP); b. espaço criado na distal do
primeiro molar pelo deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação
de força (seta).
3.4 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Após a morte dos animais, os ossos maxilares foram dissecados e
osteotomizados para a obtenção de secções teciduais das regiões mesial e distal
aos primeiros molares superiores, englobando estruturas periodontais e dentárias
(Figura 8).
Figura 8. Osso maxilar osteotomizado.
A fixação das peças foi feita com solução contendo paraformaldeído a 4%,
Glutaraldeído a 2,5%, tamponada com Cacodilato 0,1M. Subseqüentemente, foram
36
descalcificadas por quatro semanas em solução contendo 10g de EDTA para 50mL
de Cacodilato de 0,2M.
As peças descalcificadas foram reduzidas em suas porções mesial e distal, de
modo a preservar a região de implantação dos molares, e incluídas em parafina.
Secções sagitais seriadas de 3µm, processadas para coloração de rotina
(hematoxilina e eosina – HE), foram usadas para observações em microscópio de
luz (Olympus BX51).
3.5 COLETA DE DADOS E ANÁLISE DAS LÂMINAS
Utilizando-se microscopia de luz em aumentos variados, um único
examinador, previamente calibrado, realizou uma análise descritiva e semiquantitativa, considerando a presença ou ausência dos seguintes aspectos
representativos do processo de movimentação ortodôntica: reabsorção radicular,
reabsorção óssea e concentração de osteoclastos. Para tanto, foram avaliadas as
áreas de compressão e tração do ligamento periodontal na região de furca no terço
cervical (superfície mesial da raiz distal e distal da raiz mesial, respectivamente).
A padronização da análise semi-quantitativa foi obtida pela determinação de
referenciais numéricos de correlação abaixo especificados (Quadro 2).
0 – Ausente
1- Leve
2 - Moderado
3 – Intenso
Quadro 2. Representação esquemática dos referenciais numéricos utilizados.
No instante da coleta, os dados foram registrados em tabelas com as
informações esquematizadas como apresentado (Quadro 3).
37
Reabsorção Radicular
Reabsorção Óssea
Concentração de Osteoclastos
Quadro 3. Representação da tabela utilizada para registro dos dados
Quando da análise, os dados coletados foram organizados e as lâminas
fotografadas por meio de sistema fotográfico digital Sansung acoplado ao
microscópio (Olympus BX51).
Os resultados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism® versão
4.0, sendo que as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de análise
de variância (ANOVA), tendo-se adotado como estatisticamente significantes valores
de p menores que 0,05 (p<0,05).
38
4 DESENVOLVIMENTO SEQUENCIAL DA PESQUISA
4.1 ARTIGO 1 (a ser submetido para publicação no periódico The Angle
Orthodontist)
Avaliação dos Efeitos do Clodronato na Movimentação Dentária e Reabsorção
Radicular em Rattus norvegicus
Telles-Pinheiro, A. M.; Vannier-Santos, M. A.; Oliveira-Costa, M. R. L.
Resumo
Objetivo: Avaliar os efeitos induzidos pela aplicação de clodronato na fase
intermediária (5º dia) do ciclo de remodelação alveolar em ratos submetidos à
movimentação dentária induzida ortodonticamente.
Materiais e Métodos: Dezoito ratos foram distribuídos em três grupos: CONTROLE,
com 6 animais; GRUPO I, com 5 animais (clodronato administrado nos dias 0, 2, 4 e
6); GRUPO II, com 7 animais (clodronato administrado no 5º dia). Todos foram
submetidos à movimentação dentária ortodôntica e mortos no sétimo dia do
experimento.
A
taxa
de
movimentação
foi
calculada
e
foram
avaliados
39
histologicamente os seguintes aspectos: reabsorção radicular, reabsorção óssea e
concentração de osteoclastos.
Resultados: Comparando-se as taxas de movimentação foi encontrada diferença
estatisticamente significante entre os grupos CONTROLE e I, o que não ocorreu
entre o CONTROLE e o GRUPO II. Durante a análise histológica semi-quantitativa o
GRUPO CONTROLE apresentou concentração de osteoclastos superior em relação
ao GRUPO II (83% e 43%, respectivamente, para o grau moderado-intenso). A
reabsorção óssea nesses dois grupos, por sua vez, não apresentou diferenças
marcantes (50% e 57%, respectivamente, para o grau moderado-intenso), enquanto
que a reabsorção radicular foi maior no GRUPO CONTROLE do que nos grupos I e
II (respectivamente 67%, 20% e 57% para o grau moderado-intenso).
Conclusões: A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação
dentária sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir
a reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária induzida
ortodonticamente.
PALAVRAS-CHAVE: Clodronato; Reabsorção radicular; Movimentação dentária
ortodôntica.
40
INTRODUÇÃO
Inúmeros estudos vêm sendo desenvolvidos ao longo dos anos com o
objetivo de se descobrir recursos através dos quais se consiga diminuir o risco de
reabsorção radicular durante o tratamento ortodôntico. Após a descoberta da
eficácia dos bisfosfonados na formação e dissolução de fosfato de cálcio in vitro,
bem como na mineralização e reabsorção óssea in vivo, estes passaram a ser
utilizados no tratamento de desordens ósseas tais como a Doença de Paget, a
hipercalcemia maligna, a displasia fibrosa, e a osteoporose
1-5
e, por ligarem-se de
maneira eficiente à hidroxiapatita, têm sido associados a uma provável interferência
na reabsorção óssea e radicular.
O mecanismo de ação desses agentes ainda não foi completamente
esclarecido e cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características
químicas, físico-químicas e biológicas 1, 3, 5, 6, 7, sendo elas dose-dependentes 8 - 11.
O clodronato encontra-se no grupo dos bisfosfonados que contém dois
átomos de Cloro na cadeia lateral, apresentando propriedades físico-químicas
semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica 11 - 14.
ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área. A
exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de
bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica como a
recidiva podem ser evitadas. Isto torna tais substâncias úteis no reforço de
ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico
4, 6, 11
. Além disso, a
administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas de
reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica 6.
41
Os dados conseguidos a partir de uma ativação simples de aparelhos
ortodônticos montados em ratos sugerem que o período entre o estímulo e o
aumento detectável na população de osteoclastos é de aproximadamente três dias,
sendo este o intervalo mínimo para que a remodelação óssea alveolar apareça
nesses animais (um e quatro dias após a ativação inicial)
15 - 17
. Por sua vez, o
número e o tamanho dessas células, além do perímetro da erosão atingem o seu
pico no quinto dia de movimentação dentária ortodôntica experimental, sendo a
superfície mesial radicular (lado de pressão) a mais atingida 18.
Acredita-se que o período de maior concentração de osteoclastos na
superfície radicular não coincida com o de máxima atividade dessas células na
superfície óssea e, conseqüentemente, com o de movimentação ortodôntica mais
intensa. De fato, num estudo desenvolvido por Rody Jr. e colaboradores, em 2001, a
cinética osteoclástica foi observada, tendo sido constatado que o número de
osteoclastos no dia 3 encontra-se significativamente maior no osso alveolar e no
ligamento periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico ocorre no dia
7, evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em momentos
distintos19 - 21.
O objetivo desta pesquisa é avaliar os efeitos induzidos pela aplicação de
clodronato na fase intermediária (5º dia) do ciclo de remodelação alveolar em ratos
submetidos à movimentação dentária induzida ortodonticamente.
42
MATERIAIS E MÉTODOS
Esta pesquisa consistiu num estudo experimental com Rattus Norvegicus,
tendo seguido as normas de conduta de experimentação animal do Centro de
Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-Ba) e as Normas
para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais, recomendadas pela Lei
6638 de 08 de maio de 1979.
Os animais foram fornecidos e mantidos no biotério da FIOCRUZ-Ba, em
temperatura ambiente, com iluminação dia e noite, alimentados com ração Purina
LabinaTM e água ad libitum e pesados quando da montagem do aparelho e no dia da
morte, com o objetivo de se observar quaisquer alterações de peso relacionadas à
alimentação e/ou às condições experimentais
Dezoito ratos (Rattus norvegicus), machos, com aproximadamente 300g e
dois meses de vida foram distribuídos, aleatoriamente, em três grupos: CONTROLE,
com seis animais; GRUPO I, com cinco animais tratados com administração do
clodronato por via subctânea nos dias 0, 2, 4 e 6 do experimento; e GRUPO II, com
sete animais tratados com administração em dose única de clodronato por via
subcutânea no dia 5. Todos os animais foram submetidos à movimentação dentária
ortodôntica e mortos no dia 7 do experimento.
Os procedimentos foram realizados sob anestesia geral, obtida pela
associação de 1,33 mL/kg de cloridrato de quetamina e 0,67 mL/kg de xilazina por
via subcutânea.
O aparelho consistiu na utilização de fio de aço inoxidável de 0.08” (fio de
amarrilho) da marca Dental Morelli para laçar o primeiro molar superior esquerdo . A
esse amarrilho foi adaptada uma mola fechada de níquel-titânio (NiTi) da TP
43
Orthodontics®, presa na sua extremidade anterior a fio de amarrilho de mesmo
calibre e marca. Esse, por sua vez, foi introduzido em orifício criado entre os
incisivos superiores, no terço cervical, com broca esférica nº2 (KG Sorensen),
montada em peça reta (Kavo) adaptada a um motor elétrico BLM 600 (Driller).
A força liberada pela mola foi de 45g. Para proceder à ativação do aparelho,
os animais foram posicionados num dispositivo de acrílico ligeiramente inclinado, em
decúbito dorsal, com a cabeça perpendicular ao solo. Foi preso ao amarrilho fixado à
extremidade anterior da mola de NiTi um peso de chumbo de 45g que ficou
suspenso, criando uma distensão na mola produzindo força equivalente. O amarrilho
envolveu os incisivos e foi fixado à sua superfície vestibular, previamente atacada
com ácido fosfórico a 37% (Vigodent), sendo coberto por resina composta
fotopolimerizável (Vigodent), removendo-se o excesso de fio de amarrilho com
alicate de corte específico (Unitek- 3M) (Figura 1a).
Os procedimentos na mandíbula limitaram-se à extração do primeiro molar
esquerdo e ao desgaste dos incisivos para evitar danos ao aparelho.
O clodronato utilizado foi o Ostac® (sal sódico do ácido clodrônico) em
solução injetável. Sua administração ocorreu por via subcutânea numa concentração
de 10 mg/Kg. A solução de clodronato foi preparada diluindo-o em água destilada,
até alcançar uma concentração de 2x10-3M, sendo o seu pH ajustado a 7,4. Os
animais do GRUPO I receberam a medicação nos dias 0, 2, 4 e 6 em dose única e
horário pré-estabelecido; e os animais do GRUPO II receberam o bisfosfonado em
dose única no dia 5, também em horário pré-estabelecido.
O movimento dentário ortodôntico ocorreu durante sete dias, ao término dos
quais os ratos foram mortos.
44
A avaliação clínica da movimentação dentária consistiu na realização de
medidas iniciais e finais do período experimental, com o auxílio de paquímetro de
precisão (Beerendonk Caliper 78532 - AESCULAP). Foram utilizadas como
referências a face mesial do primeiro molar superior esquerdo e um orifício criado na
resina localizada na face vestibular dos incisivos superiores. Considerou-se como
taxa de movimentação dentária a diferença entre as medidas iniciais e finais (Figura
1b e c). Esses dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA).
Após a morte dos animais, os ossos maxilares foram dissecados e
osteotomizados para a obtenção de secções teciduais das regiões mesial e distal
aos primeiros molares superiores, contendo estruturas periodontais e dentárias.
A fixação das peças foi feita com solução contendo paraformaldeído a 4%,
glutaraldeído a 2,5%, tamponada com cacodilato 0,1M. Subseqüentemente, foram
descalcificadas por quatro semanas em solução contendo 10g de EDTA para 50ml
de cacodilato de 0,2M.
As peças descalcificadas foram reduzidas em suas porções mesial e distal, de
modo a preservar a região de implantação dos molares, e incluídas em parafina.
Secções sagitais seriadas de 3µm, processadas, coradas com hematoxilina e eosina
(HE), foram usadas para observações em microscópio de luz (Olympus BX51).
Foram realizadas análises descritiva e semi-quantitativa, considerando-se os
seguintes aspectos: reabsorção radicular, reabsorção óssea e concentração de
osteoclastos. Para tanto, foram avaliadas as áreas de compressão do ligamento
periodontal na região de furca, no terço cervical (superfície mesial da raiz distal).
Os resultados obtidos foram analisados no software GraphPad Prism® versão
4.0, sendo que as diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de análise
45
de variância (ANOVA). Foram considerados estatisticamente significantes valores de
p menores que 0,05 (p<0,05).
46
RESULTADOS
- Movimentação Dentária
Pelo teste de Kolomorov-Smirnov, constatou-se distribuição normal da taxa de
movimentação entre os três grupos, com p valor igual a 0,05.
A média de movimentação dentária para o GRUPO CONTROLE foi de
1,1mm; para o GRUPO I, 0,5mm e para o GRUPO II, 0,9mm. A análise de variância
(ANOVA)
indicou
diferença
estatisticamente
significante
entre
o
GRUPO
CONTROLE e o GRUPO I, o que não foi detectado entre o GRUPO II e o GRUPO
CONTROLE (Gráfico 1), com p < 0,001.
- Reabsorção Óssea
A reabsorção óssea encontrou-se em grau moderado-intenso em 50% dos
espécimes para o GRUPO CONTROLE e 57% para o GRUPO II (Figura 2). Essa
diferença, todavia, não foi considerada estatisticamente significante.
Cem por cento das peças avaliadas do GRUPO I apresentaram reabsorção
óssea em grau ausente-leve. Quando esses dados são comparados com os dos
outros dois grupos, percebe-se significância estatística (p=0,046) (Figura 3; Gráfico
2).
- Reabsorção Radicular
No
grupo
CONTROLE
observou-se
33%
da
amostra
apresentando
reabsorção radicular em grau ausente-leve, enquanto que 67% apresentaram esse
mesmo aspecto variando de moderado a intenso (Gráfico 3). A maioria dessas
lacunas eram ativas, contendo osteoclastos no seu interior (Figura 4).
47
No GRUPO II o padrão de reabsorção radicular foi mais suave, com 43%
apresentando-o em grau ausente-leve (Figura 6b) e 57%, moderado-intenso (Gráfico
3). Uma diferença marcante foi que a maior parte dessas lacunas apresentaram-se
inativas, com ausência de células multinucleadas no seu interior e, muitas dessas
lesões, em franca regeneração (Figura 5).
No GRUPO I 80% dos animais exibiram esse aspecto de forma ausente-leve,
enquanto os outros 20%, moderado-intenso (Figura 6a).
- Concentração de Osteoclastos
A concentração de osteoclastos, dentro de um padrão moderado-intenso, no
GRUPO CONTROLE foi de 83% (Figura 2a). O GRUPO II, por sua vez, apresentou
esse mesmo padrão em 43% (Figura 2b) e no GRUPO I 100% dos espécimes exibiu
essa taxa em grau ausente-leve (Figura 7; Gráfico 4).
Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos I e CONTROLE.
48
DISCUSSÃO
A montagem do aparelho utilizada trouxe como vantagem a liberação de força
durante um intervalo de tempo suficientemente longo para induzir a reabsorção
radicular de forma constante, além de ser bem tolerada pelos animais, o que está de
acordo com os achados de Brudvik & Rygh, em 1993. Essa foi padronizada em 45g,
sendo capaz de estimular a movimentação ortodôntica, além de induzir a
diferenciação de um grande número de osteoclastos 16, 21 - 23.
Foram utilizadas, como recurso para ativação do aparelho, molas de níqueltitânio. Dessa forma, buscou-se eliminar os efeitos do tempo, temperatura, pH
salivar, absorção de água e da deformação permanente sofridos pelos recursos
elastoméricos 24.
Apesar de alguns autores defenderem a idéia de que os estudos que
descrevem as características e a resposta biológica durante a fase linear do
movimento dentário ortodôntico devam apresentar um período experimental de pelo
menos duas semanas
25
, o presente trabalho levou em consideração que a fase de
recrutamento dos osteoclastos normalmente coincide com o primeiro dia após a
ativação inicial do aparelho no rato, enquanto que o pico do aumento no seu número
ocorre quatro dias após a ativação inicial
16, 17
. Acredita-se ainda que o aumento na
concentração dessas células se dá de maneira diferenciada para o osso alveolar e
para a superfície radicular. Rody Jr. e colaboradores, em 2001, constataram que o
número de osteoclastos no dia 3 encontra-se significativamente maior no osso
alveolar e no ligamento periodontal. Por outro lado, na superfície radicular esse pico
ocorre no dia 7, evidenciando que tais células chegam nessas diferentes regiões em
momentos distintos
20
. Dessa forma, os animais foram sacrificados no sétimo dia do
49
experimento, o que está de acordo com metodologias desenvolvidas também em
outros trabalhos 18, 20, 21, 23.
A mecânica ortodôntica utilizada produz um deslocamento dentário inicial de
inclinação mesial, cujo centro de resistência localiza-se próximo ao ápice radicular,
criando áreas de tensão e compressão bem características. Por essa razão, foi
escolhido para ser avaliado o terço cervical da superfície mesial da raiz distal na
região de furca (área de compressão), concordando com relatos encontrados na
literatura
18, 22, 23
. Tais regiões são claramente de maior risco para a reabsorção
radicular do que as de tensão, por apresentarem indução osteoclástica associada à
existência de força compressiva no ligamento periodontal 17, 18, 23, 26.
Tem sido observado que o osso alveolar adjacente a áreas de hialinização
tecidual não é reabsorvido na fase inicial da movimentação dentária
26
. Tais regiões
são comumente observadas no terceiro ou quarto dia de experimento, normalmente
nas superfícies mesiais das raízes, podendo estar relacionadas com reabsorções
radiculares
22
. Nesse estudo, poucas áreas de tecido hialinizado puderam ser
detectadas. Esse baixo índice pode estar associado ao fato dos animais terem sido
sacrificados no sétimo dia do experimento, o que pode sugerir que uma eliminação
prévia do tecido necrótico já tenha ocorrido, deixando como seqüelas áreas de
reabsorção radicular, caracterizadas como pequenas lacunas ou cavidades no
cemento, algumas atingindo a junção cemento-dentinária 9, 10, 27.
A remoção do tecido hialinizado ocorre antes e durante o restabelecimento do
ligamento periodontal. Dessa forma, algumas áreas da superfície radicular tornamse menos protegidas e, portanto, mais susceptíveis à reabsorção, sendo
prontamente atacadas por osteoclastos. Uma vez criadas as lacunas de reabsorção,
o cemento é removido da sua superfície de maneira gradativa 9, 10, 27. Com isso, após
50
movimentação induzida, além de ter sido detectada redução significativa na altura da
crista alveolar na região de furca e alargamento da membrana periodontal na
periferia dos sítios de compressão, também foram observadas lacunas de
reabsorção radicular ativas nos três grupos 22.
Analisando os dados obtidos a partir do GRUPO CONTROLE, observa-se um
quadro histológico previsível, com uma concentração de osteoclastos variando,
principalmente, de moderada a intensa, compatível com a estimulação ortodôntica
desenvolvida 15 - 18, 21, 23, 26.
No GRUPO I foi detectada uma concentração de 100% da reabsorção óssea
dentro de um padrão ausente-leve, o que condiz com a concentração reduzida do
número de osteoclastos presentes (100% - ausente-leve). Pela mesma razão, as
lacunas de reabsorção radicular ativas não foram observadas ou encontraram-se de
forma leve na maioria dos animais avaliados desse grupo (80%), o que está de
acordo com a literatura quando afirma que a administração de bisfosfonado causa a
redução tanto no número de lacunas de reabsorção quanto no de osteoclastos
durante a movimentação ortodôntica 6.
Sendo assim, a taxa de movimentação dentária para esse grupo mostra que a
administração do clodronato influenciou tal aspecto, vez que diminuiu de forma
estatisticamente significativa quando comparada com o GRUPO CONTROLE, o que
concorda com a literatura quando sugere que tais substâncias podem ser úteis no
reforço de ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico4, 6, 11.
Para o GRUPO II, a administração do clodronato ocorreu no quinto dia de
movimentação ortodôntica, uma vez que existem estudos que afirmam que do
primeiro ao sétimo dia após a aplicação de uma força ortodôntica, a concentração de
pré-osteoclastos e osteoclastos aumenta no lado de pressão do ligamento
51
periodontal, havendo um pico no quarto ou quinto dia na superfície alveolar e um
decréscimo a partir do sétimo15 - 18, 20, 21, 23, 26. Por outro lado, no sétimo dia estaria
ocorrendo um aumento no número de osteoclastos na superfície radicular20. Com a
metodologia aplicada a esse grupo, buscou-se atingir uma concentração máxima do
bisfosfonado coincidente ao momento de maior atividade osteoclástica na superfície
radicular. Há autores, entretanto, que indicam que, na circunferência do ligamento
periodontal necrótico, a reabsorção radicular ocorre após 2 a 3 dias em ratos 22.
O
GRUPO
II
apresentou
uma
concentração
de
osteoclastos
predominantemente dentro de um padrão ausente-leve (57%), especialmente na
superfície radicular. Dessa forma, as lacunas de reabsorção radicular apresentaramse com menor freqüência, dimensão e atividade osteoclástica quando comparadas
ao GRUPO CONTROLE sem, entretanto, influenciar significativamente a taxa de
movimentação dentária. Tal fato deve-se, provavelmente, à atuação do clodronato
nas fases iniciais do ciclo de remodelação no rato, coincidindo com o pico de
osteoclastos na superfície radicular. Esses resultados são importantes quando
confrontados com relatos prévios da utilização clínica dos bisfosfonados em
Ortodontia para inibir a reabsorção óssea 1, 9, 10, 28, 29, podendo ser úteis no reforço de
ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico
6, 11
. Tais propriedades
precisam ser entendidas sempre como dependentes da dose e do período do ciclo
de remodelação em que a droga é administrada8 - 11.
A dose diária subcutânea relativamente alta de 10 mg/Kg do clodronato vem
sendo usada em diversos estudos desenvolvidos em ratos e tem mostrado aumentar
a densidade óssea desses animais
30
. Tal fato fundamentou a dosagem utilizada no
presente trabalho, assim como o tempo de aplicação da droga baseou-se na cinética
osteoclástica que vem sendo estudada ao longo dos anos, demonstrando que,
52
dependendo do período em que a droga é administrada, a população de
osteocalstos vai estar mais concentrada na superfície alveolar ou radicular20.
O fato de que no GRUPO II houve uma diminuição no número de
osteoclastos e estes estariam tendendo a concentrar a sua ação na reabsorção
óssea pode sustentar a hipótese de que o pico da concentração dessas células na
raiz ocorre posteriormente, ou sugerir que cementoclastos e osteoclastos podem
apresentar meias-vidas diferentes 19- 21.
Quando os três grupos são comparados em relação à taxa de movimentação
dentária, observa-se que não houve diferenças estatisticamente significante entre os
grupos CONTROLE e II, podendo-se inferir que, apesar do clodronato ter sido
administrado, a movimentação ortodôntica não foi alterada. Entre os grupos
CONTROLE e I, por sua vez, foi detectada uma diminuição desse mesmo aspecto
com significância estatística. Duas considerações podem ser feitas acerca desses
achados: a primeira é a de que o clodronato estaria interferindo na cinética
osteoclástica, vez que, sendo administrado no quinto dia, conseguiria inibir o
aumento da concentração dessas células na superfície radicular, já tendo esse
mesmo pico ocorrido na superfície óssea e, portanto, possibilitando a movimentação
dentária ortodonticamente induzida, ao contrário do que foi observado no GRUPO I.
Nesse, a administração do medicamento nos dias indicados pode ter atuado numa
fase inicial da movimentação dentária, quando a concentração de osteoclastos é alta
na superfície alveolar, impedindo a reabsorção nessa região e, por conseguinte, o
deslocamento do dente. Outra consideração a ser feita é se essa interferência
ocorreu em virtude da dosagem do medicamento ter sido diferenciada. Para
esclarecer eventuais dúvidas outros estudos devem ser realizados, com variações
nas dosagens, em períodos diferentes.
53
Qualquer correlação a ser feita com o movimento ortodôntico em humanos,
deve considerar que neles a fase em que o osso é reabsorvido no ciclo de
remodelação dura aproximadamente um mês, enquanto que o mesmo período
aparenta finalizar em aproximadamente uma semana em estudos realizados em
ratos17.
Um dos maiores interesses relacionados a esse tipo de experimento consiste
em quanto tais achados podem ser extrapolados para o ser humano. Uma vez que a
maioria dos estudos com experimentação animal vem sendo realizada em ratos, as
diferenças morfológicas e fisiológicas entre esses animais e o osso alveolar e o
ligamento periodontal humanos devem ser consideradas. De modo particular, o
desenvolvimento tecidual durante a formação radicular e as mudanças decorrentes
da ativação ortodôntica aparentam ser mais rápidas nos ratos do que nos seres
humanos, apesar dos seus principais mecanismos serem muito semelhantes17.
É sabido que um número cada vez maior de pacientes que procura o
consultório odontológico para realizar tratamento ortodôntico pode fazer uso dos
bisfosfonados para controle de desordens ósseas, o que torna imprescindível o
entendimento dos mecanismos de ação desses medicamentos e sua possível
interferência na mecânica ortodôntica.
Esse estudo introduz importantes considerações quanto às possibilidades do
uso dessa classe de medicamentos para o controle clínico da reabsorção radicular.
Entretanto, experimentos mais específicos devem ser realizados para confirmação
desses achados e determinação de dosagens e métodos de administração efetivos.
54
CONCLUSÃO

A administração do clodronato no quinto dia não trouxe alterações
significantes para a taxa de movimentação dentária;

A aplicação do clodronato diminuiu sensivelmente as reações histológicas do
periodonto de inserção de ratos (Rattus norvegicus), entretanto, quando
aplicado no quinto dia do ciclo de remodelação óssea o aspecto mais
influenciado dentre os estudados foi a reabsorção radicular;

A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária
sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode diminuir a
reabsorção radicular com pouca influência na movimentação dentária
induzida ortodonticamente.
55
AGRADECIMENTOS
A André Luiz Andrade Pinheiro, Myrela Galvão Cardoso Costa, Diego
Menezes, pela colaboração durante toda a fase de execução do trabalho; a Luciana
Ramalho, pelo auxílio na avaliação histológica de todo o material coletado; a Cristina
Cangussu, pela ajuda inestimável na estatística do estudo e a Cristina dos Santos
Vasconcelos, pelo empenho que dedicou no processamento das lâminas.
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LEGENDAS DAS FIGURAS E DOS GRÁFICOS
Figura 1. a. Aparelho montado; b. Avaliação da distância entre as cavidades de
referência utilizando paquímetro; c. Espaço criado na distal do primeiro molar pelo
deslocamento mesial deste durante uma semana de aplicação de força (seta).
Figura 2. a. Reabsorção óssea em grau moderado-intenso observada em amostras
do GRUPO CONTROLE; b. Lacunas de reabsorção contendo osteoclastos no seu
interior (setas). Ligamento periodontal (LP); cemento radicular (CR); osso alveolar
(OA); dentina (D). Aumento de 400x. H. E.
Figura 3. Área de pressão na região de furca. Comparação entre o padrão de
reabsorção óssea nos grupos I (a) e II (b). Lacunas de reabsorção óssea (setas).
Aumento de 200x. H.E.
Figura 4. Lacunas de reabsorção radicular ativas (setas) em amostras do GRUPO
CONTROLE. Aumento de 1000x. H. E.
Figura 5. Lacunas de reabsorção radicular inativas em amostras do GRUPO II.
Áreas de reparo (setas). Aumento de 1000x. H. E.
Figura 6. Integridade radicular em amostras dos grupos I (a) e II (b). pode-se
observar ausência de reabsorção radicular mesmo na periferia de área de
hialinização (setas). Aumento de 400x. H. E.
Figura 7. a. Concentração de osteoclastos em grau ausente-leve em amostras do
GRUPO I. Aumento de 200x. H. E. b. Baixa concentração de osteoclastos próximo a
60
área de hialinização no GRUPO I. Lacunas de reabsorção óssea (setas); área de
hialinização (H). Aumento de 1000x. H. E.
Gráfico 1. Comparação entre as taxas de movimentação dos três grupos, tendo
como teste estatístico o ANOVA (**p = 0,000) **p= p valor.
Gráfico 2. Proporção de lacunas de reabsorção óssea ausentes-leves e moderadasintensas nos grupos estudados. Houve diferença estatisticamente significante do
GRUPO I em relação aos grupos CONTROLE e II (p=0,046).
Gráfico 3. Proporção de lacunas de reabsorção radicular nas intensidades ausenteleve
e
moderada-intensa
nos
grupos
estudados.
Não
houve
diferença
estatisticamente significante entre os grupos (p=0,253).
Gráfico 4. Proporção da concentração de osteoclastos nas intensidades ausenteleve e moderada-intensa nos grupos estudados. Houve diferença estatisticamente
significante do GRUPO I em relação aos grupos CONTROLE e II (p=0,008).
61
FIGURAS
b
a
Figura 1
c
62
OA
LP
OA
OA
LP
D
D
a
CR
b
Figura 2
D
D
CR
CR
LP
LP
OA
OA
a
b
Figura 3
LP
LP
CR
D
CR
a
Figura 4
D
b
63
LP
LP
CR
CR
D
D
a
b
Figura 5
D
CR
D
CR
LP
LP
OA
OA
a
b
Figura 6
H
OA
CR
CR
LP
D
a
Figura 7
OA
b
D
LP
64
GRÁFICOS
Taxa de Movimentação Dentária (mm)
1,6
1,4
1,2
1,12
0,9
1
0,8
0,6
0,47
0,4
0,2
0
Controle
Grupo I
Grupo II
Gráfico 1
* *p < 0,001
Reabsorção Óssea
8
7
6
5
4
3
2
1
57%
50%
100%
43%
50%
0
Controle
Grupo I
Ausente-Leve
Moderado-Intenso
Gráfico 2
GrupoII
p=0,046
65
Reabsorção Radicular
8
7
6
57%
5
20%
67%
4
3
80%
2
1
43%
33%
0
Controle
Grupo I
Ausente-Leve
Moderado-Intenso
Grupo II
p=0,253
Gráfico 3
Concentração de Osteoclastos
8
7
6
43%
5
4
3
2
1
0
83%
100%
57%
17%
Controle
Grupo I
Ausente-Leve
Moderado-Intenso
Gráfico 4
Grupo II
p=0,008
66
4.2 ARTIGO 2 (a ser submetido para publicação no periódico Dental Press)
Mecanismos da Ação dos Bisfosfonados (Clodronato) e sua Influência na
Clínica Ortodôntica
Telles-Pinheiro, A. M.; Vannier-Santos, M.; A. Oliveira-Costa, M. R. L.
Resumo
O objetivo deste trabalho é fazer uma breve revisão de literatura acerca das
alterações
metabólicas
decorrentes
da
administração
dos
bisfosfonados,
particularmente do clodronato, uma vez que, sendo a hidroxiapatita o seu principal
alvo, tanto o tecido ósseo quanto o dentário podem sofrer modificações. Desta
forma, é interessante que o ortodontista conheça o tema, afim de que possa antever
possíveis implicações durante o tratamento ortodôntico de pacientes que fazem uso
crônico deste medicamento, assim como conhecer os benefícios que, futuramente,
poderão ser aplicados à clínica ortodôntica.
PALAVRAS-CHAVE:
Bisfosfonados;
Clodronato;
Mineralização
óssea;
Osteoporose; Doença de Paget.
INTRODUÇÃO
A reabsorção óssea é uma importante função celular para o desenvolvimento
e a fisiologia do esqueleto. A fisiopatologia de muitas desordens ósseas inclui tanto
o aumento (como a exemplo da osteoporose, metástases ósseas e a doença de
Paget) quanto a diminuição (variadas síndromes da osteoporose) do grau de
reabsorção óssea. Portanto, existe uma necessidade genuína de regular,
67
especialmente inibir, este processo em muitas dessas doenças, o que pode ocorrer
de várias formas: diminuição no número de osteoclastos formados; inibição do seu
mecanismo de ação; ou indução da morte celular prematura. Esses aspectos, além
de serem regulados por mediadores fisiológicos, vêm sendo utilizados na terapêutica
clínica medicamentosa e em abordagens experimentais para inibir a reabsorção
óssea 1.
68
BISFOSFONADOS
Os bisfosfonados foram primeiramente sintetizados na Alemanha, em 1865,
tendo sido o Etidronato o primeiro a ser utilizado para tratamento em humanos, há
aproximadamente cem anos 2.
Após a descoberta de que podem controlar de maneira eficiente a formação e
dissolução de fosfato de cálcio in vitro, assim como a mineralização e a reabsorção
óssea in vivo, os bisfosfonados foram desenvolvidos e usados no tratamento de
desordens ósseas como a doença de Paget, a hipercalcemia maligna e a
osteoporose
3, 4
. Cada bisfosfonado deve ser considerado um complexo isolado,
cujas estruturas os tornam específicos para o tecido ósseo ou outros tecidos
mineralizados 5.
Estes compostos são análogos dos pirofosfatos nos quais a ponte de oxigênio
foi deslocada por um carbono com várias cadeias laterais (P-C-P)
3, 4, 6-8
. Ambos
ligam-se fortemente à hidroxiapatita, o que explica sua ação farmacológica
específica nos tecidos mineralizados, em especial nos ossos
2, 3, 7, 9-11
. De fato, eles
se depositam preferencialmente em locais de reabsorção osteolcástica ativa, sendo
liberados quando o osso sobre o qual ele se encontra depositado é novamente
reabsorvido, inibindo tal processo
3, 4, 12
. Todavia, o tratamento de osteoclastos,
monócitos e células tumorais com bisfosfonados, levou à morte celular, indicando
que a reabsorção óssea não é essencial para que a droga penetre nas células 4. Da
mesma forma, há estudos que demonstram que a hidroxiapatita não é essencial
para que tais compostos sejam ativados, apesar de não excluírem a possibilidade de
a sua incorporação nessa matriz contribuir para a sua eficácia in vivo 13.
69
O grupo P-C-P é resistente à hidrólise enzimática, o que explica porque os
bisfosfonados não são metabolizados no corpo, sendo excretados de forma
inalterada pelos rins, em parte por um processo de secreção tubular ativa.
Apresentam baixa absorção no intestino, o que pode ser atribuído ao tamanho e
carga do grupo atuando como agentes limitantes da sua penetração na membrana
celular. A concentração destes compostos será maior para o osso medular e menor
para o osso cortical
2, 3, 9, 11
. Deve-se considerar ainda que sua meia-vida óssea é
longa, situando-se entre três meses e um ano 14.
A ação farmacológica dos bisfosfonados para uso clínico é inibir a reabsorção
óssea
3, 4, 15-17
. Essa inibição levaria a um aumento na maturação óssea, o que traria
como conseguinte maior resistência à reabsorção daquele osso mais mineralizado
18
. Entretanto, há estudos que sugerem a possibilidade de formação óssea quando a
droga é administrada em doses mais baixas do que aquelas necessárias para
prevenir a reabsorção. Isto pode ser atribuído ao efeito positivo no processo de
diferenciação dos osteoblastos
19
. Neste sentido, há autores que defendem a idéia
de que, apesar de serem os bisfosfonados considerados ávidos por osteoclastos,
apresentam efeitos evidentes sobre os osteoblastos e osteócitos. Existe ainda ação
sobre a angiogênese; apoptose; secreção de citocinas e adesão celular; e sistema
imunológico 4.
O mecanismo de ação desses agentes ainda não foi completamente
esclarecido e cada grupo de bisfosfonado apresenta suas próprias características
químicas, físico-químicas e biológicas
17, 21
2, 3, 8, 19, 20
, sendo elas dose-dependentes
13, 16,
.
Os mecanismos de ação dos bisfosfonados podem ser considerados em três
níveis: tecidual, celular, e molecular 2, 3.
70
Em nível tecidual, a ação de todos os bisfosfonados aparenta ser semelhante:
redução do turnover ósseo. Isso é evidenciado pela diminuição tanto da reabsorção
quanto da formação óssea. A reabsorção é difícil de ser medida quantitativamente
através de métodos morfológicos, todavia, os bisfosfonados diminuem os seus
parâmetros, tais como a extensão da área de reabsorção ativa e a profundidade da
erosão medida a partir da superfície óssea. A esta reabsorção diminuída, soma-se
uma formação também reduzida. Já que não existe evidência de redução da
atividade osteoblástica nos sítios individuais de mineralização, conclui-se que a
redução na formação óssea total é conseqüência de reabsorção diminuída, o que
implica em menor remodelação 2, 3.
Em nível celular, os osteoclastos constituem o alvo dos bisfosfonados. Estas
células podem ter sua ação reduzida através: da inibição do seu recrutamento para
a superfície óssea; da inibição da sua atividade na superfície óssea; da diminuição
do seu ciclo celular, vez que, após desligarem-se da superfície óssea, tais
osteoclastos sofreriam um processo de apoptose; e existe ainda a teoria de que
haveria alteração óssea ou do mineral ósseo, reduzindo o grau de sua dissolução, o
que não pôde ser sustentado
3, 8, 9, 11, 15,
. Há autores que afirmam que os
bisfosfonados podem atuar ainda sobre outras células envolvidas na renovação
óssea, como os osteoblastos e macrófagos. Estes apresentam a sua atividade e
proliferação inibidas in vitro. Segundo tais autores, parte da atividade antireabsortiva dos bisfosfonados sobre os osteoclastos seria osteoblasto-dependente
10, 22
4,
. Outros autores sugerem que os osteoclastos seriam mais sensíveis a esses
compostos do que os macrófagos 13.
Num estudo realizado por Hughes e colaboradores, ficou constatado que,
quando os osteoclastos foram expostos a três tipos de bisfosfonados (risedronato,
71
pamidronato e clodronato), sofreram apoptose in vitro, o que foi confirmado in vivo.
Estes resultados sugerem que estes compostos podem causar redução no número
de osteoclastos pela indução de apoptose osteoclástica, sendo este o seu principal
mecanismo de ação in vivo 13.
Uma vez que os odontoclastos apresentam características semelhantes aos
osteoclastos, estudos revelam que também estes últimos sofrem apoptose após a
administração de bisfosfonado, apresentando alterações citológicas, incluindo
atividade reabsortiva reduzida 20, 23.
Em nível molecular, a cadeia de eventos que leva à inativação osteoclástica
ou à sua formação diminuída, decorrente da exposição direta ou indireta a
determinado bisfosfonado ainda não foi completamente elucidada. As possibilidades
incluem tanto a sua ação direta num receptor da superfície celular e/ou a sua
fagocitose pelo osteoclasto no interior do qual ele interage com uma enzima ou outra
molécula afetando o metabolismo celular
3
. O mecanismo através do qual o
bisfosfonado penetra no osteoclasto pode ser tanto a difusão passiva como durante
a reabsorção, graças às características endocíticas destas células
10, 22
. Estes
processos são creditados às suas bordas em escova, apesar de alguns autores
sugerirem a existência de outra via de captação destes compostos 8.
Após a administração dos bisfosfonatos, o número de osteoclastos diminuiu
significativamente num estudo desenvolvido por Ito e colaboradores. Inicialmente,
estas células tornaram-se desprovidas das bordas em escova e destacaram-se da
superfície óssea. Nelas o aparelho de Golgi encontrava-se degradado ou disperso
no citoplasma. Logo em seguida, os osteoclastos passaram a apresentar
características
típicas
de
apoptose,
com
núcleos
picnóticos,
mostrando
condensação e marginação de heterocromatina e fragmentação de DNA. Numa fase
72
tardia da apoptose, pôde ser observado o aumento e fusão nucleares e sua
subseqüente destruição, levando ao extravasamento dos componentes nucleares no
citoplasma. Em determinadas áreas também foi detectada a presença de
osteoclastos apoptóticos migrando para ou presentes nos capilares. Logo, a maioria
destas células é eliminada pelos macrófagos, mas algumas ainda escapam para a
corrente sanguínea 24.
ortodôntica, o que justifica um número cada vez maior de pesquisas nessa área. A
exemplo disso, um estudo feito com administração tópica e sistêmica de
bisfosfonados em ratos mostrou que tanto a movimentação ortodôntica dentária
como a recidiva podem ser evitadas. Isto torna tais substâncias úteis no reforço de
ancoragem ou contenção durante o tratamento ortodôntico20,
21
. Além disso, a
administração local de bisfosfonado causa a redução tanto no número de lacunas de
reabsorção quanto no de odontoclastos durante a movimentação ortodôntica20.
Kim e colaboradores desenvolveram um estudo onde constataram que uma
única administração sistêmica de bisfosfonado diminui a quantidade de recidiva
inicial em molares de ratos movimentados experimentalmente, o que estaria
associado a diminuição no número de osteoclastos no ligamento periodontal, assim
como
às
mudanças
estruturais
detectadas
nessas
células,
tais
como o
desaparecimento das bordas em escova e da polaridade citoplasmática7. Alguns
bisfosfonados
podem,
movimentação dentária20.
ainda,
inibir
a
reabsorção
radicular
decorrente
da
73
CLODRONATO
Estudos sobre a relação existente entre a estrutura e a atividade dos
bisfosfonados indicam que a sua potência e o seu mecanismo de ação variam de
acordo com a cadeia lateral ligada ao átomo de carbono na molécula de P-C-P,
estrutura comum dos bisfosfonados. Baseado na diferença da estrutura desta cadeia
lateral, eles podem ser divididos em duas classes: os que contêm uma molécula de
Nitrogênio e os que não a contêm. Essas duas classes de medicamento também
diferem no seu mecanismo de ação molecular. Investigações recentes revelaram
que aqueles bisfosfonados que apresentam um átomo de Nitrogênio na cadeia
lateral, tais como o Alendronato, são mais potentes do que os que não o
apresentam, inibindo a reabsorção por bloquear a penetração de proteínas nos
osteoclastos 4, 21, 25, 26. Aqueles bisfosfonados que não contêm o átomo de Nitrogênio
podem ser incorporados a análogos do ATP e atuar inibindo a síntese de proteínas e
induzindo a apoptose nos osteoclastos 4, 26.
A maioria dos bisfosfonados clinicamente testados apresenta afinidades
semelhantes em relação ao tecido ósseo do ser humano. Uma afinidade reduzida, é
traduzida em baixa potência o que implicaria em dosagens maiores para aumentar a
sua eficácia, à exemplo do que é observado com o clodronato 12.
O clodronato, por sua vez, encontra-se no grupo dos bisfosfonados que não
apresentam aquele átomo de Nitrogênio
21
. Ao invés disso, contém dois átomos de
Cloro na cadeia lateral. Além da sua grande semelhança estrutural com o
Pirofosfato, este bisfosfonado é conhecido por apresentar propriedades físicoquímicas semelhantes às dos demais, inibindo, portanto, a função osteoclástica
sendo incorporado metabolicamente a um análogo do ATP não-hidrolisável,
74
resultando na apoptose osteoclástica (principal mecanismo de ação para inibir a
reabsorção óssea por este composto) 21, 26, 27.
O tratamento combinado do clodronato com o alendronato pode aumentar o
efeito antireabsortivo de baixa concentração de um bisfosfonado que apresente o
átomo de Nitrogênio. Ao mesmo tempo, o clodronato pode também antagonizar
alguns dos efeitos e das funções moleculares atribuídas a concentrações mais altas
destes mesmos compostos 26.
Somada a atividade anti-reabsortiva, tem sido relatada a associação deste
tipo de bisfosfonado com função antiinflamatória
21
. Já que as citocinas e os
mediadores do processo inflamatório desempenham importante papel na resposta
biológica à simulação mecânica ortodôntica, incluindo reações adversas como dor
28
e reabsorção radicular 29, o clodronato deveria ser o bisfosfonado mais indicado para
o controle da movimentação ortodôntica 21.
O clodronato é um bisfosfonado de segunda geração de potência baixa
quando comparado com as drogas mais recentes, mas tem sido bem estudado e já
se encontra comercialmente disponível. As doses recomendadas para seres
humanos são baixas quando comparadas com as utilizadas nas experimentações
animais, onde se costuma observar o efeito dose-dependente do medicamento,
assim como ocorre para outros bisfosfonados
21, 30
. A dose diária subcutânea
relativamente alta de 10 mg/Kg do clodronato tem sido usada em diversos estudos
desenvolvidos em ratos e tem mostrado aumentar a densidade óssea desses
animais 30.
A via de administração mais utilizada para o clodronato é a intravenosa, vez
que essa droga apresenta pobre absorção no trato gastrointestinal, com proporção
de 1 a 2 % da dose oral 31.
75
Uma característica importante associada ao clodronato é que sua atividade
anti-reabsortiva não prejudica a mineralização óssea e, além disso, ele tem sido
associado à prevenção de perda óssea decorrente de imobilização em pacientes
paraplégicos 30; e decorrente de extração de molares superiores em ratos 32.
Estudos mostram que a administração de clodronato por períodos longos em
dosagem terapêutica apresenta alguns efeitos benéficos sobre o desenvolvimento
ósseo, o que o torna um medicamento seguro para a osteoporose 14.
76
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Desde a descoberta dos seus efeitos sobre os tecidos biológicos em 1968,
muito progresso tem sido conseguido para se compreender melhor os mecanismos
de ação dos bisfosfonados. Enquanto os efeitos sobre a mineralização aparentam
ser físico-químicos através da inibição do crescimento dos cristais, os referentes à
sua reabsorção são celulares. Todavia, os mecanismos moleculares que levam à
inibição desta reabsorção ainda precisam ser esclarecidos. Existe um consenso de
que o efeito final é sobre os osteoclastos, mas não se sabe o quanto desse efeito se
dá por inibição da sua atividade e o quanto ocorre devido à diminuição no seu
número 2, 11, 24.
As aplicações clínicas atuais dos bisfosfonados são a doença de Paget, a
osteoporose, e osteólises associadas às neoplasias. Pode-se citar ainda a utilização
deste fármaco para a diminuição da reabsorção óssea para casos de: atrofia de
Sudeck; displasia fibrosa; para evitar perda de implantes ósseos; reabsorção
alveolar e perda óssea associada à doença periodontal 2, 4, 11, 21, 25,26.
Estudos experimentais, por sua vez, particularizam a utilização de
bisfosfonados para otimizar o tratamento ortodôntico. Neste, a reabsorção óssea
mecanicamente induzida é uma etapa importante para que a movimentação dentária
ocorra e, por essa razão, deve ser o principal alvo para que a intervenção
farmacológica assegure os resultados conseguidos. Caso uma movimentação
dentária indesejável possa ser prevenida com bloqueadores da reabsorção óssea, o
tratamento ficaria menos complexo e mais seguro. Dentro desse contexto, o
clodronato se apresenta, em determinadas concentrações, como um potente inibidor
77
do movimento dentário ortodôntico quando administrado localmente. Esta resposta é
comparável à de outros tipos de bisfosfonados 9, 20, 21.
A atividade anti-reabsortiva e antiinflamatória do clodronato e, por
conseguinte, sua ação indireta na resposta biológica à simulação da mecânica
ortodôntica, incluindo reações adversas como dor
21, 28
e reabsorção radicular
29
,
sugerem que este deveria ser o bisfosfonado mais indicado para o controle da
movimentação ortodôntica 21.
O conhecimento aprofundado deste tema por parte do Ortodontista é de
extrema importância, vez que, com o aumento do número de adultos que buscam
esta especialidade, a tendência de tratar pacientes que fazem uso crônico deste
fármaco e, por conseguinte, apresentam o metabolismo ósseo alterado, é aumentar.
Além disso, a Ortodontia, como especialidade que acompanha os avanços
conseguidos também no campo da Farmacologia, tem intensificado os estudos
nessa área, para, num futuro próximo, trazer os benefícios dos bisfosfonados para a
realidade clínica.
78
AGRADECIMENTOS
Dr. André Luiz Andrade Pinheiro, Drª. Myrela Galvão Cardoso Costa, Dr.
Diego Menezes, pela colaboração durante toda a fase de execução do trabalho; Drª.
Luciana Ramalho, Drª. Cristina Cangussu e Srª. Cristina, por estarem sempre
disponíveis para nos ajudar no que fosse preciso.
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83
5 CONCLUSÃO
Após o exposto, conclui-se:
1. A aplicação do clodronato diminuiu sensivelmente as reações histológicas
do periodonto de inserção de ratos (Rattus norvegicus), entretanto, quando
aplicado no quinto dia do ciclo de remodelação óssea a influência foi maior
sobre a reabsorção radicular;
2. A administração do clodronato no quinto dia não trouxe alterações
significantes para a taxa de movimentação dentária;
3. A associação dos achados histológicos à taxa de movimentação dentária
sugere que o uso do clodronato no quinto dia do experimento pode
diminuir a reabsorção radicular com pouca influência na movimentação
dentária induzida ortodonticamente.
84
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93
7 ANEXO
Normas para a prática Didático-Científica da Vivissecção em animais
Art. 01. Fica permitida, em todo território nacional, a vivissecção em animais, nos
termos desta lei.
Art. 02. Os biotérios e os centros de experiências e demonstrações com animais
vivos deverão ser registrados em órgão competente e por ele autorizado a funcionar.
Art. 03. A vivissecção não será permitida:
I – sem o emprego de anestesia;
II – em centros de pesquisas e estudos não registrados em órgão competente;
III – sem supervisão de técnico especializado;
IV – com animais que não tenham permanecido mais de 15 dias em biotério
legalmente autorizado;
V – em estabelecimento de ensino de 1o e 2o graus e em quaisquer locais
freqüentados por menores de idade;
Art. 04. O animal só poderá ser submetido às intervenções recomendadas nos
protocolos das experiências que constituem a pesquisa ou os programas de
aprendizagem cirúrgica, quando durante ou após a vivissecção, receber cuidados
especiais.
Parágrafo 1 – Quando houver indicação, o animal poderá ser sacrificado sob estrita
obediência às prescrições científicas.
Parágrafo 2 – Caso não sejam sacrificados, os animais utilizados em experiência ou
demonstrações somente poderão sair do biotério 30 (trinta) dias após a intervenção,
desde que destinados à pessoas ou entidades idôneas que por eles queiram
responsabilizar-se.
Art. 05. Os infratores desta lei estarão sujeitos:
I – às penalidades cominadas no artigo 64, caput, do Decreto-lei 3.688 de
03/10/1941, no caso de ser a primeira infração;
II – à interdição e cancelamento do registro do biotério ou do centro de pesquisa, no
caso de reincidência;
Art. 06. O Poder Executivo, no prazo de 90 (noventa) dias, regulamentará a
presente Lei, especificando:
94
I – o órgão competente para o registro e a expedição de autorização dos biotérios e
centros de experiências e demonstrações com animais vivos;
II – as condições gerais exigíveis para o registro e o funcionamento dos biotérios;
III – o órgão e autoridades competentes para fiscalização dos biotérios e centros
mencionados no inciso I.
Art. 07. Esta lei entra em vigor na data de sua publicação.
Art. 08. Revogam-se as disposições em contrário.