Enzimas na Nutrição de Ruminantes Enzymes on Ruminant
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Enzimas na Nutrição de Ruminantes Enzymes on Ruminant
Enzimas na Nutrição de Ruminantes Enzymes on Ruminant Nutrition Ricardo Andrade Reis 1,2*, Erika Christina Lara1, Carlos Henrique Silveira Rabelo1 RESUMO: O objetivo deste texto é discutir sobre as possibilidades de utilização de enzimas exógenas, seja no processo de ensilagem ou como suplemento alimentar, e seus efeitos sobre a nutrição e desempenho de ruminantes. Normalmente, enzimas fibrolíticas são mais pesquisadas pela comunidade científica com o intuito de reduzir a fração fibrosa do alimento e/ou aumentar a digestibilidade desta fração no ambiente ruminal, sendo particularmente interessante na ensilagem de capins tropicais. Porém, enzimas amilolíticas e proteolíticas também têm sido investigadas como estratégia para aumentar a degradabilidade do amido no rúmen. Adicionalmente, o uso de inoculantes bacteriano-enzimáticos tem se tornado importante por promover melhoras no processo de conservação dos alimentos e desempenho animal. No entanto, os resultados são amplamente variáveis, seja pelos fatores intrínsecos aos produtos enzimáticos, ou também em relação ao uso exclusivo de enzimas exógenas ou associadas aos inoculantes bacterianos, em que na maioria dos casos, não há efeito positivo destes aditivos sobre o valor nutritivo das silagens produzidas, bem como sobre o desempenho animal. Palavras-chave: amilase, consumo, enzimas fibrolíticas, inoculante bacteriano-enzimático, proteases ABSTRACT: Our objective is highlighting the possibility in using exogenous enzymes, either in the ensiling process or as supplement and their effects on the nutrition and ruminant performance. Fibrolytic enzymes are widely investigated by scientific community by reducing of fiber and increasing the ruminal fiber digestibility, or both, being particularly interesting for ensiling of tropical grasses. However amylolytic and proteolytic enzymes also have been used as a strategy to enhance the starch rumen degradability. Moreover, use of bacterial-enzymes inoculants has become important to promote improvements at the fermentation process and animal performance. However, the results show a great variation on the nutritive value of silages due to use of exogenous enzymes as an exclusive additive or combined with silage inoculants. As a consequence, the majority of studies no display positive effect of these additives on animal performance. Key words: amylase, bacteria-enzymatic inoculant, fibrolytic enzymes, intake, proteases 1 Departamento de Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, São Paulo, Brasil. INCT/CA, UFV, Departamento de Zootecnia, Av. Peter Henry Rolfs, s/n Campus Universitário, Viçosa, Minas Gerais 36570-000, Brasil. * Autor correspondente. E-mail: [email protected] 2 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 1. Introdução Ao longo dos anos, a ação conjunta de vários programas de melhoramento genético de plantas forrageiras, estratégias de manejo e avanços agronômicos tem contribuído para melhorar a digestibilidade da fibra dos alimentos fornecidos aos animais. No entanto, mesmo diante do avanço nestas áreas, a digestibilidade da fibra ainda limita o consumo de energia disponível nas forragens pelos ruminantes, contribuindo para a excessiva excreção de nutrientes no ambiente (Beauchemin et al., 2003). Neste sentido, o uso de enzimas fibrolíticas exógenas tem por intuito aumentar a digestibilidade da fração fibrosa melhorando sua utilização e a eficiência na produção de ruminantes (Beauchemin et al., 1995). No Brasil, a utilização de enzimas fibrolíticas foi avaliada no processo de ensilagem de gramíneas tropicais (Coan et al., 2005), uma vez que estas apresentam menor valor nutritivo em relação àquelas cultivadas em áreas de clima temperado (Bernardes e Adesogan, 2012), e silagens de capins constituem uma das principais fontes de fibra e energia na alimentação de animais destinados a produção de leite e de carne em confinamento (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al., 2009). Como se sabe, o uso das enzimas fibrolíticas tem por intuito disponibilizar carboidratos solúveis provenientes da hidrolise da parede celular os quais podem ser utilizados no processo de fermentação, melhorando a conservação da forragem (Lynch et al., 2015). Embora as enzimas fibrolíticas sejam as mais pesquisadas pela comunidade científica, enzimas amilolíticas e proteolíticas têm sido estudadas com particular interesse em melhorar a degradabilidade do amido no rúmen, uma vez que a primeira atua quebrando a estrutura do amido em partículas menores (Rojo et al., 2005; Van Soest et al., 1991) e a segunda reduz a proteção da matriz proteica presente nos grânulos de amido sobre a ação dos microrganismos ruminais (DePeters et al., 2007; Wang et al., 2009). Ambas as enzimas, amilases e proteases, devem ser utilizadas para melhorar o valor nutritivo de silagens de cereais (Young et al., 2012), uma vez que estas estão entre os principais alimentos utilizados na nutrição de ruminantes no Brasil (Bernardes e Rêgo, 2014; Millen et al., 2009). Adicionalmente, complexos enzimáticos (enzimas fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas) têm sido utilizados em conjunto com inoculantes bacterianos no processo de ensilagem, os quais são conhecidos como inoculantes bacteriano-enzimáticos. No Brasil, a utilização de inoculantes contendo complexos-enzimáticos varia de 2,5 a 62,5% dependendo da cultura a ser ensilada (Reis et al., 2015). Geralmente, os resultados apontam que não há melhora no valor nutritivo destas silagens (Reis et al., 2015), embora o potencial de ação dos inoculantes bacteriano-enzimáticos seja intimamente dependente da forragem ensilada, taxa de aplicação e tempo de ensilagem, assim como observado no uso exclusivo de enzimas exógenas. Diante deste contexto, o objetivo desta revisão é elucidar o potencial e as limitações da utilização de enzimas exógenas associadas ou não à inoculantes bacterianos sobre o valor nutritivo das silagens e seu efeito na nutrição e desempenho de ruminantes. 56 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 2. Enzimas Uma vez que há inúmeras enzimas com grande potencial de utilização na nutrição de ruminantes, serão abordados aspectos inerentes à produção destas, bem como descrever o sítio de ação das principais enzimas pesquisadas nesta área e, posteriormente, discorrer sobre seus efeitos na conservação de forragens e na nutrição e desempenho de ruminantes. 2.1 Produção de enzimas Enzimas utilizadas na alimentação de ruminantes são produzidas por microrganismos específicos através da metabolização de nutrientes presentes no meio de cultivo, seguida pela síntese e secreção enzimática. Uma vez que o processo se completa, o extrato enzimático é separado do resíduo e dos organismos que lhe deram origem. Ainda que a fonte de organismo entre os produtos enzimáticos seja geralmente semelhante, o tipo e a atividade de enzimas produzidas podem variar amplamente, a depender da linhagem selecionada, do substrato de crescimento e do meio de cultura utilizado (Considine e Coughlan, 1989; Gashe, 1992; Lee et al., 1998). Os aditivos enzimáticos são normalmente classificados com base nos compostos que degradam, como as celulases, xilanases e ligninases, que atuam sobre celulose, xilana e lignina, respectivamente (McAllister et al., 2001). Além disso, os produtos enzimáticos destinados à alimentação animal, geralmente são compostos por diferentes combinações enzimáticas e, mesmo produtos compostos somente por celulases e hemicelulases, podem apresentar atividades secundárias como amilases, proteases e/ou pectinases, as quais podem se associar às celulases e hemicelulases, consideradas primárias ou essenciais às dietas de bovinos (McAllister et al., 2001). As enzimas de origem microbiana são preferencialmente utilizadas pela indústria e são provenientes, principalmente, de quatro espécies de bactérias (Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum e Streptococcus faecium, spp.) e três espécies de fungos (Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei e Saccharomyces cerevisiae) (Muirhead, 1996). O interesse em produzir e utilizar estas enzimas é relativamente maior no setor de nutrição animal comparado a outros setores (Polizeli, 2008). Dentre as vantagens da utilização de microrganismos na produção de enzimas estão o rápido crescimento celular, curto tempo de produção de metabólitos, cepas com alto potencial de produção, meio de crescimento barato e fácil extração do produto. 57 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 2.1 Principais enzimas e sítios de ação 2.1.1 Celulases O sistema enzimático das celulases é constituído de um conjunto de hidrolases glicosídicas, que envolvem três tipos de enzimas: endo-β-1,4-glucanases ou endoglucanases, exo-β-1,4-glucanases ou celobiohidrolases, ou apenas exoglucanases e β-1,4-glucosidases. Esses três componentes atuam de forma sinérgica na hidrólise de celulose (Dillon, 2004; Zhang et al., 2007), porém, em locais diferentes. As endoglucanases agem nas regiões de menor organização das microfibrilas da celulose reduzindo a polimerização das microfibrilas e disponibilizando mais substratos para ação das exoglucanases (McAllister et al., 2001). Em outras palavras, endoglucanases hidrolisam aleatoriamente as cadeias de celulose produzindo oligômeros de celulose de vários graus de polimerização. Por sua vez, exoglucanases hidrolisam a cadeia de celulose a partir da extremidade não redutora para produzir celobiose, enquanto β-glucosidases liberam glicose a partir da celobiose e hidrolisam cadeias curtas de celoligossacarídeos a partir de extremidades redutoras ou não (Bhat e Hazlewood, 2000). Por outro lado, as celulases são inibidas pela presença de altas concentrações de seus produtos de hidrólise (Bhat e Hazlewood, 2000), enquanto endo e exoglucanases são geralmente inibidas pela celobiose e β-glucosidases são inibidas pela alta concentração de glicose. 2.1.2 Hemicelulases A utilização de hemicelulases para promover modificação na composição química da fibra está essencialmente associada à aplicação de xilanases, que catalisam a hidrólise das xilanas. As xilanases participam da desagregação da parede celular de plantas e, em conjunto com outras enzimas, hidrolisam polissacarídeos (Polizeli et al., 2005). A heterogeneidade das hemiceluloses, notadamente das xilanas, exige tal como a celulose, um sistema enzimático (cooperativo) complexo para que a sua solubilização completa ocorra (Sunna e Antranikian, 1997). As endo-β-1,4-xilanases são as principais enzimas no processo de despolimerização da xilana, as quais hidrolisam a cadeia principal mais fácil e rapidamente em regiões sem substituições gerando oligossacarídeos não substituídos e ramificados ou esterificados (Biely, 1985; 2003). Estas enzimas diferem na sua especificidade por substratos, em que algumas delas quebram aleatoriamente resíduos de xilose não substituídos, enquanto outras dependem fortemente dos substituintes próximos aos resíduos de xilose hidrolisados (De Vries e Visser, 2001). As β-xilosidases são exoglucosidases que hidrolisam xilooligossacarídeos pequenos e xilobiose, liberando xilose. A especificidade dessas enzimas por pequenos oligossacarídeos de xilose é alta (Reilly, 1981; Sunna e Antranikian, 1997), e elas são capazes de liberar xilose de terminais não 58 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. redutores de oligossacarídeos ramificados somente quando dois resíduos de xilose contínuos estão adjacentes à resíduos de xilose simples ou duplamente substituídos (De Vries e Visser, 2001). Outras enzimas responsáveis por eliminar resíduos substituintes específicos são conhecidas como enzimas auxiliares ou desramificadoras e atuam em sinergia com as xilanases e β-xilosidases no processo de despolimerização da xilana. Dentro desse grupo são conhecidas as acetil xilana esterases, α-glucuronidases, α-L-aferanosidase, feroluil esterase e coumaroil esterase (Aro et al., 2005; Kulkarni et al., 1999; Prade, 1995). Algumas atuam nas ligações entre um resíduo da cadeia principal e o grupo substituinte, enquanto outras quebram ligações internas ou terminais das cadeias laterais (De Vries e Visser, 2001). 2.1.3 Amilases Amilases são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas α-1,4 da molécula de amido e, de acordo com seu modo de ação, podem ser divididas em duas categorias: endoamilases e exoamilases. A α-amilase trata-se de uma endoamilase que promove a hidrólise de ligações α-1,4 no interior da cadeia de amilose e de amilopectina, liberando várias cadeias de oligossacarídeos de diversos tamanhos que apresentam conformação α no carbono 1 (Reddy et al., 2003). A glucoamilase ou amiloglicosidase trata-se de uma exoamilase capaz de hidrolisar ligações glicosídicas do tipo α-1,4 por meio da remoção de sucessivas unidades de glicose a partir da extremidade não redutora da cadeia, liberando moléculas de D-glicose na conformação β. Essas enzimas também hidrolisam as ligações α1,6 e algumas ligações do tipo α-1,3, porém, em uma velocidade menor (Kumar e Satyanarayana, 2009; Michelin et al., 2008). 2.1.4 Proteases As proteases podem ser classificadas de acordo com o tipo de reação catalisada, a natureza química da porção catalítica de sua cadeia química, entre outras, sendo divididas em exopeptidases e endopeptidases. As exopeptidases atuam na quebra das ligações peptídicas próximas aos grupos amino ou carboxílico terminal da proteína, enquanto as endopeptidases promovem a lise de ligações distantes dos grupos amino ou carboxílicos terminais (Rao et al., 1998). Estas enzimas proteolíticas têm sido associadas na melhora da digestibilidade do amido (DePeters et al., 2007; Young et al., 2012), uma vez que agem sobre a matriz proteica dos grânulos de amido hidrolisando cadeias complexas de polipeptídeos e liberando compostos de menor peso molecular, o que resulta em mais sítios de ação para atuação dos microrganismos do rúmen (Simpson, 2001). Desta maneira, o impedimento físico-químico na digestão do amido em ruminantes promovido pela matriz proteica (Owens et al., 1986) pode ser reduzido. 59 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 2.1.5 Feruloil esterase (FAE) O uso da FAE na nutrição de ruminantes tem se tornado importante por quebrar ligações cruzadas entre lignina e os polissacarídeos da parede celular. Essa enzima é uma hidrolase que atua em ésteres carboxílicos liberando ácido ferúlico e outros ácidos cinâmicos presentes nos polissacarídeos da parede celular vegetal, envolvidos na interligação entre a hemicelulose e a lignina (Faulds et al., 2002). Por isso, as FAEs são conhecidas como enzimas acessórias, pois ajudam a ação das xilanases e celulases na hidrólise da biomassa lignocelulósica (Gottschalk et al., 2010). 3. Aplicação de enzimas na nutrição de ruminantes A forragem é a maior fonte de energia para os ruminantes, sendo constituída, principalmente, por celulose e hemicelulose (Van Soest, 1994). Esses dois compostos são formados por moléculas simples interligadas por ligações rígidas e altamente resistentes. Com isso, a degradação do alimento pelos microrganismos do rúmen pode ser comprometida diminuindo a liberação de energia e proteína para os ruminantes, além do desempenho animal (Church et al., 1993). Portanto, o maior volume de pesquisas envolvendo enzimas fibrolíticas no intuito de melhorar a nutrição e maximizar o desempenho animal é justificado. Enzimas fibrolíticas foram inicialmente testadas como aditivos na ensilagem de forrageiras, pois se acreditava que estas poderiam melhorar o processo fermentativo pela disponibilização de maiores quantidades de carboidratos solúveis para as bactérias ácido-láticas (BAL), as quais rapidamente produzem ácido lático e reduzem o pH da forragem ensilada (Colombatto et al., 2004; McDonald et al., 1991). Além disso, essas enzimas podem atuar na degradação da parede celular da forragem, diminuindo o conteúdo de fibra e/ou aumentando a digestibilidade desta fração, o que potencialmente pode melhorar o desempenho animal (Beauchemin et al., 2003). Contudo, devido à variedade de produtos enzimáticos e condições experimentais, as respostas observadas na utilização de enzimas para ruminantes são muitas vezes inconsistentes, e variam desde a maior liberação de carboidratos solúveis e melhora na digestibilidade do alimento, até respostas nulas ou negativas da aplicação desses aditivos (Tabela 1). Tais respostas podem ser atribuídas às condições nas quais a energia não é limitante, pela diferença de atividade enzimática e características das enzimas suplementadas, assim como, por uma super ou sub-dosagem da atividade enzimática e pelo método inapropriado de fornecimento da enzima para o animal (Beauchemin et al., 2003). Além do efeito sobre a concentração da FDN e FDA ser variável, o uso de enzimas fibrolíticas como estratégia para melhorar o processo de conservação de forragens não apresenta grandes impactos sobre o valor nutritivo das silagens. Como exemplo, Lynch et al. (2014a; 2015a) não encontraram efeitos positivos no uso das de enzimas fibrolíticas exógenas sobre o valor nutritivo e digestibilidade da FDN de silagem e feno de alfafa. Além disso, os autores observaram que o uso das enzimas 60 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. favoreceram a fermentação heterolática da silagem de alfafa e proporcionou maiores perdas de matéria seca (MS) da forragem. Adicionalmente, em alguns casos, o uso das enzimas fibrolíticas tem promovido resultados negativos. Por exemplo, Colombatto et al. (2004) avaliaram silagens tratadas com enzimas comerciais e observaram menor produção de gases e degradação mais lenta nas tratadas quando comparadas com a controle, o que implicou em substrato menos fermentável e disponível para os microrganismos do rúmen. Tabela 1. Efeito da aplicação de enzimas na ensilagem de diferentes forrageiras sobre as concentrações de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA) (valores expressos em g/kg de MS) Fonte FDN FDA Beuvink e Spoelstra (1994) -35,6 - Jacobs e McAllan (1991) -4,9 -10,2 Choung e Chamberlain (1992) -12,3 -11,7 Rodrigues et al. (1993) -29,6 -19,2 Selmer-Olsen et al. (1993) -26,9 -30,7 Stokes et al. (1996) -5,3 -8,2 0 -8,8 +1,1 +2,6 -1,3; -7,8 -1,4; -6,5 Hoffman et al. (1995) -6,7 -2,0 Sheperd et al. (1995) -9,5; -7,8 -9,2; -4,2 -3,7 0 Kung et al. (1990) -4,2 -2,8 Weinberg et al. (1993) -7,3 -7,2 Adogla-Bessa et al. (1999) -8,5 -12,8 Adogla-Bessa et al. (1999) (+ ureia) +0,3 -1,1 Nia e Wittenberg (1999) -0,4 -0,6 Silagem de capim Weinberg et al. (1993) Silagem de leguminosas e capim-leguminosas Kung et al. (1991) Fredeen e Mc Queen (1993) Nadeau e Buxton (1997) Silagem de planta inteira de milho Fonte: Adesogan (2005). Embora a fração fibrosa possa ser reduzida em alguns casos devido ao uso de enzimas fibrolíticas (Tabela 1), os resultados negativos de várias pesquisas conduzidas em condições tropicais parecem estar mais vinculados a um provável aumento proporcional na fração fibra em detergente neutro indigestível (FDNi) das silagens tratadas em detrimento da redução na fração potencialmente 61 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. digestível da FDN (FDNpd), uma vez que a ação das enzimas fibrolíticas deve resultar em maior quantidade de substratos fermentáveis pelas BAL, as quais produzem ácido lático e ácidos de cadeia curta (McDonald et al., 1991; Nadeau et al., 2000). Como exemplo, Cysneiros et al. (2006) observaram redução no teor de FDN em silagens de milho tratadas com enzimas fibrolíticas, porém, sem qualquer efeito sobre a degradação ruminal da FDN. Portanto, estudos passaram a avaliar enzimas fibrolíticas como aditivos em ração para ruminantes, ou seja, fornecida imediatamente antes da alimentação, no intuito de aumentar a digestibilidade, melhorar a eficiência de utilização dos alimentos e, consequentemente, melhorar o desempenho animal. Quando fornecidas dessa maneira, as enzimas formam ligações com os substratos, que as protegem da degradação ruminal e podem aumentar a digestibilidade através de diferentes mecanismos, como: hidrólise direta, melhoria da aceitabilidade, alterações na viscosidade intestinal e mudanças do local de digestão (Beauchemin et al., 2003; Loures, 2004; Martins, 2003). O fato de aplicar as enzimas diretamente no cocho parece conferir maior estabilidade enzimática graças à formação do complexo enzima-substrato, dificultando a ação de proteases microbianas e aumentando seu tempo de permanência no rúmen por não estar dissolvida no fluído ruminal (Morgavi et al., 2000). Entretanto, na falta do complexo enzima-substrato estável, as enzimas se solubilizam no líquido ruminal e fluem rapidamente para o intestino (Beauchemin et al., 2003). Frente ao contexto de que enzimas fibrolíticas devem ser mais efetivas na degradação ruminal da FDN quando aplicadas sobre o alimento, imediatamente antes do fornecimento aos animais, Lara et al. (2012) verificaram maior degradação da parede celular primária de silagens de milho tratadas com xilanases e celulases após 6 horas de contato entre enzimas e substrato (Figura 1). Neste mesmo estudo, os autores verificaram ainda maior colonização e exposição dos grânulos de amido da matriz proteica das silagens de milho quando tratadas com as enzimas fibrolíticas e a bactéria Lactobacillus buchneri. Tal fato comprovou que aumentos na taxa de degradação do alimento no rúmen estão relacionados com a melhora na colonização dos alimentos pelos microrganismos ruminais em função do tratamento enzimático (Colombatto et al., 2003). No rúmen, as enzimas podem agir diretamente nos alimentos ou estimular indiretamente a digestão por potencializar as atividades das enzimas microbianas (McAllister et al., 2001), demonstrando a possibilidade de haver sinergismo entre enzimas exógenas e microbianas (Morgavi et al., 2000). Neste sentido, produtos enzimáticos contendo xilanases, esterases e proteases mostraram-se efetivos em estimular a degradação in vitro do feno de alfafa (Colombatto et al., 2003; Nsereko et al., 2000). Melhorias na digestibilidade in vitro da FDN e fibra em detergente ácido (FDA) da palha de arroz também foram observadas com a aplicação de xilanase e celulase (Eun et al., 2006). Os resultados positivos reportados em condições in vitro devido à aplicação das enzimas poderiam sugerir que as mesmas respostas fossem obtidas em condições in vivo. Entretanto, a aplicação de enzimas em dietas contendo tortas de azeitona e gramíneas no momento da alimentação de cordeiros não surtiu qualquer efeito sobre o consumo e digestibilidade (Awawdeh e Obeidat, 2011; 62 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. Miller et al., 2008). Além disso, outros estudos envolvendo carneiros (McAllister et al., 1999; Rojo et al., 2005) e bovinos (Krueger et al., 2008; ZoBell et al., 2000) não reportaram efeitos positivos no ganho de peso dos animais tratados com enzimas aplicadas no momento da alimentação. Figura 1. Elétron-micrografia de varredura de silagem de milho não tratada (A), silagem de milho tratada com L. buchneri (B), silagem de milho tratada com enzimas fibrolíticas (C) e silagem de milho tratada com L. buchneri e enzimas fibrolíticas (D) por 0,5; 1,0; 3,0; 6,0 e 12 horas, de cima para baixo, respectivamente. Fonte: Lara et al. (2012). Em condições brasileiras, a adição de enzimas como suplemento para bovinos não proporcionou mudanças no consumo de matéria seca e de fibra em detergente neutro, como também na digestibilidade da matéria seca, conforme apresentado na Figura 2 (Martins et al., 2006; Loures et al., 2005). Porém, foi verificado melhora na digestibilidade da fibra em detergente neutro dos alimentos suplementados com enzimas (Figura 3). Respostas negativas ou nulas podem estar relacionadas ao 63 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. tempo no qual o produto enzimático ficou em contato com o alimento antes de ser consumido, e também ao nível de atividade enzimática presente e ativa no substrato. 12 Sem enzimas Com enzimas Ingestão, kg/dia 10 8 6 4 2 0 Silagem de milho Silagem de capim Feno de Tifton 85 Silagem de milho MS Silagem de capim Feno de Tifton 85 FDN Figura 2. Ingestão de matéria seca (MS) e fibra em detergente neutro (FDN) em bovinos suplementados ou não com enzimas fibrolíticas exógenas em condições brasileiras. Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005). 70 Sem enzimas Com enzimas Digestibilidade, % 60 50 40 30 20 10 0 Silagem de Silagem de milho capim Feno de Tifton 85 MS Silagem de Silagem de milho capim Feno de Tifton 85 FDN Figura 3. Coeficientes de digestibilidade aparente total (%) da matéria seca (MS) e fibra em detergente neutro (FDN) de bovinos suplementados ou não com enzimas fibrolíticas exógenas em condições brasileiras. Fonte: Adaptado de Martins et al. (2006) e Loures et al. (2005). Como mencionado acima, para que as enzimas sejam eficazes como modificadoras da fermentação ruminal, elas devem resistir à proteólise decorrente da ação de microrganismos do rúmen e à flutuação do pH e temperatura do rúmen durante um período de tempo suficientemente longo. Em pesquisa para verificar a estabilidade de enzimas no líquido ruminal, Morgavi et al. (2000) concluíram 64 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. que, na maioria das enzimas, isso não constitui um fator limitante para sua utilização em dietas para ruminantes. Todavia, existem evidências de que a aplicação de enzimas sobre os alimentos, principalmente na forma líquida, aumenta sua adsorção, com consequente aumento da resistência das enzimas à proteólise prolongando sua viabilidade no ambiente ruminal (Beauchemin et al., 1999). Além disso, o modo de ação das enzimas exógenas é extremamente complexo, acarretando respostas variáveis quando da sua utilização em dietas de ruminantes (McAllister et al., 2001). Outra provável explicação para a falta de resultados positivos em muitos estudos está relacionada às condições de atuação das enzimas. Em geral, as enzimas usadas na alimentação animal são misturas de diferentes polissacaridases, glucosidases, ligninases e proteases, que geralmente necessitam de condições diferentes para mostrarem máximo efeito (Vahjen e Simon, 1999). Por exemplo, temperatura de 50ºC e pH entre 4,8 a 5,3 são recomendados para celulases provenientes do Trichoderma spp. (Ghose, 1987; Wood e Bhat, 1988). No entanto, essas condições não refletem a situação in vivo (Sabatier e Fish, 1996), como temperatura do rúmen de 39ºC e pH entre 5,8 e 6,8. Para aplicações em ração animal, parece lógico que o pH e a temperatura utilizada nos ensaios de avaliação devem assemelhar-se às condições encontradas no alimento ou no animal, dependendo do local onde as enzimas irão atuar. Outro fator que também exerce grande influência sobre os resultados é o nível de aplicação enzimática, ou seja, quantas unidades de atividade enzimática devem ser adicionadas por quilo de MS a ser ingerida. O uso de níveis moderados de enzimas na alimentação de ruminantes pode causar rupturas benéficas na estrutura da superfície dos alimentos, antes ou após a ingestão (Nsereko et al., 2002). No entanto, níveis elevados de enzimas podem ser menos eficazes do que níveis mais baixos por diminuir a adesão microbiana e limitar a digestão do alimento, enquanto o nível ótimo é dependente da dieta (Beauchemin et al., 2003). Neste sentido, as quantidades de enzimas normalmente utilizados como aditivos na alimentação de ruminantes variam de 0,5 a 2,0 mg/g (ou g/kg) da dieta total, com base na MS (Beauchemin et al., 2003). Porém, estas quantidades são dependentes das características específicas de cada produto, como tipo de atividade das enzimas presentes. 4. Inoculantes bacteriano-enzimáticos 4.1 Efeito sobre o valor nutritivo das silagens A ensilagem de culturas que apresentam baixo teor de MS, baixa concentração de carboidratos solúveis e alta capacidade tampão, ou a escolha errada do ponto de colheita, invariavelmente resultam em silagens inadequadamente fermentadas e de baixa qualidade nutricional (McDonald et al., 1991). Este quadro é mais grave particularmente em regiões de clima tropical, onde geralmente plantas forrageiras apresentam menor valor nutritivo comparado àquelas de clima temperado (Bernardes e Adesogan, 2012). Portanto, a obtenção de silagens com boa qualidade requer adequado manejo da 65 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. cultura e do processo de ensilagem e, a população epífita de BAL deve estar presente em quantidade suficiente (105 - 106 unidades formadoras de colônia/g de forragem) para dominar o processo de fermentação e garantir a fermentação lática (McDonald et al., 1991). No entanto, os produtos utilizados pelas BAL no processo fermentativo estão restritos basicamente aos carboidratos solúveis (mono e dissacarídeos), uma vez que a maioria destas bactérias não possui complexo enzimático para metabolizar carboidratos complexos (Rooke e Hatfield, 2003). Estratégias como a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido avaliadas para melhorar o padrão de fermentação e valor nutritivo das silagens. Geralmente podem-se considerar dois tipos distintos de inoculantes bacteriano-enzimáticos: o primeiro e mais comum refere-se à utilização de BAL homo e/ou heterofermentativas associadas a um complexo enzimático exógeno (enzimas fibrolíticas, amilolíticas e proteolíticas); o segundo trata-se de cepas específicas de BAL ou outros microrganismos que são capazes de produzir enzimas. Por exemplo, algumas cepas de Lactobacillus buchneri, L. plantarum e Bacillus subtilis demonstraram ser hábeis em produzir algum tipo de enzima, normalmente fibrolíticas (Cavin et al., 1997; Donaghy et al., 1998; Kang et al., 2009). A aplicação de enzimas fibrolíticas seja isoladamente ou associada à BAL antes da ensilagem de qualquer forragem deve facilitar a ação das mesmas, uma vez que o tempo de contato entre forragem e enzimas aumenta, permitindo obter um grande impacto sobre o valor nutritivo da silagem (Lynch et al., 2015b). Neste sentido, a utilização de inoculantes bacteriano-enzimáticos é benéfica, uma vez que as BAL presentes no inoculante agem promovendo maior e mais rápida produção de ácido lático, enquanto o complexo enzimático contido no inoculante age na parede celular e na matriz proteica dos grânulos de amido liberando açúcares solúveis prontamente disponíveis para fermentação (Fugita et al., 2012). Especificamente no caso de enzimas fibrolíticas, estas agem na parede celular das plantas removendo ácido-ferúlico, o que teoricamente implicaria no aumento da digestibilidade das silagens, pois a fração fibrosa torna-se mais susceptível à ação de bactérias fibrolíticas presentes no rúmen dos animais (Kang et al., 2009). Como se sabe, o ácido ferúlico é o mais abundante e mais inibitório ácido fenólico que limita a digestão ruminal da fibra (Yu et al., 2005). Portanto, reduções no teor de FDN em silagens de milho tratadas com inoculantes bacteriano-enzimáticos têm sido reportadas em silos laboratoriais nos países de clima temperado (Stokes e Chen, 1994). Por outro lado, em uma ampla revisão da literatura brasileira, Reis et al. (2015) observaram que inoculantes bacteriano-enzimáticos são mais utilizados em silagens de sorgo (62,5% dos tratamentos avaliados), seguido por silagem de capim e milho (30 e 24%, respectivamente). De acordo com os dados compilados pelos autores citados anteriormente, ao contrário do que se esperava, a aplicação de inoculantes bacteriano-enzimáticos não reduziu os teores de FDN ou alterou os coeficientes de digestibilidade comparado às silagens não tratadas (Figura 4). Uma das premissas em utilizar inoculantes bacteriano-enzimáticos deve-se a preservação de maior quantidade de compostos solúveis durante a fermentação (Ribeiro et al., 2008). Se esta premissa é atingida, poderia esperar-se uma redução indireta na participação percentual da parede celular na silagem tratada. No entanto, a maioria 66 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. dos resultados obtidos experimentalmente no Brasil sugere que inoculantes bacteriano-enzimáticos não são eficientes em preservar carboidratos solúveis e aumentar a produção de ácido lático nas silagens (Reis et al., 2015). Além disso, a obtenção de resultados similares quanto aos coeficientes de digestibilidade possivelmente está associada ao aumento da FDNi na silagem, uma vez que as enzimas contidas nos inoculantes são capazes de agir somente na fração FDNpd (Rooke e Hatfield, 2003). 800 Controle Inoculante bacteriano-enzimático DIVMS PB g/kg de MS 600 400 200 0 PB FDN Milho FDN Capim DIVMS PB FDN DIVMS Sorgo Figura 4. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de proteína bruta (PB), fibra em detergente neutro (FDN) e coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) de silagens de milho, capim e sorgo. Fonte: Adaptado de Reis et al. (2015). Outros fatores como estádio de maturidade da forragem, tempo de fermentação, exposição ao oxigênio e perdas de constituintes não fibrosos durante a fermentação também contribuem para as discrepâncias sobre os efeitos de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre o teor de FDN das silagens (Addah et al., 2014). De fato, o estádio de maturidade da forragem interfere marcadamente sobre a ação de inoculantes bacteriano-enzimáticos. Como exemplo, a aplicação de um inoculante bacterianoenzimático foi mais eficiente em aumentar os coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas a partir de plantas colhidas mais tardiamente (Figura 5), como reportado por Rabelo et al. (2014). De acordo com os próprios autores, os maiores coeficientes de DIVMO encontrados em silagens produzidas nos estádios 2/3 de linha de leite e camada negra se devem à presença de enzimas amilolíticas, assim como celulolíticas no inoculante, que atuam sobre o amido e celulose, respectivamente, e auxiliam na degradação destas frações durante o processo digestivo. Contudo, de maneira geral, os inoculantes bacteriano-enzimáticos não têm contribuído de forma positiva em melhorar o valor nutritivo das silagens produzidas em condições brasileiras, especialmente sobre a redução da FDN e aumento da digestibilidade (Reis et al., 2015), o que está de acordo com dados reportados em países de clima temperado (Van Soest, 1994). 67 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 90 Controle Inoculante bacteriano-enzimático 80 DIVMO, % 70 60 50 40 30 20 10 0 SLL 1/3 LL 1/2 LL 2/3 LL CN Figura 5. Efeito de um inoculante bacteriano-enzimático sobre os coeficientes de digestibilidade in vitro da matéria orgânica (DIVMO) em silagens de milho produzidas em diferentes estádios de maturidade (SLL = sem linha de leite (25,9% de MS); 1/3 de linha de leite (29,5% de MS); 1/2 de linha de leite (31,6% de MS); 2/3 de linha de leite (33,9% de MS); CN = camada negra (38,4% de MS)). Fonte: Adaptado de Rabelo et al. (2014). Mesmo que não haja reduções na fração fibrosa, os inoculantes bacteriano-enzimáticos são aplicados no intuito de promover benefícios sobre a degradação da FDN em condições ruminais (Kang et al., 2009). Estudos de degradabilidade in situ têm demonstrado que a hidrólise completa ou parcial das ligações entre ácido ferúlico e carboidratos da parede celular da forragem deve diretamente melhorar a digestão ruminal ou aumentar a susceptibilidade da parede celular para digestão ruminal (Nsereko et al., 2008; Kang et al., 2009). Todavia, dados sumarizados de estudos conduzidos nos Estados Unidos e Canadá mostram que o efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a degradabilidade da MS e FDN é muito pequeno (<2,5%) em silagens de milho, enquanto observa-se um negativo efeito em silagens de alfafa pré-secada (Figura 6). O ligeiro aumento na degradabilidade da MS e da FDN em silagem de milho pode indicar que carboidratos presentes na parede celular das silagens tratadas são mais facilmente digestíveis devido à ação da enzima ferulato-esterase (Lynch et al., 2015). Porém, de maneira geral, os efeitos observados sobre a digestibilidade de silagens tratadas com inoculantes bacteriano-enzimáticos são inconsistentes e controversos (Chen et al., 1994; Sheperd e Kung, 1996; Kung et al., 2000). Adicionalmente, silagens de milho apresentam maior digestibilidade da fibra em condições in vitro quando tratadas imediatamente antes do ensaio de digestão somente com enzimas fibrolíticas (Colombatto et al., 2004; Phakachoed et al., 2013). 68 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. Controle Inoculante bacteriano-enzimático 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 24 h 48 h 24 h DMS 48 h DFDN Milho 24 h 48 h DMS 24 h 48 h DFDN Alfafa pré-secada Figura 6. Efeito de inoculantes bacteriano-enzimáticos sobre a degradabilidade da matéria seca (DMS) e fibra em detergente neutro (DFDN) de silagens de milho e alfafa pré-secada após 24 e 48 horas de incubação in vitro. Fonte: Adaptado de Kang et al. (2009) e Lynch (2014a,b, 2015). 4.2 Efeito no desempenho animal Nos trabalhos onde inoculantes bacteriano-enzimáticos melhoram o valor nutritivo das silagens tratadas é compreensível que algumas expectativas em maximizar o desempenho animal sejam geradas. Como se sabe, o consumo de MS é direta e negativamente correlacionado com a concentração de fibra no alimento (Allen, 1997). Portanto, qualquer ação que diminua a concentração de fibra e/ou maximize a digestibilidade da fração fibrosa no rúmen deve implicar no aumento do consumo e, consequentemente no ganho de peso dos animais (Van Soest, 1994). Todavia, como descrito anteriormente, na maioria dos casos os inoculantes bacteriano-enzimáticos não tem promovido melhorias significativas no valor nutritivo das silagens. Como resultado, dados sumarizados de estudos conduzidos em países de clima temperado e tropical indicam desempenhos similares entre os animais que consomem silagens tratadas e não tratadas (Figura 7 e Tabela 2). 10 Consumo de matéria seca Ganho de peso kg/dia 8 6 4 2 0 Controle Inoculante Figura 7. Efeito de inoculantes contendo BAL produtoras de ferulato esterase sobre o desempenho de bovinos de corte alimentados com silagem de cevada e terminados em confinamento. Fonte: Adaptado de Addah et al. (2012, 2014, 2015). 69 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. Isto sugere que em muitos casos não há ação do complexo enzimático contido nos inoculantes durante o processo fermentativo, nem mesmo dentro do rúmen, onde o mesmo poderia maximizar a digestão da fibra e outros componentes. Como não há atuação das enzimas, provavelmente o potencial de ação das BAL presentes no inoculante também não é alterado, embora estas possam interferir marcadamente sobre o desempenho animal (Basso et al., 2014) por melhorar a qualidade da silagem e/ou fornecer massa microbiana diretamente no rúmen, agindo como um probiótico (Weinberg et al., 2007). Os dados obtidos em condições brasileiras indicam que o consumo de MS (kg/dia) diminuiu ligeiramente quando bovinos e ovinos foram alimentados com silagens de capim e milho tratadas com inoculantes bacteriano-enzimáticos (Tabela 2). Além disso, bovinos consumindo silagem de milho tratada apresentaram acentuada redução (14,2%) na digestibilidade da FDN em relação aos animais alimentados com silagem não tratada. Como resultado, a digestibilidade da MS também foi ligeiramente prejudicada pelo inoculante. Do mesmo modo, ovinos alimentados com silagem de milho tratada com o inoculante bacteriano-enzimático apresentaram redução de 9,3% na digestibilidade da MS. No entanto, estudos envolvendo inoculantes bacteriano-enzimáticos e seus efeitos sobre o desempenho animal ainda são incipientes no Brasil (Reis et al., 2015) e, novos estudos são necessários para atestar o potencial destes aditivos nas mais variadas condições. Tabela 2. Dados sumarizados sobre consumo e digestibilidade em bovinos e ovinos alimentados com silagens de capim, milho e sorgo tratadas ou não com inoculantes bacteriano-enzimáticos em condições brasileiras Bovinos Ovinos Controle Inoculante Controle Inoculante Consumo de matéria seca, kg/dia Capim 4.71 4.67 1.10 1.08 Milho 8.67 8.42 1.37 1.11 Sorgo 6.53 6.63 0.51 0.53 Consumo de matéria seca, % do peso vivo Capim 2.34 2.37 2.16 2.05 Milho 2.19 2.22 2.81 2.39 Sorgo 1.99 2.10 1.64 1.72 Digestibilidade in vivo da matéria seca, % Capim 65.74 66.35 64.00 63.32 Milho 65.25 64.21 60.40 54.80 Sorgo 60.10 61.07 52.24 54.05 Digestibilidade in vivo da fibra em detergente neutro, % Capim 62.78 61.39 53.55 50.97 Milho 56.92 48.85 35.17 37.21 Sorgo 50.43 52.30 46.49 48.84 Digestibilidade in vivo da proteína bruta, % Capim 66.28 66.71 65.04 66.40 Milho 65.33 60.01 60.50 59.20 Sorgo 60.21 60.17 36.21 36.92 Fonte: Adaptado de Bergamaschine et al. (2006), Bumbieris Junior et al. (2009), Fugita et al. (2012), Henrique e Bose (1992), Jayme et al. (2011), Rocha et al. (2006), Rodrigues et al. (2002), Silva et al. (2006) e Zanette et al. (2011). Item 70 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. 5. Implicações De maneira geral, com base no conjunto de artigos consultados na construção desta revisão notou-se que a aplicação de enzimas antes da ensilagem na forma exclusiva ou associada à inoculantes bacterianos não altera positivamente o valor nutritivo da silagem. Além disso, resultados de degradação da fibra e do alimento como um todo demonstra o baixo impacto das enzimas sobre estas variáveis, o que explica a falta de resultados positivos no desempenho animal. A aplicação das enzimas nas dietas no momento do fornecimento aos animais parece gerar resultados mais promissores. Por outro lado, o volume de estudos no Brasil sobre o efeito de enzimas exógenas sobre o desempenho animal ainda é incipiente. Portanto, novas pesquisas que contribuam para o entendimento de mecanismos de ação das várias enzimas utilizadas na nutrição de ruminantes visando maximizar o desempenho animal devem ser estimuladas. 6. Referências ADDAH, W.; BAAH, J.; OKINE, E. K. et al. A third generation esterase inoculant alters fermentation pattern and improves aerobic stability of barley silage and the efficiency of body weight gain of growing feedlot cattle. Journal of Animal Science, v.90, n.5, p.1541-1552, 2012. ADDAH, W.; BAAH, J.; OKINE, E. K. et al. Effect of barley silage chop length and inoculation on growth performance, feeding behavior, and ruminal acidosis in finishing feedlot steers. Journal of Animal Science, v.93, n.5, p.2309-2321, 2015. ADDAH, W.; BAAH, J.; OKINE, E. K. et al. Effects of chop-length and a ferulic acid esteraseproducing inoculant on fermentation and aerobic stability of barley silage, and growth performance of finishing feedlot steers. Animal Feed Science and Technology, v.197, p.34-46, 2014. ADESOGAN, A. T. Improving forage quality and animal performance with fibrolytic enzymes. FLORIDA RUMINANT NUTRITION SYMPOSIUM. 16., Gainesville, Florida, 2005. Proceedings… Gainesville, Florida: University of Florida Dairy Extension, 2005. p.91-109. ALLEN, M. S. Relationship between fermentation acid production in the rumen and the requirement for physically effective fiber. Journal of Dairy Science, v.80, n.7, p.1447-1462, 1997. ARO, N.; PAKULA, T.; PENTTILÄ, M. Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi. FEMS Microbiology Reviews, v.29, n.4, p.719-739, 2005. AWAWDEH, M. S.; OBEIDAT, B. S. Effect of supplemental exogenous enzymes on performance of finishing Awassi lambs fed olive cake-containing diets. Livestock Science, v.138, n.1-3, p.20-24, 2011. BASSO, F. C.; ADESOGAN, A. T.; LARA, E. C. et al. Effects of feeding corn silage inoculated with microbial additives on the ruminal fermentation, microbial protein yield, and growth performance of lambs. Journal of Animal Science, v.92, n.12, p.5640-5650, 2014. BEAUCHEMIN, K. A.; COLOMBATTO, D.; MORGAVI, D. P. et al. Use of exogenous fibrolytic enzymes to improve feed utilization by ruminants. Journal of Animal Science, v.81, E. Suppl. 2, p.E37-E47, 2003. BEAUCHEMIN, K. A.; RODE, L. M.; SEWALT, V. J. H. Fibrolytic enzymes increase fiber digestibility and growth rate of steers fed dry forages. Canadian Journal of Animal Science, v.75, n.4, p.641-644, 1995. 71 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. BEAUCHEMIN, K. A.; YANG, W. Z.; RODE, L. M. Effects of grain source and enzyme additive on site and extent of nutrient digestion in dairy cows. Journal of Dairy Science, v.82, n.2, p.378-390, 1999. BERGAMASCHINE, A. F.; PASSIPIÉRI, M.; VERIANO FILHO, W. V. et al. Qualidade e valor nutritivo de silagens de capim-marandu (B. brizantha cv. Marandu) produzidas com aditivos ou forragem emurchecida. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, n.4, p.1454-1462, 2006. BERNARDES, T. F.; ADESOGAN, A. T. Aerobic deterioration of silages in warm climates. In: Pereira O. G., Fonseca, D. M., Ribeiro, K. G. et al. (Eds.) Proceedings of the Symposium on Strategic Management of Pastures. 6., Viçosa: UFV, 2012. p.249-268. BERNARDES, T. F.; RÊGO, A. C. Study on the practices of silage production and utilization on Brazilian dairy farms. Journal of Dairy Science, v.97, n.3, p.1852-1861, 2014. BHAT, M. K.; HAZLEWOOD, G. P. Enzymology and other characteristics of cellulases and xylanases. In: BEDFORD, M. R.; PARTRIDGE, G. G. (Eds.) Enzymes in Farm Animal Nutrition. Oxford, UK.: CABI Publishing, 2000. Chap. 2, p.11-60. BIELY, P. Microbial xylanolytic system. Trends in Biotechnology, v.3, n.11, p.286-290, 1985. BIELY, P. Xylanolytic enzymes. In: WHITAKER, J. R.; VORAGEN, A. G. J.; WONG, W.S. (Eds.) Handbook of Food Enzymology. New York: Marcel Dekker, 2003. p.879-916. BUMBIERIS JUNIOR, V. H.; JOBIM, C. C.; CALIXTO JUNIOR, M. et al. Composição química e digestibilidade em ovinos da grama estrela ensilada com diferentes aditivos. Ciência e Agrotecnologia, v.33, n.5, p.1408-1414, 2009. CAVIN, J.-F.; BARTHELMEBS, L.; GUZZO, J. et al. Purification and characterization of an inducible p-coumaric acid decarboxylase from Lactobacillus plantarum. FEMS Microbiology Letters, v.147, n.2, p.291-295, 1997. CHEN, J.; STOKES, M. R.; WALLACE, C. R. Effects of enzyme-inoculant systems on preservation and nutritive value of haycrop and corn silages. Journal of Dairy Science, v.77, n.2, p.501-512, 1994. CHURCH, D. F. (Ed.) The Ruminant Animal: Digestive physiology and nutrition. Hardcover: Waveland Pr, 1993. 564p. COAN, R. M.; VIEIRA, P. F.; SILVEIRA, R. N. et al. Inoculante enzimático-bacteriano, composição química e parâmetros fermentativos das silagens dos capins Tanzânia e Mombaça. Revista Brasileira de Zootecnia, v.34, n.2, p.416-424, 2005. COLOMBATTO, D.; MORGAVI, D. P.; FURTADO, A. F. et al. Screening of exogenous enzymes for ruminant diets: relationship between biochemical characteristics and in vitro ruminal degradation. Journal of Animal Science, v.81, n.10, p.2628- 2638, 2003. COLOMBATTO, D.; MOULD, F. L.; BHAT, M. K. et al. In vitro evaluation of fibrolytic enzymes as additives for maize (Zea mays L.) silage: II. Effects on rate of acidification, fibre degradation during ensiling and rumen fermentation. Animal Feed Science and Technology, v.111, n.1-4, p.129-143, 2004. CONSIDINE, P. J.; COUGHLAN, M. P. Production of carbohydrate hydrolyzing enzyme blends by solid-state fermentation. In: Coughlan, M. P. (Ed.) Enzyme Systems for Lignocelluloses Degradation. New York, NY: Elsevier Applied Science, 1989. p.273-281. CYSNEIROS, C. S. S.; FRANCO, G. L.; ULHOA, C. J. et al. Efeito de enzimas fibrolíticas sobre a composição química da silagem de milho. Ciência Animal Brasileira, v.7, n.1, p.339-348, 2006. DE VRIES, R. P.; VISSER, J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.65, n.4, p.497-522, 2001. DePETERS, E. J.; GETACHEW, G.; FADEL, J. G. et al. Influence of corn hybrid, protease and methods of processing on in vitro gas production. Animal Feed Science and Technology, v.135, n.12, p.157-175, 2007. 72 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. DILLON, A. Celulases. In: SAID, S.; PIETRO, R. C. L. Enzimas como Agentes Biotecnológicos. Ribeirão Preto: Legis Summa, 2004. p.243-270. DONAGHY, J.; KELLY, P. F.; McKAY, A. M. Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp. and Lactobacilli. Applied Microbiology and Biotechnology, v.50, n.2, p.257-260, 1998. EUN, J.-S.; BEAUCHEMIN, K. A; HONG, S.-H. et al. Exogenous enzymes added to untreated or ammoniated rice straw: Effects on in vitro fermentation characteristics and degradability. Animal Feed Science and Technology, v.131, n.1-2, p.87-102, 2006. FAULDS, C. B.; SANCHO, A. I.; BARTOLOMÉ, B. Mono- and dimeric ferulic acid release from brewers’ spent grain by fungal feruloyl esterases. Applied Microbiology and Biotechnology, v.60, n.4, p.489-494, 2002. FUGITA, C. A.; PRADO, I. N.; JOBIM, C. C. et al. Corn silage with and without enzyme-bacteria inoculants on performance, carcass characteristics and meat quality in feedlot finished crossbred bulls. Revista Brasileira de Zootecnia, v.41, n.1, p.154-163, 2012. GASHE, B. A. Cellulase production and activity by Trichoderma sp. A-001. Journal of Applied Bacteriology, v.73, n.1, p.79-82, 1992. GHOSE, T. K. Measurement of cellulase activity. Pure and Applied Chemistry. v.59, n.2, p.257268, 1987. GOTTSCHALK, L. M. F.; OLIVEIRA, R. A.; BON, E. P. S. Cellulases, xylanases, β-glucosidase and ferulic acid esterase produced by Trichoderma and Aspergillus act synergistically in the hydrolysis of sugarcane bagasse. Biochemical Engineering Journal, v.51, n.1-2, p.72-78, 2010. HENRIQUE, W.; BOSE, M. L. V. Efeito de aditivos enzimo-bacterianos sobre a qualidade da silagem de capim-elefante (Pennisetum purpureum, Schum.). Revista da Sociedade Brasileira de Zootecnia, v.21, n.3, 429-438, 1992. JAYME, C. G.; GONÇALVES, L. C.; MOLINA, L. R. et al. Consumo e digestibilidade aparente de silagens de Brachiaria brizantha cv. Marandu adicionada de aditivos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63, n.3, p.704-711, 2011. KANG, T. W.; ADESOGAN, A. T.; KIM, S. C. et al. Effects of an esterase-producing inoculant on fermentation, aerobic stability, and neutral detergent fiber digestibility of corn silage. Journal of Dairy Science, v.92, n.2, p.732-738, 2009. KRUEGER, N. A.; ADESOGAN, A. T.; STAPLES, C. R. et al. Effect of method of applying fibrolytic enzymes or ammonia to Bermudagrass hay on feed intake, digestion, and growth of beef steers. Journal of Animal Science, v.86, n.4, p.882-889, 2008. KULKARNI, N.; SHENDYE, A.; RAO, M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiology Reviews, v.23, n.4, p.411-456, 1999. KUMAR, P.; SATYANARAYANA, T. Microbial glucoamylases: characteristics and applications. Critical Reviews in Biotechnology, v.29, n.3, p.225-255, 2009. KUNG Jr., L.; TREACHER, R. J.; NAUMAN, G. A. et al. The effect of treating forages with fibrolytic enzymes on its nutritive value and lactation performance of dairy cows. Journal of Dairy Science, v.83, n.1, p.115-122, 2000. LARA, E. C.; BASSO, F. C.; RABELO, C. H. S. et al. Silagem de milho inoculada com Lactobacillus buchneri e tratada com enzimas fibrolíticas exógenas avaliadas por meio do microscópio eletrônico de varredura. In: XXII CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA, 22., Cuiabá, 2012. Anais... Cuiabá: ZOOTEC, 2012. CD-ROM. LEE, B.; POMETTO, A. L.; DEMIRCI, A. et al. Media evaluation for the production of microbial enzymes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.46, n.11, p.4775-4778, 1998. 73 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. LOURES, D. R. S. Enzimas Fibrolíticas e Emurchecimento no Controle de Perdas da Ensilagem e na Digestão de Nutrientes em Bovinos Alimentados com Rações Contendo Silagem de Capim Tanzânia. Pirassununga: USP, 2004. 146f. Tese (Doutorado em Agronomia). LOURES, D. R. S.; NUSSIO, L. G.; PAZIANI, S. F. et al. Efeito de enzimas fibrolíticas e do teor de matéria seca em silagens de capim-tanzânia sobre os parâmetros ruminais, o comportamento ingestivo e a digestão de nutrientes em bovinos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.34, n.3, p.736-745, 2005. LYNCH, J. P.; BAAH, J.; BEAUCHEMIN, K. A. Conservation, fiber digestibility, and nutritive value of corn harvested at 2 cutting heights and ensiled with fibrolytic enzymes, either alone or with a ferulic acid esterase-producing inoculant. Journal of Dairy Science, v.98, n.2, p.1214-1224, 2015b. LYNCH, J. P.; JIN, L.; CHURCH, J. S. et al. Fibrolytic enzymes and a ferulic acid esterase-producing bacterial additive applied to alfalfa hay at baling: Effects on fibre digestibility, chemical composition and conservation characteristics. Grass and Forage Science, v.70, n.1, p.85-93, 2015a. LYNCH, J. P.; JIN, L.; LARA, E. C. et al. The effect of exogenous fibrolytic enzymes and a ferulic acid esterase-producing inoculant on the fibre degradability, chemical composition and conservation characteristics of alfalfa silage. Animal Feed Science and Technology, v.193, p.21-31, 2014a. LYNCH, J. P.; PREMA, D.; VAN HAMME, J. D. et al. Fiber degradability, chemical composition and conservation characteristics of alfalfa haylage ensiled with exogenous fibrolytic enzymes and a ferulic acid esterase-producing inoculant. Canadian Journal of Animal Science, v.94, n.4, p.697704, 2014b. MARTINS, A. S. Enzimas Fibrolíticas Exógenas na Alimentação de Bovinos. Jaboticabal: UNESP, 2003. 125f. Tese (Doutorado em Agronomia). MARTINS, A. S.; VIEIRA, P. F.; BERCHIELLI, T. T. et al. Consumo e digestibilidade aparente total em bovinos sob suplementação com enzimas fibrolíticas. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, n.5, p.2118-2124, 2006. McALLISTER, T. A.; HRISTOV, A. N.; BEAUCHEMIN, K. A. et al. Enzymes in ruminant diets. In: BEDFORD, M. R.; PARTRIDGE, G. G. (Eds.). Enzymes in Farm Animal Nutrition. Oxon: CABI Publishing, 2001. p.273-298. McALLISTER, T. A.; OOSTING, S. J.; POPP, J. D. et al. Effect of exogenous enzymes on digestibility of barley silage and growth performance of feedlot cattle. Canadian Journal of Animal Science, v.79, n.3, p.353-360, 1999. McDONALD, P.; HENDERSON, A. R.; HERON, S. J. E. The Biochemistry of Silage. Kingston, Kent: Chalcombe Publications, 1991. 340p. MICHELIN, M.; RULLER, R.; WARD, R. J. et al. Purification and biochemical characterization of a thermostable extracellular glucoamylase produced by the thermotolerant fungus Paecilomyces variotii. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v.35, n.1, p.17-25, 2008. MILLEN, D. D.; PACHECO, R. D. L.; ARRIGONI, M. D. B. et al. A snapshot of management practices and nutritional recommendations used by feedlot nutritionists in Brazil. Journal of Animal Science, v.87, n.10, p.3427-3439, 2009. MILLER, D. R.; ELLIOTT, R.; NORTON, B. W. Effects of an exogenous enzyme, Roxazyme® G2, on intake, digestion and utilisation of sorghum and barley grain-based diets by beef steers. Animal Feed Science and Technology, v.145, n.1-4, p.159-181, 2008. MORGAVI, D. P.; NEWBOLD, C. J.; BEEVER, D. E. et al. Stability and stabilization of potential feed additive enzymes in rumen fluid. Enzyme and Microbial Technology, v.26, n.2-4, p.171-177, 2000. MUIRHEAD, S. (Ed.) Direct-Fed Microbial, Enzyme, and Forage Additive Compendium. 3rd ed. Minnetonka, Minnesota, USA: The Miller Publishing Company, 1996. 391p. 74 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. NADEAU, E. M.; BUXTON, D. R.; RUSSELL, J. R. et al. Enzyme, bacterial inoculant, and formic acid effects on silage composition of orchardgrass and alfalfa. Journal of Dairy Science, v.83, n.7, p.1487-1502, 2000. NSEREKO, V. L.; BEAUCHEMIN, K. A.; MORGAVI, D. P. et al. Effect of a fibrolytic enzyme preparation from Trichoderma longibrachiatum on the rumen microbial population of dairy cows. Canadian Journal of Microbiology. v.48, n.1, p.14-20, 2002. NSEREKO, V. L.; MORGAVI, D. P.; RODE, L. M. et al. Effects of fungal enzyme preparations on hydrolysis and subsequent degradation of alfalfa hay fiber by mixed rumen microorganisms in vitro. Animal Feed Science and Technology, v.88, n.3-4, p.153-170, 2000. NSEREKO, V. L.; SMILEY, B. K.; RUTHERFORD, W. M. et al. Influence of inoculating forage with lactic acid bacterial strains that produce ferulate esterase on ensilage and ruminal degradation of fiber. Animal Feed Science and Technology, v.145, n.1-4, p.122-135, 2008. OWENS, F. N.; ZINN, R. A.; KIM, Y. K. Limits to starch digestion in the ruminant small intestine. Journal of Animal Science, v.63, n.5, p.1634-1648, 1986. PHAKACHOED, N.; SUKSOMBAT, W.; COLOMBATTO, D. et al. Use of fibrolytic enzymes additives to enhance in vitro ruminal fermentation of corn silage. Livestock Science, v.157, n.1, p.100-112, 2013. POLIZELI, M. L. T. M. Properties and commercial applications of xylanases from fungi. In: RAI, M. K. (Ed.) Mycotechnology: Current Trends and Future Prospects. New Delhi: I.K. International Publisher, 2008. p.82-108. POLIZELI, M. L. T. M.; RIZZATTI, A. C. S.; MONTI, R. et al. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology, v.67, n.5, p.577-591, 2005. PRADE, R. A. Xylanases from biology to biotechnology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, v.13, p.101-131, 1995. RABELO, C. H. S.; REZENDE, A. V.; RABELO, F. H. S. et al. Silagens de milho inoculadas microbiologicamente em diferentes estádios de maturidade: perdas fermentativas, composição bromatológica e digestibilidade in vitro. Ciência Rural, v.44, n.2, p.368-373, 2014. RAO, M. B.; TANKSALE, A. M.; GHATGE M. S. et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.62, n.3, p.597-635, 1998. REDDY, N. S.; NIMMAGADDA, A.; RAO, K. R. S. S. An overview of the microbial α-amylase family. African Journal of Biotechnology, v.2, n.12, p.645-648, 2003. REILLY, P. J. Xylanases: structure and function. In: HOLLAENDER, A.; RABSON, R.; ROGERS, P. et al. (Eds.) Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals. New York: Springer US, 1981. p.111-129. REIS, R. A.; JOBIM, C. C.; RABELO, C. H. S. et al. An overview about the role of silage inoculants in Brazil: a good strategy to improve the silage quality. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 52., 2015, Belo Horizonte. Anais... Brasília: SBZ, 2015. p.1-43. RIBEIRO, J. L.; NUSSIO, L. G.; MOURÃO, G. B. et al. Valor nutritivo de silagens de capimmarandu submetidas aos efeitos de umidade, inoculação bacteriana e estação do ano. Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, N.7, p.1176-1184, 2008. ROCHA, K. D.; PEREIRA, O. G.; VALADARES FILHO, S. C. et al. Valor nutritivo de silagens de milho (Zea mays L.) produzidas com inoculantes enzimo-bacterianos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, n.2, p.389-395, 2006. RODRIGUES, P. H. M.; SENATORE, A. L.; LUCCI, C. S. et al. Valor nutritivo da silagem de sorgo tratada com inoculantes enzimo-microbianos. Acta Scientiarum. Animal Sciences, v.24, n.4, p.11411145, 2002. 75 Anais do X Congresso Nordestino de Produção Animal, Teresina, PI: SNPA, nov. 2015: Palestras. ROJO, R.; MENDOZA, G. D.; GONZÁLEZ, S. S. et al. Effects of exogenous amylases from Bacillus licheniformis and Aspergillus niger on ruminal starch digestion and lamb performance. Animal Feed Science and Technology, v.123-124, Part 2, p.655-665, 2005. ROOKE, J. A.; HATFIELD, R. D. Biochemistry of ensiling. In: BUXTON, D. R.; MUCK, R. E.; HARRISON, J. H. (Eds.). Silage Science and Technology. Madison, USA: American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America, 2003. p.95-139. SABATIER, A. M.; FISH, N. M. Method of analysis for feed enzymes: methodological problems?. Journal of Applied Poultry Research, v.5, n.4, p.408-413, 1996. SHEPERD, A. C.; KUNG Jr., L. An enzyme additive for corn silage: Effects on silage composition and animal performance. Journal of Dairy Science, v.79, n.10, p.1760-1766, 1996. SILVA, A. V.; PEREIRA, O. G.; VALADARES FILHO, S. C. et al. Consumo e digestibilidades dos nutrientes em bovinos recebendo dietas contendo silagens de milho e sorgo, com e sem inoculante microbiano. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, n.6, p.2469-2478, 2006. SIMPSON, D. J. Proteolytic degradation of cereal prolamins - the problem with proline. Plant Science, v.161, n.5, p.825-838, 2001. STOKES, M. R.; CHEN, J. Effects of an enzyme-inoculant mixture on the course of fermentation of corn silage. Journal of Dairy Science, v.77, n.11, p.3401-3409, 1994. SUNNA, A.; ANTRANIKIAN, G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Critical Reviews in Biotechnology, v.17, n.1, p.39-67, 1997. VAHJEN, W.; SIMON, O. Biochemical characteristics of non starch polysaccharide hydrolyzing enzyme preparations designed as feed additives for poultry and piglet nutrition. Archiv für Tierernaehrung, v.52, n.1, p.1-14, 1999. VAN SOEST, P. J. Nutritional Ecology of the Ruminant. 2.ed. Ithaca: Cornell University, 1994. 476p. VAN SOEST, P. J.; ROBERTSON, J. B.; LEWIS, B. A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition. Journal of Dairy Science, v.74, n.10, p.3583-3597, 1991. WANG, P.; JOHNSTON, D. B.; RAUSCH, K. D. et al. Effects of protease and urea on a granular starch hydrolyzing process for corn ethanol production. Cereal Chemistry, v.86, n.3, p.319-322, 2009. WEINBERG, Z. G.; SHATZ, O.; CHEN, Y. et al. Effect of lactic acid bacteria inoculants on in vitro digestibility of wheat and corn silages. Journal of Dairy Science, v.90, n.10, p.4754-4762, 2007. WOOD, T. M.; BHAT, K. M. Methods of measuring cellulase activities. Methods in Enzymology, v.160, p.87-112, 1988. YOUNG, K. M.; LIM, J. M.; DER BEDROSIAN, M. C. et al. Effect of exogenous protease enzymes on the fermentation and nutritive value of corn silage. Journal of Dairy Science, v.95, n.11, p.66876694, 2012. YU, P.; McKINNON, J. J.; CHRISTENSEN, D. A. Hydroxycinnamic acids and ferulic acid esterase in relation to biodegradation of complex plant cell walls. Canadian Journal of Animal Science, v.85, n.3, p.255-267, 2005. ZANETTE, P. M.; NEUMANN, M.; SANDINI, I. et al. Características da carcaça de bovinos e digestibilidade de silagens de milho (Zea mays L.) com adição de açúcar ou inoculante enzimobacteriano. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, v.10, n.3, p.235-246, 2011. ZHANG, Y. H.; SCHELL, D. J.; McMILLAN, J. D. Methodological analysis for determination of enzymatic digestibility of cellulosic materials. Biotechnology Bioengineering, v.96, n.1, p.188-194, 2007. ZoBELL, D. R.; WEIDMEIER, R. D.; OLSON, K. C. et al. The effect of an exogenous enzyme treatment on production and carcass characteristics of growing and finishing steers. Animal Feed Science and Technology, v.87, n.3-4, p.279-285, 2000. 76