universidade tecnológica federal do paraná campus curitiba

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
CAMPUS CURITIBA - ECOVILLE
DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUIMICA E BIOLOGIA
CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM QUÍMICA AMBIENTAL
RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO
LIANA CRISTIANE DE SOUSA
CURITIBA
2013
LIANA CRISTIANE DE SOUSA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO
Relatório de Estágio Supervisionado,
apresentado à disciplina de Estágio
Supervisionado do Curso Superior de
Tecnologia em Química Ambiental do
Departamento Acadêmico de Química e
Biologia – DAQBI – da Universidade
Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR.
Orientadora: Profª Marlene Soares
Supervisora: Profª Marlene Soares
CURITIBA
2013
IDENTIFICAÇÃO
Aluna
Nome: Liana Cristiane de Sousa
E-mail: [email protected]
Código: 890146
Empresa
Razão Social: Universidade Tecnológica Federal Do Paraná – Curitiba
CNPJ:75.101.873/0008-66
Endereço: Av. Silva Jardim, 879 – Rebouças - CEP 80230-901 – Curitiba - PR
– Brasil. Telefone: (41) 3310-4545
Departamento Acadêmico de Química e Biologia: Rua Deputado Heitor de
Alencar Furtado, 4900 – Bairro Cidade Industrial - CEP 81280-340 - Curitiba PR – Brasil. Telefone: (41) 33730832 R.237
Supervisão
Orientadora: Profª Marlene Soares
Supervisor: Profª Marlene Soares
Carga Horária do Estágio Obrigatório
Período: 22/04/2013 a 21/10/2013
Carga horária: 20 horas semanais – 08h às 12h
Horas Obrigatórias: 400 horas
Horas Cumpridas: 400 horas
Atividades Desenvolvidas
- Auxílio no preparo de aulas práticas da disciplina de Microbiologia Ambiental;
- Preparo de soluções e reagentes;
- Acompanhamento da qualidade microbiológica das águas dos bebedouros do
Bloco C, sede Ecoville;
- Manutenção do laboratório.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................6
2 UTFPR .............................................................................................................6
3 LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UTFPR (DAQBI) .......................7
4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ...................................................................9
4.1 AUTOCLAVE ............................................................................................. 10
4.1.1 Procedimento Para Operação Da Autoclave........................................... 12
4.2 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ....................................................... 12
4.4 PREPARO DE CRISTAL VIOLETA, SOLUÇÃO DE LUGOL, FUCSINA,
ÁLCOOLACETONA, ÁLCOOL 70% E ÁLCOOL IODADO............................... 14
4.4.1 Cristal Violeta........................................................................................... 14
4.4.2 Solução Lugol.......................................................................................... 15
4.4.3 Álcool Acetona......................................................................................... 15
4.4.4 Fucsina.................................................................................................... 15
4.4.5 Álcool 70.................................................................................................. 16
4.4.6 Álcool Iodado........................................................................................... 16
4.5 ACOMPANHAMENTO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DAS ÁGUAS
DOS BEBEDOUROS DO BLOCO C – SEDE ECOVILLE.................................16
4.5.1 Objetivos...................................................................................................18
4.5.2 Materiais e métodos.................................................................................18
4.5.2.1 Amostras................................................................................................18
4.5.2.2 Preparo de Amostras.............................................................................19
4.5.2.3 Rapid Coliform Broth/Rapid Coliform Agar............................................20
4.5.2.4 Reativo de Kovacs.................................................................................21
4.5.3 Resultados................................................................................................22
4.5.4 Discussão dos Resultados........................................................................24
5 CONCLUSÃO ................................................................................................25
6 REFERÊNCIAS..............................................................................................26
1 INTRODUÇÃO
O presente relatório tem como objetivo a descrição das atividades
desenvolvidas pela aluna Liana Cristiane de Sousa no laboratório de
Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, no Campus
Curitiba – Ecoville. O estágio foi realizado no período de 22/04/2013 a
21/10/2013 para o cumprimento do estágio obrigatório, necessário para a
graduação do Curso Superior de Tecnologia em Química Ambiental.
As atividades realizadas no laboratório durante o período de estágio
foram: auxílio no preparo de aulas práticas para as disciplinas de Microbiologia
Básica, Microbiologia Ambiental e Biotecnologia, preparo de soluções e
reagentes, acompanhamento da qualidade microbiológica das águas dos
bebedouros do bloco C – sede Ecoville e a manutenção do laboratório.
2 UTFPR
A história da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) teve
início em 1909 com a Escola de Aprendizes Artífices. Sua função era oferecer
conhecimentos elementares e ensino profissionalizante a garotos de classes
menos favorecidas (UTFPR, 2012).
No ano de 1937, a escola começou a oferecer o ensino de 1º grau e
passou a ser denominada Liceu Industrial do Paraná. Em 1942, após a
organização e reestruturação do ensino industrial em todo o país, a instituição
passou a se chamar Escola Técnica de Curitiba. Em 1959, o ensino técnico no
Brasil foi unificado pela legislação, foi renomeada Escola Técnica Federal do
Paraná (UTFPR, 2012).
Em 1978, a instituição foi transformada em Centro Federal de Educação
Tecnológica do Paraná (CEFET-PR), oferecendo cursos de graduação plena e,
posteriormente, cursos de pós-graduação. No ano de 1996, devido à restrição
de implementação de cursos técnicos integrados, o CEFET-PR passou a
oferecer cursos de Tecnologia e o Ensino Médio (UTFPR, 2012).
6
Finalmente no ano de 2005, após a aprovação de um projeto de lei o
CEFET-PR foi elevado à categoria de Universidade Tecnológica Federal do
Paraná (UTFPR), a primeira universidade especializada do país (UTFPR,
2012).
A UTFPR possui 12 campus no estado do Paraná, sendo eles:
Apucarana, Campo Mourão, Cornélio Procópio, Curitiba, Dois Vizinhos,
Francisco Beltrão, Guarapuava, Londrina, Medianeira, Ponta Grossa, Pato
Branco e Toledo. Cada Campus oferece cursos visando atender necessidade
da região onde está situado. No total são 63 cursos superiores de tecnologia,
bacharelados, engenharias e licenciaturas. A Universidade Tecnológica
também oferta cursos técnicos em diversas áreas para pessoas que desejam
qualificação profissional de nível médio (UTFPR, 2012).
3 LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UTFPR
O Laboratório de Microbiologia da UTFPR realiza as aulas práticas das
disciplinas de Microbiologia Básica, Microbiologia Ambiental, Biossegurança e
Biotecnologia, sob responsabilidade do Departamento Acadêmico de Química
e Biologia (DAQBI). No laboratório também são desenvolvidas atividades de
pesquisa relacionadas ao estágio supervisionado, iniciação científica, trabalhos
de conclusão de curso e mestrado.
O
laboratório
possui
nível
de
biossegurança
2,
por
possuir
microrganismos da classe de risco 2. São microrganismos de risco individual
moderado e baixo para a comunidade, que podem provocar infecções, porém,
dispõe-se de medidas terapêuticas e profiláticas eficientes, sendo o risco de
propagação limitado. Entre os microrganismos classe 2 pertencentes ao banco
de cepas do laboratório estão: Acinetobacter baumannii, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes e Aspergillus niger (Ministério da Saúde,
2006). Sendo assim, normas e práticas devem ser seguidas para garantir a
segurança e o bom funcionamento do laboratório, como:

O acesso ao laboratório é restrito ou limitado somente às pessoas
autorizadas pela chefia;
7

Não é permitida a presença de crianças;

As salas devem ser mantidas trancadas quando fora de uso. Manter um
controle de chaves;

É proibido comer, beber, fumar, mascar chicletes, manusear lentes de
contato e aplicar cosméticos nas áreas de trabalho;

Utilização de roupas apropriadas como jalecos, gorros ou uniformes de
proteção, dentro do laboratório. Antes de sair do laboratório para as
áreas externas (cantina, biblioteca, escritório administrativo), a roupa
protetora deve ser retirada e deixada no laboratório;

Manter cabelos compridos presos;

Devem ser usadas luvas, quando houver um contato direto com
materiais e superfícies potencialmente infecciosas ou equipamentos
contaminados;

Lavar as mãos: antes e após o manuseio de materiais viáveis, após a
remoção das luvas e antes de sair do laboratório; antes e após o uso de
luvas; depois de manusear material infectante, mesmo quando as luvas
tenham sido
usadas;
mãos e
antebraços devem
ser lavados
cuidadosamente;

É proibida a pipetagem com a boca; devem ser utilizados dispositivos
mecânicos. É proibido lamber as etiquetas ou colocar os materiais na
boca;

As
superfícies
de
trabalho
devem
ser
descontaminadas
com
desinfetantes que sejam eficazes contra os agentes manipulados, ao
final do trabalho ou no final do dia e após qualquer vazamento ou
borrifada de material viável;

Todas
as
culturas,
colônias
e
outros
resíduos
devem
ser
descontaminados antes de serem descartados através de um método de
descontaminação aprovado como, por exemplo, esterilização por calor
úmido (autoclave);

O pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no
manejo de agentes patogênicos e devem ser supervisionados por
profissionais competentes;

A manipulação de microrganismos viáveis ou de meios de cultivos em
placas ou tubos não fechados deve ser realizada nas proximidades da
8
chama, onde o risco de contaminação por agentes aéreos é menor,
devendo-se evitar ao máximo as correntes de ar;

O acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos
operacionais.
Figura 1: Laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
As principais atividades desenvolvidas no laboratório de Microbiologia
durante o estágio foram:

Preparo e plaqueamento de meios de cultura a serem utilizados nas
aulas práticas, sendo os mais comuns: PCA (Plate Count Agar), PDA
(Potato Dextrose Agar), Ágar Sabouraud, Ágar Nutriente, Ágar Ágar e
Ágar Mueller Hinton;
9

Preparo de diferentes materiais e reagentes para as aulas práticas
ministradas no laboratório nas disciplinas de Microbiologia Básica,
Microbiologia Ambiental, Segurança Biológica e Biotecnologia;

Preparo de soluções para limpeza, higiene e desinfecção das mãos,
bancadas e materiais, como álcool 70%, álcool iodado;

Preparo de reagentes utilizados em coloração de Gram, como cristal
violeta, fucsina, solução de lugol e álcool acetona;

Controle de estoque dos materiais do laboratório como vidrarias,
reagentes e meios de cultivo;

Acompanhamento da qualidade microbiológica das águas do bloco C, da
sede Ecoville;

Organização e manutenção do laboratório.
Para a manutenção e limpeza das vidrarias utilizadas no laboratório, os
materiais que foram contaminados devem ser esterilizados antes de serem
lavados ou devidamente destinados. Alguns materiais devem ser esterilizados
antes da sua utilização. Para esterilizar materiais e meios de culturas utiliza-se
a autoclave. Depois de serem descontaminados, os meios contendo
microrganismos são descartados. As vidrarias são lavadas com água e sabão,
enxaguadas com água corrente e com água deionizada respectivamente. O
material lavado é destinado à secagem natural em um compartimento próprio.
4.1 AUTOCLAVE
O princípio de operação de uma autoclave é governado pela Lei de
Boyle, a qual relaciona pressão, temperatura e volume. Na autoclave de vapor
saturado de água, a função esterilizante é baseada, principalmente, na perfeita
distribuição do calor propiciado pelo vapor que transmite o calor a todo o
material a ser esterilizado na câmara de forma efetiva. A principal razão pela
qual a esterilização com vapor saturado sob pressão é eficiente para todo
material, quer líquido quer sólido, é que estes materiais recebem de uma forma
rápida grande quantidade de caloria, propiciada pelo vapor saturado à alta
temperatura em virtude de grande pressão. A pressão em si não contribui para
o processo de esterilização. O processo ocorre mesmo em virtude de vapor ser
10
ótimo para transmitir calor aos materiais que estiverem dentro da câmara de
esterilização.
A autoclave é essencial no laboratório de microbiologia, pois é o
equipamento com o método mais eficaz para esterilizar e desinfectar materiais
e meios de cultivo. Normalmente opera sob pressão de 1,02 bar e temperatura
de 121ºC. A pressão é usada para elevar a temperatura do vapor acima dos
100ºC, já que a temperatura de 121ºC permite a esterilização dos endosporos,
que são as formas de vida das bactérias mais resistentes ao calor.
Materiais não contaminados são esterilizados depois de 15 minutos sob
a pressão de 121°C na autoclave, enquanto os contaminados são esterilizados
depois de 30 minutos. A esterilização de placas de Petri e pipetas graduadas
não contaminadas é feita com o acondicionamento em containers, enquanto
que as contaminadas são colocadas em sacos plásticos. Os tubos de roscas
devem estar com as tampas afrouxadas, permitindo a saída de ar e entrada de
vapor, evitando a quebra do material dentro da autoclave. Nos tubos grandes
lisos, assim como em béqueres e erlenmeyers, devem-se utilizar tampões
feitos de algodão e gaze, sendo evolto individualmente por papel Kraft ou no
caso dos tubos, devem ser arranjados dentro de cestas apropriadas. É
importante que todos os materiais, principalmente aqueles contaminados,
sejam identificados antes da autoclavagem, com o nome do responsável pelo
material e o nome do microrganismo presente, evitando acidentes e
possibilitando que os procedimentos corretos sejam seguidos em caso de
acidente.
Figura 2: Autoclaves do Laboratório de Microbiologia. Uma é utilizada para material não contaminado (à
esquerda) e outra para material contaminado (à direta).
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4.1.1 Procedimentos para a Operação Da Autoclave
O uso da autoclave é um dos passos primordiais para a obtenção do material
estéril. A utilização correta da autoclave garante segurança, material
esterilizado e interfere na conservação do equipamento.

É necessário verificar o nível da água. Adicionando água destilada
suficiente para cobrir a resistência, de forma a impedir a oxidação do
metal e danificação da resistência; em seguida introduzir o material a ser
esterilizado, fechar a tampa, apertando por igual os manípulos;

Para que a esterilização seja bem feita, é necessário ter em atenção que
no início do aquecimento existe ar no interior da autoclave além do
vapor de água, deve-se ligar na temperatura máxima, e abrir a válvula
para deixar sair o ar. Quando o vapor estiver constante, a válvula pode
ser fechada. Esperar que o termômetro atinja a temperatura de
esterilização desejada 121ºC, ou que a pressão indicada seja 1,02bar, e
então reduzir a potência do termostato para o mínimo, mantendo a
temperatura constante;

Iniciar a contagem de tempo (15 ou 30 minutos);

Quando termina o tempo calculado para uma correta esterilização, devese desligar o equipamento e deixar arrefecer lentamente, só abrindo a
torneira de descarga e lentamente, após o manómetro indicar zero.
Deve-se ter o máximo de cuidado ao abrir devido à pressão interna,

Remover os materiais utilizados.
4.2 PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
Primeiramente deve-se determinar a quantidade de meio a ser
preparado tendo em vista que para cada placa de Petri são utilizados 20 mL de
meio, para cada tubo pequeno com tampa de rosca 5 mL e para os demais
tubos de ensaio 10 mL. Para preparar meios de cultivo deve-se adicionar água
deionizada ou outro solvente, se for o caso, ao meio desidratado.
12
Se o meio de cultivo já vier pronto é feita a relação da quantidade
indicada pelo fabricante que deve ser utilizada por litro de água e a quantidade
a ser preparada através de regra de três:
g de meio ------------------------- 1000mL
X -------------------------- Quantidade a ser preparada (mL)
Sendo X a quantidade de meio de cultivo a ser dissolvida.
Deve-se então pesar a quantidade de meio em um erlenmeyer e
adicionar a água deionizada necessária. A mistura deve então ser levada para
o microondas para que possa dissolver o ágar. O recipiente deve ser retirado
do interior do microondas de tempo em tempo, e o meio deve ser misturado
com um bastão de vidro. Este procedimento deve ser repetido até que levante
fervura da solução, para que o meio possa se dissolver bem na água. Quando
o meio estiver dissolvido, deve-se retirar o erlenmeyer do microondas e tampálo com um tampão de algodão, embrulhando a boca do mesmo com papel
alumínio e papel Kraft, prendendo com um elástico de borracha. Caso o meio
seja destinado a tubos, deve-se transferi-lo com o auxílio de uma pipeta
graduada antes da autoclavagem. Após a autoclavagem os meios são
plaqueados em câmara de fluxo laminar, que deve ser previamente preparada
e higienizada. A câmara de fluxo laminar permite a obtenção de uma área
limpa, em cujos trabalhos requeiram total proteção ao material que está sendo
manipulado.
Figura 3: Plaqueamento dos meios de cultivo na câmara de fluxo laminar.
13
4.4 PREPARO DE CRISTAL VIOLETA, SOLUÇÃO DE LUGOL, FUCSINA,
ÁLCOOLACETONA, ÁLCOOL 70% E ÁLCOOL IODADO
Considerando-se a constituição das membranas das células bacterianas,
podemos observar, basicamente, dois grupos de bactérias. Em um grupo
predominam ácidos teicóicos e no outro, lipopolissacarídeos.
Em 1984,
Christian Gram desenvolveu uma técnica de coloração onde um grupo de
bactérias se corava de azul escuro, enquanto outro grupo permanecia incolor,
ou se corava por um segundo corante. As bactérias gram positivas possuem
grande quantidade de ácidos teicóicos na membrana.
Após coloração por
violeta de genciana, seguida de tratamento com solução de iodo (lugol), formase um complexo corado, cor escura, entre a violeta de genciana e o iodo. Essa
coloração é fortemente retida pelas bactérias, não sendo facilmente removida
após tratamento com álcool. As demais bactérias descoradas (gram negativas)
são reveladas com solução de Fucsina e apresentam coloração avermelhada.
Fungos e famílias bacterianas são, em geral, gram positivos. Protozoários e
células animais são gram negativos.
As soluções preparadas no laboratório de microbiologia vão verificar e
caracterizar em cada caso, o tipo de microorganismo em questão.
4.4.1 Cristal Violeta
O corante cristal violeta é usado na coloração de gram. A coloração
recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a
estrutura bacteriana, corando a parede celular bacteriana de violeta ou púrpura.
As bactérias que retêm a coloração após o uso de álcool são classificadas
como gram-positivas.
Para o preparo do cristal violeta é necessário o preparo de duas
soluções, sendo a solução A composta por 2g de cristal violeta e 20mL de
etanol, e ao solução B composta por 0,8g de oxalato de amônia e 80 mL de
água destilada. As duas soluções devem ser misturadas e transferidas para um
frasco âmbar.
14
4.4.2 Solução Lugol
Para o preparo do lugol para gram é necessário misturar 1g de iodo e 2g
de iodeto de potássio em 300 mL de água destilada, em uma proveta ou
béquer de 500 mL. A aplicação de lugol em células gram-positivas e negativas
fará com que haja a formação do complexo CV-I no interior da célula, que
permanece violeta.
4.4.3 Álcool Acetona
Para preparar álcool acetona deve-se colocar, em uma proveta de 1L,
800mL de álcool comercial 92,8º INPM e completar o volume para 1L com
acetona. A proveta deve ser tampada e agitada para que ocorra a mistura do
álcool e da acetona. A solução deve ser armazenada em frasco âmbar.
O álcool-acetona irá fazer com que ocorra a desidratação da parede
celular de
bactérias gram-positivas,
diminuindo
sua
porosidade
e a
permeabilidade, não permitindo que o complexo CV-I saia da célula, o violeta.
Já em células gram-negativas com a aplicação do álcool-acetona haverá a
extração dos lipídeos da parede celular, o que irá aumentar a porosidade e o
complexo CV-I será removido da célula.
4.4.4 Fucsina
As bactérias que perdem a coloração púrpura após a descoloração com
álcool acetona são chamadas de gram-negativas. Para que as células possam
ser visualizadas é aplicado outro corante, geralmente a fucsina, colorindo as
células de rosa.
Para o preparo da fucsina é preciso fazer duas soluções, a fucsina
concentrada composta por 2,5g de fucsina e 100 mL de etanol, e a fucsina
diluída (para uso na coloração) composta pela fucsina concentrada (10mL) e
90mL de água destilada. Tudo preparado em béquer ou provetas.
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4.4.5 Álcool 70
Soluções alcoólicas com atividade microbiana ideal dependem de uma
concentração em peso ou em volume em relação à agua, sendo ela 70% p/p
(70ºINPM) ou 77% v/v (77ºGL). Nesta concentração a parede celular do
microrganismo não será desidratada pelo álcool, o qual pode penetrar no
interior da mesma desnaturando proteínas, fato que não ocorre quando utiliza o
álcool acima ou abaixo da concentração ideal.
Para preparar o álcool 70 deve-se colocar em uma proveta de 1L, 700
mL de álcool comercial e completar o volume da proveta com água deionizada.
Em seguida deve-se tampar a proveta e promover a mistura do álcool com a
água. Depois se deve colocar o alcoômetro na solução, o qual deverá marcar
70 Gay-Lussac.
4.4.6 Álcool Iodado
O álcool 70% quando associado a iodo, formulando Álcool Iodado,
apresenta um maior efeito residual e bactericida.
Para o preparo do álcool iodado deve-se colocar 8 mL de lugol forte em
um balão volumétrico de 1L e adicionar 300mL de água deionizada. Completase o volume do balão com álcool 70%. Deve-se misturar bem e armazenar o
álcool iodado em frasco âmbar.
4.5 ACOMPANHAMENTO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DAS ÁGUAS
DOS BEBEDOUROS DO BLOCO C – SEDE ECOVILLE
A água é uma substância que se manifesta sob a forma de numerosas
dispersões aquosas, de composição muito variável, que lhe conferem, em
consequência, características que nem sempre são aquelas que representam a
condição desejada. Quando se pensa em qualidade da água para consumo
humano, surge a necessidade de conhecer, estabelecer, estudar e controlar o
conjunto de características que fazem (ou não) com que ela seja considerada
adequada para este fim. É fundamental conhecer essas características com o
16
objetivo de saber quais são e por que representam a condição pretendida;
estabelecê-las para evidenciar a opção por determinada qualidade; estudá-las,
a fim de aperfeiçoar seu conhecimento e, controlá-las, visando garantir sua
adequação ao consumo humano.
Os indicadores de contaminação fecal, tradicionalmente aceitos,
pertencem a um grupo de bactérias denominadas coliformes. O principal
representante desse grupo de bactérias chama-se Escherichia coli. O
“Standard Methods for the Examinations of Water and Wastewater” define o
grupo coliforme como: “todas as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas,
gram negativas, não esporuladas e na forma de bastonete”, as quais
fermentam a lactose e produzem ácido, gás e aldeído em um prazo de 24-48
horas a 35°C. Neste grupo são incluídos organismos que diferem nas
características bioquímicas, sorológicas e no seu habitat. Podem ser
classificadas em: Escherichia, Aerobacter, Citrobacter, Klebsiela e outros
gêneros que quase nunca aparecem em fezes como a Serratia.
A razão da escolha dos coliformes como indicadores de contaminação
da água deve-se aos seguintes fatores:
• estão presentes nas fezes de animais de sangue quente, inclusive os
seres humanos;
• sua presença na água possui uma relação direta com o grau de
contaminação fecal;
• são facilmente detectáveis e quantificáveis por técnicas simples e
economicamente viáveis, em qualquer tipo de água;
• possuem maior tempo de vida na água que as bactérias patogênicas
intestinais, por serem menos exigentes em termos nutricionais, além de ser
incapazes de se multiplicarem no ambiente aquático;
• são mais resistentes à ação dos agentes desinfetantes do que os
germes patogênicos.
17
4.5.1 Objetivo
O objetivo do estudo foi avaliar a potabilidade da água mineral que abastece os
bebedouros do bloco C – sede Ecoville, quanto à presença de coliformes totais
e fecais.
4.5.2 Material e Métodos
4.5.2.1 Amostras
Um total de cinco amostras de água, sendo elas dos bebedouros: Térreo,
Primeiro Segundo e Terceiro andar, mais uma amostra do Daqbi (terceiro
andar), do bloco C - sede Ecoville. Todas as amostras foram coletadas em
duplicata, em tubos de ensaio e suas quantidades medidas em proveta
analítica.
Figura 4: Preparação dos frascos para as análises.
18
4.5.2.2 Preparo de Amostras
Para 100 mL de amostra foram utilizados 50 mL do meio Rapid
HiColiform Broth/ Rapid HiColiform Agar.
Para preparar o meio, conforme orientações do Fabricante devem ser
utilizados 16,03g do meio para 1000 mL de água destilada. Foram feitas cinco
amostras em duplicata (total de 10 amostras), cada uma com 50 mL, sendo
utilizados 8,015g para preparo de 500 mL de meio, distribuídos e autoclavados
por quinze minutos, a 15lbs. Quando em temperatura ambiente, foi feito a
coleta de amostras e adicionado a estes meios, sendo identificados e
colocados na estufa a uma temperatura de 37°C para permanência de 24
horas.
Figura 5: Frascos com amostras na estufa.
19
4.5.2.3 Rapid HiColiform Broth/Rapid Hicoliform Agar
Rapid HiColiform Broth
é um caldo modificado do descrito por LMX
MANAFI Kneifel. Este meio é útil para a detecção e confirmação de Escherichia
coli e coliformes totais em amostras de água e contém substratos de bases
cromogênicos e fluorogênicos.
Sua composição é rica em Peptona, Cloreto de Sódio, Sorbitol, Fosfato
de Hidrogênio Dipotássico, Dihidrogeno Fosfato de Potássio e Lauril sulfato de
Sódio. O substrato fluorogênico é dividido pela enzima ß-D-glucuronidase
especificamente encontrado em Escherichia coli. A reacção é indicada pelo
desenvolvimento de uma fluorescência azul sob a luz UV. A presença de
coliformes totais é indicada pela coloração azul-esverdeado, devido à clivagem
do substrato cromogênico. A Peptona é rica em triptofano, fornecendo
nutrientes de crescimento essenciais e é útil para a detecção simultânea de
produção de indol. O Sorbitol é a fonte de carbono. Os sais de fosfato irão
fornecer a ação de tamponamento para o rápido crescimento de coliformes.
Lauril sulfato de sódio torna o meio seletivo inibindo microflora acompanhante,
especialmente organismos gram positivos.
Figura 6: Rapid HiColiform Broth
20
4.5.2.4 Reativo de Kovacs
A prova do indol é útil para a diferenciação entre Escherichia coli das demais
Enterobacterias. Alguns não fermentadores e anaeróbios podem também ser
diferenciados através desta prova. Após crescimento em caldo, contendo
triptofano, a formação de metabólitos indólicos é determinada pela reação com
o reativo de Kovacs. Devem ser pingadas 4-5 gotas do reativo, que formará um
anel vermelho dentro de dois minutos caso haja reação positiva.
Figura 7: Reativo de Kovacs
21
4.5.3 Resultados
Na primeira vez que a pesquisa foi realizada, em apenas um bebedouro
(segundo andar) houve reação positiva para coliformes totais e resultado
negativo para Escherichia coli.
Figura 8: Resultado da Análise 1 para Coliformes Totais.
Figura 9: Resultado Análise 1 para Escherichia coli (Teste com reativo de kovaks).
22
Na segunda vez que a pesquisa foi realizada, o resultado foi positivo para
coliformes totais em dois bebedouros do bloco, e negativo para presença de
Escherichia coli em ambos.
Figura 10: Resultado da Análise 2 para Coliformes Totais.
Figura 11: Resultado Análise 2 para Escherichia coli (Teste com reativo de kovaks).
23
4.5.4 Discussão dos Resultados
Na análise da qualidade microbiológica da água, 30% das amostras
coletadas estavam contaminadas por coliformes totais, sendo que 70%
estavam aptas para o consumo. Este resultado é importante visto que
contaminantes como a E. Coli podem causar infecção das vias urinárias e
também pode provocar diarreia.
A Portaria nº 518/2004 do Ministério da Saúde estabelece que sejam
determinados, na água, para aferição de sua potabilidade, a presença de
coliformes totais e termotolerantes de preferência Escherichia coli e a
contagem de bactérias heterotróficas. A mesma portaria recomenda que a
contagem padrão de bactérias não deve exceder a 500 Unidades Formadoras
de Colônias por 1 mililitro de amostra (500/UFC/ml).
Conforme a RDC nº 275/2005 da ANVISA, a água mineral natural e a
água natural envasadas não devem apresentar risco à saúde do consumidor e
devem estar em conformidade com as características microbiológicas. Devem
ser rejeitadas águas onde que tiverem sido constatadas a presença de
Escherichia coli ou coliformes (fecais) termotolerantes em uma das unidades
da amostra representativa; ou apresentar contagem de coliformes totais em
uma das unidades da amostra representativa, maior que "M" (limite máximo
aceitável - 2,0 UFC); apresentar contagem de coliformes totais em mais de
uma unidade da amostra representativa, maior que "m"(limite mínimo aceitável
– menor que 1,0 UFC).
Traçando as bases do Programa Nacional de Vigilância em Saúde
Ambiental relacionadas à qualidade da água para consumo humano, a
Secretaria de Vigilância em Saúde, órgão vinculado ao Ministério da Saúde,
afirma que: “A vigilância da qualidade da água para consumo humano deve
ser uma atividade rotineira, preventiva, de ação sobre os sistemas públicos e
soluções alternativas de abastecimento de água, a fim de garantir o
conhecimento da situação da água para consumo humano, resultando na
redução das possibilidades de enfermidades transmitidas pela água”. Portanto,
através do monitoramento contínuo da qualidade da água, é possível se obter
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um produto dentro das normas de qualidade da água para consumo humano. E
nisso se resume a finalidade dos sistemas de abastecimento/distribuição de
água.
A água é um produto essencial para a existência do ser humano. E, por
essa razão, deve ser disponibilizada em quantidade suficiente e em boa
qualidade para garantir a manutenção e qualidade de vida. No entanto, o que
se percebe é que a observância dos parâmetros de qualidade nem sempre é
realizada.
Por
diversos
fatores
a
qualidade
da
água
é
vulnerável,
principalmente, devido às condições ambientais a qual está exposta. Preservar
a qualidade da água é uma necessidade e ao mesmo tempo um problema
universal, que vem exigindo o empenho não somente dos organismos de
governo, mas também da sociedade civil organizada.
5 CONCLUSÃO
O estágio no laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal
do Paraná – UTFPR realizado pela aluna Liana Cristiane de Sousa foi
importante para sua formação profissional, proporcionando a chance de
aplicação de conceitos teóricos e práticos adquiridos antes e durante o período
de estágio. Além disso, foram desenvolvidas a capacidade de comunicação e
relação interpessoal e profissional que serão importantes para o aluno no
mercado de trabalho.
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6 REFERÊNCIAS
[CETESB] Companhia Estadual de Tecnologia e Saneamento Ambiental.
Controle da qualidade da água para consumo humano: bases conceituais e
operacionais. São Paulo; 1997. p. 152-4.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Resolução 275 de setembro de 2005. Regulamento Técnico de Características
Microbiológicas para Água Mineral Natural e Água Natural. Diário Oficial da
União, 2005.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos
Estratégicos. Departamento de Ciência e Tecnologia. Classificação de risco
dos agentes biológicos / Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência,
Tecnologia e Insumos Estratégicos, Departamento de Ciência e Tecnologia. –
Brasília : Editora do Ministério da Saúde, 2006.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Portaria MS
nº 518/2004. Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2004. Vigilância e
controle da qualidade da água para consumo humano. Brasília: Ministério da
Saúde, 2005.
PELCZAR, Jr., M. J. ; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2ª edição; São Paulo-SP: Makron Books, 1997. v.2.
PERAZOLLO, L.M. Coloração de Gram: Princípios e Características.
Disponível em: <http://www.liaaq.ufsc.br/aulas/Gram%20complemento.PDF>.
Último acesso: 23 de outubro de 2013.
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 8a. ed. Porto
Alegre, Brasil: ARTMED, 2004.
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