universidade federal do rio de janeiro - Sicbolsas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
_________________________________________________________________
Departamento de Bioquímica
Laboratório de Biotecnologia Microbiana (IQ/UFRJ)
Projeto Final de Curso
PRODUÇÃO DE LIPASES DE ASPERGILLUS PARASITICUS
POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO
Laila de Castro Cortás
Orientadoras: Profa. Denise M. G. Freire (IQ/UFRJ)
DSc Melissa L. E. Gutarra (IQ/UFRJ)
Produção de lipases de Aspergillus parasiticus por
Fermentação no Estado Sólido
Laila de Castro Cortás
Projeto Final de Curso submetido ao Departamento de Bioquímica do Instituto de Química
da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários para
obtenção do grau de Química com Atribuições Tecnológicas.
Apresentado por:
_____________________________________________
Laila de Castro Cortás
Aprovado por:
_____________________________________________
Profa. Denise Maria Guimarães Freire (Orientadora)
_____________________________________________
Melissa Limoeiro Estrada Gutarra, D.Sc. (Orientadora)
_____________________________________________
Prof. Reginaldo Ramos de Menezes
_____________________________________________
Prof. Rodrigo Volcan Almeida
Rio de Janeiro,
Março 2008
II
Esse Trabalho de Conclusão de Curso foi
realizado com o apoio financeiro da ANP Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural
e Biocombustíveis.
III
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, aos meus pais, Pedro Paulo e Inês que tanto contribuíram com a minha
formação e me ajudaram a suportar todos os desafios e momentos difíceis até a conclusão
deste trabalho.
Ao meu irmão, Samir, que sempre me anima, me dá forças e me faz rir nas horas mais
difíceis.
Ao Bruno, pelo carinho, amor, paciência, por me ajudar e me compreender nos momentos
difíceis.
À minha orientadora, Denise Freire, pelo grande aprendizado, confiança e estímulo no
desenvolvimento deste trabalho.
À Valéria, por toda a ajuda, força, pelo desenvolvimento deste trabalho comigo, pela
disponibilidade em me ajudar sempre. Se não fosse por sua ajuda, eu não conseguiria.
À Melissa, por toda a atenção, todo o conhecimento que me transmitiu sendo sempre
solícita.
Ao professor Reginaldo Menezes, por sua essencial ajuda neste trabalho.
Aos amigos do LaBiM, por todo o carinho e por tornarem o meu ambiente de trabalho
muito agradável.
Aos meus amigos, Luiza, Carol e Gabriel por toda a paciência, amizade e força que muito
me ajudaram.
IV
ÍNDICE
ABSTRACT ...................................................................................................... X
1. Introdução .................................................................................................... 1
2. Revisão Bibliográfica .................................................................................. 3
2.1. Lipases .................................................................................................................... 3
2.1.1.
Definição ........................................................................................................ 3
2.1.2.
Estrutura e mecanismo catalítico das lipases .................................................. 5
2.1.3.
Fontes de Lipases ........................................................................................... 8
2.1.4.
Caracterização de lipases ................................................................................ 9
2.1.5.
Aplicações das Lipases ................................................................................. 10
2.1.5.1 Produção de biodiesel utilizando lipases .................................................. 11
Desvantagens ............................................................................................................ 12
Químico .................................................................................................................... 12
2.2. Fermentação no Estado Sólido ............................................................................. 14
2.2.1.
Aplicações da fermentação no estado sólido ................................................ 15
2.2.2.
Características da fermentação no estado sólido .......................................... 15
2.2.3.
Microorganismos empregados em processos de FES................................... 16
2.2.4.
Produção de lipases por fermentação em estado sólido ............................... 17
3. Objetivos.................................................................................................... 19
3.1.
3.2.
Objetivo geral ....................................................................................................... 19
Objetivos Específicos ........................................................................................... 19
4. Materiais e Métodos .................................................................................. 20
4.1. Materiais ............................................................................................................... 20
4.1.1.
Reagentes e produtos químicos .................................................................... 20
4.1.2.
Equipamentos ............................................................................................... 21
4.2. Métodos ................................................................................................................ 22
4.2.1.
Microorganismos .......................................................................................... 22
4.2.2.
Propagação de esporos para obtenção da suspensão de esporos .................. 22
4.2.3.
Preparo da torta da babaçu............................................................................ 22
4.2.4.
Fermentação no estado sólido ...................................................................... 23
4.2.5.
Monitoramento da fermentação no estado sólido ......................................... 24
4.2.5.1 Medida de pH ........................................................................................... 24
4.2.5.2 Medida do teor de umidade e atividade de água ...................................... 24
4.2.5.3 Imobilização em Accurel® MP 1000 ....................................................... 25
4.2.5.4 Quantificação da atividade lipásica .......................................................... 26
4.2.5.5 Caracterização dos parâmetros cinéticos .................................................. 30
4.2.5.6 Determinação da atividade proteásica ...................................................... 30
4.2.5.7 Efeito do pH e da Temperatura na atividade lipásica ............................... 31
4.2.5.8 Atividade de esterificação da lipase ......................................................... 32
5. Resultados e discussão .............................................................................. 33
5.1. Produção da lipase de Aspergillus parasiticus ..................................................... 33
5.1.1.
Estudos da produção de lipase e protease pela técnica de planejamento
experimental ................................................................................................................. 35
5.1.2.
Acompanhamento dos parâmetros da fermentação ...................................... 45
V
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
Propriedades das lipases no extrato bruto ............................................................ 47
Determinação dos parâmetros cinéticos da preparação enzimática bruta ............ 48
Efeito da liofilização na atividade enzimática do extrato bruto ........................... 49
Efeito da temperatura e do pH na atividade lipásica ............................................ 50
Atividade e eficiência de imobilização ................................................................. 52
Estudo da atividade de esterificação da lipase...................................................... 53
6. Conclusões................................................................................................. 54
7. Trabalhos futuros ....................................................................................... 56
8. Referências ................................................................................................ 57
VI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1: Diferentes reações catalisadas pelas lipases......................................................... 5
Figura 2.2:A estrutura tridimensional das lipases de Rhizomucor miehei, de Pseudomonas
sp., de Candida rugosa, da lipase pancreática humana e da lipase gástrica, mostrando
o sítio ativo (em vermelho) e a conformação aberta (em amarelo) e fechada (em azul)
da tampa (Aloulou et al., 2006) ...................................................................................... 6
Figura 2.3: Mecanismo catalítico da lipase (Jaeger et al., 1999). .......................................... 7
Figura 2.4: Reação de alcóolise ............................................................................................ 12
Figura 4.1: Béqueres utilizados para a FES. ......................................................................... 24
Figura 5.1: Perfil produção de lipase (ASE – U/g) pelo fungo A. parasiticus em FES
utilizando torta de babaçu sem suplementação como meio de cultivo com 70% de
umidade e pH inicial igual 7,0. ..................................................................................... 34
Figura 5.2: Diagrama de Pareto ............................................................................................ 37
Figura 5.3: Superfície de resposta para atividade lipásica em função das variáveis, umidade
e da temperatura............................................................................................................ 39
Figura 5.4: Superfície de resposta para atividade lipásica em função das variáveis,
concentração de inóculo e da temperatura. ................................................................... 40
Figura 5.5:Diagrama de Pareto ............................................................................................. 42
Figura 5.6: Superfície de resposta para atividade proteásica em função das variáveis,
umidade e da temperatura. ............................................................................................ 44
Figura 5.7: Perfil de produção de lipase e protease por FES do fungo A. parasiticus em
torta de babaçu sem suplementação, e acompanhamento dos parâmetros da
fermentação em função do tempo. ................................................................................ 45
Figura 5.8: Variação das constantes cinéticas Km e Vm em função do tamanho de cadeia do
éster utilizado:1- butirato (C4); 2- Caprilato (C8); 2 – laurato (C12); 4 – palmitato
(C16); 5- esterato (C18). ............................................................................................... 48
Figura 5.9:Gráfico de resposta para atividade lipásica em função das variáveis, pH e da
temperatura. .................................................................................................................. 51
VII
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 2.1: Principais vantagens e desvantagens dos processos químico e enzimático para a
produção de biodiesel. .................................................................................................. 12
Tabela 4.1:Componentes dos meios de cultura .................................................................... 20
Tabela 4.2:Lista de reagentes utilizados de grau analítico ................................................... 21
Tabela 4.3: Lista de equipamentos utilizados ....................................................................... 21
Tabela 5.1: Atividades lipásicas em função da suplementação do meio basal( 48 horas de
fermentação) ................................................................................................................. 33
Tabela 5.2: Valores reais e codificados das variáveis testadas ............................................ 35
Tabela 5.3: Valores experimentais e preditos de atividade lipásica para as diferentes
condições experimentais do delineamento composto central rotacional ...................... 36
Tabela 5.4: Análise de variância (ANOVA) do DCCR........................................................ 38
Tabela 5.5: Valores experimentais e preditos de atividade proteásica para as diferentes
condições experimentais do delineamento composto central rotacional. ..................... 41
Tabela 5.6: Análise de variância (ANOVA) do DCCR........................................................ 43
Tabela 5.7: Atividade lipásica dos extratos brutos oriundos da fermentação em torta de
babaçu sem suplementação (água) e suplementada com melaço (3,3%) em substratos
com diferentes tamanhos de cadeia. ............................................................................. 47
Tabela 5.8: Valor das constantes cinéticas Km e Vm em função do tamanho de cadeia do
éster utilizado: 1- butirato (C4); 2- Caprilato (C8); 2 – laurato (C12); 4 – palmitato
(C16); 5- esterato (C18). ............................................................................................... 49
Tabela 5.9: Variáveis testadas (temperatura e pH), condições utilizadas nos ensaios e
atividades lipásicas (AST) obtidas. ................................................................................ 50
Tabela 5.10: Efeito das variáveis pH e temperatura sobre a atividade lipásica. .................. 50
Tabela 5.11: Eficiência e rendimento de imobilização da enzima do fungo Aspergillus
parasiticus. ................................................................................................................... 52
VIII
RESUMO
PROJETO DE CURSO
TÍTULO: PRODUÇÃO DE LIPASES DE ASPERGILLUS PARASITICCUS POR
FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO
ALUNO: Laila de Castro Cortás
ORIENTADORES: Denise Maria Guimarães Freire,DQB-Instituto de Química-UFRJ
Melissa Limoeiro Estrada Gutarra, DQB -Instituto de Química UFRJ
A fermentação no estado sólido (FES) é uma interessante alternativa para a produção de
enzimas a baixo custo, visto que materiais de origem vegetal, como resíduos agroindustriais
podem ser utilizados como meio de cultivo. O objetivo deste trabalho é investigar a
produção por FES da lipase do fungo Aspergillus parasiticus proveniente da coleção de
culturas do Laboratório de Biotecnologia Microbiana (LaBiM). Foi utilizado como meio
sólido basal a torta de babaçu sem suplementação, e suplementada com melaço de cana, ou
óleo de oliva. O estudo das condições de cultivo para produção de lipase do fungo A.
parasiticus por FES foi realizado empregando-se técnicas de planejamento experimental.
Utilizando um delineamento composto central rotacional (DCCR) foi avaliada a influência
das variáveis concentração de inóculo, temperatura e teor de umidade inicial na produção
de enzima. Foi ajustado um modelo empírico aos dados experimentais, no qual as duas
últimas variáveis mostraram-se as mais significativas na produção de lipase. Observou-se
que a maior produção de lipase (25 U/g) foi alcançada, à temperatura de 28º C e umidade
de 65% (m/m). Quanto ao estudo das propriedades catalíticas da lipase de A. parasiticus
presente no extrato bruto investigou-se a especificidade da lipase utilizando ésteres do pnitro fenol com diferentes tamanhos de cadeia. Os valores de Vm diminuíram com o
aumento da cadeia do éster, enquanto o Km sofreu um aumento considerável quando o
substrato passa de 4 para 18 átomos de carbono. Estes resultados indicam que esta
preparação enzimática bruta apresenta maior afinidade por substratos de cadeia curta.
Investigou-se também o efeito do pH e temperatura sobre atividade desta enzima. O extrato
bruto apresentou maior atividade lipásica a 35oC e em pH de 6,5. A imobilização desta
enzima em polipropileno microporoso (Accurel) revelou um biocatalisador imobilizado
com elevadas atividades de síntese do éster oleato de etila (300 U/g).
IX
ABSTRACT
The solid-state fermentation (SSF) appears as an interesting low-cost alternative for
the production of enzymes. Additionally, low-cost, abundant materials of vegetal origin,
such as agroindustrial wastes (soy cake, wheat bran, sugar cane bagasse, etc.) can be
employed as raw materials. The present investigation reports the production, and
characterization of lipase of an Aspergillus parasiticus strain. Initially, the kinetic study
experiments were carried out using babassu cake as basal solid medium moisturized with
water (70%,w/v) without supplementation or with 3.3%(w/w) sugar cane molasses showing
higher activities on babassu cake without supplementation in 72h of fermentation at 30°C.
The influence of inoculum concentration, temperature and moisture on enzyme production
was evaluated employing statistical experimental design, and an empirical model was
adjusted to the experimental data. The last two variables were found to be the most
significant in the process. It was shown that higher lipase activities could be achieved at
lower temperatures and moisture. The maximum lipase activity (25 U/g) was obtained at
the temperature of 28°C and moisture of 65% (w/v). The substrate specificity of the crude
lipase was determined using several p-nitrophenyl as substrate. Higher Vmax and lower Km
were obtained with p-nitrophenyl butyrate indicating that this enzyme presents high affinity
for short-chain esters. The immobilized lipase in hydrophobic support (acurel) also
catalyzes the synthesis of ethyl oleate. Thus the lipase production by SSF using an
abundant and low cost agroindustrial residue as culture medium, showed high
biotechnological potential.
X
1. Introdução
Lipases são enzimas hidrolíticas que atuam na interface aquosa-orgânica, catalisando
a clivagem da ligação éster em triglicerídeos, produzindo glicerol e ácidos graxos livres. No
entanto, em ambientes aquo-restritos, as lipase são capazes de catalisar reações de
esterificação e transesterificação (Sharma et al., 2001; Pandey et al., 2003).
Desde meados dos anos 1980, existe um interesse crescente por lipases, especialmente as
de origem microbiana, devido às diferentes reações que são capazes de catalisar, sua
estabilidade em presença de solventes orgânicos, às suas características de regio e enantio
seletividade. As lipases vêm sendo empregadas de forma crescente na indústria de
detergentes, alimentícia, química fina, farmacêutica, indústria de celulose e papel e no
tratamento de efluentes (Freire e Castilho, 2000). No entanto, o aumento da aplicação
industrial destas enzimas ainda depende do desenvolvimento de processos de produção de
baixo custo. Neste contexto, a fermentação em estado sólido (FES) apresenta-se como uma
tecnologia extremamente apropriada, uma vez que a produção de enzimas pode ser feita por
uma técnica simples e de baixo custo, passível de ser implementada em locais adjacentes
aos de geração dos resíduos agroindustriais utilizados como matérias-primas (Freire e
Castilho, 2000). Além disso, a FES, que é caracterizada pelo crescimento microbiano em
meios sólidos, tem provado ser uma forma eficiente de produção de enzimas, especialmente
por fungos filamentosos, uma vez que esses meios fornecem aos microorganismos
condições ambientais semelhantes aos seus habitats naturais (Pandey et al., 1999; Durand,
2003).
1
Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção de lipases
pelo fungo Aspergillus parasiticus oriundo da coleção de culturas do LaBiM por
fermentação no estado sólido a partir de um rejeito agroindustrial.
2
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Lipases
2.1.1.
Definição
As lipases (glicerol ester hidrolases, E.C. 3.1.1.3) compreendem um grupo de
enzimas hidrolíticas que atuam geralmente na interface orgânico-aquosa, catalisando a
hidrólise e a síntese de ésteres formados por glicerol e ácidos graxos de cadeia longa
(Sharma et al., 2001).
A função biológica destas enzimas é primordialmente catalisar a hidrólise de
triglicerídeos insolúveis para gerar ácidos graxos livres, mono e diacilgliceróis e glicerol.
Entretanto, em condições em que a disponibilidade de água no meio é reduzida, a maioria
das lipases pode exercer sua atividade catalítica reversa, catalisando também reações de
esterificação e transesterificação, entre outras (Figura 2.1) Assim, devido às diferentes
reações que são capazes de catalisar e às suas características de regio e enântio seletividade,
as lipases, além de sua utilização em áreas tradicionais, como a indústria de detergentes e
alimentícia, vêm sendo intensamente empregadas nos mais diversos campos: indústria
farmacêutica, de química fina, óleoquímica, de couros, de polpa e papel e no tratamento de
resíduos industriais (Freire e Castilho, 2000).
A maioria das lipases é caracterizada por atuar em interfaces orgânico-aquosas,
onde os mecanismos catalíticos dependem da organização dos lipídeos na interface
(Aloulou et al., 2006; Cajal et al., 2000). Esse fenômeno interfacial é uma das
características que as distinguem das esterases. As lipases possuem maior atividade em
substratos insolúveis, tipicamente triglicerídeos compostos de ácidos graxos de cadeia
longa com mais de 10 átomos de carbono, enquanto as esterases atuam em substratos
3
solúveis, principalmente ésteres simples, tais como o acetato de etila e triglicerídeos
compostos de ácidos graxos de cadeia curta com menos de 6 carbonos. As esterases
obedecem à cinética de Michaelis-Menten, enquanto as lipases necessitam de uma mínima
concentração de substrato para que atividades elevadas sejam obtidas, mas também
obedecem essa cinética (Bornscheuer, 2002).
As lipases são encontradas na natureza em animais, vegetais e microrganismos.
Recentemente, tem crescido muito o interesse pelas lipases microbianas, devido
principalmente à sua maior estabilidade e diversidade quando comparadas a lipases de
outras fontes. Assim, a descoberta de novas lipases, a partir da seleção de microrganismos,
com características desejáveis e interessantes (estabilidade a altas temperaturas e amplas
faixas de pH, alta especificidade em relação a certos ácidos graxos e enâncio seletividade),
pode abrir promissoras perspectivas científicas e comerciais (Björkling et al., 1991).
4
Figura 2.1: Diferentes reações catalisadas pelas lipases
2.1.2.
Estrutura e mecanismo catalítico das lipases
As lipases possuem baixa homologia na seqüência de aminoácidos, porém possuem
alta similaridade em sua estrutura tridimensional, possuindo uma estrutura de dobramento
do tipo α/β hidrolase. O centro ativo é composto por uma tríade catalítica que possui um
resíduo serina, responsável pela catálise, semelhante ao observado em serino-proteases
(Jaeger e Reetz, 1998; Aloulou et al., 2006). Em muitas lipases, o acesso ao sítio ativo é
controlado por uma estrutura helicoidal chamada de tampa que, sob determinadas
condições, é responsável por recobrir o centro ativo da enzima, deixando-o inacessível ao
substrato. A principal hipótese para explicar a ativação interfacial envolve uma mudança
conformacional da estrutura da tampa quando em contato com uma interface, caracterizada
por um deslocamento da tampa em volta de sua região dobradiça, expondo o sítio ativo e
5
uma grande superfície hidrofóbica provavelmente responsável pela interação com a
interface lipídeo-água (Cajal et al., 2000; van Tilbeurgh et al., 1993).
A estrutura tridimensional das lipases de Rhizomucor miehei, de Thermomyces
lanuginosa, de Candida rugosa, da lipase pancreática humana e da lipase gástrica mostra a
conformação aberta e fechada da tampa e o sítio catalítico escondido abaixo da estrutura da
tampa (Figura 2.2). Além de regular o acesso ao sítio ativo das lipases, estudos mostraram
que a tampa parece modular as propriedades funcionais das lipases, visto que todas as
mudanças na estrutura da tampa afetaram o comportamento da enzima, alterando a
especificidade e estabilidade das enzimas (Secundo et al., 2007).
Figura 2.2:A estrutura tridimensional das lipases de Rhizomucor miehei, de Pseudomonas sp.,
de Candida rugosa, da lipase pancreática humana e da lipase gástrica, mostrando o sítio ativo
(em vermelho) e a conformação aberta (em amarelo) e fechada (em azul) da tampa (Aloulou et
al., 2006)
6
O mecanismo catalítico de reações de hidrólise ou síntese de ésteres é semelhante
para as lipases e proteases, devido à semelhança estrutural entre o sítio ativo destas enzimas
(presença da tríade catalítica Ser-Asp-Glu/His). O mecanismo é composto por quatro etapas
e segue o modelo proposto para a quimotripsina, uma serina protease (Figura 2.3).
Figura 2.3: Mecanismo catalítico da lipase (Jaeger et al., 1999).
Inicialmente, a histidina aumenta a nucleofilicidade do grupo hidroxila da serina do
sítio catalítico. Ocorre, então, um ataque nucleofílico do oxigênio da hidroxila serínica ao
carbono carbonílico da ligação éster da cadeia do substrato, formando um intermediário
tetraédrico, que é estabilizado pelos resíduos catalíticos de His e Asp. Uma molécula de
7
álcool é liberada, formando um complexo acil-enzima. Em um segundo ataque nucleofílico
por um íon hidroxila da água, o ácido graxo é liberado e a enzima é regenerada (Jaeger et
al., 1994).
Evidências deste mecanismo têm sido confirmadas por estudos de ligação de
inibidores a lipases e pela análise estrutural destas proteínas (Jaeger et al., 1999).
2.1.3.
Fontes de Lipases
Aproximadamente cem anos atrás, o microbiologista C. Eijkmann reportou que
diferentes cepas bacterianas poderiam produzir e secretar lipases (Jaeger e Eggert, 2002).
Então, a partir de 1906, iniciaram-se os estudos sobre produção de lipases utilizando-se
diversos microrganismos como bactérias, fungos e leveduras (Hasan et al., 2006).
As lipases diferem grandemente com respeito à origem (bacteriana, fúngica, vegetal,
animal) e propriedades cinéticas. Do ponto de vista econômico e industrial, as lipases
obtidas de microrganismos (bactérias, leveduras e fungos) são as mais utilizadas, devido a
sua relativa facilidade de produção e abundância de microrganismos capazes de sintetizálas. Os fungos são especialmente valorizados porque as enzimas por eles produzidas
normalmente são extracelulares, o que facilita a sua recuperação do meio de fermentação e
também porque a maioria dos fungos não é nociva à saúde humana, sendo reconhecidos
como GRAS (Generally Regornized as Safety), (Jaeger et al., 1994). Fungos de diversos
gêneros demonstraram ser bons produtores de lipases e as suas enzimas têm sido bastante
estudadas. Dentre as bactérias produtoras de lipases comerciais, para aplicação em síntese
estereoseletiva estão o gênero Pseudomonas e Bulkholderia cepacia. Enquanto as lipases de
Burkholderia sp e Arthrobacter sp são utilizadas na determinação em diagnóstico de
triacilgliceróis (www.amano-enzyme.co.jp/).O rápido crescimento celular, em relação aos
8
fungos é uma das vantagens citadas das fontes bacterianas como produtoras destas enzimas
(Jaeger et al., 1999). Apesar de pouco exploradas em escala industrial, várias lipases
produzidas por vegetais foram purificadas e estudadas quanto às suas características
bioquímicas e quanto a potenciais aplicações na biotransformação de lipídeos. Dentre as
enzimas vegetais estudadas estão as triacilglicerol lipases, as acil-hidrolases não específicas
como as fosfolipases A1, A2 e B, as glicolipases, as sulfolipases e monoacilglicerol lipases,
além das fosfolipases C e D (Mukherjee, 2003).
As lipases humanas incluem, as gástricas e pancreáticas, que ajudam na digestão e
assimilação de lipídeos da dieta - e as lipases hepáticas (lipoproteína lipase e a lipase
endotelial) que atuam no metabolismo de lipoproteínas. Estas enzimas têm sido largamente
estudadas devido às implicações que sua estimulação ou inibição têm sobre a saúde
humana, notadamente sobre problemas associados com a obesidade (Miled et al., 2000).
2.1.4.
Caracterização de lipases
Muitos trabalhos de produção e caracterização de lipases têm sido reportados na
literatura. Lipases obtidas de Pseudomonas (Jinwal et al., 2003), Candida rugosa (Pernas et
al,.2000), Aspergillus (Saxena et al., 2003), Rhizopus (Hiol et al,. 1999), Mucor (Abbas et
al, 2002), Streptomyces (Abramic et al,. 1999) e Penicillium (Freire et al., 1996; Sztajer et
al,. 1992) foram estudadas e apresentaram diferentes propriedades moleculares e catalíticas.
Lipases de várias origens têm sido aplicadas em vários segmentos, como na
indústria farmacêutica e na clínica. Nesse sentido, a caracterização dessas enzimas é
essencial para o estabelecimento das condições de trabalho e aplicações como para a
determinação da temperatura e pH ótimos e de estabilidade.
9
A termoestabilidade também é um requerimento importante para o emprego de
enzimas na indústria. Muitos processos industriais são conduzidos a temperaturas elevadas,
visto que o aumento da temperatura pode apresentar algumas vantagens, tais como
diminuição do risco de contaminação, aumento da solubilidade do substrato e aumento da
velocidade de reação (Sharma et al., 2001).
2.1.5.
Aplicações das Lipases
A indústria de enzimas como existe hoje é o resultado do rápido desenvolvimento
das últimas quatro décadas, graças à evolução das técnicas biotecnológicas. O
desenvolvimento dos processos de fermentação durante a última parte do século XX
propiciou a produção de enzimas através do uso de cepas selecionadas e tornou possível a
obtenção de enzimas purificadas e bem caracterizadas, mesmo em escala industrial.
Recentemente, o interesse em pesquisas com lipases, principalmente de origem
microbiana, têm crescido devido ao seu grande potencial biotecnológico. Como
biocatalisadores, as lipases apresentam algumas vantagens importantes sobre os
catalisadores clássicos industriais. Efetivamente, suas características de especificidade,
regiosseletividade e enantiosseletividade, permitem a síntese de compostos de alta pureza,
com um número reduzido de subprodutos e baixa geração de resíduos. Além disso, os
processos enzimáticos requerem procedimentos mais fáceis e baratos, que utilizam
temperatura e pressão ambientes, condições que minimizam a degradação de compostos
lábeis e evitam o uso de compostos químicos com alto potencial poluente (Villeneuve et al.,
2000). As lipases têm sido freqüentemente utilizadas na resolução de misturas racêmicas,
na formulação de detergentes e síntese de biosurfactantes; no tratamento de efluentes, na
10
indústria oleoquímica (bioconversão de óleos e gorduras) para a produção de biodiesel; na
indústria agroquímica; na manufatura do couro e papel; na nutrição; na produção de
aromas; na formulação de perfumes, fragrâncias e cosméticos; na fabricação de plásticos e
fibras sintéticas; na síntese de sedativos e outros fármacos; dentre outras (Cammarota e
Freire, 2006; Hassan et al., 2006; Jaeger e Eggert, 2002).
2.1.5.1 Produção de biodiesel utilizando lipases
O biodiesel é um produto que pode ser obtido pela reação de alcóolise ácida ou
alcalina de um triglicerídeo com um álcool, usualmente metanol ou etanol (Figura 2.4)
(Shieh et al., 2003). Embora esses processos sejam muito vantajosos em termos de tempo
de reação, eles apresentam algumas desvantagens, como a dificuldade de remoção do
glicerol e o grande gasto de energia. Dessa forma, é de grande interesse a utilização de
biocatalisadores que propiciem a síntese de alquil ésteres específicos, possibilitem a fácil
remoção do glicerol e forneçam altos rendimentos. A utilização de enzimas,
especificamente de lipases, como catalisadores para esse tipo de reação pode vir de
encontro a todas as expectativas citadas anteriormente, desde que o custo de obtenção
desses biocatalisadores não se apresente como um fator proibitivo.
A Tabela 2.1 apresenta uma comparação entre os processos químicos e o processo
enzimático de produção do biodiesel.
11
Figura 2.4: Reação de alcóolise
Processo
Vantagens
Desvantagens
- Alto rendimento;
- Dificuldade de separação do
- Curto tempo de reação.
catalisador;
- Impossibilidade de reutilização
Químico
do catalisador;
- Produção de rejeitos aquosos
alcalinos
-
Facilidade
de
separação
do - Longo tempo de reação;
Biocatalisador (enzima imobilizada); - Menor rendimento;
Enzimático
- Fácil recuperação do glicerol;
- Elevado custo das enzimas;
- Conversão dos ácidos livres
-Dificuldades de reutilização das
presentes
no
óleo
vegetal
em enzimas
biodiesel
Tabela 2.1: Principais vantagens e desvantagens dos processos químico e enzimático para a
produção de biodiesel.
Já podem ser encontrados na literatura alguns trabalhos nos quais se utilizam
enzimas como catalisadores do processo de transesterificação; entretanto, em todos os
12
trabalhos pesquisados, o custo da enzima ainda se apresenta como uma desvantagem
potencial ao uso deste tipo de catalisador.
Wu et al. (1999) sintetizaram biodiesel a partir de um óleo de fritura descartado por
um restaurante e 95% de etanol, utilizando como catalisador uma lipase comercial de
Pseudomonas cepacia. A obtenção do biodiesel foi fortemente influenciada pelo tempo e
temperatura de reação chegando a atingir bons níveis de conversão à temperaturas
relativamente altas.
Iso et al. (2001) estudaram a utilização de diferentes lipases comerciais (lipases de
P. fluorescens, P. cepacia, M. javanicus, C. rugosa e R. niveus) para a síntese de biodiesel.
Inicialmente, os autores observaram que a reação catalisada pela lipase de P. fluorescens
apresentou maior índice de conversão a produto. Foi testado também o efeito da
imobilização na conversão dos metil ésteres. Neste caso os autores observaram que os
índices de conversão eram maiores quando se utilizava enzima imobilizada. Além disso, os
autores observaram que ao utilizar metanol e etanol como substrato há necessidade de se
empregar um solvente orgânico, pois estes álcoois não solubilizaram eficientemente o
triglicerídeo testado.
Shimada et al. (2002) estudaram a catálise enzimática para a produção de biodiesel,
utilizando uma lipase imobilizada de Candida antartica. Os autores investigaram a
realização da alcoólise em duas ou três etapas (com o aumento gradativo da quantidade de
álcool no meio) e observaram que este procedimento é bastante vantajoso em termos de
conversão.
Salis et al. (2005) investigaram a utilização de diferentes lipases comerciais
(Candida antartica B, Rhizomucor miehei e Pseudomonas cepacia) para a produção de
biodiesel. Foram avaliados alguns parâmetros que influenciavam, tanto na conversão
13
quanto na atividade catalítica da enzima, entre eles: temperatura, atividade de água, razão
entre os reagentes e o tipo de álcool. A reação de alcoólise apresentou melhores resultados
quando foi realizada à temperatura de 40ºC, a atividade de água se situou na faixa de 0,4 a
0,6 e a razão entre os reagentes foi de 3:1, sendo o 1-butanol o melhor álcool testado.
Desta forma, apesar da rota química de produção de biodiesel a partir de óleos
vegetais encontrar-se bem estabelecida, industrialmente, a rota enzimática se apresenta
como uma excelente alternativa, tanto para redução dos custos de processo quanto para
redução dos impactos ambientais. No entanto, para a sua viabilidade industrial, necessita-se
que ocorra uma diminuição substancial dos custos de produção e um aumento de sua
atividade e estabilidade. Esta necessidade urgente poderia vir a ser alcançada através de
processos que utilizem substratos de baixo custo como a fermentação em meio sólido que
utiliza rejeitos agroindustriais, além de processos de imobilização das enzimas que
aumentem consideravelmente a estabilidade e atividade destes biocatalisadores.
2.2. Fermentação no Estado Sólido
A fermentação no estado sólido (FES) é uma prática empregada no Oriente há
muitos séculos para a obtenção de alimentos fermentados. Hoje em dia, a FES vem sendo
empregada para a produção de enzimas, aromas, biossurfactantes, biopesticidas, ácidos
orgânicos, alimentos fermentados e também para a biorremediação e biodegradação de
compostos e detoxificação biológica de resíduos agro-industriais (Pandey et al., 2000).
Uma das principais vantagens da FES é a utilização de meios de cultura, compostos de
materiais de origem vegetal, como farelos e cascas de arroz, trigo, milho e outros cereais,
necessitando de poucos nutrientes adicionais ao meio. Isso possibilita a utilização de
14
resíduos agroindustriais como substrato, representando, em países como o Brasil, matéria
prima abundante e de baixo custo.
2.2.1.
Aplicações da fermentação no estado sólido
A FES tem mostrado um enorme potencial tecnológico no que diz respeito ao
desenvolvimento de produtos que apresentam componentes derivados de microorganismos
como rações para animais, produtos para a indústria alimentícia, química e farmacêutica.
Estas aplicações envolvem a biotransformação de produtos e resíduos agrícolas para
enriquecimento nutricional, produção de biomassa, e formação produtos com alto valor
agregado, como metabólitos secundários biologicamente ativos, incluindo antibióticos,
alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos, biopesticidas, micro-pesticidas e bioerbicidas,
biossufactantes, biocombustíveis, compostos aromáticos, etc. Muitos estudos sobre
aplicações da FES envolvem a agregação de valor a resíduos agroindustriais, uma vez que a
base da economia brasileira atual está voltada diretamente à produção agroindustrial. A
produção ou processamento de diversos grãos e insumos agrícolas envolve a geração de
resíduos que têm sido utilizados como substrato ou suporte para FES (Pandey, 2003).
2.2.2.
Características da fermentação no estado sólido
No processo de fermentação em estado sólido deve-se levar em consideração alguns
aspectos importantes, tais como a seleção dos microorganismos, a escolha do substrato, a
otimização dos parâmetros do processo, o isolamento e a purificação do produto, dentre
outros fatores (Pandey, 2003).
Uma das características principais da FES é a baixa atividade de água (a w) do meio,
onde a quantidade de água é apenas suficiente para permitir o crescimento do
15
microrganismo, estando próxima à capacidade máxima de absorção do material sólido
(Rahardjo et al., 2006; Mitchell et al., 2002). Além disso, os meios de cultivo empregados
em FES são insolúveis em água. Assim, devido à baixa condutividade dos meios de cultivo
sólidos utilizados em FES e à reduzida quantidade de água, gradientes de temperatura,
umidade, substrato e produto são freqüentemente formados em FES. Desta forma, a
geração de gradientes, principalmente de temperatura, é um dos maiores problemas da FES.
Mas a transferência de oxigênio não é um fator limitante, pois, além de possuir uma fase
líquida ao redor do substrato sólido, que permite a transferência de oxigênio, essa
transferência pode ocorrer diretamente da fase gasosa, como no caso de fungos
filamentosos (Schutyser et al., 2003).
A FES, tipicamente, emprega meios de cultivo naturais que atuam como fonte de
carbono e nitrogênio (Pandey et al., 2000), podendo, desta forma, empregar diversos
rejeitos agroindustriais como meio de cultivo. No entanto, a FES também pode empregar
meios sólidos inertes embebidos de uma solução de nutrientes, sendo esta estratégia
frequentemente utilizada em estudos de modelagem, visto que estas partículas não sofrem
mudança na sua estrutura e composição, como ocorre com meios sólidos que são
metabolizados ao longo do processo (Pandey, 2003).
2.2.3.
Microorganismos empregados em processos de FES
Na produção de enzimas por FES, a quantidade reduzida de água no substrato limita
o número de microrganismos, sendo que os mais utilizados são os fungos, devido a sua
capacidade de tolerar ambientes com baixa quantidade de água.
Os fungos filamentosos possuem uma grande facilidade de se adaptar à FES, devido
principalmente ao seu crescimento em forma de hifas e às suas características fisiológicas.
16
Essa maior adaptação pode estar relacionada à similaridade da FES com o habitat natural
dos fungos (Holker et al., 2004). A penetração de hifas no interior das partículas permite
uma maior acessibilidade aos nutrientes do que no caso dos microorganismos não
filamentosos, reduzindo a distância em que os processos de difusão devem ocorrer. Isso é
de grande importância, principalmente nos estágios finais da fermentação, quando os
nutrientes da superfície encontram-se exaurido. Adicionalmente, os fungos possuem a
capacidade de crescer em meios com baixa atividade de água (Aw) e baixo pH, e produzem
enzimas extracelulares hidrolíticas para degradar as macromoléculas presentes no substrato
sólido, favorecendo assim o seu uso em FES.
2.2.4.
Produção de lipases por fermentação em estado sólido
Enzimas de interesse industrial, como as lipases, são produzidas tradicionalmente
por fermentação submersa. No entanto, a FES pode ser uma alternativa muito interessante
quando se utilizam rejeitos de baixo custo como meio de fermentação (Gutarra et al.,
2003).
Em FES, lipases de diferentes microorganismos foram produzidas em diferentes
rejeitos sólidos, como: a lipase de Penicillium restrictum em torta de babaçu (Azeredo et
al., 2007; Palma et al., 2000), de Penicillium simplicissimum , em torta de babaçu, torta de
soja e rejeito de mamona (Gutarra et al., 2005; Cavalcanti et al., 2005; DiLucio et
al.,2004), entre outras. A produção destas lipases por FES foi produzida em escala de
bancada em sua maioria utilizando biorreatores do tipo bandeja.
A produção de lipase por FES, em alguns casos, mostra-se altamente dependente da
relação de carbono/nitrogênio e do tipo de fonte de carbono do meio, por isso estudos
utilizando diferentes fontes suplementares de carbono e nitrogênio, com o objetivo de
17
enriquecer o meio e induzir a síntese da lipase vêm sendo desenvolvidos (Azeredo et al.,
2007).
Recentemente vários trabalhos buscam elucidar os efeitos causados pela adição de
nutrientes, e a presença de indutores durante o processo de produção da lipase, em estado
sólido ou submerso (Freire et al., 1997b; Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000; Azeredo
et al., 2007). Em alguns casos, o uso de suplementações tem possibilitado aumentos
razoáveis na capacidade produtiva dos microorganismos. Contudo, alguns trabalhos que
utilizam a FES para a produção de lipase mostram que dependendo da composição do
substrato utilizado na fermentação a adição de fontes suplementares de carbono e
nitrogênio é desnecessária (Kamini et al., 1998). O uso de triglicerídeos como fonte de
carbono é adequado para crescimento celular e produção de enzima, embora a indução da
biossíntese da lipase em presença de ácidos graxos livres ou triglicerídeos ainda seja
controversa (Freire et al., 1997b; Azeredo et al., 2007).
Outros fatores que afetam a produção de lipase extracelular por fermentação em
estado sólido são o pH do meio durante o processo de produção, a temperatura de condução
da fermentação, a aeração do meio (Dominguez et al., 2003).
Estudos mostram que as lipases microbianas produzidas por FES se mantêm
estáveis na faixa de pH entre 5,0 a 8,0 e apresentam maior atividade na faixa de
temperatura de 30 a 40°C, no entanto, algumas lipases têm mostrado níveis de estabilidade
consideráveis mesmo em temperaturas extremas, como 5° e 60° C (Freire et al., 1997a;
Kamini et al., 1998; Benjamin e Pandey, 2001; Pastore et al., 2003). Porém, algumas
lipases produzidas através de fermentação em estado sólido são enzimas sensíveis quanto à
presença de proteases e aumentos no pH do meio, tendo sua atividade comprometida por
estes fatores (Gombert et al., 1999; Benjamin e Pandey, 2001).
18
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
O presente trabalho propõe produzir e caracterizar a preparação enzimática bruta
obtida por fermentação no estado sólido do fungo Aspergillus parasiticus.
3.2. Objetivos Específicos
- Investigar o efeito da suplementação de nutrientes no meio de cultivo basal
constituído de torta de babaçu.
- Avaliar, utilizando a ferramenta de planejamento experimental, o efeito da
temperatura, concentração de inoculo e teor de umidade inicial na produção de
lipase e protease pelo fungo Aspergillus parasiticus.
- Determinar os parâmetros cinéticos (Vm e Km) da preparação enzimática bruta
frente a substratos com diferentes tamanhos de cadeia.
- Investigar o efeito da temperatura e do pH na atividade da lipase de A. parasiticus
presente no extrato bruto.
- Avaliar a atividade de esterificação da lipase de A. parasiticus imobilizada em
suporte hidrofóbico
19
4. Materiais e Métodos
4.1. Materiais
4.1.1.
Reagentes e produtos químicos
A matéria-prima empregada nos meios de fermentação foi a torta de babaçu
(Orrbignya speciosa), rejeito da produção de óleo de babaçu, gentilmente fornecida pela
empresa TOBASA S.A. O óleo de oliva utilizado foi o produto comercial da marca Gallo e
o melaço de cana utilizado, um rejeito da produção de açúcar cristalizado.
Os nutrientes utilizados na formulação dos meios de cultura e seus respectivos
fornecedores encontram-se listados na Tabela 4.1.
Produtos
Fornecedor
Amido solúvel
Vetec
MgSO4.7H2O
Reagen
(NH4)2SO4
Reagen
KH2SO4
Reagen
CaCO3
Reagen
Extrato de lêvedo
Difco
NaCl
Vetec
Agar
Reagen
Tabela 4.1:Componentes dos meios de cultura
Os principais reagentes utilizados nos ensaios analíticos e seus respectivos
fornecedores encontram-se listados na Tabela 4.2.
20
Produtos
Fornecedor
Acetona
Vetec
Álcool Etílico
Vetec
NaOH
Vetec
KHSO4
Vetec
Goma arábica
Vetec
Na2CO3
Vetec
p-nitrofenil éster
Sigma/ Fluka
Tabela 4.2:Lista de reagentes utilizados de grau analítico
4.1.2.
Equipamentos
Os equipamentos utilizados neste projeto estão listados abaixo na Tabela 4.3.
Equipamento
Câmara de fluxo laminar
Estufa para incubação
Câmara climática
Estufa para secagem
Balança analítica
Placas de agitação
Potenciômetro
Agitador rotatório
Banho com agitação
Banho de recirculação
Espectrofotômetro UV-VIS
Titulador automático
Dispersor de partículas
Higrômetro
Liofilizador
Peneiras
Fabricante
Elzividros
Fabber-Primar
Quimis
Quimis
Mettler
Corning
PH meter Mettler Toledo
New Brunswick
Nova Ética
Corola
Shimadzu
Mettler
IKA
Aqualab Decagon
Heto Dry Winner
GranuTest
Modelo
115-003
216
AE 260
PC 240
320
Bioflo II e III
DUBNOFF
MultiSpec-1501
DL 21 e 50
D 118
-
Tabela 4.3: Lista de equipamentos utilizados
21
4.2. Métodos
A produção de lipase utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo foi
realizada em condições pré-determinadas nos trabalhos de Gutarra 2005 e 2007, para o
fungo Penicillium simplissicimum. Estas condições foram utilizadas como ponto de partida
para as fermentações realizadas com o fungo Aspergillus parasiticus.
4.2.1.
Microorganismos
A cepa de Aspergillus parasiticus utilizada neste trabalho pertence à coleção de
culturas do Laboratório de Biotecnologia Microbiana da UFRJ e encontra-se estocado em
glicerol a -15ºC.
4.2.2.
Propagação de esporos para obtenção da suspensão de
esporos
A propagação dos esporos foi realizada através do crescimento do fungo a 30ºC por
sete dias em meio com a seguinte composição (%m/v): amido solúvel 2,0; MgSO4.7H2O
0,025; KH2PO4 0,05; (NH4)2SO4 0,5; CaCO3 0,5; extrato de lêvedo 0,1; óleo de oliva 1,0;
ágar 1,0. Os esporos foram raspados e suspensos em tampão fosfato (100 mM pH 7,0)
estéril, formando a suspensão de esporos. A concentração de esporos foi determinada
através de contagem ao microscópico óptico em câmara de Neubauer.
4.2.3.
Preparo da torta da babaçu
Utilizou-se como meio basal para a fermentação no estado sólido a torta de babaçu,
triturada e peneirada. Partículas entre 210 e 420µm foram, então, utilizadas para posterior
composição do meio de cultivo. A torta de babaçu sem suplementação ou suplementada
com 3,3 % m/m de melaço ou óleo foi esterilizada a 1 atm por 20 minutos.
22
4.2.4.
Fermentação no estado sólido
A produção de lipase utilizando a torta de babaçu como meio de cultivo foi
realizada em condições pré-determinadas nos trabalhos de Gutarra 2005 e 2007, para o
fungo Penicillium simplicissimum. Estas condições foram utilizadas como ponto de partida
para as fermentações realizadas com o fungo Aspergillus parasiticus.A fermentação em
meio sólido foi realizada em béqueres de polipropileno de 500 mL, tampados com manta
acrílica (Figura 4.1), contendo 10 g de torta em camada de 1 cm de espessura, inoculada
com 1,0 x 107 esporos/g. Os reatores foram incubados em estufa com temperatura
controlada (30ºC) e injeção de ar úmido com 95% de saturação, de forma a manter a
umidade inicial do meio (70% m/m). A torta de babaçu foi analisada sem suplementação
ou suplementada com melaço ou óleo de oliva (3,3 % m/m). Após o tempo de fermentação
determinado, retirou-se, de cada reator, alíquotas de 0,5 g para análises de umidade, pH e
atividade de água. A extração da preparação enzimática bruta do meio fermentado foi
realizada em agitador rotatório a 35oC e velocidade de agitação de 200 rpm por 30 minutos,
adicionando-se 45 mL de tampão fosfato (100mM, pH 7,0) à 10 g de torta inicial.
Posteriormente, a torta foi prensada para a recuperação do extrato enzimático bruto, o qual
foi centrifugado a 3000 rpm por 2 minutos para remoção de sólidos mais finos (Gombert et
al., 1999). O sobrenadante foi estocado a -20oC para posterior dosagem das atividades
enzimáticas e procedimento de imobilização.
23
Figura 4.1: Béqueres utilizados para a FES.
4.2.5.
Monitoramento da fermentação no estado sólido
4.2.5.1 Medida de pH
Para medida do pH, adicionou-se 5 mL de água destilada a 0,5g de torta fermentada,
agitou-se vigorosamente em vortex e verificou-se o pH em potenciômetro (Gombert et al.,
1999).
4.2.5.2 Medida do teor de umidade e atividade de água
Para a determinação do teor de umidade, amostras de aproximadamente 0,5g de
material sólido fermentado foram colocadas em placas de Petri previamente taradas e
pesadas em balança analítica. Após incubação em estufa a 60oC até atingir peso constante, o
que ocorria após aproximadamente 48h, as mesmas foram pesadas e o teor de umidade da
amostra foi calculado de acordo com a Equação 4.1:
Teor de Umidade (%)= (massa úmida - massa seca ) x 100
massa úmida
(Equação 4.1)
24
Para a determinação da atividade de água nos diversos tempos de fermentação,
amostras de aproximadamente 1,0g de material fermentado foram analisadas no
higrômetro.
4.2.5.3 Imobilização em Accurel® MP 1000
As lipases foram imobilizadas em suporte hidrofóbico de polipropileno microporoso
denominado comercialmente de Accurel® MP 1000 segundo metodologia descrita em
Olveira et al, 2006, com algumas modificações.
Inicialmente, foram pesadas 1000 mg do suporte e a este foi adicionado 10 mL de
álcool etílico. O conjunto foi mantido em repouso por 30 min e, em seguida, lavado
sucessivas vezes até que todo álcool etílico fosse eliminado. Após este procedimento, foi
adicionado ao suporte 50 mL de meio fermentado livre de células obtido por FES. O
conjunto foi mantido sob agitação em banho de gelo. Após 120 minutos, filtrou-se, sob
vácuo a enzima imobilizada. E dosou-se o extrato de acordo com o método
espectrofotométrico (4.2.5.4). A retenção de imobilização (R) foi calculada pela Equação
4.2.:
R (%) = UIMO x 100
UTEO
(Equação 4.2)
Onde:
UIMO = atividade da enzima imobilizada;
UTEO = UE - US = atividade teórica da enzima na imobilização;
UE = atividade de entrada da enzima no início do processo de imobilização;
Us = atividade de saída da enzima no final do processo de imobilização.
25
E a eficiência da imobilização (Ef ) foi calculada pela Equação 4.3.:
Ef (%) = UTEO x 100
UE
(Equação 4.3)
Onde:
UTEO = UE - US = atividade teórica da enzima na imobilização
UE = atividade da enzima no início do processo de imobilização
Us = atividade da enzima no final do processo de imobilização
4.2.5.4 Quantificação da atividade lipásica
Método titulométrico
A determinação da atividade lipásica foi realizada utilizando-se como substrato o
óleo de oliva (5% m/v) emulsionado por 3 minutos com goma arábica (5% m/v) em tampão
fosfato de sódio (100 mM, pH 7,0). O extrato enzimático (1 mL) foi adicionado a 19 mL de
emulsão e incubado por 15 minutos a 35oC em banho com agitação a 200 rpm. A reação foi
interrompida pela adição de 20 mL uma solução de acetona-etanol (1:1 v/v), que também
promove a extração dos ácidos graxos liberados. Os ácidos graxos foram titulados com
solução 0,04 N de NaOH em titulador automático até um valor de pH final de 11,0. Os
brancos reacionais foram obtidos adicionando-se o preparado enzimático após a solução
acetona-etanol.
A atividade enzimática no meio de extração líquido (ALT) é definida como a
quantidade de enzima que produz 1 μmol de ácido graxo por minuto, nas condições do
26
ensaio (Freire et al., 1997), de modo que o cálculo da atividade enzimática foi feito pela
Equação 4.4:
ALT = (V-Vb) x M x 1000
t.Va
(Equação 4.4)
Onde:
ALT = atividade lipásica titulométrica no meio de extração líquido (U/mL)
V = volume de solução de NaOH gasto para a titulação da amostra (mL)
Vb = volume de solução de NaOH gasto para a titulação do branco (mL)
M = molaridade da solução de NaOH (mmol/mL)
t = tempo de reação (min)
Va = volume de amostra (mL)
A atividade lipásica no meio fermentado sólido (AST) foi calculada conforme a
Equação 4.5 e expressa em U/g.
AST = ALT x Vext
Mi
(Equação 4.5)
Onde:
AST = atividade lipásica titulométrica no meio fermentado sólido(U/g)
ALT = atividade lipásica titulométirca no meio de extração líquido(U/mL)
V ext = volume de extração enzimática (mL)
Mi = massa seca de torta inicial (g)
27
Método espectrofotométrico
Este método se baseia na formação de um produto cromóforo (p-nitro fenol) a partir
da reação de hidrólise de ésteres graxos do p-nitrofenil catalisada pelas lipases. A solução
do substrato foi preparada utilizando-se 0,25 mL de p-nitrofenil butirato 2,5 mM em 2,2
mL de tampão fosfato de sódio 25 mM pH 7,0. A reação foi disparada pela adição de 0,05
mL do extrato enzimático. O progresso da reação (formação do p-nitrofenol) foi
acompanhado em espectrofotômetro com leituras das absorbâncias a 412 nm. A atividade
(ALE) é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1,0 μmol de pnitrofenil butirato por minuto nas condições descritas anteriormente. A atividade lipásica
espectrofotométrica (ALE) foi expressa em U/ml. O cálculo da atividade enzimática foi feito
pela Equação 4.6:
ALE = (α. F. Vf) .Fd
Va
(Equação 4.6)
Onde:
ALE = atividade lipásica espectrofotométrica no meio de extração líquido
(U/mL)
α = coeficiente angular da reta (Abs / tempo)
F = fator (concentração do produto / absorvância)
Vf = volume final (mL)
Va = volume da amostra (mL)
Fd = fator de diluição
Calculou-se o fator, a partir de curva padrão, utilizando- se diferentes concentrações
do p-nitrofenol:
28
Pontos
1
2
3
4
5
Concentração(mM)
0,0693
0,0578
0,0462
0,0347
0,0231
Absorvânica 412
0,678
0,5586
0,4288
0,348
0,223
Curva padrão
0,8
Absorvânica 412
0,7
y = 9,682x
R2 = 0,9956
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
Concentação (mM)
Fator = 1/coeficiente angular = 1/ 9,682 = 1,0328 mM
A atividade lipásica espectrofotométrica no meio fermentado sólido (ASE) foi
calculada conforme a Equação 4.7 e expressa em U/g.
ASE = ALE x Vext
Mi
(Equação 4.7)
Onde:
ASE = atividade lipásica espectrofotométrica no meio fermentado sólido(U/g)
ALE = atividade lipásica espectrofotométrica no meio de extração
líquido(U/mL)
V ext = volume de extração enzimática (mL)
Mi = massa seca de torta inicial (g)
29
4.2.5.5 Caracterização dos parâmetros cinéticos
A determinação dos parâmetros cinéticos dos extratos enzimáticos, frente a
diferentes substratos, foi realizada utilizando ésteres do p-nitro fenol com diferentes
tamanhos de cadeia: p-nitrofenil-butirato (C4:0); p-nitrofenilcaprilato (C8:0); p-nitrofenillaurato (C12:0); p-nitrofenil-palmitato, (C16:0) e p-nitrofenil-estearato (C18:0).
Utilizou-se diferentes concentrações de cada substrato: 0- 0,50 – 1,00 – 1,25 – 1,50
– 1,75 – 2,00 – 2,25 – 2,50- 5,00 mM.
A determinação de Km e Vm foi feita através de um programa específico para
cálculos de cinética enzimática, Kinetic. E curvas foram obtidas para cada substrato,
conforme modelo abaixo:
Curva de Progresso
45
40
35
Produto (P)
30
25
20
15
10
5
0
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
tempo (t)
4.2.5.6 Determinação da atividade proteásica
A atividade proteásica foi determinada utilizando-se o método de Charney e
Tomarelli (1947). A 2 mL de azocaseína 0,5% foi adicionado igual volume de extrato
enzimático e incubados a 37oC. Alíquotas de 0,5 mL do meio reacional foram retiradas a
cada 1 minuto até o 10 minutos e a reação interrompida pela adição de 0,5 mL de TCA
30
10% gelado. Esperou-se 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugou-se 0,5 mL do
sobrenadante que foi neutralizado com 0,5 mL de KOH 5N. A absorvância foi lida em
436nm.
Para o preparo do branco, procedeu-se como acima, adicionando primeiro o TCA
antes da colocação do extrato enzimático. A atividade proteásica no meio fermentado
sólido foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferença de 1 unidade na
absorbância entre o branco e a amostra, por minuto, nas condições do ensaio. O cálculo da
atividade enzimática foi feito segundo a Equação 4.8:
APS = (Absb –Absa) x Ve
t x Va x Ms
(Equação 4.8)
Onde:
APS = atividade proteásica no meio fermentado sólido (ΔAbs/g ou U/g)
Absa = absorvância da amostra no tempo zero
Absb = Absorvãncia da amostra no tempo t
Ve = volume de extração (mL)
Ms = massa seca (g)
Va = volume da alíquota do extrato enzimático (mL)
t = tempo de reação (min)
4.2.5.7 Efeito do pH e da Temperatura na atividade lipásica
A atividade lipásica foi determinada em diferentes valores de pH (5,4-7,6) e
temperaturas (28-42 oC), utilizando o método titulométrico descrito no item 4.2.5.3 em
tampão fosfato ou citrato-fosfato.
31
4.2.5.8 Atividade de esterificação da lipase
A atividade de esterificação da enzima imobilizada foi quantificada pelo consumo
de ácido oléico na reação de esterificação com etanol na razão mássica de ácido: álcool de
6:1. A reação foi conduzida à temperatura de 35oC utilizando-se 3% (m/m) de enzima
imobilizada sob agitação constante. A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio
reacional, em um reator aberto, provido de agitação magnética e conectado a um banho
termostático. Alíquotas de 150 L foram retiradas do meio reacional em triplicata, no
tempo zero e nos tempos de reação determinados. A cada amostra foram adicionados 20
mL de uma solução de acetona-etanol (1:1) (v/v) para extração do ácido oléico. A
quantidade de ácido consumido foi determinado por titulação com NaOH 0,02N. Uma
unidade de atividade enzimática de esterificação foi definida como a quantidade de enzima
que esterifica 1μmol de acido graxo por minuto, nas condições do ensaio de modo que o
cálculo da atividade enzimática foi feito pela Equação 4.9:
AE = (Va – Vb) x M x1000 x Vf
(Equação 4.9)
t. MIME. Ve
onde:
AE = atividade de esterificação (μmol/ min. MIME ou U/g)
Ve = volume de NaOH gasto na titulação da amostra retirada no tempo zero (mL)
Vb = volume de NaOH gasto na titulação da amostra retirada após o tempo t (mL)
M = molaridade da solução de NaOH (mmol/mL)
Vf = volume final de meio reacional (mL)
MIME = massa da enzima imobilizada utilizada na reação (g)
Ve = volume da alíquota do meio reacional retirada para titulação (mL)
t = tempo (min)
32
5. Resultados e discussão
5.1. Produção da lipase de Aspergillus parasiticus
A produção de lipase pelo fungo A. parasiticus foi feita por FES utilizando torta de
babaçu como meio de cultivo. As primeiras fermentações foram realizadas nas condições
de cultivo definidas no item 4.2.4.
A Tabela 5.1 ilustra os resultados da atividade lipásica, segundo o método
espectrofotométrico (AST), utilizando-se como substrato o p- nitro fenil butirato (48 horas
de fermentação) em função da suplementação do meio basal.
Atividade Lipásica- AST
(U/g)
Suplemento
Sem suplemento
Melaço Óleo de oliva
Água
14,3
15,7
15,3
Tabela 5.1: Atividades lipásicas produzidas pelo fungo A.parasiticus por FES em função da
suplementação do meio basal (48 horas de fermentação)
Pôde-se observar que o meio sem suplementação apresenta atividade lipásica
semelhante aos meios suplementados. A produção de lipase em 48 horas de fermentação
não foi alterada com a adição de suplementos. Esse efeito pode estar relacionado ao fato do
babaçu possuir óleo em sua composição, assim nota-se que este rejeito já contém os
nutrientes necessários ao crescimento e produção desta enzima pelo fungo Aspergillus
parasiticus, assim como descrito para o fungo Penicillium retrictum (Palma et al., 2000).
Sendo assim, para as fermentações posteriores utilizou-se apenas a torta de babaçu,
como meio de fermentação.
O perfil cinético de produção da lipase de A. parasiticus em função do tempo de
fermentação está apresentado na Figura 5.1.
33
1a fermentação
Atividade Lipásica (U/g)
30
2a fermentação
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (horas)
Figura 5.1: Perfil produção de lipase (ASE – U/g) pelo fungo A. parasiticus em FES utilizando
torta de babaçu sem suplementação como meio de cultivo com 70% de umidade e pH inicial
igual 7,0.
As duas fermentações realizadas apresentaram uma excelente reprodutibilidade e a
atividade máxima encontrada (25,5 U/g) ocorreu em 72h de fermentação com
produtividade de 0,35 U/g.h. Observou-se que a atividade lipásica do fungo A . parasiticus
apresentou uma queda bastante acentuada após 80 horas de fermentação, Esta perda de
atividade após um máximo já foi observado para os fungos Penicillium restrictum
(Gombert et al, 1999 e Palma et al, 2000) e P. simplicissimum (Gutarra et al 2007), no
mesmo sistema. Esta diferença de comportamento está possivelmente relacionada a
presença de enzimas proteolíticas e/ou a desestabilização da enzima produzida pela
alcalinização do meio. Deste modo, na etapa de otimização da produção da lipase de A.
parasiticus buscou-se analisar, pela técnica de planejamento de experimentos, o
comportamento de duas variáveis de resposta: atividade lipásica e proteásica, de modo a
maximizar a primeira e minimizar a segunda.
34
5.1.1.
Estudos da produção de lipase e protease pela técnica de
planejamento experimental
No procedimento de otimização do sistema utilizou-se um delineamento composto
central rotacional (DCCR), onde as variáveis, temperatura (T), teor de umidade inicial (U) e
concentração de inoculo (I) foram testadas nos níveis apresentados na Tabela 5.2:. A
análise do planejamento foi realizada utilizando o software Statistica 7.0. A Tabela 5.3:
mostra as condições experimentais e os valores de atividade lipásica experimentais e
preditos pelo modelo gerado e o desvio relativo entre eles. A atividade lipásica após 72
horas de fermentação foi medida através do método espectrofotométrico, utilizando-se
como substrato o p-nitro fenil butirato.
.
Valores codificados das variáveis
Variáveis
Temperatura (°C)
Concentração de
inoculo
(esporos/g)
Teor de umidade
inicial (%)
-1,68
-1
0
1
1,68
24
28
34
40
44
1 x 106
5 x107
1,25 x 108
2 x 108
2,51 x 108
61,6
65
70
75
78,4
Tabela 5.2: Valores reais e codificados das variáveis testadas
35
Ensaios
Temperatura
(oC)
Teor de
umidade inicial
(%)
Concentração de
inoculo (esp/g)
Valores experimentais
Valores preditos de
Desvio
de atividade lipásica
atividade lipásica
relativo
(U/g)
(U/g)
(%)
1
-1
-1
-1
17,40
18,50
6,32
2
1
-1
-1
6,00
7,50
25,00
3
-1
1
-1
2,80
4,90
75,00
4
1
1
-1
1,20
3,10
158,33
5
-1
-1
1
19,50
18,50
-5,13
6
1
-1
1
7,40
7,50
1,35
7
-1
1
1
4,60
4,90
6,52
8
1
1
1
1,40
3,10
121,43
9
-1,68
0
0
13,50
12,98
-3,85
10
1,68
0
0
4,50
2,23
-50,49
11
0
-1,68
0
13,26
13,19
-0,54
12
0
1,68
0
0,83
-1,93
-332,75
13
0
0
-1,68
14,29
13,81
-3,34
14
0
0
1,68
16,16
13,81
-14,52
15
0
0
0
17,00
17,20
1,18
16
0
0
0
17,00
17,20
1,18
17
0
0
0
17,00
17,20
1,18
Tabela 5.3: Valores experimentais e preditos de atividade lipásica para as diferentes condições
experimentais do delineamento composto central rotacional
O diagrama de Pareto mostra o efeito padronizado (valor de t) das variáveis testadas
sobre a atividade lipásica e este parâmetro foi utilizado para avaliar a significância dos
efeitos das variáveis (Figura 5.2). Observou-se que as variáveis, teor de umidade inicial e
temperatura apresentaram maior efeito sobre a produção de lipase, assim como a interação
entre elas. No entanto a variável concentração de inóculo apresentou um efeito
marginalmente significativo.
36
(2)Umidade(L)
-8,23897
Umidade(Q)
-6,80063
(1)Temperatura(L)
-5,84709
Temperatura(Q)
-5,64613
1Lby2L
3,288973
Inóculo(Q)
(3)Inóculo(L)
1Lby3L
2Lby3L
-1,97152
1,164859
-,404526
-,263821
p=,05
Efeito padronizado (valor de tcal)
Figura 5.2: Diagrama de Pareto
Foi possível construir um modelo empírico para atividade lipásica em função das
variáveis temperatura, umidade e concentração de inoculo codificadas (Equação 5.1),
incluindo apenas os termos estatisticamente significativos (valor de p < 0,05).
ASE = 17,2 – 3,2T – 3,4T2 – 4,5 U - 4,1U2 – 1,2I2 + 2,3T.U
(Equação 5.1)
Onde:
ASE = atividade lipásica espectrofotométrica no meio fermentado sólido(U/g)
T = Variável temperatura codificada
U = Variável teor de umidade codificada
I = Variável concentração de inoculo codificada
37
A análise de variância (ANOVA) foi realizada para avaliar a adequação do modelo.
O modelo é considerado preditivo se o coeficiente de determinação (R2) é próximo de 1 e
se o valor de F calculado for superior ao valor crítico de F. O modelo apresentado na
Equação 5.1 apresentou um F calculado 2,5 vezes maior que o valor crítico de F e o R 2 foi
0,95 (Tabela 5.4). Além disso, o modelo gerou atividades lipásicas preditas muito similares
aos valores obtidos experimentalmente apresentando desvios relativos altos apenas para os
valores mais baixos de atividade, isto é em condições afastadas do ótimo (Tabela 5.4:),
indicando um bom ajuste do modelo. Este modelo foi utilizado para a construção das
superfícies de resposta, mostrando os valores de atividade lipásica preditos para cada
condição de temperatura e umidade (Figura 5.3) e de temperatura e concentração de inóculo
(Figura 5.4) dentro da faixa estudada.
Fonte de
Soma
Graus de
Média
variação
quadrática
liberdade
quadrática
Regressão
705,1
6
28,7
8,2
Resíduo
34,7
10
3,5
-
Falta de ajuste
34,7
8
-
-
Erro puro
0
2
-
-
Total
739,8
16
-
-
Valor de F
Tabela 5.4: Análise de variância (ANOVA) do DCCR.
Coeficiente de determinação: R2 = 0,9531; F0.05;6.10 = 3,22
Valor de F = média quadrática da regressão/média quadrática do resíduo
38
Atividade lipásica
(U/g)
Teor de
umidade (%)
Temperatura
(ºC)
20
10
0
-10
-20
Figura 5.3: Superfície de resposta para atividade lipásica em função das variáveis, umidade e
da temperatura.
39
Atividade lipásica
(U/g)
Co
n
de cen
tra
i
(e nóc çã
o
sp ul
/g o
)
Temperatura
(ºC)
15
10
5
0
-5
-10
Figura 5.4: Superfície de resposta para atividade lipásica em função das variáveis,
concentração de inóculo e da temperatura.
Os maiores níveis de atividade lipásica foram obtidos na faixa de temperatura de 26
a 32ºC, umidade de 63 a 68% e concentração de inoculo de 5 x 107 a 2 x 108 esporos/g.
Através do modelo gerado, foi possível determinar as condições ótimas para a produção de
lipase pelo fungo A. parasiticus por FES em torta de babaçu: temperatura de 29°C, teor de
umidade inicial de 65 % e concentração de inóculo de 1,25 x 108 esp/g. Nestas condições a
atividade lipásica predita foi de 19,8 U/g. No entanto, observou-se na Figura 9 que a
variável concentração de inóculo apresentou pouca influência sobre a produção de lipase
dentro da faixa estudada. Utilizando a menor concentração de inoculo testada (106 esp/g),
125 vezes menos esporos que a concentração ótima, e mantendo as condições ótimas de
40
temperatura e umidade, uma redução de apenas 1,2 vezes na atividade seria obtida (16,4
U/g). Este resultado é muito interessante visto que a geração de grandes concentrações de
esporos é um dos gargalos de escalonamento da FES para escala industrial (Gutarra et al,
2007).
A produção de proteases também foi analisada neste planejamento como uma
segunda variável de resposta. A Tabela 5.5 mostra as condições experimentais e os valores
de atividade proteásica experimentais e preditos pelo modelo gerado e o desvio relativo
entre eles.
Ensaios
Teor de
Temperatura
umidade
inicial
(oC)
(%)
Concentração de
inoculo (esp/g)
Valores experimentais
de atividade proteásica
(U/g)
Valores preditos de
atividade proteásica
(U/g)
Desvio
relativo
(%)
1
-1
-1
-1
20,14
19,80
-1,69
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
1
-1
1
-1
1
-1
1
-1,68
1,68
0
0
0
0
0
0
0
-1
1
1
-1
-1
1
1
0
0
-1,68
1,68
0
0
0
0
0
-1
-1
-1
1
1
1
1
0
0
0
0
-1,68
1,68
0
0
0
10,84
16,25
2,84
21,65
7,84
3,51
2,70
17,80
4,38
12,82
3,04
15,74
22,65
14,58
12,44
15,94
11,00
12,20
3,40
19,80
11,00
12,20
3,40
21,59
6,81
13,25
0,48
14,20
14,20
14,20
14,20
14,20
1,48
-24,92
19,72
-8,55
40,31
247,58
25,93
21,30
55,43
3,32
-84,28
-9,78
-37,31
-2,61
14,15
-10,92
Tabela 5.5: Valores experimentais e preditos de atividade proteásica para as diferentes
condições experimentais do delineamento composto central rotacional.
41
No diagrama de Pareto (Figura 5.5), estão apresentados os efeitos padronizados das
variáveis testadas sobre a atividade proteásica. Observou-se que apenas as variáveis, teor de
umidade e temperatura apresentaram efeito estatisticamente significativo sobre a produção
de protease.
(1)Temperatura(L)
-4,04264
(2)Umidade(L)
-3,48395
Umidade(Q)
-2,24919
Temperatura(Q)
-1,31357
Inóculo(Q)
1,086183
2Lby3L
-1,0037
1Lby2L
,7841241
1Lby3L
(3)Inóculo(L)
,7126958
-,184984
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
Figura 5.5:Diagrama de Pareto
Foi possível construir um modelo empírico para atividade proteásica em função das
variáveis temperatura e umidade codificadas (Equação 5.2), incluindo apenas os termos
estatisticamente significativos (valor de p < 0,05).
APS = 14,2 – 4,4T – 3,8U – 2,6 U2
(Equação 5.2)
42
Onde:
APS = atividade proteásica no meio fermentado sólido (ΔAbs/g ou U/g)
T = Variável temperatura codificada
U = Variável teor de umidade codificada
O modelo apresentado na Equação 5.2 apesar de ter apresentado um baixo valor de
coeficiente de determinação (R2 =0,72), apresentou um F calculado 3,2 vezes maior que o
valor crítico de F (Tabela 5.6) e atividades proteásicas preditas pelo modelo, foram muito
similares aos valores obtidos experimentalmente apresentando desvios relativos mais altos
apenas para os valores mais baixos de atividade, isto é em condições afastadas do ótimo
(Tabela 5.6), indicando um bom ajuste do modelo. Este modelo foi utilizado para a
construção das superfícies de resposta, mostrando os valores de atividade proteásica
preditos para cada condição de temperatura e umidade (Figura 5.6) dentro da faixa
estudada.
Fonte de variação Soma quadrática
Graus de
Média
liberdade
quadrática
Valor de F
Regressão
547,5
3
182,5
11,1
Resíduo
213,3
13
16,4
-
Falta de ajuste
207,1
11
-
-
Erro puro
6,2
2
-
-
Total
760,8
16
-
-
Tabela 5.6: Análise de variância (ANOVA) do DCCR.
Coeficiente de determinação: R2 = 0,7196; F0.05;2.13 = 3,41
Valor de F = média quadrática da regressão/média quadrática do resíduo
43
Atividade proteásica
(U/g)
Teor de
umidade (%)
Temperatura
(ºC)
20
15
10
5
0
-5
Figura 5.6: Superfície de resposta para atividade proteásica em função das variáveis, umidade
e da temperatura.
A maior produção de proteases (20U/g) foi obtida em temperatura e umidade
menores que 28 ºC e 70%, respectivamente. Esta atividade proteásica é alta comparada a
fungos como o Penicillium restrictum, também produtor de lípases e que possui uma
atividade proteásica em torno de 8U/g, nas mesmas condições. (Palma et al., 2000).
Apesar das condições ótimas para produção de lipases e proteases do fungo A .
parasiticus serem bastante semelhantes, utilizando-se temperaturas de incubação maiores,
de 30 a 35 ºC, a produção de lipase pode ser favorecida.
44
5.1.2.
Acompanhamento dos parâmetros da fermentação
A partir destes resultados, optou-se por realizar uma cinética de fermentação nas
condições de cultivo de 30oC, 65 % de umidade e concentração de inoculo de 106
esporos/g., acompanhando diversas variáveis ao longo da fermentação (Figura 5.7).
umidade (%)
AST.(U/g)
APS(U/g)
pH
ASE (U/g)
Atividade água
80
60
10
Ativ. lip. titul. A
SE(U/g)
8
Ativ. proteásica A
PS (U/G)
6
Umidade
4
Ativ. lip. espect. A
ST(U/g)
2
Atividade água
40
20
0
0
30
60
90
120
150
0
180
pH
Tempo (horas)
Figura 5.7: Perfil de produção de lipase e protease por FES do fungo A. parasiticus em torta
de babaçu sem suplementação, e acompanhamento dos parâmetros da fermentação em função
do tempo.
A atividade da água manteve-se constante ao longo de toda a fermentação em torno
de 0,98, e o teor de umidade decresceu apenas 10% após 100 horas de cultivo. Estes
resultados indicam o bom funcionamento do sistema de fermentação utilizando reatores do
tipo bandeja incubados em câmara de fermentação com umidade controlada (95% de
saturação).
As atividades lipásicas máximas obtidas pelo método espectrofotométrico e
titulométrico foram de 25 U/g e 2,7 U/g, respectivamente. Estes valores aparentemente
discrepantes estão possivelmente relacionados a uma elevada produção de esterases por
45
este fungo. Esta atividade é revelada apenas pelo método espectrofotométrico que utiliza
um éster como substrato e não um triacilglicerol (óleo de oliva) como no método
titulométrico. Desta forma parece razoável concluir que a enzima de A parasiticus deve
produzir concomitantemente as duas enzimas.
Apesar dos perfis de atividade lipásica utilizando as duas metodologias serem
semelhantes, o decaimento da atividade titulométrica foi mais elevado chegando a zero em
120h de fermentação. Este fato reforça a hipótese deste fungo produzir uma maior
quantidade de esterases.
O perfil de produção de proteases foi bem distinto, apresentando-se crescente ao
longo da fermentação, não sendo observado o pico máximo de produção até 144h de
fermentação. Pode-se observar que a maior inflexão positiva na produção de proteases
ocorre justamente com o mesmo comportamento do perfil de pH e no tempo de
fermentação onde ocorre o início do decaimento da atividade lipásica. Estes resultados já
foram observados para outros microrganismos em trabalhos do nosso grupo de pesquisa. A
presença de proteases parece promover o aumento do pH do meio através da desaminação
de aminoácidos e liberação de amônia, podendo causar desativação da atividade lipásica
quando a enzima não apresenta estabilidade em pHs alcalinos. Além disso, as proteases
podem atuar diretamente na degradação das lipases indicando que em FES o efeito da
proteólise é um parâmetro significativo na degradação da lipase produzida e deve ser
levado em consideração na etapa de formulação e otimização do meio de cultivo (Freire et
al, 1997; Gombert et al, 1999; Palma et al, 2000; Leal et al, 2002; Dilluccio et al, 2004;
Soares et al, 2005; Gutarra et al, 2005 e 2007; Kempka et al, 2007; Azeredo et al, 2007).
46
5.2. Propriedades das lipases no extrato bruto
Para o estudo das propriedades das lipases presentes no extrato bruto produzido por
FES, dois tipos de preparação enzimática foram utilizados. Uma obtida pela fermentação na
torta de babaçu sem suplementação e outra obtida com melaço como suplemento. As
atividades dos extratos brutos foram determinadas pelo método espectrofotométrico para
ésteres de cadeia curta (C4), média (C12) e longa (C16) e frente ao óleo de oliva pelo
método titulométrico. (Tabela 5.7)
Método
Suplemento
Água
Melaço
ASE
AST
(U/g torta )
(U/g torta)
Óleo de oliva
Butirato
Laurato
Palmitato
35,57
24,95
10,13
2,7
24,60
18,95
7,69
3,9
Tabela 5.7: Atividade lipásica dos extratos brutos oriundos da fermentação em torta de
babaçu sem suplementação (água) e suplementada com melaço (3,3%) em substratos com
diferentes tamanhos de cadeia.
Pode-se observar que a adição de suplemento levou a uma diminuição da produção
de esterases e um pequeno aumento na produção de lipases (óleo de oliva como substrato).
A elevada atividade catalítica destas preparações frente a p-nitrofenil ésteres de
cadeia curta indica fortemente que esta preparação bruta deve conter majoritariamente
esterases.
47
5.3. Determinação dos parâmetros cinéticos da preparação enzimática
bruta
Com o objetivo de determinar os parâmetros cinéticos destas enzimas (Km e Vm),
optou-se por trabalhar com o extrato enzimático obtido da fermentação em meio basal sem
suplementação.
A Figura 5.8 e a Tabela 5.8 descrevem o comportamento destas constantes em
função do tamanho de cadeia do éster utilizado como substrato.
Cada ponto desta figura e tabela foi obtido, utilizando-se diferentes concentrações
de substrato com diferentes tamanhos de cadeia. A determinação destes parâmetros foi
realizada utilizando-se um programa característico para o cálculo de constantes cinéticas de
enzimas (Programa Kinetic).
Figura 5.8: Variação das constantes cinéticas Km e Vm em função do tamanho de cadeia do
éster utilizado:1- butirato (C4); 2- Caprilato (C8); 2 – laurato (C12); 4 – palmitato (C16); 5esterato (C18).
A Tabela 5.8 abaixo apresenta os valores dos parâmetros cinéticos da
preparação enzimática bruta obtida por FES do fungo Aspergillus parasiticus.
48
Butirato
Caprilato
Laurato
Palmitato
Estearato
(C4)
(C8)
(C12)
(C16)
(C18)
Vm (M/min)
417,4
396,7
365,6
321,3
269,9
Km (mM)
4,4
4,6
11,5
12,3
15,95
Tabela 5.8: Valor das constantes cinéticas Km e Vm em função do tamanho de cadeia do éster
utilizado: 1- butirato (C4); 2- Caprilato (C8); 2 – laurato (C12); 4 – palmitato (C16); 5esterato (C18).
Os resultados indicados na Figura 5.8 e Tabela 5.8 indicam que esta preparação
apresenta o dobro da velocidade máxima e um Km 5 vezes inferior quando o substrato
diminui de 18 para 4 carbonos. Esta tendência de diminuição de Vm com o aumento do
tamanho de cadeia está bem evidente na figura 5.8. Em relação à afinidade (km) pode-se
observar que este permanece constante quando o substrato aumenta de C4 para C8 e ocorre
um aumento brusco deste parâmetro quando o substrato é de 12 carbonos. Estes resultados
indicam claramente que quando se passa de substratos ditos de cadeia pequena (até C8)
para o de cadeia média (C12) a afinidade desta enzima diminui drasticamente. Isto leva a
confirmação da hipótese aventada anteriormente de que esta preparação contém elevadas
concentrações de esterases com afinidade por ésteres de cadeia curta.
5.4. Efeito da liofilização na atividade enzimática do extrato bruto
Este ensaio foi realizado com o extrato bruto após 72 horas de fermentação,
utilizando-se o liofilizador, a – 46º C, sob vácuo. E observou-se que as atividades lipásicas
(ASE) mantêm-se constantes, antes e depois da liofilização (25 U/g). A análise abaixo, de
determinação do efeito da temperatura e do pH realizada após 3 meses da liofilização
comprovou a estabilidade do extrato liofilizado.
49
Outros autores já observaram que o processo de liofilização mantém a conformação,
a estabilidade e a termoestabilidade de outras lipases como a produzida por Candida
rugosa. (Yu et al. 2005)
5.5. Efeito da temperatura e do pH na atividade lipásica
O pH e temperatura ótimos de atuação das lipases, presentes no extrato bruto
liofilizado obtido por FES, foram determinados variando-se o pH entre 5,4 e 7,6 e a
temperatura (T) entre 28 e 42oC. Os valores das variáveis testadas estão apresentados na
Tabela 5.9: e na Figura 5.9. A análise dos dados foi realizada utilizando o software
Statistica 6.0. A análise estatística permitiu verificar o efeito das variáveis pH e temperatura
na atividade da enzima (Tabela 5.10) e indicar as melhores condições de pH e temperatura
de atuação da lipase do fungo Aspergillus parasiticus, na faixa estudada (Figura 5.9).
Variáveis
Condições utilizadas
Temperatura (°C)
28
28
35
42
42
pH
Atividades
lipásicas
(ALT- U/mL)
5,4
7,6
6,5
5,4
7,6
1,1
3,26
7,63
1,86
5,04
Tabela 5.9: Variáveis testadas (temperatura e pH), condições utilizadas nos ensaios e
atividades lipásicas (AST) obtidas.
Variáveis
Temperatura
pH
Temperatura x pH
Efeito
25,4
53,4
10,2
Tabela 5.10: Efeito das variáveis pH e temperatura sobre a atividade lipásica.
50
Atividade
Lipásica (U/m L)
Tem peratura (ºC)
pH
Figura 5.9:Gráfico de resposta para atividade lipásica em função das variáveis, pH e da
temperatura.
As variáveis temperatura e pH apresentaram um efeito positivo sobre a atividade
lipásica, isto é, maiores atividades foram obtidas em função do aumento da temperatura e
do pH. Além disso, observou-se que a variável, pH, apresentou maior efeito sobre a
atividade da enzima. No entanto, o valor máximo de atividade lipásica (7,63 U/mL) foi
obtido em condições intermediárias (ponto central), em temperatura de 35ºC e pH 6,5,
indicando que as condições ótimas estão nesta região, sendo necessários mais ensaios para
construção de um modelo de segunda ordem e a determinação das condições ótimas desta
enzima. Estes resultados indicam que a lipase de A. parasiticus é uma enzima neutra e que
atua em condições brandas de temperatura, assim como a lipase do fungo Aspergillus niger
e Penicillium restrictum (Carvalho et al., 2005; Jesus et al, 1999).
51
Baseando-se neste resultado, os experimentos de obtenção da atividade de
esterificação foram realizados sob estas condições.
5.6. Atividade e eficiência de imobilização
As vantagens do uso de enzimas imobilizadas em relação ao uso de preparações de
enzimas livres, principalmente em reações de síntese em reações de síntese são muitas,
como por exemplo: facilidade de recuperação do biocatalisador e facilidade de separação
dos produtos (Benjamin e Pandey, 1998; Villeneuve et al., 2000). Deste modo, avaliou-se
preliminarmente a imobilização da lipase deste fungo no suporte polipropileno microporoso
(Accurel MP1000) segundo metodologia desenvolvida em trabalhos anteriores (Oliveira et
al, 2006).
A determinação da eficiência e rendimento de imobilização, segundo o método
descrito em 4.2.5.3., está apresentada na Tabela 5.11.
Determinação da Eficiência e Rendimento de Imobilização
Unidades de atividade lipásica imobilizada = UIMO(U)
11,20 U
Unidades de atividade oferecidas para o procedimento de imobilização do
29,25 U
extrato bruto inicial =UE (U)
Unidades de atividade lipásica do extrato bruto que sobra ao final da
4,55 U
imobilização=US (U)
Atividade teórica da enzima na imobilização = UTEO= UE - US (U)
24,70 U
Eficiência de Imobilização (Ef - %)
84,4 %
Retenção de Imobilização (- %)
45%
Tabela 5.11: Eficiência e rendimento de imobilização da enzima do fungo Aspergillus
parasiticus.
52
Os valores de eficiência e rendimento de imobilização são bastante elevados
comparativamente a outros trabalhos da literatura.(Oliveira et al, 2007; Bernardes et al.,
2007; Bevilaqua et al., 2005).
Entretanto, cabe ressaltar que estes resultados são preliminares e que uma
otimização do procedimento de imobilização faz-se necessária.
5.7. Estudo da atividade de esterificação da lipase
Observando que o fungo Aspergillus parasiticus apresenta-se como um bom
produtor de lipases, realizou-se uma avaliação preliminar da potencial aplicação desta
enzima em reações de síntese em meio aquo-restrito. A reação de esterificaçãode oleato de
etila foi escolhida porque diversos autores na literatura, indicam esta reação interessante
para avaliar o potencial de lipases na síntese de biodiesel (Bernardes et al., 2007).
A atividade de esterificação da lipase do fungo A. parasiticus foi realizada com a
enzima imobilizada e de acordo com os procedimentos definidos no item 4.2.5.8..
Os
experimentos
foram
realizados
em
triplicata,
e
encontraram-se
atividadesreprodutíveis de 300 U/g. Este valor é bastante interessante quando comparado
ao de enzimas comerciais de elevado custo
como por exemplo a Lipozyme, que
apresentam atividade sintéticas que variam 120 a 600 U/g (Castro et al, 1997).
53
6. Conclusões
O rejeito de babaçu demonstrou ter um grande potencial nutricional, possibilitando
o bom desenvolvimento do microorganismo em termos de produção de enzimas, uma vez
que os resultados obtidos neste trabalho mostraram não haver a necessidade de utilização
de fontes suplementares de carbono e nitrogênio, o que pode levar a uma considerável
economia com matérias-primas no processo industrial.
Com a utilização da técnica de planejamento experimental foi possível a
determinação das condições de fermentação que permitiram a maximização da produção da
atividade lipásica (temperatura de 28°C, umidade de 65 %) e minimização da concentração
de inóculo de 106 esporos/g.
Entretanto, como a variável concentração de inóculo apresentou pouca influência
sob a produção de lipase, utilizou-se a menor concentração de inóculo testada, o que
significa 125 vezes menos esporos no processo.
A maior produção de proteases foi obtida utilizando-se temperaturas de incubação
inferiores a 28ºC e valores de umidade menores que 70%, condições ótimas parecidas com
as da lipase. Mas pôde-se observar que se utilizando temperaturas de incubação maiores, de
30 a 35 ºC, a produção de lipase é favorecida.
Com relação ao efeito do pH e da temperatura de atuação da enzima, as condições
ótimas foram obtidas em temperatura de 35ºC e pH 6,5, indicando que esta enzima possui
características neutras e mesofilicas.
A elevada atividade catalítica da enzima frente aos substratos p-nitrofenil ésteres de
cadeia curta indica fortemente que esta preparação bruta contém elevada concentração de
54
esterases, com afinidade por ésteres de cadeia curta. Pôde-se verificar que a maior Vmáx e o
menor Km foram observados para o éster de cadeia curta (C4).
A capacidade desta enzima de apresentar altas atividades de esterificação, em meio
aquo-restrito, torna esta preparação um alvo interessante para atuar na produção de
biodiesel e/ou biolubrificantes.
55
7. Trabalhos futuros
Com base nos resultados e conclusões obtidos neste estudo, sugere-se como
trabalhos futuros:
- A produção e otimização de enzimas lipases, utilizando-se como meio de cultivo
outros rejeitos agroindustriais, como por exemplo, a mamona e o pinhão manso;
-Otimização da etapa de imobilização da preparação enzimática em suportes
comerciais e produzidos na UFRJ;
-Caracterização da preparação enzimática bruta produzida em relação as suas
características de régio, quimio e estereoespecificidade.;
-Melhoramento da produção utilizando-se técnicas de Biologia Molecular;
-Estudos de aplicação da enzima como catalisador de reações (hidrólise e
esterificação) de interesse para a indústria do petróleo.
56
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