Difco Salmonella O, H e Vi - bula Port

1
DIFCO SALMONELLA O ANTISERA
DIFCO SALMONELLA H ANTISERA
DIFCO SALMONELLA ANTISERUM Vi
FINALIDADE
Difco Salmonella O Antisera ( antisoros para Salmonella O Difco) são utilizados
nas provas de aglutinação em lâmina para a identificação de Salmonella
mediante antígenos somáticos ( O ).
Difco Salmonella H Antisera ( antisoros para Salmonella H Difco ) são utilizados
nas provas de aglutinação em tubo para a identificação de Salmonella mediante
antígenos flagelares ( H ).
Difco Salmonella Vi Antiserum ( antisoro para Salmonella Vi Difco ) é utilizado
nas provas de aglutinação em lâmina para identificação de Salmonella Vi.
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A espécie de Salmonella causa diversas enfermidades humanas denominadas
salmoneloses. Pode variar desde gastroenterites leves de remissão espontânea
até formas mais graves, podendo levar a uma bacteremia ou febre tifóide, que
põe em perigo a vida. A enfermidade grave e a bacteremia se associam
principalmente com três sorotipos de S. enterica subespécie enterica (
Choleraesuis, Paratyphi A e Typhi ), apesar de outras 2300 cepas ou mais
estejam associadas com gastroenterites. A gravidade da enfermidade diarreica
depende da virulência da cepa e do estado do indivíduo.
A Salmonella é encontrada em outros seres vivos e se encontra no intestino de
muitos animais, tanto selvagens como domésticos. O microorganismo pode
chegar ao ser humano por contato com dejetos, ingestão de carne vermelha ou
alimentos de origem vegetal.
Todos os sorotipos de Salmonella pertencem a duas espécies: S. bongori, que
inclui 18 sorotipos, e S. enterica, que inclui as 2300 cepas restantes ou mais
divididos em seis subespécies1,2.
As seis subespécies de S. enterica são as seguintes:
S. enterica subespécie enterica ( I ou 1 )
S. enterica subespécie salamae ( II ou 2 )
S. enterica subespécie arizonae ( IIIa ou 3 a )
S. enterica subespécie diarizonae ( IIIb ou 3 b )
S. enterica subespécie houtenae ( IV ou 4 )
S. enterica subespécie indica ( VI ou 6 )
2
A nomenclatura e classificação dessas bactérias se alteram constantemente 3.
Salmonella e a antiga Arizona devem ser consideradas do mesmo gênero,
Salmonella4. Recomenda – se que os laboratórios informem os nomes dos
sorotipos de Salmonella para a subespécie enterica. Os nomes dos sorotipos já
não se escreve mais em cursivas e a primeira letra deve ser maiúscula. Por
exemplo, a cepa que antigamente identificava – se como Salmonella
typhimurium agora se escreve Salmonella Thyphimurium.
Os sorotipos de outras subespécies de S. enterica ( exceto algumas das
subespécies salamae e houtenae ) e as
da S. bongori não têm nome e são designadas por sua fórmula antigênica. Para
obter informações mais recentes, consultar as referências correspondentes1-10.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
Os antígenos Salmonella O são antígenos somáticos ( O ) termoestáveis e são
identificados primeiramente. O antígeno Vi é um antígeno de membrana
termolábil que pode permear a parede celular e mascarar a atividade do antígeno
somático. Os microorganismos com antígeno Vi não aglutinam com antisoros O .
Para determinar o antígeno O dessas culturas, deve – se ferver uma suspensão
do organismo para destruir o antígeno de membrana termolábil, para, então,
realizar o teste com o antisoro O . Os antígenos flagelares (H) são termolábeis e
geralmente são associados à motilidade.
Não é necessário uma caracterização sorológica completa da Salmonella para
uma detecção satisfatória do microorganismo quando se trata de um patógeno.
O uso de procedimentos de isolamento adequados e provas bioquímicas de
diferenciação são de suma importância. As suspeitas de Salmonella podem ser
identificadas de maneira presuntiva com uma identificação sorológica mínima.
Para análise mais completa, é possível enviar os isolados para laboratórios de
referência.
Para obter mais informação sobre a identificação sorológica de Salmonella,
consultar as referências correspondentes1-3,9, 11- 14.
A identificação da espécie de Salmonella inclui identificação tanto bioquímica
quanto sorológica. No procedimento de confirmação sorológica, é produzida uma
reação na qual o microorganismo (antígeno) reage com anticorpos
correspondentes. Esta reação in vitro produz a formação de grumos
macroscópicos denominada aglutinação. A reação homóloga é rápida, de alta
afinidade e não dissociativa ( alta avidez ).
Dado que um microorganismo ( antígeno ) pode aglutinar com um anticorpo
produzido como resposta a alguma outra espécie, são possíveis as reações
heterólogas. Nestes casos as reações são frágeis e de formação lenta.
Conhecidas como reações cruzadas, podem causar dúvidas na identificação
sorológica. Portanto, uma reação de aglutinação homóloga positiva deve ser
3
interpretada juntamente com a identificação morfológica e bioquímica do
microorganismo.
A aglutinação do antígeno somático na prova em lâmina aparece como uma
aglutinação granular firme. As reações homólogas são fortes e rápidas (3+). As
reações heterólogas são frágeis e lentas.
A aglutinação de antígenos flagelares na prova em tubo aparece como uma
floculação não firme que pode ressuspender novamente com facilidade.
REATIVOS
Difco Salmonella O Antisera, Difco Salmonella H Antisera e Difco Salmonella Vi
Antisera são antisoros de coelho policlonais liofilizados que contém
aproximadamente 0,04% de timerosol como conservante.
Difco Salmonella O Poly Antisera são antisoros polivalentes. Cada antisoro é
específico para determinados antígenos de sorogrupo. Quando se rehidrata
corretamente e utiliza de maneira recomendada, cada frasco de Difco
Salmonella O Antisera ou Difco Salmonella Vi Antisera contém reativo suficiente
para 60 provas. Difco Salmonella O Poly A-I Antisera e Difco Salmonella Vi
Antisera são preparados com cepas representativas para estes sorogrupos e
não são absorvidos. Podem apresentar reação cruzada devido a antígenos O em
comum.
Difco Salmonella O Group Antisera são específicos para os principais fatores
presentes no sorogrupo. Difco Salmonella O Factor Antisera são específicos
para os fatores de sorogrupos individuais. Ao utilizar Difco Salmonella O Group
Antisera, é possível que se produzam reações cruzadas porque os sorogrupos
podem ter em comum antígenos de grupos secundários. Difco Salmonella O
Factor Antisera são absorvidos segundo necessidade, o que torna cada antisoro
tão específico quanto prático, sem reduzir as reações homólogas a níveis
insatisfatórios.
Difco Salmonella H Poly Antisera são antisoros polivalentes específicos para
determinados antígenos flagelares. Cada frasco de Difco Salmonella H Antisera
contém reativo suficiente para realizar 150 – 1500 provas, segundo antisoro
utilizado. Difco Salmonella H Antisera são absorvidos ou não, de maneira
específica, para as antígenos de fase 1 ou 2. Difco Salmonella H Antisera Spicer
– Edwards são antisoros polivalentes combinados e antisoros complementares
adicionais para a identificação dos antígenos H mais freqüentes.
Advertências e Precauções
Para uso diagnóstico in vitro.
O conteúdo deste produto contém goma natural seca.
4
Empregar técnica asséptica e seguir precauções habituais contra riscos
microbiológicos durante todo processo. Depois do uso, esterilisar as amostras,
reagentes, lâminas, tubos e demais materiais contaminados em autoclave. É
necessário seguir rigorosamente as instruções de uso.
Conservação: Conservar Difco Salmonella O Antisera, Difco Salmonella H
Antisera e Difco Salmonella Vi Antisera, liofilizados e rehidratados a uma
temperatura de 2 – 8o C.
Uma exposição prolongada dos reativos a temperaturas diferentes das
especificadas é prejudicial aos produtos.
Deterioração do produto: A data de validade se aplica ao produto conservado
na embalagem original. Não utilizar o produto se apresentar aglutinação,
alteração de cor ou outros sinais de deterioração.
RECONSTITUIÇÃO E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Amostras clínicas: a Salmonella pode ser recuperada a partir de meios de
diferenciação seletivos tais como o agar entérico Hektoen ou agar XLD.
Consultar as referências correspondentes para obter recomendações
específicas11,12. Assegurar a obtenção de um cultivo puro do microorganismo e
uma identificação bioquímica correta. Uma vez satisfeitos esses critérios, a
identificação sorológica poderá ser realizada com segurança.
Amostras de alimentos: a Salmonella pode ser recuperada a partir de diversos
tipos de amostras quando processos de recuperação de microorganismos
estressados e crescimento excessivo de microorganismos competidores são
utilizados. Consultar as referências correspondentes para obter recomendações
específicas acerca dos procedimentos para isolar Salmonella dos
alimentos13,14.. Assegurar a obtenção de um cultivo puro do microorganismo e
uma identificação bioquímica correta. Uma vez satisfeitos esses critérios, a
identificação sorológica poderá ser realizada com segurança.
Cepas isoladas a partir de meios seletivos devem ser reisoladas em meios não
seletivos, para então realizar as provas sorológicas.
PROCEDIMENTO
Materiais fornecidos: Difco Salmonella O Antisera; Difco Salmonella H
Antisera; ou Difco Salmonella Antiserum Vi.
Materiais necessários mas não fornecidos: Prova em lâminas: solução de
NaCl 0,85% estéril; lâmina de aglutinação com 6,54 cm2; palitos de madeira;
Banho Maria fervente; centrífuga.
Tubo de ensaio: solução de NaCl 0,85%; tubos de cultura 12X75 mm e estante;
Banho Maria, 50 ? 20 C; pipetas sorológicas de 1 ml; formaldeido.
5
Preparação do reativo: Deixar os reativos atingirem a temperatura ambiente
antes de iniciar as provas. Assegurar que a vidraria e as pipetas estejam limpas
e livres de resíduos, como, por exemplo, detergente.
Para reconstituir o produto, adicionar 3 ml de solução de NaCl 0,85% estéril e
misturar suavemente para dissolver o conteúdo completamente. Após
reconstituição, os antisoros estarão com diluição de 1:2.
Análise da cepa isolada para determinar a autoaglutinação
1. A partir do cultivo da prova em meio não seletivo, transferir uma alça de
crescimento a uma gota de solução salina estéril 0,85% depositada em uma
lâmina limpa e misturar bem.
2. Com movimentos circulares, girar a lâmina durante 1 min. e em seguida,
observar a formação ou não de aglutinação.
3. Se ocorrer a aglutinação ( autoaglutinação ), a cultura é rugosa e a análise
não poderá ser realizada. Realizar um subcultivo em agar não seletivo,
incubar e repetir o procedimento descrito nos itens 1 e 2.
4. Se não ocorrer nenhum tipo de aglutinação, realizar a análise do organismo.
Seleção de antisoros
Salmonella O Antisera: Este Esquema I de identificação sorológica (ver Tabela
1) começa com Difco Salmonella O Antisera Poly A até Poly G, que inclui o
seguinte:
Antisoros do grupo Salmonella
presentes
Salmonella O Antiserum Poly A
Salmonella O Antiserum Poly B
Salmonella O Antiserum Poly C
Salmonella O Antiserum Poly D
Salmonella O Antiserum Poly E
Salmonella O Antiserum Poly F
Salmonella O Antiserum Poly G
Grupos somáticos
A,B,D,E 1 ( E 2,E3) *, E 4, L
C1,C 2,F,G,H
I,J,K,M,N,O
P,Q,R,S,T,U
V,W,X,Y,Z
51-55
56-61
*As cepas dos grupos E 2 e E 3 são lisogenizadas pelo bacteriófago 15, logo pelo
34. Essas cepas agora estão no grupo E 1.2
Se houver aglutinação, utilizar Difco Salmonella O Group Antisera individuais
para determinar o sorogrupo específico a que pertence a cepa testada. Para fins
de eficácia, testar primeiro com Difco Salmonella O group Antisera B, D e C 1
individuais ( os sorogrupos mais comuns ).
6
Se não houver aglutinação com Salmonella O Antiserum Poly A ou Salmonella O
Antiserum Poly B, analisar a cepa com Difco Salmonella Antiserum Vi. Se o
resultado for positivo, aquecer e repetir a prova com Difco Salmonella Antiserum
Vi. Se após ferver a amostra ocorrer aglutinação com Difco Salmonella Antiserum
Vi, é provável que o isolado não seja Salmonella. Se não ocorrer aglutinação
com Difco Salmonella Antiserum Vi depois da fervura, analisar a amostra fervida
com Difco Salmonella O Antisera individuais. Se os resultados das provas forem
indeterminados, as amostras deverão ser enviadas a um laboratório de
referência para realização de provas adicionais.
Se não houver aglutinação com Salmonella O Antiserum Poly C, D, E, F e G, é
provável que o isolado não seja Salmonella.
Tabela 1. – Esquema I para uso de Salmonella O Antisera Poly Groups A,
B, C, D, E, F e G.
Prova com
Resultado da
prova
Prova com
Resultado da
prova
Prova com
Resultado da
prova
Conclusão da
prova ou seguir
procedimento
Salmonella O Antisera Poly Groups A,B,C,D,E,F e G
+
Salmonella O Antisera
individuais
+ com Salmonella O
Antiserum (requerido)
?
Determinar a
Salmonella H Antigen
- com Poly A ou B
- com
Poly C,D,E,F e G
Salmonella O Antiserum Vi
-
+
Aquecer e repetir com
Salmonella O Antiserum Vi
+
Amostra não
é Salmonella
Analisar a
amostra
fervida com
Salmonella O
Antisera
individuais
?
?
Amostra
não é
Salmonella
Amostra não é
Salmonella
Salmonella O Antiserum Poly A–I e Vi, esquema II (ver Tabela 2
continuação): Este antisoro detecta os fatores 1-16,19,22-25,34 e Vi. Esta
combinação de fatores representa os grupos A-I isolados mais freqüentemente e
os antígenos Vi, e é utilizado para detecção sistemática de possíveis isolados de
Salmonella.
Uma possível reação indica que são necessárias mais provas sorológicas para
identificar a amostra com Difco Salmonella O Group Antisera. Os sorogrupos
mais comuns são B,D e C 1. Para maior eficácia, utilizar primeiro Difco
Salmonella O Group Antisera para estes grupos.
Se o isolado for positivo com Difco Salmonella O Antiserum Poly A-I e Vi mas
negativo com antisoros somáticos específicos, analisar a amostra com Difco
Salmonella Antiserum Vi. Se o resultado for positivo com Difco Salmonella
Antiserum Vi, aquecer e repetir a prova com Difco Salmonella Antiserum Vi. Se o
7
resultado for positivo com Difco Salmonella O Antiserum Vi após a fervura, é
possível que a amostra não seja Salmonella. Se não produzir aglutinação com
Difco Salmonella Antiserum Vi depois de fervido , analisar com Difco Salmonella
O Antisera individuais. Se os resultados da prova são indeterminados, as
amostras devem ser enviadas a um laboratório de referência para provas
adicionais.
Uma reação negativa com Difco Salmonella O Antiserum Poly A-I e Vi indica que
a amostra não pertence aos sorogrupos A-I. Se as reações bioquímicas estão de
acordo com Salmonella, é possível que seja de um sorogrupo diferente de A-I.
Nesses casos, outras provas com antisoros para antígenos de outros sorogrupos
são necessários.
Tabela 2.- Esquema II para uso de Salmonella O Antiserum Poly A-I e Vi
Prova com
Resultado da prova
Prova com
Resultado da prova
+
Prova com
Resultado da prova
Prova com
Resultado da prova
Conclusão da prova ou
seguir procedimento
?
Determinar
a Salmonella
H Antigen
Salmonella O Antiserum Poly A-I e Vi
+
Salmonella O Antisera individuais
-
-
Salmonella O Antiserum Vi
+
Aquecer e repetir a prova
com Salmonella O
Antiserum Vi
+
?
?
Amostra
Analisar a
Amostra não Pode ser Salmonella detectável
não e
é Salmonella mediante o uso de Salmonella O
amostra
Salmonella fervida com
Antisera Poly C,D,E,F ou G
Salmonella
O Antisera
individuais
Antisoros de fator de grupo e de um só fator para Salmonella O: Utilizar
Difco Salmonella O Group Antisera selecionados para identificação adicional de
amostras. As reações cruzadas são possíveis entre os sorogrupos com antígenos
em comum. Abaixo, lista parcial de Difco Salmonella O Group Antisera como
exemplo:
Salmonella O Antiserum Group A Factors 1,2,12; Salmonella O Antiserum
Group B Factors 1,4,12,27. Os fatores 1 e 12 são produzidos em combinação
com outros antígenos e podem causar reações cruzadas. A potência das reações
ajuda na interpretação. Uma aglutinação de 3+ ou mais, de formação rápida,
indica uma reação homóloga.
Utilizar Difco Salmonella O Factor Antisera selecionados. Para chegar a uma
identificação adicional da amostra, são utilizados antisoros absorvidos
específicos para um antígeno identificável num determinado sorogrupo. No
exemplo anterior, os seguintes Difco Salmonella O Factor Antisera poderiam ser
utilizados:
8
Salmonella O Antiserum Factor 2; Salmonella O Antiserum Factor 4; Salmonella
O Antiserum Factors 4,5; Salmonella O Antiserum Factor 5.
Antisoros polivalentes para Salmonella H: A identificação adicional de uma
amostra de Salmonella inclui a caracterização dos antígenos flagelares. A
determinação de sorogrupo pode ser realizado com os seguintes Difco
Polyvalent H Antisera:
Antisoros de grupo polivalentes para Salmonella H Antígenos flagelares
presentes
Salmonella H Antiserum Poly a-z
z,z 6,z 10,z 29
Salmonella H Antiserum Poly A
Salmonella H Antiserum Poly B
Salmonella H Antiserum Poly C
Salmonella H Antiserum Poly D
Salmonella H Antiserum Poly E
Grupos EN,G,L,Z4,1 complexos e a-k,rGrupos a,b,c,d,i,z 10,z 29
Grupos eh,en,enx,enz15 ,complexo G
Grupos k,l,r,y,z,z 4
Grupos z 35,z 36,z 37,z 38,z 39,z 41,z 42
1 complexo z 6
Os antisoros de antígeno H absorvidos específicos para determinados antígenos
ou complexo de antígenos podem ser utilizados para realizar uma identificação
adicional da amostra.
Antisoros de antígeno H absorvidos e não absorvidos: a identificação
completa de uma amostra de Salmonella conduz à análise de antígenos de fase
1 e 2 mediante o antisoro de antígeno H. Para o padrão de complexos de
análises e procedimentos, consultar as referências correspondentes9.
Salmonella H Antisera Spicer-Edwards: Difco Salmonella H Antisera SpicerEdwards é utilizado para a detecção sistemática e identificação das cepas de
Salmonella mais freqüentes, mediante uma combinação de antisoros de
complexos específicos e polivalentes.
Tabela 3. –Identificação de Salmonella H mediante Salmonella H Antisera
Spicer-Edwards.
Antígeno H
a
b
c
d
e,h
Salmonella H Antisera SpicerEdwards
1
2
3
4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Antígeno H
Salmonella H Antisera SpicerEdwards
1
2
3
4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
k
r
y
z
Z4
Complexo**
G Complexo* +
+
z 10
+
i
+
z 29
+
+
* O componente do complexo G da Salmonella H Antisera Spicer-Edwards 1 e 4 reage com os
antígenos f,g; f,g,s; f,g,t; g,m; g,m,q; g,m,s; g,m,s,t; g,m,t;g,p; g,p,s; g,p,u; g,q; g,s,t; g,t;
m,p,t,uym,t.
** O componente do complexo z4 reage com z4,z 23;z 4,z 24 e z4,z 32.
9
Observar que não há antígeno com resultado positivo para os quatro Salmonella
H Antisera Spicer-Edwards. Os antígenos que reagem com os quatro soros
devem ser analisados para determinar sua uniformidade.
Método de prova em Lâmina
Antisoros para Salmonella O e Vi
Utilizar este procedimento para analisar a amostra com cada antisoro
selecionado.
1. colocar 1 gota (35ul) de cada antisoro a ser analisado numa lâmina de
aglutinação.
2. Com um loop ou alça de platina, transferir uma colônia isolada do meio sólido
para a área de reação e misturar bem.
3. Controle Negativo: Colocar 1 gota de solução de NaCl a 0,85% estéril numa
lâmina de aglutinação. Colocar 1 gota de cada Difco Salmonella O Antiserum
a ser analisado na lâmina de aglutinação e misturar bem.
4. Controle Positivo: Colocar 1 gota de cada Difco Salmonella O Antiserum a
ser analisado numa lâmina de aglutinação. Adicionar 1 gota de Difco QC
Antigen Salmonella apropriado ou de cultivos de referência para identificação
sorológica conhecida.
5. Agitar a lâmina em movimento rotatório durante 1 min. Efetuar a leitura para
determinar a presença de aglutinação. Os resultados devem ser interpretados
no prazo de 1 min.
Preparação da prova em tubo
1. Salina formalizada a 0,6%: preparar adicionando 6 ml de formaldeído para
cada 1000 ml de solução de NaCl a 0,85% estéril .
2. Preparo da amostra: é necessário aumentar a motilidade do
microorganismo a ser testado. Para isso, deve – se realizar várias
transferências consecutivas no Motility GI Medium .
??
Inocular o tubo em profundidade até a superfície do meio, com
uma alça em ponta.
??
Incubar a 35-37 °C por 18-20 h.
??
Transferir apenas os microorganismos que migraram para o
fundo do tubo.
??
Quando o microorganismo de deslocar de 50-60 mm pelo meio,
num prazo de 18-20 h, estará pronto para ser utilizado.
??
Recomenda – se um caldo de infusão para o cultivo de
Salmonella motilidade positiva antes da análise. Deve ser incubada e
inoculada a 35°C por 24 h. Ao utilizar o caldo de infusão cérebro –
coração, incubar a 35°C por 4 – 6 h. Ao utilizar caldo de soja tríptico,
incubar a 35°C por 24 h.
??
Preparar a suspensão do organismo utilizando volumes iguais
de cultivo de caldo e solução formalizada a 0,6%. A densidade final
desta suspensão deve ser equivalente ao padrão de turbidez Nº 3 de
McFarland.
10
3. Controle Positivo: Não se encontram disponíveis controle de qualidade para
antígenos de Salmonella H preparados comercialmente. O usuário deve
manter cultivos de referência de identificação sorológica conhecida para uso
com fins de controle de qualidade. Preparar o antígeno utilizando sorotipos
conhecidos e seguindo o procedimento descrito anteriormente. ( ver Preparo
da amostra, item anterior)
4. Antisoros para Salmonella H: Os antisoros reconstituídos possuem diluição
de trabalho 1:2. Preparar as diluições como descrito abaixo e utilizar no dia
da preparação. Descartar qualquer porção não utilizada.
??
A maioria dos antisoros para Salmonella H: Preparar uma
diluição 1:250 adicionando 0,1 ml de antisoro reconstituído a 25 ml de
solução de NaCl a 0,85%. Depois , misturar quantidades iguais (0,5 ml)
de antisoro diluído e suspensão da amostra. A diluição final será de
1:1000.
??
Salmonella H Antisera x, z 13, z 15 e z 28: Preparar uma diluição
de 1:125 adicionando 0,1 ml de antisoro reconstituído a 12,5 ml de
solução de NaCl a 0,85%. Misturar quantidades iguais (0,5ml) de
antisoro diluído e suspensão da amostra. A diluição final será de 1:500.
??
Salmonella H Antiserum Poly a-z: Preparar uma diluição de
1:25
adicionando 0,1ml de antisoro reconstituído a 2,5ml de solução de NaCl a
0,85%. Misturar quantidades iguais (0,5ml) de antisoro diluído e
suspensão de amostra. A diluição final será de 1:100.
Procedimento para prova em tubo
Antisoro para Salmonella H
1. Preparar um tubo de ensaio de 12X75 mm para cada amostra.
2. Antisoro diluído: colocar 0,5 ml em cada tubo.
3. Amostra: adicionar 0,5 ml ao tubo correspondente.
4. Controle Positivo: Adicionar 0,5 ml de controle positivo de antígeno a um
tubo com 0,5 ml de antisoro.
5. Controle Negativo: Adicionar 0,5 ml de solução de NaCl a 0,85% a um tubo
com 0,5 ml de amostra.
6. Incubar todos os tubos em banho Maria a 50 ? 2°C durante 1 h.
7. Efetuar uma leitura para verificar floculação ( aglutinação ).
8. Repetir a prova em um tubo com organismo de prova com fase inversa. (Ver o
procedimento Inversão de fase a seguir ).
Inversão de fase
1. Preparar meio de inversão de fase para Motility GI Medium segundo
instruções.
2. Preparar o antisoro contrário à fase desejada. Por exemplo, a incubação de
Salmonella Typhimurium fase 1[i] no GI Motility Medium com antisoro i ,
permite o crescimento e a propagação de S. Typhimurium fase 2 [1,2].
11
3.
4.
5.
6.
7.
Adicionar 1 ml de uma diluição 1:10 de antisoro a 25 ml de GI Motility Medium
estéril e misturar bem. Verter numa placa de Petri estéril e deixar solidificar.
Inocular, perfurando a borda do meio solidificado.
Incubar a 35 – 37°C por 24 h.
Transferir o crescimento do bordo de propagação frente ao sítio de
inoculação a um meio líquido para análise segundo os passos do item
Procedimento de prova em tubo: Antisoros para Salmonella H.
Se a motilidade não for aceitável, realizar outro repique no meio Motility GI
Medium.
Salmonella H Antiserum Spicer-Edwards
1. Preparar a amostra e a diluição de antisoro 1:2 segundo descrição anterior
em preparação da prova em tubo.
2. Diluição final de antisoro 1:1000: Adicionar 0,1 ml de antisoro reconstituído
( diluição de trabalho 1:2) a 25 ml de solução de NaCl a 0,85%.
3. Preparar 4 tubos de cultivo 12X75 mm para cada amostra.
4. Salmonella H Antisera Spicer-Edwards 1-4: Adicionar 0,5 ml de antisoro
diluído nos tubos de ensaio.
5. Amostra: Adicionar 0,5 ml a cada tubo.
6. Incubar os tubos em banho Maria a 50 ? 2°C por 1 h.
7. Retirar os tubos do banho Maria. Evitar agitação intensa dos tubos durante a
incubação ou antes de realizar a leitura.
8. Efetuar leitura para verificar floculação ( aglutinação ).
Controle de Qualidade: No momento do uso, aplicar controles, tanto homólogos
quanto heterólogos, para comprovar o rendimento do antisoro, as técnicas e a
metodologia. Difco QC Antigens Salmonella podem ser utilizados como controle
homólogo. Para mais instruções, consultar o folheto Difco QC Antigens
Salmonella.
O controle de Qualidade deve chegar a resultados conforme a política local e/ou
nacional, aos requisitos dos organismos testados e aos procedimentos padrões
de controle de qualidade do laboratório. Recomenda – se consultar instruções do
NCCLS e normativas do CLIA correspondentes, para obter informações acerca
das práticas adequadas de controle de qualidade.
RESULTADOS
Prova em lâmina
1. Ler e registrar os resultados da seguinte forma:
4+
3+
2+
100% e aglutinação (fundo de transparente a ligeiramente
leitoso)
75% de aglutinação (fundo ligeiramente turvo)
50% de aglutinação (fundo moderadamente turvo)
1+
25% de aglutinação (fundo turvo)
-
Sem aglutinação
1. O controle positivo deve indicar uma aglutinação de 3+ ou mais.
2. O controle negativo não deve mostrar nenhum indício de aglutinação.
3. Para as cepas isoladas das análises, uma aglutinação de 3+ ou mais indica
um resultado positivo.
12
4. Uma aglutinação parcial (menor que 3+) ou demorada, considerar como
reação negativa .
5. Se houver a necessidade de uma identificação de Salmonella H, continuar a
prova.
Prova em tubo
1. Ler e registrar os resultados da seguinte forma:
4+
3+
100% de aglutinação (fundo transparente a ligeiramente
leitoso)
75% de aglutinação (fundo ligeiramente turvo)
2+
50% de aglutinação (fundo moderadamente turvo)
1+
25% de aglutinação (fundo turvo)
-
Sem aglutinação
1. O controle positivo deve indicar uma aglutinação de 3+ ou mais na maior
diluição da prova de rotina.
2. O controle negativo não deve apresentar nenhum indício de aglutinação.
Ao utilizar Difco Salmonella H Spicer-Edwards, comparar os resultados com
padrões de floculação (aglutinação) do esquema de Spicer-Edwards (ver a
tabela 3, acima).
Limitações do procedimento
1. Uma identificação final, requer a caracterização completa dos antígenos O e H
de um isolado de Salmonella. Devido à complexidade dos procedimentos de
laboratório, a identificação com soros polivalentes pode ser suficiente para a
maioria dos laboratórios.
2. Os isolados suspeitos de Salmonella que apresentem discordâncias nas
reações bioquímicas e nas provas de antígenos O e H devem ser enviados a
um laboratório de referência para análises adicionais.
3. O calor excessivo proveniente de fontes externas ( alça bacteriológica quente,
chama do bico de Bunsen, fonte de luz, etc) podem impedir a formação de uma
suspensão uniforme do microorganismo ou causar a evaporação ou precipitação
da mistura de análise. Podem ocorrer reações falso positivas.
1. Efetivamente, ocorrem cepas de cultivos rugosos, as quais aglutinam
espontaneamente, causando reação no teste negativo (autoaglutinação). É
necessário selecionar e analisar colônias uniformes em procedimentos
sorológicos.
2. No procedimento de aglutinação em lâmina para análise de antígeno O,
recomenda – se que se analise várias colônias e que utilize antisoros
polivalentes não absorvidos seguidos de antisoros de um fator absorvido. Por
exemplo, as colônias de um cultivo 1,2,12 na placa de agar apresentarão
diversos níveis de cada antígeno. Um antisoro 1,2,12 absorvido de
anticorpos1 e 12 será altamente específico, mas mostrará aglutinação fraca
ou nula com as colônias que tiverem menos do antígeno 2 e mais do antígeno
1 e 12. O uso de Difco Salmonella O antiserum Group A não absorvido ,
fatores 1,2,12, para analisar várias colônias suspeitas numa placa, seguido
13
da análise com Difco Salmonella O Antiserum absorvido, fator 2, atinge
equilíbrio necessário de sensibilidade e especificidade.
3. As reações de aglutinação de 3+ ou mais são interpretadas como reações
positivas. As reações cruzadas que geram aglutinação de 1+ ou 2+ são
possíveis, dado que existem antígenos somáticos em comum entre os
diferentes grupos como antígenos de grupos secundários.
4. Podem existir antígenos em comum entre os diversos sorogrupos “O” de
Salmonella. Por exemplo, Difco Salmonella O Antiserum Poly A contém,
entre outros, aglutininas para fator 1, pois cultivos com fator 1 foram utilizados
na imunização. Assim, é possível que este antisoro polivalente reaja com
cultivos diferentes aos contidos nos sorogrupos “O” A,B,D,E e L devido ao
antígeno 1 em comum ( os organismos no grupo G1, G2, H, R, T, etc., que
contém o fator 1).
5. Difco Salmonella O Antiserum Poly A-I e Vi são preparados com membros
representativos daqueles grupos somáticos e não são absorvidos. È evidente
que este soro pode reagir e reagirá com grupos O de Salmonella mais
elevados.
6. A técnica de aglutinação em tubo é recomendada para análise de antígeno H
porque podem ocorrer reações cruzadas com antígenos somáticos nas
diluições utilizadas na técnica em lâmina.
7. Na prova em tubo, o preparo da diluição adequada para um determinado
antisoro é imprescindível. São utilizadas diversas diluições para diferentes
antisoros. Consulte os detalhes no item Preparação da prova em tubo.
CARACTERÍSTICAS DO RENDIMENTO
Salmonella O Antisera e Salmonella Antiserum Vi: A sensibilidade do Difco
Salmonella O Antisera e Salmonella Antiserum Vi é determinada ao demonstrar a
reatividade correspondente, definido no item Resultados, Prova em lâmina, frente
a um conjunto de cultivos homólogos de Salmonella (ver tabela 4, continuação). A
especificidade é determinada ao demonstrar a falta de reatividade a grupos não
relacionados (heterólogos) de Salmonella.
Antisoros para Salmonella H
A sensibilidade do Difco Salmonella H Antisera é determinada ao demonstrar a
reatividade correspondente, definido no item Resultados, Prova em lâmina, frente
a um conjunto de cultivos homólogos de Salmonella (ver a tabela 5). A
especificidade é determinada ao demonstrar a falta de reatividade frente a
grupos não relacionados (heterólogos) de Salmonella
REFERÊNCIAS: Ver “References” no texto em inglês
14
Tabela 4
Ref
Produto
229471
Salmonella O Antiserum Group A Factors 1,2,12
Cultivos homólogos analisados
Grupo de Antígenos
Sorotipo
A
Paratyphi A1,2,12
Paratyphi A 2,12 var.
Durazzo
228141
229481
Salmonella O Antiserum Factor 2
Salmonella O Antiserum Group B Factors
1,4,5,12
B
Paratyphi B 1,4,(5),12
Essen 4,12
Paratyphi B 1,4,{5},12
Schleissheim 4,12,27
Typhimurium 1,4,{5},12
Schleissheim 4,12,27
229731
Salmonella O Antiserum Group B Factors
1,4,12,27
Salmonella O Antiserum Factor 4
Salmonella O Antiserum Factor 5
Salmonella O Antiserum Factor 27
Salmonella O Antiserum Group C1 Factors 6,7
C
Kentucky 8,20
Thompson 6,7,14
Newport 6,8
Virginia 8
D
Enteritidis 1,9,12
Typhi 9,12,(Vi)
Pullorum 1,9,12
Haarlem (9),46
226591
226601
226671
229491
229501
230161
226621
226611
228161
229511
Salmonella O Antiserum Group C2 Factors 6,8
Salmonella O Antiserum Group C3 Factors(8),20
Salmonella O Antiserum Factor 20
Salmonella O Antiserum Factor 14
Salmonella O Antiserum Factor 7
Salmonella O Antiserum Group D1 Factors
1,9,12
230171
Salmonella O Antiserum Group D2 Factors(9),46
15
228181
Salmonella O Antiserum Factor 9
228191
Salmonella O Antiserum Group E Factors
1,3,10,15,19,34
Salmonella O Antiserum Group E1 Factors 3,10
Salmonella O Antiserum Group E2 Factors 3,15
Salmonella O Antiserum Group E3 Factors
(3),(15),34
Salmonella O Antiserum Group E4 Factors
1,3,19
229521
229541
230181
230191
222571
222581
222591
211778
222601
230291
226661
222631
211780
225181
225191
211781
Salmonella O Antiserum Factor 10
Salmonella O Antiserum Factor 15
Salmonella O Antiserum Factor 19
Salmonella O Antiserum Factor 34
Salmonella O Antiserum Group F Factor 11
Salmonela O Antiserum Group G Factors
13,22,23,(36),(37)
Salmonella O Antiserum G1 Factors 13,22,(36)
Salmonella O Antiserum Group G2 Factors
1,13,23,(37)
Salmonella O Antiserum Factor 22
Salmonella O Antiserum Factor 23
Salmonella O Antiserum Group H Factors
1,6,14,24,25
Salmonella O Antiserum Factor 25
Salmonella O Antiserum Group I Factor 16
Salmonella O Antiserum Group J Factor 17
Salmonella O Antiserum Group K Factor 18
Salmonella O Antiserum Group L Factor 21
Salmonella O Antiserum Group M Factor 28
211783
225221
Salmonella O Antiserum Group N Factor 30
Salmonella O Antiserum Group O Factor 35
222611
230201
226631
226641
222621
Illinois 3,15,34
Anatum 3,10
E
London 3,10,26
Newington 3,15
Senftenberg 1,3,19
F
Rubislaw 11
G
Wichita 1,13,23
H
Florida {1},6,14,{25}
I
J
K
L
M
Gaminara 16
Kirkee 17
Cerro 6,14,18
Minnesota 21,26
Telaviv 28ab
Dakar 28ac
Urbana 30ab
Adelaide 35
N
O
Ref. 225341 Salmonella O Antiserum Poly A (Groups A,B,D,E1,E2,E3,E4 e
L) cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
A
Sorotipo
Grupo de antígeno
Paratyphi A 1,2,12; Paratyphi D
A var; Durazzo 2,12
B
Paratyphi B 1,4,{5},12;
Essen 4,12; Schleissheim
4,12,27
E
L
Sorotipo
Enteritidis 1,9,12; Typhi
9,12,Vi; Pullorum 9,12;
Haarlem{9},46
Anatum3,10;London3,10,26;
Newington3,15;Illinois{3},{15
},34;Senftenberg1,3,19
Minnesota 21,26
Ref. 225351 Salmonella O Antiserum Poly B (Groups C1, C2,F,G e H)
cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
C1
C2
Sorotipo
Thompson 6,9,{14}
Newport 6,8
Grupo de antígeno
G1
G2
F
Rubislaw 11
H
Sorotipo
Poona{1},13,22,{36}
Worthington
1,13,23,{37};Grumpensis
13,23
Carrau 6,14,24; Florida
1,6,14,25;Boecker{1},6,14,
{25}
Ref. 225361 Salmonella O Antiserum Poly C (Groups I,J,K,M,N e O) cultivos
homólogos testados
16
Grupo de antígenos
I
J
K
Sorotipo
Gaminara 16
Kirkee 17
Cerro 6,14,18
Grupo de antígenos
M
N
O
Sorotipo
Telaviv 28ab;Dakar 28ac;Aderike 28
Urbana 30
Adelaide 35
Ref. 225371 Salmonella O Antiserum Poly D (Groups P,Q,R,S,T e U)
cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
P
Q
R
Sorotipo
Inverness 38
Champaign 39
Riogrande {1},40ab;
Bulawayo 1,40ac,49
Grupo de antígeno
S
T
U
Sorotipo
Waycross {1},41
Weslaco {1},42;Loenga 1,42ab
Milwaukee 43abc, Bunnik 43 acd
Ref. 225381 Salmonella O Antiserum Poly E (Groups V,W,X,Y e Z) cultivos
homólogos testados
Grupo de antígeno
V
W
X
Sototipo
Niarembe {1},44
Devesoir 45ab; dugbe 45ac
Bergen {1},47ab; Kaolack {1},47ac
Grupo de antígeno
Y
Z
Sorotipo
Dahlem 48ab; Djakarta 48abc
Wassenaar 40abc; Greenside 50abd
Ref. 226451 Salmonella O Antiserum Poly F (Groups 51-55) cultivos
homólogos testados
Grupo e antígeno
51
52
53
Sorotipo
Treforest 1,51; Haarlem 51
Utrecht 52
Humber 1,53
Grupo de antígeno
54
55
Sorotipo
Uccle 54
Tranoroa 55
Ref. 226461 Salmonella O Antiserum Poly G (Groups 56-61) cultivos
homólogos testados
Grupo de antígeno
56
57
58
Sorotipo
Artis 56
Locarno 57
Basel 58
Grupo de antígeno
59
60
61
Sorotipo
Betoiky 59
Luton 60
Eilbek 61
Ref. 228271 Salmonella Antiserum Vi cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
Vi
Sorotipo
Typhi (felix) 9,12,Vi
Ballerup Vi
Tabela 5
Ref
222691
Produto
Salmonella H Antiserum G Complex
225441
225461
225481
225501
225511
Salmonella H Antiserum f
Salmonella H Antiserum m
Salmonella H Antiserum p
Salmonella H Antiserum s
Salmonella H Antiserum t
Grupo de antígeno
G Complex
Sorotipo
Derby f,g; Berta f,g,t; Enteritidis
g,m;Bledgam g,m,q; Montevideo
g,m,(p),s; Dublin g,p; Rostock g,p,u;
Senftenberg g,(s),t; Budapest g,t;
Oranienburg m,t
17
222711
Salmonella H Antiserum L Complex
L Complex
Bredeney l,v; London l,v;
Worthington l,w; Livingstone l,w;
Morocco l,z 13,z 28; Javiana l,z 28;
Rutgers l,z 40; Lz 19,lz 13,lz 13
225541
225561
225611
222721
Salmonella H Antiserum w
Salmonella H Antiserum z 13
Salmonella H Antiserum z 28
Salmonella H Antiserum 1 Complex
1 Complex
Newport var. puertorico 1,2;
Thompson var. berlin 1,5,3,10:1,6
1,6; Madelia 1,7
224741
224751
224761
224771
222701
Salmonella H Antiserum Single Factor 2
Salmonella H Antiserum Single Factor 5
Salmonella H Antiserum Single Factor 6
Salmonella H Antiserum Single Factor 7
Salmonella H Antiserum EN Complex
Salmonella H Antiserum x
Salmonella H Antiserum z 15
EN Complex
Abortusequi e,n,x; Salinatis
(PC230)e,n,z 15
Salmonella H Antiserum Z4Complex
Salmonella H Antiserum z 32
Salmonella H Antiserum z 23
Z4 Complex
Cerro z 4,z 23; Duesseldorf
z 4,z 24;Tallahassee z 4,z 32
225451
222731
Salmonella H Antiserum h
Salmonella H Antiserum eh
h
Reading e,h
222651
Salmonella H Antiserum Spicer-Edwards 1
Spicer-Edwards
222661
222671
Salmonella H Antiserum Spicer-Edwards 2
Salmonella H Antiserum Spicer-Edwards 3
222681
Salmonella antiserum Spicer-Edwards 4
228201
225551
225571
222781
225621
225581
Paratyphi A a
Paratyphi B b
Budapest g,t
Typhimurium l
Salmonella H Antiserum a
Cholerasuis c
Paratyphi C c
Oranienburg m,t
228211
Salmonella H Antiserum b
S. typhi 901 d
Reading e,h
Madelia y
228221
Salmonella H Antiserum c
228231
Salmonella H Antiserum d
228241
Salmonella H Antiserum i
222741
Salmonella H Antiserum k
222751
222761
Salmonella H Antiserum r
Salmonella H Antiserum y
Derby f,g
AtlantaWorthington z
Berta f,g,t
Enteritidis g,m
Bledgam g,m,q
Montevideo
g,m,(p),s
Taksony z 6
Cerro z 4,z 23
Duesseldorf
z 4,z 24
Dublin g,p
Tallahassee
z 4,z 32
222771
Salmonella H Antiserum z
Rostock g,p,u
18
222791
Salmonella H Antiserum z 10
222801
Salmonella H Antiserum z 29
224731
Salmonella H Antiserum z 6
Tennessee z 29
Illinois z 10
Seftenberg g,s,t
Ref. 225391 Salmonella H Antiserum Poly A (Groups a,b,c,d,i,z 10 e z 29 )
cultivos homólogos testados
grupo de antígeno
a
b
c
d
sorotipo
Paratyphi A; Dakar; 58:a:
(z 6)
Paratyphi B;Schleissheim;
Artis
Choleraesuis; Paratyphi C;
Deversoir
Typhi 901
grupo de antígeno
i
sorotipo
Typhimurium
Z10
Illinois (spec)
Z29
Tennessee
Ref. 225401 Salmonella H Antiserum Poly B (Groups eh,en,enx,enz 15 e G
complex) cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
e,h
e,n,x
e,n,z 15
f,g
f,g,t
g,m
g,m,q
Sorotipo
Reading
Abortusequi
Salinatis (PC 230)
Derby
Berta
Enteritidis
Blegdam
Grupo de antígeno
g,m,(p),s
g,p
g,p,u
g,(s),t
g,t
m,t
Sorotipo
Montevideo
Dublin
Rostock
Senftenberg
Budapest
Oranienburg
Ref. 225411 Salmonella H Antiserum Poly C (Groups k,l,r,y,z e z 4) cultivos
homólogos testados
Grupo de antígeno
k
l,v
l,w
l,z 13
l,z 28
l,z 13,z 28
l,z 40
Sorotipo
Thompson
Bredeney
Worthington (spec)
lz 19,lz 13
Javiana
Rutgers
Grupo de antígeno
r
r,(l)
y
z
z 4,z 23
z 4,z 24
z 4,z 32
Sorotipo
Rubislaw
Madelia
Atlanta-Worthington
Cerro
Duesseldorf
Tallahassee
Ref. 225421 Salmonella H Antiserum Poly D (Groups z 35,z 36,z 37,z 38,z 39,z 41 e
z 42) cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
z 35
z 37
z 38
Sorotipo
Chittagong
Wichita
Lille
Grupo de antígeno
z 39
z 41
z 42
Sorotipo
Quimbamba
Karamoma
Locarno
Ref. 225431 Salmonella H Antiserum Poly E (Groups 1 Complex, z 6)
cultivos homólogos testados
Grupo de antígeno
z6
1,2
1,5
Sorotipo
Taksony
Newport var.puertorico
Thompson var.berlin
Grupo de antígeno
1,6
1,7
Sorotipo
3,10:1,6
Madelia