Caracterização Genotípica e Fenotípica de - PPGBAIP

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA E FENOTÍPICA DE Escherichia coli
DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO
ESTADO DO PARÁ
CINTYA DE OLIVEIRA SOUZA
Belém-Pará
2013
DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL
ISOLADAS NO ESTADO DO PARÁ
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Doutor em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro
Belém-Pará
2013
1
DIARREIOGÊNICAS DE ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL ISOLADAS NO
ESTADO DO PARÁ
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro
Instituto Evandro Chagas / SVS / MS
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Ricardo Ishak
Instituto de Ciência Biológicas, UFPA
Profa. Dra. Lena Líllian Canto de Sá Morais
Instituto Evandro Chagas / SVS / MS
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado
Profa. Dra. Karla Tereza Silva Ribeiro
Profa. Dra. Marluisa de Oliveira Guimarães Ishak (Suplente)
Belém, 10 de Julho de 2013
2
“Nosso limite nós mesmos o construímos; expandi-lo é apenas uma questão de vontade e de
coragem”.
Francisco Lúzio de Paula Ramos
3
À minha família, especialmente à minha querida mãe Neiva Monari e ao meu amado esposo
Alexandre Moraes.
"Há pessoas que transformam o sol
numa simples mancha amarela,
mas há também aquelas
que fazem de uma simples mancha amarela
o próprio sol" (Pablo Picasso).
Mãezinha, esta foi a forma que achei para descrever sua força e sua coragem. Você é
uma grande e surpreendente mulher, na qual eu busquei o exemplo de superação.
Meu bem, você é um presente de Deus.
Ao teu lado tornei-me uma pessoa melhor e mais feliz!
A Deus, sem o qual eu não teria coragem para lutar nem forças para amar!
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar comigo durante todos os momentos de minha vida. Obrigada por sua
infinita misericórdia e por guiar-me por seus caminhos.
Ao meu amado esposo Alexandre, seu amor, cuidado, compreensão e carinho foram
essenciais para a superação dos momentos difíceis desta conquista. Obrigada por sempre estar
ao meu lado!
À minha mãe Neiva e meu pai José Carlos, por todo amor, dedicação, carinho, respeito
e educação que me ensinaram a viver.
Aos meus irmãos Carlos César e Nádia, pelo verdadeiro exemplo de família, onde a
conquista de um é a vitória de todos. Ao meu querido sobrinho João Gabriel (6 anos) que
mesmo sem saber restaurava as minhas forças com o seu sorriso.
Ao meu orientador Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro, por ter sido um grande
incentivador e orientador. Muito Obrigada!
À Universidade Federal do Pará e ao Curso de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários do Centro de Ciências Biológicas, pela oportunidade de crescimento
profissional ofertado com o desenvolvimento e a conclusão deste doutorado.
Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários da UFPA pelos vários ensinamentos e experiências que me fizeram crescer no
conhecimento.
Aos Professores Doutores, Antonio Carlos Rosário Vallinoto, Lena Líllian Canto de
Sá Morais e Karla Tereza Silva Ribeiro, membros da banca examinadora, pelas importantes
contribuições no plano de qualificação.
Ao Instituto Evandro Chagas/SVS/MS e seu corpo técnico e administrativo pela
oportunidade de desenvolvimento desta tese.
À Dra Elizabeth Conceição de Oliveira Santos, diretora do Instituto Evandro Chagas, pelo
apoio às atividades de pesquisa e a qualificação profissional.
5
Às chefias da Seção de Bacteriologia e Micologia, Dra Maria Luiza Lopes e, da Seção
de Meio Ambiente, Dra Iracina Maura de Jesus, que viabilizaram a execução deste trabalho
por meio da concordância na utilização das coleções bacterianas.
À Dra Flávia Correa Bastos pela inestimável colaboração e orientação na execução e
análise dos testes de PFGE. Obrigada por ter estado sempre à disposição!
À Dr.ª Lena Líllian Canto de Sá Morais pela orientação direta e pessoal durante todo
processo de análise dos perfis de macrorrestrição enzimática, desde as importantíssimas
orientações sobre a utilização do programa Bionumerics até a análise e descrição final dos
resultados. Obrigada por sua valiosa contribuição, por sua paciência e disposição em ajudar!
À Profa Dra Karla Tereza Silva Ribeiro pela concordância e disponibilização das
amostras ambientais isoladas de água de consumo e de beber provenientes do município de
São Sebastião da Boa Vista.
À Dra Daniela Rocha pelas orientações durante a execução dos ensaios de PCR
multiplex.
À amiga Ana Judith Pires Garcia Quaresma pela disposição e colaboração ativa
durante a execução dos testes de suscetibilidade
Às amigas Maurimelia Mesquista da Costa, Karla Valéria Batista Lima, Daniele
Murici Brasiliensis e Ana Roberta Fusco da Costa pelas importantes contribuições durante as
etapas de revisão dos resultados.
À Geralda Resende e Elivan Vale (Seção de Meio Ambiente) pela atenção e
colaboração durante a localização e obtenção das informações referentes às amostras
ambientais.
À Denise Amorim e Raimundo Pio pela colaboração durante os ensaios de PFGE.
À amiga Fernanda Sagica e ao Prof. Dr. Édson Ramos pelas importantes contribuições
durante as análises estatísticas.
Às amigas Silvia Marques, Luana Nepomuceno, Ana Roberta, Karla Lima, Daniele
Murici, Ana Judith, Flavia Bastos e Maurimelia Costa pela amizade e palavras de incentivo
durante este período.
6
Ao Prof. Dr. Francisco Lúzio de Paula Ramos pelo apoio, atenção e incentivos na
busca do aprimoramento técnico e científico.
Aos estudantes, bolsistas e servidores do IEC e da Universidade Federal do Pará que
participaram do isolamento e identificação dos isolados de Escherichia coli: Taiany Bicalho,
Patricia Yoshida, Eveline Bezerra de Sousa, Dolores Dias, José Góes, Caetano, Raimundo
nonato, Madalena, Jardel, Vanderley, Maria Odete, Raquel, Rosinha Kaieda, Elivan Vale,
Geralda Rezende, Raimundo Pio.
Às amigas Ana Roberta Fusco da Costa e Eveline Bezerra de Sousa que foram
responsáveis pela identificação molecular das E.coli diarreiogênicas de origem humana.
Às coordenações dos Projetos Juruti (Dra Lourdes Garcez), Projeto HIV (Dra Yvone
Gabbay), Projeto Praias (Dr Edvaldo Loureiro), Projeto Ilhas (Dra Lena Líllian) e Projeto
Marajó (Dr. Ricardo Ishak) pela oportunidade de participar de alguns desses estudos e pela
disponibilidade das amostras que comporam este trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Bacteriologia Geral, Entéricos I e II e do Setor de
esterilização da Seção de Bacteriologia e Micologia (SABMI/IEC) por toda colaboração no
preparo dos meios de cultura, cultivo e recuperação das amostras.
Aos profissionais e estudantes das áreas técnica e administrativa da SABMI/IEC/MS pelo
convívio, auxílio e amizade no decorrer desta etapa. Muito obrigada!
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
11
RESUMO
12
ABSTRACT
13
1
INTRODUÇÃO .........................................................................................
14
1.1
CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli................................
14
1.2
CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli ............................
14
1.3
RECONHECIMENTO
DE
E.
coli
COMO
PATÓGENO
GASTROINTESTINAL..............................................................................
15
1.4
Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS......................................................
16
1.4.1
E. coli enteropatogênica - EPEC..............................................................
18
1.4.2
E. coli enterotoxigênica - ETEC...............................................................
21
1.4.3
E. coli enteroinvasora - EIEC...................................................................
22
1.4.4
E. coli produtora da Toxina de Shiga - STEC.........................................
24
1.4.5
E. coli enteroagregativa - EAEC..............................................................
25
1.5
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL..........................................................
27
1.6
RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA.......................................................
28
1.7
RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD
GEL ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE
Escherichia coli...........................................................................................
30
1.8
OBJETIVOS................................................................................................
33
1.8.1
Objetivo Geral ...........................................................................................
33
1.8.2
Objetivos Específicos ................................................................................
33
2
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................
34
2.1
AMOSTRAS................................................................................................
34
2.2
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS................................................
35
2.2.1
Reisolamento, Identificação e manutenção das culturas de E. coli.......
35
2.2.2
Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas......................................
35
2.2.2.1 Extração do DNA bacteriano ......................................................................
36
2.2.2.2 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Multiplex (PCRmultiplex).....................................................................................................
37
8
2.2.2.3 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex)..
38
2.2.2.4 Eletroforese.................................................................................................
39
2.2.3
Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos.........................................
40
2.2.3.1 Preparação do Inóculo.................................................................................
40
2.2.3.2 Semeadura nas placas..................................................................................
40
2.2.3.3 Aplicação dos Discos de Antimicrobianos..................................................
40
2.2.3.4 Leitura e interpretação do teste....................................................................
41
2.2.4
Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE) ..................................
41
2.2.4.1 Preparo da suspensão bacteriana ................................................................
42
2.2.4.2 Montagem dos blocos de agarose ...............................................................
42
2.2.4.3 Processo de Lise in situ ...............................................................................
42
2.2.4.4 Digestão do DNA com a enzima de restrição XbaI.....................................
43
2.2.4.5 Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas............................
43
2.2.4.6 Coloração e fotodocumentação do gel de agarose.......................................
44
2.2.4.7 Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE..
44
2.3
APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS........................................
44
2.4
ASPECTOS ÉTICOS..................................................................................
45
3
RESULTADOS..........................................................................................
46
3.1
FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS
46
3.2
PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E
FENÓTIPOS DE RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS.......
50
3.3
VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS .....
56
4
DISCUSSÃO..............................................................................................
64
4.1
DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS...............................
64
4.1.1
E. coli diarreiogênicas de origem humana..............................................
65
4.1.2
E. coli diarreiogênicas de origem ambiental...........................................
69
4.2
RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS
74
4.3
ANÁLISE
5
DA
VARIABILIDADE
GENÉTICA
EM
E.
coli
DIARREIOGÊNICAS.................................................................................
80
CONCLUSÕES..........................................................................................
83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................
85
APÊNDICES .............................................................................................
103
9
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1-
Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa
(Hernades et al., 2009)............................................................................
19
Figura 2-
Fímbria BFP de EPEC (Nataro & Kaper, 1998).....................................
19
Figura 3-
Estrutura em forma de pedestal vista na lesão A/E de EPEC (Kaper et
al., 2004).................................................................................................
Figura 4-
Padrão de aderência localizada de EPEC em cultura de células HeLa
(Hernandes et al., 2009)..........................................................................
Figura 5-
26
Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a
categoria patogênica................................................................................
Figura 6-
20
47
Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex.
Linha 1:
Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica,
linha 2 a 8: Controles positivos para observação da amplificação
individual dos alvos moleculares............................................................
Figura 7-
Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli
diarreiogênicas.........................................................................................
Figura 8-
50
Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com
a origem de isolamento...........................................................................
Figura 9-
49
52
Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela
enzima Xba I por meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13:
Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 KB); linhas 2-5 e 6-8: E.
coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC
615 (ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12:
Salmonella Braenderup...........................................................................
Figura 10-
56
Dendograma da relação genética entre as E. coli diarreigênicas
baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima Xba I e
definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi
determinado
pelo
coeficiente
de
Dice
e
método
UPGMA.
(Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths)..............................................
Figura 11-
Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli
enteropatogênica (EPEC) baseado nos perfis de macrorrestrição
59
10
gerados pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por
similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método
UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths)............................
Figura 12-
60
enteroagregativa (EAEC) baseado nos perfis de macrorrestrição
Figura 13-
61
enterotoxigênica (ETEC) baseado nos perfis de macrorrestrição
Figura 14-
62
enteroinvasora (EIEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados
pela enzima Xba I e definidos pelo PFGE. O agrupamento por
UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).............................
63
11
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Página
Quadro 1-
Cepas de referência de Escherichia coli para PCR.................................
35
Quadro 2-
Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli.............
36
Quadro 3-
Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex................
37
Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCRQuadro 4-
multiplex.................................................................................................
38
Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex...............................
38
Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex................
39
Quadro 5-
Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCRQuadro 7 Quadro 8Quadro 9-
monoplex.................................................................................................
39
Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex..............................
39
Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos
utilizados.................................................................................................
41
Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo
Tabela 1-
a origem de isolamento...........................................................................
46
Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo
Tabela 2-
Tabela 3-
com origem de isolamento......................................................................
46
Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com os
fatores de virulência e a origem de isolamento.......................................
48
Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de
Tabela 4-
acordo com as origens de isolamento......................................................
50
Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com
Tabela 5-
os antimicrobianos utilizados.............................................................
51
Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com
Tabela 6-
as categorias patogênicas........................................................................
53
Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de
Tabela 7-
acordo com a origem de isolamento........................................................
54
Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de
Tabela 8-
acordo com as categorias patogênicas.....................................................
55
12
RESUMO
A Escherichia coli é uma enterobactéria comensal do trato intestinal de humanos e
animais e sua presença no ambiente é indicativo de contaminação fecal. A presença de
determinados genes de virulência tornam essas bactérias patogênicas, podendo ser
classificadas em categorias diarreiogênicas: E.coli enteropatogênica típica (EPEC-t) ou atípica
(EPEC-a), E.coli enterotoxigênica (ETEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da
toxina de Shiga (STEC) e E. coli enteroagregativa (EAEC). Com objetivo de conhecer a
frequência, a resistência antimicrobiana e as relações genéticas entre estas categorias no
estado do Pará, foram pesquisados genes de virulência por PCR-multiplex e/ou monoplex
entre 410 amostras de E.coli, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem humana. A
resistência antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em disco e as relações
genéticas por PFGE. As cinco categorias de E.coli diarreiogênicas foram identificadas, sendo
mais frequentes entre a origem humana (13,36%) do que ambiental (1,74%). A ETEC, EAEC
e EPEC atípicas foram frequentes entre as duas origens. A EIEC e STEC foram exclusivas de
origem humana, enquanto, a EPEC tipica foi exclusiva de origem ambiental. As maiores
resistências foram observadas ao sulfametoxazol-trimetoprim (44,44%), ampicilina (40,28%)
e tetraciclina (33,33%) e a única diferença de resistência entre as amostras humanas e
ambientais foi à amoxicilina-ácido clavulânico. Não houve diferença estatística de resitência
antimicrobiana entre as catogorias de E. coli, no entanto, a EAEC e EPEC apresentaram a
maior diversidade de fenótipos de resistência. Os fenótipos de resistência mais frequentes
foram AMP-STX-TE (24,32%), AM-STX (21,62%) e STX-TE (16,22%). A análise das
relações genéticas revelou uma ampla variabilidade dos perfis de macrorrestrição entre todas
as categorias de E. coli diarreiogênicas, tanto as de origem humana quanto ambiental, mesmo
assim, foi possível a identificação de clones de origem humana que estavam geograficamente
relacionados. Uma vez que as E. coli diarreiogênicas, puderam ser identificadas entre
amostras humanas e ambientais, sendo a maioria resistente, sugere-se que as E. coli isoladas
no Pará, podem apresentar potencial patogênico para o desenvolvimento de doença
gastrointestinal e, que a água de rio, pode servir de fonte de infecção para população.
Palavras chaves: E. coli diarreiogênicas, humana, ambiente, resistência e PFGE.
13
ABSTRACT
Escherichia coli is a commensal enterobacteria from the intestinal tract of humans and
animals and their presence in the aquatic environment is indicative of fecal contamination.
The presence of certain virulence genes make these pathogenic bacteria be classified into
diarrheogenic categories: enteropathogenic E.coli typical (EPECt) or atypical (EPECa),
enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), and. enterohemorrhagic E. coli
(EHEC) or E. coli Shiga toxin-producing (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC). In
order to know the frequency, antimicrobial resistance and between these categories in the Pará
State, we investigated virulence genes by multiplex and/or monoplex-PCR among 410 E. coli
strains, among which, 344 were of environmental origin and 66 of human origin.
Antimicrobial resistance was evaluated by the disk diffusion and the genetic relationship by
PFGE. The six categories of diarrheagenic E. coli have been identified and the most common
were the ones from human origin (13.36%) than the environmental ones (1.74%). The ETEC,
EAEC and atypical EPEC were frequent between the two sources. The EIEC and STEC were
exclusive of human origin, while the typical EPEC was exclusive of environmental origin.
The highest resistance was observed to trimethoprim-sulfamethoxazole (44.44%), ampicillin
(40.28%) and tetracyclin (33.33%) and the only difference in resistance between the human
and environmental samples was to amoxicillin-clavulanic acid. There was no statistical
difference in antimicrobial resistance among E. coli categories, however, EAEC and EPEC
showed the highest diversity of resistance phenotypes. The most frequent resistance
phenotypes were AMP-STX-TE (24.32%), AM-STX (21.62%) and STX-TE (16.22%). The
genetic relationships analysis revealed a wide variability of macrorestriction profiles among
all categories of diarrheagenic E. coli, both of human origin as of environmental one, anyway,
it was possible to identify clones of human origin that were geographically related. Since
diarrheagenic E. coli, have been identified among human and environmental samples, being
the majority resistant, it is suggested that the E. coli strains isolated in Pará, may have
pathogenic potential for the development of gastrointestinal disease, and that river water, can
serve as source of infection for population.
Keywords: diarrhoeagenic E. coli, human, environment, resistance, PFGE.
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DE Escherichia coli
A
Escherichia
coli
é
um
bacilo
Gram-negativo
pertencente
à
família
Enterobacteriaceae que coloniza o trato gastrointestinal de humanos e animais, mede 1,1 - 1,5
m de diâmetro por 2,0 - 6,0 m de comprimento, são móveis por flagelos peritríquios ou
imóveis e apresentam metabolismo respiratório ou fermentativo com bom crescimento à
temperatura de 37ºC. As seguintes características bioquímicas são utilizadas para sua
identificação: fermentam a glicose e outros carboidratos com a formação de ácido e gás; são
oxidase-negativa, catalase-positiva, vermelho de metila e indol positivos, Voges-Proskauer e
citrato de Simmons negativos, não produzem H2S e não realizam a hidrólise da uréia; a
maioria das cepas fermenta a L-arabinose, maltose, D-manitol, D-manose, L-raminose, Dxilose (Winn Jr et al., 2008).
Além das cepas de E. coli comensais, que fazem parte da microbiota do intestino
humano, existem cepas que podem ser patogênicas e causar doença, produzindo diferentes
quadros clínicos. As categorias que causam infecção intestinal são coletivamente chamadas de
E. coli diarreiogênicas com distintos mecanismos de patogenicidade; e as associadas às
infecções extraintestinais (urinárias, meningites, septicemias e outras) são conhecidas como
EXPEC (Extraintestinal Pathogenic E. coli) (Martinez & Trabulsi, 2008).
1.2.
CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS DE Escherichia coli
A E. coli K-12 é considerada uma E. coli comensal e devido sua ampla utilização
como modelo na biologia molecular e biotecnologia teve seu genoma primeiramente descrito.
O genoma da E. coli K-12 é constituído por uma sequência de DNA de fita dupla possuindo
4.639.221 pares de bases, sendo 87,8% dos genes codificantes para proteínas, 0,8% para RNA
estáveis, 0,7% consiste de repetições não-codificantes e, aproximadamente, 11% são
destinados para regulação e outras funções. O genoma também contém sequência de
elementos de inserção (IS), fragmentos de fagos, e muitas outras sequências de composição
incomum, indicando uma elevada plasticidade genômica através de transferência horizontal
de genes (Blattner et al., 1997).
15
As categorias patogênicas de E. coli são definidas pela presença ou ausência de
determinados segmentos de DNA codificantes de fatores de virulência que, em sua maioria
são adquiridos através de eventos de transferências horizontais de genes intra ou extra espécie
(Bielaszewska et al., 2007). Devido à aquisição de segmentos específicos como as ilhas de
patogenicidade e outros elementos genéticos móveis, os genomas de E. coli patogênicas
podem ser de até 1Mb maiores do que as comensais e pode codificar cerca de 5.000 genes
(Croxen & Finlay, 2010).
1.3.
RECONHECIMENTO DE E. coli COMO PATÓGENO GASTROINTESTINAL
A Escherichia coli passou a ser reconhecida como patógeno intestinal primário após a
ocorrência de um surto de diarreia infantil relatado por Bray & Beavan (1948), no qual foi
isolada uma cepa particular de E. coli, identificada como Bacterium coli neopolitanum.
A partir desse relato, cada amostra epidêmica de E. coli identificada, recebia uma
designação de seus descobridores. Para padronizar a nomenclatura da E. coli, um
bacteriologista dinamarquês, Fritz Kauffmann, adaptou o esquema de sorotipagem
desenvolvido para Salmonella enterica, para o uso com E. coli (Kauffmann, 1954; Ewing,
1986). De acordo com este esquema, a E. coli é sorotipada com base na presença dos
antígenos somáticos (antígeno O), flagelares (antígeno H) e capsulares (antígeno K) (Nataro
& Kaper, 1998).
A utilidade imediata desse esquema foi demonstrada pelo fato de que várias cepas de
E. coli, que haviam sido isoladas em outros surtos de diarreia entre 1920 e 1940, pertenciam,
surpreendentemente, a um pequeno número de sorogrupos O, em particular O111 e O55.
Entretanto, nem todas as E. coli podem ser tipadas dessa forma, devido alguns isolados
autoaglutinarem e serem chamados “rugosos” (O rough ou OR) ou por não poderem ser
tipados pelos antissoros existentes (O non-typable ou ONT). São conhecidos mais de 180
sorogrupos O e mais de 60 sorogrupos H, sendo possíveis mais de 10.000 combinações entre
estes antígenos (Robins-Browne & Hartland, 2002). O antígeno O é responsável pela
designação do sorogrupo, enquanto que a determinação do antígeno somático e flagelar (O:H)
indica o sorotipo (Angeles, 2002).
De acordo com Nataro e Kaper (1998), as Escherichia coli podem ser classificada em
três grupos: comensais, patogênicas intestinais e extraintestinais. Entre as patogênicas
intestinais são identificadas seis diferentes categorias conhecidas como E. coli diarreiogênicas
16
descobertas ao longo do tempo: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica
(ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli
produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente
difusa (DAEC).
A primeira categoria a ser reconhecida foi a E. coli enteropatogênica (EPEC), na
década de 1940 (Bray & Beavan 1948). Com o passar dos anos, as infecções por esta
categoria em países industrializados tornaram-se pouco frequentes e o interesse nesta bactéria
também. No final da década de 1960, observou-se que algumas variedades de E. coli
causavam diarreia semelhante à cólera, produziam enterotoxinas termolábil e termoestável e
foram nomeadas como E. coli enterotoxigênica (ETEC) (Sack et al., 1971).
Na década de 1970, foi observado que um grupo de E. coli era capaz de causar
disenteria bacilar e ceratoconjuntivite em cobaias pelo teste de Sereny, uma característica
encontrada até então no gênero Shigella. Essas amostras foram inicialmente classificadas
como Shigella e mais tarde identificadas como E. coli enteroinvasora (EIEC) (Dupont et al.,
1971).
No início de 1980, dois surtos de diarreia associados à colite hemorrágica e síndrome
hemolítica urêmica ocorreram na América do Norte (Estados Unidos e Canadá - 1982) devido
o consumo de sanduíches com carne bovina mal passada. Durante a investigação destes surtos
foi isolado das fezes dos pacientes um sorotipo incomum de E. coli, identificado como
O157:H7, produtor de citotoxinas e denominado de E. coli entero-hemorrágica (EHEC) (Riley
et al., 1983; Karmali et al., 1983).
Essas novas descobertas evidenciaram o potencial patogênico das Escherichia coli e
estimularam o interesse em E. coli diarreiogênicas, bem como a investigação de suas
propriedades patogênicas. Com a introdução de novos testes de investigação de
patogenicidade, como a adesão em cultura de células e inoculação em alças intestinais de
coelho, novas categorias foram sendo descritas como a E. coli enteroagregativa (EAEC) (Vial
et al., 1988; Cravioto et al., 1991).
1.4.
Escherichia coli DIARREIOGÊNICAS
De acordo com Nataro & Kaper (1998), as E. coli diarreiogênicas representam
importante causa de diarreia endêmica e epidêmica no mundo. No entanto, a frequência
17
desses patógenos pode ser subestimada devido sua detecção exigir métodos diagnósticos
específicos, que não são utilizados na prática clínica.
A identificação de E. coli diarreiogênicas requer sua diferenciação das espécies não
patogênicas da microbiota normal (Toma et al., 2003). As E. coli que causam diarreia são
classificadas em categorias patogênicas de acordo com fatores de virulência específicos, que
são codificados por cromossomos, plasmídeos e DNA de bacteriófagos. Esses fatores de
virulência fornecem a cada categoria uma capacidade de causar síndrome clínica com
características epidemiológicas e patológicas distintas (Browne et al., 2004).
As seis categorias diarreiogênicas de E. coli são diferenciadas com base nos seus
mecanismos de patogenicidade em: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica
(ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC) ou E. coli
produtora da toxina de Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli aderente
difusa (DAEC) que atuam de acordo com a presença de fatores de virulência como adesinas
fimbriais e afimbriais, toxinas e invasinas (Nataro & Kaper, 1998; Teng et al., 2004; Nguyen
et al., 2005). Destas, as principais categorias associadas à diarreia aguda em menores de 5
anos são EPEC e ETEC (Souza et al., 2002, Ochoa et al., 2011), mas recentemente, a
ocorrência de EAEC associada à diarreia vem sendo investigada e evidenciada nas regiões
Sudeste e Nordeste do Brasil (Spano et al., 2008; Regua-Mangia et al., 2009a; Moreno et al.,
2010).
Percebe-se que a ocorrência das E. coli é um processo dinâmico e a cada época uma
modificação de prevalência ou surgimento de uma nova categoria pode ser observada. Um
exemplo foi o que ocorreu com a E. coli enteropatogênica típica (EPEC-t), anteriormente
associada às diarreias infantis. Atualmente, há poucos relatos dessa categoria (EPEC-t), e a
mesma vem sendo substituída pelas E. coli enteropatogênica atípica (EPEC-a) e E. coli
enteroagregativa (EAEC) (Souza et al., 2002; Gomes et al., 2004; Rodrigues et al., 2004;
Araújo et al., 2007; Moreno et al., 2010). Estudos epidemiológicos, sorológicos e moleculares
desenvolvidos com EPEC atípica, sugerem que esta pode ser uma nova categoria e não um
subgrupo de EPEC com ausência do plasmídeo EAF (Schmidt, 2010). Outro exemplo foi a
descoberta de uma nova variante híbrida de E. coli (STEC-EAEC), sorotipo O104:H4,
relacionada a um surto de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica, ocorrido na
Alemanha e em outros países da Europa com relato de vários óbitos (Kim et al., 2011).
18
1.4.1. E. coli enteropatogênica – EPEC
A primeira categoria de E. coli diarreiogênica foi a EPEC, identificada na década de
1940. Esta categoria foi considerada, em países em desenvolvimento, uma importante causa
de diarreia aguda e eventual diarreia persistente em crianças menores de 5 anos, com
prevalência em crianças menores de 2 anos de idade (Albert, 1996; Gomes et al., 1991) e
responsáveis por surtos de diarreia hospitalar em berçários no período de inverno (Smith et
al., 1996).
O quadro clínico causado por EPEC se manifesta com diarreia aguda, que pode ser
leve ou grave, acompanhada de febre e vômito (Fagundes-Neto & Scaletsky, 2000; Angeles,
2002).
Em 1995, durante o 2º Simpósio Internacional sobre EPEC, realizado em São Paulo,
foi reconhecida a existência de duas subcategorias de EPEC denominadas EPEC típica e
EPEC atípica. Nesse simpósio ficou definido que EPEC típica de origem humana é aquela que
possui um gene cromossômico eae (E. coli attachment-effacement) e um plasmídeo de
virulência conhecido como EAF (EPEC adherence factor) que codifica a fímbria BFP
(Bundle Forming Pilus), responsável pelo padrão de aderência em células epiteliais; enquanto
que EPEC atípica é aquela que não possui o plasmídeo EAF ou fímbria BFP (Kaper, 1996;
Trabulsi et al., 2002).
Uma ampla definição de EPEC pode não requerer a presença do plasmídeo EAF ou
fímbria BFP, mas apenas a habilidade de causar a lesão A/E (attaching and effacing), ou seja,
presença de eae, com ausência de Stx (Toxina de Shiga) (Kaper, 1996).
Em estudos com voluntários, verificou-se que algumas amostras destituídas de EAF
causavam diarreia de menor intensidade nos pacientes do que as EAF-positivas (Nataro &
Kaper, 1998). O mecanismo central da patogênese de EPEC é a lesão A/E, habilidade também
presente em E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) e outras espécies bacterianas. O
mecanismo pelo qual EPEC típicas promovem diarreia é complexo e provavelmente resulta
dos efeitos de adesão na célula epitelial que inclui alterações na estrutura da membrana e na
secreção de íons (Vidal et al., 2007).
De acordo com Frankel et al. (1996), Nataro & Kaper (1998) e Vidal et al. (2007), o
processo enteropatogênico ocorre em três estágios:
1º) Aderência localizada: as EPEC típicas produzem um padrão de aderência
característico em culturas de células Hep-2 (células epiteliais de laringe humana) e HeLa
(células epitelial de cervix humano), chamado de aderência localizada. Neste padrão, a
19
bactéria adere em pontos localizados da membrana plasmática dos enterócitos formando
microcolônias compactas (Figura 1). Este fenômeno está associado com a presença da fímbria
BFP que é codificada pelo plasmídeo EAF. Cleary et al. (2004) demonstraram que além do
papel de interação entre as EPEC, a fímbria BFP é o fator de fixação inicial predominante,
entretanto, na ausência de BFP (Figura 2), os filamentos EspA (EPEC secreted protein) são
capazes de promover uma fixação bacteriana inicial, porém de menor eficiência;
Figura 1- Padrão de aderência
localizada de EPEC em cultura
de células HeLa (Hernades et al.,
2009).
Figura 2- Fímbria BFP de EPEC
(Nataro & Kaper, 1998).
2º) Transdução de sinais: a aderência de EPEC à célula epitelial induz uma variedade
de rotas de sinalização na célula eucariótica. Os genes responsáveis pela ativação da
transdução de sinais são codificados em uma ilha de patogenicidade chamada de “Locus of
enterocyte effacement” ou região LEE, que codifica um Sistema de Secreção do Tipo III,
secretor de várias proteínas como as Esp (EPEC secreted proteins) e receptor Tir
(Translocated intimin receptor). Nessa etapa ocorrem alguns eventos como fosforilação de
proteínas com ativação da tirosina quinase e aumento da concentração de Ca2+ intracelular
que inibe a absorção de Na+ e Cl-;
3º) Aderência íntima: a aderência íntima à célula epitelial é mediada pela ação da
intimina (IntEPEC) que é uma proteína de membrana codificada pelo gene cromossômico eae
(E. coli attachment-effacement). Abaixo da região de aderência ocorre a condensação dos
filamentos de actina das microvilosidades dos enterócitos que resulta na formação de
estruturas semelhantes a pedestais (Figura 3). Este conjunto de modificações representa a base
da lesão A/E (attaching and effacing).
20
Figura 3 - Estrutura em forma de pedestal
vista na lesão A/E (attaching and
effacing) de EPEC (Kaper et al., 2004).
A classificação de EPEC em típicas e atípicas tem importante implicação na
patogenicidade e desfecho da diarreia, antes não totalmente apreciada (Trabulsi et al., 2002).
As EPEC típicas (EPEC-t) são isoladas somente de humanos, enquanto as EPEC atípicas
(EPEC-a) são encontradas em humanos e em vários animais como gado bovino, bubalino,
equinos, aves e animais domésticos como cães e gatos (Ishii et al., 2007; Morato et al., 2009;
Moura, 2009; Chase-Topping et al., 2012). Por muitos anos, as EPEC típicas foram associadas
à diarreia infantil, mas têm-se observado, frequentemente, a redução desta subcategoria e um
aumento relativo do isolamento de EPEC atípicas (Souza et al., 2002; Ghosh & Ali, 2010;
Moreno et al., 2010) inclusive como única categoria entre as E. coli diarreiogênicas associadas
aos casos diarreicos (Ferrer, 2007).
A alta prevalência de EPEC-atípica em pacientes com diarreia comparada aos
indivíduos controles (sem diarreia) em muitos países e em algumas regiões do Brasil e, a
ocorrência de surtos fortemente associados a esta categoria, faz com que as EPEC-a sejam
consideradas como verdadeiros patógenos intestinais (Hernandes et al., 2009; Sousa, 2010). De
acordo com Scaletsky et al. (2009), há evidências que mesmo entre as EPEC atípicas ocorra
subgrupos patogênicos relacionados à doença diarreica.
Os principais sorotipos de EPEC encontrados são: O55:[H6], O86:H34, O111:[H2],
O114:H2, O119:[H6], O127:H6, O142:H6, O142:H34 (típicas) e O26:H[11], O55:[H7],
O55:H34, O86:H8, O111ac:[H8], O111:[H9], O111:H25, O119:H2, O125ac:H6, O128:H2
(atípicas) (Trabulsi et al., 2002). Várias EPEC atípicas de humanos e animais, que não
21
pertencem aos sorogrupos clássicos, tem sido identificadas (Blanco et al., 2005; Bando et al.,
2007).
1.4.2. E. coli enterotoxigênica – ETEC
A segunda principal categoria de E. coli a ser associada com diarreia foi a ETEC, que
emergiu no final dos anos 60 e início dos anos 70, devido principalmente ao trabalho
desenvolvido por Sack et al. (1971) em Calcutá. As cepas de ETEC estão associadas à causa
de diarreia em crianças com maior incidência na faixa etária de 2 a 3 anos (Albert et al., 1995)
e a diarreia dos viajantes de características semelhante à cólera (Black, 1990; Nataro et al.,
2006).
Estão distribuídas numa grande variedade de sorogrupos, que abrangem pelo menos 78
grupos O e 34 H. Os sorogrupos “O” mais comuns são: O6, O8, O15, O20, O25, O27, O49,
O63, O78, O128, O148, O153, O159, O167 e O169, e os grupos O e H mais fortemente
associados: O8:H9, O78:H12 e O25:H42 (Wolf, 1997; Nataro et al., 2006).
Investigações epidemiológicas têm implicado a água e os alimentos contaminados,
com dose infectante de 108 UFC/mL (unidades formadoras de colônia), como veículos
comuns de transmissão de ETEC sendo, a diarreia dos viajantes, diretamente relacionada à
contaminação de alimentos e água (Mattila, 1994; Angeles, 2002). O sintoma predominante é
a diarreia aquosa profusa, acompanhada de câimbras abdominais leves, vômitos e febre; esta
diarreia pode ser leve e autolimitada, mas em alguns casos pode ser grave (Angeles, 2002).
Em contraste com a patogenia da EPEC, o mecanismo pelo qual a ETEC promove
diarreia se deve a aderência na mucosa intestinal e produção de enterotoxinas.
A aderência à mucosa intestinal está relacionada às adesinas conhecidas como Pili tipo
1 e CFA I e II (colonization factor antigens) também chamados de antígenos CS (coli surface
antigens), sendo ambos considerados como os fatores de virulência mais importantes para a
colonização da mucosa intestinal por ETEC. Os genes codificadores dos CFA são encontrados
em plasmídeos que também podem conter informações genéticas para as enterotoxinas. A
investigação de CFA para a detecção de ETEC é pouco prática devido ao seu grande número
e heterogeneidade (Nataro & Kaper, 1998).
A partir da colonização inicia-se a elaboração de enterotoxinas. As cepas de ETEC
produzem dois tipos de enterotoxinas: toxinas termolábeis LT – I e LT – II (heat-labile toxin)
e toxinas termoestáveis STa e STb (heat-stable toxin) (Nataro & Kaper, 1998).
22
A LT – I é expressa por E. coli que são patogênicas ao homem e animais, enquanto
que LT-II é encontrada primariamente em amostras de animais (Costa et al., 2006). LT-I é
uma toxina oligomérica, antigenicamente semelhante à toxina produzida por V. cholerae,
possuindo uma subunidade A e cinco subunidades B. O mecanismo de patogenicidade de LTI consiste na ligação das subunidades B ao mesmo receptor da toxina colérica (gangliosídio
GM1), permitindo a entrada da subunidade A. O principal alvo da subunidade A é uma
proteína de membrana (Gs) que regula a adenilato-ciclase; como efeito final, tem-se o
aumento de AMPc (monofostato de adenosina cíclico), com ativação dos íons sódio, cloreto,
bicarbonato de potássio e água da célula para luz intestinal, promovendo assim a diarreia
aquosa (Nataro & Kaper, 1998).
Há duas classes distintas de ST, a STa (também chamada de ST-I) e STb, que diferem
em estrutura e mecanismo de ação. Existem algumas variantes de STa, a STp (ou STIa) e STh
(ou STIb). A STp ou STIa é isolada de humanos e animais, a STh ou STIb é encontrada
predominantemente em humanos (Nataro & Kaper, 1998). A classe STb está associada
primariamente a cepas ETEC isoladas de suínos, entretanto, algumas cepas ETEC
expressando STb, de origem humana, foram observadas (Trabulsi et al., 2002; Kaper et al.,
2004). De modo semelhante, a enterotoxina STa liga-se à guanilato-ciclase, resultando em
elevação dos níveis de monofosfato de guanosina cíclico e hipersecreção subsequente de
líquidos (Nataro & Kaper, 1998).
1.4.3. E. coli enteroinvasora – EIEC
Em 1971, DuPont et al. (1971) descreveram certas amostras de E. coli que causavam
doença diarreica invasiva ou disenteria em voluntários. Estas amostras, de sorotipos distintos
de ETEC e EPEC, eram extremamente semelhantes à Shigella. Hoje, há evidências de que
EIEC e Shigella spp estão relacionadas genética e bioquimicamente (Angeles, 2002), no
entanto, há diferenças no processo patogênico e na resposta imunológica do hospedeiro que
evidenciam que a diarreia causada por EIEC é mais branda que a provocada por Shigella
(Ferreira et al., 2012).
As EIEC são frequentemente lactose-negativas, lisina descarboxilase-negativa,
imóveis, com exceção do sorotipo O124:H30 e produzem uma doença semelhante à shigelose
(Gibotti et al., 2004).
A doença é mais comumente descrita em surtos do que em casos esporádicos (Gordillo
et al., 1992), afetam, principalmente, crianças acima de dois anos de idade e adultos de baixa
23
renda em países em desenvolvimento, causando uma diarreia aguda aquosa que precede a
disenteria bacilar (fezes contendo muco, sangue e leucócitos), acompanhada de dor
abdominal, vômito, tenesmo e febre (Taylor et al., 1988, Nataro & Kaper, 1998). No Brasil,
há relatos de que na cidade de São Paulo a frequência com que esta categoria está associada a
diarreia varia de 2,3 a 15,8% dependendo da população de estudo e de que em outras cidades
essa frequência é mais baixa (Toledo & Trabulsi, 1990, Ferreira et al., 2012).
O mecanismo patogênico inclui a capacidade de invadir os enterócitos da mucosa do
cólon e proliferar no interior dessas células, resultando em processo inflamatório, morte
celular e propagação para células vizinhas; a produção de enterotoxinas é outro fator
considerado de importância para patogênese da infecção por EIEC, pois são responsáveis pela
secreção de água e eletrólitos no intestino delgado, promovendo assim, a fase de diarreia
aquosa (Nataro & Kaper, 1998).
Um processo complexo de colonização e permanência da EIEC nas células intestinais
envolve múltiplos genes, tanto cromossomais como plasmidiais. Os genes necessários para a
invasão se encontram em um plasmídeo de 140 MDa chamado pInv (plasmídeo de invasão),
que codifica proteínas invasivas, como as Ipa (invasion plasmid antigen) e outras que estão
envolvidas no processo patogênico (Angeles, 2002).
O conjunto do gene ipa codifica quatro proteínas (IpaA, IpaB, IpaC e IpaD) sendo um
dos loci essencial à invasão e está próximo a uma região do plasmídeo onde ocorrem deleções
espontâneas. A perda do plasmídeo de invasão ou deleção espontânea de uma pequena região
contendo genes ipa ocorre com relativa frequência (1 em 103 a 104 células), tornando a
bactéria não invasiva, e portanto, avirulenta. O gene ipaH codificador de um polipeptídeo
semelhante a proteína IpaB, mas distinto imunológica e geneticamente, está presente em
múltiplas cópias, tanto em plasmídeo quanto no cromossomo, e não faz parte do conjunto dos
genes ipaBCDA. Portanto, a pesquisa de ipaH é pouco comprometida pela perda do plasmídeo
e/ou eventos de deleção seletiva do plasmídeo de invasão, sendo assim, mais sensível para
diagnóstico laboratorial (Venkatesan et al., 1989).
Os principais sorotipos desta categoria são: O28ac:Nomotile (NM - não móvel),
O29:NM, O112ac:NM, O121:NM, O124:NM, O124:H30, O136:NM, O143:NM, O144:NM,
O152:NM, O164:NM e O167:NM. O número de antígenos O associados à EIEC são
limitados, sendo que três deles estão presentes em Shigella (O112ac, O124 e O152) (Gibotti
et al., 2004).
24
1.4.4. E. coli produtora da Toxina de Shiga – STEC
Em 1982, um surto de colite hemorrágica, ocorrido nos Estados Unidos, chamou
atenção para uma síndrome clínica incomum de doença diarreica e para um novo patógeno
bacteriano entérico. O agente etiológico se tratava da E. coli O157:H7, um sorotipo não
reconhecido, anteriormente, como causador de doença diarreica em humanos (Riley et
al.,1983).
As STEC são reconhecidas como importante causa de diarreia aquosa, sanguinolenta
com desenvolvimento de colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (HUS – hemolytic
uremic syndrome) em todo o mundo, causadoras de surtos tanto em países desenvolvidos
como em países em desenvolvimento (Morabito et al., 1998; Gomes et al., 2011). A maioria
dos casos e dos surtos tem sido atribuída ao consumo de carne bovina e suína (Stephan &
Schumacher, 2001) e outras fontes como frutas, saladas, sucos, iogurte e água, quando
contaminados por fezes de animais infectados (Feng, 1995; Costa et al., 2006; Von Sydow et
al., 2006).
Diferentes quadros clínicos são observados nas infecções por STEC: quadro de
diarreia cujo período de incubação é de 3-4 dias e perduram por 5-10 dias, são acompanhados
por câimbras e dores abdominais, febre baixa e vômito em 30-50% dos casos; o quadro de
síndrome hemolítica urêmica é caracterizado por manifestações de insuficiência renal aguda,
trombocitopenia e anemia hemolítica microangiopática (López et al., 2000).
As manifestações diarreicas promovidas por STEC são atribuídas a duas enterotoxinas
semelhantes à toxina de Shiga, denominadas SLT-I e SLT-II (Toxina Shiga Like), também
conhecidas como Verotoxinas (VT-1 e VT-2) ou toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2). A Stx-1 é
idêntica à toxina de Shiga produzida por Shigella dysenteriae tipo 1 e a Stx-2 possui 60% de
homologia; como esta, ambas possuem cinco subunidades B e uma subunidade A, estando a
subunidade B ligada a um glicolipídio específico na célula hospedeira. Uma vez internalizada,
a subunidade A é clivada em duas moléculas, e o fragmento A1, liga-se a um ácido
ribonucléico ribossomal 28S (rRNA) e interrompe a síntese protéica. A síndrome hemolítica
urêmica tem sido preferencialmente associada à produção de Stx-2, que destrói seletivamente
as células endoteliais renais (Levine, 1987; Browne, 2005).
Stx-1 e Stx-2 são codificadas por genes encontrados em dois distintos bacteriófagos,
que são integrados ao cromossomo do hospedeiro (Browne, 2005). Outros potenciais fatores
de virulência são codificados pelo cromossomo e um plasmídeo de 60 MDa encontrado em
todas as amostras do sorotipo O157:H7, dentre os quais podemos citar: proteína intimina,
25
enterohemolisina citolítica (Ehly- Enterohaemolysin), proteínas séricas e uma catalase (Nataro
& Kaper, 1998).
Trabalhos realizados em alguns países da América do Sul (Chile e Argentina) citam
além do sorotipo O157:H7, outros sorogrupos envolvidos nos quadros de HUS (Síndrome
Hemolítica Urêmica): O11:H- (H- - antígeno flagelar ausente), O21:H- , O26:H-, O26:H11,
O75:H- e O87:H- (Morabito et al., 1998; López et al., 2000; Browne, 2005). O sorogrupo
O157, antes característico de EHEC, foi descrito por Blank et al. (2003) no Brasil em
amostras de EPEC, o que evidencia o fato da não correlação de sorogrupos com determinada
categoria patogênica. Segundo Schmidt (2010), outros sorogrupos como O111, O103 e O145
tem sido reconhecidos como importante causa de colite hemorrágica e HUS.
Dentre os determinantes de virulência acessórios das amostras O157:H7 e O26:H11
temos a ilha de patogenicidade conhecida como LEE (Locus of enterocyte effacement). Esta
ilha consiste num agrupamento de genes associados à virulência incluindo eae, que codifica a
adesina intimina (como em EPEC) que é utilizada como alvo em alguns ensaios diagnósticos.
A ilha de patogenicidade LEE foi primeiramente identificada em EPEC (que causa diarreia
em crianças, mas não produz Stx ou causa HUS) (Browne, 2005).
Em estudos de evolução de E. coli patogênicas verificou-se que, na análise
comparativa de sequências completas do genoma de amostras E. coli não patogênicas e EHEC
O157:H7, estas bactérias compartilham um arcabouço genético comum com ilhas de DNA
interceptadas. Há evidências de que muitos fatores podem ter sido adquiridos de outras
bactérias por transferência horizontal de gene (por exemplo, através dos bacteriófagos,
transposons e plasmídeos). Nesse contexto, é preciso lembrar que a evolução bacteriana é um
processo que pode conduzir indubitavelmente a emergência de outro clone patogênico de E.
coli bem sucedido no futuro (Schmidt, 2010).
1.4.5. E. coli enteroagregativa – EAEC
Pesquisadores em 1987, ao examinarem amostras de E. coli isoladas em um estudo
epidemiológico sobre a etiologia da diarreia no Chile encontraram amostras que apresentavam
um padrão exclusivo de aderência, semelhante a empilhados de tijolos, que foi chamada
aderência agregativa (AA) (Cravioto et al., 1991) (Figura 4).
As cepas de E. coli que se aderem às células de cultura de Hep-2 (célula epitelial de
laringe humana) ou HeLa (célula epitelial de cérvix humano) são classificadas em três
diferentes categorias de acordo com o tipo de aderência: aderência localizada (AL), aderência
26
agregativa (AA) e aderência difusa (AD). As E. coli de aderência agregativa são denominadas
Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) (Nataro et al., 1987).
Figura 4- Padrão de aderência localizada de
EAEC em cultura de células HeLa (Hernandes et
al., 2009)
As EAEC são consideradas como agente causador de diarreia aguda e persistente em
crianças e adultos de países em desenvolvimento como Peru e Brasil (Ochoa et al., 2011;
Souza et al., 2002; Moreno et al., 2010) e desenvolvidos como Estados Unidos e Reino Unido
(Navarro-Garcia & Elias, 2011). Alguns surtos de gastroenterites foram relatados no Japão
envolvendo crianças em idade escolar e na Iuguslávia entre recém-nascidos de 2 a 11 dias de
idade, internados em unidade neonatal (Itoh et al., 1997). A Escherichia coli enteroagregativa
(EAEC) é considerada uma categoria emergente de E. coli diarreiogênica com distribuição e
importância mundial (Okhuysen & DuPont, 2010).
De acordo com Chan et al. (1994), alguns sintomas como vômito e febre foram
relacionados aos casos de diarreia causada por EAEC.
O mecanismo pelo qual a EAEC causa diarreia não esta bem definido, porém vários
fatores de virulência vêm sendo identificados: fímbria de aderência agregativa – I e II (AAF I
e II) responsáveis pela aderência à mucosa intestinal (Nataro et al., 1992), hemolisina e a
produção de uma toxina termo estável chamada EAST, semelhante a STa produzida pelas
cepas de ETEC e outra toxina codificada por plasmídeos conhecida como Pet (plasmidencoded toxin) (Garcia et al., 1999), além desses fatores, fazem parte da patogênese desta
categoria a produção de biofilme e a inflamação da mucosa intestinal (Navarro-Garcia &
Elias, 2011).
27
O diagnóstico padrão para classificação de EAEC é a observação da aderência
agregativa (AA) em cultura de células HEp-2, no entanto, a investigação do gene pCVD432
(plasmídeo de aderência agregativa - pAA) ou a presença do gene aggR (ativador
transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) são utilizadas como marcador
molecular em estudos epidemiológicos que buscam esclarecer a associação de EAEC às
doenças diarreicas (Baudry et al., 1990; Schmidt et al., 1995; Jenkins et al., 2006).
Vários estudos sugerem que as cepas de EAEC são genética e fenotipicamente
heterogêneas (Nataro et al., 1995; Czeczulin et al., 1999).
1.5.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico laboratorial das infecções diarreicas é realizado pela identificação direta
ou indireta do agente etiológico. No caso das infecções de origem bacteriana, a maioria dos
diagnósticos é realizada pelo método convencional, que consiste no isolamento do agente
bacteriano das fezes e posterior identificação bioquímica e sorológica (Winn Jr et al., 2008;
Martinez & Trabulsi, 2008).
Para o isolamento de bactérias da família Enterobacteriaceae, especificamente de E.
coli, as amostras fecais são semeadas em meios seletivos indicadores como o ágar Mac
Conkey – MC e/ou ágar EMB (Eosina Azul de Metileno); após incubação, as colônias
suspeitas são submetidas aos meios de triagem Triple Sugar Iron Agar – TSI e a
caracterização bioquímica realizada por meio de testes bioquímicos convencionais (Winn Jr et
al., 2008) ou em aparelhos semi-automatizados (Mini API- bioMèrieux) ou automatizados
(Vitek II-bioMèrieux). Após identificação do gênero ou espécie bacteriana, a amostra é
submetida à caracterização sorológica através da técnica de soroaglutinação que pode ser
realizada em lâminas ou tubos, segundo recomendações de Ewing (1986) e Kauffmann
(1954).
O método convencional utilizado na identificação da maioria dos enteropatógenos
bacterianos não é suficiente para o diagnóstico das E. coli diarreiogênicas. Um estudo mais
amplo envolvendo aspectos moleculares, como a pesquisa de genes codificantes de fatores de
virulência e experimentos “in vivo” como os testes de aderência e invasão à cultura de
células, são necessários para a identificação destas categorias (Nataro et al., 1987; Cravioto et
al., 1991).
28
A detecção dos genes codificantes de fatores de virulência por meio da Reação em
Cadeia Mediada pela Polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) está sendo amplamente
utilizada para a diferenciação de E. coli patogênicas das comensais e classificação das
diferentes categorias diarreiogênicas (Frankel et al., 1989; Wang et al., 1997; Paton & Paton,
1998; Pennisi, 1999; Phantoumath et al., 2003).
Os principais fatores de virulência utilizados na pesquisa molecular para diferenciação
entre as E. coli diarreiogências são: a fímbria BFP (Bundle-forming pilus) codificada pelo gene
bfpA localizado no plasmídeo EAF (EPEC Adherence Factor) e a proteína intimina codificada
pelo gene cromossomal eaeA (E. coli attachment-effacement) para identificação de EPEC; a
proteína de invasão codificadas pelo plasmídeo Ipa (invasion plasmid antigen) para
identificação de EIEC; as enterotoxinas termolábil (LT) e a termoestável (ST) para
identificação de ETEC e toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2) codificadas pelos identificação de
STEC (Campos et al., 2004; Franzolin et al., 2005). Para investigação de EAEC pesquisa-se os
genes pCVD432 (plasmídeo de aderência agregativa - pAA) ou gene aggR (ativador
transcricional das fímbrias de aderência agregativa - AAF) (Jenkins et al., 2006).
Apesar da técnica de PCR convencional ser utilizada rotineiramente para a pesquisa de
E. coli diarreiogênicas, a investigação dos isolados bacterianos requer um grande número de
reações individuais para a detecção de vários fatores de virulência (Kimata et al., 2005). Para
reduzir o número de testes necessários para a identificação dessas E. coli, vários sistemas de
PCR multiplex, para a amplificação simultânea de dois ou mais loci em uma única reação,
têm sido desenvolvidos. Estes sistemas de detecção múltipla representam apropriada solução
para laboriosa identificação de categorias diarreiogênicas de E. coli, além de se mostrar como
uma tecnologia mais eficiente e econômica (Saucedo et al., 2003).
Usualmente mais de uma PCR multiplex é requerida (Toma et al., 2003, Costa et al.,
2010), no entanto, uma única PCR multiplex já foi utilizada para determinação simultânea de
cinco categorias diarreiogênicas de Escherichia coli (Aranda et al., 2007; Sousa, 2010).
1.6.
RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
Ao longo das últimas quatro décadas, desde a descoberta das penicilinas naturais, o
avanço da indústria farmacêutica levou ao surgimento de diversos antimicrobianos, com
espectro de ação cada vez mais amplo, porém não houve, paralelamente, a preocupação com
as consequências futuras de tal desenvolvimento. Hoje, é notório o uso inadequado destes
29
antimicrobianos tendo como principal consequência a emergência de micro-organismos
multirresistentes (Martins et al., 2000).
Para que os antimicrobianos sejam utilizados adequadamente, conhecimentos
específicos relacionados a estes, às características epidemiológicas dos pacientes e às
infecções em questão, devem ser avaliados. A exposição aos antimicrobianos pode
desencadear resistência bacteriana, mesmo quando empregado de forma correta. O uso
inadequado desses fármacos agrava esta ocorrência, sendo este, o principal fator envolvido na
emergência de micro-organismos multirresistentes, limitando as opções terapêuticas para o
tratamento de processos infecciosos (Brasil, 1998).
A multirresistência abrange muitos grupos bacterianos, inclusive Escherichia coli
diarreiogênicas e comensais isoladas de diferentes fontes: intestinais e extraintestinais de
humanos, animais e ambientais (Estrada-Garcia et al., 2005; Melo, 2006; Aslani et al., 2008;
Ochoa et al., 2009; Gibson et al., 2010; Patoli et al., 2010; Johnson et al., 2010).
Nos
países
em
desenvolvimento,
a
multirresistência
aos
antimicrobianos
sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), ampicilina (AMP) e tetraciclina (TE) em E. coli
diarreiogênicas isolada de pacientes com diarreia, é considerado um problema emergente
(Estrada-Garcia et al., 2005; Oteo et al., 2005; Ochoa et al., 2009; Garcia et al., 2011).
Estrada-Garcia et al. (2005), no México, evidenciaram que 73% das E. coli
diarreiogênicas foram resistentes a ampicilina (AMP) e 65% ao sulfametoxazol-trimetoprima
(SXT); além, do fenômeno de multirresistência (3 ou mais antimicrobianos) encontrado em
58% das amostras. Entre as diferentes categorias diarreiogênicas, pode-se constatar que a
resistência a ampicilina (AMP) e ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) foi maior entre ETEC
(E. coli enterotoxigênica) e EAEC (E. coli enteroagregativa) do que entre EPEC-a (E. coli
enteropatogênica atípica).
No Peru, os percentuais de resistência a estes antimicrobianos foram maiores do que
no México: 85% a ampicilina (AMP) e 65% a tetraciclina (TE). As multirresistências mais
frequentes foram aos antimicrobianos AMP-SXT-TE e AMP-SXT, em 24% e 19% das
amostras, respectivamente. A multirresistência variou de 44 a 100%, sendo a EAEC (E. coli
enteroagregativa) a mais resistente entre as categorias diarreiogênicas (Ochoa et al., 2010).
No Brasil, Garcia et al. (2011) encontraram menores percentuais de resistência entre
E. coli diarreiogênicas, sendo 39,7% de resistência a tetraciclina (TE) e 30,9% a ampicilina e
ao sulfametoxazol-trimetoprim (SXT), no entanto, identificaram resistência de 5,9% a
cefalotina e de 3% a levofloxacina. A EAEC apresentou o maior percentual de resistência
30
(81%), seguida pela ETEC (62,8%) e EPEC (60%). A resistência aos antimicrobianos tem
sido identificada como característica relevante entre EAEC, que já apresentou 81,5% de
resistência com definição de 15 perfis distintos, sendo 11, com padrão de multirresistência
(Regua-Mangia et al., 2009b).
Sabe-se que antibioticoterapia é indicada apenas nos casos de infecções
extraintestinais por Escherichia coli e outras enterobactérias, principalmente nas infecções
urinárias, septecemias e outras, sendo desaconselhável nos casos de infecções intestinais
(Silva, 2002; Brasil, 2009). Mesmo assim, observam-se quadros diarreicos causados por
bactérias multirresistentes, sendo essa situação, reconhecida como um importante problema
de saúde pública nos países em desenvolvimento e, sua investigação é prioritária para o
Programa de Controle das Doenças Diarreicas estabelecido pela Organização Mundial de
Saúde (Vila et al., 1999).
Em relação à resistência de Escherichia coli isoladas de ambientes aquáticos, Melo
(2006) e Patoli et al. (2010), observaram que os maiores percentuais de resistência aos
antimicrobianos foram detectados em ambientes com maior ação antrópica, sendo a presença
de dejetos de origem humana ou animal, a principal fonte de contaminação da água por E. coli
multirresistentes (Reinthaler et al., 2003). Os maiores percentuais de resistência dos isolados
ambientais foram aos antimicrobianos ampicilina e acido nalidíxico, que são indicados no
manejo clínico de casos diarreicos graves (Estrada-Garcia et al., 2005; Silva, 2002; Brasil,
2009).
1.7. RELEVÂNCIA DA ANÁLISE CLONAL POR PFGE (PULSED FIELD GEL
ELETROFORESIS) NA EPIDEMIOLOGIA DE ISOLADOS DE Escherichia coli
A Eletroforese de Campo Pulsante (PFGE) é uma técnica de tipagem molecular
baseada no estudo da similaridade cromossomal. Esta técnica consiste na separação de
fragmentos de DNA de alto peso molecular, obtidos pela digestão do DNA genômico com
enzimas de restrição com baixa frequência de corte (Gandra et al., 2008).
É reconhecida como técnica “padrão ouro” para identificação de linhagens bacterianas
e apresenta poder discriminatório elevado, sendo utilizada como instrumento eficaz para as
análises de diversidade genética de diferentes micro-organismos e nos estudos de relações
epidemiológicas (Persing & Tenover, 2004; Magalhães et al., 2005; Goering, 2010).
31
O PFGE vem sendo utilizado na rotina da pesquisa epidemiológica e molecular de
Escherichia coli em diferentes contextos relacionados à saúde humana, dando resposta a uma
série de questionamentos, como na determinação de possíveis fontes de infecções
comunitárias e hospitalares para elucidação de surtos ou origem de contaminação (ReguaMangia et al., 2003; Borges et al., 2010), na inspeção de alimentos e manipuladores de
alimentos para avaliação do processo produtivo e qualidade do produto final (Badri et al.,
2009; Campos et al., 2009) e, no estudo das relações genéticas entre amostras isoladas de
humanos e animais para o reconhecimento de possíveis reservatórios e o esclarecimento das
prováveis vias de transmissão (Santos et al., 2010; Chase-Topping et al., 2012).
No Brasil, a maioria dos estudos com E. coli, utilizando PFGE, é desenvolvido com
E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC), que avalia a diversidade de fatores de virulência
entre principais sorogrupos: O26, O111, O113 e O157, e demonstram a heterogeneidade
genética entre amostras isoladas de humanos, de animais e de alimentos (Guth et al., 2002;
Bastos et al., 2006; Vaz et al., 2006; Santos et al., 2010).
A utilização do PFGE foi essencial para determinar aspectos epidemiológicos de
EPEC atípicas. Enquanto as EPEC típicas raramente são isoladas de animais, sendo o homem
seu principal hospedeiro suscetivel, as EPEC atípicas são isoladas de animais (cães, gatos,
bovinos, macacos) e humanos e, os resultados dos perfis eletroforéticos gerados pelo PFGE
permitiram a identificação de clones comuns entre humanos e animais, sendo possível
considerar que animais atuam como reservatórios e fonte de infecção de EPEC atípica para
humanos (Moura, 2009).
Johnson et al. (2008) identificaram por meio do PFGE que E. coli uropatogênica
(UPEC) isoladas de animais de companhia e de humanos apresentam os mesmos clones e que
a trasmissão cruzada desta categoria de E. coli entre humanos e animais pode ocorrer no
ambiente domiciliar.
A técnica de PFGE permitiu o reconhecimento da diversidade genética entre amostras
de Escherichia coli pertencentes aos mesmos sorotipos e a similaridade genética entre cepas
de diferentes sorotipos e sorogrupos. Estes achados indicam que cepas pertencentes ao mesmo
sorogrupo O podem ter evoluído separadamente umas das outras e que o sorogrupo O em si
não deve ser tomado por indicador de relações genéticas entre as cepas de E. coli (Bando et
al., 2007; Peroto, 2007).
De acordo com Afset et al. (2008), a análise das relações genéticas, entre EPEC atípica
isoladas de crianças com ou sem diarreia, por PFGE e MLST (Multilocus sequence typing),
32
permitiu evidenciar elevada heterogeneidade entre as amostras avaliadas e, que os resultados
de PFGE confirmaram um padrão de infecção endêmica entre as crianças durante o período
de estudo, demonstrando que o PFGE possuiu maior poder discriminatório do que o MLST na
diferenciação entre EPEC atípicas não relacionadas epidemiologicamente.
33
1.8.
OBJETIVOS
1.8.1. Objetivo Geral
Caracterizar genotípica e fenotipicamente os isolados de Escherichia coli
diarreiogênicas de origem humana e ambiental identificados no Estado do Pará.
1.8.2. Objetivos Específicos

Identificar sequências gênicas (eae, bfp, st, lt, stx, ipaH, aggR) codificantes dos fatores de
virulência em E. coli de origem humana e ambiental e classificá-las em categorias
diarreiogênicas E. coli enteropatogênica - EPEC; E. coli enterotoxigênica - ETEC, E. coli
produtora de Toxina Shiga - STEC, E. coli enteroinvasora – EIEC e E. coli
enteroagregativa - EAEC);

Determinar e comparar as frequências de E. coli diarreiogênicas (EPEC, ETEC, STEC,
EIEC e EAEC) entre as origens humana e ambiental;

Identificar o perfil de suscetibilidade das E. coli diarreiogênicas frente aos
antimicrobianos;

Determinar e comparar a frequência e os fenótipos de resistência aos antimicrobianos
entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental e entre as categorias
patogênicas;
 Determinar a variabilidade genética das categorias diarreiogênicas de E. coli de origem
humana e ambiental;
 Avaliar e comparar os perfis de macrorrestrição das categorias diarreiogênicas de E. coli
de acordo com a origem e data de isolamento.
34
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1.
AMOSTRAS BACTERIANAS
O estudo incluiu um total de 410 amostras de Escherichia coli coletadas em projetos
anteriores entre os anos de 2000 a 2012, sendo 344 de origem ambiental e 66 de origem
humana.
2.1.1. Amostras Ambientais: Das 344 E. coli ambientais, 146 foram isoladas de águas
superficiais de rio no entorno das ilhas Grande e Murutucu no município de Belém/PA, no
período de 2002 a 2004; 106 foram isoladas de areia das praias de Mosqueiro e Salinópolis Belém/PA, no ano de 2002 e, as 92 E. coli restantes foram isoladas de água de beber ou de
consumo doméstico que abasteciam residências no município de São Sebastião da Boa Vista –
Marajó/PA, no ano de 2012.
2.1.2. Amostras Humanas: Das 66 E. coli diarreiogênicas de origem humana (fezes), 24
foram provenientes de indivíduos HIV-positivo com ou sem diarreia, atendidos nas Unidades
de Referência para doenças infecto-parasitárias localizadas em Belém/PA e identificadas
segundo Costa et al. (2010). As demais 42 E. coli diarreiogênicas foram provenientes de
indivíduos com ou sem diarreia residentes no município de Juruti-Pará e, identificadas
segundo Sousa (2010). A seleção destas amostras e as informações referentes à data de
isolamento e números de indivíduos positivos para E. coli diarreiogênicas foram obtidas por
meio de consulta às fichas epidemiológicas e aos registros laboratoriais.
35
2.2.
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
2.2.1. Reisolamento, reidentificação e manutenção das culturas de E. coli
As amostras estavam estocadas em ágar nutriente e foram semeadas em tubos
contendo caldo TSB (Tryptic Soy Broth, Merck) e incubadas à temperatura de 35-37 ºC por
18-24 horas. Após crescimento, as amostras foram plaqueadas em ágar MC (Mac-Conkey,
Merck) e incubadas à temperatura de 35-37 ºC por 18-24 horas. Uma colônia isolada e
representativa do cultivo foi semeada em tubos contendo ágar TSI (Triple Sugar Iron, Merck)
e incubada à temperatura de 35-37 ºC por 18-24 horas. Após crescimento, as amostras foram
repicadas para dois tubos contendo ágar nutriente, um deles foi direcionado para
reidentificação bioquímica utilizando o sistema API 20E e outro mantido à temperatura
ambiente para utilização no decorrer do trabalho. As amostras originais foram devolvidas e
novamente estocadas nas coleções biológicas.
2.2.2. Detecção Molecular de E. coli diarreiogênicas
A pesquisa das sequências gênicas para detecção molecular de E. coli diarreiogênicas
foi realizada por PCR-multiplex e/ou PCR-monoplex seguindo as recomendações de Sousa
(2010).
As E. coli de origem ambiental foram testadas inicialmente por PCR-multiplex para
triagem das E. coli diarreiogênicas e, posteriormente, por PCR-monoplex para confirmação e
classificação. As E. coli de origem humana, já classificadas como E. coli diarreiogênicas,
foram testadas apenas por PCR-monoplex para confirmação da presença dos genes
característicos de cada categoria.
Foram utilizadas cepas padrões de cada categoria diarreiogênica como controles
positivos, além de um controle negativo (Quadro 1), cedidas pela Dra Tânia Vaz do Instituto
Adolfo Lutz – IAL / São Paulo.
Quadro 1- Cepas de referência de Escherichia coli para PCR
Cepas de Referência
E2348/69
H10407
EDL1284
EDL933
EAEC O42
E. coli K12 DH5α
Categoria
EPEC
ETEC-LT/ST
EIEC
STEC
EAEC
E. coli comensal
36
As E. coli diarreiogênicas foram classificadas de acordo com a presença dos seguintes
genes ou sequências de DNA utilizando os critérios estabelecidos nos trabalhos de Campos et
al. (2004) e Franzolin et al. (2005) (Quadro 2). Essa classificação orientou a seleção dos alvos
moleculares utilizados na PCR.
Quadro 2- Classificação molecular das categorias patogênicas de E. coli
Categorias
patogênicas
Genes Característicos
EPEC típica
Gene eaeA (intimina), gene bfpA (fímbria BFP) e/ou Região EAF com
ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga)
EPEC atípica
Gene eaeA (intimina) com ausência dos genes stx-1 e stx-2 (toxina de Shiga)
ETEC
Genes codificadores das enterotoxinas LT (termolábil) e/ou ST (termoestável)
EIEC
Gene ipaH (plasmídeo de invasão)
STEC
Genes eaeA (intimina) e stx (Stx-1 e/ou Stx-2); ou somente Stx-1 e/ou Stx-2
EAEC
Gene aggR (ativador transcricional para AAF -fímbria de aderência
agregativa)
Fonte: Adaptado de Campos et al., 2004; Franzolin et al., 2005.
2.2.2.1 Extração do DNA bacteriano
A extração do DNA bacteriano foi realizada por fervura e congelamento seguindo às
recomendações de Starnbach et al. (1989), Olsvik & Strockbine (1993) e Baloda et al. (1995)
como descrito a seguir:

um repique da cultura de trabalho foi transferida para tubo contendo 3 mL de caldo Luria,
e incubado à temperatura de 35-37 ºC por 12 horas;

1,5 mL da cultura foi transferido para um microtubo de 1,5 mL e centrifugado a 9.660 g
durante 5 minutos;

o sobrenadante foi descartado, e o precipitado solubilizado em 400 L de água purificada
(milli-Q) estéril;

a suspensão foi homogeneizada em agitador mecânico do tipo vortex e levada ao
termobloco (100 ºC) por 10 minutos; após este tempo, a suspensão foi imediatamente,
submetida à temperatura de _ 20º C para congelamento.

após congelamento, a suspensão foi descongelada a temperatura ambiente e centrifugada
a 9.660g por 5 minutos para separação e estocagem do sobrenadante a - 20 ºC.
37
Para realização do PCR-multiplex, a extração do DNA bacteriano foi reunida em grupos
(pools) que continham 2 a 5 amostras de E. coli. Para PCR-monoplex o DNA foi extraído
individualmente por amostra.
2.2.2.2. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase – Multiplex (PCR-multiplex)
As reações foram realizadas com volume final de 25 µL, utilizando os componentes e
suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 3. A descrição dos oligonucleotídeos
utilizados para amplificação dos genes de virulência está apresentada no Quadro 4. Os ciclos
de temperaturas estão apresentados no Quadro 5 e para realização das ciclagens foi utilizado o
aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems).
Quadro 3- Componentes e concentrações utilizados na PCR-multiplex
Componentes e concentrações
Água purificada estéril
Volume
4,75
Tampão de reação 10X (Invitrogen)
2,5 µL
Cloreto de magnésio - MgCl2 50mM (Invitrogen)
1,0 µL
Desoxinucleotídeos - dNTP 10mM (Invitrogen)
1,25 µL
Iniciadores
EAE 1/2 (10 pmol)
(1,5 µL/1,5 µL)
BFP 1/ 2 (2,5 pmol)
(1,0 µL/1,0 µL)
Stx f/r (2,5 pmol)
(1,0 µL/1,0 µL)
LT f/r (2,5 pmol)
(0,5 µL/0,5 µL)
ST f/r (10 pmol)
(1,0 µL/1,0 µL)
EI 1/2 (2,5 pmol)
(0,5 µL/0,5 µL)
aggR1/ 2 (2,5 pmol)
(1,0 µL/1,0 µL)
Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen)
0,5 µL
DNA da Escherichia coli
2,0 µL
Volume final da reação
25,0 µL
38
Quadro 4- Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-multiplex.
Designação
LT-f
LT-r
BFP-1
BFP-2
EAE-1
EAE-2
ST-f
ST-r
EI-1
EI-2
STX-f
STX-r
AggR-1
AggR-2
Sequência de oligonucleotídeos
(5’– 3’)
Fator de virulência
(gene)
Enterotoxina
termolábil-LT (lt)
Produto
AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC
GCCGCTTTATCCAACCTGGTA
CTGAACGGCGATTACGCGAA
CGAGACGATACGATCCAG
Fímbria BFP (bfpA)
326 pb
Intimina (eaeA)
917 pb
ATTTTTMTTTCTGATTTRTCTT
CACCCGGTACARGCAGGATT
Enterotoxina
termoestável-ST (st)
Plasmídeo de invasão
(ipaH)
Toxina de Shiga 1 e 2
(Stx)
Fimbria de aderência
agregativa (aaf)
GGCGACAGATTATACCGTGC
CGGTCTCTATATTCCCTGTT
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
GAGCGAAATAATTTATATGTG
TGATGATGGCAATTCAGTAT
GTATACAAAAGAAGGAAGC
ACAGAATCGTCAGCATCAGC
Referência
450 pb
Aranda et
al. (2004)
190 pb
600 pb
518 pb
254 pb
Toma et al.
(2003)
Quadro 5- Programa de cliclagem utilizado na PCR-multiplex
Estágios
Etapas
Temperatura
Estágio 1
Desnaturação
Hibridização
Extensão
Desnaturação
Hibridização
Extensão
Desnaturação
Extensão
95 °C
60 °C
72 °C
94 °C
55 °C
72 °C
94 °C
72 °C
Estágio 2
Estágio 3
Estágio 4
Tempo
Nº de Ciclos
7 min.
1 min.
1 min e 20 seg.
1 min.
1 min.
1 min e 20 seg.
1 min.
30 min.
1
15
25
1
2.2.2.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase - Simples (PCR-monoplex)
A PCR-monoplex foi realizada em três situações: 1ª) confirmação das E. coli
ambientais que apresentaram amplificação para um ou mais genes investigados na PCRmultiplex, 2ª) confirmação das E. coli humanas já identificadas como E. coli diarreiogênicas e
3ª) diferenciação dos genes que codificam para as toxinas de Shiga 1 e 2 (Stx-1 e 2) em
STEC.
As reações de PCR-monoplex foram realizadas com volume final de 25 µL, utilizando
os componentes e suas respectivas concentrações de acordo com o Quadro 6. A descrição dos
oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos genes está apresentada no Quadro 4 (1ª e
2ª situação) e Quadro 7 (3ª situação). Os ciclos de temperaturas estão apresentados no Quadro
8 e para realização das ciclagens foi utilizado o aparelho termociclador Veriti Thermal Cycler
(Applied Biosystems).
39
Quadro 6 - Componentes e concentrações utilizados na PCR-monoplex
Componentes
Quantidade
Água purificada estéril
17 L
Tampão de reação 10X (Invitrogen)
2,5 L
Cloreto de magnésio - MgCl2 50mM (Invitrogen)
0,75 L
Desoxinucleotídeos - dNTP 10mM (Invitrogen)
1,25 µL
Oligonucleotídeos - 2,5pmol/L (Invitrogen)
1,0 L/1,0 L
Platinum -Taq DNA Polymerase 5U/µL (Invitrogen)
0,5 L
DNA da Escherichia coli
1,0 L
Volume final da reação
25 L
Quadro 7 - Oligonucleotídeos e produtos de amplificação utilizados na PCR-monoplex
Designação
STX- 1a
STX- 1b
STX- 2a
STX- 2b
Sequência de oligonucleotídeos
(5’– 3’)
Fator de
virulência/gene
CAACACTGGATGATCTCAG
CCCCCTCAACTGCTAATA
ATCAGTCGTCACTCACTGGT
CTGCTGTCACAGTGACAAA
Toxina de Shiga -1
(stx1)
Toxina de Shiga -2
(stx2)
Produto
Referência
349 pb
Pal et al.
(1999)
110 pb
Quadro 8 - Programa de cliclagem utilizado na PCR-monoplex
Etapas
Desnaturação Inicial
Desnaturação
Hibridização
Extensão
Extensão Final
Temperatura
95 °C
95 °C
50 – 55 °C
72 °C
72 °C
Tempo
5 min.
1 min.
1 min.
1 min.
10 min.
Nº de Ciclos
1
40
1
2.2.2.4. Eletroforese
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2,0%
contendo 1,5 µL de Sybr Safe (Invitrogen) para visualização e determinação dos fragmentos
de DNA amplificados. Juntamente com as amostras, os controles positivos e o marcador de
peso molecular (Ready-load 100pb DNA Ladder, Invitrogen) foram aplicados aos géis para
comparação. A corrida eletroforética foi realizada sob voltagem máxima e constante de 100 V
em tampão TE (Tris-EDTA Buffer) por 1 hora. Após a corrida, os géis foram visualizados em
40
transiluminador (luz ultravioleta) para análise visual dos fragmentos de DNA amplificados e,
o registro fotográfico foi realizado pelo sistema de fotodocumentação UPV Biolmaging
Systems (EpiChemi Darkroom).
2.2.3 Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos
A suscetibilidade aos agentes antimicrobianos das E. coli diarreiogênicas foi avaliada
pelo método de difusão em sistema de disco, de acordo com Bauer et al. (1966), observando
as recomendações do Clinical and Laboratory Standards (CLSI, 2012).
2.2.3.1. Preparo do inóculo
Cada amostra de E. coli foi repicada para tubos contendo caldo Mueller-Hinton
(Oxoid) e incubadas à temperatura de 35 °C durante 24 horas. Após esse período, foram
novamente repicadas para outro tubo contendo caldo Mueller-Hinton (Oxoid) e incubadas à
temperatura de 35 °C por 6 horas para obtenção do inóculo equivalente a 0,5 da escala de Mc
Farland que corresponde a 1,5 x 108 UFC/mL. A concentração do inóculo foi observada por
meio de densitômetro (VITEK Densichek - bioMèrieux).
2.2.3.2. Semeadura nas placas
A partir da suspensão bacteriana equivalente a 0,5 da escala de Mc Farland e com
auxílio de um swab (J.Prolab), cada amostra foi semeada na superfície das placas contendo
4,0 mm de altura de ágar Mueller Hinton (Oxoid). O swab foi aplicado sobre toda a superfície
do meio de cultura por três vezes, girando a placa num ângulo de 60° após cada aplicação.
Para finalizar a semeadura, o swab foi aplicado ao redor das bordas da superfície do ágar e as
placas permaneceram por 10 minutos à temperatura ambiente com tampa fechada para
secagem do inóculo.
2.2.3.3. Aplicação dos discos de antimicrobianos
A aplicação dos discos de antimicrobianos foi realizada com auxílio do dispensador
automático Disc dispenser (Oxoid). Em seguida, as placas foram incubadas à temperatura de
35 °C por 16-18 horas. Foram utilizados os antimicrobianos (Oxoid) a seguir nas respectivas
concentrações: ampicilina 10µg (AMP), amoxicilina 20µg / ácido clavulânico 10µg (AMC),
cloranfenicol 30µg (C), ceftazidima 30µg (CAZ), ciprofloxacina 5µg (CIP), gentamicina
41
10µg (CN), cefotaxima 30µg (CTX), nitrofurantoína 300µg (F), ácido nalidíxico 30µg (NA),
sulfametoxazol 23,75µg / trimetoprim 1,25µg (SXT), tetraciclina 30µg (TE) e canamicina
30µg (K).
2.2.3.4. Leitura e interpretação do teste
O diâmetro das zonas de inibição foi medido com auxílio de um paquímetro
(Digimatic Caliper, Mitutoyo Corporation) e a interpretação do diâmetro dos halos foi
realizada conforme especificações apresentadas no Quadro 9 (CLSI, 2012). Foram
consideradas resistentes as amostras que apresentaram resistência a pelo menos um
antimicrobiano e amostras multirresistentes as que apresentaram resistência simultânea a
três ou mais antimicrobianos com diferentes mecanismos de ação (Magiorakos et al., 2012).
Quadro 9- Interpretação do diâmetro dos halos de inibição aos antimicrobianos utilizados
Agentes
Antimicrobianos
Ácido nalidíxico (NA)
Ampicilina (AMP)
Amoxicilina – Acido
Clavulânico (AMC)
Canamicina (K)
Ceftazidima (CAZ)
Cefotaxima (CTX)
Ciprofloxacina (CIP)
Cloranfenicol (C)
Gentamicina (CN)
Nitrofurantoína (F)
Sulfametoxazol –
trimetoprim (SXT)
Tetraciclina (TE)
Concentração
/Disco
30µg
10µg
20µg/10µg
Diâmetro do halo de inibição (mm)*
Resistentes
Intermediários
Sensíveis
13 ou menos
14-18
19 ou mais
13 ou menos
14-16
17 ou mais
13 ou menos
14-17
18 ou mais
30µg
30µg
30µg
5µg
30µg
10µg
300µg
23,75µg /1,25µg
13 ou menos
14 ou menos
14 ou menos
15 ou menos
12 ou menos
12 ou menos
14 ou menos
10 ou menos
14-17
15-17
15-22
16-20
13-17
13-14
15-16
11-15
18 ou mais
18 ou mais
23 ou mais
21 ou mais
18 ou mais
15 ou mais
17 ou mais
16 ou mais
30µg
14 ou menos
15-18
19 ou mais
* Milímetros
O controle de qualidade da potência dos discos de antimicrobianos foi realizado com
cepas padrões de Escherichia coli (ATCC 25.922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC:
27853).
2.2.4. Eletroforese em Gel de Campo Pulsante (PFGE)
A identificação dos perfis de macrorrestrição das amostras de E. coli diarreiogênicas foi
realizada por meio de extração e digestão do DNA genômico por enzima de restrição, seguido
de eletroforese em gel de campo pulsante (PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis)
42
utilizando o sistema Contour-Clamped Homogeneuos Electric Field DRIII apparatus (CHEFDR III/ Bio-Rad). As etapas e os procedimentos realizados estão descritos abaixo e foram
realizados conforme as recomendações de Gautom (1997).
2.2.4.1. Preparo da suspensão bacteriana
As amostras foram semeadas em tubos contendo 5 mL de caldo TSB (Tryptic Soy
Broth, Merck) e incubadas à temperatura de 37 ºC por 18 horas. Após esse período, as
amostras foram semeadas em placas contendo meio TSA (Tryptic Soy Agar, Merck) e
incubadas nas mesmas condições anteriores para obtenção de colônias isoladas. A partir de
uma colônia, a amostra bacteriana foi semeada em placa contendo meio TSA (Tryptic Soy
Agar) para obtenção de crescimento confluente após incubação à temperatura de 37 °C por 18
horas.
A partir desse crescimento confluente e com o auxílio de swab foi preparada uma
suspensão bacteriana em 3 mL de solução tampão TE (Tris EDTA – Apêndice 1.3) até a
obtenção de turbidez igual a 1 da escala de Mc Farland que corresponde a 3,0 x 108 UFC/mL.
2.2.4.2. Montagem dos blocos de agarose
Uma alíquota de 300 µL da suspensão bacteriana de cada amostra foi transferida para
um microtubo de 1,5 mL e adicionado 15 µL de proteinase K (20mg/mL) para obtenção de
uma concentração final de 1mg/mL. Em seguida, foi preparada uma solução de agarose
(Seakem Gold Agarose, Lonza) a 1,2%, em tampão TE (Apêndice 1.3). O volume de 300 µL
desta agarose foi distribuído para os tubos contendo a suspensão bacteriana mais a proteinase
K. Antes da solidificação e com o auxílio de uma micropipeta, as amostras foram suavemente
homogeneizadas e distribuídas em moldes apropriados (Bio-Rad Laboratories) para a
confecção dos blocos (plugs) de agarose. Foram preparados três blocos por amostra.
2.2.4.3. Processo de lise in situ
Após solidificação à temperatura ambiente por 10 minutos, os blocos de agarose,
referentes a cada amostra, foram transferidos para distintos tubos cônicos de 50 mL contendo
10 mL de solução de lise celular (Apêndice 1.8) e incubados à temperatura de 54 °C por 2
horas para que ocorresse o processo de lise celular e liberação do DNA cromossômico in situ.
43
Após incubação, a solução de lise foi desprezada e os blocos de agarose foram lavados
a fim de eliminar todos os resíduos do processo de lise celular. Foram realizadas duas
lavagens com 10 mL de água milli-Q esterilizada (pré-aquecida à temperatura de 50 oC) na
qual os tubos permaneceram incubados por 15 minutos em banho maria à temperatura de
50°C, seguida de mais quatro lavagens com 10 mL de solução tampão TE (Apêndice 1.3)
repetindo-se as condições de tempo e incubação (15 minutos a 50 ºC). Após a última lavagem,
os blocos de agarose foram mantidos em solução tampão TE e armazenados à temperatura de
4 ° C, até o momento de uso.
2.2.4.4. Digestão do DNA com a enzima de Restrição Xba I
Para cada amostra foi selecionado um bloco de agarose do qual foi retirado um corte
de 2 mm com o auxílio de lâmina e de bisturi. Este corte foi transferido para microtubos de
1,5 mL contendo 200 µL de solução de pré-digestão (solução tampão da enzima de restrição
XbaI à 10% (Roche) e incubado à temperatura de 37 ºC por 10 minutos. Em seguida, a
solução de pré-digestão foi retirada e substuida por 200 µL da solução de digestão (Apêndice
1.11) contendo a enzima de restrição Xba I (Roche) na concentração de 50U por amostra e os
tubos foram novamente incubados à temperatura de 37 °C por 18 a 24 horas. A enzima de
restrição Xba I reconhece o DNA alvo na sequência T/CTAGA. A cepa padrão universal
Salmonella Braenderup H9812 foi utilizada como controle do processo de digestão das
amostras.
2.2.4.5. Montagem do gel de corrida e condições eletroforéticas
Após o período de digestão, o corte de 2 mm foi colocado nos orifícios de um gel de
agarose e em seguida esses orifícios foram selados com o próprio gel para que as frações não
se desprendessem. Este gel de agarose (For Pulsed Field Electrophoresis: Running Gel/
Sigma) foi preparado na concentração de 1% em TEB 0,5X (Apêndice 1.10) e montado sobre
o molde do próprio aparelho CHEF-DR III System (Bio-Rad). Nas posições externas e
centrais dos géis foi utilizado o marcado de peso molecular de 48,5 a 1018,5 KB (Lambda
Ladder PFGE marker/BIOLABS, Beverly, MA, USA).
A separação dos fragmentos de DNA do cromossoma bacteriano clivado pela enzima
de restrição foi realizada em sistema de eletroforese do tipo CHEF-DR III System (Bio-Rad)
utilizando tampão de corrida TE 0,5X (Apêndice 1.10) sob as seguintes condições
44
eletroforéticas: tempo de pulso inicial de 5 segundos e final de 30 segundos por 24 horas,
ângulo de 120º, gradiente de 6 V/cm correspondendo aproximadamente a 120-150V,
velocidade de recirculação do tampão de 70 e temperatura de 14 ºC.
2.2.4.6. Coloração e fotodocumentação do gel de agarose
Após a eletroforese, o gel foi corado por imersão em solução de brometo de etídio
(5mg/mL) por 30 minutos e em seguida lavado uma vez com água milli-Q destilada. Os perfis
de marrestrição foram visualizados sob iluminação ultravioleta e as imagens capturadas no
formato TIFF e digitalizadas pelo sistema de fotodocumentação GEL LOGIC 2200 Imaging
System (Molecular Imaging System, Carestream Health, Inc.).
2.2.4.7. Interpretação e análise dos perfis de macrorrestrição gerados pelo PFGE
Os perfis de macrorrestrição foram analisados com o auxílio do programa de
computação Software Bionumerics Versão 6.5 (Applical Maths, Inc., Austin, TX) que permitiu
a comparação entre diferentes perfis eletroforéticos (diferentes géis) que apresentaram em
comum uma mesma escala de referência (marcador de peso molecular). As bandas foram
selecionadas automaticamente pelo programa e em seguida, procedeu-se a inspeção visual
para correção. Os perfis considerados geneticamente idênticos foram aqueles que
apresentaram percentual de similaridade de 100%, e aqueles com uma ou mais bandas foram
considerados diferentes.
O grau de homologia entre as amostras foi determinado pelo coeficiente de Dice e a
correlação para agrupamento e construção do dendoograma foi calculada por UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) com tolerância de 2,5%. O
algorítimo (cluster cut off algorithm) do Bionumerics Version 6.5 foi utilizado para a
definição dos agrupamentos significantes.
2.3.
APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS
As informações referentes à origem e data de isolamento das E. coli diarreiogênicas e
os resultados sobre fatores de virulência e fenótipos de resistência foram organizados em
banco de dados utilizando-se o programa Microsoft Office Access 2007 e apresentados por
meio de gráficos ou tabelas gerados pelo programa Microsoft Office Excel 2010.
45
Para análise estatística, foram realizados o teste binomial para duas proporções, o teste
exato de Fisher e o teste X2 de partição para comparação entre as variáveis, estes testes foram
executados por meio do programa BioEstat Versão 5.0 (Ayres et al., 2007) considerando o
nível de confiança de 95% (p ≤ 0,05).
2.4.
ASPECTOS ÉTICOS
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos (CEP) do Instituto Evandro Chagas com registro CEP/IEC Nº 0046/11
(CAAE: 0045.0.072.000-11) (Apêndice 2).
46
3. RESULTADOS
3.1 FREQUÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS
Do total de 344 amostras de E. coli de origem ambiental, seis (1,74%) foram
classificadas como E. coli diarreiogênicas. Estas amostras foram identificadas apenas entre as
E. coli isoladas de água superficial de rio e, dentro desta amostragem, o percentual foi de
4,11% (6/146) (Tabela 1). Destas seis amostras, três foram provenientes do entorno da ilha
Murutucu e três da ilha Grande.
Tabela 1- Frequência das E. coli diarreiogênicas de origem ambiental de acordo com a origem
de isolamento.
Isolamento de origem
ambiental
Escherichia coli avaliadas
Escherichia coli diarreiogênica
Nº
146
92
106
344
Agua superficial de rio
Agua de beber/consumo
Areia de Praia
Total
Nº
6
0
0
6
%
4,11
0
0
1,74
Todas as 66 E. coli de origem humana foram confirmadas como diarreiogênicas e
foram isoladas das fezes de 64 indivíduos. Em dois deles foram detectadas infecções mistas
por dois tipos diferentes de E. coli diarreiogênica (EPEC+EAEC e EPEC+EIEC).
Considerando o número de indivíduos participantes destes projetos, o percentual de
ocorrência de E. coli diarreiogênica de origem humana foi de 13,36% (64/479) (Tabela 2).
Tabela 2- Frequência de E. coli diarreiogênicas de origem humana de acordo com a origem de
isolamento.
Isolamento de origem
humana
Indivíduos Participantes
Nº
Indivíduos com Escherichia coli
diarreiogênica
Nº
%
Portadores do HIV
181
24
13,25
Indivíduos de Juruti-PA
298
42
14,09
Total
479
64
13,36
As diferenças entre estes percentuais (1,74% e 13,36%) ou (4,11% e 13,36%) foram
estatisticamente significantes (Teste binomial: p<0,0001 e p=0,0019, respectivamente),
47
demonstrando que houve diferença quanto à frequência de E. coli diarreiogênica entre as
origens ambiental e humana.
As 66 E. coli de origem humana e as seis de origem ambiental perfazem um total de
72 E. coli diarreiogênicas que estão distribuidas em cinco categorias, sendo a E. coli
enterotoxigênica-ETEC
a
mais
frequente
(29,17%-21/72),
seguida
pelas
E.
coli
enteropatogênica-EPEC e E. coli agregativa-EAEC (ambas com 26,39%-19/72), E. coli
enteroinvasora-EIEC (15,28%-11/72) e E. coli produtora de toxina de Shiga-STEC (2,78%2/72) (Figura 5).
Figura 5- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a categoria
patogênica. ETEC: E. coli enterotoxigênica; EPEC: E. coli enteropatogênica; EAEC: E. coli
enteroagregativa; EIEC: E. coli enteroinvasora; STEC: E. coli produtora de toxina de Shiga.
De acordo com as origens de isolamento, as ETEC (3,96%-19/479), EAEC (3,76%18/479) e as EPEC atípicas (3,34%-16/479) foram as mais frequentes entre as amostras
humanas, seguidas pela EIEC (2,29%-11/479) e STEC (0,41%-2/479). Entre as amostras
ambientais foram detectadas ETEC e EPEC atípica na frequência de 0,58% (2/344) (ambas) e
EPEC típica e EAEC, ambas com frequência de 0,29% (1/344) (Tabela 3).
48
Tabela 3- Distribuição e frequência das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de
isolamento.
E. coli diarreiogênicas e Fatores de
Virulência
ETECd
LT (Enterotoxina termolábel)
ST (Enterotoxina termoestável)
ST e LT
EPECe atípica
EPECe típica
EAECf
EIECg
STECh
Stx-1
Stx-1, Stx-2 e Intimina/EAE
Somatória das linhas em negrito
a
Origem de Isolamento
Humana (479)a Ambiental (344)b
Nº (%)
Nº (%)
19 (3,96)
7
8
4
16 (3,34)
0(-)
18 (3,76)
11 (2,29)
2 (0,41)
1
1
66
b
Total
2 (0,58)
1
1
0
2 (0,58)
1 (0,29)
1 (0,29)
0(-)
0(-)
0
0
21
8
9
4
6
72
18
1
19
11
2
1
1
p-valorc
0,9930
1,000
1,000
1,000
0,6326
0,0833
0,6795
0,5812
1,000
c
Número total de indivíduos; Número de amostras avaliadas; Teste exato de Fisher.
d
ETEC: E. coli enterotoxigênica; eEPEC: E. coli enteropatogênica; fEAEC: E. coli
enteroagregativa; gEIEC: E. coli enteroinvasora; hSTEC: E. coli produtora de toxina de Shiga.
Das 19 ETEC identificadas de origem humana, sete (36,84%) foram positivas para
enterotoxina termolábil (LT), oito (42,10%) para enterotoxina termoestável (ST) e quatro
(21,06%) para as duas enterotoxinas (ST e LT). Destas duas ETEC de origem ambiental, uma
foi ETEC-LT e outra ETEC-ST. Entre as 19 EPEC, 18 (94,7%) foram classificadas como
EPEC atípicas produtoras da proteína de adesão íntima (intimina/EAE- E. coli attachmenteffacement) e apenas uma foi classificada como típica (1,36%) de origem ambiental, que
apresentou além da proteína intimina, a fímbria BFP (Bundle Forming Pilus). Das 18 EPEC
atípicas, 16 foram de origem humana e duas de origem ambiental. As EIEC (2,29%) e as
STEC (0,41%) foram identificadas apenas entre as amostras de origem humana. Entre as duas
STEC, uma foi positiva apenas para toxina de Shiga tipo 1 (Stx-1) e a outra positiva para Stx1 e 2 além de apresentar a proteína intimina/EAE (Tabela 3).
A diferença de ocorrência de cada categoria de E. coli diarreiogênica considerando as
origens de isolamento (humana e ambiental) não foi estatisticamente significativa (p> 0,05).
A relação das 72 E. coli diarreiogênicas e a distribuição dos genes que codificam os
fatores de virulência que permitiram a classificação das mesmas em categorias patogênicas ou
patotipos estão demonstradas no Apêndice 3 e as amplificações referentes aos alvos
49
moleculares que permitiram a identificação das categorias de E. coli diarreiogênicas podem
ser observados abaixo na Figura 6.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
eae (917pb)
ipaH (600pb)
stx (518pb)
lt (450pb)
bfp (326pb)
aggR (254pb)
st (190pb)
Figura 6- Amplificação dos alvos moleculares gerados pelo PCR-multiplex. Linha 1: Ladder
1 Kb, linha 2: Mix de DNA das cepas padrões de E. coli diarreiogênica, linha 3 a 9:
Controles positivos para observação da amplificação individual dos alvos moleculares.
50
3.2 PELFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS E FENÓTIPOS DE
RESISTÊNCIA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS.
A resistência antimicrobiana entre as E. coli diarreiogênicas foi de 51,39% (37/72)
(Figura 7) sendo de 53,03% (35/66) entre as de origem humana e de 33,33% (2/6) entre as de
origem ambiental (Tabela 4). A diferença de resistência entre E. coli diarreiogênicas de
origem humana e ambiental não foi significativa (p=0,4230).
Figura 7- Frequência de resistência aos antimicrobianos entre as E. coli diarreiogênicas.
Tabela 4- Frequência da resistência antimicrobiana de E. coli diarreiogênica de acordo com as
origens de isolamento.
Origem de isolamento
E. coli diarreiogênicas
E. coli diarreiogênica resistentes
Nº
Nº
Humana
66
35
53,03
Ambiental
6
2
33,33
Total
72
37
51,39
Teste exato de Fisher: (Humana x Ambiental) p=0,4230
%
51
A resistência entre as E. coli diarreiogênicas foi mais frequente aos antimicrobianos
sulfametoxazol-trimetoprim (44,44% - 32/72), ampicilina (40,28% - 29/72) e tetraciclina
(33,33% - 24/72) e, considerada estatisticamente significativa (X2 de partição= 98,2252;
p>0,0001) quando comparada à resistência ao cloranfenicol (11,12% - 8/72), a amoxicilinaácido clavulânico (5,56% - 4/72), a canamicina (2,77% - 2/72) e a gentamicina (1,39% - 1/72)
(Tabela 5). Ao se comparar os percentuais de resistência aos três principais antimicrobianos
sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina, observou-se que não houve diferença
estatística de resistência entre os mesmos (X2 de partição= 2,4597; p=0,1168).
Todas as E. coli diarreiogênicas foram sensíveis aos antimicrobianos ácido nalidíxico,
ceftazidima, cefotaxima e ciprofloxacina (Tabela 5).
Tabela 5- Perfil de suscetibilidade entre as E. coli diarreiogênicas de acordo com os
antimicrobianos utilizados.
Antimicrobiano
Acido Nalidixico
Ampicilina
Amoxicilina-ácido clavulânico
Canamicina
Ceftazidima
Cefotaxima
Ciprofloxacina
Cloranfenicol
Gentamicina
Nitrofurantoina
Sulfametoxazol trimetoprim
Tetraciclina
* Número de amostras avaliadas.
Perfil de Suscetibilidade (72)*
Sensível
%
Intermediário % Resistente
72
100,00
0
0
41
56,94
2
2,78
29
64
88,88
4
5,56
4
48
66,67
22
30,56
2
72
100,00
0
0
72
100,00
0
0
72
100,00
0
0
64
88,88
0
8
68
94,44
3
4.17
1
69
95,83
3
4,17
0
39
54,17
1
1,39
32
43
59,72
5
6,95
24
%
40,28
5,56
2,77
11,12
1,39
0,00
44,44
33,33
52
Entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana, destacam-se os percentuais de
resistência aos antimicrobianos sulfametoxazol-trimetoprim (46,97% - 31/66), ampicilina
(40,91% - 27/66), tetraciclina (34,85% - 23/66) e cloranfenicol (10,61% - 7/66). As E. coli
diarreiogênicas de origem ambiental foram resistentes à ampicilina e amoxicilina-ácido
clavulânico, ambos (40,00%-2/6) e, aos antimicrobianos cloranfenicol, sulfametoxazoltrimetoprim e tetraciclina (20% -1/6) (Figura 8). A diferença percentual de resistência à
amoxicilina-ácido clavulânico foi a única significativa entre os dois grupos, sendo as E. coli
diarreiogênicas de origem ambiental, as mais resistentes a este antimicrobiano do que as de
origem humana (Teste exato de Fisher: p=0,0228).
Figura 8- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a origem de
isolamento. AMP: Ampicilina; AMC: Amoxicilina-Acido Clavulânico; K: Canamicina; C:
Cloranfenicol; CN: Gentamicina; SXT: Sulfametoxazol – trimetoprim; TE: Tetraciclina.
53
Avaliando-se a resistência antimicrobiana por categoria de E. coli diarreiogênica,
verificou-se que a EPEC (X2 de partição=6.5469; p=0,0108) e a EAEC (X2 de
partição=6.5769; p=0,0103) apresentaram resistência significativa aos antimicrobianos
ampicilina, sulfametozaxol-trimetoprim (ambos 63,16% - 12/16) e tetraciclina (36,84% - 7/19
e 47,37% - 9/19, respectivamente). As ETEC (X2 de partição=6.5469; p=0,0105) foram
significativamente resistentes à ampicilina (33,33%-7/21) e ao sulfametozaxol-trimetoprim
(28,57%-6/21), enquanto as EIEC (X2 de partição=5.3036; p=0,0213) apresentaram
resistência significativa aos antimicrobianos sulfametozaxol-trimetoprim (45,45% - 5/11) e
tetraciclina (54,55% - 6/11). Entre as duas STEC foi observada resistência ao sulfametozaxoltrimetoprim (50,00% - 1/2) e à tetraciclina (50,00% - 1/2) (Tabela 6). Analisando-se a
resistência entre os principais antimicrobianos de cada categoria, observou-se que não houve
diferença estatística da resistência entre os mesmos (Tabela 6).
Tabela 6- Resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com as categorias
patogênicas.
Antimicrobiano
Ampicilina
Amoxicilina /Ac. Clavulânico
Canamicina
Cloranfenicol
Gentamicina
Sulfametoxazol trimetoprim
Tetraciclina
* Número de amostras avaliadas
E. coli diarreiogênicas
ETEC (21)* EPEC (19)* EAEC (19)* EIEC (11)* STEC (2)*
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
7 33,33
9
47,37
12 63,16 1
9,09 0
1
4,76
2
10,53
1 5,26 0
0
0
0
2 10,53 0
0
0
3
15,79
5 26,32 0
0
0
0
1 5,26 0
0
6 28,57
8
42,11
12 63,16 5 45,45 1 50,00
1
4,76
7
36,84
9 47,37 6 54,55 1 50,00
54
Foram identificados 13 diferentes fenótipos de resistência antimicrobiana variando de
um a cinco antimicrobianos e distribuídos entre 37 E. coli diarreiogênicas.
Os mais frequentes fenótipos de resistência entre as E. coli diarreiogênicas de origem
humana foram AMP-SXT-TE (25,71% - 9/35), AMP-SXT (22,86% - 8/35) e SXT-TE
(17,14% - 6/35). Dois fenótipos de resistência foram identificados entre as amostras
ambientais, sendo um deles, representado por cinco antimicrobianos (AMP-AMC-C-SXT-TE)
e o outro por dois (AMP-AMC). O fenótipo ambiental AMP-AMC-C-SXT-TE também
ocorreu entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana na frequência de 5,71% (2/35), no
entanto, o fenótipo AMP-AMC foi exclusivo de amostra ambiental (Tabela 7). Das 37 E. coli
diarreiogênicas que apresentaram resistência, 17 (45,94%) foram multirresistentes.
Tabela 7- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com a
origem de isolamento.
Fenótipos de Resistência
AMP-K-C-CN-SXT
AMP-K-C-SXT-TE
AMP-AMC-C-SXT-TE
AMP-C-SXT-TE
AMP-C-SXT
AMP-SXT-TE
AMP-SXT
AMP-AMC
AMP-TE
SXT-TE
SXT
TE
AMP
Total de fenótipos
Origem de isolamento
Humana
Ambiental
Nº
%
Nº
%
1
2,86
0
1
2,86
0
2
5,71
1
50,00
2
5,71
0
1
2,86
0
9
25,71
0
8
22,86
0
0
1
50,00
2
5,71
0
6
17,14
0
1
2,86
0
1
2,86
0
1
2,86
0
35
100,00
2
100,00
Total de Fenótipos
Nº
1
1
3
2
1
9
8
1
2
6
1
1
1
37
%
2,70
2,70
8,11
5,41
2,70
24,32
21,62
2,70
5,41
16,22
2,70
2,70
2,70
100,00
55
A E. coli diarreiogênica que apresentou maior frequência e diversidade de fenótipos
de resistência foi a EAEC (73,68% - 14/19). Em seguida, destacou-se as frequências de EIEC
(54,54% - 6/11) e EPEC (42,10% - 8/19), porém estas diferenças não foram significativas (X2
de partição=3.9075; p=0,1417). Entre as EAEC e as EPEC o fenótipo mais comum foi AMPSXT-TE, com percentuais de 28,60% (4/14) e 37,50% (3/8), respectivamente. Entre as ETEC,
o mais frequente foi AMP-SXT (83,33% - 5/6) e entre as EIEC o SXT-TE (66,66% - 4/6). Os
fenótipos constituídos por cinco ou quatro antimicrobianos foram identificados somente entre
amostras de EAEC e EPEC, sendo o AMP-AMC-C-SXT-TE e o AMP-C-SXT-TE presentes
nestas duas categorias enquanto os fenótipos AMP-K-C-CN-SXT e AMP-K-C-SXT-TE,
envolvendo a canamicina, ocorreram somente entre as EAEC (Tabela 8).
Tabela 8- Fenótipos de resistência antimicrobiana das E. coli diarreiogênicas de acordo com
as categorias patogênicas.
Origem de
Isolamento
E. coli diarreiogênica
ETEC (6/21)* (28,57%)**
Fenótipos de Resistência
AMP-SXT-TE
AMP-SXT
EPEC (8/19)* (42,10%)**
AMP-AMC-C-SXT-TE
AMP-C-SXT-TE
AMP-SXT-TE
AMP-SXT
AMP-TE
EAEC (14/19)* (73,68)**
AMP-K-C-CN-SXT
Humana
AMP-K-C-SXT-TE
AMP-AMC-C-SXT-TE
AMP-C-SXT-TE
AMP-C-SXT
AMP-SXT-TE
AMP-SXT
AMP-TE
SXT-TE
SXT
AMP
EIEC (6/11)* (54,54%)**
AMP-SXT-TE
SXT-TE
TE
STEC (1/2)* (50,00%)**
SXT-TE
ETEC (1/2)* (50,00%)**
AMP-AMC
Ambiental
EPEC atípica (1/2)* (50,00)** AMP-AMC-C-SXT-TE
* Número de amostras resistentes por número de amostras avaliadas.
** Percentual de amostras resistentes.
Frequência
Nº
%
1
16,64
5
83,33
1
12,50
1
12,50
3
37,50
2
25,00
1
12,50
7,14
1
7,14
1
7,14
1
7,14
1
7,14
1
28,60
4
7,14
1
7,14
1
7,14
1
7,14
1
7,14
1
1
16,67
4
66,66
1
16,67
1
100,00
1
100,00
1
100,00
56
3.3. VARIABILIDADE GENÉTICA DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS
Na análise do perfil de macrorrestrição cromossômica pela enzima Xba I foram tipadas
70 das 72 E. coli diarreiogênicas identificadas. As duas amostras não tipadas apresentaram
degradação do DNA genômico, mesmo após inúmeras tentativas de extração. Estas amostras
foram identificadas como ETEC-ST, uma de origem ambiental e outra humana. Entre as 70 E.
coli diarreiogênicas foram identificados 67 distintos perfis de macrorrestrição com número
mínimo de 13 e máximo de 23 fragmentos variando na faixa de 48,5 a 485,0 kb. A
demonstração da variação dos tamanhos dos fragmentos de macrorrestrição e da corrida
eletroforética está apresentada abaixo na Figura 9.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
485,0 kb
436,5 kb
388,0 kb
339,5 kb
291,0 kb
242,5 kb
194,0 kb
145,5 kb
97,0
97,0 kb
48,5 kb
Figura 9- Perfis de macrorrestrição de E. coli diarreiogênicas gerados pela enzima Xba I por
meio do método de PFGE. Linhas 1, 7 e 13: Marcador de peso molecular (48,5 a 1018,5 kb);
linhas 2-6 e 8-10: E. coli diarreiogênicas com perfil de macrorrestrição; linha 11: ETEC 615
(ambiental) com degradação do DNA genômico; linha 12: Salmonella Braenderup.
Uma ampla variabilidade genética foi detectada na análise global das amostras deste
estudo, estando as categorias de E. coli diarreiogênicas dispostas em diferentes topologias do
dendograma (Figura 10).
57
Foi possível identificar dois grupos que concentraram a maioria das amostras. O grupo
G1 com 71,2% de similaridade contendo 10 amostras e o grupo G2 com 69,2% de
similaridade e reunindo o maior número de amostras (41). Outros nove agrupamentos
menores (G3 a G11) contendo até quatro amostras foram formados. Tanto os agrupamentos
maiores (G1 e G2) quanto os menores com duas a quatro amostras (G3, G6 a G10) ocorreram
independentes da categoria de E. coli diarreiogênica, da origem e da data de isolamento.
Observou-se nos grupos G1 e G2 que as amostras que agruparam em torno de 93 a
97% de similaridade pertenciam a mesma categoria de E. coli diarreiogênica. No grupo G1, as
amostras 537HIV (posição 11), 792MC1PJ (posição 12), 849HIV (13) e 1364HIV (14), com
93,3% de similaridade, foram identificadas como E. coli enteroinvasora (EIEC). No grupo
G2, as amostras 2077MC1PJ (19), 762MU (20) e 701HIV (21) com similaridade de 93,7 a
97,4% foram identificadas como E. coli enteropatogênica atípica (EPEC-a). Estas EPEC
foram identificadas de diferentes origens de isolamento, as amostras 2077MC1PJ (19) e
701HIV (20) são de origem humana, enquanto a amostra 762MU (20) é de origem ambiental.
As amostras, 106PJ (30) e 1078MC1PJ (31), com 94,4% de similaridade pertencem à
categoria EPEC-a, enquanto as amostras 2094MC2PJ (41) e 7562MC1PJ (42) pertencem à
categoria EAEC (E. coli enteroagregativa).
Por meio do PFGE foram identificadas três ocorrências com amostras apresentando
perfis idênticos (100% de similaridade), duas delas no grupo maior G2 e uma no grupo menor
G10. As amostras 1085MC2PJ (25) e 7242MC3PJ (26) pertencem à categoria EAEC e foram
isoladas em 02/2008 e 07/2009, respectivamente; enquanto, a amostra 887MC1PJ (50),
isolada em 02/2008, e a amostra 7551MC1PJ (51), isolada em 07/2009, pertencem à categoria
ETEC. As amostras 2164MC1PJ (67) e 7556MC3PJ (68) pertencem à categoria EAEC e
foram isoladas em 06/2008 e 07/2009, respectivamente.
Das cinco amostras ambientais tipadas, duas categorias diferentes: 770IG (2) - EPEC e
784IG (3) - EAEC, com mesmo período de isolamento (04/2004), foram agrupadas com
74,7% de similaridade no grupo G3, juntamente, com uma amostra de EPEC de origem
humana. As outras três amostras, 762MU (20) - EPEC, 743MU (34) -ETEC/ST e 813(1)IG
(53) - EPEC típica, ficaram dispersas no maior agrupamento identificado (G2).
Um reduzido grau de similaridade também foi observado quando realizada a análise
segundo as categorias diarreiogênicas. Em análise isolada, o grupo de amostras classificadas
como EPEC exibiu o menor percentual de similaridade (49,1%) (Figura 11), seguido por
EAEC (60,4%) (Figura 12) e ETEC (64,24) (Figura 13). Diferentemente destas, a categoria
58
EIEC apresentou amostras com maiores similaridades (68,2%), sustentadas por dois
agrupamentos com 71 e 74% de similaridade (Figura 14).
Na análise de agrupamento por categoria de E. coli diarreiogênica, observou-se, que
entre as categorias com apenas uma E. coli diarreiogênica de origem ambiental, as amostras
(14) 784IG - EAEC (Figura 12) e (15) 743MU - ETEC (Figura 13), continuaram dispersas no
dendograma. Especificamente, entre as EPEC (Figura 11), que apresentaram três amostras de
origem ambiental, essas amostras, também permaneceram dispersas em diferentes topologias
do dendograma, no entanto, evidenciou-se uma próxima relação genética, com 97% de
similaridade, entre uma amostra de origem humana [2077MC1 (1)] e outra de origem
ambiental [762MU (2)], não relacionadas geograficamente.
59
Figura 10- Dendograma da relação genética entre as E. coli diarreiogênicas baseado nos perfis de
macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo PFGE. O agrupamento por similaridade foi
determinado pelo coeficiente de Dice e método UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).
60
Figura 11- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteropatogênica
(EPEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo
PFGE. O agrupamento por similaridade foi determinado pelo coeficiente de Dice e método
UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5 / Applied Maths).
61
Figura 12- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroagregativa
(EAEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo
62
Figura 13- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enterotoxigênica
(ETEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo
63
Figura 14- Dendograma da relação genética entre as amostras de E. coli enteroinvasora
(EIEC) baseado nos perfis de macrorrestrição gerados pela enzima XbaI e definidos pelo
UPGMA. (Bionumerics Versão 6.5/ Applied Maths).
64
4.
DISCUSSÃO
4. 1.
DISTRIBUIÇÃO DAS E. coli DIARREIOGÊNICAS
As E. coli são consideradas micro-organismos versáteis variando de uma simples
integrante da microbiota normal até patotipos especializados em infecções intestinais e
extraintestinais. Sua especialização é ainda mais evidente quando se observa a diversidade de
categorias de E. coli diarreiogênicas e sua ampla distribuição entre humanos, animais e
ambientes naturais (Sousa, 2006).
Geralmente, os estudos que demonstram a distribuição das E. coli diarreiogênicas em
diferentes fontes de isolamento ocorrem de forma particularizada: somente em humanos com
interesse de esclarecer a causa da infecção intestinal (Moreno et al., 2010); somente em
animais para esclarecimento da causa diarreica ou elucidação de possíveis reservatórios
(Morato et al., 2009); em humanos e animais em busca de relações genéticas entre os isolados
(Ishii et al., 2007; Moura, 2009) e somente em amostras ambientais com o objetivo de
investigar a frequência e distribuição das E. coli diarreiogênicas em ambientes aquáticos
(Sidhu et al., 2013).
Neste estudo, a oportunidade de se investigar as E. coli diarreiogênicas de duas
diferentes origens (ambiental e humana) permitiu demonstrar sua circulação no estado do Pará
e confirmar sua ocorrência tanto em amostras humanas (13,36%) como em ambientais
(1,74%). Entre as ambientais, destacou-se a ocorrência das E. coli diarreiogênicas,
especificamente, em água superficial de rio (4,11%). Essa diferença percentual significativa
entre as duas origens (humana e ambiental) era esperada, pois as E. coli comensais ou
patogênicas não estão naturalmente distribuídas em ecossistemas aquáticos naturais como rios
ou lagoas. Elas são encontradas no ambiente intestinal de humanos e animais e sua presença
nestes ambientes aquáticos naturais ou não é atribuída à contaminação de origem fecal
humana ou animal (Albertini et al., 2009; Mohamed et al., 2012).
Em relação às categorias de E. coli diarreiogênicas pesquisadas neste estudo, os
resultados evidenciaram que todas as cinco categorias de E. coli diarreiogênicas estiveram em
circulação no estado do Pará. Das 72 amostras identificadas, as mais frequentes foram a
ETEC (29,17%) e as EAEC e EPEC na frequência de 26,39%. As EIEC (15,28%) e STEC
(2,78%) ocorreram em frequências menores e foram identificadas apenas em amostras de
origem humana, enquanto a única EPEC típica identificada foi de origem ambiental. Apesar
65
da ocorrência de EIEC e STEC somente em humanos e EPEC típica no ambiente aquático, o
estudo evidenciou que não houve diferença significativa quanto à ocorrência destas categorias
entre as origens humana e ambiental.
4.1.1. E. coli diarreiogênicas de origem humana
A existência de cinco categorias de E. coli potencialmente associadas à diarreia faz
com que esta bactéria seja a mais pesquisada e a mais frequentemente identificada como
causa de processos diarreicos na população infantil, principalmente, nos países em
desenvolvimento, onde as condições sanitárias são insatisfatórias. Nestes países, todas as
categorias de E. coli diarreiogênicas (EPEC típica, EPEC atípica, EAEC, STEC, ETEC e
EIEC) aparecem associadas à diarreia, variando apenas na frequência com que as mesmas
ocorrem. Esta variação depende, geralmente, da área geográfica e da população estudada
(Orlandi et al., 2006; Paniagua et al., 2007; Ochoa et al., 2011).
Em países desenvolvidos a maior ocorrência de E. coli diarreiogênica está relacionada
aos surtos de origem alimentar ocasionados pelo consumo de carne bovina, leite e derivados
contaminados por duas principais categorias: STEC e EAEC (Morabito et al., 1998, Scavia et
al., 2008; Mora et al., 2011; Werber et al., 2012). Nestes países, os casos isolados de diarreia,
geralmente estão associados às categorias EPEC atípica, STEC e EAEC, que são categorias
também isoladas em animais e que apresentam potencial zoonótico (Hernandes et al., 2009;
Santona et al., 2013).
Em alguns estudos realizados na Venezuela, Argentina e México, a frequência de E.
coli diarreiogênicas associadas à diarreia em crianças foi de 18,93% a 36,6 % com variação de
prevalência entre as categorias patogênicas investigadas.
Na Venezuela, Hannaoui et al. (2010) identificaram 32 casos (18,93%) de E. coli
diarreiogênica entre 169 crianças menores de 5 anos sendo isoladas 16 EPEC atípica (9,47%),
2 EPEC típica (1,18%), 10 ETEC-ST (5,91%), 3 EAEC (1,78%) e 1 EIEC (0,59%). As
amostras foram negativas para os genes Stx que codificam para as toxinas de Shiga
específicas de STEC.
Na Argentina, das 112 E. coli isoladas de crianças, as E. coli diarreiogênicas foram
detectadas em 36,6% (41) das amostras, com frequência similar entre as cinco categorias
identificadas, sendo: STEC, EPEC e EIEC (6,35% cada) e, EAEC e ETEC (ambas com 8,9%)
(Medina et al., 2010).
66
No México, das 300 E. coli isoladas de crianças, 32,3% (97) foram positivas para E.
coli diarreiogênica entre as crianças com diarreia, enquanto este percentual foi de apenas 5%
(4/80) entre as crianças sem diarreia. Entre as amostras diarreicas, as frequências foram de
13,3% para ETEC (40), 9,3% para EPEC (28), 8,6% para STEC (26) e 1% para EIEC (1)
(Paniagua et al. 2007).
No presente estudo, a frequência geral de 13,36% de E. coli diarreiogênicas de origem
humana foi inferior às observadas nos países citados acima e em algumas cidades brasileiras.
Em Porto Velho, a ocorrência de E. coli diarreiogênica entre crianças com e sem diarreia
(controles) foi de 14,25% (Orlandi et al., 2006), em Salvador de 17,31% (Bueris et al., 2007),
no Rio de Janeiro de 27,6% (Regua-Mangia et al., 2004) e no Espirito Santo de 32,23%
(Spano et al., 2008). Esta frequência pode ser realmente menor, ou pode ter ocorrido em
função da população deste estudo ter envolvido tanto crianças como indivíduos adultos com
ou sem diarreia, enquanto a frequência de E. coli diarreiogênica nestes outros estudos foi
apenas em relação à população infantil.
No nordeste brasileiro, Moreno et al. (2010), em João Pessoa, identificaram entre
2.344 E. coli isoladas de 290 crianças com diarreia e 290 saudáveis, a frequência de 25% para
EAEC, 9,3% e 1,7% para EPEC atípica e típica, respectivamente, 10% para ETEC e 1,4%
para EIEC. Não foram identificadas amostras de STEC e a comparação dos percentuais entre
casos diarreicos e controles indicaram associação de EAEC e EPEC atípica à diarreia aguda
infantil. Em Salvador, Franzolin et al. (2005) investigando E. coli isoladas de 119 crianças
com diarreia, observaram que 25,2% (30) foram positivas para E. coli diarreiogênicas sendo a
EPEC atípica (10,1%), ETEC (7,5%) e EAEC (4,2%) as categorias mais frequentes.
Percentuais menores foram registrados para STEC (1,6%), EIEC e EPEC típica, ambas com
0,8%.
No Espírito Santo, Spano et al. (2008) analisando 218 amostras de crianças com
diarreia e 86 controles, também identificaram as EPEC atípica e EAEC (5,5% e 4,6%,
respectivamente) em casos diarreicos e 6,9% (ambas) no grupo controle como as mais
frequentes e, observaram que a ETEC esteve associada aos casos diarreicos (3,2%) quando
comparada aos controles (1,2%). As EPEC típicas (0,9%) e EIEC (0,4%) foram identificadas
apenas em crianças com diarreia.
Um estudo prospectivo desenvolvido na cidade de São Paulo e Ribeirão Preto,
envolvendo crianças menores de 5 anos com diarreia, hospitalizadas (H) e atendidas em
ambulatórios (A), demonstrou que as de E. coli diarreiogênica foram mais frequentes entre as
67
crianças do atendimento ambulatorial (36,6% - 120/328) do que as crianças internadas (27,6%
- 123/446). Com exceção das categorias STEC (1,7%) e EPEC típica (0,4%) identificadas
apenas em crianças hospitalizadas, as demais categorias apresentaram frequências
semelhantes: EAEC (11%-H; 7,4%-A), ETEC (1,5-H; 0,9%-A) e EIEC (0,6%-H; 0,4%-A)
(Araújo et al., 2007).
Como observado nestes estudos brasileiros, as categorias patogênicas EAEC, EPEC
atípica e ETEC são as mais comuns detectadas em amostras de origem humana, sendo, em
algumas situações, associadas aos casos diarreicos, enquanto que as EPEC típica e STEC
acontecem de maneira menos frequente (Franzolin et al., 2005; Spano et al, 2008; Moreno et
al. 2010). Esse perfil é semelhante ao detectado no presente estudo, que destacou estas três
categorias como as mais frequentes E. coli diarreiogênicas entre as amostras humanas isoladas
no estado do Pará, no entanto, uma diferença importante foi observada: as EIEC foram mais
frequentes neste estudo do que nos estudos realizados em outras regiões brasileiras, que não
identificaram EIEC entre as amostras ou as identificaram em frequência inferior a observada
neste estudo.
A frequência de EIEC em amostras humanas foi destacada em outro estudo
desenvolvido na região norte. Na cidade de Porto Velho - Rondônia, Orlandi et al. (2006)
identificaram as E. coli diarreiogênicas como o principal grupo bacteriano associado à diarreia
em crianças menores de 6 anos de idade. Entre os grupos pesquisados, os autores detectaram a
frequência de 18,27% (86/470) de E. coli diarreiogênicas no grupo diarreico (D) e 9,58%
(39/407) no grupo controle (C). As EAEC (5,53%-D; 4,17%-C), ETEC (4,46%-D; 3,43%-C)
e EPEC típica (2,13%-D; 1,47%-C) foram as mais frequentes e ocorreram de forma
semelhante entre os dois grupos. As EPEC atípicas (4,04%-D; 0,49%-C) e EIEC (1,48%-D;
0%-C) estiveram associadas à diarreia. As EIEC e STEC (0,63%-D; 0%-C) foram
identificadas apenas no grupo diarreico.
Em vários países, incluindo o Brasil, essa baixa prevalência de EIEC se mantém
constante, mesmo com o passar dos tempos, e pode ser observada em estudos anteriores como
o desenvolvido por Medeiros et al. (2001) em que das 1.836 amostras de crianças abaixo de
10 anos com diarreia, avaliadas durante os anos de 1994 a 1997 na cidade de Ribeirão Preto São Paulo, as EIEC foram identificadas apenas em dois casos, um em 1994 e o outro em
1997. Em revisão realizada por Sabrá (2002) sobre a etiologia da diarreia em países como
México, Costa Rica, Bangladesh e Brasil, durante os anos de 1977 a 1983, a ocorrência de
EIEC variou de 0,6 a 2,0.
68
Considerando que as EIEC são patógenos exclusivos de humanos e o primer utilizado,
neste estudo, para detecção de ETEC abrange as variantes ST1a e ST1b da enterotoxina
termoestável (ST), encontrada principalmente em humanos, a contaminação destes indivíduos
pode ter ocorrido pela transmissão fecal-oral direta (homem-homem) ou indireta devido ao
consumo de água ou alimentos contaminados, sendo este tipo de contaminação diretamente
influenciado pelas condições higiênicas e/ou sanitárias insatisfatórias (Barreto et al., 2007).
Com relação às ocorrências das outras categorias diarreiogênicas identificadas em
humanos, observa-se as maiores frequências para ETEC (3,96%-19/479) e EAEC (3,76%18/479). A ETEC-ST (1,87%-9/479) ocorreu em frequência semelhante à ETEC-LT (1,67%8/479), enquanto que a ETEC-ST/LT foi menos frequente (0,83%). A ETEC continua sendo
um problema de saúde em países em desenvolvimento, como mostram os resultados de
Estrada-García et al. (2005), no México, onde esta categoria ocorreu em 27% dos casos
diarreico e, de Gomes et al. (1991) que descreveram a importância das ETEC em São Paulo,
sendo responsáveis por 7 a 20% de casos de diarreia infantil. Quanto as EAEC, sua frequência
reflete a revisão realizada por Huang et al. (2006) que evidenciou que a EAEC é cada vez
mais identificada em humanos e reconhecida como causa de diarreia aguda e crônica entre
crianças e adultos de forma semelhante em países desenvolvidos e em desenvolvimento.
Entre as EPEC, somente a categoria EPEC atípica foi encontrada entre as amostras
humanas na frequência de 3,34% (16/479). A diminuição e até mesmo a ausência de isolados
de EPEC típica em amostras de fezes humanas é um cenário atual no Brasil e em outros
países. Em 2004, essa mudança foi registrada por Rodrigues et al. (2004) ao observarem que
os sorotipos clássicos que caracterizam as EPEC típicas (O26, O55, O86, O111, O114, O119,
O125, O126, O127, O128, O142 e O158) estavam associados com EPEC atípicas (padrão de
aderência LAL - adesão localizada like) e EAEC (padrão de aderência agregativa). O registro
destes sorogrupos clássicos continuou frequente nos estudos sobre a etiologia da diarreia,
porém, atualmente, associados a diferentes categorias de E. coli diarreiogênicas como EPEC
atípica e EAEC (Ghosh & Ali, 2010; Moreno et al., 2010).
Um estudo com EPEC-a (eae+EAF-stx-), isoladas de pacientes com diarreia
sanguinolenta, utilizando o MLST (multi-locus sequence typing), os perfis de virulência e a
sorotipagem, identificou estas amostras como EHEC que perderam o gene stx durante a
infecção (Bielaszewka et al., 2008). Este evento é conhecido como interconversão de E. coli
A/E. O aumento das ocorrências de EPEC-a em detrimento a diminuição de EPEC-t, pode
estar acontecendo devido à interconversão de EPEC-t em EPEC-a pela perda do plasmídeo
69
EAF. Este evento de interconvesão colabora para a difícil caracterização das E.coli
diarreiogênica, principalmente, entre as E. coli produtoras de lesão A/E que apresentam o
gene eae+ (Schmidt, 2010).
Embora a transmissão direta de EPEC atípicas entre animais e humanos não esteja
estabelecida, a observação de alguns sorogrupos envolvidos na doença humana, e que foram
isolados também em animais, sugere a possibilidade de que esses animais sejam reservatórios
de EPEC atípicas e possam transmiti-las aos humanos (Hernandes et al., 2009; Monaghan et
al., 2013).
As únicas STEC encontradas no presente estudo foram de origem humana e,
identificadas na frequência de 0,41% (2/479), considerada inferior às registradas em outros
estados brasileiros, com exceção de Rondônia, que apresentou a frequência de 0,63%. Das
duas STEC, uma apresentou apenas o gene para toxina de Shiga-1, enquanto a outra
apresentou o gene eae (intimina) e os genes para ambas as toxinas de Shiga tipo 1 e 2. As
infecções por STEC podem evoluir de uma simples diarreia à colite hemorrágica e síndrome
hemolítica urêmica (SHU), que é uma síndrome causada por lesão renal, trombocitopenia e
anemia hemolítica que pode levar a morte (Blanco et al., 2004) e os casos graves de SHU
estão comprovadamente associados à ação da toxina de Shiga tipo 2 (Stx-2) (Gomes et al.,
2011).
A principal fonte de contaminação para o homem é o consumo de carne bovina
(principalmente a carne moída), de leite ou derivados contaminados, pois o gado bovino e
outros ruminantes são os principais reservatórios de STEC, sendo que, a transmissão direta
por meio destes animais também pode ocorrer (Montenegro et al., 1990; Zschock et al.,
2000).
Com exceção da Argentina, considerada região endêmica para Síndrome Hemolítica
Urêmica (SHU) (Fernandez-Brando et al., 2011), os países sul-americanos registram baixas
frequências de STEC comparado às outras categorias (EAEC, EPEC atípica e ETEC). Nestes
países, elas são isoladas de casos diarreicos leves e esporadicamente associadas à SHU
(Franzolin et al., 2005; Paniagua et al., 2007; Guth et al., 2002).
4.1.2. E. coli diarreiogênicas de origem ambiental
As categorias de E. coli diarreiogênicas estão sendo frequentemente identificadas em
vários ambientes aquáticos, desde ecossistemas naturais até reservatórios de abastecimento de
70
água e redes de esgoto, em diversas regiões do mundo (Nascimento & Van Der Sand, 2007;
Hamilton et al., 2010; Carlos et al., 2011; Ibkewe et al., 2011; Oliveira et al., 2012).
Em Taiwan, Huang et al. (2011) detectaram a presença de genes de E. coli
diarreiogênicas em 29,1% das amostras de abastecimento de água não tratada, sendo as
maiores frequências para STEC (10,9%), EPEC (9,1%) e EIEC (9,1,%). A frequência para
EAEC (3,6%) foi baixa e não houve identificação dos genes codificantes para toxinas LT e
ST de ETEC. Em outro país asiático, Bangladesh, Akter et al. (2013) utilizando a PCR para
detecção de genes de virulência, diretamente de sistemas aquáticos naturais, evidenciaram a
maior frequência de genes codificantes para os fatores de virulência de ETEC, EPEC e STEC
em comparação com os de EIEC e EAEC e, observaram que a distribuição destes genes
ocorria em função dos diferentes períodos sazonais.
Um estudo, realizado nos Estados Unidos, sobre a avaliação microbiológica da
qualidade da água de bacias hidrográficas utilizadas como fonte de abastecimento urbano,
Ibkewe et al. (2011) pesquisaram a ocorrência de genes de virulência para ETEC, STEC e
EPEC em 389 E. coli isoladas de água superficial e sedimentos destas bacias e, identificaram
uma positividade de 3,85% (15/389). Todas as 15 E. coli diarreiogênicas identificadas
possuiam o gene eae e foram classificadas como EPEC atípicas.
Na Austrália, Sidhu et al. (2013) avaliando a presença de genes de virulência em 300
E. coli isoladas da água de rios e enseadas, detectaram altas frequências de E. coli
diarreiogênica com variação maior ou menor entre as categorias de acordo com as períodos
sazonais, as EAEC (23%), STEC (11%) e EPEC (11%) prevaleceram sobre as outras
categorias durante os períodos secos, porém, depois de constantes chuvas fortes, que
caracterizam o período mais úmido, houve prevalência de todas as categorias, EPEC típicas
(14%) e atípica (3%), EAEC (12%), EIEC (10%), EHEC (7%) e ETEC (7%). Essas
observações levaram os autores a concluir a importância do controle das fontes de
contaminação humana e do gerenciamento de fontes de águas residuais para minimizar os
riscos para saúde humana, como também, destacaram para aquele país, a necessidade de
tratamento da água da chuva captada antes da reutilização para fins potáveis ou domésticos.
As observações destes estudos que destacam a ocorrência de E. coli diarreiogênicas
nos ecossistemas aquáticos naturais ou nas águas de abastecimento público, indicam a
participação destes ambientes como possíveis fontes de surtos ou de infecções por E. coli
diarreiogênicas para população geral em várias localidades do mundo, independente do estado
de desenvolvimento do país.
71
No Brasil, as E. coli diarreiogênicas já foram pesquisadas e identificadas em
ambientes aquáticos como águas de lastro e de regiões portuárias (Albertini, 2009), águas de
praia, de lagoas, de rios, de córregos e de represas (Melo, 2006; Orsi et al., 2007; Oliveira et
al., 2012; Rebello, 2012). Estes estudos avaliaram a presença de E. coli diarreiogênicas por
meio da pesquisa de genes codificantes dos diferentes fatores de virulência que as
caracterizam, utilizando-se para isso a reação em cadeia mediada pela polimerase - PCR.
Albertini (2009) identificou a presença de 11 (3,33%) E. coli diarreiogênicas entre as
331 E. coli isoladas de água de lastro e de regiões portuárias brasileiras, destas, quatro eram
EAEC, três ETEC, três EPEC atípica e uma STEC-Stx2.
Melo (2006), após avaliar 80 E. coli isoladas de lagoas em Minas Gerais, identificou
sete E. coli diarreiogênicas (8,75%), sendo cinco STEC-Stx2, uma ETEC-LT e uma EPEC
atípica. Rebello (2012) ao analisar as águas provenientes de rios, lagoas e canais, no Rio de
Janeiro, com influência de contaminação de esgoto urbano ou rural, identificou seis E. coli
diarreiogênicas (3,37%) sendo cinco STEC-Stx1 e uma ETEC-LT.
No estado de São Paulo, região metropolitana, Orsi et al. (2007) avaliaram 133 E. coli
isoladas de duas represas (Guarapiranga e Bilings) utilizadas com fins recreativos e
identificaram 11 E. coli patogênicas (8,2%), destas, seis eram EAEC, duas ETEC-LT, duas
EPEC atípica e uma STEC-Stx2.
Um interessante estudo envolvendo E. coli isoladas de águas de praias permanentes de
rios, foi desenvolvido por Oliveira et al. (2012) no estado do Tocantins. Essas praias são
artificiais oriundas das praias fluviais sazonais, típicas de alguns rios como o Tocantins e o
Araguaia, na região Centro-Norte do Brasil, que se formam durante a estação seca (julho e
agosto). Das 149 E. coli isoladas de seis diferentes praias e submetidas à pesquisa dos genes
de virulência para EPEC, ETEC e STEC por PCR, foram identificadas quatro (2,68%) E. coli
diarreiogênicas durante a estação seca, sendo duas EPEC atípicas e duas ETEC-LT .
Com base nos estudos citados acima, percebe-se que a frequência com que as
categorias de E. coli diarreiogênicas foram encontradas nos ambientes aquáticos no Brasil,
variou de 2,68% a 8,75%, percentual superior a frequência geral detectada neste estudo, que
foi 1,74% (6/344). Considerando, no entanto, as diferentes fontes ambientais investigadas
neste estudo, a identificação de E. coli diarreiogênica ocorreu, exclusivamente, entre as E. coli
provenientes de água superficial de rio na frequência de 4,11% (6/146). Este percentual ficou
em torno da média observada entre os estudos brasileiros que investigaram a presença de E.
coli diarreiogênica entre amostras de origem ambiental. Essa variação provavelmente ocorre
72
em função dos períodos sazonais ou/e posição das marés durante as coletas de água e, pela
presença, ausência ou proximidade com fontes contaminantes de origem humana ou animal.
Neste estudo, a frequência de 4,11% de E. coli diarreiogênica de origem ambiental
pode ser em decorrência da exposição destas águas superficiais de rios aos contaminantes
oriundos de esgoto urbano provenientes de Belém, de dejetos lançados pelas embarcações que
navegam pelo rio ou pela contaminação direta por dejetos animais ou humanos provenientes
da população ribeirinha.
Existe uma diversidade na frequência com que as E. coli diarreiogênicas estão
distribuidas entre os ambientes aquáticos brasileiros, sendo frequente a identificação de
EAEC, ETEC-LT, STEC (Stx-2) e EPEC atípica. No presente estudo, das seis E. coli
diarreiogênicas identificadas: ETEC-ST (1), ETEC-LT (1), EAEC (1), EPEC atípicas (2) e
EPEC típica (1), destaque-se a presença de ETEC-ST e EPEC típica, que são categorias não
frequentemente identificadas entre as amostras ambientais brasileiras e, a ausência de STEC
que é comumente identificada nestes estudos. A ausência de identificação de EIEC entre
amostras ambientais está de acordo com os achados brasileiros e alguns internacionais (Orsi et
al., 2007; Rebello, 2012; Oliveira et al., 2012; Mohamed et al., 2012).
Para algumas categorias de E. coli diarreiogênicas identificadas somente em humanos,
como as EPEC típicas e a EIEC, a presença nestes ambientes aquáticos sugere contaminação
de origem fecal humana, já no caso de outras categorias como a EAEC e a EPEC atípica,
identificadas em humanos e em uma variedade de animais, esta contaminação pode ser de
origem fecal humana ou animal. No caso específico de EPEC típica, entre as amostras de água
deste estudo, demonstra a possível influência de contaminação de origem humana e,
indiretamente, aponta para a circulação desta categoria na população local. Fato este, que se
destaca, em virtude da ausência de EPEC típica entre as amostras humanas de outras
localidades, como as avaliadas neste estudo e, da ocorrência cada vez mais rara das EPEC
típicas em detrimento de novas categorias que estão surgindo e se adaptando ao ambiente
intestinal e ambiental como as EPEC atípicas e EAEC.
A diversidade de E. coli diarreiogênicas identificadas entre as amostras de água
superficial do entorno das ilhas Grande e Murutucu, demonstra a possibilidade de risco de
transmissão destas categorias patogênicas à população ribeirinha que, pelos próprios hábitos
culturais impostos pela baixa condição socioeconômica, realiza a captação dessa água
contaminada para utilização no consumo, no uso doméstico e nas atividades de lazer. Há de se
considerar, também, o ambiente aquático não só como fonte de contaminação como também
73
de manutenção destes patógenos, contribuindo assim, com o ciclo das infecções intestinais
(Rebello, 2012).
A possibilidade de monitoramento ambiental realizado com a inclusão da identificação
destas categorias de E. coli diarreiogênica pode ajudar na avaliação sazonal de risco que estes
patógenos oferecem e minimizar o impacto das doenças diarreicas causadas pelo consumo de
água contaminada (Sidhu et al., 2013). O monitoramento ambiental também foi sugerido por
Batabyal et al., (2013) ao constatarem em Bengal, na Índia, a frequência de E. coli
diarreiogênica em 21,4% das amostras de água potável com multirresistência em 9% delas.
O reconhecimento do potencial patogênico de E. coli diarreiogênica isolada de
ambiente aquático é evidenciado no estudo de Lascowski et al. (2013) ao analisarem 1.850
amostras de E. coli isoladas de água de beber provenientes de 41 municípios do Estado do
Paraná e identificaram 12 STEC sendo 11 amostras isoladas de água tratada e uma não
tratada. Estas amostras foram positivas tanto para Stx-1 quanto para Stx-2 e apresentaram
mais outros cinco fatores de virulência, levando os autores a concluir que a água de beber,
especialmente de abastecimento de água não tratada, pode ser fonte de STEC potencialmente
patogênica ao homem.
A ausência de isolamento de qualquer categoria de E. coli diarreiogênica em água de
beber ou de uso doméstico coletadas no município de São Sebastião da Boa Vista, no
arquipélogo do Marajó, deve ser reflexo da baixa frequência com que estas categorias
ocorrem na região ou de características ambientais próprias que desfavoreçam a permanência
das mesmas no ambiente aquático, pois de acordo com as informações epidemiológicas a
maioria destas amostras não era tratada. Estas hipóteses poderão ser observadas com mais
propriedade através dos resultados que serão gerados pelo projeto “Marcadores
epidemiológicos em saúde no arquipélago do Marajó”, onde as E. coli de origem humana de
São Sebastião da Boa Vista serão testadas para categorias de E. coli diarreiogênicas, como
também, as amostras ambientais e humanas provenientes de outros municípios deste
arquipélago.
No estudo desenvolvido por Lothigius et al. (2009) ao analisarem experimentalmente
a sobrevivência e viabilidade de amostras de ETEC em água por meio da expressão de genes
envolvidos no metabolismo bacteriano, os autores constataram que as células bacterianas de
ETEC, na água doce ou salgada, podem entrar em um estado viável não cultivado durante
situações de estresse e permaneceram intactas por um período de três meses, apresentando
portanto, um potencial infeccioso mesmo após um longo período de incubação na água, que
74
consequentemente, potencializa o risco de transmissão de E. coli diarriogênica pelo ambiente
aquático.
A importância da presença de E. coli patogênica na água foi evidenciada por Ribeiro et
al. (2011) ao descobrirem o potencial citotóxico e enterotóxico de E. coli isoladas do
abastecimento de água potável do município de Ouro Preto, Minas Gerais. Estas amostras
foram capazes de produzir uma citotoxina termoestável com ação enterotóxica diferente das
produzidas por ETEC (LT), STEC (Stx-1 ou Stx-2) e EAEC (EAST-1) e que, até o momento,
não tinha sido descrita.
Considerando a presença de E. coli nos ambientes aquáticos como águas de praias
(Oliveira et al., 2012), é fato a constatação das mesmas nas areias, no entanto, são poucos os
registros que descrevem sua ocorrência, talvez por não existir legislação que regulamente a
qualidade microbiológica das areias como acontece com a análise da água da praia para
determinação dos critérios de balneabilidade (Andraus, 2006).
Pelo levantamento bibliográfico realizado, não foi identificado nenhum estudo que
demonstrasse a pesquisa de E. coli diarreiogênica em amostras de areia de praias,
caracterizando este trabalho como pioneiro na área. Apesar dos resultados negativos,
demonstrando ausência de E. coli diarreiogênica entre as 106 amostras isoladas das areias das
praias de Mosqueiro e Salinópolis, o risco da contaminação das areias pela presença de E. coli
e consequente transmissão ao homem é evidenciado por Andraus (2006) ao constatar que a
contaminação da areia da praia, não ocorre exclusivamente pela água do mar, e sim pelo
fenômeno de bioaculação de bactérias neste ambiente e, por Bevesrdorf et al., (2007) que
constatou que a areia de praia serve como reservatório e que pode favorecer a replicação e
contribuir para a persistência das E. coli neste ambiente.
4.2. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM E. coli DIARREIOGÊNICAS
O fenômeno de resistência bacteriana é considerado um problema mundial que vem se
agravando com o aumento do percentual de isolados resistentes e com o surgimento de
multirresistências, principalmente, as que incluem antimicrobianos considerados de última
escolha terapêutica como as quinolonas, os carbapenêmicos e as cefalosporinas de espectro
estendido (Vila et al., 1999; Shahrokhi et al., 2011).
Os resultados deste estudo demonstraram que as E. coli diarreiogênicas apresentaram
uma resistência antimicrobiana geral de 51,39% (37/72) e multirresistência de 45,94%
75
(17/37). As resistências mais frequentes foram observadas ao sulfametoxazol-trimetoprim
(44,44%-32/72), à ampicilina (40,28%-29/72) e à tetraciclina (33,33%-24/72) e, consideradas
significativas quando comparadas aos outros antimicrobianos como o cloranfenicol (11,12%8/72) e a amoxicilina-ácido clavulânico (5,56%-4/72). De acordo com Mosquito et al. (2011),
com exceção deste último, os demais, juntamente com o ácido nalidíxico, são os
antimicrobianos para os quais as E. coli diarreiogênicas apresentam os mais elevados
percentuais de resistência. Mesmo estes sendo, os principais antimicrobianos, o padrão de
resistência é variável para cada amostragem e local de estudo e, deve ser monitorado para o
acompanhamento das multirresistências.
No Brasil, Garcia et al. (2011) observaram que os maiores percentuais de resistência
entre as E. coli diarreiogênicas foram à tetraciclina (39,7%), à ampicilina (30,9%) e ao
sulfametoxazol-trimetoprim (30,9%), valores similares aos observados neste estudo. Além
desses antimicrobianos, foi registrada resistência à cefalotina de 5,9 % e à levofloxacina de
3%, que são antimicrobianos das classes das cefalosporinas e quinolonas, cuja resistência, não
foi detectada no presente estudo.
No Iran, a resistência antimicrobiana geral entre as E. coli diarreiogênica foi de 55%,
sendo os maiores percentuais para tetraciclina (63%), ampicilina (62%), amoxicilina-ácido
clavulânico (44,5%), sulfametoxazol-trimetoprim (39,5%), cefalotina (37%) e cloranfenicol
(31%); percentuais menores foram encontrados para ciprofloxacina e ácido nalidixico (ambos
2,5%) (Aslani et al., 2008).
Em dois trabalhos realizados no Peru, pode-se constatar, que os maiores percentuais de
resistência entre as E. coli diarreiogênicas foram para ampicilina (74 a 85%), cotrimoxazole
(70 a 79%), tetraciclina (61 a 65%) e ácido nalidíxico (28 a 30%); percentuais menores foram
registrados para amoxicilina-ácido clavulânico (9%), cefatoxima, ceftazidima, cloranfenicol e
gentamicina (4% cada) (Medina et al., 2010; Ochoa et al., 2010).
Ao contrário do que se observa nestes estudos, as E. coli diarreiogênicas desta
casuística, foram todas sensíveis aos antimicrobianos pertencentes as classes das quinolonas
(ciprofloxacina e àcido nalidíxico) e das cefalosporinas de espectro estendido (ceftazidima e
cefotazima), demonstrando que a resistência a estes antimicrobianos ainda não foi introduzida
entre as categorias de E. coli diarreiogênica da nossa região, isoladas durante o período de
estudo. Em outras localidades do Brasil e do mundo, a resistência a estes antimicrobianos é
frequente entre ETEC e EAEC de origem humana (Aslani et al., 2011; Regua-Mangia et al.,
2009b; Shahrokhi et al., 2011), esta consolidada entre categorias de ETEC animal (Lee et al.,
76
2009) e, é, frequentemente, relatada entre E. coli isoladas de infecções urinárias e
extraintestinais (Oteo et al., 2005; Pereira et al., 2007; Farshad et al., 2011).
A preocupação com o aumento da resistência à ciprofloxacina e às cefalosporinas,
entre humanos, é devido ao surgimento da multirresistência, pois como observado por Pereira
et al. (2007). As amostras de E. coli resistentes à ciprofloxacina, geralmente, apresentam
mecanismos de resistência adicionais, como a produção de β-lactamases de espectro
estendido, que reduzem as opções terapêuticas. Além disso, a constatação do aumento de
tratamento empírico da diarreia infantil com cefalosporinas, em hospitais brasileiros, pode
colaborar para seleção de isolados multirresistentes (Moura et al., 2012).
Apesar de terem sido identificadas apenas seis E. coli diarreiogênicas de origem
ambiental, os testes estatísticos permitiram evidenciar que não houve diferença significativa
entre os percentuais de resistência, detectados entre as E coli diarreiogênicas de origem
humana (53,03%-35/66) e ambiental (33,33%-2/6).
A comparação, entre E. coli diarreiogênicas de origem humana e ambiental,
demonstrou que os percentuais de resistência aos antimicrobianos sulfametoxazoltrimetoprim, ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol foram frequentes entre as duas origens. A
única diferença, considerada significativa, foi a resistência à amoxicilina-ácido clavulânico,
maior entre as E. coli diarreiogênicas de origem ambiental (40,00%) do que entre as de
origem humana (3,03%). Esta diferença pode ter sido influenciada pela pressão seletiva do
ambiente, uma vez que este antimicrobiano é considerado um metabólito secundário
produzido, naturalmente, por Streptomyces clavuligerus presentes no solo (Brown, A.G. et al.,
1976; Brown, D. et al., 1979).
A resistência antimicrobiana ao sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina, tetraciclina e
cloranfenicol identificada tanto em amostras de origem ambiental e humana, é reconhecida
como uma tendência global entre as E. coli diarreiogênicas isoladas de casos clínicos,
variando entre elas, apenas em relação a uma maior ou menor frequência entre estes
antimicrobianos (Ochoa et al., 2009; Shahrokhi et al., 2011; Garcia et al., 2011).
Neste estudo, por exemplo, todas as categorias apresentaram resistência aos três
principais antimicrobianos (sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina), no
entanto, essas resistências variaram de acordo com as categorias diarreiogênicas. As EPEC e
EAEC estiveram igualmente associadas à resistência à ampicilina (47,37% e 63,16%,
respectivamente), ao sulfametoxazol-trimetoprim (42,11% e 63,16%, respectivamente) e à
tetraciclina (36,84% e 47,37%, respectivamente) e, as ETEC à ampicilina (33,33%) e ao
77
sulfametoxazol-trimetropim (28,57%), enquanto que as EIEC estiveram associadas ao
sulfametoxazol-trimetoprim (45,45%) e à tetraciclina (54,55%), confirmando a tendência de
resistência para estes antimicrobianos.
Estrada-Garcia et al. (2005), no México, constataram que as resistências à ampicilina,
ao sulfametoxazol-trimetoprim e à tetraciclina foram maiores entre EPEC típicas, EAEC e
ETEC do que entre EPEC atípicas. Scaletsky et al. (2010), avaliando a resistência de EPEC,
no Brasil, observaram maiores percentuais de resistência entre as EPEC típicas
(sulfametoxazol-trimetoprim - 62,8%, ampicilina - 60%, tetraciclina -34,3% e cloranfenicol 20%) enquanto essa frequência foi 25,3%, 24%, 10,1% e 2,5% (respectivamente) para as
EPEC atípicas. Todas as EPEC (típicas e atípicas) foram sensíveis à ceftazidima,
ciprofloxacina e ácido nalidíxico. Contrário a estes resultados, a única EPEC típica,
identificada no presente estudou, foi sensível a todos os antimicrobianos testados.
Dentre as duas STEC identificadas, neste estudo, apenas uma apresentou resistência ao
sulfametoxazol-trimetoprim e à tetraciclina (SXT-TE). Este fenótipo também foi observado
por Cergole-Novella et al. (2011) ao analisarem 31 STEC isoladas de humanos (21) e bovinos
(11) e detectarem resistência à tetraciclina (100%) e ao sulfametoxazol-trimetoprim (68%), no
entanto, resistências a outros antimicrobianos como a estreptomicina (78%) e a ampicilina
(35%) foram observadas.
Os estudos sobre resistência entre as categorias são mais frequentes com as ETEC e,
assim como observado neste estudo, alguns confirmam que esta categoria é mais resistente à
ampicilina e ao sulfametoxazol-trimetoprim. Rodas et al. (2011), na Bolívia, detectaram as
resistências à ampicilina (53,5%), à ampicilina-sulbactam (46,5%) e ao sulfametoxazoltrimetoprim (32,5%) como as mais frequentes, enquanto, Shahrokhi et al. (2011), no Iran,
detectaram resistências ainda mais elevadas à ampicilina (88,93%) e ao sulfametoxazoltrimetoprim (82,3%).
Neste estudo, os resultados evidenciaram a presença de seis fenótipos de
multirresistência envolvendo de três a cinco antimicrobianos, com destaque para o AMPSXT-TE encontrado em 24,32% das amostras. As maiores frequências para este fenótipo de
multirresistência e para os de dupla resistência como o AMP-SXT (21,62%) e o SXT-TE
(16,22%) funcionam como reflexo do elevado percentual de resistência encontrado para estes
antimicrobianos individualmente (ampicilina - 40,28%; sulfametoxazol-trimetoprim 44,44%; tetraciclina - 33,33%) e evidencia a possibilidade do compartilhamento de genes de
resistência em uma mesma estrutura genética como os integrons, evidenciando uma possível
78
coseleção de resistência para estes antimicrobianos (Di Conza & Gutking, 2010; Mosquito et
al., 2011).
Resultados semelhantes foram observados por Ochoa et al. (2010) e Rivera et al.
(2010), no Peru, onde evidenciaram que os fenótipos AMP-SXT-TE (24%) e AMP-SXT
(19%) foram os mais frequentes entre as categorias de E. coli diarreiogênicas e que as ETEC e
EAEC foram as que apresentaram maiores percentuais de multirresistência.
A partir da observação de Pinto (2013) ao avaliarem E. coli humanas e ambientais e,
demonstrarem a ocorrência de genes de resistência aos aminoglicosídeos e ao trimetoprim
localizados em integrons de classe 1, que já possuem no segmento conservado 3’ os genes de
resistência às sulfonamidas, é possível considerar a hipótese de que, entre as amostras deste
estudo, a existência dos fenótipos de multirresistência mais comuns, envolvendo a ampicilina,
o sulfametoxazol-trimetoprim e a tetraciclina, seja em decorrência da presença concomitante
de genes de resistência nestes integrons e da pressão seletiva ocorrida por várias décadas de
utilização destes antimicrobianos na rotina clínica.
Neste estudo, a observação dos fenótipos de resistência por categoria de E. coli
dirreiogênica, identificou a EAEC (73,68%) e a EIEC (54,54%) como as categorias com
maior frequência de resistência. A maior diversidade de fenótipos de multirresistência foi
observada entre as EAEC e EPEC, sendo AMP-SXT-TE o mais frequente em ambas. Essa
diversidade de fenótipos, principalmente, em EAEC e EPEC também foi observada por
Garcia et al. (2011), sendo o percentual de multirresistência de 81,9% para EAEC e de 60%
para EPEC. Destaca-se também que somente entre estas duas categorias foram observadas
resistência ao cloranfenicol e identificados fenótipos de resistência com mais de 4
antimicrobianos, incluindo o fenótipo AMP-AMC-C-SXT-TE que foi detectado tanto nas
amostras humanas como ambientais.
A EAEC é apresentada por Aslani et al. (2011) e Regua-Mangia et al. (2009b) como
uma categoria isolada de casos diarreicos com emergente resistência. Além da consolidada
resistência aos antimicrobianos de escolha para o tratamento da diarreia: ampicilina (100%),
eritromicina (100%), co-trimoxazole (71,4%) e tetraciclina (64,3%), as EAEC apresentaram
elevados percentuais de resistência ao ácido nalidíxico (57,1%), as cefotazime e ceftriaxone
(42,9%) e ao cloranfenicol (35,7%) (Aslani et al., 2011). A multirresistência para até seis
antimicrobianos foi observada em 81,5% das EAEC, que apresentaram 11 diferentes fenótipos
de multirresistência contendo os antimicrobinos ciprofloxacina, ácido nalidíxico, cefotaxima,
ceftazidima e nitrofurantoína (Regua-Mangia et al., 2009b).
79
Entre as seis amostras de E. coli diarreiogênicas de origem ambiental (água de
superfície de rio), duas foram resistentes a dois e a três antimicrobianos. Os fenótipos de
resistência foram AMP-AMC em ETEC e AMP-AMC-C-SXT-TE em uma EPEC atípica.
Alguns trabalhos, no Brasil, demonstraram a ocorrência de multirresistência entre E. coli
diarreiogênicas isoladas de ambientes aquáticos que incluem, além da amoxicilina-ácido
clavulânico e do cloranfenicol, as quinolonas e as cefalosporinas (Albertini, 2009; Oliveira et
al., 2012).
Oliveira et al., (2012) detectaram multirresistência entre quatro E. coli diarreiogênicas
isoladas de água de praias urbanas da cidade de Palmas-Tocantins, duas EPEC apresentaram
resistência aos fenótipos SXT-TE-CEF (cefalotina) e o outro AMP-C-SXT-TE, enquanto os
fenótipos de resistência para as ETEC-LT foram AMP-TE e AMP-AMC-SXT-TE-TIC-CEF,
sendo TIC (Ticarcilina+ácido clavulânico).
Albertini (2009) identificou entre as E. coli isoladas de água de lastro e de regiões
portuárias brasileiras, 49,6% de resistência variando de dois a oito antimicrobianos, com
destaque para os fenótipos AMP-CTX-CAZ-CPX-ERI-PPT-SUT e AMI-AMC-AMP-CTXCAZ-CRX-ERI-SUT [AMI (amicacina), CTX (cefotaxima), CAZ (ceftazidima), CPX
(ciprofloxacina), CRX (cefuroxima), ERI (eritromicina), SUT (sulfametoxazol-trimetoprim].
Nos trabalhos de Oliveira et al. (2012) e Albertini (2009), as E. coli foram isoladas de
água urbanas próximas a descarga de efluentes e este fato é considerado como favorecedor
para o isolamento de E. coli com fenótipos de multirresistência, no entanto, Melo (2006) ao
avaliar E. coli diarreiogênicas e não diarreiogênicas isoladas de água de lagoas em área de
preservação ambiental e com baixa contagem de coliformes fecais, identificaram 65% de
resistência a pelo menos um antimicrobiano e 16% de multirresistência para até sete
antimicrobianos, incluindo a ampicilina (AMP), o sulfametoxazol-trimetropim (SXT), a
tetraciclina (TE), amoxicilina-ácido clavulânico (AMC), cloranfenicol (C), ceftazidima
(CAZ), ceftriazona (CRO), cefalotina (CFL), cefoxitina (CFO) entre outros.
Esse perfil de multirresistência entre E. coli diarreiogênicas de origem ambiental
também foi observado em Bangladesh, onde as ETEC e EPEC típicas apresentaram
multirresistências que envolviam além da ampicilina, sulfametoxazol-trimetoprim e
tetraciclina, as cefalosporinas de espectro estendido, quinolonas e fluoroquinolonas (Talukdar
et al., 2013).
A presença de resistência antimicrobiana entre micro-organismos aquáticos é
considerada frequente, mais de 90% dos isolados bacterianos naturalmente encontrados na
80
água são resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 20% apresentam multirresistência, de
forma que o meio ambiente, é considerado como um grande reservatório de genes de
resistência (Martinez, 2003; Dantas et al., 2008; Caumo et al., 2010). A água constitui, não
somente um meio de disseminação de organismos resistentes aos antimicrobianos, ela é
também, considerada a via pela qual os genes de resistência são introduzidos em bactérias
naturais ou transitórias, alterando a microbiota ambiental (Caumo et al., 2010).
A capacidade que as bactérias possuem de trocar informação genética, por captação de
DNA livre (transformação) ou através do contato entre as mesmas (conjugação), associada à
pressão seletiva no ambiente, devido à presença de substâncias antimicrobianas naturais
produzidas pela própria microbiota ambiental ou de efluentes industriais, agrícolas ou
hospitalares, favorece a disseminação da resistência antimicrobiana entre bactérias presentes
no ambiente aquático (Alonso, 2001; Baquero et al., 2008).
4.3.
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE E. coli DIARREIOGÊNICA DE
ORIGEM HUMANA E AMBIENTAL
A análise dos perfis de macrorrestrição enzimática revelou uma ampla variabilidade
genética entre as amostras de E.coli diarreiogênicas indicando as diferentes origens clonais
dos isolados.
A variabilidade de perfis entre amostras de uma mesma categoria diarreiogênica,
encontrada neste estudo, reforça a hipótese de que a diversidade genômica de E. coli é
resultado de um conjunto de mudanças ocasionadas por mecanismos como mutações,
deleções e inserções de DNA (plasmídeos, bacteriófagos, transposons, elementos de inserção
e ilhas genômicas) de outros micro-organismos, eventos que ocorrem de forma
independentemente, nas diversas categorias patogênicas. Esta propriedade dinâmica do DNA
de se modificar é chamada de plasticidade genômica (Schmidt & Hensel, 2004; Rasko et al.,
2008; Schmidt, 2010).
No contexto das E. coli diarreiogênicas o fenômeno de plasticidade genômica está
diretamente envolvido na determinação das categorias patogênica, pois como observado por
Kaper et al. (2004) e Bielaszewska et al. (2007), a riqueza de elementos genéticos móveis que
caracterizam os fatores de virulência das categorias de E. coli diarreiogênicas como: os
transposons codificantes da enterotoxina termoestável (ST) de ETEC, os plasmídeos para
produção de enterotoxina termolábel (LT) de ETEC e de invasão de EIEC, os bacteriófagos
81
carreadores dos genes para as toxinas de Shiga (Stx) de STEC e as ilhas de patogenicidade
como o LEE (locus of enterocyte effacement) em EPEC/EHEC, permite e contribui de forma
expressiva para a constante evolução e diversidade de E. coli patogênicas. A presença desses
elementos genéticos móveis, desde que inseridos no genoma cromossômico, podem, portanto,
aumentar a variabilidade dentro dos perfis gerados através do PFGE (Gurtler & Mayall,
2001).
A comparação entre o genoma de E. coli diarreiogênicas de mesma categoria, permitiu
a Rasko et al. (2008) a observação de que cada isolado patogênico pode ter se desenvolvido,
independentemente da capacidade de virulência, este fato, portanto, também contribui para
variabilidade genética entre as categorias diarreiogênicas e justifica, até mesmo, a
variabilidade genética entre categorias patogênicas caracterizadas pelos mesmos fatores de
virulência.
A potencialidade da metodologia de PFGE também pode ter contribuído para elevada
variabilidade entre as E. coli diarreiogênicas deste estudo, observada pelas diferentes posições
na topologia do dendograma geral e pelos baixos percentuais de similaridade encontrados por
categoria patogênica (EPEC: 49,1%; EAEC: 60,4%; ETEC: 64,24 e EIEC: 68,2%) (Ribot et
al., 2006).
Os estudos comparando uma categoria específica de E. coli diarreiogênica entre
diferentes ou mesmas fontes de isolamento, demonstraram esta ampla variabilidade. Santos et
al. (2010), comparando STEC O113:H21 de origem animal e humana, observaram que o
percentual de similaridade entre as amostras foi 75%, com formação de um pequeno
agrupamento com 87% de similaridade, somente entre as amostras humanas. Blanco et al.
(2006) avaliando 57 amostras de EPEC isoladas de crianças com diarreia, identificaram 44
distintos perfis de macrorrestrição gerando 12 agrupamentos, evidenciando a diversidade
clonal entre as EPEC associadas à diarreia infantil.
As relações genéticas entre E. coli diarreiogênicas, utilizando-se o PFGE, que
evidenciam a ocorrência de altos ou idênticos percentuais de similaridade genética, ocorrem
entre amostras geograficamente ou epidemiologicamente relacionadas, como demonstrado
nos resultados encontrados por Shaheen et al. (2009) e Vaz et al. (2006), descritos abaixo.
Apesar da ampla diversidade genética encontrada entre ETEC ST, LT ou ST/LT
expressando o mesmo fator de colonização antigênico (CFA-I) e, isoladas de crianças com
diarreia grave, algumas amostras com o mesmo fator de virulência (ST ou LT ou ST/ST)
82
apresentaram 100% de similaridade e foram procedentes do mesmo local e período de
atendimento (Shaheen et al., 2009).
No estudo desenvolvido por Vaz et al. (2006) ao avaliarem 46 STEC e não-STEC dos
sorogrupos O26, O111 e O157 observaram que dois perfis com 100% de similaridade
ocorreram entre sorotipos O157:H7 isolados de surto na mesma região geográfica.
Neste estudo, a identificação de E. coli diarreiogênicas apresentando padrões de PFGE
indistinguíveis, permitiu caracterizá-las como clones, que se encontravam geograficamente
relacionados, circulando na mesma localidade, em diferentes anos (Magalhães et al., 2005).
Essas amostras eram de origem humana, provenientes de indivíduos participantes do mesmo
projeto de pesquisa “Saúde no município de Juruti, Pará: cenário atual, desafios e
possibilidades” e, portanto, residentes no mesmo município. Em contra partida, a ocorrência
de ampla variedade genética entre as amostras de E. coli diarreiogênicas de origem humana,
envolvendo amostras de uma mesma localidade e período de estudo, como as provenientes de
Juruti, permitiu a observação de um padrão de infecção endêmica por E. coli diarreiogênicas
nesta localidade (Afset et al., 2008).
Quando se estuda a relação genética, por PFGE, entre amostras não relacionadas
epidemiologicamente ou geograficamente, como neste estudo, que comparou os perfis de
macrorrestrição entre E. coli diarreiogênicas de origem ambiental e humana de diferentes
localidades, a possibilidade de ocorrência de clones entre os isolados é baixa, no entanto, o
estudo evidenciou estreita relação genética (97% de similaridade) entre duas amostras de
EPEC de origem humana e ambiental, indicando a possibilidade de circulação de E. coli
diarreiogênicas, geneticamente relacionadas, em diferentes ambientes (Badri et al., 2009;
Melo, 2010).
83
5.
CONCLUSÕES
 As cinco categorias de E. coli diarreiogênicas - E. coli enteropatogênica (EPEC), E.
coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora
(EIEC) e E.coli produtora de toxina de Shiga (STEC) - estiveram em circulação no
estado do Pará, no período de 2000 a 2012, sendo mais frequentes entre as amostras de
origem humana do que entre as amostras de origem ambiental;
 Entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana, foram identificadas as categorias
ETEC, EAEC, EPEC atípicas, EIEC e STEC, sendo as três primeiras as mais
frequentes e, também identificadas entre as amostras de origem ambiental;
 As EIEC e STEC foram identificadas apenas entre as E. coli de origem humana,
enquanto, a EPEC típica foi, exclusivamente, de origem ambiental;
 A presença de ETEC, EAEC, EPEC atípica e típica na água superficial de rio,
evidencia que o ambiente aquático pode servir de fonte de infecção para população;
 Embora sem significância estatística, a resistência antimicrobiana foi maior entre as E.
coli diarreiogênicas de origem humana do que entre as de origem ambiental;
 As
E.
coli
diarreiogênicas
apresentaram
resistência
aos
antimicrobianos
sulfametoxazol-trimetoprim, ampicilina e tetraciclina, porém foram sensíveis ao ácido
nalidíxico, ciprofloxacina, ceftazidima e cefotaxima, demonstrando que a resistência
às quinolonas e às cefalosporinas de espectro estendido ainda não foi introduzida entre
as categorias de E. coli diarreiogênica identificadas no estado do Pará;
 A resistência antimicrobiana entre as E. coli diarreiogênicas de origem humana e
ambiental foi semelhante para os antimicrobianos testados, à exceção da resistência à
amoxicilina-ácido clavulânico, que foi maior entre as E. coli diarreiogênicas de origem
ambiental;
 Os fenótipos de resistência mais frequentes entre as E. coli diarreiogênicas de origem
humana foram AMP-SXT-TE, AMP-SXT e SXT-TE, diferentes dos fenótipos de
resistência apresentados pelas amostras ambientais: AMP-AMC-C-SXT-TE e AMPAMC;
84
 Apesar de não ter sido observada diferença na frequência de resistência antimicrobiana
entre as categorias de E. coli diarreiogênicas, a EAEC e a EPEC foram as categorias
que apresentaram maior diversidade de fenótipos de resistência;
 Os perfis de macrorrestrição enzimática revelou uma ampla variabilidade genética
entre as amostras de E.coli diarreiogênicas indicando diferentes origens clonais dos
isolados.
 Foi evidenciada estreita relação genética entre uma amostra de EPEC de origem
humana e outra ambiental, indicando a possibilidade de circulação de E. coli
diarreiogênicas, geneticamente relacionadas, em diferentes ambientes.
85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AFSET, J.E., ANDERSSEN, E., BRUANT, G., HAREL, J., WIELER, L., BERGH, K.
Phylogenetic background and virulence profiles of atypical enteropathogenic Escherichia
coli strains from a case-control study using multilocus sequence typing and DNA
microarray analysis. Journal of Clinical Microbiology 46 (7): 2280 - 2290, 2008.
AKTER, S., ISLAM, M., AFREEN, K.S., AZMUDA, N., KHAN, S.I., BIRKELAND, N.K.
Prevalence and distribution of different diarrhoeagenic Escherichia coli virulotypes in
major water bodies in Bangladesh. Epidemiology and Infection 28: 1-10, 2013.
ALBERT, M. J.,FARUQUE, S.M., FARUQUE, A.S., NEOGI, P.K., ANSARUZZAMAN,
M., BHUIYAN, N.A., ALAM, K., AKBAR, M.S. Controlled study of Escherichia coli
diarrheal infections in Bangladesh children. Journal of Clinical Microbiology 33 (4):
973-977, 1995.
ALBERT, M.J. Epidemiology of enteropathogenic Escherichia coli infection in Bangladesh.
Revista de Microbiologia 27 (l): 17-20, 1996.
ALBERTINI, L.S. Ecologia, fatores associados à virulência e diversidade de Escherichia
coli isoladas de amostras de água de lastro, água de regiões portuárias e moluscos
bivalvel no Brasil. Tese (Doutorado em Ciências) – São Paulo, Universidade de São
Paulo, 2009. 215p.
ALONSO, A., SANCHEZ, P., MARTINEZ, J. L. Environmental selection of antibiotic
Resistance genes. Environmental Microbiology 3:1 - 9, 2001.
ANDRAUS, S. Aspectos Microbiológicos da Qualidade Sanitária das Águas do Mar e
areias das Praias de Matinhos, Caiobá e Guaratuba-Pr. Dissertação (Mestrado) - Curitiba,
Universidade Federal Do Paraná, 2006. 142p.
ANGELES, G.R. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de
Escherichia coli. Artículo de Revisión. Instituto de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos. Salud Pública de México 44 (5): 464-475, 2002.
ARANDA, K.R.S., FABBRICOTTI, S.H., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A.
Single multiplex assay to identify simultaneously enteropathogenic, enteroaggregative,
enterotoxigenic, enteroinvasive and Shiga toxin-producing Escherichia coli strains in
Brazilian children. FEMS Microbiology Letters 267 (2):145-150, 2007.
ARANDA, K.R.S., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A. Evaluation of Multiplex
PCRs for Diagnosis of Infection with Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella spp.
Journal of Clinical Microbiology 42 (12): 5849-5853, 2004.
ARAUJO, J.M., TABARELLI, G.F., ARANDA, K.R., FABBRICOTTI, S.H.,
FANGUNDES-NETO, U., MENDES, C.M.F., SCALETSKY, I.C.A. Typical
enteroaggregative and atypical enteropathogenic types of Escherichia coli are the most
prevalent diarrhea-associated pathotypes among Brazilian children. Journal of Clinical
Microbiology 45 (10): 3396-3399, 2007.
ASLANI, M.M., AHRABI, S.S., ALIKHANI, Y.M., JAFARI, F., ZALI, R.M., MANI, M.
Molecular detection and antimicrobial resistance of diarrheagenic Escherichia coli strains
86
isolated from diarrheal cases. Saudi Medical Journal 29 (3): 388-392, 2008.
ASLANI, M.M., ALIKHANI, M.Y, ZAVARI, A., YOUSEFI, R., ZAMANI, A.R.
Characterization of enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) clinical isolates and their
antibiotic resistance pattern. International Journal of Infectious Diseases 15: 136–139,
2011.
AYRES, M.; AYRES JUNIOR, M.; AYRES, D.L.; SANTOS, A.A.S. BioEstat 5.0.:
aplicações estatísticas nas áreas das Ciências Biomédicas. Sociedade Civil Mamirauá:
Belém, Pará-Brasil. 2007. 324p.
BADRI, S., FASSOUANE, A., FILLIOL, I., HASSAR, M., COHEN, N. Clonal analysis of
Escherichia coli strains isolated from food by pulsed field electrophoresis. Internet
Journal of Food Safety 11: 44-49, 2009.
BALODA, S.B., KROVACEK, K., ERICSSON, L., LINNE, T., MANSSON, I. Detection of
aerolysin gene in Aeromonas strains isolated from drinking water, fish and foods by
polymerase chain reaction. Comparative Immunology and Microbiology Infections
Diseases 18: 17-26, 1995.
BANDO, S.Y., TRABULSI, L.R., MOREIRA-FILHO, C.A. Genetic relationship of
diarrheagenic Escherichia coli pathotypes among the enteropathogenic Escherichia coli O
serogroup. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 102 (2): 169-174, 2007.
BAQUERO, F., MARTÍNEZ, J. L., CANTÓN, R. Antibiotics and antibiotic resistance in
water environments. Current Opinion in Biotechnology 19, 260 - 265, 2008.
BARRETO, M.L.; BARRETO, M.; GENSER, B.; STRINA, A.; TEIXEIRA, M.G.; ASSIS,
A.M.O; REGO, R.F.; TELES, C.A; PRADO, M. ; MATOS, S. M. A. ; SANTOS, D. N.;
CAIRNCROSS, S. Effect of city-wide sanitation programme on reduction in rate of
childhood diarrhoea in northeast Brazil: assessment by two cohort studies. Lancet, 9599:
1622 – 1628, 2007.
BASTOS, F.C., VAZ, T.M.I., IRINO, K., GUTH, B.E.C. Phenotypic characteristics,
virulence profile and genetic relatedness of O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli
isolated in Brazil and other Latin American countries. FEMS Microbiology Letters 265
(1): 89–97, 2006.
BATABYAL, P., MOOKERJEE, S., SUR, D., PALIT, A. Diarrheogenic Escherechia coli in
potable water sources of West Bengal, India. Acta Tropica 127 (3): 153-157 2013.
BAUDRY, B., SAVARINO, S.J.,VIAL, P., KAPER, J.B., LEVINE, M.M. A sensitive and
specific DNA probe to identify enteroagregative Escherichia coli, a recently discovered
diarrheal pathogen. Journal Infection Diseases 161: 1249-1251, 1990.
BAUER, A. W., BAUER, A.W., KIRBY, W.M., SHERRIS, J.C., TURCK, M. Antibiotic
susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical
Pathology 45: 493-496, 1966.
BEVERSDORF, L.J., BORNSTEIN-FORST, S.M., MCLELLAN, S.L. The potential for
beach sand to serve as a reservoir for Escherichia coli and the physical influences on cell
87
die-off. Journal of Applied Microbiology 102: 1372 – 1381, 2007.
BIELASZEWSKA, M., DOBRINDT, U., GÄRTNER, J., GALLITZ, I., HACKER, J.,
HARCH, H., MÜLLER, D., SCHUBERT, S., SCHMIDT, M.S., SORSA, L.J.,
ZDZIARSKI, J. Aspects of genome plasticity in pathogenic Escherichia coli.
International Journal of Medical Microbiology 297: (7-8), 625 - 639, 2007.
BIELASZEWSKA, M.; MIDDENDORF, B.; KÖCK, R.; FRIEDRICH, A.W.; FRUTH, A.;
KARCH, H. Shiga toxin-negative attaching and effacing Escherichia coli: distinct clinical
associations with bacterial phylogeny and virulence traits and inferred in host-pathogen
evolution. Clinical Infectious Disease 47: 208–217, 2008.
BLACK, R.E. Epidemiology of traveler’s diarrhea and relative importance of various
pathogens. Reviews Infection Disease 12 (1):73-79, 1990.
BLANCO, M., BLANCO, J.E., DAHBI, G., MORA, A., ALONSO, A.P., VARELA, G.,
GADEA, M. P., SCHELOTTO, F., GONZÁLEZ, E.A., BLANCO, J. Typing of intimin
(eae) genes from enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated from children with
diarrhoea in Montevideo, Uruguay: identification of two novel intimin variants (mB and
jR/b2B). Journal of Medical Microbiology 55:1165-1174, 2006.
BLANCO, M., PADOLA, N.L., KRUGER, A. Genes de virulencia y tipos de intiminas de
Escherichia coli productoras de toxinas Shiga aisladas de ganado bovino y carne de
vacuno en Argentina. International Microbiology 7 (4): 269-276, 2004.
BLANCO, M., SCHUMACHER, S., TASARA, R., ZWEIFEL, C., BLANCO, J.E., DAHBI,
G., BLANCO, J., STEPHAN, R. Serotypes, intimin variants and other virulence factors of
eae positive Escherichia coli strains isolated from healthy cattle in Switzerland.
Identification of a new intimin variant gene (aea-eta2). BioMed Central Microbiology 5:
23-34, 2005.
BLANK, T.E., LACHER, D.W., SCALETSKY, I.C.A., ZHONG, H., WHITTAM, T.S.,
DONNENBERG, M.S. Enteropathogenic Escherichia coli O157 Strains from Brazil.
Emerging Infectious Diseases 9 (1): 36-42, 2003.
BLATTNER, F.R., PLUNKETT III, G., BLOCH, C.A., PERNA, N.T., BURLAND, V.,
RILEY, M., COLLADO-VIDES, J., GLASNER, J.D., RODE, C.K., MAYHEW, G.F.,
GREGOR, J., DAVIS, N.W., KIRKPATRICK, H.A., GOEDEN, M.A., ROSE, D.J.,
MAU, B., SHAO, Y. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science
277, 1453 - 1462, 1997.
BORGES, L.J., CAMPOS, M.R.H., CARDOSO, J.L., ANDRE, M.C.D.P.B., SERAFINI,
A.B. Molecular epidemiology of microorganisms isolated from food workers and enteral
feeding of public hospitals. Journal of Food Sciense 75 (7): M449- M454, 2010.
BRASIL, Ministério da Saúde. Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Consenso
sobre o uso racional de antimicrobianos. Brasília: MS, 57p. 1998.
BRASIL, Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Doenças Diarreicas Agudas. In: Guia de Vigilância
Epidemiológica. Brasília – (Série A: Normas e Manuais Técnicos): MS, 2009. P. 33-47.
88
BRAY, J., BEAVAN, T.E.D. Slide Agglutination of Bacterium coli var. neapolitanum in
Summer Diarrhoea. Journal of Pathology and Bacteriology 60: 395-401, 1948.
BROWN, A.G., BUTTERWORTH, D., COLE, M., HANSCOMB, G., HOOD, J.D.,
READING, C., ROLINSON, G.N. Naturally-occurring β-Lactamase inhibitors with
antibacterial activity. The Journal of antibiotics, XXIX (6): 668-669, 1976.
BROWN, A.G., BUTTERWORTH, D., COLE, M., HANSCOMB, G., HOOD, J.D.,
READING, C., ROLINSON, G.N. Naturally occurring β-lactamase inhibitor with
antibacterial activity. The Journal of Antibiotics 29 (6): 668-669, 1976.
BROWN, D., EVANS, J.R., FLETTON, R.A. Structures of three novel β-lactams isolated
from Streptomyces clavuligerus. Journal of the Chemical Society, Chemical
Communications, 282-283, 1979.
BROWNE, R.M.R. The Relentless Evolution of Pathogenic Escherichia coli. Editorial
Commentary. Clinical Infectious Diseases 41: 793-794, 2005.
BROWNE, R.M.R., BORDUN, A.M., TAUSCHEK, M., BENNETT-WOOD, V.R.,
RUSSELL, J., OPPEDISANO, F., LISTER, N.A., BETTELHEIM, K.A., FAIRLEY, C.K.,
SINCLAIR, M.I., HELLARD, M.E. Escherichia coli and Community Acquired
Gastroenterits, Melbourne, Australia. Emerging Infectius Diseases 10 (10): 1797-1805,
2004.
BUERIS, V., SIRCILI, M.P., TADDEI, C.R., SANTOS, M.F., FRANZOLIN, M.R.,
MARTINEZ, M. B., FERRER, S.R., BARRETO, M.L.,TRABULSI, L.R. Detection of
diarrheagenic Escherichia coli from children with and without diarrhea in Salvador, Bahia,
Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 102 (7): 839-844, 2007.
CAMPOS, L.C., FRANZOLIN, M.R., TRABULSI, L.R. Diarrheagenic Escherichia coli
Categories among the Traditional Enteropathogenic E. coli O Serogroups – A Review.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 99 (6): 545-552, 2004.
CAMPOS, M.R.H., ANDRE, M.C.D.P.B., BORGES, L.J., KIPNIS, A., PIMENTA, F.C.,
SERAFINI, A.B. Genetic heterogeneity of Escherichia coli strains isolated from raw milk,
minas frescal cheese, and food handlers. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia 61 (5): 1203-1209, 2009.
CARLOS, C., ALEXANDRINO, F., VIEIRA, M.A., STOPPE, N.C., SATO, M.I., GOMES,
T.A., OTTOBONI, L.M. Prevalence of virulence factors in Escherichia coli isolated from
healthy animals and water sources in Brazil. Journal of water and health 9 (1): 138 –
142, 2011.
CAUMO, K., DUARTE, M., GARGNIN, S.T., RIBEIRO, V.B., TASCA, T., MACEDO, A.J.
Resistência bacteriana no meio ambiente e implicações na clínica hospitalar. Revista
Liberato 11 (16): 180 - 186, 2010.
CERGOLE-NOVELLA, M.C., PIGNATARI, A.C., CASTANHEIRA, M., GUTH, B.E.
Molecular typing of antimicrobial-resistant Shiga-toxin-producing Escherichia coli strains
(STEC) in Brazil. Revista de Microbiologia 162 (2): 117-123, 2011.
89
CHAN, K. N., PHILLIPS, A.D., KNUTTON, S., SMITH, H.R., WALKER-SMITH, J.A.
Enteroaggregative Escherichia coli: Another cause of acute and chronic diarrhea in
England? Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 18: 87-91, 1994.
CHASE-TOPPING, M.E., ROSSER, T., ALLISON, L.J., COURCIER, E., EVANS, J.,
MCKENDRICK, I.J., PEARCE, M.C., HANDEL, I., CAPRIOLI, A., KARCH, H.,
HANSON, M.F., POLLOCK, K.G.J., LOCKING, M.E., WOOLHOUSE, M.E.J.,
MATTHEWS,L., LOW, J.C., GALLY, D.L. Pathogenic Potential to Humans of Bovine
Escherichia coli O26, Scotland. Emerging Infectious Diseases 18 (3): 439 - 448, 2012.
CLEARY, J., LAI, L.C., SHAW, R.K., STRAATMAN-IWANOWSKA, A.,
DONNENBERG, M.S., FRANKEL, G., KNUTTON, S. Enteropathogenic Escherichia
coli (EPEC) adhesion to intestinal epithelial cells: role of bundle-forming pili (BFP), EspA
filaments and intimin. Microbiology 150: 527–538, 2004.
CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute – Performance standards for
antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty Second Informational Supplement.
M100-S22 32(3), Replaces M100-S21 31 (1). Wayne, PA, USA, 2012. 177p.
COSTA, A.R.F, LIMA, K.V.B, SOUZA, C.O., LOUREIRO, E.C.B. Desenvolvimento de
PCR multiplex para detecção e diferenciação de categorias de Escherichia coli
diarreiogênicas. Revista Pan-Amazônica da Saúde 1 (2): 77-84, 2010.
COSTA, M.M., SILVA, M.S., SPRICIGO, D.A., WITT, N.M., MARCHIORO, S.B.,
KOLLING, L., VARGAS, A.P.C. Caracterização epidemiológica, molecular e perfil de
resistência aos antimicrobianos de Escherichia coli isoladas de criatórios suínos dos sul do
Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 26 (1): 5-8, 2006.
CRAVIOTO, A., TELLO, A., NAVARRO, A., RUIZ, J., VILLAFÁN, H., URIBE,
F., ESLAVA, C. Association of Escherichia coli Hep-2 adherence patterns with type and
duration of diarrhea. Lancet 337: 262-264, 1991.
CROXEN, M.A., FINLAY, B.B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity.
Nature 8, 26 - 38, 2010.
CZECZULIN, J. R., WHITTAM, T.S., HENDERSON, I.R., NAVARRO-GARCIA, F,
NATARO, J.P. Phylogenetic analysis of enteroaggregative and diffusely adherent
Escherichia coli. Infection and Immunity 67: 2692-2699, 1999.
DANTAS, G., SOMMER, M.O.A, OLUWASEGUN, R.D., CHURCH, G.M. Bacteria
Subsisting on Antibiotics. Science 320: 100 - 103, 2008.
DI CONZA, J.A., GUTKING, G.O. Integrons: gene collectors. Revista Argentina de
Microbiologia 42: 63-78, 2010.
DUPONT, H.L., FORMAL, S.B., HORNICK, R.B., SNYDER, M.J., LIBONATI, J.P.,
SHEAHAN, D.G., LABREC, E.H., KALAS, J.P. Pathogenesis of Escherichia coli
diarrhea. New England Journal of Medical 285: 1-9, 1971.
ESTRADA-GARCIA, T., CERNA, J.F., PAHECO-GIL, L., VELÁZQUEZ, R.F., OCHOA,
T.J., TORRES, J., DUPONT H.L. Drug-resistant diarrheogenic Escherichia coli, Mexico.
90
Emerging Infectious Disease 11 (8): 1306-1308, 2005.
EWING, W.H. Edwards and Ewind’s identification of Enterobacteriaceae. New York,
Elsevier Science Pulblishing, 1986. 536p.
FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C.A. The gut at war: the consequences of
enteropathogenic Escherichia coli infection as a factor of diarrhea and malnutrition.
Revista Paulista de Medicina 118 (1): 21-29, 2000.
FARSHAD, S., ANVARINEJAD, M., TAVANA, A.M., RANJBAR, R., JAPONI1, R.,
ZADEGAN, R.M., ALBORZI, A. Molecular epidemiology of Escherichia coli strains
isolated from children with community acquired urinary tract infections. African
Journal of Microbiology Research 5 (26): 4476-4483, 2011.
FENG, P. Escherichia coli serotype O157:H7: Novel vehicles of infection and emergence of
phenotypic variants. Emerging Infectious Diseases 1 (2): 47-52, 1995.
FERNANDEZ-BRANDO, R.J., BENTANCOR, L.V., MEJIAS, M.P., PANEK, A.C.,
CABRERA, G.G., EXENI, R.A., PALERMO, M.S. Actualizacion en el tratamiento del
sindrome uremico hemolitico endemico patogenesis y tratamiento de la complicacion
sistemica mas grave de las infecciones por Escherichia coli productor de toxina Shiga.
Medicina 71: 383-389, 2011.
FERREIRA, L.G., SANTOS, H.C.A.S., MARTINEZ, M.B. Escherichia coli enteroinvasora:
Características, fatores de virulência e relação parasita-hopedeiro. Microbiologia in foco
(5): 5-11, 2012.
FERRER, S.R. Fatores de Risco das Diarréias em crianças em Salvador, Bahia. Tese
(Doutorado em Saúde Pública) – Salvador, Universidade Federal da Bahia, 2007. 385p.
FRANKEL, G. GIRON J.A., VALMASSOI, J., SCHOOLNIK, G.K. Multi-gene
amplification: simultaneous detection of three virulence genes in diarrhoeal stool.
Molecular Microbiology 3: 1729–1734, 1989.
FRANKEL,G., LIDER, O., HERSHKOVIZ, R., MOULD, A.P., KACHALSKY, S.G.,
CANDY, D.C., CAHALON, L., HUMPHRIES, M.J., DOUGAN, G. Intimin-mediated
adherence to epithelial cells. Revista de Microbiologia 27 (1): 99-103, 1996.
FRANZOLIN, M..R., ROSELY, CABETTE, B., KELLER, R., GOMES, T. A.T., BEUTIN,
L., BARRETO, M.L., MILROY, C., STRINA, A., RIBEIRO, H., TRABULSI, L.R.
Prevalence of Diarrheagenic Escherichia coli in Children with Diarrhea in Salvador,
Bahia, Brasil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 100 (4): 359-363, 2005.
GANDRA, E.A., GANDRA, T.K.V., MELO, W. S., GODÓI, H. S. Técnicas moleculares
aplicadas à microbiologia de alimentos. Acta Scientiarum Technology 30 (1): 109-118,
2008.
GARCIA, C., CHINCHA, O., LEON, M., IGLESIAS, D., BARLETTA, F., MERCADO, E.,
OCHOA. T.J. Short Report: High Frequency of Diarrheagenic Escherichia coli in Human
Immunodeficiency Virus (HIV) Patients with and without Diarrhea in Lima, Peru. The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 82 (6), 1118 - 1120, 2010.
91
GARCIA, F.N., SEARS, C., ESLAVA, C., CRAVIOTO, A., NATARO, J.P. Cytoskeletal
effects induced by Pet, the Serine Protease enterotoxin of enteroaggregative Escherichia
coli. Infection and Immunity 67 (5): 2184 – 2192, 1999.
GARCIA, P.G., SILVA, V.L., DINIZ, C.G. Occurrence and Antimicrobial Drug
Susceptibility Patterns of Commensal and diarrheagenic Escherichia coli in Fecal
Microbiota from Children with and without acute diarrhea. The Jornal of Microbiology
49 (1): 46-52, 2011.
GAUTOM, R. K. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of Escherichia
coli O157:H7 and other Gram-negative organisms in 1 day. Journal Clinical
Microbiology 35: 2977-2980, 1997.
GHOSH, P.K, ALI, A. Isolation of atypical enteropathogenic Escherichia coli from children
with and without diarrhea in Delhi and the National Capital Region, India. Journal of
Medical Microbiology 59 (10): 1156-1162, 2010.
GIBOTTI, A., TANAKA, T.L., OLIVEIRA, V.R., TADDEI, C.R., MARTINEZ, M.B.
Molecular Characterization of Enteroinvasive Escherichia coli ipa genes by PCR-RFLP
Analysis. Brazilian Journal of Microbiology 35: 74 – 80, 2004.
GIBSON, J.S., COBBOLD, R.N., TROTT, D.J. Characterization of multidrug-resistant
Escherichia coli isolated from extraintestinal clinical infections in animals. Journal of
Medical Microbiology 59: 592-596, 2010.
GOERING, R. V. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation
in the molecular epidemiology of infectious disease. Review. Infection, Genetics and
Evolution 7 (7): 866 - 875, 2010.
GOMES, P.A.D.P., FERREIRA, R.C.C., PALERMO, M.S., FERREIRA, L.C.S. A síndrome
Hemolítica Urêmica (SHU) e a busca de uma estratégia de controle para a doença.
Microbiologia in foco 4: 41-47, 2011.
GOMES, T.A.T., IRINO, K., GIRÃO, D.M., GIRÃO, V.B.C., GUTH, B.E.C., VAZ, T.M.I.,
MOREIRA, F.C., CHINARELLI, S.H., VIEIRA, M.A.M. Emerging Enteropathogenic
Escherichia coli Strains? Emerging Infectious Diseases 10 (10): 1851-1855, 2004.
GOMES, T.A.T., RASSI, V., MACDONALD, K.L., RAMOS, S.R., TRABULSI, L.R.,
VIERA, M.A., GUTH, B.E., CANDEIAS, J.A., IVEY, C., TOLEDO, M.R.F.
Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in São Paulo,
Brazil. Journal Infection Diseases 164: 331-337, 1991.
GORDILLO, M. E., REEVE, G. R., PAPPAS, J., MATHEWSON, J.J., DUPONT, H.L.,
MURRAY, B.E. Molecular characterization of strains of enteroinvasive Escherichia coli
O143, including isolates from a large outbreak in Houston, Texas. Journal of Clinical
Microbiology 30: 889-893, 1992.
GÜRTLER, V., MAYALL, B.C. Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of
bacterial isolates. International Journal Systematic and Evolucionary Microbiology 51
(1): 3 - 16, 2001.
GUTH, B.E.C., RAMOS, S.R.T.S., CERQUEIRA, A.M.F., ANDRADE, J.R.C., GOMES,
92
T.A.T. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Shiga Toxin-producing Escherichia
coli strains isolated from children in São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz 97 (8): 1085-1089, 2002.
HAMILTON, M.J., HADI, A.Z., GRIFFITH, J.F., ISHII, S., SADOWSKY, M.J. Large Scale
Analysis of Virulence Genes in Escherichia coli Strains Isolated from Avalon Bay, CA.
Water Research 44 (18): 5463 – 5473, 2010.
HANNAOUI, E., VILLALOBOS, L., MARTINES, R., MALDONADO, A., HAGEL, I.,
BASTARDO, J. Escherichia coli diarreiogênica asociada a casos de diarrea aguda em
niños de Cumaná, Venezuela. Investigatión Clínica 51 (4): 489 - 500, 2010.
HERNANDES, R.T., ELIAS, W.P., VIEIRA, M.A.M., GOMES, T.A.T. An overview of
atypical enteropathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters 297: 137-149,
2009.
HUANG, D.B., MOHANTY, A., DUPONT, H., OKHUYSEN, P.C., CHIANG, T. A review
of an emerging enteric pathogen: enteroaggregative Escherichia coli. Journal of Medical
Microbiology 55: 1303 - 1311, 2006.
HUANG, S.W., HSU, B.M., SU, Y.J., JI, D.D., LIN, W.C., CHEN, J.L., SHIH, F.C., KAO,
P.M., CHIU, Y.C. Occurrence of diarrheagenic Escherichia coli genes in raw water of
water treatment plants. Environmental Science and Pollution Research International 19
(7): 2776- 2783, 2011.
IBKEWE, A.M., MURINDA, S.E., GRAVES, A.K. Microbiological Evaluation of Water
Quality from Urban Watersheds for Domestic Water Supply Improvement. International
Journal of Environmental Research and Public Health 8: 4460 – 4476, 2011.
ISHII, S., MEYER, K.P., SADOWKY, M.J., Relationship between Phylogenetic Groups,
Genotypic Clusters, and Virulence Gene Profiles of Escherichia coli Strains from Diverse
Human and Animal Sources. Applied and Environmental Micorbiology 73 (18): 5703 –
5710, 2007.
ITOH, Y., NAGANO, I., KUNISHIMA, M., EZAKI, T. Laboratory Investigation of
enteroaggregative Escherichia coli O untypeable:H10 associated a massive outbreak of
gastrointestinal illness. Journal of Clinical Microbiology 35 (10): 2546-2550, 1997.
JENKINS, C., TEMBO, M., CHART, H., CHEASTY, T., WILLSHAW, G.A., PHILLIPS,
A.D., TOMPKINS, D. SMITH, H. Detection of enteroaggregative Escherichia coli in
faecal samples from patients in the community with diarroea. Journal of Medical
Microbiology 55: 1493-1497, 2006.
JOHNSON, J.R, OWENS, R., GAJEWSKI, A., CLABOTS, C. Escherichia coli colonization
pattern among human household members and pets, with attention to acute urinary tract
infection. Journal Infection Diseases 197: 218-224, 2008.
JOHNSON, J.R., JOHNSTON, B., CLABOTS, C., KUSKOWSKI, M.A., CASTANHEIRA,
M. Escherichia coli Sequence Type ST131 as the Major Cause of Serious MultidrugResistant E. coli Infections in the United States. Clinical Infectious Diseases 51 (3): 286–
294, 2010.
93
KAPER, J. B. Defining EPEC. Revista de Microbiologia 27 (1): 130-133, 1996.
KAPER, J.B., NATARO,J.P, MOBLE, H.L.T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews
2: 123 - 140, 2004
KARMALI, M.A., STEELE, B.T., PETRIC, M., LIM, C. Sporadic cases of haemolytic
uremic syndrome associated with faecal cytotoxin and cytotoxin-producing Escherichia
coli in stools. Lancet i: 619-620, 1983.
KAUFFMANN, F. Enterobacteriaceae. Copenhagem, Munksgaard, 1954. 382p.
KIM, J., OH, K., JEON, S., CHO, S., LEE, D., HONG, S., CHO, S., PARK, M., JEON, D.,
KIM., S. Escherichia coli O104:H4 from 2011 European Outbreak and Strain from South
Korea. Emerging Infectious Diseases 17 (9): 1755-1756, 2011.
KIMATA, K., SHIMA, T., SHIMIZU, M., TANAKA, D., ISOBE, J., GYOBU, Y.,
WATAHIKI, M., NAGAI, Y. Rapid Characterization of Pathogenic Escherichia coli by
Multiplex PCR. Microbiology and Immunology 49 (6):485-492, 2005.
LASCOWSKI, K.M.S, GUTH, B.E.C., MARTINS, F.H., ROCHA, S.P.D., IRINO, K.,
PELAYO, J.S. Shiga toxin-producing Escherichia coli in drinking water supplies of north
Paraná State, Brazil. Journal of Applied Microbiology 114 (4): 1230 – 1239, 2013.
LEE, S.I., RAYAMAHJI, N., LEE, W.J., CHA, S.B., SHIN, M.K., ROH, Y.M., YOO, H.S.
Genotypes, antibiogram, and pulsed-field gel eletrophoresis profises of Escherichia coli
Strains from piglets in Korea. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 21: 510516, 2009.
LEVINE, M. M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic,
enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent. The Journal Infectious Diseases
155: 377-389, 1987.
LÓPEZ, E.L., PRADO-JIMÉNEZ, V., O'RYAN-GALLARDO, M., CONTRINI, M.M.
Shigella and Shiga toxin-producing Escherichia coli causing bloody diarrhea in Latin
America. Infectious Disease Clinics of North America 14 (1): 41-65, 2000.
LOTHIGIUS, A., SJÖLING, A., SVENNERHOLM, M., BÖLIN, I. Survival and gene
expression of enterotoxigenic Escherichia coli during long-term incubation in sea water
and freshwater. Journal of Applied Microbiology 108: 1441–1449, 2010.
MAGALHÃES, V.D., FERREIRA, J,C., BARELLI, C., DARINI, A.L.C. Eletroforese em
campo pulsante em bacteriologia – uma revisão técnica. Revista do Instituto Adolfo Lutz
64 (2):155-161, 2005.
MAGIORAKOS, A.P., SRINIVASAN, A., CAREY, R.B., CARMELI, Y., FALAGAS, M.E.,
GISKE, C.G., HARBARTH, S., HINDLER, J.F., DAHLMETER, G., OLSSON
LILJEQUIST, B., PATERSON, D.L., RICE, L.B., STELLING, J., STRUELENS, M.J.,
VATOPOULOS, A., WEBER, J.T., MONNET, D.L. Multidrug-resistent, extensiley drugresistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim
standar definitions for acquired resistence. Clinical Microbiology and Infection 18 (3):
268-281, 2012.
94
MARTINEZ, J. L. Recent advances on antibioticresistance genes. Molecular Genetics of
Marine Organisms 10:13 - 32, 2003.
MARTINEZ, M.B., TRABULSI, L.R. Enterobacteriaceae. In: Microbiologia. Trabulsi, L. R.;
Alterthum, F. (Eds). São Paulo, Atheneu, 2008. P. 271 – 279.
MARTINS, I.S., NOGUEIRA, I.A., CONCEIÇÃO, M., BRASIL, P. Recomendações para o
uso adequado de antimicrobianos. Secretaria Estadual de Saúde, Rio de Janeiro, 2000.
MATTILA, L. Clinical features and duration of traveler’s diarrhea in relation of its etiology.
Clinical Infection Diseases 19: 728-734, 1994.
MEDEIROS, M.I.C., NEME, S.N., SILVA, P., CAPUANO, D.M., ERRERA, M.C.,
FERNANDES, S.A.; VALLE, G.R. & AVILA, F.A. - Etiology of acute diarrhea among
children in Ribeirão Preto-SP, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São
Paulo 43 (1): 21-24, 2001.
MEDINA, M.G., ESQUIVEL, P., LIFSCHITZ, V., MEDINA, M.L., LÖSCH, L.S.,
MERINO, L.A. Detection of diarrheagenic Escherichia coli in children from poor
neighborhoods in Corrientes, Argentina. Revista Cubana de Medicina Tropical 62 (1):
42 – 47, 2010.
MELO, D.B. Padrão clonal e perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de cepas de
Escherichia coli isoladas de alimentos e de espécimes clínicas. Dissertação (Mestrado
em Ciência de Alimentos) – Salvador, Universidade Federal da Bahia, 2010. 80p.
MELO, S.K. Caracterização de fatores de virulência em amostras de Escherichia coli
isoladas de lagoas do Parque Estadual Rio Doce, Minas Gerais. Dissertação (Mestrado
em Engenharia Ambiental) – Ouro Preto, Universidade Federal de Ouro Preto, 2006.
100p.
MOHAMED, M. M.A., MOHAMED, Z. K., KLENA, K.J., AHMED, S.F., MOUSSA,
T.A.A., GHENGHESH, K.S. Molecular Characterization of Diarrheagenic Escherichia
coli from Libya. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene 86 (5): 866 871, 2012.
MONAGHAN, Á., BYRNE, B., FANNING, S., SWEENEY, T., MCDOWELL, D.,
BOLTON, D.J. Serotypes and virulence profiles of atypical enteropathogenic Escherichia
coli (EPEC) isolated from bovine farms and abattoirs. Journal of Applied Microbiology
114 (2): 595 – 603, 2013.
MONTENEGRO, M.A., BUÈ I. M., TRUMPF T. Detection and characterisation of faecal
verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle. Journal of Clinical
Microbiology 28: 1417-1421, 1990.
MORA, A., HERRERA, A., LÓPEZ,C., DAHBI,G., MAMANI, R., PITA, J.M., ALONSO,
M.P., LLOVO, J., BERNÁRDEZ, M.I., BLANCO, J.E., BLANCO, M., BLANCO, J.
Characteristics of the Shiga-toxin-producing enteroaggregative Escherichia coli O104:H4
German outbreak strain and of STEC strains isolated in Spain. International
Microbiology 14: 121 - 141, 2011.
95
MORABITO, S., KARCH, H., MARIANI-KURKDJIAN, P., SCHMIDT, H., MINELLI, F.,
BINGEN, E., CAPRIOLI, A. Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli
O111:H2 associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. Journal of
Clinical Microbiology 36 (3):840 – 842, 1998.
MORATO, E. P., LEOMIL, L., BEUTIN, L., KRAUSE, G., MOURA, R. A., PESTANA DE
CASTRO, A. F. Domestic Cats Constitute a Natural Reservoir of Human Enteropathogenic
Escherichia coli Types. Zoonoses and Public Health 56 (5): 229 - 237, 2009.
MORENO, A.C.; FILHO, A.F.; GOMES, T.D.O.A.; RAMOS, S.T.; MONTEMOR, L.P.;
TAVARES, V.C.; FILHO, L.D.O.S.; IRINO, K; MARTINEZ, M.B. Etiology of
childhood diarrhea in the northeast of Brazil: significant emergent diarrheal pathogens.
Diagnostic Microbiology Infection Diseases 66 (1): 50-7, 2010.
MOSQUITO, S., RUIZ, J., BAUER, J.L., OCHOA, T.J. Mecanismos moleculares de
resistência antibiótica em Eschechiria coli asociadas a diarreia. Revista Peruana de
Medicina Experimental y Salud Publica 28 (4): 648-656, 2011.
MOURA, M.R.S.A.L., MELO, M.J.G., CALÁBRIA, W.B., GERMANO, E.M., MAGGI,
R.R.S, CORREIA, J.B. Frequência de Escherichia coli e sua sensibilidade aos
antimicrobianos em menores de cinco anos hospitalizados por diarreia aguda. Revista
Brasileira de Saúde Materno Infantil 12 (2): 173 - 182, 2012.
MOURA, R.A. Estudo das relações clonais entre amostras de Escherichia coli atípica de
origem animal e humana. Tese (Doutorado em Microbiologia) - São Paulo,
Universidade de São Paulo, 2009. 67p.
NASCIMENTO, A.M, VAN DER SAND, S.T. Uso da PCR na detecção de E. coli
enterotoxigênica em amostras de água de esgoto. Acta Scientiae Veterinariae 35 (2): 181188, 2007.
NATARO, J. P., DENG, Y., COOKSON, S., CRAVIOTO, A., SAVARINO, S.J., GUERS,
L.D., LEVINE, M.M., TACKET, C.O. Heterogeneity of enteroaggregative Escherichia
coli virulence demonstrated in volunteers. Journal of Infectious Diseases 171: 465-468,
1995.
NATARO, J. P., DENG, Y., MANEVAL, D.R., GERMAN, A.L., MARTIN, W.C., LEVINE,
M.M. Aggregative adherence fimbriae I of enteroaggregative Escherichia coli mediate
adherence to Hep-2 cells and hemogglutination of human erythrocytes. Infection and
Immunity 60 (6): 2297-2304, 1992.
NATARO, J. P., KAPER, J.B., ROBINS-BROWNE, R., PRADO, V., VIAL, P., LEVINE,
M.M. Patterns of adherence of diarrheagenic Escherichia coli to Hep-2 cells. Pediatric
Infection Disease Journal 6: 829-831, 1987.
NATARO, J.P., KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology
Reviews 11 (1): 142-201, 1998.
NATARO, J.P., MAI, V., JOHNSON, J., BLACKWELDER, W. C., HEIMER, R., TIRREL,
S., EDBERG, S. C., BRADEN, C. R., MORRIS, J. G. e HIRSHON, J. M. Diarrheagenic
Escherichia coli infection in Baltimore, Maryland, and New Haven, Connecticut. Clinical
96
Infection Diseases 43: 402-407, 2006.
NAVARRO-GARCIA, F., ELIAS, V.P. Autotransporters and virulence of enteroaggregative
E. coli. Gut Microbe 2 (1): 13-24, 2011.
NGUYEN, T. V., LE, V. P., LE, H. C., GIA, K.N., WEINTRAUB, A. Detection and
Characterization of Diarrheagenic Escherichia coli from Young Children in Hanoi,
Vietnam. Journal of Clinical Microbiology 43 (2): 755–760, 2005.
OCHOA, T.J., MERCADO, E.H., DURAND, D., RIVERA, F.P., MOSQUITO, S.,
CONTRERAS, C., RIVEROS, M., LLUQUE, A., BARLETTA, F., PRADA, A., RUIZ, J.
Frequencia y patotipos de Escherichia coli diarrogénica en niños peruanos con y sin
diarrea. Revista Peruana de Medicina Experimental e Salud Publica 28 (1): 13-20,
2011.
OCHOA, T.J., RUIZ, MOLINA, M., DEL VALLE, L.J., VARGAS, M., GIL, A.I., ECKER,
L., BARLETTA, F., HALL, E.R., CLEARY, T.G., LANATA, C.F. Hich frequency of
antimicrobial resistance of diarrheagenic E. coli in Peruvian infants. The American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 81 (2): 296-301, 2009.
OKHUYSEN, P.C., DUPONT, P.C. Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC): A cause of
acute and persistent diarrhea of worldwide importance. The Journal of Infectious
Diseases 202 (4): 503-505, 2010.
OLIVEIRA, K.W., GOMES, F. C. O., BENKO, G., PIMENTA, R. S., MAGALHÃES, P.P.,
MENDES, E. N., MORAIS, P. B. Antimicrobial resistance profiles of diarrheagenic
Escherichia coli strains isolated from bathing waters of the Lajeado reservoir in Tocantins,
Brazil. Revista Ambiente & Água - An Interdisciplinary Journal of Applied Science 7
(2): 30 - 41, 2012.
OLSVIK, O., STROCKBINE, N.A. PCR detection of heat-stable, heat-labile, and Shiga-like
toxin genes in Escherichia coli. Diagnostic Molecular Microbiology Principles and
Applications 18: 271-276, 1993.
ORLANDI, P.P., MAGALHÃES, G.F., MATOS, N.B., SILVA, T., PENATTI, M.,
NOGUEIRA, P.A., SILVA, L.H.P.DA. Etiology of diarrheal infections in children of Porto
Velho, Rondonia, Western Amazon region, Brazil. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research 39: 507-517, 2006.
ORSI, R.H., STOPPE, N.C., SATO, M.I.Z., GOMES,T.A.T., PRADO, P.I., MANFIO, G.P.,
OTTOBONI, L.M.M. Genetic variability and pathogenicity potential of Escherichia coli
isolated from recreational water reservoirs. Research in Microbiology 158 (5): 420 – 427,
2007.
OTEO, J. LÁZARO, E., ABAJO, F.J., BAQUERO, F., CAMPOS, J. Antimicrobial-resistante
Invasive Escherichia coli, Spain. Emerging Infectious Diseases 11 (4): 546-553, 2005.
PAL, A., GHOSH, S., RAMAMURTHY, T., YAMASAKI, S., TSUKAMOTO, T.,
BHATTACHARYA, S.K. Shiga-toxin producing Escherichia coli from healthy cattle in a
semi-urban community in Calcutta, India. Indian Journal of Medical Research 110: 8385, 1999.
97
PANIAGUA, G.L., MONROY, E., GONZÁLEZ, O.G., ALONSO, J., NEGRETE, E.,
VACA, S. Two or more enteropathogens are associated with diarrhoea in Mexican
children. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 6: 17 - 25, 2007.
PATOLI, A.A., PATOLI, B.B., MEHRAJ, V. High prevalence of multi-drug resistant
Escherichia coli in drinking water samples from Hyderabad. Gomal Journal of Medical
Sciences 8 (1): 23-26, 2010.
PATON, A.W., PATON, J.C. Detection and characterization of Shiga Toxigenic E. coli using
multiplex PCR assay. Journal of Clinical Microbiology 36 (2): 598-602, 1998.
PENNISI, E. First Food – Borne Pathogen Sequenced. Sciense 283 (26): 19, 1999.
PEREIRA, A.S., ANDRADE, S.S., MONTEIRO, J., SADER, H.S., PIGNATARI, A.C.C.,
GALES, A.C. Evaluation of the susceptibility profiles, genetic, similarity and presence of
qnr gene in Escherichia coli resistant to ciprofloxacin isolated in Brazilian hospitals. The
Brazilian Journal of Infectious Diseases 11 (1): 40-43, 2007.
PEROTO, M.C. Estudo de cepas de Escherichia coli portadoras dos genes da toxina
citoletal distensora isoladas de humanos, animais e alimentos. Dissertação (Mestrado
em Genética e Biologia Molecular) – Campinas, Universidade Estadual de Campinas,
2007. 96p.
PERSING, D.H., TENOVER, F.C. Molecular microbiology: diagnostic principles and
practice. Washington, ASM Press, 2004. 724p.
PHANTOUMATH, B., SITHIVONG, N., INSISIENGMAY, S., HIGA, N., TOMA, C.,
NAKASONE, N., IWANAGA, M. The incidence of Escherichia coli Having Pathogenic
Genes for Diarrhea: A Study in the People’s Democratic Republic of Lao. The Journal
Infectious Diseases 56: 103-106, 2003.
PINTO, C.O. Pesquisa de integron classe 1 e cassete gênico em Escherichia coli
recuperadas de indivíduos sadios e infectados e em DNA de sedimento contaminado
por arsênio. Dissertação (Mestrado em Genética) – Belo Horizonte, Universidade Federal
de Minas Gerais, 2013. 88p.
RASKO, D.A., ROSOVITZ, M.J., MYERS, G.S.A., MONGODIN, E.F.,FRICKE, W.F.,
GAJER, P., JONATHAN, C., SEBAIHIA, M., THOMSON, N.R., CHAUDHURI, C.,
HENDERSON, I.R., SPERANDIO, V., JACQUES RAVEL. The pangenome structure of
Escherichia coli: comparative genomic analysis of E. coli commensal and pathogenic
isolates. Journal of Bacteriology 190: 6881- 6893, 2008.
REBELLO, R. C.L. Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio em
amostras de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no Rio de Janeiro.
Dissertação (Mestrado) - Rio de Janeiro, Escola Nacional de Saúde Pública Sergio
Arouca, 2012. 121p.
REGUA-MANGIA, A.H., BEZERRA, R.M., ESPARIS, C.M., TEIXEIRA, L.M. Escherichia
coli enteroagregativa (EAEC): Filotipagem e resistência a antimicrobianos em um
enteropatógeno emergente. Revista de Patologia Tropical 38 (1): 27-34, 2009b.
REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A., VIEIRA, M.A., IRINO, K., TEIXEIRA, L.M.
98
Molecular typing and virulence of enteroaggregative Escherichia coli strains isolated from
children with and without diarrhea in Rio de Janeiro city, Brazil. Journal of Medicine
Microbiology 58 (4): 414-22, 2009a.
REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A.T., ANDRADE, J.R.C., VIEIRA, M.A.M.,
GONZALEZ , A.G.M., ZAHNER, V., IRINO, K., TEIXEIRA, L.M. Genetics analysis of
Escherichia coli strains carrying enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) markes,
isolated from children in Rio de Janeiro city, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology
34 (1): 38-41, 2003.
REGUA-MANGIA, A.H., GOMES, T.A.T., VIEIRA, M.A.M., ANDRADE, J.R.C., IRINO,
K., TEIXEIRA, L.M. Frequency and characteristics of diarrhoeagenic Escherichia coli
strains isolated from children with and without diarrhea in Rio de Janeiro, Brazil.
Journal of infection 48 (2): 161-167, 2004.
REINTHALER, F.F., POSCH, J. FEIER, L.G., WÜST, G., HAAS, D., RUCKENBAUER, F.,
MASCHER, F., MARTH, E. Antibiotic resistance of E. coli in sewage and sludge. Water
Research 37 (8): 1685-1.690, 2003.
RIBEIRO, D.A., NIEMANN, F.S., GATTI, M.S.V., LANNA, M.C.S., TSUJI, T., YANO, T.
Putative new heat-stable cytotoxic and enterotoxic factors in culture supernatant of
Escherichia coli isolated from drinking water. The Journal of Venomous Animals and
Toxins including Tropical Diseases 17 (1): 103 – 107, 2011.
RIBOT E.M., FAIR M.A., GAUTOM R., CAMERON D.N., HUNTER S.B.,
SWAMINATHAN B. and BARRET T.J. Standardization of pulsedfield gel electrophoresis
protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for
PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease 3: 59 - 67, 2006.
RILEY, L.W., REMIS, R.S., HELGERSON, S.D., MCGEE, H.B., WELLS, J.G., DAVIS,
B.R., HEBERT, R.J., OLCOTT, E.S., JOHNSON, L.M., HARGRETT, N.T., BLAKE, P.
A., COHEN, M.L. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype.
New England Journal of Medicine 308: 681-685, 1983.
RIVERA, F.P., OCHOA, T.J, MAVES, R.C., BERNA, L. M., MEDINA, A.M., MEZA, R.,
BARLETTA, F., MERCADO, E., ECKER, L., GIL, A.I., HALL, E.R., HUICHO, L.,
LANATA, C.F. Genotypic and phenotypic characterization of enterotoxigenic
Escherichia coli strains isolated from Peruvian children. Journal of Clinical
Microbiology 48 (9): 3198 -3203, 2010.
ROBINS-BROWNE, R.M.; HARTLAND, E.L. Escherichia coli as a cause of diarrhea.
Journal of Gastroenterology and Hepatology 17: 467-475, 2002.
RODAS, C., MAMANI, R., BLANCO, J., BLANCO, J.E., WIKLUND, G.,
SVENNERHOLM , A.M., SJÖLING, A., INIGUEZ, V. Enterotoxins, colonization
factores, sertypes and antimicrobial resistance of enterotoxigenic Escherichia coli
(ETEC) strains isolated from hopitalized children with diarrhea in Bolivia. Brazilian
Journal Infection Diseases 15 (2): 132 - 137, 2011.
RODRIGUES, J., THOMAZINI, C.M., MORELLI, A., BATISTA, G.C.M. Reduced
Etiological Role for Enteropathogenic Escherichia coli in Cases of Diarrhea in Brazilian
99
Infants. Journal of Clinical Microbiology 42 (1): 398 – 400, 2004.
SABRÁ, A. Escherichia coli subtypes EPEC, ETEC, EAEC, EHEC, EIEC, and DAEC in
acute diarrhea. Jornal de Pediatria 77 (1): 5 - 7, 2002.
SACK, R.B., GORBACH, S.L., BANWELL, J.G., JACOBS, B., CHATTERIEE, B.D.,
MITRA, R.C. Enterotoxigenic Escherichia coli isolated from patients with severe choleralike disease. Journal of Infectious Diseases 123 (4): 378-85, 1971.
SANTONA, S., DIAZ, N., FIORI, P.L., FRANCISCO, M., SIDAT, S., CAPPUCCINELLI,
P., RAPPELLI, P. Genotypic and phenotypic features of enteropathogenic Escherichia coli
isolated in industrialized and developing countries. The Journal of Infection in
Developing Countries 7 (3): 214 – 219, 2013.
SANTOS, L.F., IRINO, K., VAZ, T.M.I., GUTH, B.E.C. Set of virulence genes and genetic
relatedness of O113 : H21 Escherichia coli strains isolated from the animal reservoir and
human infections in Brazil. Journal of Medical Microbiology 59: 634-640, 2010.
SAUCEDO, C. L., CERNA, J.F., VILLEGAS-SEPULVEDA, N., THOMPSON, R.,
VELAZQUEZ, F.R., TORRES, J.,TARR, P.I., ESTRADA-GARCÍA, T. Single Multiplex
Polymerase Chain Reaction to Detect Diverse Loci Associeted With Diarreagenic
Escherichia coli. Dispatches. Emerging Infectius Diseases 9 (1): 127-131, 2003.
SCALETSKY, I.C.A, SOUZA, T.B., ARANDA, K.R.S., OKEKE, I.N. Genetic elements
associated with antimicrobial resistance in enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)
from Brazil. BioMed Center Microbiology 10: 25, 2010. Disponível em:
http://www.biomedcentral.com/1471-2180/10/25>Acesso em: 31/05/2013.
SCALETSKY, I.C.A., ARANDA, K.R.S., SOUZA, T.B., SILVA, N.P., MORAIS, M.B.
Evidence of pathogenic subgroups among atypical enteropathogenic Escherichia coli
strains. Journal of Clinical Microbiology 47 (11): 3756-3759, 2009.
SCAVIA, G., STAFFOLANI, M., FISICHELLA, S., STRIANO, G., COLLETTA, S.,
FERRI, G., ESCHER, M., MINELLI, F., CAPRIOLI, A. Enteroaggregative Escherichia
coli associated with a foodborne outbreak of gastroenteritis. Journal of Medical
Microbiology 57: 1141 - 1146, 2008.
SCHMIDT, H., HENSEL, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical
Microbiology Review 14 (1): 14-56, 2004.
SCHMIDT, H., KNOP, C., FRANKE, S., FRANKE, S., ALEKSIC, S., HEESEMANN, J.,
KARCH, H. Development of PCR for screening of enteroaggregative Escherichia coli.
SCHMIDT, M.A. LEEways: tales of EPEC, ATEC and EHEC. Celular Microbiology 12
(11): 1544-1552, 2010.
SHAHEEN, H.S., MESSIH, I.A.A., KLENA, J.D., MANSOUR, A., EL-WAKKEEL, Z.,
WIERZBA, T.F., SANDERS, J.W., KHALIL, S.B., ROCKABRAND, D.M.,
MONTEVILLE, M.R., ROZMAJZL, P.J., SVENNERHOLM, A.M., FRENCK, R.W.
Phenotypic and Genotypic Analysis of Enterotoxigenic Escherichia coli in Samples
Obtained from Egyptian Children Presenting to Referral Hospital. Journal of Clinical
100
Microbiology 47 (1): 189 - 197, 2009.
SHAHROKHI, N., BOUZARI, S., JAFARI, A. Comparison of virulence markes and
antibiotic resistance in enterotoxigenic Escherichia coli isolated ten years apart in
Tehran. The Journal of Infection in Developing Countries 5 (4): 248 – 254, 2011.
SIDHU, J.P.S, AHMED, W., HODGERS, L.,TOZE,S. Occurrence of Virulence Genes
Associated with Diarrheagenic Pathotypes in Escherichia coli Isolates from Surface Water.
Applied and Environmental Microbiology 79 (1): 328 – 335, 2013.
SILVA GAP. Fatores de risco e Manejo. Revista de Pediatria do Ceará 3 (1): 5-9, 2002.
SMITH, H. R., SCOTLAND , S., CHEASTY, T., WILLSHAW, G., ROWE, B.
Enteropathogenic Escherichia coli infections in the United Kingdom. Revista de
Microbiologia 27 (1): 45-49, 1996.
SOUSA, C.P. Escherichia coli as a specialized bacterial pathogen. Revista de Biologia e
Ciências da Terra 6 (1): 341-352, 2006.
SOUSA, E.B. Aspectos Microbiológicos e Epidemiológicos da Doença Diarreica Aguda
no Município de Juruti, Pará. Dissertação (Mestrado em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários) – Belém, Universidade Federal do Pará, 2010. 136p.
SOUZA, E.C., MARTINEZ, M.B., TADDEI, C.R., MUKAI, L., GILIO, A.E., RACZ, M.L.,
SILVA, L., EJZENBERG, B., OKAY, Y. Perfil etiológico das diarreias agudas de
crianças atendidas em São Paulo. Revista de Pediatria 78 (1): 31-38, 2002.
SPANO, L.C., SADOVSKY, A.D., SEGUI, P.N., SAICK, K.W., KITAGAWA, S.M.,
PEREIRA, F.E., FAGUNDES-NETO, U., SCALETSKY, I.C. Age-specific prevalence of
diffusely adherent Escherichia coli in Brazilian children with acute diarrhea. Journal
Medicine Microbiology 57 (3): 359-63, 2008.
STARNBACH, M.AL., FALKOW, S., TOMPKINS, L.S. Species-specifc detection of
Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. Journal of
Clinical Microbiology 27: 1257-1261, 1989.
STEPHAN, R., SCHUMACHER, S. Resistance patterns of non-O157 Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) strains isolated from animals, food and asymptomatic human
carriers in Switzerland. Letters in Applied Microbiology 32: 114-117, 2001.
TALUKDAR, P.K., RAHMAN, M., RAHMAN, M. NABI, A., ISLAM, Z., HOQUE, M.M.,
ENDTZ, H.P., ISLAM, M.A. Antimicrobial Resistance, Virulence factors and genetic
diversity of Escherichia coli isolates from Household water supply in Dhaka, Bangladesh.
PLOS
ONE
8
(4),2013.Disponível
em:
<
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0061090>Acessado
em:
03/06/2013.
TAYLOR, D. N., ECHEVERRIA, P., SETHABUTR, O., PITARANGSI, C.,
LEKSOMBOON, U., BLACKLOW, N.R., ROWE,B., GROSS, R., CROSS, J. Clinical
and microbiologic features of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infections
detected by DNA frequência. Journal of Clinical Microbiology 26: 1362-1366, 1988.
101
TENG, L.J., HSUEH, P.R., LIAW, S.J., HO, S.W., TSAI, J.C. Genetic Detection of
Diarrheagenic Escherichia coli Isolated from Children with Sporadic Diarrhea. Journal of
Microbiology and Immunology Infectious 37: 327-334, 2004.
TOLEDO, M.R.F., TRABULSI, L.R. Frequency of enteroinvase Escherichia coli in children
with diarrhea and healthy controls, in São Paulo, SP, Brazil. Revista de Microbiologia 21:
1 – 4, 1990.
TOMA, C., LU, Y., HIGA, N., NAKASONE, N., CHINEN, I., BASCHKIER, A., RIVAS,
M., IWANAGA, M. Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic
Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 41 (6): 2669-2671, 2003.
TRABULSI, L.R., KELLER, R., GOMES, T.A.T. Typical and Atypical Enteropathogenic
Escherichia coli. Synopsis. Emerging Infectious Diseases 8 (5): 508-513, 2002.
VAZ, T.M.I., IRINO, K., NISHIMURA, L.S., CERGOLE-NOVELLA, M.C., GUTH, B.E.C.
Genetic heterogeneity of Shiga Toxin-producing Escherichia coli strains isolated in Sao
Paulo, Brazil, from 1976 through 2003, as revealed by pulsed-field gel electrophoresis.
VENKATESAN, M.M., BUYSSE J.M., KOPECKO, D.J. Use of Shigella flexneri ipaC and
ipaH sequences for the general identification of Shigella spp. and enteroinvasive
Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology 27 (12): 2687-2691, 1989.
VIAL, P.A., ROBINS-BROWNE, R., LIOR, H., PRADO, V., KAPER, J.B., NATARO, J.P.,
MANEVAL, D., ELSAYED, A., LEVINE, M.M. Characterization of enteroadherentaggregative Escherichia coli, a putative agent of diarrheal disease. Journal of Infectious
Diseases 158 (1): 70-79, 1988.
VIDAL, J.E., CANIZÁLEZ-ROMÁN, A., GUTIÉRREZ-JIMÉNEZ. J., NAVARROGARCIA, F. Patogénesis molecular, epidemiologia y diagnóstico de Escherichia coli
enteropatógena. Salud Pública de México 49 (5): 376-386, 2007.
VILA, J., VARGAS,M., CASALS, C., URASSA, H., MSHINDA, H., SCHELLEMBERG,
D., GASCON, J. Antimicrobial resistance of diarrheagenic Escherichia coli isolated from
children under the age of 5 years from Ifakara, Tanzânia. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 43 (12): 3022-3024, 1999.
VON SYDOW, A.C.M., COOGAN, D.G., MORENO, J.A., MELVILLE, A.M., BENITES,
N.R. Ocorrência de fatores de virulência em estirpes de Escherichia coli isoladas de fezes
de cães errantes. Arquivo do Instituto Biológico 73 (4): 401-407, 2006.
WANG, R.F., CAO,W.W., CERNIGLIA, C.E. A universal protocol for PCR detection of 13
species of foofborne pathogens in foods. Journal applied Microbiology 83: 727-736,
1997.
WERBER, D., KRAUSE, G., FRANK, C., FRUTH, A., FLIEGER, A., MIELKE, M.,
STARK, K. Outbreaks of virulent diarrheagenic Escherichia coli - are we in control?
BioMed
Center
Medicine
10:11,
2012.
Disponível
em:<
http://www.biomedcentral.com/1741-7015/10/11> Acesso em: 28/05/2013.
WINN
Jr,
W.,
ALLEN,
S.,
JANDA,
W.,
KONEMAN,
E.,
PROCOP,
G.,
102
SCHRECKENBERGER, P., WOODS, G. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto
e Atlas. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2008. 1488p.
WOLF, M.K. Occurrence, distribution, and associations of O and H serogroups, colonization
factor antigens, and toxins of enterotoxigenic Escherichia coli. Clinical Microbiologic
Review 10 (4): 569-84, 1997.
ZSCHOCK, H. P., HAMANN, B., WOLTER, W. Shiga-toxin-producing Escherichia coli in
faeces of healthy dairy cows, sheep and goats: prevalence and virulence properties. Letters
in Applied Microbiology 31: 203-208, 2000.
103
APÊNDICES
APÊNDICE 1: PREPARO DE SOLUÇÕES
1.1-Solução Tris 1M pH 8,0
Trizma-base
(Bio-Rad)
Água destilada
121,1g
1000mL
Após a dissolução de 121,1g de Trizma-base em 800 mL de água bidestilada, o pH deverá
ser ajustado para 8,0 com solução de HCl (aproximadamente 50 mL) e o volume completado
com água bidestilada para 100 mL. A solução final após sua esterilização em autoclave a
121C por 15 minutos, deverá ser mantida a temperatura ambiente até o momento do uso.
1.2- Solução EDTA 0,5M pH 8,0
EDTA (Sigma)
93,06g
Água destilada
500mL
Após a dissolução de 93,06g de EDTA em 300 mL de água bidestilada, o pH deverá
ser ajustado para 8,0 com solução de NaOH (aproximadamente 10g) e o volume foi
completado com água bidestilada para 500 mL. A solução final após sua esterilização em
autoclave a 121C por 15 minutos, deverá ser mantida a temperatura ambiente até o momento
do uso.
1.3- Solução tampão Tris-EDTA (TE) – pH 8,0
Tris 1M pH8 (item 1.1)
10mL
EDTA 0,5M pH8 (item 1.2)
2mL
Água destilada q.s.p
1000mL
A solução deverá ser preparada no momento do uso.
1.4- Solução N-Lauryl-Sarcosine 10% (Sarcosyl )
Sarcosyl
10g
H2O q.s.p
100 mL
A solução deverá ser mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.
104
1.5- Solução Dodecyl Sulfato de Sódio 20% (SDS)
SDS
20g
H2O q.s.p
100 mL
A solução deverá ser mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.
1.6- Proteinase K 20mg/mL (Sigma)
Proteinase K (100mg)
0,02g
H2O destilada
1 mL
A solução deverá ser mantida a -70C até o momento do uso.
1.7- Solução de suspensão celular (SSC)
Tris 1M pH8,0 (item 1.1)
EDTA 0,5M pH8,0 (item 1.2)
10mL
20mL
100mL
1.8- Solução de lise celular
Tris 1M pH8,0 (item 1.1)
2,5mL
EDTA 0,5M pH8,0 (item 1.2)
5mL
Sarcosyl 10% (item 1.4)
5mL
Proteinase K 20mg/mL (item 1.6)
0,25mL
50mL
1.9- Solução tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) – pH 8,0 (10x)
Trizma-base
108g
H3BO3
55g
Na2EDTA
8,4g
H2O destilada q.s.p
1000 mL
A solução depois de preparada deverá ser esterilizada em autoclave a 121C por 15
minutos, sendo mantida em temperatura ambiente até o momento do uso.
105
1.10- Solução tampão TEB – pH 8,0 (0,5x)
TEB – pH 8,0 (10x) (item 1.9)
100 mL
H2O MiliQ estéril
1900 mL
1.11- Solução de Digestão
Buffer 10X (10x)
200 mL
H2O MiliQ estéril
1750 mL
Enzima
50μ (50U por amostra)
106
APÊNDICE 2: PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
107
APÊNDICE 3: Distribuição dos genes codificantes de fatores de virulência entre as E. coli
diarreiogênicas de origem humana e ambiental.
ORIGEM
H
U
M
A
N
A
Amostras
815 HIV
121 PJ
157 PJ
174 PJ
849MC1 PJ
7271MC2 PJ
7549MC1 PJ
139 HIV
795 HIV
139 PJ
184 PJ
222(1) PJ
798MC2 PJ
887MC1 PJ
7551MC1 PJ
2078MC2 PJ
7561MC2 PJ
2076MC3 PJ
7275MC1 PJ
09 HIV
331 HIV
397 HIV
551 HIV
701 HIV
887 HIV
1322 HIV
106 PJ
166 PJ
794MC1 PJ
877MC1 PJ
1078MC1 PJ
2077MC1 PJ
2159MC1 PJ
7240MC3 PJ
7529MC1 PJ
857 HIV
2072MC1 PJ
2094MC2 PJ
2164MC1 PJ
2092MC1 PJ
7245MC2 PJ
615 HIV
705 HIV
795MC3 PJ
844 SS4
1085MC2 PJ
2171MC1 PJ
7242MC3 PJ
7530MC3 PJ
7542MC2 PJ
7556MC3 PJ
7562MC1 PJ
1088MC4 PJ
74 HIV
358 HIV
556 HIV
849 HIV
ETEC
lt
st
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
EPEC
eae
bfpA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
EAEC
aggR
EIEC
ipaH
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
STEC
stx-1 stx-2
-
-
108
Apêndice 3: Distribuição dos genes codificantes de fatores de virulência entre as E. coli
diarreiogênicas de origem humana e ambiental. (Continuação)
ORIGEM
H
U
M
A
N
A
AMBIENTAL
Amostras
962 HIV
1081 HIV
1276 HIV
1325 HIV
1364 HIV
537 HIV
792MC1 PJ
1033 HIV
7281MC1 PJ
615 MU
743 MU
813(1) IG
770 IG
762 MU
784 IG
ETEC
lt
st
+
-
+
-
EPEC
eae
bfpA
+
+
+
+
-
+
-
EAEC
aggR
EIEC
ipaH
+
+
+
+
+
+
+
+
-
STEC
stx-1 stx-2
+
+
-
+
-

Caracterização Genotípica e Fenotípica de - PPGBAIP

Transcrição

Documentos relacionados

AMC 30 ANALISE

AMC 30 ANALISE

BIBLIOGRAFÍA

PESQUISA DE SOROGRUPOS DE EPEC E TESTE DE - CRMV

Resumo mensal dos resultados das analises referentes aos

Diagnóstico enterobactérias

Qualidade microbiológica e físico-química da água utilizada

Baixar este arquivo PDF

diarréia e disenteria