universidade do sul de santa catarina jean abreu machado

Transcrição

UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
JEAN ABREU MACHADO
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA GABAPENTINA SOBRE A REGENERAÇÃO
NERVOSA, NUMA MODALIDADE DE LESÃO NEURAL INDUZIDA POR
ESMAGAMENTO SEGUIDO DE ESTIRAMENTO EM RATOS.
Tubarão
2012
JEAN ABREU MACHADO
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciências da Saúde, da
Universidade do Sul de Santa Catarina, como
requisito para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Anna Paula Piovezan, Dra.
Tubarão
2012
JEAN ABREU MACHADO
Esta dissertação foi julgada adequada à
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde e aprovada em sua forma final pelo
Programa de Mestrado em Ciências da Saúde
da Universidade do Sul de Santa Catarina.
Tubarão, 30 de julho de 2012.
______________________________________________
Professora e orientadora: Anna Paula Piovezan, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina.
______________________________________________
Professora: Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
______________________________________________
Professor: Jarbas Mota Siqueira Júnior, Dr.
Centro de Referência em Farmacologia Pré-clínica - Centro de Referência em Tecnologias
Inovadoras.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
A minha família: Denise Thomaz Machado, João Pedro Thomaz Machado,
Eduarda Thomaz Machado, meus pais.
Aos Colegas de trabalho, amigos e colegas de Mestrado.
A minha orientadora, Profa. Dra. Anna Paula Piovezan.
Ao Prof. Marcos Ghizoni.
Ao Prof. Dr. Jayme Bertelli.
Ao Corpo Docente do Mestrado em Ciências da Saúde – UNISUL: representado
pela Profa. Dra. Rosemeri Maurici da Silva.
A secretaria: Franciéli Zimmer e Silvane Cauz.
Aos acadêmicos de medicina: Gabriel Teske, Guilherme Teske.
Aos professores: Profa. Ester Blazius, Prof. Renê Blazius, Prof. Dr. Luiz Alberto
Kanis, Profa. Dra. Jucélia Jeremias Fortunato, Prof. Dr. Jarbas Mota Siqueira Junior.
Ao Laboratório de Neurobiologia da Dor e Inflamação – UFSC: Prof. Dr. Adair
Roberto Soares dos Santos, Leidiane Mazzardo Martins e Daniel Fernandes Martins
(doutorandos).
Ao Prof. Dr. Eduardo Cargnin Ferreira.
Aos funcionários e acadêmicos do Anatômico – UNISUL.
Ao funcionário do Laboratório didático Sr. Rodrigo Batista de Souza.
RESUMO
Objetivo: O propósito deste estudo foi avaliar a influência da gabapentina (GABAP) sobre a
regeneração nervosa, com a análise em testes funcionais e histológicos, em ratos submetidos à
lesão por estiramento seguido de esmagamento do nervo mediano da pata dianteira. Método:
Realizou-se estudo experimental com avaliação diária, por 30 dias, de três grupos de animais
(n= 9-10), mantidos sob condições controladas em laboratório. O 1º. grupo, falso-operado
sofreu cirurgia e exposição do nervo mediano, sem lesão nervosa por estiramento e
esmagamento, sendo tratados diariamente, por 30 dias, com GABAP (300 mg Kg-1,
intragástica). No 2º. grupo, operado + veículo, os animais sofreram cirurgia e exposição do
nervo mediano, com lesão nervosa por estiramento e esmagamento, sendo tratados
diariamente, por 30 dias, com veículo (salina estéril, 0,1 ml Kg-1, intragástica). No 3º. grupo,
operado + GABAP, os animais sofreram cirurgia e exposição do nervo mediano, com lesão
nervosa por estiramento e esmagamento, sendo tratados diariamente, por 30 dias, com
GABAP (300 mg Kg-1, intragástica). Os animais foram observados diariamente (ou até
aparecimento do desfecho esperado) nos seguintes testes: Grasping (força de agarrar em g),
von Frey (sensibilidade mecânica para 10 g), estimulação elétrica (sensibilidade elétrica para
5V ou 39V). Ao término dos 30 dias de observação, o nervo mediano foi seccionado; a porção
distal serviu para análises histológicas e a proximal para dosagens de neurotrofinas. Os dados
obtidos em escala contínua (ex.: força de agarrar em g) ou ordinais (ex.: dia em que ocorreu a
resposta) foram analisados, respectivamente pelos testes ANOVA de uma via, seguido de
Tukey para comparação entre grupos, ou Kruskal-Wallis (p< 0,05). Resultados: Não foram
observadas alterações entre os grupos operado + veículo ou operado + GABAP na força de
agarrar no teste de Grasping, ao longo dos 30 dias de observação (p > 0,05). Estes grupos
também não diferiram em relação ao dia em que ocorreu a recuperação da sensibilidade
mecânica ou elétrica (p> 0,05). Nas análises histológicas, não registrou-se diferenças entre os
grupos operado + veículo ou operado + GABAP nas concentrações de BDNF ou NGF
dosadas a partir do nervo lesado. Por outro lado, os dados morfométricos demonstraram que
em relação ao grupo operado + veículo, o grupo operado + GABAP melhorou os parâmetros
de área de fibras mielinizadas (respectivamente 12,2 ± 1,2% e 57,1% ± 3,1; p< 0,001),
densidade de fibras mielinizadas/mm2 (respectivamente 18.789 ± 3.568 fibras/mm2 e 29.600 ±
2.822 fibras/mm2; p< 0,05), área de tecido conjuntivo (respectivamente, 76,5 ± 4,2% e 63,6 ±
5,20%; p< 0,05) e fragmentos de degeneração (respectivamente 5,3 ± 1,0% e 2,5 ± 0,8%; p<
0,05). Conclusões: O modelo de lesão induzida por esmagamento seguido de estiramento é
uma alternativa à técnica de esmagamento, promovendo início de recuperação mais tardia no
teste do Grasping. Os dados apontam ainda para um efeito benéfico da GABAP sobre a
regeneração nervosa, observados principalmente a partir de análise histológica.
Palavras-chave: Regeneração nervosa. Esmagamento. Gabapentina.
ABSTRACT
Objective: The purpose of this study was to evaluate the influence of gabapentin (GABAP)
on nerve regeneration, with the analysis being based on functional and histological tests on
rats subjected to stretch injury followed by crushing of the median nerve in the foreleg.
Method: We conducted an experimental study involving three animal groups (n=9-10). They
were kept under controlled laboratory conditions, with daily evaluations for 30 days, and were
treated as described below. The 1st group, (false-operated) underwent surgery and exposure
of the median nerve without nerve injury via stretching and squashing. The group was treated
daily with GABAP for 30 days (300 mg kg-1, intragastric). In the 2nd group (operated +
vehicle), the animals underwent surgery and exposure of the median nerve, with the nerve
injury induced via stretching and squashing. They were then treated daily for 30 days with
vehicle (sterile saline 0.1 ml kg-1, intragastric). In the 3rd group (operated + GABAP), the
animals underwent surgery and exposure of the median nerve, with the nerve injury induced
via stretching and squashing. They were then treated daily for 30 days with GABAP (300 mg
kg-1, intragastric). The animals were observed daily (or until the appearance of the expected
outcome) in the following tests: Grasping (grip force in g), von Frey (mechanical sensitivity
to 10 g) and electrical stimulation (electrical sensitivity to 5V or 39V). At the end of the 30
day observation period, the median nerve was sectioned and the distal portion was used for
histological analysis of neurotrophin levels. Data obtained in a continuous scale (e.g. grasping
force in g) or ordinal (e.g. day on which the response occurred) were analysed respectively by
one-way ANOVA followed by Tukey test for comparison between groups, or via the Kruskal
-Wallis test (p <0.05). Results: No differences were observed between any of the groups
(operated, operated + vehicle or operated + GABAP) in the grip strength test for Grasping,
over the 30 days of observation (p> 0.05). These groups did not differ in relation to the day
that the mechanical or electrical sensitivity recovery happened (p> 0.05). In histological
analyses, there was no difference between the operated or operated + vehicle + GABAP
groups relating to the concentrations of BDNF or NGF measured in the injured nerve.
Moreover, morphometric data showed that compared to the operated + vehicle group, the
operated + GABAP group improved the parameters in the areas of; myelinated fibers
(respectively 12.2 ± 1.2% and 57.1% ± 3.1; p <0.001), fiber density myelinated/mm2
(respectively 18,789 and 29,600 ± 3568 ± 2822 fibers/mm2 fibers/mm2, p <0.05), connective
tissue area (respectively, 76.5 ± 4.2% and 63.6 ± 5.20%, p <0.05) and fragments of
degeneration (respectively 5.3 ± 1.0% and 2.5 ± 0.8%, p <0.05). Conclusions: The model of
injury induced by crushing followed by stretching is an alternative to the crushing technique,
promoting initiation of later recovery in the Grasping test. The data also points to the
beneficial effects of GABAP on nerve regeneration, mainly observed from histological
analysis.
Keywords: Nerve regeneration. Crushing. Gabapentin.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Microscopia óptica e eletrônica do nervo ciático de ratos adultos. ........................ 10
Figura 2 - Ilustração das diferentes etapas do processo de regeneração nervosa. ................... 12
Figura 3 - Esquema ilustrativo das diferentes etapas envolvidas no fenômeno de degeneração
Walleriana. .......................................................................................................................... 13
Figura 4 - Plexo braquial e suas origens nas raízes cervicais................................................. 15
Figura 5 - Sequela de paralisia completa do plexo braquial. ................................................. 16
Figura 6 - Foto ilustrando o procedimento de esmagamento seguido de estiramento do nervo
mediano de ratos. ................................................................................................................. 23
Figura 7 - Influência da GABAP no teste de Grasping em ratos com lesão de nervo mediano.
............................................................................................................................................ 29
Figura 8 - Influência da GABAP no teste de von Frey em ratos com lesão de nervo mediano.
............................................................................................................................................ 30
Figura 9 - Influência da GABAP no teste de estimulação elétrica em ratos com lesão de nervo
mediano. .............................................................................................................................. 31
Figura 10 - Influência da GABAP sobre a concentração de neurotrofinas dosadas a partir do
nervo mediano de ratos. ....................................................................................................... 32
Figura 11 - Micrografia de luz obtida de cortes transversais do nervo mediano, 30 dias após
lesão por esmagamento e estiramento................................................................................... 33
Figura 12 - Imagens da análise morfométrica das secções transversais do nervo mediano 30
dias após a indução da lesão por esmagamento e estiramento. .............................................. 34
Figura 13 - Influência da GABAP sobre parâmetros histológicos obtidos de secções
transversais do nervo mediano de ratos, 30 dias após lesão por esmagamento seguido de
estiramento. ......................................................................................................................... 36
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BDNF - Brain Derived Neurotrophic Fator
cm – centímetro
g – grama
GABA - Ácido amino-gama-butírico
GABAP - Gabapentina
kg – quilograma
mg – miligrama
ml – mililitro
mm – milímetro
NCAM-L-1 - Neur al Cell Adhesion Molecule
NGF - Nerve Growth Factor
PMP22 – Peripheral Mmyelin Protein
V – volt
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 9
2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 19
3 OBJETIVOS................................................................................................................. 20
3.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 20
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 20
4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 21
4.1 ANIMAIS ...................................................................................................................... 21
4.2 AMOSTRA .................................................................................................................... 21
4.3 GRUPOS DE ESTUDO ................................................................................................. 21
4.4 INDUÇÃO DE LESÃO NERVOSA POR ESMAGAMENTO E ESTIRAMENTO........ 22
4.5 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO NERVOSA......................................................... 23
4.5.1 Análises funcionais .................................................................................................... 23
4.5.1.1 Teste de grasping ..................................................................................................... 24
4.5.1.2 Resposta à estimulação mecânica ............................................................................. 24
4.5.1.3 Resposta à estimulação elétrica................................................................................. 24
4.5.2 Análise histológica e morfométrica ........................................................................... 25
4.5.3 Dosagem das neurotrofinas bdnf e ngf a partir do nervo mediano ......................... 26
4.6. ANÁLISE DOS DADOS .............................................................................................. 27
5 RESULTADOS ............................................................................................................... 28
6 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 37
7 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 42
8 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 43
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 44
ANEXO .............................................................................................................................. 51
ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA)
UNISUL .............................................................................................................................. 52
9
1 INTRODUÇÃO
Historicamente a ciência vem se preocupando com a descrição e a observação das
alterações ocorridas na morfologia do sistema nervoso periférico frente à lesão traumática há
mais de um século, como pode ser confirmado pela observação escrita por Augustus Waller
em 1850, que descreveu pela primeira vez a degeneração Walleriana (WALLER, 1850).
Com relação ao tratamento da lesão nervosa periférica, esta teve grande evolução
nas últimas duas décadas em decorrência da introdução de novas técnicas microcirúrgicas;
contudo, infelizmente ainda a recuperação funcional do membro afetado raramente é total
(MCALLISTER et al., 1996; BATTISTON et al., 2005; HOKE, 2006; CASHA, YONG,
MIDHA, 2008). Sendo assim, atualmente os esforços parecem estar voltados para estudos que
englobem a neurobiologia, a neuroanatomia e os mecanismos bioquímicos da regeneração
funcional do nervo, como forma de tentar elucidar os mecanismos pelos quais esta ocorre,
bem como de procurar por novos potenciais terapêuticos que possam ser empregados no
tratamento de tais lesões.
Uma vez que o funcionamento do sistema nervoso periférico depende da sua
integridade morfológica, o conhecimento da sua anatomia e dos mecanismos empregados na
regeneração nervosa são muito importantes. O nervo periférico é composto pelo parênquima,
composto de axônios e células de Schwann, e pelo estroma, composto de tecido conectivo,
epineuro, perineuro e endoneuro. Além disso, conforme pode ser observado na Figura 1, um
nervo pode ser considerado mielinizado, quando o axônio é envolvido por um grupo de
células de Schwann produtoras de mielina, ou não-mielinizado quando um grupo de axônios é
envolto por células de Schwann que não produzem mielina (FLORES, LAVERNIA, OWENS,
2000).
Os nervos periféricos podem ser classificados em três categorias de acordo com a
composição de suas fibras e a função que exercem. Estes podem ser sensitivos, motores ou
mistos, e possuem a propriedade de levarem informações de tato, dor, sensibilidade térmica,
pressão e propriocepção ao sistema nervoso central, assim como, através de impulsos elétricos
centrais, fazerem com que unidades motoras efetuem contração muscular.
De acordo com o mecanismo pelo qual um nervo sofre lesão, diferentes tipos de
injúrias podem ocorrer. Utiliza-se a denominação de neurotmese quando ocorre ruptura total
do nervo, de axoniotmese quando ocorre ruptura do axônio com o epineuro e/ou endoneuro
permanecendo intactos e, por fim, de neuropraxia, quando ocorre inexistência de alteração
anatômica, havendo apenas disfunções fisiológicas (JONATHAN et al., 2009).
10
Figura 1 - Microscopia óptica e eletrônica do nervo ciático de ratos adultos.1
Fonte: Kaplan et al., 2009.
1
Painel C: Célula de Schwann (Sch) produtora de mielina (m) que envolve individualmente os axônios
neuronais (ax). Painel E: axônios não-mielinizados. Tradução adaptada de: Kaplan et al., 2009.
11
Do ponto de vista celular, a ocorrência de um dano neural desencadeia uma série
de mudanças morfológicas e metabólicas no nervo lesado, iniciando o processo de
regeneração, tanto no local como distantemente à lesão. Estas alterações foram divididas para
uma melhor compreensão, e são descritas a seguir.
Primeiramente, ocorrem mudanças no segmento proximal do nervo. Apesar do
comprometimento celular ocorrer no axônio, podem ser observadas alterações em todo corpo
celular, como as encontradas nos cornos dorsais, que possuem função sensitiva, ou nos cornos
ventrais da medula, que possuem função motora, estas podem inclusive culminar com a morte
do neurônio. Morfologicamente observa-se um fenômeno chamado de cromatólise, que
acarretará em edema do corpo e do núcleo neuronal, com excentricidade deste último
(LIEBERMAN, 1971). A célula passa então a um estado de crescimento, (FU; GORDON;
1997) com alterações metabólicas como síntese de neuropeptídios (HOKFELT; ZHANG;
WIESENFELD-HALLIN, 1994) e de proteínas (SCHREYER; SKENE, 1991), seguido do
fenômeno de brotamento (MIRA, 1984).
Este último processo, ilustrado na Figura - 2, também é conhecido como
fenômeno de arborização e tem por função aumentar as chances da porção proximal do
neurônio lesado em refazer a conexão com o segmento distal, que foi seccionado. Evidências
sugerem que as células de Schwann desempenham um papel importante nesta etapa da
regeneração nervosa. Elas servem como guias físicos para este restabelecimento da condução
nervosa, facilitando o encontro destas duas porções do axônio (SON; THOMPSON, 1995).
12
Figura 2 - Ilustração das diferentes etapas do processo de regeneração nervosa.2
Fonte: Adaptado de Rotshenker, 2011.
Em segundo lugar ocorrem mudanças no segmento distal do nervo. Após a
transecção do mesmo, ocorre a denominada degeneração Walleriana (WALLER, 1850), que é
caracterizada pelo colapso da mielina, pela proliferação das células de Schwann e pelo
recrutamento de macrófagos (Figura - 3). A perda do contato entre o axônio e as células de
Schwann é um sinal para a proliferação destas últimas, além da elevação na síntese de
neurotrofinas e neurogulinas (HEUMANN, 1987; THOENEN et al., 1988; FUNAKOSHI et
al., 1993; GEUNA et al., 2007). As célula de Schwann presentes no segmento distal
organizam-se em colunas, chamadas bandas de Büngner, e os axônios em crescimento
provenientes do coto proximal, associam-se ao segmento distal através da membrana basal
2
(A) nervo intacto; (B) sítio da lesão com recrutamento de macrófagos; (C) destruição do axônio; (D)
desintegração da mielina; (E) formação da banda de Bünger.
13
dessas células. Existem outros fatores responsáveis pelo crescimento do próprio axônio como
a laminina e a fibronectina (BARON-VAN EVERCOOREN et al., 1982; LIU, 1996; HALL,
1997), além de moléculas de adesão celular neuronal, ou neural cell adhesion molecule
(NCAM-L-1) e moléculas de reconhecimento neuronal como a TAG-1 (DANILOFF et al.,
1986; WALSH; DOHERTY, 1996).
Figura 3 - Esquema ilustrativo das diferentes etapas envolvidas no fenômeno de degeneração
Walleriana.
Fonte: Gaudet; Popovich; Ramer, 2011.
Como citado anteriormente, as neurotrofinas possuem papel importante na
regeneração neuronal. Secretadas tanto por tecido nervoso como por células e órgãos
distintos, as neurotrofinas são polipeptídios solúveis, que não somente exercem papel
fundamental para a regeneração neuronal como também cumprem função de diferenciação,
manutenção e sobrevivência desse tecido (LEIBROCK et al., 1989; ERNFORS et al., 1990;
TERENGHI, 1999). Foi demonstrada a expressão dessas neurotrofinas em segmento de
nervos lesados, dentre as mais conhecidas em seu mecanismo de ação estão o fator de
14
crescimento nervoso, ou nerve growth factor (NGF) e o fator neurotrófico de origem cerebral,
ou brain derived neurotrophic factor (BDNF) (MEYER et al., 1992; GORDON, 2009).
De acordo com Meyer et al. (1992), a transecção de nervo ciático de ratos
aumentou os níveis de mRNA para BDNF e para NGF, sendo que a expressão dos mesmos
variou de maneira dependente do tempo e do local de observação, sugerindo diferenças nos
mecanismos de regulação da síntese das destas neurotrofinas por células não neuronais do
nervo ciático (MATSUOKA et al., 1991).
Do ponto de vista do presente estudo, outra consideração importante é sobre a
possível participação de sistemas endógenos, que de alguma forma possam agir na regulação
da regeneração neuronal do sistema nervoso periférico, como é o caso do sistema gabaérgico,
por meio do neurotransmissor GABA, ou ácido amino-gama-butírico (NAGAI et al., 1998).
Sabe-se que receptores GABA são encontrados tanto em fibras mielinizadas como não
mielinizadas, e podem influenciar tanto a proliferação das células de Schwann como a
plasticidade neuronal (REN; MODY, 2003; STEIGER et al., 2004; MAGNAGHI, 2007;
ULRICH; BETTLER, 2007).
Uma revisão realizada por Magnaghi (2007) sugere que o neurotransmissor
GABA extracelular poderia interagir com receptores GABA-B nas células de Schwann e
diminuir sua proliferação neuronal e, desta forma, estimularia as mesmas a entrarem em
diferenciação. Os esteróides neuroativos modulariam então a expressão e a responsividade
destes receptores até a sua dessensibilização. Por outro lado, atuando em receptores GABA-A,
tais esteróides, assim como o GABA, poderiam aumentar a expressão de proteína mielina.
Além disso, em um modelo de lesão de ciático em ratos, foi utilizado implante de tubos de
silicone contendo ácido valpróico, uma substância que atua na neurotransmissão gabaérgica
aumentando os níveis de neurotransmissor GABA na fenda sináptica, para unir as porções
próxima e distal do nervo seccionado. Nos animais tratados com esta substância, houve
melhora da regeneração periférica e da recuperação da função motora em comparação ao
grupo controle (WU et al., 2008).
Na clínica, com relação às causas das lesões de nervos periféricos estas ocorrem
principalmente por trauma. Na criança, ocorre principalmente no parto, com uma prevalência
em torno de 0,6 nascimentos/1000/ano (LABRANDERO-DE LERA, 2008), enquanto que no
adulto, os acidentes de trânsito são os principais responsáveis, afetando na grande maioria o
membro superior (ESER et al., 2009; SAADAT, ESLAMI; RAHIMI-MOVAGHAR, 2011).
Quanto ao gênero, os homens estão mais envolvidos neste tipo de acidente, que geralmente
ocorre em plena fase produtiva de suas vidas (FLORES 2006; ASPLUND et al., 2009; ESER
15
et al., 2009; GIUFFRE et al., 2010). Sobre a natureza destes traumas, a motocicleta tem papel
de destaque na lesão do plexo braquial, talvez porque a natureza do trauma facilite este tipo de
lesão.
O plexo braquial, responsável pela inervação do membro superior, é uma
organização especial de nervos periféricos sendo formado pela confluência dos ramos ventrais
das raízes nervosas espinhais de C5 a T1. A variação mais comum é a contribuição das raízes
de C4 e/ou T2, todavia a anatomia do plexo braquial parece apresentar um grande grau de
variabilidade. A combinação destas raízes dá origem aos troncos e fascículos, que por sua vez
originam os cinco principais nervos do membro superior: musculocutâneo, axilar, radial,
mediano e ulnar, sendo estes nervos responsáveis pela inervação motora e sensorial, conforme
ilustrado na figura 4 (BERTELLI, GHIZONI 2005; JONATHAN et al., 2009; AKBORU et
al., 2010).
Figura 4 - Plexo braquial e suas origens nas raízes cervicais.3
Fonte: Capeler (2010). In: Ghizoni, 2011.
A lesão do plexo braquial traumática no adulto, segundo Leffert (1974), pode ser
classificada como aberta ou fechada. Um adequado exemplo da lesão aberta é a lesão por
arma de fogo, quando geralmente haverá a ruptura total do nervo (neurotmese). Na lesão
fechada, o principal mecanismo de lesão é o estiramento nervoso. As lesões ainda podem ser
classificadas como supraclaviculares, infraclaviculares ou combinação de ambas, quando
usado a clavícula como referência anatômica, e como pré-ganglionar ou pós-ganglionar,
considerando como referência o gânglio sensitivo da raiz dorsal (JONATHAN et al. 2009).
3
SSE nervo supra escapular, MCN nervo músculo cutâneo, AXN nervo axilar, RN nervo radial, MN nervo
mediano, UN nervo ulnar, TD nervo torácico dorsal, MCFA nervo cutâneo medial do antebraço, MCA nervo
cutâneo medial do braço.
16
Na prática clínica tais lesões traduzem-se em perda dos movimentos da mão ou
até mesmo de todo o membro superior, perda da sensibilidade, dor neuropática e intolerância
ao frio (BERTELLI; GHIZONI, 2008).
Este pobre prognóstico tem consequências econômicas, sociais e psicológicas
dramáticas. Estas lesões envolvem pessoas em fase ativa de suas vidas que dificilmente
conseguem voltar ao mesmo nível de trabalho que tinham antes do acidente. A atrofia,
deformidade (Figura – 5), disfunção e dor no membro afetado retiram do paciente o convívio
social prévio à sequela. Isto porque o humano usa a mão como forma de expressão corporal,
importante na comunicação e, anomalias de forma ou movimentação dificilmente passam
despercebidas num convívio e relação em grupo. Ainda, estes pacientes relatam
frequentemente sintomas de paranoia quanto ao seu estado de saúde, diminuição de sua
autoestima e sexualidade (FLORES, 2006; BEVERLEY, 2009; BEVERLEY, 2010).
Figura 5 - Sequela de paralisia completa do plexo braquial.
Fonte: Ghizoni, 2011.
Outro sintoma importante que estes pacientes apresentam é a dor neuropática. De
acordo com revisão realizada por Costigam e colaboradores (2009), a dor neuropática
decorrente de lesões no plexo braquial pode depender da maturidade do sistema nervoso, isto
porque embora recém-nascidos não desenvolvam dor após a avulsão do plexo braquial, cerca
de 40% dos adultos desenvolvem dor crônica severa ao mesmo tipo de lesão.
Dentre as substâncias comumente usadas no tratamento da dor neuropática estão
os anestésicos locais, os opióides e os anti-inflamatórios não-esteroidais (SELPH et al., 2011).
Além destes, os antidepressivos inibidores da receptação de serotonina e norepinefrina e os
anticonvulsivantes são considerados como tratamentos de primeira linha na dor neuropática
17
(SELPH et al., 2011). Dentre estes anticonvulsivantes, a gabapentina (GABAP) é uma das
substâncias comumente usadas.
Apesar de a GABAP ser um análogo do GABA, seu mecanismo de ação na
modulação da dor parece não estar relacionado à interação com receptores GABA-A ou
GABA-B, mas sim depender de outras estruturas. A partir de estudo eletrofisiológico foi
sugerido que seu efeito antinociceptivo pode estar relacionado às alterações da
neurotransmissão espinhal por atuação em receptores acoplados a canal de cálcio (BAYER,
AHMADI, ZEILHOFER, 2004), enquanto em modelo animal de neuropatia em
camundongos, observou-se que seus efeitos anti-hiperalgésico e antialodínico sistêmicos
foram dependente da via descendente de controle da dor (TANABE et al., 2005). Por ser um
análogo do GABA, que é um neurotransmissor inibitório, a GABAP parece influenciar
também na biologia das células de Schwann e estas, como citado anteriormente, são muito
importantes na regeneração nervosa periférica (MAGNAGHI, PROCACCI, TATA, 2009).
Conforme comentado anteriormente sobre os sistemas endógenos, embora se
conheça um pouco mais sobre a função do sistema GABAérgico sobre as funções neuronais
no nível do sistema nervoso central (NAIK et al., 2012; SHULGA et al., 2008), parece que há
um vasto campo inexplorado em relação à modulação GABAérgica na lesão do nervo
periférico (MAGNAGHI, PROCACCI, TATA, 2009). Estudo com base em métodos
anatômicos e eletrofisiológicos mostrou que neurônios olfatórios em crescimento expressam
receptores GABA-B e sugere que tais neurônios devem ser capazes de detectar a presença de
GABA liberado de células justaglomerulares e utilizar o mesmo como sinal para limitar seu
crescimento e localizar alvos sinápticos importantes para sua regeneração (PRIEST e
PUCHE, 2004). Além disso, em modelo de axotomia de nervo motor facial em ratos, foi
registrado que o mRNA para diferentes subunidades do receptor GABA-A, além dos
receptores GABA-B1 e GABA-B2 sofreram down-regulation pelo fenômeno de axotomia
(VASSIAS et al., 2005).
Com relação à GABAP, os dados são bem escassos. Recentemente foram
registrados dados preliminares de que a administração intraperitoneal, por 21 dias, de GABAP
(100 e 300 mg/Kg-1) associada a nitoroglicerina (1 mg/kg-1) promoveu maior regeneração de
nervo ciático em ratos quando comparados ao grupo controle, sendo esta avaliada pelo
parâmetros de proporção de células neuronais, formato das células e diferença no tamanho
destas células e de suas conexões (AYDIN et al., 2009).
Sabe-se que os modelos animais usados para avaliar regeneração nervosa são
praticamente idênticos aos usados para avaliar a dor neuropática (BERTELLI, MIRA 1995;
18
RODRIGUES-FILHO et al., 2003). Assim, avaliar a GABAP em um modelo de lesão nervosa
periférica que confira dor neuropática, déficit motor e sensitivo, poderia servir para testar a
hipótese de que ela possa também influenciar, de alguma forma, a regeneração de nervos
nestes quadros. Isto seria importante já que na prática clínica existem evidências de que os
pacientes que tratam a dor neuropática decorrente da lesão do nervo periférico com os
gabapentinóides apresentam uma melhora na regeneração nervosa no que tange o tempo para
recuperação funcional do membro afetado quando comparados com os pacientes que não
fazem uso dessa classe de medicação (WHITLOCK et al., 2007).
19
2 JUSTIFICATIVA
A busca da reabilitação funcional do membro afetado pela lesão nervosa
periférica, como no caso de lesão do plexo braquial, está apoiada em três pontos primordiais.
Primeiro o reestabelecimento da integridade do nervo de maneira microcirúrgica,
cujas técnicas parecem já estar bem estabelecidas (MCALLISTER et al., 1996). Segundo, o
arsenal farmacológico que possa de alguma forma melhorar a regeneração nervosa tanto
quantitativa quanto qualitativamente, do ponto de vista motor e sensitivo. Finalmente, fazer
com que o tecido muscular esteja preparado para receber os impulsos elétrico/químicos do
nervo reabilitado, cuja recuperação é dependente do tempo de inatividade do nervo, ou seja,
quanto maior o tempo de inatividade menor a chance de recuperação (GORDON,
BRUSHART, CHAN 2008). Quanto a estes dois últimos pontos citados, salienta-se que os
mesmos necessitam ainda de comprovações científicas sobre quais os melhores fármacos a
serem empregados, bem como sobre quais as ações biológicas promovidas pelos mesmos e a
maneira pelas quais estas possam afetar os tecidos envolvidos nos fenômenos, tais como os
tecidos nervoso e muscular.
Do ponto de vista deste trabalho, explorar a possibilidade de a GABAP
desempenhar papel farmacológico na regeneração nervosa, a partir de um modelo
experimental, é interessante já que a mesma é usada nos pacientes com lesões periféricas para
o tratamento da dor. Assim, estudos desta natureza podem trazer nova compreensão sobre a
fisiopatogenia envolvida no processo de lesão/regeneração nervosa, bem como auxiliariam a
elucidar aspectos do mecanismo de ação do fármaco GABAP, que ainda não está
completamente elucidado.
Além disso, salienta-se que poucos trabalhos sobre o tema foram encontrados na
literatura avaliando estes aspectos, e resultados neste sentido podem apontar novas
perspectivas de pesquisas ou até mesmo de formas de tratamento utilizando o fármaco em
questão em pacientes com lesões de plexo nervoso. Estes poderiam assim, contribuir
futuramente no tratamento e obtenção de melhores resultados clínicos dos mesmos,
minimizando o desfecho desfavorável destas lesões.
20
3
OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
•
Avaliar a influência da GABAP sobre a regeneração nervosa, numa modalidade de
lesão neural induzida por esmagamento seguido de estiramento no nervo mediano de
ratos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A partir do modelo de lesão por esmagamento seguido de estiramento do nervo
mediano em ratos, pretende-se avaliar a influência da GABAP sobre:
•
a recuperação funcional nervosa, medida através de sua resposta a estímulos elétricos
e mecânicos;
•
a recuperação funcional motora, medidas pelo dia de recuperação da função e pela
força de preensão (Grasping), como avaliação indireta de sua ação sobre o nervo na
junção neuromuscular;
•
a morfometria do nervo mediano;
•
a expressão de neurotrofinas no segmento do nervo lesado.
21
4
MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de
Animais (CEUA)-UNISUL, sob número 11.005.4.01. IV e foi realizado dentro das condições
descritas a seguir.
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando cerca de 300 gramas, obtidos do
Biotério Central da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL). Estes foram mantidos
durante o período do estudo sob condições controladas de temperatura (23º C ± 2º C) e
luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 h), com livre acesso à ração (NUVILAB CRI®) e
água.
4.2 AMOSTRA
Foram inicialmente empregados 10 animais por grupo experimental. Este número
de animais já está bem estabelecido na literatura científica da área (entre 6 a 12) em trabalhos
pré-clínicos para avaliação de eficácia de tratamentos. Além disso, este número está baseado
no cálculo da amostra para comparação de hipóteses, que serve aos estudos experimentais,
estabelecendo um número ao redor de nove indivíduos por grupo a ser avaliado, segundo a
fórmula:
- n/grupo: [(Zα/2 + Zβ)2 p* (1-p*)2]/∆2
- onde: p*= (p0+p1)/2, e ∆= (p0+p1)
E considerando-se os seguintes valores:
• Zα=1,96;
• Zβ = 0,84;
• p: 1,0 e p1: 0,5. Isto é, arbitrando-se uma redução do efeito de 50% no grupo
experimental, em relação ao grupo controle.
4.3 GRUPOS DE ESTUDO
Para avaliação da possível atividade da GABAP sobre a regeneração nervosa, os
animais foram divididos em três grupos, nos quais foram realizadas as análises funcionais e
22
histológicas descritas posteriormente. Os três grupos de estudo foram tratados da seguinte
maneira:
• Grupo 1 (falso-operado): este grupo foi composto por animais que sofreram
cirurgia e exposição do nervo mediano, não submetidos a lesão nervosa por estiramento do
mesmo. Estes animais foram tratados diariamente, por 30 dias, com GABAP (300 mg Kg-1,
intragástrica, em salina isotônica estéril).
• Grupo 2 (controle negativo ou operado + veículo): este grupo foi composto
por animais que sofreram cirurgia e exposição do nervo mediano, com posterior lesão nervosa
por esmagamento e estiramento do mesmo, conforme descrito a seguir. Estes animais
receberam ainda tratamento diário por 30 dias com veículo de diluição da GABAP, no mesmo
volume e via de administração que os animais do grupo.
• Grupo 3 (experimental ou operado + GABAP): este grupo foi composto por
animais que sofreram cirurgia e exposição do nervo mediano, com posterior lesão nervosa por
esmagamento e estiramento do mesmo, conforme descrito a seguir. Estes animais receberam
ainda tratamento diário, a partir do dia consecutiva ao da cirurgia até o 30º. dia após, com
GABAP (300 mg Kg-1, intragástrica).
4.4 INDUÇÃO DE LESÃO NERVOSA POR ESMAGAMENTO E ESTIRAMENTO
A lesão nervosa por esmagamento e estiramento foi adaptada neste estudo. Para a
realização destes procedimentos, os animais foram previamente anestesiados com uma
mistura de cloridrato de cetamina (100 mg kg-1) + xilazina (10 mg kg-1), por via
intramuscular, e permaneceram sob respiração espontânea durante todo o período operatório.
Depois de constatada a anestesia geral, os ratos foram posicionados em decúbito
dorsal horizontal sob uma prancha de fórmica (30 x 35 cm), com as patas anteriores presas
por fita adesiva, realizou-se tricotomia e antissepsia na face interna de ambas as patas
anteriores com solução de clorohexidine (2,0 %).
Para a realização da lesão, foi realizado estiramento do nervo mediano, na pata
esquerda dos animais, conforme as seguintes características: distância entre as pinças de 2 cm,
deslizamento proximal e distal de 3 mm e manteve-se o nervo comprimido e estirado por 5
segundos (Figura -6). Além disso, foi realizada a ressecção do nervo ulnar.
Na pata direita dos animais foi realizada ressecção dos nervos mediano e ulnar.
Este procedimento teve por objetivo impedir que durante a avaliação do teste funcional de
23
Grasping houvesse interferência desta pata na medida de força de preensão da pata esquerda
(experimental).
Após a recuperação anestésica, os animais foram mantidos sob condições
controladas de luz e temperatura, individualmente em caixas de polipropileno, no Laboratório
de Microcirurgia da UNISUL. Como analgesia pós-operatória, utilizou-se dipirona sódica
(100 mg ml-1) diluído na água e oferecida livremente aos animais por quatro dias seguidos.
Não foi utilizado antibiótico no período pós-cirúrgico, uma vez que os animais
foram pesados e monitorados diariamente quanto à possível infecção e desconforto.
Figura 6 - Foto ilustrando o procedimento de esmagamento seguido de estiramento do nervo
mediano de ratos.
Fonte: Ghizoni, 2011.
4.5 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO NERVOSA
4.5.1 Análises Funcionais
24
4.5.1.1 Teste de Grasping
O teste de Grasping é um procedimento simples, descrito originalmente para
avaliação quantitativa da regeneração de nervos periféricos em ratos (BERTELLI, MIRA
1995). Neste teste o animal foi elevado pela cauda, permitindo que o mesmo agarrasse uma
grade de arames com dimensões de 1,5 mm de diâmetro e 8 x 14 cm, fixada em uma balança
eletrônica. Os animais foram avaliados diariamente até o 30º dia após a cirurgia e registrou-se
o dia após a cirurgia em que ocorreu flexão total dos dedos da pata operada do animal
(esquerda) para preensão da mesma, como o dia da recuperação nervosa após a lesão.
Além disso, no momento exato em que os animais agarraram a grade, iniciou-se
uma tração em sentido perpendicular ao plano da grade. A tração foi firmemente aumentada
até o momento em que o animal soltou a grade. O peso negativo obtido na balança no
momento em que o animal soltou a grade também foi registrado com a finalidade de avaliação
quantitativa da força recuperada. Como descrito anteriormente, a pata direita foi desnervada
para não influenciar no resultado deste teste.
4.5.1.2 Resposta à estimulação mecânica
A resposta dos animais à estimulação mecânica foi avaliada por meio do teste de
Von Frey analógico. Neste teste, os animais foram avaliados diariamente até o 30º dia após a
cirurgia quanto ao aparecimento de resposta de retirada da pata à aplicação de um
monofilamento de nylon correspondente à pressão de 10 g, por ser a força que promoveu
maior freqüência de resposta no grupo falso-operado desde o primeiro dia de observação após
a lesão nervosa. Os animais foram colocados individualmente em caixas com malha de arame
e o filamento foi aplicado entre os mesmos, no centro da planta da pata operada dos animais,
até que este produzisse uma resposta de retirada e sacudida da mesma. Foi registrado o dia
após a cirurgia em que houve a resposta do animal.
4.5.1.3 Resposta à estimulação elétrica
A resposta dos animais à estimulação elétrica foi avaliada por meio da aplicação
de estímulo elétrico com neuroestimulador cutâneo, nas intensidades de 5 V ou 39,0 V na face
plantar esquerda da pata operada. Os animais foram avaliados diariamente até o 30º dia após a
cirurgia quanto ao aparecimento de resposta e registrou-se o dia em que os mesmos
25
apresentaram resposta de retirada da pata a uma das duas voltagens avaliadas, como o dia de
recuperação da função sensorial da pata.
4.5.2 Análise Histológica e Morfométrica
As amostras foram preparadas para análise histológica e morfométrica no
Laboratório de Marcadores Histo-Citológicos do Departamento de Biologia Celular,
Embriologia e Genética da UFSC.
No 30º dia após a indução da lesão nervosa por esmagamento e estiramento do
nervo mediano da pata dianteira esquerda, os ratos foram eutanasiados em câmera de CO2 e
este nervo foi removido por incisão no local da inserção do mesmo nas fossas axilar e cubital.
As amostras foram fixadas em uma solução de formalina-zinco (cloreto de zinco 1,6%,
formaldeído 4%, acetato de cálcio 20%) durante 24 horas. Imediatamente foram colocadas em
dicromato de potássio a 5% por 5 dias e, posteriormente, lavadas em água corrente e deixadas
na água (overnight) para remoção de todo dicromato, antes de sofrerem desidratação gradual
em etanol.
Em seguida o nervo foi seccionado em duas partes, proximal e distal, sendo que a
porção distal foi imediatamente congelada a -80º para posterior dosagem das neurotrofinas
NGF e BDNF. A porção proximal foi cuidadosamente desidratada em etanol, e utilizou-se a
metodologia de rotina (CARGNIN-FERREIRA; SARASQUETE, 2008) para a inclusão em
parafina 58ºC, utilizando como líquido intermediário o xilol, de acordo com as seguintes
etapas: a) desidratação e inclusão em parafina: etanol 70% (mínimo 24 horas), etanol 80% (45
minutos), etanol 90% (45 minutos), etanol absoluto 100% I (45 minutos), Etanol absoluto II
(45 minutos), etanol-xilol 1/1 (45 minutos), xilol I (45minutos), xilol II (45 minutos), parafina
I (1 hora), parafina II (1 hora), parafina III (1 hora); b) uma vez que o material foi incluído
verticalmente em parafina e foram feitos seus blocos, estes foram cortados em um micrótomo
Leica RM 2025 com espessura de 5 µm; c) os cortes foram então estirados e recolhidos em
um banho termostático a 52ºC e dispostos sobre lâminas gelatinizadas para sua fácil adesão.
Para a histomorfometria, os cortes obtidos foram desparafinizados e hidratados
segundo a metodologia de rotina e corados com a técnica de Cason (CARGNIN-FERREIRA;
SARASQUETE, 2008) e Oil Red (KIERNAN, 1999). As preparações histológicas foram
dispostas numa solução de Orange G (1%), Fucsina Ácida (1%), Azul de Anilina (1%) e ácido
fosfotúngstico (1%) durante 5 minutos e depois em solução hidroalcóolica Oil Red (1%) por 1
minuto. Decorrido este tempo, as lâminas foram lavadas para retirada do excesso de corante,
26
desidratadas e montadas em meio de montagem aquoso. A opção pela técnica acima descrita
deveu-se ao fato de que, ao contrário da coloração bicromática hematoxilina-eosina, as
técnicas tricrômicas aumentam os contrastes e evidenciam melhor as estruturas analisadas.
Como tratamento das imagens, a análise histológica foi realizada em corte
transversal da porção proximal do nervo mediano esquerdo, restrita ao tecido conjuntivo e à
área de bainha mielinizada. As imagens foram adquiridas usando-se uma câmera digital de
microscopia modelo TA – 0124-A, conectada a um microscópio de luz DME (Leica). As
imagens foram capturas em aumento de 1000x e ampliada mais 200x para análise pelo Image
Pro Plus Software 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, Maryland). Posteriormente, as imagens
foram analizadas em um programa de imagem (Chtool) desenvolvido pelo Projeto Cyclops
(Depto. de Informática – UFSC) para análises histopatológicas dos projetos desenvolvidos
pelo Dr. Eduardo Cargnin Ferreira e para o Serviço de Anatomia Patológica do Hospital
Universitário. O programa atualmente desenvolvido analisa as imagens policromáticas
diretamente, o que leva a uma maior precisão nas quantificações planimétricas das alterações
histopatológicas porque integram distintos matizes de cor derivados das técnicas de coloração
utilizadas.
Para a análise morfométrica foram selecionados os melhores cortes, pela
microscopia de pequeno aumento, descartando os cortes de má qualidade que poderiam
prejudicar o processo de medida dos parâmetros a serem avaliados. Os critérios de seleção dos
cortes foram a integridade da morfologia do nervo, particularmente do perineuro, qualidade
da coloração, ausência de artefatos de técnicas (rachaduras, dobras). Depois de corados, os
cortes foram observados e fotografados com microscopia de luz e uma série de 4 parâmetros
foram quantificados: (1) densidade de fibras mielinizadas (fibras/mm2), (2) área de fibras
mielinizadas (%), (3) área de tecido conjuntivo (%), sendo que para este parâmetro os
fragmentos de degeneração foram subtraídos da imagem analisada, e (4) fragmentos de
degeneração (%).
Como forma de se garantir um controle de qualidade, todo o estudo histológico,
desde a biópsia até a análise das imagens obtidas a partir das preparações histológicas foram
realizadas por um único observador.
4.5.3 Dosagem das Neurotrofinas BDNF e NGF a Partir do Nervo Mediano
Os níveis teciduais de brain derived neurotrophic factor (BDNF) e nerve growth
factor (NGF) foram avaliados como descrito anteriormente (CAMPOS et al., 2002) com
27
poucas modificações, conforme segue. Estas avaliações foram realizadas no 30º dia após a
indução da lesão nervosa por esmagamento e estiramento do nervo mediano. A porção
proximal ao esmagamento do nervo mediano dos ratos foi removida e homogeneizada com
PBS contendo Tween 20 (0.05%), fluoreto de fenilmetilsulfonil 0.1 mM, cloreto de
benzometônio 0.1 mM, EDTA 10 mM, e aprotinina A 2 ng/ml. A solução formada foi
centrifugada a 3.000 x g por 10 minutos a 4ºC, e o sobrenadante foi armazenado a -70ºC por
no máximo 2 semanas. Os níveis das neurotrofinas foram determinados utilizando-se kits
específicos de ELISA (R&D systems) de acordo com as recomendações do fabricante.
4.6. ANÁLISE DOS DADOS
Os resultados foram apresentados como média ± S.E.M (erro padrão da média) e
foram analisados no programa Graphpad Instat®, usando ANOVA seguida de Tukey para
valores obtidos de variáveis contínuas (ex.: força em g) ou de Kruskal-Wallis para valores
obtidos de variáveis ordinais (ex.: dia após cirurgia para recuperação sensorial). Foram
considerados como estatisticamente significantes os valores de p< 0,05.
28
5 RESULTADOS
O procedimento de indução da lesão nervosa em ratos por esmagamento seguido
de estiramento promoveu uma perda da função do nervo mediano (Figura -7). Isto pode ser
observado, uma vez que em comparação com o grupo falso-operado os animais dos dois
grupos que sofreram a lesão do nervo mediano apresentaram redução na força de agarrar,
quando avaliados no teste do Grasping. A perda total da força de agarrar perdurou até o 12º
dia após a lesão do nervo (p< 0,001), quando as médias de força de agarrar nestes grupos
foram iguais a zero; a força retornou gradativamente a partir deste dia, sem alcançar, contudo,
valores semelhantes ao grupo falso-operado até o 30º dia (p < 0,05). O tratamento diário dos
animais com gabapentina (300 mg/kg, v.o.), por sua vez, não alterou a atividade funcional
motora do nervo lesionado; isto porque os valores obtidos para a força de agarrar destes
animais ao longo dos 30 dias de avaliação não diferiram dos observados no grupo que sofreu
a lesão e recebeu veículo como tratamento diário (Figura -7).
Da forma avaliada neste estudo, a GABAP também não foi capaz de promover
alteração da atividade sensorial do nervo mediano de ratos nos testes de estimulação mecânica
ou elétrica. A Figura -8 demonstra que no teste do von Frey, a média para o dia de retorno da
capacidade sensorial mecânica no grupo tratado com GABAP (operado + GABAP) foi de
14,4 ± 0,5 dias, não diferindo do valor médio observado nos animais do grupo tratado com
veículo (operado + veículo; 13,1 ± 0,2 dias). Dados semelhantes foram encontrados para a
atividade sensorial elétrica, conforme pode ser observado na Figura -9. Não houve diferença
no dia médio para recuperação da resposta à estimulação elétrica entre os grupos que
receberam ou não o tratamento diário com a GABAP (300 mg/kg, intragástrica, por 30 dias),
tanto para o estímulo de 5V quanto para o de 39V. Outro dado encontrado foi o de que o
tempo médio (em dias) para a recuperação da atividade sensorial do nervo mediano ao
estímulo de 5V foi significativamente maior do que para o estímulo de 39V tanto no grupo
falso-operado (respectivamente 4,3 ± 0,5 dias e 2,4 ± 0,3 dias; p< 0,001), quanto no grupo
operado + veículo (respectivamente 17,7 ± 0,8 dias e 14,0 ± 1,3 dias; p< 0,001) ou operado +
GABAP (respectivamente 16,4 ± 0,7 dias e 14,1 ± 0,6 dias; p< 0,001).
29
Figura 7 - Influência da GABAP no teste de Grasping em ratos com lesão de nervo mediano.
0
2
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
falso-operado
operado+veículo
operado+GABA
400
Força de agarrar (em g)
4
300
200
100
0
* ** **
**
* * * * * * * ** * * * * ** *
* ** * * ** * * * *
2
4
6
8
10
12 14
*
*
*
*
** * ** * * * *
*
*
*
*
*
* * * * * **
16 18
20 22
24 26
28
30
Dias após indução da lesão
Fonte: Elaboração do autor, 2012.
Legenda: Influência da GABAP no teste de Grasping em ratos com lesão de nervo mediano. A recuperação
funcional foi medida por 30 dias após a indução da lesão, sendo registrada a força de tração (em g) necessária
para que os animais soltassem a grade presa à balança. A influência da GABAP (300 mg/kg, intragástrica, por 30
dias) em animais que sofreram lesão do nervo mediano por estiramento + esmagamento (operado + GABAP) foi
analisada em relação ao grupo de animais que sofreu a lesão e foi tratado diariamente com veículo (salina,
operado + veículo). A perda da atividade funcional do nervo, promovida pela lesão, foi avaliada comparando-se
este último grupo ao grupo de animais que sofreu cirurgia sem a lesão nervosa e que foram tratados diariamente
com GABAP (falso-operado). Grupos de animais com n= 9-10); * p< 0,05 quando comparado ao grupo falsooperado; ANOVA seguida de Tukey.
30
Dia da recuperação
à sensibilidade mecânica
Figura 8 - Influência da GABAP no teste de von Frey em ratos com lesão de nervo mediano.
20
15
*
*
10
5
0
lesão nervosa
GAPAB
+
+
-
+
+
Fonte: Elaboração do autor, 2012
Legenda: Os animais foram avaliados diariamente quanto à resposta de retirada da pata à estimulação com
monofilamento de nylon correspondente à pressão de 10 g, sendo registrado o dia após a indução da lesão em
que houve o aparecimento desta resposta. Os dados são apresentados como a média ± E.P.M. (erro padrão da
média) para as resposta individuais dos animais. A resposta dos animais tratados com GABAP (300 mg/kg,
intragástrica) em animais que sofreram lesão do nervo mediano por estiramento+esmagamento (operado +
GABAP, barra preta) foi analisada em relação ao grupo de animais que sofreu a lesão e foi tratado diariamente
com veículo (operado + veículo, barra cinza). O efeito promovido pela lesão do nervo sobre a sensibilidade
mecânica foi analisado comparando-se as respostas destes últimos grupos às dos animais que sofreram cirurgia
sem a lesão nervosa e que foram tratados diariamente com GABAP (falso-operado, barra branca). Asteriscos (*)
denotam diferença estatística em relação ao grupo falso-operado (n= 9-10, ANOVA seguida de Kruskal-Wallis,
p< 0,05).
31
Figura 9 - Influência da GABAP no teste de estimulação elétrica em ratos com lesão de nervo
Dia da recuperação
à sensibilidade mecânica
mediano.
20
*
15
20
*
15
10
10
5
5
0
0
*
*
Lesão nervosa
-
+
+
-
+
+
GAPAB
+
-
+
+
-
+
Legenda: Os animais foram avaliados diariamente quanto à resposta de retirada da pata à estimulação elétrica de
5 V (painel A) ou 39 V (painel B), sendo registrado o dia após a indução da lesão em que houve o aparecimento
desta resposta. Os dados são apresentados como a média ± E.P.M. (erro padrão da média) para as resposta
individuais dos animais. A resposta dos animais tratados com GABAP (300 mg/kg, intragástrica) em animais
que sofreram lesão do nervo mediano por estiramento+esmagamento (operado + GABAP, barra preta) foi
analisada em relação ao grupo de animais que sofreu a lesão e foi tratado diariamente com veículo (operado +
veículo, barra cinza). O efeito promovido pela lesão do nervo sobre a sensibilidade mecânica foi analisado
comparando-se as respostas destes últimos grupos às dos animais que sofreram cirurgia sem a lesão nervosa e
que foram tratados diariamente com GABAP (falso-operado, barra branca). Asteriscos (*) denotam diferença
estatística em relação ao grupo falso-operado (n= 9-10, ANOVA seguida de Kruskal-Wallis, p< 0,05).
Ausência de efeito para a GABAP (300 mg/kg, oral, 30 dias) também foi
registrada quanto aos níveis das neurotrofinas BDNF e NGF determinados a partir de amostra
do nervo mediano da pata que foi lesionada nos animais dos diferentes grupos. A Figura -10
demonstra que não houve diferença estatística entre os três grupos para as concentrações das
duas neurotrofinas dosadas no 30º. dia após a lesão do nervo.
32
Figura 10 - Influência da GABAP sobre a concentração de neurotrofinas dosadas a partir do
2
0.025
pg/mg de proteína
pg/mg de proteína
nervo mediano de ratos.
1
0
0.020
0.015
0.010
0.005
0.000
Lesão nervosa
-
+
+
-
+
+
GAPAB
+
-
+
+
-
+
Legenda: O BDNF (brain-derived neutrotrophic factor, painel A) e o NGF (nerve growth factor, painel B)
foram dosados a partir da porção distal do nervo mediano, retirado no 30º. dia após a indução da lesão. Os dados
são apresentados como a média ± E.P.M. (erro padrão da média) para os dados obtidos individualmente dos
nervos de cada animais. A influência sobre as neurotrofinas em animais tratados com GABAP (300 mg/kg,
intragástrica) e que sofreram lesão do nervo mediano por estiramento+esmagamento (operado + GABAP, barra
preta) foi analisada em relação ao grupo de animais que sofreu a lesão e foi tratado diariamente com veículo
(operado + veículo, barra cinza). O efeito promovido pela lesão do nervo sobre a dosagem de neurotrofinas foi
analisado comparando-se as respostas destes últimos grupos às dos animais que sofreram cirurgia sem a lesão
nervosa e que foram tratados diariamente com GABAP (falso-operado, barra branca). Grupos com n= 9-10,
ANOVA seguida de Kruskal-Wallis.
Com relação aos achados histológicos, contudo, observou-se que o tratamento dos
animais com a GABAP (300 mg/kg, via oral, administração diária por 30 dias) promoveu
melhora em alguns parâmetros morfométricos analisados, quando comparados com o grupo
tratado com o veículo, conforme pode ser observado na Figura -11.
33
Figura 11 - Micrografia de luz obtida de cortes transversais do nervo mediano, 30 dias após
lesão por esmagamento e estiramento.
A
B
C
Legenda: Porções proximais de nervo mediano, respectivamente para os grupos falso-operado (painel A),
operado + veículo (painel B) e operado + GABAP (painel C). Nota-se o aparente espectro de fibras bimodais,
mielinizadas de pequeno e grande calibre (em vermelho) e escasso tecido conjuntivo (em verde) no espaço
endoneural entre as fibras mielinizadas. No painel B, predominância de fibras finas e de pequeno diâmetro, além
de aumento no tecido conjuntivo no espaço endoneural, muito sugestivo de fibrose endoneural. No painel C,
fibras mielinizadas com aspecto semelhante ao grupo falso-operado. As imagens foram capturadas com aumento
de 1.000x. Escala da barra de 5 µm.
Com relação aos achados histológicos, contudo, observou-se que o tratamento dos
animais com a GABAP (300 mg/kg, via oral, administração diária por 30 dias) promoveu
melhora em alguns parâmetros morfométricos analisados, quando comparados com o grupo
tratado com o veículo, conforme pode ser observado na Figura -12.
A análise morfométrica das imagens dos cortes transversais da porção distal do
nervo mediano (Figura -12) demonstrou que no 30º dia após a indução da lesão por
esmagamento + estiramento, na análise da área de fibras mielinizadas (percentagem [%],
Figura -12A) o grupo operado + veículo (12,2 ± 1,2%) apresentou uma redução da mesma
quando comparado ao grupo falso-operado (57,1 ± 3,1%; p< 0,001), no entanto, observou-se
um aumento desta percentagem no grupo operado + GABAP (38,6 ± 3,0%; p< 0,001).
34
Figura 12 - Imagens da análise morfométrica das secções transversais do nervo mediano 30
dias após a indução da lesão por esmagamento e estiramento.
A
B
C
D
Legenda: Aumento de 1000x (A-B). Quantificação da área de fibras mielinizadas, como indica a seta grossa
(painel A) e a marcação em verde (painel B); (A-C) quantificação da área de tecido conjuntivo indicada pela seta
fina (painel A) e pela marcação em verde (painel C), e (A-D) quantificação dos fragmentos de degeneração,
como indicado pelas duplas setas (panel A) e pela marcação em verde do painel D. As secções dos nervos foram
coradas com a coloração tricrômica de Mason a qual permitiu uma evidente diferenciação entre o tecido
mielinizado (vermelho) e o tecido conjuntivo (verde). Escala da barra de 5 µm.
Quanto à percentagem da área de tecido conjuntivo observada nos cortes do nervo
mediano (Figura -12B), novamente ocorreu diferença entre os grupos falso-operado e operado
+ veículo (respectivamente 9,3 ± 1,2% e 76,5 ± 4,2%; p< 0,001), com aumento significativo
neste último grupo em relação ao primeiro e, mais uma vez, sendo o efeito da lesão nervosa
observada sobre o grupo falso-operado reduzido pelo tratamento com GABAP (63,6 ± 5,20%;
p< 0,05). O efeito benéfico da GABAP também foi observado em relação à densidade de
fibras mielinizadas/mm2; percebe-se na Figura -12C que o grupo operado + veículo (controle)
35
apresentou média de densidade de 18.789 ± 3.568 fibras/mm2, que não diferiu
estatisticamente do grupo falso-operado (22.982 ± 885.6 fibras/mm2); por outro lado, houve
aumento significativo no grupo operado + GABAP com relação aos dois primeiros grupos,
apresentando valor médio de 29.600 ± 2.822 fibras/mm2 de densidade de fibras (p< 0,05).
Finalmente, enquanto o grupo falso-operado praticamente não apresentou
fragmentos de degeneração (0,25 ± 0,2%), observou-se aumento deste índice no grupo
operado + veículo para 5,3 ± 1,0% (p < 0,01) e novamente uma reversão parcial deste efeito
promovida pelo tratamento dos animais com GABAP (2,5 ± 0,8%; p< 0,05).
36
Figura 13 - Influência da GABAP sobre parâmetros histológicos obtidos de secções
transversais do nervo mediano de ratos, 30 dias após lesão por esmagamento seguido de
densidade fibras mielinizadas/mm
2
30000
A
B
*
#
Sham
Salina
Gabapentina
*
C
20000
10000
Lesão
GAPAB
área tecido conjuntivo (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
Sham
Salina
Gabapentina
+
+
-
+
+
área de degeneração (%)
área fibras mielinizadas (%)
estiramento.
#
80
*
60
40
20
0
7
6
5
4
3
2
1
0
Sham
Salina
Gabapentina
#
D
*
Sham
Salina
+
+
-
Gabapentina
+
+
Legenda: Quantificação da área de fibras mielinizadas (Painel A), da área de tecido conjuntivo (Painel B), de
densidade de fibras mielinizadas/mm2 (Painel C) e dos fragmentos de degeneração (Painel d). A quantificação
foi realizada a partir das imagens capturas em aumento de 1000x para análise pelo Image Pro Plus Software 6.0
(Media Cybernetics, Bethesda, Maryland) e posteriormente analizadas pelo programa de imagem (Chtool)
desenvolvido pelo Projeto Cyclops do Departamento de Informática da UFSC. Grupos de animais com n= 9-10;
p< 0,05; ANOVA seguida de Tukey. (#) denotam diferença estatística em relação ao grupo falso-operado +
GABA e (*) em relação ao grupo lesão + veículo.
37
6 DISCUSSÃO
De acordo com dados apresentados em uma revisão recente, em cerca de 3% dos
pacientes que sofrem traumas ocorrem lesões nervosas. Destes, apenas a metade recupera a
sua função e em menos de 10% dos casos há recuperação completa (IRINTCHEV, 2011).
Desta forma, a elucidação dos fenômenos compreendidos na regeneração nervosa, bem como
a busca por novas alternativas de tratamento constituem-se objetivos extremamente relevantes
na área.
O papel do sistema GABAérgico endógeno durante a regeneração nervosa ainda é
controverso. Wu e colaboradores (2008) observaram que o tratamento em ratos, com ácido
valpróico, substância que aumenta a liberação de GABA, melhorou a regeneração do nervo
ciático , nos animais, após lesão induzida por incisão. Por outro lado, a pregabalina, um
análogo do GABA, não promoveu melhora da regeneração do nervo ciático de ratos com
lesão induzida por esmagamento (WHITLOCK et al., 2007). Apesar desta controvérsia, foi
demonstrado a partir de estudos in vitro que os receptores GABA-A e GABA-B podem
interagir de maneira a influenciar as células de Schwann quanto a produção de proteínas
formadoras da bainha de mielina. De acordo com revisão de Magnaghi e colaboradores
(2009), enquanto os receptores GABA-A exercem efeito estimulatório sobre a peripheral
myelin protein (PMP22), os receptores GABA-B causariam redução da expressão desta
proteína.
O interesse em avaliar o papel da GABAP, um análogo do GABA, sobre a
regeneração nervosa decorre destes achados, bem como do fato de que a mesma vem sendo
amplamente empregada no tratamento da dor neuropática, como a experimentada por
pacientes com lesão nervosa periférica (SELPH et al., 2011). Além disso, existem evidências
empíricas de que o tratamento com outro análogo deste neurotransmissor leva a um melhor
prognóstico funcional em pacientes com lesão de nervo periférico (WHITLOCK et al., 2007).
O presente estudo demonstrou, ao que tudo indica pela primeira vez, que a
administração diária e sistêmica de GABAP (300 mg/kg, via oral por 30 dias) promoveu
resultados favoráveis sobre diferentes parâmetros histológicos relacionados à regeneração
nervosa, em ratos submetidos à lesão por esmagamento e estiramento em nervo mediano. Por
outro lado, o tratamento prévio dos animais com a substância não promoveu a alteração de
diferentes comportamentos utilizados para a avaliação funcional do nervo.
Embora, no presente estudo, tenha sido utilizada apenas uma dose de GABAP
para avaliação destes efeitos, levando-se em consideração a escassez de dados na literatura
38
sobre o tema esta dose foi selecionada tendo como base alguns aspectos. Primeiramente, esta
é a dose preconizada para o tratamento da dor neuropática em humanos, em dose única diária,
por via oral, semelhante ao procedimento que foi adotado neste estudo. Em segundo lugar, foi
a dose usada em um trabalho preliminar em que a droga, associada à nitroglicerina, melhorou
parâmetros de regeneração do nervo ciático tais como proporção, formato e tamanho das
células nervosas de nervo ciático (AYDIN et al., 2009).
Finalmente, outros estudos que avaliaram alteração na nocicepção em animais em
modelos de dor neuropática observaram que doses de 30 ou 100 mg/Kg promoveram,
respectivamente, redução da alodinia tatil e hiperalgesia mecânica em camundongos (OMORI
et al., 2009), bem como da alodinia mecânica em ratos (HAHN et al., 2009). Assim, a
ausência de efeito comportamental observada para a mesma neste estudo não parece ser
decorrente da dose de GABAP empregada, mas sim exclusivamente da falta de ação da
substância sobre estes parâmetros no modelo utilizado.
Com relação ao modelo, sabe-se que a indução de lesão de diferentes nervos por
esmagamento vem sendo uma técnica amplamente empregada para o estudo de possíveis
tratamentos da dor neuropática (BOBINSKI et al., 2011; MARTINS et al., 2011; BORDET et
al., 2008). Quanto à regeneração nervosa, contudo, apesar deste modelo ser menos empregado
discute-se que ele pode ser bastante útil, principalmente pelo fato de que a lesão nervosa que
ele causa (de axoniotmese) apresenta uma evolução para a regeneração relativamente rápida,
bem como pela técnica ser de fácil execução (WOLTHERS et al., 2005). Por outro lado, Tos e
colaboradores (2009) lembram que esta rápida recuperação também pode ser considerada uma
desvantagem, uma vez que pode reduzir a sensibilidade do método para detectar diferenças de
efeitos entre tratamentos diversos (TOS et al., 2009). A partir dos achados do presente estudo,
contudo, acreditamos que a ausência de efeito da GABAP nos parâmetros funcionais
avaliados nos modelos do Grasping e de sensibilidade sensorial (mecâmica e elétrica) não
deva ser decorrente deste último aspecto. Isto porque ocorreu uma diferença bastante
significativa entre os efeitos observados entre o grupo falso-operado e operado + veículo,
promovendo uma margem considerável que permitiria a visualização de qualquer efeito da
GABAP sobre estes parâmetros, em relação ao grupo tratado com veículo, o que não foi
encontrado no presente estudo.
Principalmente ainda pelas limitações da técnica de indução de lesão nervosa por
esmagamento citadas anteriormente, no presente estudo o método foi adaptado com o
procedimento de estiramento seguindo o esmagamento, como forma de tentar causar uma
lesão nervosa mais pronunciada, e mais semelhante ao que pode ser observado clinicamente
39
(CAI et al., 1998). Com esta alteração o retorno da atividade funcional do nervo, avaliado
pelo teste do Grasping, passou a ocorrer em torno do 13º. dia após a indução da lesão,
diferentemente do que ocorreu com a técnica de lesão apenas por esmagamento anteriormente
observada em nosso laboratório, que ocorreu em torno do 8º. dia (BERTELLI e MIRA, 1995).
Este fato pode ter contribuído também para o desfecho das avaliações histológicas
do presente estudo, que permitiram visualizar um efeito importante para a GABAP quanto aos
aspectos de aumento de densidade e de área de fibras mielinizadas, além de redução de áreas
degeneradas e de tecido conjuntivo. Isto porque num estudo prévio envolvendo o modelo de
lesão apenas por esmagamento do ciático em ratos, outro análogo do GABA, a pregabalina,
não foi capaz de alterar a regeneração nervosa, avaliada após 21 dias da lesão em testes
comportamentais e morfométricos (WHITLOCK et al., 2007).
As diferenças nas técnicas empregadas para a indução da lesão nervosa também
podem influenciar o tempo de regeneração observado em cada um deles. Cabe então discutir o
tempo para a avaliação dos parâmetros funcionais e de regeneração que foi selecionado neste
estudo, de 30 dias após a indução da lesão nervosa. Este período para observação foi
escolhido por conveniência. Sabe-se que embora o restabelecimento funcional de um tecido
lesado dependa das alterações histológicas e/ou morfológicas ocorridas no mesmo, nem
sempre os resultados funcionais são observados simultânea ou imediatamente após o rearranjo
celular ou tecidual (WOLTHERS et al., 2005) Assim, apesar dos nossos achados histológicos
demonstrarem a melhora da regeneração promovida pela GABAP, a falta de correlação dos
mesmos com o efeito funcional pode sugerir que as alterações promovidas pela substância não
são significativas para a recuperação da função do nervo no tempo de observação permitido
pelo método empregado no estudo.
Por outro lado, embora deva ser levada em consideração a natureza da lesão
nervosa, deve-se lembrar que a recuperação funcional é complexa e multifatorial, envolvendo
também além do nervo o tecido muscular. Uma revisão recente sobre modelos de lesão de
nervos mistos em roedores discute diferentes fatores que podem influenciar a recuperação
funcional dos mesmos por transecção, mesmo após imediato reparo por microcirurgia
(IRINTCHEV, 2011). Para este autor, entre os fatores limitantes que podem ser citados está o
direcionamento equivocado para crescimento dos axônios, a diminuição da oferta de fatores
tróficos pelas células de Schwann e propriedades funcionais aberrantes nos axônios
regenerados, entre outros.
Ainda sobre os fatores que podem influenciar a regeneração nervosa, o presente
estudo também investigou uma possível influência da GABAP sobre as neurotrofinas BDNF e
40
NGF dosadas no nervo mediano, no 30º dia após a lesão. O papel destas neurotrofinas em
promover uma regeneração mais precoce do nervo ciático foi demonstrado anteriormente por
Gordon (2009). Além disso, o tratamento de ratos com BDNF e NGF exógenas demonstrou
efetividade em promover aumento do número de neurônios motores, bem como de regenerar
seus axônios (BOYD; GORDON, 2002; 2003). Também foi registrado em modelos animais
que procedimentos que melhoram a regeneração nervosa tais como a estimulação elétrica e a
prática de exercício moderado, elevam o nível de BDNF ( AL-MAJED; BRUSHART;
GORDON et al., 2000; SABATIER et al., 2008).
Tais achados reforçam a hipótese de que substâncias que promovam um aumento
de produção das neurotrofinas influenciam positivamente a regeneração nervosa. Nas
condições do presente estudo, contudo, não foi observada influência da GABAP sobre as
concentrações de BDNF e NGF a partir do nervo mediano. Tal fato pode ter sido resultado do
período selecionado para a realização desta análise. Embora tenham sido registrado que o
aumento da expressão das neurotrofinas BDNF e NGF em nervos que sofreram axoniotmese
ocorre principalmente nos primeiros 10 dias após a lesão (GORDON, 2009), no presente
estudo o período de 30 dias foi empregado por questões metodológicas, podendo representar
uma limitação.
Apesar das possíveis limitações do método empregado, contudo, outros fatores
justificam o uso deste para o estudo de regeneração nervosa. Inicialmente, Tos e
colaboradores (2009) discutem que este método é adequado para o estudo de fármacos e
substâncias com envolvimento nos mecanismos de regeneração, entre outras coisas porque
englobam a fisiopatogenia da lesão neuronal e porque a resposta à lesão gerada apresenta
pouca variação entre os animais estudados (TOS et al., 2009). Por sua vez, Irintchev (2011),
lembra em sua revisão que o uso de modelos de lesão de nervo mediano pode ser mais
propício do que com lesão de nervo ciático, uma vez que a maioria das intervenções
cirúrgicas de reparo de nervos lesionados em humanos é realizada em membros superiores,
ainda, o teste do Grasping é particularmente interessante porque requer habilidade para os
movimentos finos dos dedos e que, além disso, tais movimentos são muito semelhantes entre
roedores e humanos.
Uma última consideração em relação ao método empregado no presente estudo,
diz respeito ao número de grupos experimentais avaliados. Apesar de a análise dos resultados
não ter sido controlada por um grupo falso-operado com administração oral e diária de
veículo, acreditamos que os efeitos da GABAP no grupo operado + GABAP em relação ao
grupo operado + veículo podem ser considerados específicos. Isto com base nos resultados
41
obtidos teste do Grasping, no qual o efeito observado no grupo falso-operado após 30 dias de
administração da mesma não diferiu daqueles obtidos nos primeiros dias de observação.
42
7 CONCLUSÃO
Nossos resultados confirmam a utilidade do modelo de lesão induzida por
esmagamento seguido de estiramento, como adaptação à técnica de esmagamento, para o
estudo de parâmetros histológicos e funcionais associados à regeneração do nervo mediano.
Os dados apontam ainda para um efeito benéfico da GABAP sobre a regeneração
nervosa, observados principalmente a partir de análise histológica.
43
8 PERSPECTIVAS
Sugere-se que novos estudos sejam conduzidos sobre o tema, já que a
confirmação da ação da GABAP sobre a regeneração nervosa, bem como dos mecanismos
envolvidos, poderia trazer subsídios para um maior entendimento sobre a ação da mesma,
bem como para a descoberta de novas abordagens de tratamento desta condição.
44
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51
ANEXO
52
ANEXO A – Parecer Comissão de Ética no uso de animais (CEUA) UNISUL

universidade do sul de santa catarina jean abreu machado

Transcrição

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