CECILIA HELENA VIEIRA FRANCO DE GODOY CARVALHAES

Transcrição

Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do
título de Doutor em Infectologia.
São Paulo
2014
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do
título de Doutor em Infectologia.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Coorientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro
fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
São Paulo
2014
ii
CARVALHAES, Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy
Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e
Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em
Bactérias Gram-negativas. Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy Carvalhaes - São Paulo,
2014.
xxiii, 179.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Standardization and application of matrix-assisted laser desorption
ionization time-of-flight mass spectrometry for carbapenemase detection in Gram-negative
rods.
1. Pseudomonas spp., 2. Acinetobacter spp., 3. Enterobactérias, 4. Klebsiella
pneumoniae; 5. β-lactamase; 6. OXA-carbapenemase; 7. KPC; 8. Infecção de
corrente sanguínea; 9. Metalo-β-lactamase; 10. MALDI-TOF MS; 11. Hemocultura;
12. Espectrometria de massa; 13. Resistência bacteriana.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Profa. Dra. Maria Tereza Zanella
Coordenador do curso de Pós-graduação:
Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Chefe da Disciplina de Infectologia:
Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato
São Paulo
2014
iv
BANCA EXAMINADORA:
Presidente:
Profa. Dra. Ana Cristina Gales
Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do
Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Titulares:
Prof. Dr. Luis Martinez-Martinez
Professor Titular do Departamento de Biología Molecular da Facultad de Medicina da
Universidad de Cantabria - UNICAN e Chefe do Servicio de Microbiología do Hospital
Universitario Marqués de Valdecilla - IDIVAL, Santander, Espanha.
Prof. Dr. Cledir Rodrigues Santos
Gerente da Qualidade da Micoteca da Universidade do Minho, Braga, Portugal e Professor
Visitante Internacional no Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, Minas
Gerais.
Prof. Dr. Adagmar Andriolo
Professor Associado e Livre Docente da Disciplina de Patologia Clínica do Departamento de
Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo
Chefe do Grupo de Infecção em Transplantes da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP.
Suplentes:
Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Médica-coordenadora do Setor
de Microbiologia do Laboratório Clínico da Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital
Albert Einstein (SBIBHAE).
Prof. Dr. João Nóbrega de Almeida Júnior
Médico Assistente do Laboratório de Microbiologia da Divisão de Laboratório Central, Hospital
das Clínicas - HC, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP.
v
“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são”
Aristóteles
vi
Dedico este trabalho ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, a quem eu tenho muito
orgulho de chamar de PAI.
vii
Agradeço à DEUS, pela Sua INTERCEDÊNCIA na minha vida, pela Sua SABEDORIA acima de
todas as coisas, e por permitir a CONFLUÊNCIA de fatores que me levaram a concretizar esta
jornada.
viii
Agradeço ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, mas para mim, MEU PAI, que
com muito amor e dedicação me ensinou o valor do ESFORÇO e da DEDICAÇÃO, e que devo
sempre ter mérito e perseverança para alcançar os meus objetivos. Pai, você me proporcionou
todos os instrumentos para que eu trilhasse meu caminho. OBRIGADA MEU PAI.
Agradeço à minha amada mãe, Maria Carmen, não há palavras no mundo que possam
expressar meu reconhecimento e retribuir seu AMOR, DEDICAÇÃO e CARINHO, sempre tão
presentes em minha vida. Mãe, você é o meu alicerce. Obrigada por procurar fazer de mim uma
pessoa melhor, por ser o exemplo do AMOR INCONDICIONAL, por me ensinar a FÉ e a buscar
minha FORÇA INTERIOR.
ix
Agradeço ao meu amado marido, Marcelo, meu companheiro de uma longa jornada, pela
paciência, pela compreensão nos momentos em que estive ausente, pelos conselhos, pela
segurança na tomada de decisões. Agradeço a construção e dedicação à nossa MARAVILHOSA
FAMÍLIA e por permitir que eu buscasse meu SONHO e a minha REALIZAÇÃO.
Agradeço aos meus amados filhos, Alessandra e Lucas, que me ensinaram que a VIDA é um
milagre de DEUS e que o AMOR pode ser maior do que eu poderia imaginar. Obrigada pela
ALEGRIA que vocês me trazem, e por me fazerem entender o PROPÓSITO da VIDA.
x
Agradeço às minhas irmãs, Cris, Carola e Silvinha, minhas amadas companheiras de vida,
cada uma um exemplo incrível de dedicação, perseverança, esforço e força. Obrigada, pelo
amor e carinho a mim dedicados, por estarem do meu lado em TODOS os momentos da minha
vida e me levantarem quando mais precisei. Somos uma IRMANDADE com toda força, amor e
união que a palavra remete. Amo vocês.
xi
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, por quem tenho imenso
RESPEITO e ADMIRAÇÃO. Sinto-me imensamente privilegiada não apenas pelos inúmeros
conhecimentos transmitidos e grande dedicação à minha formação, mas também pela sua
essência, pela busca no aprimoramento do SER HUMANO, mente e espírito, por compartilhar
experiências de VIDA e por me dedicar seu escasso tempo com muito carinho. Tenho
ORGULHO de ser sua aluna e, muito mais, de ser sua AMIGA. OBRIGADA, Ana.
Ao meu grande AMIGO, Rodrigo Cayô, a quem eu muito ADMIRO pela DEVOÇÃO ao trabalho,
pelo ESFORÇO e MÉRITO por tudo que faz e, principalmente, o que o destaca, pela sua
capacidade de se DOAR aos outros. Eu agradeço pelos inúmeros momentos que passamos
juntos, pelo conhecimento compartilhado, pelos conselhos, pelo altruísmo e dedicação para
comigo. Agradeço do fundo do meu coração. OBRIGADA, meu AMIGO.
À UNIFESP, a minha amada ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA, que ainda jovem me acolheu,
onde apreendi e trilhei meu caminho profissional com muito orgulho. Onde agora posso retribuir
o muito que me foi ensinado.
Ao Prof. Dr. Adagmar Andriolo, por me acolher na Patologia Clínica, e compartilhar seus
conhecimentos. Agradeço pela sua dedicação e perseverança em tornar nossa especialidade
reconhecida e forte.
À Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado, por me ensinar MICROBIOLOGIA, por me auxiliar
na busca pelo mestrado e doutorado, pelos inúmeros conselhos pessoais e profissionais, e,
principalmente, pelo sempre presente suporte profissional. OBRIGADA pelo INCENTIVO e
ORIENTAÇÃO.
À minha querida AMIGA, Eliete Frigatto, que me passou mais do que seus conhecimentos e
imensa experiência, mas também sua paixão pela nossa MICROBIOLOGIA. Uma grande amiga,
um exemplo de dedicação e altruísmo, de respeito e responsabilidade, de comprometimento e
educação. Sinto-me honrada de tê-la ao meu lado, no trabalho, mas, principalmente, na vida.
xii
À Equipe de Microbiologia do Laboratório Central, por me acolher ainda na resisdência
médica, por compartilhar seus conhecimentos, por dividir momentos de alegria e de tristeza, por
sofrer com a falta e alegrar-se com as nossas conquistas e, principalmente, por tornarem-se a
MINHA EQUIPE, da qual eu tenho muito orgulho de estar a frente.
A todos os Médicos e Colaboradores do Laboratório Central e Disciplina de Patologia
Clínica/Medicina Laboratorial pelo apoio e incentivo, pela alegria do convívio diário.
Ao Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo, por me receber no seu competente e dedicado
grupo de Infecção em Transplante, onde tive oportunidade de adicionar à minha formação seus
preciosos conhecimentos de Infectologia, e compartilhar com profissionais de excelência, como
Dr. Alexandre Marra, Dr. Moacyr Silva Jr., Dr. Fernando Gatti Menezes e Dr. Marcelo
Mostardeiro. Obrigada a todos pela amizade, companheirismo e conhecimentos
compartilhados.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, pelo exemplo do que significa a profissão de
Médico, pela dedicação aos pacientes acima de tudo, pelos ensinamentos e conselhos
fornecidos, pela experiência de vida compartilhada, por me ensinar a ser flexível e me mostrar
caminhos não antes percebidos. OBRIGADA Professor pela sua SABEDORIA.
Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA, Adriana Nicoletti, Adriana Pereira, Ana
Carolina Ramos, Ana Paula Streling, Anderson Santos, Bruna Nonato, Danilo Xavier,
Dandara Corsi, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues,
Graziela Braun, Jéssica Werneck, Jhonatha Moura, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg,
Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Paula Peraro, Rafael Affini, Renata
Picão, Rodrigo Cayô e Talita Barone, que me ensinaram a MICROBIOLOGIA de ponta, mas
também o respeito, a amizade e a dedicação entre companheiros de trabalho. Agradeço a todos
aqueles que hoje estão no laboratório e também àqueles que por lá passaram e plantaram suas
sementes, àqueles que participaram ativamente dos meus trabalhos e dos quais são coautores,
que me auxiliaram quando eu tinha minhas obrigações maternas e que cresceram junto comigo.
Agradeço às minhas coorientandas, Ana Carolina, Bruna e Eliete, que me proporcionaram um
amadurecimento profissional. Agradeço especialmente, as minhas amigas Raquel Girardello,
Ana Carolina Ramos e Ana Paula Streling.
xiii
Aos pós-graduandos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) pelos
ensinamentos e experiências compartilhadas. Agradeço em especial ao Dr. André Doi e à
Rosana Capecce.
Ao Prof. Dr. Luis Martínez-Martínez, por me receber em um curto estágio em seu Serviço de
Microbiologia, em Santander, Espanha. Agradeço pela oportunidade de conhecer e a almeijar
um serviço de excelência, pelos seus inúmeros conhecimentos compartilhados, pela dedicação e
conselhos em nossos projetos. Agradeço imensamente por me dar a honra de ser membro de
minha banca de doutorado.
À Equipe do Servicio de Microbiología do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla,
Santander, Espanha, por me acolher e compartilhar seus conhecimentos, especialmente, Bélem
Ruiz del Castillo, Elena Román Paucar, Alain Ocampo Sosa e Dr. Jorge Calvo Montes.
À querida amiga María Pilar Garcillán Barcia, que acolheu a mim e a minha família em sua
casa, pelo carinho, alegria e dedicação. MUITO OBRIGADA.
Ao Departamento de Biofísica da UNIFESP, ao Prof. Dr. Luiz Juliano Neto e Profa. Dra.
Maria Juliano, pela colaboração e apoio aos nossos estudos. À toda equipe, especialmente, à
Débora e Lilian, pelos auxílios e dedicação a mim dispensados.
Ao amigo Diego Magno Assis, por acreditar e se dedicar ao nosso projeto, pelos
conhecimentos e grandes momentos de alegria compartilhados quando no sucesso do projeto.
Muito OBRIGADA, sem você este trabalho não teria se concretizado.
Ao Prof. Dr. Alberto Duarte, pelo apoio e incentivo para conclusão deste trabalho. Tenho uma
grande ADMIRAÇÃO pelo seu exemplo de que a ciência PODE e DEVE estar acima de outros
interesses.
Aos meus colegas e amigos do HCor, pela compreensão, apoio e estímulo para a conclusão
deste trabalho. Agradeço especialmente ao Dr. André Doi, Dr. Nilo Duarte, Dra. Carina
Ceneviva, Dr. Luis Gustavo, Dra. Maria Rita Elmor de Araújo, Dra. Lucilene Rodrigues e Dra.
Annelise Lopes. Agradeço também ao carinho e atenção dispensados a mim pela equipe da
secretaria e demais colaboradores, especialmente, Nata e Daniel.
xiv
À minha sogra, Maria Alice, pela sua IMENSA dedicação à minha família, por me auxiliar e me
dar o suporte para que eu pudesse me ausentar muitas vezes do meu lar. OBRIGADA por estar
sempre presente, pelo seu APOIO, COMPREENSÃO, CARINHO e DEVOÇÃO.
Ao meu querido sogro, Luís Fernando, a quem eu tenho enorme apreço, AGRADEÇO o AMOR
que tem por mim e pelos meus filhos, AGRADEÇO à DEUS por permitir compartilhar destes
momentos preciosos ao seu lado, e PEÇO com muito carinho que cuide de sua sáude, para que
desfrutemos de muitos outros.
À Amara Maria Felix, que com simplicidade, muita dedicação, paciência e AMOR cuida dos
meus filhos como se fossem seus, me garantindo a segurança e confiança para exercer meu
trabalho profissional. O meu profundo AGRADECIMENTO.
O meu muito obrigado aos pacientes, que proporcionaram a execução deste trabalho, muitos
dos quais já evoluiram para outra dimensão em decorrência destas infecções. Que o fruto deste
trabalho posse reverter em benefício a muitos outros pacientes que virão.
Às bactérias, a quem tenho apreço e respeito, pois apesar de suas minúsculas dimensões,
habitam a Terra há milhares de anos antes que nós e provavelmente a habitarão por milhares de
anos a mais. Temos ainda muito que apreender com vocês.
xv
SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................. XVIII
ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................................. XX
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ XXI
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................................... 6
2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica ............................................ 7
2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS................................................................. 9
2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos .......................... 11
2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas....................................................................13
2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas................................................................15
2.1.2.3. Identificação de Micobactérias..............................................................................15
2.1.2.4. Identificação de Fungos........................................................................................16
2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura......18
2.1.3. A Espectrometria de Massa na Tipagem de Micro-organimos .................................. 24
2.1.4. A Espectrometria de Massa na Resistência aos Antimicrobianos ............................. 25
2.2. Epidemiologia das Bactérias Gram-negativas no Ambiente Hospitalar ............................ 27
2.2.1. Resistência aos Antimicrobianos β-lactâmicos em Bactérias Gram-negativas ......... 31
2.3. Mecanismos Envolvidos na Resistência aos Carbapenens .............................................. 34
2.3.1. Cefalosporinases e ESβL Associadas à Impermeabilidade de Membrana ............... 35
2.3.2. Produção de β-lactamases: Carbapenemases.......................................................... 45
2.3.3.1. Carbepenemases de Classe A..............................................................................49
2.3.3.2. Carbapenemases de Classe B..............................................................................52
2.3.3.3. Carbapenemases de Classe D..............................................................................54
2.4. Impacto Clínico da Resistência aos Carbapenens ........................................................... 56
2.5. Metodologias Aplicadas à Detecção de Carbapenemases ............................................... 60
2.5.1. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos ............................................................. 61
2.5.2. Teste de Hodge Modificado ...................................................................................... 64
2.5.3. Teste com Inibidores de Carbanemases ................................................................... 65
2.5.4. Testes Genotípicos ................................................................................................... 67
2.5.5. Testes Baseados na Detecção da Atividade Enzimática .......................................... 69
2.5.5.1. Testes Colorimétricos (Carba NP, CarbAcineto NP e Blue Carba)......................69
xvi
2.5.5.2. Espectrofotometria................................................................................................71
2.5.5.3. Espectrometria de Massa - MALDI-TOF MS........................................................71
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 75
4. ARTIGOS CIENTÍFICOS ......................................................................................................... 77
4.1. Artigo Científico 1: Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and Class D
β-Lactamase-Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid ChromatographyMass Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass
Spectrometry………………………………………………………………………………..………....79
4.2. Artigo Científico 2: Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials
using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision……………….……………………92
4.3. Artigo Científico 3: Detection of carbapenemase activity using VITEK® MS: Interplay of
carbapenemase type and period of incubation……………………………………………..……108
5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 118
6. CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 138
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 140
8. ANEXOS ................................................................................................................................ 165
8.1. Anexo 1: Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in
Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results………………………..………….…167
8.2. Anexo 2: Tabela 8 - Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases
pela ténica de MALDI-TOF MS...............................................................................................178
xvii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APACHE - Acute Physiology and Chronic Health Evaluation
APBA - Ácido Aminofenil Borônico
BRCAST - Comitê Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
CARB - White House National Strategy for Combating Antibiotic Resistant Bacteria
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamases
CLSI - Clinical Laboratory Standard Institute
DPA - Ácido Dipicolínico
EARS-Net - European Antimicrobial Resistance Surveillance Network
ECDC - European Centrer for Disease Prevention and Control
EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid
ESβL - Extended-Spectrum β-Lactamases
EUA - Estados Unidos da America
EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
HCCA - Ácido α-Ciano-4-Hidroxicinâmico
ICSP - International Committee on Systematics of Prokaryotes
ICS - Infecção de Corrente Sanguínea
IRAs - Infecção Relacionada à Assistência à Saúde
IS - Insertion Sequence
KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase
LPS - Lipopolissacarídeos
xviii
MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight - Mass
Spectrometry
MβL - Metalo-β-Lactamases
MDR - Multirresistentes
MHT - Modified Hodge Test
MRSA - S. aureus resistente à meticilina
MSSA - S. aureus sensível à meticilina
NCBI - National Center for Biotechnology Information
NHSN - National Healthcare Safety Network
OMS - Organização Mundial da Saúde
OMPs - Proteínas de membrana externa
PAV - Pneumonia associada à ventilação mecânica
PCA - Análise dos Componentes Principais
PCR - Polymerase Chain Reaction
SBI - Sociedade Brasileira de Infectologia
SBM - Sociedade Brasileira de Microbiologia
SBPC/ML - Sociedade Brasileira de Patologia Clínica / Medicina Laboratorial
SCIHs - Serviços de Controle de Infecção Hospitalar
SCoN - Staphylococcus coagulase negativa
STs - Sequences Types
TSB - Caldo tríptico de soja
UTIs - Unidades de Terapia Intensiva
VRE - Enterococcus spp. resistentes à vancomicina
WHO - World Health Organization
xix
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de
bactérias diretamente do frasco de hemocultura.................................................................................... 20
Tabela 2. Característica dos estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados bacterianos
brasileiros............................................................................................................................................... 30
Tabela 3. Classificação das β-lactamases adaptada de Bush & Jacoby (2010).................................... 42
Tabela 4. Características das principais carbapenemases reportadas………...................................... 46
Tabela 5. Pontos de corte utilizados para triagem e para classificação da sensibiliade de
enterobactérias recomendados pelo EUCAST e CLSI...............................……………..….........…........ 63
Tabela 6. Characterization of the 73 clinical isolates and performance of carbapenemase detection
by different methodologies (Table 1 - Artigo Científico 1)………………................................................. 88
Tabela 7. Carbapenem susceptibility profile and time in days for detection of carbapenemaseproducing isolates by MALDI-TOF MS (Table 1 - Artigo Científico 2)………………............................... 107
Tabela 8. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of
carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Table 1 - Artigo Científico 3)……................................ 114
Tabela 9. Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de
MALDI-TOF MS.................................................................................………………............................... 178
xx
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS............................................................................ 10
Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para diferentes espécies
bacterianas............................................................................................................................................. 14
Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de micro-organismos
no laboratório de microbiologia clínica................................................................................................... 23
Figura 4. (A) The hydrolysis of ETP mediated by β-lactamases occurring in two steps. (B) Analysis
of ETP degradation by MALDI-TOF MS (Figure 1 - Artigo Científico 1)................................................ 90
Figura 5. Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS from carbapenemase-producing isolate
and non-carbapenemase-producing isolate (Figure 1 - Artigo Científico 2)..…………….………..........
106
Figura 6. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of
carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Figure 1 - Artigo Científico 3)...................................... 114
xxi
RESUMO
A presente tese de doutorado objetivou a padronização e a aplicação do MALDI-TOF MS na
detecção de carbapenemases em bacilos Gram negativos. Inicialmente, realizamos a
padronização de um ensaio para detecção da atividade de diferentes carbapenemases pela
técnica de MALDI-TOF MS. Foram testados para esse estudo 73 isolados clínicos produtores e
não produtores de carbapenemase. O método foi comparado à LC-MS, ao MHT e à
espectrofotometria. O espectro de massa do ertapenem mostrou-se superior ao do imipenem e
ao do meropenem. A atividade de carbapenemase das classes A e B foi rapidamente detectada
pelo MALDI-TOF MS após 2 horas de incubação, enquanto uma extensão do período de
incubação foi necessária para a detecção das enzimas da classe D em isolados de A.
baumannii. Embora todos os resultados obtidos pelo MALDI-TOF MS tenham sido confirmados
pela LC-MS e pela espectrofotometria, o MHT detectou 55%, 100% e 68% das enzimas de
classes D, A e B testadas, respectivamente. No segundo estudo, padronizamos a técnica de
MALDI-TOF MS na detecção de carbapenemase diretamente de 100 frascos de hemocultura.
Adicionalmente, realizamos a rápida identificação dos micro-organismos causadores de infecção
de corrente sanguínea diretamente da hemocultura. O ensaio de carbapenemase no MALDI-TOF
MS identificou 21 (72,4%) dos 29 isolados produtores de carbapenemase, especialmente
aqueles produtores de KPC-2 (100%) e SPM-1 (100%), após um período de 4 horas de
incubação. Apesar da maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 não terem
sido identificados no primeiro dia, todos foram identificados como produtores de
carbapenemases quando testados diretamente da colônia bacteriana no dia seguinte. Após a
padronização da técnica de MALDI-TOF MS na detecção de diferentes carbapenemases direto
da colônia bacteriana e de hemoculturas, utilizando o equipamento da Bruker Daltonics,
decidimos avaliar então o desempenho do VITEK MS. Nesse terceiro estudo, 79 isolados de
bacilos Gram negativos produtores e não produtores de carbapenemases foram avaliados.
Taxas progressivas de detecção dos isolados produtores de carbapenemase foram observadas
de acordo com o período de incubação para todas as classes. A maioria dos isolados produtores
de KPC e MβL foi detectada após 1 hora de incubação. Entretanto, um período de 4 horas de
incubação foi necessário para excluir a atividade de carbapenemases entre amostras produtoras
de carbapenemases fracas, como as CHDLs em isolados de A. baumannii. A técnica de MALDITOF MS mostrou-se ser uma excelente ferramenta para a detecção de diferentes
carbapenemases. As principais vantagens encontradas são a rapidez e acurácia na detecção
das diferentes classes moleculares de carbapenemases, além da simplicidade de execução
tanto da colônia bacteriana quanto diretamente dos frascos de hemocultura.
xxii
ABSTRACT
Initialy, we standardize a protocol for detecting carbapenemase activity from different
carbapenemase-producing Gram-negative bacilli by MALDI-TOF M. A total of 73
carbapenemase- and non-carbapenemase-producing clinical isolates were studied. The method
was compared to LC-MS, MHT and spectrophotometric assays. Ertapenem mass spectrum was
easier to interpret than those of imipenem and meropenem. Class A and B carbapenemases
were rapidly detected by MALDI-TOF MS in a 2-h assay. However, an extended incubation time
was necessary for detection of class D carbapenemases in A. baumannii. Although, all MALDITOF MS results were confirmed by LC-MS and espectophotometric assay, MHT detected 55%,
100%, and 68% of classes D,A and B carbapenemases, respectively. In the second study, we
standardized the MALDI-TOF MS assay for detecting carbapenemase activity directly from 100
positive blood culture vials. Additionally, we performed a rapid identification of microorganism
causing bloodstream infections directly from blood cultures. The MALDI-TOF MS carbapenemase
assay identified 21 of 29 (72.4%) of the carbapenemase-producing isolates directly from blood
culture vials, especially those producing KPC-2 (100%) and SPM-1 (100%), after a 4 h incubation
period. Although the majority of OXA-23-producing A. baumannii isolates were not identified on
the first day, but all isolates were identified as carbapenemase producers directly from the
bacterial colony on the next day. After the standardization of the MALDI-TOF MS carbapenemase
protocol from both bacterial colony and directly from blood culture vials using the Bruker
Daltonics’ equipment, we evaluated the performance of the VITEK MS by applying the same
protocol. In the third study, a collection of 79 carbapenem-producing and 28 noncarbapenemase-producing Gram-negative clinical isolates were evaluated. Progressive detection
rates of carbapenemase-producing isolates were observed according to the extension of
incubation period for all classes. The majority of KPC and MβL-producing isolates were detected
by testing 1-h incubation period. However, a 4-h incubation period was necessary to exclude
carbapenemase activity in strains producing weak carbapenemases, like the CHDLs in A.
baumannii isolates. In conclusion, the MALDI-TOF MS showed to be an excellent tool for
identifying bacterial species and different types of carbapenemase. Its main advantages are its
simplicity, accuracy and speed in detecting different carbapenemases from both bacterial colony
and positive blood culture vials.
xxiii
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1
Introdução
As doenças infecciosas são uma das principais causas de mortalidade em todo o
mundo. Uma grande diversidade de micro-organismos, desde virais, bacterianos, parasitários e
fúngicos, são capazes de acometer indivíduos tanto no ambiente hospitalar quanto na
comunidade. Apesar da euforia proveniente do decréscimo das taxas de mortalidade
relacionadas às infecções bacterianas após a descoberta do primeiro antimicrobiano e da
imunização em larga escala, vivenciamos, atualmente, a angústia da escassez de agentes
eficazes contra uma progressiva gama de micro-organismos. Diversos fatores podem estar
relacionados a este fato. O uso indiscriminado de agentes antimicrobianos não apenas na prática
médica, mas igualmente na veterinária e, principalmente, na agricultura e na pecuária, seja,
talvez, um dos maiores responsáveis pela seleção natural e disseminação de bactérias
resistentes aos antimicrobianos (Cars et al., 2011).
A crescente observação da resistência aos antimicrobianos em isolados bacterianos é
um fato que tem recebido grande destaque não apenas na comunidade médica, mas também no
âmbito governamental, econômico e social. Em 2013, no Fórum Econômico Mundial de Davos a
resistência bacteriana foi descrita como um dos poblemas que pode por em risco a existëncia da
raca humana. Em abril de 2014, a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou um
documento que alerta sobre o risco da era pós-antibiótica, onde não haverá antimicrobianos
disponíveis para o tratamento de infecções causadas por bacterias mutirresistentes (WHO,
2014). Assim como, em 2013, o Center for Disease Control and Prevention (CDC) publicou um
documento classificando o risco das bactérias multirresistentes e alertando sobre as taxas de
mortalidade e dos custos relacionados às infecções causadas por bactérias multirresistentes.
Neste documento, é estimado que 23.000 mortes ocorram por ano nos Estados Unidos (EUA)
em consequência das infecções causadas por bactérias resistentes. Além disto, estas infecções
representam um custo adicional de $20 bilhões de dolares (CDC, 2013). Em ambas as
publicações, do CDC e da OMS, as bactérias Gram-negativas constituem ao menos metade dos
2
Introdução
agentes bacterianos citados como de urgente ou de grave ameaça à saúde pública. Destes,
ambos os documentos citam enterobactérias, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella não-typhi e Shigella spp., resistentes aos carbapenens, cefalosporinas de amplo
espectro e/ou fluoroquinolonas como uma grave ameaça. O CDC ainda inclui neste grupo os
isolados de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes (MDR).
O custo adicional relacionado às infecções causadas por bactérias multirresistentes ao
sistema de saúde está relacionado à necessidade da prescrição de antimicrobianos, que podem
ser mais tóxicos, menos efetivos e/ou mais onerosos. Além disso, mesmo quando há alternativa
terapêutica, a mortalidade de pacientes acometidos por infecções causadas por microorganismos resistentes a múltiplas classes de antimicrobianos é mais elevada, e aqueles
pacientes que sobrevivem experienciam maior tempo de internação, recuperação prolongada e
maior morbidade.
Diversas são as estratégias consideradas fundamentais para conter a resistência
antimicrobiana. Dentre elas podemos citar, nos âmbitos sócio-econômico e veterinário, a
proteção aos suprimentos alimentícios, o uso criterioso de antimicrobianos no agronegócio, na
pecuária e na prática veterinária e, no âmbito da medicina, tanto o uso racional de
antimicrobianos como o controle da disseminação pessoa-a-pessoa através da detecção, do
tratamento e da prevenção. O entendimento da dimensão da resistência antimicrobiana em
bactérias Gram-negativas no âmbito hospitalar, assim como dos mecanismos envolvidos na sua
disseminação, constitue o ponto de partida para estabelecer as estratégias de detecção, terapia
adequada e controle, sobre as quais versa este estudo.
Desde a descoberta do primeiro agente antimicrobiano da classe, os β-lactâmicos são a
terapia de escolha para diversas infecções devido às suas propriedades favoráveis como amplo
espectro de atividade, boa penetração tecidual e baixa toxicidade. As infecções graves causadas
por bactérias Gram-negativas eram frequentemente tratadas com cefalosporinas de amplo
3
Introdução
espectro, até o surgimento e disseminação de isolados produtores de β-lactamases de espectro
extendido, quando o uso de carbapenens aumentou significativamente. Consequentemente, o
surgimento e disseminação de carbapenemases nestes agentes restringiu o uso desta classe de
antimicrobianos na prática clínica.
Atualmente, devido ao constante aumento da resistência aos antimicrobianos em
isolados clínicos de P. aeruginosa, A. baumannii e enterobactérias em todo o mundo, estamos
ingressando a era pós-antibiótica, onde a falta de opções terapêuticas disponíveis para estes
patógenos tem limitado o tratamento das infecções causadas por bactérias MDR (Peleg &
Hooper, 2010). Sabe-se, ainda, que a resistência aos antimicrobianos e a terapia inadequada
são fatores associados à mortalidade em pacientes com infecção graves por estes patógenos
(Falagas et al., 2008). Nos casos de infecções graves, como a infecção de corrente sanguínea
(ICS), somente com o conhecimento do micro-organismo causador e do seu perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos, será possível a introdução precoce da terapia antimicrobiana
adequada, que representa a base para o sucesso clínico do tratamento destas infecções.
A produção de carbapenemases em bactérias Gram-negativas é o principal mecanismo
associado à resistência aos carbapenens. Porém, a diversidade de enzimas, assim como as
diferentes características cinéticas e distribuição geográfica heterogênea dificultam sua
detecção. Dessa forma, considerando que: (I) as bactérias Gram-negativas vêm aumentando
sua participação nas infecções nosocomiais, especialmente espécies de enterobactérias, P.
aeruginosa e Acinetobacter spp.; (II) as taxas de resistência aos antimicrobianos entre estes
isolados tem aumentado progressivamente. Apesar de múltiplos mecanismos de resistência
possam estar presentes, a produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência ao
principal grupo de antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções graves causadas
por estes agentes; (III) os carbapenens são os compostos mais potentes deste grupo e a
produção de carbapenemases pelas espécies de bactérias Gram-negativas acima descritas
4
Introdução
inviabiliza a utilização destes compostos como opção terapêutica em monoterapia; (IV) a
frequente localização em elementos genéticos móveis dos genes que codificam as
carbapenemases facilitam a disseminação destes fatores de resistência entre diferentes
espécies bacterianas; (V) os testes disponíveis até o momento para a detecção de
carbapenemases tem importantes limitações: (i) falta de rapidez para liberação dos resultados
dificultando a administração da terapia antimicrobiana adequada e instituição de medidas de
prevenção e controle de disseminação no ambiente hospitalar, (ii) flexibilidade para detecção de
todas as inúmeras enzimas deste grupo, (iii) acurácia na detecção dos tipos e variantes de
carbapenemases, (iv) baixo custo, para que possa ser realizados em diversos cenários
econômicos, e (v) simplicidade de execução.
A espectrometria de massa consiste em uma nova ferramenta para detecção da
atividade hidrolítica de carbapenemases através da vizualização da modificação da molécula do
antimicrobiano. Dessa forma, optamos, inicialmente, pela padronização da detecção de
carbapenemases pela espectrometria de massa (MS) utilizando a técnica de dessorção e
ionização a laser assistida por matriz em um tempo de vôo (MALDI-TOF) a partir da colônia
bacteriana, para, em seguida, prosseguir com a detecção diretamente de frascos de
hemocultura.
5
Revisão Bibliográfica
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica
A espectrometria de massa está revolucionando a microbiologia ao redor do mundo. A
identificação de micro-organismos que antes demoravam dias agora é realizada em minutos por
um sistema automatizado e de simples utilizacao. Historicamente, a utilização da espectrometria
de massa na microbiologia ganhou seu espaço quando a identificação de bactérias foi proposta
nos anos 70, por Anhalt e Fenselau (1975). Estes autores demonstraram que espécies
bacterianas poderiam ser discriminadas pela obtenção de espectros de massas após o
aquecimento das mesmas (Anhalt & Fenselaul, 1975). Entretanto, somente com a descoberta de
uma matriz capaz de ionizar macromoléculas de forma a não fragmentá-las através da absorção
eficiente da energia do laser, pelo engenheiro japonês Kioshi Tanaka, é que esta tecnologia
pôde ser aplicada para a identificação de micro-organismos (Tanaka et al., 1988). Este trabalho
rendeu-lhe, em 2002, o Prêmio Nobel de Química. Na mesma época, Karas e Hillenkamp (1988),
reportaram a dessorção e ionização suave (ou seja, sem fragmentação das proteínas) utilizando
um composto orgânico como matriz, denominando-a de MALDI - dessorção e ionização à laser
assistida por matriz (Karas & Hillenkamp, 1988).
Mesmo após este avanço, os primeiros experimentos para a identificação de bactérias
usando a técnica de MALDI-TOF MS iniciaram-se na década de 90. Alguns pesquisadores
apresentaram o método inicialmente utilizando a correlação de cada ion gerado com uma
proteina e esta com o organismo fonte, através de um banco de dados de proteínas disponível
na internet (Krishnamurthy & Ross, 1996; Demirev et al., 1999). O método, apesar de promissor,
necessitava de aperfeiçoamentos relacionados ao preparo da matriz, da reprodutibilidade dos
espectros de massas, da presença de contaminantes, e principalmente, da acurácia, robustez e
agilidade no banco de dados. Dessa forma, muitos anos se passaram antes que a tecnologia
pudesse ser disponibilizada, mesmo que somente na pesquisa em laboratórios de microbiologia.
Vários anos foram dedicados à implementação de um banco de dados robusto, acurado que
7
permitisse a agilidade da análise realizada pelo MALDI-TOF MS. Pesquisadores de diversas
instituições participaram do desafio de criar e comparar os perfis de massas dos microorganismos com bancos de dados contendo os espectros de referência através da criação de
diversos algoritmos (Fenselau & Demirev, 2001; Keys et al., 2004).
A aprovação nos órgãos regulamentadores e a comercialização do MALDI-TOF MS para
os laboratórios de microbiologia clínica ocorreu apenas recentemente. A lista de microorganismos do sistema MALDI Bioyper (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) aprovada pelo
Federal and Drug Administration (FDA) nos EUA, e pela ANVISA, no Brasil, está limitada apenas
às bactérias Gram-negativas, apesar de sua aplicação para a identificação de outros microorganismos estar disponível somente para fins de pesquisa. Este sistema permite a construção
personalizada de um banco de dados. O sistema VITEK® MS (bioMérieux, Marcy l'Etoile, França)
está aprovado pelo FDA e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para
identificação de bactérias aeróbias e anaeróbias, Gram-negativas e Gram positivas, além de
leveduras. Apesar de ambos os equipamentos serem compostos por um espectrômetro de
massa, por banco de dados e por um software, estes diferem de um equipamento para o outro.
O MALDI Biotyper é um equipamento de menor porte, de bancada, capaz de trabalhar em
sistema aberto ou fechado, utilizando o mesmo banco de dados denominado Biotyper system,
atualmente na versão 4.0. O VITEK MS é um equipamento instalado sobre o piso, e disponibiliza
dois sitemas de banco de dados, o Myla (IVD) e o Saramis (RUO), porém, estes foram
combinados recentemente no VITEK MS Plus. Algumas diferenças em relação ao manuseio dos
sistemas e amostras também ocorrem. O MALDI Biotyper analisa no máximo 96 amostras por
corrida e disponibiliza placas de metal reutilizáveis, já o VITEK MS analisa quatro placas
descartáveis de 48 amostras cada (172 amostras em uma única corrida), porém, devem ser
analisadas de 16 em 16 ou os spots remanescentes serão inutilizados (Patel, 2013).
8
2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS
Na técnica de MALDI-TOF MS, um composto, chamado de matriz, é utilizado para auxiliar
na dessorção e isonização das partículas de micro-organismos através da energia do laser. Este
se caracteriza por um laser de N2 de comprimento de onda de 336 nm, frequência de 60 Hz e
tempo de vida de milhões de disparos. A função da matriz é diluir a amostra e absorver a energia
do laser, promovendo assim a suave ionização das suas moléculas (Marvin et al., 2003).
Inúmeras matrizes estão disponíveis, e a escolha da matriz adequada para cada amostra é
fundamental para o sucesso da análise (Santos et al., 2010). Estas são compostas de derivados
de ácido cinâmico ou benzóico, diluídos em um solvente orgânico e água, ou ainda em ácido
trifluoracético. A matriz adequada permite a obtenção de espectros com melhor qualidade, pela
ótima razão entre sinal e ruído e picos estreitos, favorecendo a análise final do espectro de
massas (Santos et al., 2010).
As partículas de micro-organismos e da matriz, através da incidência do laser,
desprendem-se da superfície onde se encontram (Figura 1). A maioria da energia é absorvida
pelas moléculas da matriz, convertendo-as para um estado ionizado. Através de colisões
aleatórias, na fase gasosa, a carga elétrica é transferida da matriz para as moléculas da
amostra. Estas são aceleradas, baseadas na sua relação de massa e carga para um tubo de
vácuo, o analizador de massas (TOF; tempo de vôo) (Fenselau & Demirev, 2001). Os íons
migram pelo campo elétrico até alcançarem o detector, com velocidades inversamente
proporcionais às suas massas. O espectro de massas é gerado, representanto o número de íons
que atingem o detector através do tempo. O analisador TOF determina a razão da massa
molecular pela carga (m/z) dos íons por meio da mensuração da velocidade destes, após a
calibração do instrumento com moléculas de pesos conhecidos (Santos et al., 2010). A
separação ocorre pela razão massa/carga, entretanto, a carga é praticamente única, sendo o
9
peso molecular a variável que efetivamente separa as moléculas (Patel, 2014). Todo este
processo ocorre de forma muito rápida, em menos de 1 minuto por amostra.
Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS. A placa-alvo é inserida na câmara do
espectômetro de massa. Os spots a serem analisados, são individualmente atingidos pelo feixe
de laser para dessorção e ionização das moléculas do micro-organismo e da matriz. A nuvem de
partículas ionizadas é acelerada em um analisador de massas (TOF), até atingir um detector. As
moléculas mais leves voam mais rapidamente, seguidas das de maior peso molecular. Adaptado
de Patel (2014).
As proteínas ribossomais são muito abundantes nos micro-organismos e, portanto,
constituem os principais componentes de avaliação pelo espectro de massa. Com base no perfil
das proteínas ribossomais, que variam de 2 a 20 kDa, que é único para cada espécie de microorganismo, o espectro de massa obtido é comparado a um banco de espectros de referência
como um todo. O micro-organismo com espectro de massa mais relacionado é identificado e a
medida da confiança desta análise é indicada por um valor, que difere de um sistema para outro
10
(Murray, 2010; Emonet et al., 2010). A identificação em espécie e gênero é avaliada com base
nestes valores de confiança.
Os principais fatores que influenciam a qualidade da identificação de micro-organismos
pela espectrometria de massa são a pureza das cepas a serem identificadas, a quantidade de
material biologico disponível para análise e a experiência do microbiologista. A interpretação e
validação dos resultados requerem sempre a avaliação de todos os resultados obtidos até
aquele momento, como as condições de crescimento do micro-organismo em meios de cultura e
as suas características morfológicas e tintoriais. A análise e a expertise do microbiologista são
fundamentais para a acurácia do diagóstico etiológico.
O sistema Bruker fornece valores entre 0 e 3,000, baseando-se na presença ou na
ausência de picos no espectro de massa e adota critérios para a identificação em espécie e
gênero, correspondentes a superior a 2,000 e entre 1,700 e 1,999, respectivamente. Valores
inferiores a 1,700 indicam que a identificação do micro-organismo não é confiável. O sistema
VITEK MS realiza a identificação baseando-se na similaridade do espectro do micro-organismo
testado com aquele de referência no banco de dado, e àquele denominado de superespectro,
que representa o espectro de picos conservados derivados de múltiplos isolados de uma espécie
ou grupo em particular. O valor atribuído relaciona-se à especificidade destes para a espécie ou
gênero em questão. Estes valores de confiança variam de 0 a 100% (Patel, 2014).
2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos
Há exatamente cinco anos, foi publicado o primeiro estudo que avaliou a acurácia da
espectrometria de massa pela técnica de MALDI-TOF MS com a finalidade de identificação de
isolados bacterianos, aeróbios e anaeróbios, provenientes de amostras clínicas (Seng et al.,
2009). Neste estudo, dos 1.660 isolados bacterianos, 95,4% foram identificados corretamente
pelo MALDI-TOF MS e demonstraram que a acurácia na identificação bacteriana pela
11
espectrometria de massa se correlacionou diretamente ao número de espectros de massas
daquela espécie incluído no banco de dados.
Diversos estudos se seguiram, demonstrando a utilidade desta metodologia na prática
diária dos laboratórios de microbiologia. Entretanto, algumas espécies são muito relacionadas
entre si e apresentam um pequeno número de picos que podem ser utilizados para distinguí-las,
como Streptococcus pneumoniae do grupo Streptococcus mitis. Neste caso, o sistema VITEK
MS (IVD) demonstrou superioridade, pois pelo sistema Biotyper apesar dos isolados de S.
pneumoniae serem identificados corretamente, os isolados de S. mitis/oralis podem ser
erroneamente identificados como S. pneumoniae (Martiny et al., 2012). Entretanto, alguns microorganismos são extremamente relacionados e nenhum dos algoritmos propostos, até o
momento, é capaz de diferenciá-los, como E. coli e Shigella spp. (Patel, 2014). Porém, ambos os
sistemas apresentam uma nota referente a esta limitação quando estas bactérias são
identificadas.
O procedimento para a identificação requer apenas que se transfira a colônia bacteriana,
após crescimento em placa de ágar, para o spot da placa de MALDI-TOF MS com a ajuda de um
palito ou alça bacteriológica. Adiciona-se 1 µL da matriz, para a identificação bacteriana, utilizase, preferencialmente, o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) dissolvido em 50% de
acetonitrila e 2,5% de ácido trifluoroacético. Em seguida o material é deixado à temperatura
ambiente até que o material fique completamente seco. A placa deve ser inserida no
equipamento para análise. Com o objetivo de se melhorar a qualidade do espectro obtido, a
extração de proteínas pode ser realizada através de um procedimento utilizando-se ácido
fórmico e acetonitrila, ou apenas com a adição de 1 µL de ácido fórmico a 70% sobre a colônia
do micro-organismo na placa de MALDI-TOF MS, auxiliando a ruptura celular. Entretanto, na
rotina laboratorial, este procedimento torna-se trabalhoso. Recomenda-se, então, que para
facilitar o fluxo de trabalho, a análise inicial de bactérias e leveduras seja realizada diretamente
12
da colônia do micro-organismo, com ou sem adição do ácido fórmico e, para aquelas nas quais o
resultado obtido não for satisfatório, a extração proteica poderá ser realizada (Patel, 2014).
2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas
O sistema de MALDI-TOF MS apresenta um excelente desempenho para a identificação
de bactérias aeróbicas (Figura 2). Utilizando o sistema da Bruker, Patel (2013) observou 93% e
82% de identificações corretas em gênero e espécie, respectivamente, quando avaliou 440
isolados bacterianos de bacilos Gram-negativos usuais e não-usuais. Estas taxas foram
superiores àquelas observadas para os métodos de identificação convencionais (Patel, 2013).
No mesmo estudo, Patel avaliou 217 isolados de cocos Gram positivos encontrando 98% de
identificação correta para o gênero e 79% para espécie. As maiores dificuldades relatadas estão
na diferenciação de espécies de Streptococcus, especialmente S. pneumoniae, grupo S. mitis e
grupo S. viridans, como dito anteriormente (Martiny et al., 2012; McElvania Tekippe et al., 2013).
Lau e colaboradores (2014) obtiveram 75% de identificação correta em gênero para 67
micro-organismos de difícil identificação, como Granulicatella adiacens, Micrococcus luteus,
Nocardia spp., Pantoea dispersa, Actinomyces spp., entre outros (Lau et al., 2014). Alatoom e
colaboradores (2012) mostraram que os bacilos Gram positivos também poderiam ser
identifcados por esta metodologia, já que observaram 85% de concordância em gênero ao
avaliarem 190 isolados (Alatoom et al., 2012). Entretanto, a identificação de bacilos Gram
positivos, geralmente, apresenta taxas de concordância inferiores àquelas apresentadas para
cocos Gram positivos e bacilos Gram-negativos. Bizzini e colaboradores (2010) observaram uma
concordância de 88,6% para os 1 371 micro-organismos testados, sendo que quando
estratificados mostrou 92,2% de resultados corretos para bacilos Gram-negativos, 99,2% para
cocos Gram positivos, porém, apenas 84,6% para bacilos Gram positivos (Bizzini et al., 2010).
13
Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para as diferentes espécies
bacterianas. Adapatado de Liu e colaboradores (2007).
Os estudos que avaliaram o sistema VITEK MS obtiveram resultados semelhantes,
incluindo bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fastidiosas (91-97% de identificação em
gênero e 78% a 96% em espécie). No estudo de Richter e colaboradores (2013), este sistema
identificou corretamente 97% e 84% das enterobactérias testadas em gênero e espécie,
respectivamente (Richter et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012) avaliaram o desempenho
dos dois sistemas e respectivos bancos de dados. Estes apresentaram resultados bastante
similares (93%) para a identificação de bactérias usualmente encontradas na rotina laboratorial,
exceto quando o banco de dados Saramis foi utilizado (83,8%) (Martiny et al., 2012). Em nossa
experiência, o sistema VITEK MS apresentou 98% e 92% de concordância em gênero e
14
espécies, quando 119 isolados bacterianos comumente encontrados no laboratório de
microbiologia foram avaliados, diretamente da colônica bacteriana. Dentre estes a concordância
em gênero e espécie foi de 97% e 86% para os 59 cocos Gram positivos, e de 100% e 98%,
respectivamente, para 60 bacilos Gram-negativos (dados não publicados).
2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas
A espectrometria de massa tornou-se o método de escolha para a identificação de
bactérias anaeróbicas. Barreau e colaboradores (2013) avaliaram uma coleção de 1 325
bactérias anaeróbicas e alcançaram 100% e 93% de correta identificação direto da colônia em
gênero e espécie, respectivamente, utilizando o sistema Biotyper (v. 3.0) (Barreau et al., 2013).
Jamal e colaboradores (2013b) reportaram 89% e 100% de identificação entre 274 bactérias
anaeróbicas usando os sistemas Biotyper e VITEK MS, respectivamente (Jamal et al., 2013b).
2.1.2.3. Identificação de Micobactérias
A identificação de micobactéria é um grande desafio para o laboratório de microbiologia, e
apesar de algumas limitações, o MALDI-TOF MS é uma técnica mais rápida, de menor custo, e
mais fácil que as técnicas atualmente empregadas (testes bioquímicos e moleculares). As
espécies de micobactérias exigem, além da inativação prévia, um procedimento de extração
mais elaborado. A inativação pode ser realizada com o calor ou com exposição ao etanol,
seguida de um processo de ruptura mecânica, com auxílio de pérolas de vidro, e extração
proteica com ácido fórmico e acetonitrila, uma vez que sua parede é constituida por uma camada
de ácidos graxos que impede sua ruptura apenas com a incidência do laser (Balada-Llasat et al.,
2013; Dunne et al., 2014). Em seu estudo, Balada-Llasat e colaboradores (2013) testaram 178
isolados de micobactérias, cultivados em meios sólido e líquido, utilizando-se o calor para
inativação, seguido de tratamento com etanol e lise mecânica, como recomendado pela Bruker.
15
Os autores observaram 98% e 94% de correta identificação em gênero e espécie,
respectivamente (Balada-Llasat et al., 2013). Dunne e colaboradores (2014) demonstraram boa
efetividade na inativação de isolados de Mycobacterium spp. utilizando a lise mecânica por
cinco minutos na presença de etanol 70%, seguida de um período adicional de inativação por
dez minutos (Dunne et al., 2014). Da mesma forma, Mather e colaboradores (2014) avaliaram
198 isolados clínicos utilizaram a lise mecânica com auxílio do vórtex e pérolas de silica na
presença de etanol para inativação das amostras. Com o aprimoramento do banco de dados do
sistema Biotyper (v. 2.0) com 123 espectros de cepas clínicas, foi observada uma concordância
de 95% das espécies de Mycobacterium por este sistema e 94% utilizando-se o sistema VITEK
MS (Saramis) (Mather et al., 2014). Os bancos de dados dos sistemas VITEK MS e Biotyper têm
sido atualizados principalmente com o aumento no número e variedade de espectros de
micobactérias, o que deve melhorar o desempenho desta metodologia no futuro. A condição e
tempo de crescimento das colônias de micobactérias também podem influenciar a qualidade dos
espectros obtidos. Lotz e colaboradores (2010) observaram que quando cultivada em meio
sólido (Löwenstein-Jensen), o extrato proteico obtido apresentava qualidade supeiror no
espectro de massas do que quando as amostras eram cultivadas em meio líquido,
consequentemente a identificação correta foi obtida para 97% e 77% dos isolados cultivados em
meio sólido e líquido, respectivamente (Lotz et al., 2010).
2.1.2.4. Identificação de Fungos
A identificação de leveduras pelo MALDI-TOF MS apresenta bons resultados, sendo uma
ótima alternativa aos métodos manuais, trabalhosos e demorados ou aos métodos
automatizados e painéis comerciais, que são mais honerosos. Entretanto, há diferenças de
desempenho quando avaliamos os sistemas disponíveis. O sistema VITEK MS apresenta
excelentes resultados (97-95%), apenas com a transferência da colônia associada ao ácido
16
fórmico na própria placa do MALDI-TOF MS (Westblade et al., 2013; Pence et al., 2014;
Hamprecht et al., 2014). Entretanto, o sistema da Bruker somente apresenta bons resultados
(90%), quando a análise é precedida de extração proteica, utilizando-se ácido fórmico e
acetonitrila. Esse sistema alcançou 100% quando o sistema Biotyper (v. 3.0) foi adicionado à
construção de um banco de dados próprio (Mancini et al., 2013). Desta forma, o sistema Biotyper
requer melhorias no seu banco de dados em relação aos espectros de leveduras incluídos.
Corroborando com estes achados, De Carolis e colaboradores (2014) demonstraram
excelente desempenho (96% de 4232 leveduras) quando, além do desenvolvimento do seu
próprio banco de espectros com 156 cepas referências de leveduras, os autores realizaram um
rápido procedimento de extração, analisando o sobrenadante da combinação de uma colônia
com 50 µL de ácido fórmico a 10%, após homogenização vigorosa com auxílio de um vórtex (De
Carolis et al., 2014). Santos e colaboradores (2011) avaliaram 67 isolados de leveduras,
intimamente relacionadas, como Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis; C.
albicans e C. dubliniensis; e C. glabrata e C. bracarensis, que somente podem ser discriminadas
entre si através de técnicas moleculares. Apesar de algumas espécies não apresentarem
espectros no banco de dados Saramis, quando os mesmos foram inseridos, o MALDI-TOF MS
foi capaz de identificar e distinguir todas as espécies, mostrando-se uma excelente ferramenta
para identificação de leveduras (Santos et al., 2011). Em nossa experiência com o sistema
VITEK MS para identificação direta da colônia de 66 leveduras, incluindo Trichosporon asahii,
Kodamaceri ohmeri e diversas espécies emergentes de Candida, obtivemos 92% e 84% de
concordância em gênero e espécies com o sistema API ID32, respectivamente (Mota et al.,
2014).
Embora a identificação de fungos filamentosos possa ser realizada pela plataforma de
MALDI-TOF MS, cuidados devem ser tomados para evitar que meios de cultura possam
favorecer a mutagênese ou a presença de inibidores que alterem o perfil proteico, e levem,
17
consequentemente, às alterações nas análises pelo MALDI-TOF MS (Santos et al., 2010). Outro
desafio é a aquisição das proteínas totais e em qual momento do crescimento fúngico a extração
proteica deverá ser realizada de modo efetivo. Diferentes protocolos foram descritos na literatura
e bons resultados foram alcançados quando banco de dados apropriados foram combinados.
Isso demonstrou, que da mesma forma como ocorre para micobactérias, os sistemas atualmente
disponíveis requerem aprimoramento dos seus respectivos bancos de espectros para fungos
filamentosos (Lau et al., 2013; Schulthess et al., 2014).
2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura
O diagnóstico etiológico rápido de infecção de corrente sanguínea (ICS) e a introdução
precoce da terapia antimicrobiana são a base para o sucesso clínico desta grave infecção.
Atualmente, o procedimento mais utilizado para o diagnóstico etiológico de ICS requer a cultura
em meio líquido, continuamente monitorizada, seguida da pesquisa direta pela coloração de
GRAM e subcultivo para a realização de testes fenotípicos de identificação bacteriana,
automatizados, ou não, seguido do teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Este processo
geralmente necessita de 3 a 5 dias, retardando a adequação da terapia antimicrobiana. Algumas
limitações comprometem ainda mais o resultado deste processo como a baixa sensibilidade na
detecção de micro-organismos de difícil crescimento (Bizzini et al., 2011).
A redução no tempo de resposta dos resultados microbiológicos é muito desejada para
melhorar o desfecho clínco dos pacientes, otimizar o uso de antimicrobianos, e, reduzir custos
(Doern et al., 1994; Barenfanger et al., 1999). A comunicação da coloração de Gram é
considerada urgência para as boas práticas de microbiologia clínica, e mostrou-se de grande
valor para a adequação de terapia empírica (Munson et al., 2003). Barenfanger e colaboradores
(2008) reportaram uma redução significativa da mortalidade geral quando grupos pareados de
pacientes com ICS foram comparados em relação ao tempo de comunicação da coloração de
18
Gram. O grupo em que o Gram foi reportado em menos de 1 hora (tempo médio 0,1 hora) a
mortalidade foi de 10% enquanto que quando o Gram ultrapassou este tempo (média de 3,3
horas) a mortalidade elevou-se para 19% (Barenfanger et al., 2008). Portanto, há uma imensa
necessidade de testes que auxiliem na instituição da terapia antimicrobiana apropriada precoce.
Com este objetivo, diversos protocolos foram propostos para obter a identificação do microorganismo causador de ICS diretamente de frascos de hemocultura utilizando-se a técnica de
MALDI-TOF MS (Prod’hom et al., 2010; Martiny et al., 2012; Stevenson et al., 2010). A Tabela 1
sumariza alguns destes estudos.
19
Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de bactérias diretamente do frasco de hemocultura.
MALDI-TOF
MS
Extração
Volume
da HMC
N de passos e
soluções utilizadas
Análise
Critério
Método de
comparação
N°
Concordância
Erros
Microflex LT
"in house"
utilizando tubo
contendo gel
separador
8 mL
5 passos de lavagem e
centrifugação; solução
de lise NH4Cl, NaHCO3,
EDTA
Stevenson et al., 2010
Extração
proteica
A
Convencional
202
95%
Espécie: S. mitis;
complexo E. cloacae
Prod'hom et al., 2010
Microflex LT
"in house"
5 mL
de lise NH4Cl e KHCO3
Extração
proteica
B
Convencional
122
79%
Espécie: S. caprae; Não
identificou 21%
Kok et al., 2011
Microflex LT
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica
B
Convencional
476
75%
Espécie: S. mitis; P.
putida Não identificou:
23,7%
Vlek et al., 2012
Microflex LT
"in house"
5 mL
centrifugação
Extração
proteica
B
Convencional
89
56%
Não identificou: 39%
Microflex LT
"in house"
1 mL
centrifugação, solução
de lise Saponina 5%
Colônia
C
Convencional
59
BGN: 90%; CGP:
62%
Espécie: S. typhi; Não
identificou: 27%
C
Convencional
59
BGN: 68%; CGP:
73%
Espécie: S. typhi e S.
marcescens; Não
identificou: 29%
D
Sequenciamento
gene 16S rRNA
92
97%
Não identificou: 3,3%
Estudo
Martiny et al., 2012
Chen et al., 2013
Microflex LT
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica para
CGP e
Colônia para
BGN
Microflex LT
"in house" de
Martiny et al.,
2012
1 mL
de lise Saponina 5%
Extração
proteica
20
Vitek MS
"in house" de
Martiny et al.,
2012
1 mL
de lise Saponina 5%
Extração
proteica
E
Sequenciamento
gene 16S rRNA
92
88%
Microflex LT
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica
D
Sequenciamento
gene 16S rRNA
202
94%
Não identificou: 6,5%
Vitek MS
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica
E
Sequenciamento
gene 16S rRNA
202
88%
Lagacé-Wiens et al., 2012
Microflex LT
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica
B
Convencional
61
85%
Gênero: S. mitis, SCN;
Clerc et al., 2013
Microflex LT
"in house" de
Prod'hom et al.,
2010
5 mL
de lise NH4Cl e KHCO3
Extração
proteica
B
Convencional
165
87%
Modificou a terapia
empírica em 35% dos
casos
76%
Gênero: K. oxytoca;
Espécie: Salmonella
arizonae; A. baumannii,
Streptococcus e
Staphylococcus; Não
identificou: 5,6%
Jamal et al., 2013a
Microflex LT
Kit SepsiTyper
1 mL
centrifugação
Extração
proteica
B
Convencional e
Seq. 16S rRNA
160
Abreviaturas: HMC - Hemoculturas. Critérios adotados para identificação do micro-organismo: A. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,9: identificado em gênero;
≥ 1,9: identificado em espécie; B. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: gênero; ≥ 2: identificado em espécie; C. < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: identificado
em gênero; > 2: identificado em espécie. D. < 1,6: não identificado; 1,6-1,99: identificado em gênero; ≥ 2 : identificado em espécie; E. valor < 90%: não
identificado; 90 - 98%: identificado em gênero e >98%: identificado em espécie.
21
Em seu estudo, Clerc e colaboradores (2013) utilizaram o MALDI-TOF MS para
identificação de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura e avaliaram seu
impacto na adequação da terapia antimicrobiana mesmo após a comunicção da coloração de
Gram em um cenário de baixa prevalência de bactérias MDR (Clerc et al., 2013). A adequação
da terapia pelo resultado do MALDI-TOF MS foi realizada em 35% dos casos de bacteremia
apesar do resultado prévio da coloração de Gram. Vlek e colaboradores (2012) também
observaram um impacto significativo do resultado da identificação pelo MALDI-TOF MS
diretamente do frasco de hemocultura na modificação da terapia antimicrobiana de pacientes
com ICS (Vlek et al., 2012).
Apesar do benefício da identificação bacteriana precoce, o perfil de sensibilidade aos
antimicrobianos, especialmente para aqueles considerados determinantes para o tratamento de
infecções graves, como os carbapenens, é imprescindível para a adequação da terapia,
principalmente em regiões de alta prevalência de bactérias multirresistentes.
De maneira geral, a introdução da espectrometria de massa na microbiologia clínica
trouxe um grande avanço, tanto em termos de rapidez como de acurácia frente aos métodos
disponíveis até o momento (Figura 3). Pela primeira vez, o laboratório de microbiologia tem
disponível, em uma única plataforma, a possibilidade de identificar diferentes micro-organismos,
desde bactérias comumente isoladas na prática clínica, como bactérias fastidiosas ou de díficil
identificação, micobactérias, leveduras e fungos filamentosos. Adicionalmente, esta metodologia
tem sido aplicada com sucesso para a identificação de micro-organismos diretamente de
amostras clínicas, especificamente de frascos de hemoculturas.
22
Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de microorganismos no laboratório de microbiologia clínica. Adaptado de Carvalhaes e colaboradores
(2012).
Entretanto, aprimoramentos nos bancos de referência de espectros, assim como, em
metodologias e padronizações de extrações e análises são necessárias e devem ocorrer no
futuro próximo. Este sistema apresenta vantagens frente aos tradicionais sistemas de
identificação de micro-organismos, sendo essas: (i) facilidade de implantação; (ii) fácil manuseio
do equipamento e software; (iii) rapidez nos resultados; (iv) capacidade de identificação a partir
da colônia de bactérias e leveduras; assim como
diretamente de amostras clínicas,
especificamente hemocultura (v) a acurácia semelhante ou superior a dos métodos
automatizados; (vi) baixo consumo de reagentes; (vii) poucos resíduos; (viii) baixo custo por
amostra; e (ix) com uma aplicação potencial para aplicação em tipagem de micro-organismos e
na detecção de mecanismos de resistência.
23
2.1.3. A Espectrometria de Massa na Tipagem de Micro-organimos
O princípio pelo qual a espectrometria de massa pode ser aplicada para a discriminação
de isolados pentencentes a mesma espécie se baseia na observação de que espectros de
massas podem diferir em intensidade, perda ou mudança de um sinal (ou pico de massa/carga
no espectro). As variações na intensidade do sinal podem também ser causadas por diferenças
de expressão, que por sua vez podem ser diretamente correlacionadas com as condições de
crescimento, e, não necessariamente, em relação às diferenças genéticas dos microorganismos. A perda de um sinal é causada pela falha na expressão de uma proteína ou
peptídeo, que por sua vez pode indicar uma mutação, causando a interrupção da transcrição do
gene. Entretanto, a perda do sinal também pode ser consequente das condições de cultivo,
mutações em fatores regulatórios ou do preparo da amostra. Portanto, até o momento, não há
um critério claro de correlação entre a perda de um sinal e a discriminação de um microorganismo (Josten et al., 2013).
Entretanto, a mudança de um sinal, ou seja, a perda de um sinal associado à detecção de
um novo sinal, ambos correlacionados ao mesmo peptídeo, corresponde a mutações pontuais no
gene do peptídeo correspondente. Essa mutação leva à modificação do aminoácido na
sequência proteica, modificando o peso molecular desta (Josten et al., 2013). Estas diferenças
podem contribuir para a identificação de linhagens de um isolado diretamente da análise do
MALDI-TOF MS.
A utilização de ferramentas, como a análise dos componentes principais (PCA) e
estruturação de dendogramas, auxilia na discriminação dos espectros, entretanto é muito
trabalhosa. Menacci e colaboradores (2013) utilizaram-se da PCA para discriminar isolados de A.
baumannii. Estes autores observaram boa correlação entre os achados desta técnica quando
comparados ao Rep-PCR (Menacci et al., 2013). Em seu estudo, Josten e colaboradores (2013)
identifacaram peptídeos presentes em cada linhagem de S. aureus. Estes peptídeos foram
24
capazes de correlacionar cepas clínicas de S. aureus às principais linhagens de S. aureus
conhecidas (Josten et al., 2013). Entretanto, Lasch e colaboradores (2014), utilizando as
mesmas ferramentas de análise, não obtiveram sucesso em diferenciar cepas de S. aureus e E.
faecium de acordo com seu perfil clonal (Lasch et al., 2014). Portanto, esta aplicação precisa ser
melhor avaliada antes de poder ser aplicada nos laboratórios de microbiologia.
2.1.4. A Espectrometria de Massa na Resistência aos Antimicrobianos
Visando a crescente demanda pela rápida informação quanto à sensibilidade de microorganismos aos agentes comumente utilizados para tratar infecções, diversas tentativas para
distinguir espectros de isolados bacterianos resistentes e sensíveis a determinados
antimicrobianos foram propostas. Considerando-se que o padrão de proteínas é um reflexo das
sequências gênicas que as codificam, diferenças são esperadas entre isolados sensíveis e
resistentes. Na tentativa de encontrar diferenças nos espectros foram realizados inicialmente
estudos com isolados de S. aureus resistentes (MRSA) e sensíveis (MSSA) à meticilina (EdwardJones et al., 2000). Apesar de obter sucesso na diferenciação destes isolados, esta técnica não
se mostrou reprodutível (Walker et al., 2002). Da mesma maneira, a detecção de isolados de
Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE) foi proposta, associada ao rastreamento
epidemiológico em um episódio de surto institucional, utilizando-se um modelo estatístico
baseado no espectro proteico bacteriano (Griffin et al., 2012). Os autores obtiveram 92% de
sensibilidade e 85% de especificidade na detecção de E. faecium carreador do gene vanB. Ao
incorporar este modelo na rotina laboratorial, os autores alcançaram resultados ainda melhores,
97% e 98% de sensibilidade e especificidade, respectivamente (Griffin et al., 2012). Entretanto, a
reprodutibilidade deste modelo não foi avaliada por outros grupos, o que poderia refletir apenas
em uma situação epidemiológica favorável e restrita à área geográfica avaliada (Kostrzewa et al.,
25
2013). Estes modelos assemelham-se ao acima descrito para tipagem de micro-organismos,
através da análise cuidadosa de seus espectros.
A possibilidade da detecção direta de peptídeos ou enzimas relacionadas à resistência
aos antimicrobianos também foi estudada. Entretanto, no caso da detecção direta de βlactamases, apesar de serem muito ativas, estas enzimas são produzidas em pequenas
quantidades. Além disso, seu peso molecular é semelhante a diversas outras proteínas
bacterianas e existem centenas de diferentes tipos de β-lactamases com pesos moleculares
similares. Até o presente momento, o modelo que melhor se estabeleceu para a detecção da
resistência aos β-lactâmicos mediada por β-lactamases, consiste em um ensaio funcional. Neste
modelo não é a bactéria que é analisada pela espectrometria de massa, mas sim, as moléculas
dos compostos β-lactâmicos. A detecção da modificação das moléculas destes compostos frente
aos fatores enzimáticos produzidos pelos micro-organismos é atualmente o método mais
próximo de ser aplicado à rotina laboratorial. Este método será melhor descrito no item 2.5.5.3.
Um interessante modelo para a detecção de resistência aos antimicrobianos pela técnica
de MALDI-TOF MS, é a utilização de nutrientes marcados com isótopos estáveis no meio de
cultura. Comparando-se o espectro obtido de um isolado após crescimento de três horas em
meio líquido, com ou sem a marcação isotópica adicionada de um antimicrobiano, é possível
diferenciar o isolado resistente, pois este ao se multiplicar incorpora os isótopos marcados que
desviam os picos de massa quando comparados ao perfil dos isolados em meio sem marcação
(Demirev et al., 2013). Acredita-se que tal método possa ser aplicado a diferentes
antimicrobianos e para rapidamente identificar as bactérias resistentes, com a construção de um
banco de espectros de referência e automação de sua interpretação. Um possível fator limitante
desta metodologia seria o custo de tais meios.
Recentemente, Lau e colaboradores (2014) demonstraram a possibilidade de rastrear a
presença do plasmidio pKpQIL, carreador do gene blaKPC, pela identificação de um pico de
26
~11.109 Da no espectro de massa correspondente a um produto clivado de uma proteina
codificada pelo plasmídio pKpQIL. Através desta determinação, a presença do gene blaKPC
poderia ser inferido prospectivamente nos isolados identificados pelo MALDI-TOF MS, através
da presença ou ausência deste pico no espectro de massa (Lau et al., 2014). Apesar da
detecção de um fator único de resistência, esta abordagem poderia ser interessante na vigência
de um surto. Entretanto, resultados falso-positivos e falso-negativos poderiam ocorrer caso o
palsmídio pKpQIL perdesse o gene blaKPC ou se a proteína detectada (~11.109 Da) sofresse
alguma mutação ou interrupção de sua expressão, respectivamente.
2.2. Epidemiologia das Bactérias Gram-negativas no Ambiente Hospitalar
Enterobactérias, P. aeruginosa e A. baumannii são as mais frequentes bactérias Gramnegativas causadoras de infecção hospitalar em todo o mundo. As enterobactérias são
habitantes do trato gastrointestinal de seres humanos e animais, podendo também colonizar a
pele, a orofaringe e as vias aéreas superiores, vivendo em estreita relação com o hospedeiro,
porém, podem se tornar patogênicas, causando infecções graves. P. aeruginosa tem seu habitat
natural em ambientes úmidos, e assim como A. baumannii, possui grande potencial para se
estabelecer em soluções utilizadas nos cuidados médicos, como desinfetantes, fluídos de
irrigação ou de diálise, além de equipamentos de terapia respiratória e inaladores. A. baumannii
possui ainda a capacidade de persistir por longos períodos em ambientes secos (Paterson,
2006). Estas características, associadas à capacidade de aquisição de resistência aos
antimicrobianos, permitem que estes micro-organismos permaneçam no ambiente hospitalar.
Estes patógenos podem ser facilmente transmitidos de paciente para paciente por meio dos
profissionais de saúde, sendo frequente a ocorrência de surtos hospitalares por disseminação de
clones. Estudos de vigilância reportam Acinetobacter spp. como um dos patógenos mais
frequentes entre isolados causadores de infecção relacionada à assistência à saúde (IRAs) na
27
América Latina, Europa e EUA (Gales et al., 2012; Sader, 2014; Sievert et al., 2013; Tabah et al.,
2012). No Brasil, segundo dados da ANVISA, este patógeno foi o quarto patógeno mais
frequentemente isolado de infecção de corrente sanguínea (Tabela 2).
Em sua última publicação, a National Healthcare Safety Network (NHSN) do CDC,
mostrou que entre 2009-2010, P. aeruginosa (16,6%), Klebsiella spp. (10,1%), Enterobacter spp.
(8,6%), e A. baumannii (6,6%) foram responsáveis por 42% dos episódios de pneumonias
associadas à ventilação mecânica (PAV), sendo menos frequente apenas que S. aureus (24,1%)
(Sievert et al., 2013). Gales e colaboradores (2012) reportaram dados semelhantes, em um
estudo de vigilância realizado entre os anos de 2008 e 2010, onde os principais patógenos
relacionados à etiologia de pneumonias na América Latina foram P. aeruginosa (31,2%), S.
aureus (20%), Acinetobacter spp. (17,7%), Klebsiella spp. (10,2%) e Enterobacter spp. (5,1%)
(Gales et al., 2012). Entretanto, diferenças podem ser observadas na epidemiologia das ICS
entre as localidades dos estudos. Enquanto segundo o NHSN-CDC, nos EUA, os quatro
primeiros micro-organismos foram cocos Gram positivos, na América Latina, E. coli (19%) e
Klebsiella spp. (12,3%), foram encontrados nas segunda e terceira posições. P. aeruginosa e
Acinetobacter spp. foram responsáveis por 7,5% e 7,2% das ICS na América Latina, ocupando a
quinta e sexta posições, respectivamente (Gales et al., 2012).
Poucos são os estudos de vigilância exclusivos ou que incluem isolados bacterianos
brasileiros. Dentre eles, podemos citar o programa de vigilância SENTRY, o SCOPE-Brasil e,
mais recentemente, o Programa Nacional de Monitoramento da Resistência Bacteriana no Brasil
realizado pela ANVISA (Marra et al., 2011; ANVISA, 2014). As diferenças metodológicas
empregadas por cada um destes estudos podem interferir em seus resultados e devem ser
levadas em consideração. O programa SENTRY, desde 1997, monitora os patógenos mais
prevalentes e seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos em diversos países, incluindo
quatro centros hospitalares do Brasil desde 1997. Este programa baseado em dados de
28
vigilância laboratoriais contempla patógenos isolados de ICS, infecções respiratórias e infecções
de pele e partes moles (Gales et al., 2012). O estudo SCOPE-Brasil foi realizado entre os anos
de 2007 e 2010, considerando apenas isolados de ICS e baseando-se em critérios
epidemiológicos. Dezesseis centros hospitalares distribuídos em oito Estados brasileiros fizeram
parte do estudo (Marra et al., 2011). De maneira semelhante a ANVISA iniciou em 2005 um
programa de vigilância de isolados bacterianos de ICS, exclusivamente de unidades de terapia
intensiva (UTIs), baseado em critérios epidemiológicos, porém, abrangendo os 27 estados
brasileiros (ANVISA, 2014) (Tabela 2).
29
Tabela 2. Característica dos estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados
bacterianos brasileiros.
SENTRY
Brazilian SCOPE
Programa Nacional ANVISA
Gales et al., 2012
Marra et al., 2011
ANVISA, 2014
Período
2005-2008
Jun/2007- Mar/2010
Jan a Dez/2012
Foco
Laboratórial
Epidemiológico
Epidemiológico
20 primeiros isolados
consecutivos do mês
ICS
ICS em UTI
Estudo de Vigilância
Referência
Critério
1 único isolado por paciente
Número de centros
médicos
Estados participantes
Número total de isolados
4
16
908
4
3 807
8
2 447
27
19 009
10 principais patógenos
S. aureus
SCoN
Klebsiella spp.
E. coli
Acinetobacter spp.
P. aeruginosa
Enterobacter spp.
Candida spp.
Enterococcus spp.
Serratia spp.
S. maltophilia
Proteus spp.
(%)
20,2
14,5
12,1
12
9,1
8,7
6,1
5
3,3
1,9
-
15,4
13,8
13,2
12,5
8,9
6,1
5,6
4,5
3,5
1,6
16,5
19,9
12,4
5,9
11,4
8,9
4,9
6,3
5,8
2,9
-
Em todos os estudos, as bactérias Gram-negativas foram responsáveis por
aproximadamente 50% dos isolados (46,4%-51,3%), distribuidos entre espécies de
enterobactérias, P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Dentre as espécies de enterobactérias,
destacam-se K. pneumoniae, terceiro agente mais frequente em todos os estudos, além de
Enterobacter spp., Serratia spp., E. coli e Proteus spp. (Tabela 2). Apesar das semelhanças dos
dados brasileiros em relação aos dez patógenos mais frequentemente encontrados na Europa e
30
nos EUA, nota-se uma variabilidade de prevalência regional. Biedenbach e colaboradores (2004)
observaram uma alta prevalência de E. coli em isolados de ICS na Europa, Enterococcus spp.
nos EUA e bactérias Gram-negativas entéricas e não entéricas na América Latina (Biedenbach
et al., 2004).
No Brasil, o estudo de vigilância SCOPE-Brasil, conduzido por Marra e colaboradores
(2011) durante os anos de 2007 e 2010, reportaram que 58,5% das ICS foram causadas por
micro-organismos Gram-negativos, porém, S. aureus (15,4%) e Staphylococcus coagulase
negativa (SCoN; 13,8%) foram os agentes mais isolados, seguidos de Klebsiella spp. (13,2%),
Acinetobacter spp. (12,5%), P. aeruginosa (8,9%) e Enterobacter spp. (6,1%) (Marra et al.,
2011). Neste estudo ainda, a mortalidade reportada entre estes pacientes foi muito elevada,
sendo de 31-32% entre os pacientes que apresentaram episódio de ICS por Staphylococcus
spp., de 30-52% entre aqueles com ICS por bactérias Gram-negativas e de 68% nos quais
Candida spp. foi responsável pela ICS.
2.2.1. Resistência aos Antimicrobianos β-lactâmicos em Bactérias Gram-negativas
Entre todos os micro-organismos Gram-negativos causadores de IRAs, aproximadamente
65% dos isolados de A. baumannii, 15% de Klebsiella spp. e 2% de E. coli foram considerados
multirresistentes (MDR - resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos testados) entre
2009-2010 nos EUA (Tacconelli et al., 2014). Na Europa, houve um aumento significativo nas
taxas de resistência aos antimicrobianos em isolados Gram-negativos. Em 2011, segundo o
European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) da European Center for
Disease Prevention and Control (ECDC), 36% dos isolados de E. coli foram resistentes às
cefalosporinas de amplo espectro. Esta taxa era 50% superior àquela relatada nos últimos quatro
anos. A resistência aos carbapenens também apresentou um aumento importante, se elevando
31
de 3,2% em 2009 para 6,2% em 2012. Em países como a Grécia e a Itália estas taxas chegaram
à 60,5% e 28,8%, respectivamente (ECDC, 2012).
No Brasil, Marra e colaboradores (2011), observaram que, em isolados de ICS entre os
anos 2007 e 2010, as taxas de resistência às cefalosporinas de amplo espectro em Klebsiella
spp. foram muito elevadas (54,4% e 50,2%, respectivamente) (Marra et al., 2011). Estes
achados foram corroborados pelo relatório do programa SENTRY, onde Gales e colaboradores
(2012) reportaram o fenótipo de resistência às cefalosporinas de amplo espectro em 50% dos
isolados de Klebsiella spp. no Brasil, assim como em outros países da América Latina, Argentina
(60%) e Chile (59%) (Gales et al., 2012). Portanto, o uso de antimicrobianos da classe dos
carbapenens é elevado nestes países, tanto na terapia empirica como no tratamento definitivo de
infecções graves causadas por bactérias Gram-negativas. Consequentemente, somos
testemunhas do aumento assustador das taxas de resistência destes micro-organismos aos
carbapenens. Apesar de em seu estudo, Marra e colaboradores (2011) observarem que apenas
0,3% dos isolados de Klebsiella spp. foram resistentes a imipenem, Gales e colaboradores
(2012) reportaram taxas muito mais elevadas (Marra et al., 2011; Gales et al., 2012). Entre os
anos de 1997-1999, o programa SENTRY reportou que 0,5% dos isolados de Klebsiella eram
resistentes aos carbapenens no Brasil, porém, esta taxa elevou-se para 1,7% entre 2003-2005, e
para 8,6% entre 2008-2010 (Gales et al., 2012). As diferenças nas taxas reportadas por estes
estudos podem estar relacionadas aos desenhos dos estudos. O estudo de Marra e
colaboradores (2011) incluiram 16 centros brasileiros, e isolados apenas de ICS em UTIs,
enquanto que o programa SENTRY inclui dados dos 20 primeiros e consecutivos isolados
bacterianos mensalmente de apenas quatro centros brasileiros. Recentemente, a ANVISA
reportou, pela primeira vez, um relatório epidemiológico com dados de ICS primária confirmadas
laboratorialmente obtidos de todos os 27 estados brasileiros. Foram 908 centros médicos que
enviaram dados coletados no ano de 2012 (ANVISA, 2014). Neste boletim, os isolados de
32
Klebsiella spp. resistentes às cefalosporinas de amplo espectro atingiu 32,5% de todos os
isolados de Klebsiella spp., sendo que 16,1% destes foram resistentes aos carbapenens.
A resistência aos antimicrobianos entre os isolados de P. aeruginosa são ainda piores.
No relatório do CDC, 26,1% das ICS adquiridas no ambiente hospitalar causadas por P.
aeruginosa foram resistentes aos carbapenens, e 15,4% por isolados apresentando fenótipo
MDR (CDC, 2013; Sievert et al., 2013). Na Europa, 17,1% dos isolados de P. aeruginosa
provenientes de infecções invasivas foram resistentes aos carbapenens e 13,8% foram MDR
(ECDC, 2012). No Brasil, segundo o estudo SCOPE-Brasil (2007 a 2010), 35,8% dos isolados de
P. aeruginosa provenientes de ICS foram resistentes à imipenem, corroborando com os dados
reportados recentemente pelo boletim da ANVISA, onde esta taxa foi de 36,9% em 2012, e pelo
programa de vigilância SENTRY, onde 42,1% dos isolados de P. aeruginosa foram resistentes
aos carbapenens, entre os anos de 2008 e 2010 (Marra et al., 2011; Gales et al., 2012; ANVISA,
2014).
A. baumannii, apesar de isolado em menor frequencia que P. aeruginosa e Klebsiella
spp., apresenta taxas de resistência ainda mais elevadas aos carbapenens. Nos EUA, Sievert e
colaboradores (2013) reportaram que 62,6% das amostras de A. baumannii provenientes de ICS
adquirida no ambiente hospitalar apresentavam resistência aos carbapenens. Na Europa, o
relatório do ECDC mostrou 51% de MDR entre os isolados de Acinetobacter spp. provenientes
de infecções invasivas. Semelhante ao reportado por Marra e colaboradores (2011), no estudo
SCOPE-Brasil, onde 56% dos isolados de A. baumannii foram resistentes aos carbapenens
(Marra et al., 2011). Assim como em outros países da América Latina, o programa SENTRY,
reportou importante elevação das taxas de resistência aos carbapenens no Brasil, de 16,3% em
2003-2005, para 71,4% em 2008-2010. Na Argentina este aumento foi de 58,6% para 84,9% e
no Chile de 6,2% para 50%, nos mesmos períodos avaliados (Gales et al., 2012). Segundo o
boletim da ANVISA, incluindo todos os estados brasileiros, a taxa reportada de isolados de
33
Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens foi de 38,8% (ANVISA, 2014). A diferença entre
as taxas de resistência reportadas pelo boletim da ANVISA pode ser explicada pela diversidade
geográfica de um país com dimensões continentais como o Brasil, assim como pelo fato deste
programa ser baseado em dados epidemiológicos, não havendo padronização da metodologia
utilizada para os testes de sensibilidade aos antimicrobianos.
Frente aos dados apresentados, infelizmente, a resistência das bactérias Gramnegativas, especialmente Klebsiella spp., P. aeruginosa e Acinetobacter spp. às principais
opções terapêuticas para o tratamento de infecções graves tornou-se uma das mais
desafiadoras questões de saúde pública no âmbito mundial. Em setembro de 2014, o governo
americano anunciou medidas da Casa Branca para combater a resistência bacteriana aos
antimicrobianos (White House National Strategy for Combating Antibiotic Resistant Bacteria CARB). Entre os objetivos do documento estão a redução da progressão da resistência
bacteriana e disseminação de infecções causadas por estes agentes, uso e desenvolvimento de
testes diagnósticos rápidos e inovadores para identificação e caracterização de bactérias
resistentes e a aceleração das pesquisas básicas e aplicadas ao desenvolvimento de novos
antimicrobianos, novas terapias e vacinas. Neste mesmo ano a OMS publicou um documento
onde afirma que cada vez mais os governos ao redor do mundo estão começando a prestar
atenção para um problema tão grave que ameaça as conquistas da medicina moderna. A era
pós-antibiótico em que infecções comuns e pequenas lesões podem ser letais está longe de ser
uma fantasia apocalíptica, mas, é sim, uma possibilidade muito real para o século XXI (WHO,
2014).
2.3. Mecanismos Envolvidos na Resistência aos Carbapenens
O desenvolvimento de técnicas moleculares e os conhecimentos adquiridos nas últimas
décadas possibilitou a melhor compreensão dos mecanismos de resistência das bactérias Gram-
34
negativas aos antimicrobianos. Conhecidas pela sua capacidade de aquisição de diferentes
estratégias para se defender da agressão antimicrobiana, as bactérias Gram-negativas
constituem um desafio clínico e laboratorial.
2.3.1. Cefalosporinases e ESβL Associadas à Impermeabilidade de Membrana
Um dos primeiros mecanismos que a bactéria se utiliza para se tornar resistente aos
antimicrobianos é reduzir o acesso destes agentes aos seus alvos, impedindo assim a sua ação.
A redução de permeabilidade de membrana externa confere uma elevação nos valores da
concentração inibitória mínima (CIM) dos antimicrobianos, porém, também amplifica a resistência
conferida por outros mecanismos, sejam estes intrínsecos, mutacionais ou adquiridos (Rice,
2006). A impermeabilidade pode ser conferida pela diminuição da expressão das porinas,
proteínas de membrana externa (OMPs) que atuam como canal de entrada de nutrientes e
excreção de produtos do metabolismo bacteriano, que seriam tóxicos para a célula, assim como
porta de entrada para os agentes antimicrobianos hidrofílicos. Além disso, a hiperexpressão de
sistemas de efluxo também contribui com a impermeabilidade de membrana, pois são capazes
de ejetar as moléculas de antimicrobianos para o exterior da célula bacteriana pelas proteínas de
membrana externa.
Elevados graus de resistência podem ser observados quando a impermeabilidade de
membrana se associa a produção de β-lactamases. Estas se constituem na principal ferramenta
das bactérias Gram-negativas para se contrapor à agressão pelos agentes β-lactâmicos. A
primeira enzima descrita desta classe foi uma penicilinase isolada de E. coli, em 1940 (Abraham
& Chain, 1940). Apesar do desenvolvimento de penicilinas, cefalosporinas e carbapenens com
crescente estabilidade à hidrólise causada pelas β-lactamases, as bactérias passaram a se
adaptar produzindo enzimas com uma capacidade hidrolítica cada vez maior (Livermore &
Woodford, 2006).
35
Vários esquemas foram propostos para a classificação das β-lactamases, mas as
classificações de Ambler (1980) e Bush e colaboradores (1995) são as mais utilizadas. (Ambler,
1980; Bush et al., 1995). A classificação de Ambler se baseia na sequência de aminoácidos que
compõe as β-lactamases. Esta classificação propõe que as β-lactamases sejam divididas em
classes moleculares A, B, C e D. Em uma tentativa de facilitar a utilização da classificação das βlactamases, Bush e colaboradores (1995) propuseram uma atualização da classificação de Bush
(1989) levando em consideração o substrato preferencial da β-lactamase, o seu perfil de inibição
pelos inibidores de β-lactamases e EDTA, e os principais exemplos das espécies onde estas βlactamases eram encontradas. Estes autores ainda correlacionaram esta nova classificação
com a classificação molecular proposta por Ambler. Em 2010, a classificação de Bush, Jacoby &
Medeiros passou por uma nova atualização devido ao aumento do número de β-lactamases
descritas (Bush & Jacoby, 2010). Esta constitui a classificação mais utilizada até o momento e
encontra-se exemplificada na Tabela 3.
As enzimas do tipo AmpC pertencem ao grupo 1, ou classe C, e são encontradas em
enterobactérias, P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Estas podem ser cromossomais, produzidas
constitutivamente em baixos níveis e/ou induzidas na presença de β-lactâmicos. Os genes que
codificam estes enzimas podem ser encontrados no cromossomo de algumas espécies de
enterobactérias, como Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., entre outras. Também
conhecidas como cefalosporinases, pela sua capacidade de hidrolisar penicilinas, cefamicinas e
oximino cefalosporinas (ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona), porém, sua atividade é limitada
contra cefepima (Bush et al., 1985).
Assim como em enterobactérias, as enzimas do tipo AmpC descritas em P. aeruginosa
são induzidas pela exposição aos agentes β-lactâmicos, especialmente à cefoxitina e ao
imipenem. Por meio de mutações nos genes que regulam sua produção, estas enzimas passam
a ser hiperexpressas, conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro, inclusive à
36
cefepima (Rodriguez-Martinez et al., 2009). Frequentemente a desrepressão do gene ampC
opera conjuntamente com a perda da função da OprD, sendo este um frequente determinante de
resistência aos carbapenens em P. aeruginosa (Gutierrez et al., 2007; Rodrigues-Martinez et al.,
2009). Cabot e colaboradores (2011) avaliaram a expressão dos genes codificadores de AmpC,
OprD, e sistemas de efluxo em uma coleção de 190 isolados de P. aeruginosa. Neste estudo, os
autores observaram que todos os isolados resistentes ao imipenem apresentavam deficiência de
expressão da OprD (Cabot et al., 2011). Esta porina é a principal porta de entrada destes
compostos na célula bacteriana, especialmente o imipenem, e sua diminuição ou ausência em
isolados clínicos demonstrou elevar a CIM de imipenem de 1-2 µg/mL para 8-32 µg/mL.
(Livermore, 2001). Entretanto, Ocampo-Sosa e colaboradores (2012) observaram que mutações
no gene oprD estavam presentes em isolados de P. aeruginosa com diferentes fenótipos de
sensibilidade aos carbapenens, inclusive em isolados apresentando sensibilidade a ambos,
imipenem e meropenem (Ocampo-Sosa et al., 2012). Portanto, segundo alguns autores, é
necessária uma ação conjunta destes mecanismos, hiperexpressão de AmpC e deficiência de
OprD, para que a resistência à carbapenem seja expressiva nos isolados de P. aeruginosa
(Livermore, 1992).
Em contraste, a produção de AmpC em isolados de Acinetobacter spp. não é induzível.
Porém, a presença de elementos de inserção, como a sequência de inserção (IS), ISAba1, a
montante do gene blaAmpC pode promover a sua hiperexpressão e, consequentemente, à
resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Héritier et al., 2006). Entretanto, a expressão
reduzida de OMPs e/ou seu menor tamanho contribui para a menor permeabilidade da
membrana de Acinetobacter calcoaceticus-baumannii, comparada à de P. aeruginosa (2 a 7
vezes menor para cefalosporinas) e E. coli (97 a 99% menor para carbapenens) (Sato & Nakae,
1991). A redução da expressão ou ausência de porinas, como a Omp33-36 (31 kDa) e a CarO
37
(29 kDa) foi relacionada à diminuição de sensibilidade a carbapenem em isolados de A.
baumannii (Clark, 1996; Limansky et al., 2002).
Em algumas enterobactérias genes codificadores de β-lactamases do tipo AmpC foram
descritos em elementos genéticos móveis (pAmpC). Nestas a produção de AmpC é elevada,
conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Jacoby, 2009). No Brasil, apenas
raros relatos de AmpC plasmidiais foram reportados na literatura (Pavez et al., 2008; Campana
et al., 2013).
O grupo das β-lactamases de espectro extentdido apresentam grande importância
clínica pela capacidade de hidrólise de cefalosporinas de amplo espectro, inclusive cefepima, e
pela facilidade de disseminação entre bactérias Gram negativas. Essa disseminação ocorre pelo
fato de que os genes codificadores de ESβL são frequentemente carreados por elementos
genéticos móveis, concomitantemente aos genes que conferem resistência a outras classes de
antimicrobianos,
como
aminoglicosídeos,
cloranfenicol
e
sulfametoxazol-trimetropim.
Consequentemente, a terapia antimicrobiana torne-se bastante restrita. Estas enzimas foram
reconhecidas logo após a introdução das cefalosporinas de amplo espectro na prática clínica
(Sirot et al., 1988; Jacoby et al., 1988). As ESβL originaram-se de β-lactamases de espectro
restrito, como TEM-1/TEM-2 e SHV-1, diferindo-se destas pela substituição de apenas um ou
dois aminoácidos em sua sequência (Bush, 2010). Enterobactérias também podem expressar
outras ESβLs que não estão relacionadas às famílias TEM e SHV, conhecidas como CTX-M.
Atualmente, a prevalência desta família de ESβL aumentou de forma considerável tanto nos EUA
como na Europa, porém, apresentam taxas ainda mais elevadas na América Latina e no sul da
Ásia (Castanheira et al., 2014; Cantón et al., 2008).
Em diversas espécies de enterobactérias, relatos de resistência aos carbapenens
multiplicaram-se na década de 90 em consequência da expansão de isolados produtores de
cefalosporinases plasmidiais ou cromossomais induzíveis do tipo AmpC, ou da produção de
38
ESβLs, em associação com a redução ou perda de expressão das principais OMPs (Bradford et
al., 1997; Bornet et al., 2000; Martinez-Martinez et al., 1999). A resistência aos carbapenens em
isolados de enterobactérias foi primeiramente reportada no início dos anos 90 (Chow & Shlaes,
1991). Neste estudo, Chow e Shlaes (1991) reportaram a resistência à imipenem em uma cepa
de E. aerogenes isolada de ICS, onde não foi observada nenhuma atividade hidrolítica mas sim
a ausência de uma OMP de 40 kDa. Subsequentes a este estudo, diversos autores confirmaram
os achados iniciais de que a alteração da permeabilidade da membrana externa associada à
hiperprodução de AmpC ou a produção de ESβL poderiam conferir às enterobactérias
resistência aos carbapenens (Bradford et al., 1997; MacKenzie et al., 1997). Em seu estudo,
Martinez-Martinez e colaboradores (1999) demonstraram a contribuição da porina OmpK36,
assim como de diferentes ESβLs e AmpC plasmidiais, na resistência às cefalosporinas e
carbapenens em dois isolados clínicos de K. pneumoniae que não expressavam as porinas
OmpK35 ou OmpK36. A elevação das CIM para cefalosporinas foi observada com a introdução
de genes produtores de ESβL e AmpCs, porém, a CIM de cefepime demonstrou apenas um
discreto aumento na presença de AmpC, de 1 µg/mL para 2 a 8 µg/mL. A restauração da
expressão da OmpK36, através da manipulação gênica, permitiu a redução das CIMs de
cefalosporinas de amplo espectro, tanto em isolados produtores de ESβLs como de AmpC.
Somente nos isolados produtores de AmpC, as CIMs de imipenem e meropenem reduziram de 4
a 6 log (Martinez-Martinez et al., 1999). Uma das justificativas indicadas pelos autores do estudo
para a ausência de observação de efeito das ESβLs nas CIMs dos carbapenens seria o tipo de
ESβL estudado, ou seja, variantes do tipo SHV e TEM. Em contraste, a família CTX-M parece
contribuir para este fenótipo quando associada à impermeabilidade de membrana.
Carvalhaes e colaboradores (ANEXO 1) observaram uma diminuição de sensibilidade
para ertapenem (CIMs; 16 a 64 µg/mL), imipenem (CIMs; 2 a 4 µg/mL), e meropenem (CIMs; 4 a
16 µg/mL) em isolados clínicos de K. pneumoniae que apresentavam produção de ESβLs (CTX-
39
M-2, CTX-M-15 e CTX-M-59) e a ausência de uma ou ambas as porinas, OmpK35 ou OmpK36
(ANEXO 1). Da mesma maneira, outros autores demonstraram que, apesar da ausência das
porinas não ser suficiente para conferir resistência aos carbapenens, quando associadas à
produção de β-lactamases, a elevação das CIMs destes antimicrobianos pôde ser observada
(Cornaglia et al., 1995; Girlich et al., 2009). Estes achados geraram inquietação na comunidade
médica, uma vez que, os compostos da classe dos carbapenens são os agentes de primeira
escolha para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos produtores de ESβL.
Entretanto, não há estudos randomizados e controlados para embasar a superioridade destes
para o tratamento de micro-organismos produtores de ESβL (Kanj & Kanafani, 2011). Entretanto,
alguns estudos demonstraram que o tratamento com carbapenem foi um fator independente para
redução de mortalidade quando comparado a outros agentes com atividade in vitro no
tratamento de ICS por isolados de K. pneumoniae produtores de ESβL (Paterson et al., 2004;
Paterson, 2009).
Assim como a redução da expressão de porinas, a hiperexpressão de sistemas de efluxo
tem sido associada com a resistência a múltiplas classes de antimicrobianos, entre elas os
carbapenens, especialmente em P. aeruginosa. Constitutivamente, isolados selvagens de P.
aeruginosa expressam os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM, o que lhes confere
resistência intrínseca a diversos antimicrobianos. Estes diferem de outros sistemas de efluxo,
também descritos em isolados de P. aeruginosa, por não apresentarem expressão induzida por
seus substratos, como MexCD-OprJ e MexEF-OprN (Poole, 2005). Fluoroquinolonas, penicilinas,
cefalosporinas e aminoglicosídeos são substratos comuns dos sistemas de efluxo descritos em
P. aeruginosa, e atuam como agentes na pressão seletiva de mutantes com hiper-regulação
destes sistemas quando utilizados para o tratamento destas ou de outras infecções. Além destes
antimicrobianos, diferentes especificidades de substratos podem ser observadas entre os
sistemas de efluxo, por exemplo, MexAB-OprM apresenta efetiva atividade na ejeção de
40
moléculas de meropenem, mas não de imipenem, e MexXY-OprM é capaz de extruir cefepime
mas não ceftazidima (Livermore, 2001; Farra et al., 2008; Okamoto et al., 2002).
Embora pouco estudado em isolados de Acinetobacter spp. e de enterobactérias, os
sistemas de efluxo podem ter sua eficiência elevada quando os genes reguladores de sua
expressão sofrem mutações, resultando na hiperexpressão e aumento da resistência aos
antimicrobianos (Piddock, 2006). O sistema de efluxo AdeABC, frequentemente presente em
isolados de A. baumannii, quando hiperexpresso pode conferir resistência às fluoroquinolonas,
às tetraciclinas, ao cloranfenicol, à eritromicina, à tigeciclina e ao meropenem (Peleg et al.,
2007). Da mesma maneira, Findlay e colaboradores (2012) demonstraram que a hiperexpressão
do componente acrA do sistema de efluxo AcrAB-TolC em isolados de K. pneumoniae pode
contribuir para resistência ao meropenem (Findlay et al., 2012). Esta contribuição é cada vez
mais reconhecida como decorrente não apenas da ausência ou alteração nas porinas, mas
conjuntamente com a hiperexpressão de sistemas de efluxo que agravam de maneira
substancial a impermeabilidade da membrana bacteriana aos agentes antimicrobianos (Piddock,
2006).
41
Tabela 3. Classificação das β-lactamases adaptada de Bush & Jacoby (2010).
Grupo
Funcional
(Bush &
Jacoby)
Classe
Molecular
(Ambler)
Substratos
AC ou TZB
1
C
Cefalosporinas
Características
Enzimas representantes
Espécies bacterianas de
importância clínica
Referência
Não
Hidrólise preferencial de
cefalosporinas que
benzilpenicilinas, hidrólise
cefamicinas
E. coli AmpC, P99, ACT1, CMY-2, FOX-1, MIR-1
Enterobactérias, P.
aeruginosa e
Acinetobacter spp.
Zavascki et al.,
2010
GC1, CMY-37
Enterobacter cloacae,
Citrobacter freundii
Crichlow et al.,
1999; Ahmed &
Shimamoto, 2008
Inibidoresa
Não
EDTA
1e
C
Cefalosporinas
Não
Não
Hidrólise intensa da
ceftazidima e
frequentemente de outros
oximino β-lactâmicos
2a
A
Penicilinas
Sim
Não
benzilpenicilinas que
cefalosporinas
PC1
Staphylococcus aureus
Pieper et al., 1997
2b
A
Penicilinas, cefalosporinas
espectro limitado
Sim
Não
Hidrólise similar de
benzilpenicilinas e
cefalosporinas
TEM-1, TEM-2, SHV-1
Enterobactérias
Bush & Jacoby,
2010
2be
A
cefalosporinas de espectro
extendido,
monobactâmicos
Sim
Não
Hidrólise intensa de
(cefotaxima, ceftazidima,
ceftriaxona, cefepime e
aztreoam)
TEM-3, SHV-2, CTX-M15, PER-1, VEB-1
aeruginosa e
Acinetobacter spp.
Bush & Jacoby,
2010; Shakil et al.,
2010
2br
A
Penicilinas
Não
Não
Resistência ao ácido
clavulânico, tazobactam e
sulbactam
TEM-30, SHV-10
Enterobactérias
Prinarakis et al.,
1997; Bradford et
al., 2004
42
2ber
A
Cefalosporinas de espectro
extendido,
monobactâmicos
Não
Não
combinada à resistência ao
ácido clavulânico, ao
tazobactam e ao
sulbactam
TEM-50
Enterobactérias
Sirot et al., 1997
PSE-1, CARB-3
aeruginosa
Medeiros et al.,
1982; Lachapelle
et al., 1991;
Melano et al., 2002
2c
A
Carbenicilina
Sim
Não
carbenicilina
2ce
A
Carbenicilina, cefepima
Sim
Não
carbenicilina, cefepime e
cefpiroma
RTG-4
A. baumannii
Potron et al., 2009
2d
D
Cloxacilina
Variável
Não
cloxacilina ou oxacilina
OXA-1, OXA-10
P. aeruginosa
Evans & Amyes,
2014
2de
D
Cefalosporinas de espectro
extendido
Variável
Não
Hidrólise da cloxacilina, da
oxacilina e dos oximino-βlactâmicos
OXA-11, OXA-15
P. aeruginosa
Evans & Amyes,
2014
2df
D
Carbapenem
Variável
Não
Hidrolise da cloxacilina, da
oxacilina e dos
carbapenens
OXA-23, OXA-48
Enterobactérias e
Acinetobacter spp.
Evans & Amyes.,
2014
A
cefalosporinas de espectro
extendido
Não
Hidrolise das
cefalosporinas, inibida por
ácido clavulânico, mas não
aztreonam
CepA
Bacteroides fragilis
Rogers et al., 1993
Não
Hidrólise intensa dos
carbapenens, dos oximino
β-lactâmicos e das
cefamicinas
KPC-2, IMI-1, SME-1
aeruginosa e
Acinetobacter spp.
WaltherRasmussen &
Hoiby, 2007
2e
2f
A
Carbapenem
Sim
Variável
43
3a
B
Carbapenem
Não
Sim
Espectro ampliado de
hidrólise incluindo
carbapenem, mas não
monobactâmicos
3b
B
Carbapenem
Não
Sim
carbapenens
NI
Unknown
IMP-1, VIM-1, CcrA, IND1
aeruginosa e
Acinetobacter spp.
Cornaglia et al.,
2011
CphA, Sfh-1
Aeromonas spp., Serratia
fonticola
Massidda et al.,
1991; Saavedra et
al., 2003
a. Abreviações: AC - Ácido Clavulânico; TZB - Tazobactam.
44
2.3.2. Produção de β-lactamases: Carbapenemases
Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens, a produção de carbapenemases
talvez seja o mais temido, pois estas enzimas apresentam o maior espectro de atividade e,
geralmente, hidrolisamtodos os β-lactâmicos. Estas enzimas pertencem às diferentes classes
moleculares, podendo ser encontradas na classe A, B e D (Tabela 4).
45
Tabela 4. Características das principais carbapenemases reportadas.a
Classe
Classe A
Classe B
Grupo de
enzima
Enzima(s)
Número de
variantes no
grupo
Localização
Exemplos de espécies em que foram encontradas
SME
IMI
NMC-A
SME-1 a SME-5
IMI-1 a IMI-8
NMC-A
5
8
1
C
CeP
C
KPC
KPC-2 a KPC-22
21
CeP
S. marcescens
E. cloacae, E. asburiae
E. cloacae
K. pneumoniae, Salmonella enterica, K. oxytoca,
Enterobacter spp., E. cloacae, E. aerogenes, E. coli, P.
aeruginosa, C. freundii
GES
GES-2, GES-4 a GES-6, GES-16
5
CeP
P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli
IMP
IMP-1 a IMP-48
48
CeP
P. aeruginosa, Entereobactericeae, A. baumannii, A.
xylosoxidans, A. baumannii, P. aeruginosa, P. putida, A.
caviae
VIM
VIM-1 a VIM-43
43
CeP
P. aeruginosa, Entereobactericeae, A.baumannii, A.
baumannii, P. aeruginosa, P. putida, A. hydrophila
SPM
GIM
SIM
AIM
KHM
NDM
DIM
TMB
SPM-1
GIM-1
SIM-1
AIM-1
KHM-1
NDM-1 a NDM-12
DIM-1
TMB-1 e TMB-2
1
1
1
1
1
12
1
2
CeP
P
P
P
P
CeP
P
P
P. aeruginosa
P. aeruginosa, Enterobacteriaceae
A. baumannii, Enterobacteriaceae
P. aeruginosa
C. freundii
Enterobacteriaceae e A. baumannii
P. stutzeri
A. xylosoxidans
46
OXA-23-like
OXA-23, OXA-27, OXA-49, OXA-73, OXA-102, OXA-103,
OXA-105, OXA-133, OXA-134, OXA-146, OXA-165, OXA171, OXA-225, OXA-239
19
CeP
A. baumannii, A. junii, A. radioresistens, A. pitii, P.
mirabilis, A. phenon 5, A. phenon 6/ct 13TU, A.
nosocomialis, A. genomic species 10/11, A. lwoffii, K.
pneumoniae, A. baylyi
OXA-40-like
OXA-40, OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-160,
OXA-207
7
CeP
A. baumannii, A. haemolyticus, A. pittii, A. baylyi, P.
aeruginosa, A. calcoaceticus, K. pneumoniae
OXA-51-like
OXA-51, OXA-64 - OXA-71, OXA, 75 a OXA-80, OXA-82 OXA-84, OXA-86 a OXA-95, OXA-98 a OXA-100, OXA-104,
OXA-106 a OXA-113, OXA-115 a OXA-117, OXA-120 a
OXA-128, OXA-130 a OXA-132, OXA-138, OXA-144, OXA148 a OXA-150, OXA-172 a OXA-180, OXA-194 a OXA197, OXA- 200 a OXA-203, OXA-206, OXA-208, OXA-216,
OXA-217, OXA-219, OXA-223, OXA-241, OXA-241, OXA248 a OXA-250, OXA-254
95
CeP
A. baumannii, A. noscomialis, E. clocae, E. coli, K
pneumoniae
Classe D
OXA-58-like
OXA-58, OXA-96, OXA-97, OXA-164
4
CeP
A. baumannii, A pittii, A. nosocomialis, A. phenon 6/ct
13TU, A. junii, Acinobacter genomic species 9, A.
bereziniae, A. calcoacetius, A. radioresistens, E.
cloacae, C. testosteroni, E. coli, K. pneumoniae, D.
acidovorans
OXA-134a-like
OXA-143-like
OXA-213
OXA-214-like
OXA-211-like
OXA-229-like
OXA-235-like
OXA-134a, OXA-186 a OXA-191
OXA-143, OXA-182, OXA-231, OXA-253, OXA-255
OXA-213
OXA-214, OXA-215
OXA-211, OXA-212, OXA-309
OXA-228 a OXA-230, OXA-257
OXA-235 a OXA-237, OXA-278
7
5
17
5
6
8
7
C
P
C
C
C
C
C
A. lwoffii
A. baumannii, A. pittii
A. calcoacetius
A. haemolyticus
A. johnsonii
A. bereziniae
A. schindleri
47
OXA-48-like
a.
OXA-48, OXA-48b, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA199, OXA-204, OXA-232, OXA-244, OXA-245, OXA-247
11
CeP
E. cloacae, K. pneumoniae, E. coli, S. xiamenensis, C.
freundii, S. marcescens, P. rettgeri, K. oxytoca, E.
sakazaii, A. baumannii
Adaptado de Cornaglia e colaboradores (2011), Walther-Rasmussen & Hɸiby (2007), Nordmann e colaboradores (2011), Queenan & Bush (2007), Evans &
Amyes (2014) e http://www.lahey.org/Studies/. Abreviações: C - localização cromossomal; P - localização plasmidial;
48
2.3.3.1. Carbapenemases de Classe A
Há uma variedade de enzimas da classe A alocadas no grupo 2f. Algumas destas
enzimas são cromossomais, como NmcA, Sme, IMI-1 e SFC-1, e outras, geralmente, codificadas
por genes localizados em plasmídios, como KPC, IMI-2 e as variantes do tipo GES. Todas essas
β-lactamases apresentam uma serina no seu sítio ativo e hidrolisam efetivamente os
carbapenens, sendo parcialmente inibidas pelo ácido clavulânico (Nordmann et al., 2011). A
principal representante do grupo, KPC, foi primeiramente isolada em 1996 na Carolina do Norte
nos EUA, de uma cepa de K. pneumoniae resistente aos carbapenens (Yigit et al., 2001). Entre
2001 e 2004, apenas alguns isolados produtores de KPC foram recuperados nesta área
geográfica. A disseminção deste determinante de resistência foi documentada pelo NHSN, entre
os anos 2006-2007, onde 10% de todas as K. pneumoniae isoladas de ICS relacionadas à
cateter ou de infecção do trato urinário apresentavam resistência aos carbapenens nos EUA
(Hidron et al., 2008). A mesma enzima doi documentada em isolados de enterobactérias em
Israel, seguido da Europa, Ásia e América Latina ainda na mesma década (Nordmann et al.,
2011).
Embora o gene blaKPC esteja associado ao transposon Tn4401, os quais por sua vez
estão inseridos plasmídeos que podem diferir em tamanho e estrutura, além do conteúdo de
genes codificadores de diferentes β-lactamases (Nordmann et al., 2011). Apesar da comprovada
mobilidade do gene blaKPC em isolados de K. penumoniae, a disseminação primária deste agente
parece ocorrer, principalmente de maneira clonal, sendo o principal complexo clonal, CC258,
detectado ao redor do mundo (Temkin et al., 2014). No Brasil, os primeiros quatro isolados de K.
pneumoniae produtores de KPC foram encontrados em Recife, em 2006. (Monteiro et al., 2009).
Novos casos surgiram no Rio de Janeiro, entre os anos 2007 e 2008 (Peirano et al., 2009).
Entretanto, Pavez e colaboradores (2009), ao estudarem isolados recuperados entre os anos de
2003 a 2008, em São Paulo, observaram a presença do gene blaKPC em uma amostra isolada
49
em São Paulo em 2005 (Pavez et al., 2009). A disseminação rápida deste fator de resistência
elevou a taxa de resistência aos carbapenens em isolados de K. pneumoniae no país. Embora o
CC258 seja ainda o mais frequente entre amostras de K. pneumoniae produtores de KPC-2, o
gene blaKPC passou a ser adquirido por outros sequences types (STs) de K. pneumoniae ao
longo de seu estabelecimento no país (Nicoletti et al., 2012), assim como em outros locais, a
maioria destes isolados pertenciam ao CC258, apesar da diversidade de “” (STs) encontrados
(Nicoletti et al., 2012).
Embora exista um predomínio de K. pneumoniae e Enterobacter spp. produtores de
KPC, a transferência do gene blaKPC para outras bactérias Gram-negativas, como E. coli,
Enterobacter spp., S. marcescens, P. putida e P. aeruginosa, foi observada no Brasil e no mundo
(Nordmann et al., 2009; Zavascki et al., 2009; D'Alincourt et al.; 2010; Almeida et al., 2012;
Jácome et al., 2012). A despeito de haver, até o presente momento, 21 variantes de KPC
descritas, a KPC-2 e KPC-3 são as mais encontradas mundialmente, e no Brasil apenas a
variante KPC-2 foi reportada, até o momento.
A primeira enzima da família GES, a GES-1, foi isolada de um isolado de K. pneumoniae
na Guiana Francesa, e apresentava perfil hidrolítico de ESβL (Poirel et al., 2000). As enzimas do
tipo GES são peculiares, pois, uma mutação pontual no seu sítio ativo pode conferir-lhes
extensão da sua atividade hidrolítica, tornando-as carbapenemases. Algumas variantes com
estas características são, primordialmente, isoladas em P. aeruginosa na Ásia, África do Sul e
Brasil, e em Acinetobacter spp. na Turquia, Tunisia, Kuwait e França (Zavascki et al., 2010; Zeka
et al., 2014; Bonnin et al., 2011; Bonnin et al., 2013; Charfi-Kessis et al., 2014). Os genes que
codificam as carbapenemases do tipo GES estão localizados em integrons, na sua maioria
inseridos em plasmídios transferíveis, porém, já foram descritos inseridos no cromossomo de
algumas bactérias, como E. coli e P. aeruginosa (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007). No Brasil,
a primeira enzima da família, GES-1, uma β-lactamase de espectro extendido, foi descrita em P.
50
aeruginosa por Castanheira e colaboradores em 2004 (Castanheira et al., 2004). Em 2007, da
Fonseca e colaboradores reportaram a presença do gene blaGES-5 em três isolados de P.
aeruginosa recuperados da Região Norte do país em 2001 (da Fonseca et al., 2007). Estes
isolados eram sensíveis apenas a colistina. Posteriormente, GES-5 foi observada em um isolado
de K. pneumoniae subsp. ozaenae de vigilância ativa em São Paulo (Picão et al., 2010). E mais
recentemente, uma nova variante desta classe, a GES-16, foi descrita em um isolado S.
marcescens na cidade do Rio de Janeiro (Barbosa, 2011).
De menor importância clínica, as demais serino-carbapenemases do grupo estão
localizadas no cromossomo de espécies de enterobactérias, como SME, exclusiva de S.
marcescens, com cinco variante descritas até o momento no Canadá e EUA (WaltherRasmussen & Hoiby, 2007). Estudos com a variante SME-1 mostraram que esta enzima pode
ser produzida em níveis basais elevados por uma subpopulação de S. marcescens, porém, um
aumento de sua expressão foi observada na presença de imipenem (Naas et al., 1995). A família
IMI-1/NMC-A, refere-se a imipenemase/não MβL-A, e são distribuídas em 2 grupos, as NMC-A
derivam por oito substituições de duas variantes de IMI, que por sua vez diferem entre si por 2
substituições de amino ácidos na sequência proteica. Estas enzimas foram encontradas
esporadicamente em isolados clínicos de E. cloacae e E. asburiae, nos EUA, França, Argentina,
China e mais recentemente em Singapura, e em um isolado de Enterobacter spp. resistente a
colistina na Irlanda (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007; Boo et al., 2013; Teo et al., 2013).
Apresentam até o momento apenas oito variantes, e sua expressão pode ser induzida pela
presença de imipenem. As últimas representantes do grupo, SFC-1 e SHV-38, foram reportadas
apenas em S. fonticola (Portugal) e K. pneumoniae (França), respectivamente. Ambas são
capazes de hidrolisar o imipenem, e foram encontradas no cromossomo de seus hospedeiros.
SHV-38 difere da SHV-1 pela substituição de alanina por valina na posição 146, levando a uma
modificação estrutural que favorece a hidrólise de carbapenem (Walther-Rasmussen & Hoiby,
51
2007). Geralmente, estas enzimas da classe A são capazes de hidrolizar os carbapenens, mas
não apresentam atividade contra cefalosporinas de amplo espectro (Bush, 2010).
2.3.3.2. Carbapenemases de Classe B
Pertencente ao grupo funcional 3a, as MβLs são compostas por uma vasta gama de
enzimas, que em comum necessitam de moléculas de zinco interagindo no seu sítio ativo para
excercer sua atividade hidrolítica sobre todos os compostos β-lactâmicos, incluindo carbapenem,
com exceção do aztreonam. Desta maneira, tem sua atividade inibida na presença de agentes
quelantes de íons, como EDTA e ácido 2-mercaptopropiônico. Estas enzimas foram detectadas
inicialmente, nos anos 60, no cromossomo de isolados com pouca expressão clínica, como
Bacillus cereus, Aeromonas spp., e Stenotrophomonas maltophilia (Iaconis & Sanders, 1990;
Kuwabara & Abraham, 1967; Saino et al., 1982). Entretanto, apenas na década de 90, quando os
genes codificadores destas enzimas carreados por elementos genéticos móveis se
disseminaram para os principais patógenos Gram-negativos (P. aeruginosa e S. marcescens
produtoras de IMP-1 no Japão e A. baumannii produtor de IMP-2 na Europa), estas enzimas
foram reconhecidas com importante problema clínico (Watanabe et al., 1991; Osano et al., 1994;
Cornaglia et al., 2011). Atualmente, foram descritas 48 variantes de IMP (nomeadas devido a
sua atividade contra imipenem) e 43 variantes de VIM (Verona integron-encoded metallo-βlactamase), as maiores famílias do grupo, que inicialmente eram encontradas em bacilos Gramnegativos não fermentadores, porém, disseminaram-se para espécies de enterobactérias, sendo
descritas em Enterobacter spp., E. coli, C. freundii, Klebsiella spp. e S. marcescens (Bush,
2010). Outras enzimas frequentes do grupo são GIM (German imipenemase) e SIM (Seoul
imipenemase), que assim como IMP e VIM, estão localizadas em uma variedade de integrons,
onde foram incorporados como genes cassetes (Queenan & Bush, 2007). A São Paulo metalocarbapenemase (SPM-1), descrita e restrita, até o presente momento, em amostras de P.
52
aeruginosa isoladas no Brasil, onde foi reportada a disseminação de um clone de P. aeruginosa
produtor de SPM-1 (Toleman et al., 2002; Gales et al., 2003). A única descrição de SPM-1 fora
do território brasileiro foi na Europa, especificamente na Suiça, porém com conexão
epidemiológica com o Brasil (Salabi et al., 2010). Assim como SPM-1, outras enzimas, DIM-1
(isolada na Holanda) e AIM-1 (Austrália imipenemase) contém apenas uma variante,
identificadas apenas em Pseudomonas spp. (Poirel et al., 2010; Zavascki et al., 2010). Em 2008,
Sekiguchi e colaboradores reportaram uma nova enzima da classe B, KHM-1, isolada de um
isolado clínico de Citrobacter freundii no Japão. Este apresentava resistência aos β-lactâmicos
com exceção de monobactans, e diminuição de sensibilidade aos carbapenens (Sekiguchi et al.,
2008). Recentemente, uma nova integrante do grupo das MBL foi descrita na Líbia, TMB-1, em
um isolado de Achromobacter xylosoxidans (El Salabi et al., 2012). Posteriormente, TMB-2 e
TMB-1 foram encontradas em isolados de Acinetobacter spp. no Japão (Suzuki et al., 2013;
Kayama et al., 2014).
A mais nova enzima do grupo das MβL foi descrita em um isolado de K. pneumoniae
resistente a todos os antimicrobianos testados, exceto colistina, proveniente da Índia (Yong et
al., 2009). Trata-se da New-Delhi metallo-β-lactamase (NDM), que atualmente conta com 12
variantes descritas (http://www.lahey.org/Studies/other.asp). A localização do gene blaNDM-1 em
plasmídios altamente transferíveis, possibilitou com que rapidamente casos no Reino Unido,
EUA e no sul da Ásia se alastrassem, em diferentes espécies de enterobactérias e inclusive em
A. baumannii (Rolain et al., 2010). No Brasil, o primeiro relato de NDM-1 foi em um isolado de
Providencia rettgeri na cidade de Porto Alegre, no Estado do Rio Grande do Sul (Carvalho-Assef
et al., 2013), seguido de E. cloacae, E. homaechei e Morganella morganii, nesta mesma região,
e em A. baumannii em Londrina (Rozales et al., 2014; Carvalho-Assef et al., 2014; Pillonetto et
al., 2014). Embora não tenha sido estabelecida uma ligação epidemiológica com o subcontinente
53
indiano, o Rio Grande do Sul está geograficamente próximo ao Paraguai, onde foram descritos
casos de NDM (Pasteran et al., 2014).
2.3.3.3. Carbapenemases de Classe D
O primeiro grupo de CHDL identificado em isolados de A. baumannii foi o da OXA-23 no
Reino Unido, em 1985 (Paton et al., 1993). As CHDLs compreendem um grupo de enzimas
encontrados quase que exclusivamente em Acinetobacter spp., com exceção da OXA-48,
disseminada entre as enterobactérias. Atualmente, podem ser divididas em seis grupos, sendo
os mais importantes os grupos OXA-23, OXA-24/40, OXA-48, OXA-51, OXA-58 e OXA-143. As
propriedades cinéticas das enzimas do grupo OXA-23 variam bastante entre os estudos
publicados, porém, todos concordam que estas enzimas são capazes de hidrolisar oximino
cefalosporinas (com exceção de ceftazidima), amino penicilinas, piperacilina, oxacilina e
aztreonam, além dos carbapenens, porém, com baixa afinidade (CIMs ao redor de 16 µg/mL)
(Afzal-Shah et al., 2001; Smith et al., 2013). Apresentam maior atividade contra imipenem
quando comparado aos demais carbapenens. Entretanto, valores maiores de CIMs para
carbapenens são reportados quando isolados produtores de OXA-23 também expressam o
sistema de efluxo AdeABC (CIMs; > 32 µg/mL) (Evans & Aymes, 2014). Das 19 enzimas que
compõe este grupo, apenas a OXA-146, possui atividade contra ceftazidima. Este grupo parece
ter sido adquirido de A. radioresistens (Poirel et al., 2008). Em enterobactérias, a presença do
gene blaOXA-23 somente havia sido reportado no cromossomo de isolados de P. mirabilis na
França, até que recentemente, foi também encontrado em um plasmíde isolado de E. coli em
Singapura (Bonnet et al., 2002; La et al., 2014).
A principal enzima do grupo da OXA-24/40, que leva seu nome, foi isolada de um surto
de A. baumannii na Espanha em 1997, e, apesar de frequentes nesta espécie, também foram
reportadas em isolados de P. aeruginosa e K. pneumoniae (Bou et al., 2000; Evans & Aymes,
54
2014). Em geral, este grupo de enzimas, assim como as enzimas do grupo OXA-58, possui
atividade contra penicilinas, mas fracamente hidrolisam carbapenens, e não apresentam
atividade contra cefalosporinas de amplo espectro (Poirel & Nordmann, 2006).
Assim como as enzimas do grupo OXA-51, que ocorrem naturalmente em A. baumannii,
as enzimas do grupo OXA-134 são restritas, até o presente momento, a A. lowffii. Essas enzimas
não apresentam elevada expressão, uma vez que, isolados desta espécie são sensíveis a todos
os β-lactâmicos. O maior grupo, o da OXA-51, contém 95 variantes. Estas enzimas são
intrínsecas em A. baumannii, presentes em seu cromossomo, e apresentam fraca atividade
hidrolítica contra carbapenens (Héritier et al., 2005). Entretanto, as variações no espectro de
atividade observadas entre as diferentes enzimas deste grupo, mostram a necessidade de uma
melhor caracterização do perfil hidrolítico de cada enzima (Evans & Aymes, 2014). Em 2004,
foram reportados três isolados de A. baumannii resistentes a carbapenem e produtores de OXA143, no Brasil (Mostachio et al., 2012). Outras variantes do grupo da OXA-143, as enzimas OXA231 e OXA-253, ambas isoladas em A. baumannii no Brasil e em Honduras, respectivamente, e
OXA-255 em um isolado de A. pittii nos EUA (Zander et al., 2014).
Uma importante característica dos isolados de Acinetobacter spp. é a mobilização de IS,
como ISAba-1 e ISAba-3, pelo seu cromossomo. Presentes em transposons, em únicas ou
múltiplas cópias, ISAba1, foi descrita associada aos genes blaOXA-23 e blaOXA-51 em isolados
resistentes aos carbapenens, intensificando sua expressão (Mugnier et al., 2009; Segal et al.,
2007). Já, a ISAba3 é comumente encontrada a montante do gene blaOXA-58 (Corvec et al.,
2007).
Diferentemente de todos os grupos anteriores, o grupo da OXA-48 foi inicialmente
descrito em isolado de K. pneumoniae multirresistente, inclusive a carbapenem, na Turquia em
2001 (Poirel et al., 2004). Disseminadas entre espécies de enterobactérias, porém, também
descrito em A. baumannii, as enzimas deste grupo apresentam baixa atividade hidrolítica contra
55
carbapenens, entretanto, maior afinidade ao imipenem que aos demais carbapenens. As dez
variantes deste grupo podem diferir deveras em suas características cinéticas, sendo que a
OXA-163, apresenta-se com atividade de carbapenemase muito baixa, assemelhando-se muito
mais a um perfil de ESβL, com atividade contra ceftazidima e aztreonam (Poirel et al., 2011). No
Brasil, o primeiro isolado de uma variante do grupo OXA-48, a OXA-370, foi recentemente
reportado por Sampaio e colaboradores (2014). A enzima foi encontrada em um isolado de E.
hormaechei com redução de sensibilidade para impenem e resistência à ertapenem, em Porto
Alegre (Sampaio et al., 2014). O perfil hidrolítico desta enzima ainda não foi determinado.
2.4. Impacto Clínico da Resistência aos Carbapenens
Há décadas, diversos estudos observaram que a resistência aos antimicrobianos e a
terapia inadequada são fatores associados à mortalidade em pacientes com infecção por estes
patógenos (Falagas et al., 2008). Kollef e colaboradores (1998) observaram taxas de mortalidade
superiores em pacientes com PAV quando a terapia antimicrobiana inicial não era adequada
para o agente infeccioso (23,5% vs. 7,8%; p = 0,018) (Kollef et al., 1998). Da mesma forma,
Rello e colaboradores (1997), associaram a terapia empírica inadequada para tratamento de
PAV às maiores taxas de mortalidade (37% vs 15,6%, p < 0,05) (Rello et al., 1997). Esta
diferença mostrou-se ainda maior quando Ibrahim e colaboradores (2000) analisaram a
influência da terapia antimicrobiana inadequada na mortalidade de pacientes com ICS (61,9% vs
28,4%; p < 0,001), e risco relativo de 2,18 (IC: 1,77-2,69) (Ibrahim et al., 2000).
Os carbapenens constituem a terapia de escolha contra infecções graves causadas por
bactérias Gram-negativas, principalmente, àquelas adquiridas no ambiente hospitalar. A
resistência aos carbapenens põe em risco o sucesso da terapia com os carbapenens no
tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes. A diminuição
de sensibilidade a um ou mais compostos do grupo dos carbapenens pode ocorrer tanto pela
56
presença de carbapenemases como pela associação de impermeabilidade de membrana
externa e produção de AmpC e/ou ESβL (Zavascki et al., 2013). Amostras produtoras de
carbapenemases podem-se apresentar como sensíveis aos carbapenens, dificultando a
identificação destas amostras e, portanto, a introdução da terapia antimicrobiana adequada e a
implementação das medidas adequadas de controle (Munhoz-Price et al., 2013; Cohen Stuart et
al., 2010).
Apesar dos estudos que avaliaram o tratamento de infecções causadas por microorganismos produtores de carbapenemases serem compostos apenas por série de casos e
diferentes tipos de infecção, três estudos retrospectivos avaliaram, recentemente, a mortalidade
associada à terapia antimicrobiana em ICS causadas por enterobactérias produtoras de KPC. O
primeiro, conduzido por Tumbarello e colaboradores (2012), avaliou 125 casos e os autores
observaram elevada taxa de mortalidade em 30 dias (42%). Estes autores compararam a
monoterapia com a terapia combinada com dois ou três agentes, sendo que apenas a introdução
da combinação de colistina, tigeciclina e meropenem foi associada com maior sobrevida (OR
0,27; 95% CI 0,07-1,01; p=0,009) (Tumbarello et al., 2012). De maneira semelhante, Zarkotou e
colaboradores (2011), observaram taxa de mortalidade em 30 dias de 53% e taxa de mortalidade
atribuída à infecção de 34%, entre os 53 casos avaliados naquele estudo. No geral, a terapia
antimicrobiana apropriada foi introduzida em 35 pacientes, dos quais todos os pacientes tratados
com terapia combinada apropriada sobreviveram (20), enquanto que, entre os 15 pacientes
tratados com monoterapia, mesmo que apropriada e incluindo colistina, a taxa de mortalidade
associada à infecção foi de 47% (Zarkotou et al., 2011). Por fim, Qureshi e colaboradores (2012)
avaliaram 41 pacientes apresentando bacteremia secundária à pneumonia causada por K.
pneumoniae produtora de KPC. A taxa de mortalidade em 28 dias foi de 39%, sendo de 13,3%
no grupo que recebeu terapia combinada e 57,8% no grupo tratado com monoterapia (p=0,01)
(Qureshi et al., 2012).
57
Na tangente ao tratamento de outras bactérias Gram-negativas, incluindo P. aeruginosa,
o estudo retrospectivo observacional, caso-controle, conduzido por Kofteridis e colaboradores
(2010) avaliou a terapia endovenosa de colistina com a terapia combinando colistina endovenosa
e inalatória para tratamento de PAV causada por P. aeruginosa, A. baumannii ou K. pneumoniae
sensíveis apenas à colistina. Apesar de demonstrar que a terapia de vias combinadas (EV e
inalatória) apresentou maior taxa de cura clínica (p<0,05) e tendência de superioridade em
relação ao sucesso clínico e mortalidade, a análise multivariada apresentou apenas uma
tendência em relação à cura clínica pela terapia endovenosa associada à inalatória (p=0,08)
(Kolfteridis et al., 2010). No entanto, algumas razões poderiam explicar a falha em demonstrar
superioridade do regime de vias combinadas (EV e inalatória). Inicialmente, o número da
amostragem pode não ter atingido significância estatística suficiente para demonstrar diferenças
entre os dois grupos. O número de casos de pneumonia por A. baumannii (66; 77%) foi muito
superior aos demais patógenos, e o diagnóstico de PAV, mesmo com rígidos critérios
microbiológicos, pode não ser satisfatório, ou seja, é possível que casos de colonização tenham
sido considerados como PAV, prejudicando a análise estatística. Adicionado ao fato de que por
tratar-se de um estudo retrospectivo, a decisão da equipe médica assistente possa ter sido
influenciada pela gravidade da infecção no momento da escolha ou introdução da terapia
antimicrobiana.
Da mesma forma, no estudo de Peña e colaboradores (2013), apesar de prospectivo, a
escolha da terapia a ser instituída foi determinada pelo médico assistente (Peña et al., 2013).
Neste estudo os autores compararam a monoterapia adequada (uso de um agente antipseudomonas sensível in vitro, exceto aminoglicosídeo) com a terapia combinada adequada
(uso de dois agentes anti-pseudomonas sensíveis in vitro) para o tratamento de ICS por P.
aeruginosa, e não observaram diferença na mortalidade em 30 dias. Entretanto, a terapia
combinada foi instituída com maior frequência em pacientes com pontuação ≥ 2 pelo score de
58
Pitt (67%) do que naqueles pacientes que apresentaram pontuação de Pitt < 2 (7%) (Peña et al.,
2013). A pontuação no score de Pitt é uma alternativa simplificada à pontuação de APACHE II
(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II score) para predizer o desfecho clínico de
pacientes com sepse em UTIs, e tem obtido preferência por diversos autores, não apenas por se
correlacionar adequadamente com seu objetivo, mas por não requerer dados laboratoriais para
sua determinação (Rhee et al., 2009). Ainda no estudo de Peña e colaboradores (2013), um
maior número de pacientes com bacteremia de alto risco (Infecção primária em trato respiratório,
sítio cirúrgico ou de origem indeterminada) receberam terapia combinada em relação àqueles
que apresentaram-se com bacteremia de baixo risco (Infecção primária em trato urinário ou
cateter intravascular). Fato este que pode ter resultado em viés na análise do desfecho clínico
dos pacientes em uso de terapia combinada (Peña et al., 2013).
Recentemente, os primeiros estudos clínicos randomizados, ambos avaliando a
combinação de colistina e rifampicina versus monoterapia com colistina para tratamento de
infecções graves por A. baumannii resistentes a carbapenem, foram publicados. No primeiro,
Durante-Mangoni e colaboradores (2013) avaliaram 210 pacientes em cinco centros médicos na
Itália. Os autores observaram 43% de mortalidade geral, sem diferença entre os grupos
estudados, porém, a taxa de erradicação microbiológica foi superior no grupo da terapia
combinada (Durante-Mangoni et al., 2013). De forma similar, Aydemir e colaboradores (2013),
demonstraram menor tempo para erradicação microbiológica no grupo de terapia combinada
(p=0,029). Neste estudo, apesar de não atingir significância estatística, possivelmente pelo
pequeno número de pacientes (n=43), os autores observaram maior taxa de mortalidade para
PAV causada por A. baumannii resistente a carbapenem no grupo tratado com monoterapia com
colistina (63,6%) ante ao grupo de terapia combinada (colisitna e rifampicina; 38%) (Aydemir et
al., 2013).
59
Deste modo, a prática médica urge, atualmente, por estudos randomizados e
controlados no campo do tratamento de infecções por bactérias Gram-negativas MDR. Segundo
Paterson & Rogers (2010), a gravidade das doenças e complexidade clínicas que usualmente
afetam os pacientes com infecções graves por estes agentes, assim como o suntuoso
financiamento necessário, dificultam a execução destes estudos (Paterson & Rogers, 2010).
Talvez, a randomização destes estudos devessem incluir informações quanto aos mecanismos
de resistência presentes nos isolados resistentes à carbapenem. Poderia se questionar se a
resistência conferida pela produção de carbapenemase responderia melhor à terapia combinada,
enquanto que na ausência desta, a monoterapia fosse suficientemente adequada para o
desfecho clínico favorável. Apesar das limitações metodológicas dos estudos retrospectivos, este
fato é observado nos estudos que avaliaram a terapia combinada versus a monoterapia para o
tratamento da infecção por enterobactérias resistentes a carbapenem devido à presença de
carbapenemase, acima descritos.
2.5. Metodologias Aplicadas à Detecção de Carbapenemases
A grande variedade de carbapenemases produzidas por patógenos de importância clínica,
além de suas diferentes características cinéticas dificultam a aplicação de um único teste para a
sua detecção. Diversas metodologias foram propostas e avaliadas, porém, não há uma única
metodologia disponível na prática clínica, até o presente momento, que seja rápida, prática, com
baixo custo e que apresente 100% de sensibilidade na detecção de todas as classes de
carbapenemases. A dificuldade diagnóstica contribui para a rápida disseminação destas enzimas
no ambiente hospitalar, assim como no atraso para instituição de terapia adequada, o que
consequentemente influenciou nas altas taxas de mortalidade.
60
2.5.1. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos
O teste de sensibilidade é a primeira ferramenta para predizer a adequação da terapia
instituída, entretanto, os testes de sensibilidade apesar de imprescindíveis na prática clínica,
requerem muito tempo para que seus resultados estejam prontos. É necessário que o
crescimento e o isolamento do micro-organismo, assim como um período de incubação do teste
antes que os resultados sejam reportados, em média 48 a 72 horas. Tempo este, que, na
vigência de uma infecção grave, pode comprometer o desfecho clínico do paciente. Diversos
estudos demonstram a importância da rápida e adequada introdução da terapia antimicrobiana
em casos de infecções graves como pneumonias e ICS. Kumar e colaboradores (2006)
observaram um aumento na taxa de mortalidade intra-hospitalar com a introdução da terapia
antimicrobiana efetiva realizada após duas horas do início de um episódio de hipotensão em
pacientes com sepse quando comparada à introdução desta em apenas uma hora da hipotensão
(Kumar et al., 2006). Desta maneira, a redução do tempo dispendido para a realização dos
testes de sensibilidade aos antimicrobianos a fim de guiar a terapia antimicrobiana é de
fundamental importância para o desfecho clínico de pacientes com infecções graves.
A introdução dos sistemas de automação disponíveis para a determinação do teste de
sensibilidade possibilitou a redução do tempo para obtenção destes resultados (Sanders, 2000).
Entretanto, resultados equivocados podem ter sérias implicações no desfecho clínico do paciente
(Micek et al., 2005; Jorgensen & Ferraro, 2009). Diversos estudos reportaram falhas nestes
sistemas, especialmente envolvendo P. aeruginosa e enterobactérias testados contra agentes βlactâmicos, inclusive carbapenens (Sader et al., 2006; Steward et al., 2003). Sugere-se que
estes fatos possam ocorrer, ao menos em parte, devido ao efeito da densidade do inóculo e ao
período de incubação empregado pelos sistemas (Bratu et al., 2005). Markelz e colaboradores
(2011) também avaliaram a acurácia dos diversos sistemas automatizados na detecção da
sensibilidade de isolados do complexo A. calcoaceticus-baumannii aos carbapenens. Neste
61
estudo os autores relatam resultados bastantes discrepantes quando foram interpretados
utilizando-se os pontos de corte recomendado pelo EUCAST ou pelo CLSI (Markelz et al., 2011).
Além desta limitação, os testes de sensibilidade aos carbapenens podem falhar na
acurácia em predizer o desfecho clínico. A categoria de sensibilidade, segundo o documento do
CLSI (CLSI, 2014) implica que o isolado bacteriano é inibido pelas concentrações usualmente
alcançadas do agente antimicrobiano quando a dose recomendada para tratar o sítio de infecção
é administrada. Porém, diversos isolados de Enterobacteriaceae produtores de carbapenemases
(KPC, NDM, VIM e OXA-48) são considerados como sensíveis quando estes pontos de corte são
empregados, colocando em risco o uso da terapia adequada e consequentemente o sucesso
clínico. O sucesso clínico raramente é atingido quando o carbapenem é utilizado como
monoterapia no tratamento de infecções causadas por estes micro-organismos (Nordmann &
Poirel, 2013; Weisenberg et al., 2009; Cornaglia et al., 2011; Nordmann et al., 2011). Entretanto,
quando a diminuição de sensibilidade a um ou mais compostos do grupo dos carbapenens
ocorre devido a impermeabilidade de membrana externa associada à produção de ESβL ou
AmpC, a utilização de carbapenem como terapia antimicrobiana definitiva pode ser adequada
(Endimiani et al., 2010). Desta forma, a detecção da presença de carbapenemases, ao menos
em enterobactérias, é fundamental não apenas para fins epidemiológicos e controle de infecção,
mas também para dirigir a terapia antimicrobiana a ser empregada, especialmente, em infecções
graves e pacientes imunocomprometidos ou com agravantes comorbidades.
Nas enterobactérias, a sensibilidade aos diferentes compostos do grupo dos
carbapenens pode diferir deveras entre os isolados com diferentes mecanismos de resistência, a
até mesmo entre aqueles que produzem as mesmas carbapenemases. O teste de triagem
utilizando o disco de ertapenem é o indicador mais sensível da produção de carbapenemases,
porém, quando testes dilucionais são utilizados, os valores das CIMs de imipenem, meropenem
e doripenem podem ser úteis para a detecção destes micro-organismos (Levy Hara et al., 2013).
62
Apesar da elevada sensibilidade, o emprego do ertapenem na triagem de enterobactérias
produtoras de carbapenemases demonstra baixa especificidade, uma vez que a resistência a
ertapenem e sensibilidade a imipenem e meropenem ocorre também em isolados que
apresentam impermeabilidade de membrana externa e produção de ESβBL ou AmpC (Anexo 1).
O CLSI e o EUCAST recomendam que a suspeita de enterobactérias produtoras de
carbapenemases ocorra quando estes isolados apresentem diminuição de sensibilidade para um
ou mais carbapenens, e que testes confirmatórios devem ser realizados apenas para fins
epidemiológicos ou de controle de infecção. A mesma recomendação foi realizada pela ANVISA,
em 2013, porém, compondo seus critérios com dados tanto do CLSI como do EUCAST. Estes
pontos de corte podem ser observados na Tabela 5.
Tabela 5. Pontos de corte utilizados para triagem e para classificação da sensibiliade de
enterobactérias recomendados pelo EUCAST e CLSI.
Halo de inibição (mm) com disco
10 µg
CIM (µg/mL)
EUCAST
CLSI
ANVISA
Ponto de corte
S/I
Ponto de corte
triagem
Ponto de corte
S/I
Ponto de corte
triagem
Meropenem
≤2
> 0,12
≥ 22
< 25
Imipenem
≤2
>1
≥ 22
< 23
Ertapenem
≤ 0,5
> 0,12
≥ 25
< 25
Meropenem
≤1
≥2
≥ 23
≤ 22
Imipenem
≤1
≥2
≥ 23
≤ 22
Ertapenem
≤ 0,5
≥1
≥ 22
≤ 21
Meropenem
≤1
≥2
≥ 23
≤ 22
Imipenem
≤1
≥2
≥ 23
≤ 22
Ertapenem
≤ 0,5
≥1
≥ 25
≤ 24
63
O CLSI e o EUCAST, além de diferirem quanto aos valores de triagem, também
recomendam distintos testes fenotípicos confirmatórios, e apenas convergem quanto ao valor
dos testes moleculares como padrão-ouro na determinação e caracterização das
carbapenemases (CLSI, 2014; EUCAST, 2013). O EUCAST, assim como a ANVISA, adotou o
teste fenotípico de disco combinado com diferentes inibidores, enquanto que o CLSI recomenda
a realização do MHT, até o presente momento (ANVISA, 2013).
2.5.2. Teste de Hodge Modificado
Em 1971, Orstavik & Odegaard descreveram um teste fenotípico para a detecção de
isolados de S. aureus produtores de penicilinases. Este foi denominado de teste da folha de
trevo (Cloverleft test), devido ao formato semelhante que os isolados com resultado positivo
apresentavam no ágar (Orstavik & Odegaard, 1971). O teste foi utilizado por Hodge e
colaboradores (1978) para detecção de penicilinase em isolados de Neisseria gonorrhoeae
(Hodge et al., 1978). Em 2009, o CLSI recomendou que o teste, modificado para a detecção de
carbapenemases, fosse realizado para os isolados de enterobactérias com diminuição de
sensibilidade a um ou mais carbapenens e resistentes às cefalosporinas de amplo espectro
(CLSI, 2009). Porém, em junho de 2010, o mesmo comitê, reduzindo os pontos de corte para a
combinação de enterobactérias com carbapenens, passou a recomendá-lo apenas para fins
epidemiológicos e de controle de infecção (CLSI, 2010).
A simplicidade do teste tornou-o muito difundido nos laboratórios de microbiologia,
especialmente em regiões onde testes moleculares não estão facilmente disponíveis, como no
Brasil. Este teste apresenta excelente sensibilidade para detecção de carbapenemases das
classes A e D, inclusive para aquelas de baixa atividade como OXA-23 e GES-5 (Hornstein et al.,
1997; Vourli et al., 2004; Thomas et al., 2013). Entretanto, amostras produtoras de NDM, VIM e
OXA-48 podem não ser identificadas por esta metodologia (Castanheira et al., 2011). O teste
64
também apresenta baixa especificidade, especialmente, onde a prevalência de enterobactérias
produtoras de ESβL ou AmpC é elevada, uma vez que isolados com alteração de
permeabilidade associada à produção destas enzimas podem apresentar resultados falsopositivos no MHT (Anexo 1). Além disto, o teste requer um período de incubação de 16 a 20
horas na liberação dos resultados, o que leva a um retardo na liberação dos resultados e
possivelmente na adequação da terapia antimicrobiana.
2.5.3. Teste com Inibidores de Carbanemases
Na presença de inibidores específicos para as classes de carbapenemases, é possível
detectar a redução da atividade destas enzimas e aumento da sensibilidade dos isolados
bacterianos aos β-lactâmicos. Diversos testes fenotípicos foram criados e avaliados, sendo uma
opção interessante para a detecção de carbapenemases das classes A e B. Estes inibidores
também podem ser empregados na detecção de cepas produtoras de carbapenemases da
classe D, porém, como estas apresentam hidrólise fraca contra os carbapenens e outros
mecanismos de resistência associados estão presentes na amostra, o teste de inibição pode
falhar na detecção destas amostras. Recentemente, foi reportado que o avibactam apresenta
atividade inibitória também às enzimas da classe D, podendo tornar-se uma alternativa para um
teste fenotípico baseado em inibição (Huang et al., 2014). O mesmo princípio de inibição pode
ser utilizado empregando-se diferentes métodos, disco combinado, dupla difusão, fita combinada
e diferença das CIMs na presença ou ausência de determinado inibidor.
A utilização de testes inibitórios para a detecção de MβLs foi avaliada por diversos
estudos, utilizando diferentes inibidores e substratos. Yong e colaboradores (2002) observaram
100% e 95,7% de sensibilidade para P. aeruginosa e A. baumannii, respectivamente, quando o
disco combinado de EDTA-Imipenem foi empregado (Yong et al., 2002). Corroborando com
estes achados, Picão e colaboradores (2008) realizou um estudo avaliando separadamente
65
diferentes metodologias, substratos e concentrações de inibidores contra isolados de P.
aeruginosa, A. baumanni e enterobactérias produtoras de diferentes MβLs (GIM, IMP, SIM, SPM
e VIM) e concluiu que o disco combinado utilizando imipenem e ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) é uma excelente estratégia para enterobactérias. Enquanto que a dupla-difusão
utilizando ácido 2-mercaptopropiônico com 20 mm de distância dos discos de imipenem e
ceftazidima foi uma ótima estratégia para detecção destas enzimas em A. baumannii e P.
aeruginosa, respectivamente (Picão et al., 2008). Mais recentemente, outros estudos
demonstraram a habilidade da combinação EDTA-Imipenem em detectar a presença de NDM-1
em bactérias Gram-negativas (Solanki et al., 2013; Bonnin et al., 2012). Entretanto, resultados
falso-positivos, com isolados produtores de AmpC e ESβL, e falso-negativos, com isolados
produtores de VIM, foram descritos (Huang et al., 2014; Cassu-Corsi et al., 2014). A vantagem
do método é a simplicidade de sua execução e alta sensibilidade, entretanto, assim como o
MHT, requer um período prolongado de incubação (16-20 horas).
Da mesma forma, os excelentes resultados obtidos utilizando-se a inibição de imipenem
ou meropenem com ácido fenil borônico para detecção de carbapenemases da classe A,
especialmente KPC, fizeram deste teste uma opção para os laboratórios de microbiologia.
Entretanto, isolados coprodutores de AmpC e/ou ESβL, podem apresentar resultados falsopositivos, uma vez que o ácido fenil borônico também é um potente inibidor de enzimas de
classe A e C (Tsakris et al., 2009; Pasteran et al., 2009). Baseando-se nos mesmos princípios,
fitas comerciais estão disponíveis utilizando as combinações de meropenem e meropenem/ácido
fenil borônico, e, imipenem e imipenem/EDTA para a detecção de carbapenemases das classes
A e B, respectivamente. Os estudos que avaliaram estes produtos mostraram bons resultados de
sensibilidade e especificidade para enzimas da classe A (sensibilidade 92%, especificidade 97%)
e classe B (sensibilidade 94%, especificidade 95%) (Walsh et al., 2002; Girlich et al., 2013;
Bonnin et al., 2012).
66
Em dezembro de 2013, o EUCAST publicou um documento recomendando a detecção e
confirmação da produção de carbapenemases em isolados de enterobactérias, apenas para fins
epidemiológicos ou de controle de infecção. Neste documento, após a triagem com disco (halo <
25 mm) ou CIM (> 0,12 µg/mL) de meropenem, combinações deste antimicrobiano com e sem
adição de ácido fenil borônico (PBA ou ácido aminofenil borônico; APBA), de cloxacilina, e de
ácido dipicolínico ou EDTA devem ser comparadas quanto ao halo de inbição e interpretadas
com diferentes critérios (EUCAST, 2013). De forma semelhante, porém, com algumas
modificações, a ANVISA recomenda em todo território nacional que testes com inibidores sejam
utilizados para os mesmos fins (ANVISA, 2013). As limitações destes testes são a incapacidade
de detecção de enzimas da classe D em qualquer isolado bacteriano, e da classe A em presença
de isolados co-produtores de AmpC, plasmidiais ou cromossomais, o que limita sua utilização
entre algumas espécies de enterobactérias.
Recentemente, Woodford e colaboradores (2014) publicaram um estudo demonstrando
a utilidade da temocilina como marcador da presença de OXA-48 entre isolados de
enterobactérias (Woodford et al., 2014). Associado a este fato, Huang e colaboradores (2014)
propuseram um teste de inibição utilizando a temocilina como substrato e o novo e potente
inibidor de β-lactamases das classes A, C e algumas representantes da classe D, o avibactam.
Os resultados foram promissores, uma vez que, usando o critério de inibição de ≥ 8 mm,
alcançou 97% de sensibilidade e 93% de especificidade para detecção de OXA-48 (Huang et al.,
2014). Porém, como para todos os testes com inibidores, os métodos moleculares ainda são
recomendados para a confirmação e determinação da enzima presente.
2.5.4. Testes Genotípicos
Os testes moleculares são considerados como padrão-ouro para a detecção e
caracterização dos genes que codificam as carbapenemases. Os testes realizados da colônia
67
bacteriana podem gerar resultados em 2 a 6 horas. A reação em cadeia da polimerase (PCR)
pode ser realizada para detectar um único alvo ou múltiplos, e ser realizada em três etapas,
extração, amplificação e detecção com gel de agarose (PCR convencional); em duas etapas,
extração e amplificação/detecção em tempo real (RT-PCR); ou, mais recentemente, em uma
única etapa, onde plataformas totalmente automatizadas são utilizadas (amostra-resultado).
Devido à grande diversidade das carbapenemases, em geral, as reações são direcionadas a um
grupo de enzimas, por exemplo, grupo VIM, grupo KPC, grupo IMP, grupo NDM, grupo OXA-23
(Poirel et al., 2011b; Monteiro et al., 2012; Mendes et al., 2007).
Algumas plataformas comerciais compreendendo uma grande variedade de enzimas em
um mesmo teste já encontram-se disponíveis (Hyplex, CheckPoints) e outras em
desenvolvimento (Film array, X-pert Carba-R). Cada uma apresenta diferentes genes alvos e
devem ser avaliadas com cuidado antes de sua implantação. Entretanto, estes testes não estão
isentos de limitações, a principal delas é a incapacidade de detectar novas enzimas, ou variantes
com mutações no sítio de anelamento dos iniciadores, seu custo e necessidade de profissionais
especializados (Levy Hara et al., 2013). Podem ainda detectar variantes que não apresentem
cinética compatível com outras carbapenemases do mesmo grupo (Poirel et al., 2012).
Recomenda-se que um resultado negativo nos testes moleculares com fenótipo de resistência
aos carbapenens seja confirmado por métodos que detectem atividade enzimática, como a
espectrofotometria (Cohen Stuart et al., 2010). Ainda que, raramente, diversos eventos podem
interferir na expressão de um gene. A detecção do gene que codifica determinada enzima pode
não garantir a sua expressão e a compatibilidade com o fenótipo observado (Pellegrino et al.,
2008). Para fins epidemiológicos, a identificação do gene da β-lactamase ainda requer o
sequenciamento integral de sua região codificadora, e a comparação da sequência obtida com
os bancos de dados, como o National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Queenan &
Bush, 2007).
68
2.5.5. Testes Baseados na Detecção da Atividade Enzimática
Os testes baseados na detecção da atividade enzimática são considerados referência
entre os testes fenotípicos. São capazes de detectar novas enzimas ou variantes que
apresentem o perfil cinético procurado, por exemplo, de carbapenemase, utilizando-se o
respectivo substrato. Podem ainda ser associados aos inibidores de β-lactamases para a
determinação de sua classe molecular. O primeiro teste disponível foi a espectrofotometria. Mais
recentemente, a espectrometria de massa e a detecção da atividade enzimática pela colorimetria
foram propostas.
2.5.5.1. Testes Colorimétricos (Carba NP, CarbAcineto NP e Blue-Carba)
O teste CarbaNP basea-se na detecção bioquímica da atividade enzimática contra
imipenem, através da mudança de pH gerada pela reação de hidrólise do anel β-lactâmico e
seguida da visualização colorimétrica, utilizando-se o indicador de pH vermelho-fenol (Nordmann
et al., 2012). O teste apresentou elevada sensibilidade e especificidade para detecção de
carbapenemase em P. aeruginosa (94% e 100%, respectivamente) e enterobactérias (100%),
não apresentando resultados falso-positivos para a combinação de impermeabilidade de
membrana externa com a produção de ESβL ou AmpC (Dortet et al. 2012, Nordmann et al.,
2012). Entretanto, o teste falhou na detecção de variantes da família GES e OXA-48,
possivelmente pela baixa atividade de carbapenemase destas enzimas (Dortet et al., 2012; Tijet
et al., 2013). Tijet e colaboradores (2014) observaram dois resultados falso-negativos, uma P.
rettgeri produtora de NDM-1 e um P. mirabilis produtor de IMP-27, quando este teste foi
empregado. Os autores atribuiram estes resutados ao fenótipo mucóide da primeira e a
formação do chamado véu da segunda cepa, com consequente lise celular incompleta (Tijet et
al., 2014). Entretanto, a expressão destes genes não foi avaliada.
69
Com o objetivo de superar as dificuldades na detecção de CHDLs, Dortet e
colaboradores (2014) aprimoraram o teste Carba NP com modificações no inóculo bacteriano e
na solução de lise, chamando o de CarbAcineto NP. Importante ressaltar que as colônias
utilizadas para os testes foram cultivadas por uma noite em tryptic soy agar (TSB) (Dortet et al.,
2014). Neste estudo, os autores reportaram a detecção de todos os isolados produtores de
CHDLs, com exceção de três isolados apresentando resistência aos carbapenens em
decorrência da hiperexpressão da enzima OXA-51 pela presença da ISAba1 a montante do gene
blaOXA-51, além de oito isolados produtores de carbapenemases do tipo GES (GES-11 e GES-14).
A vantagem deste teste é a possibilidade de se obter um resultado em duas horas e a
simplicidade de sua execução, pois não requer o uso de equipamentos. Este teste será
recomendado para detecção rápida de carbapenemases no próximo documento do CLSI em
2015 e futuramente terá um kit comercialmente disponibilizado pela bioMérieux.
Uma modificação no teste CarbaNP foi proposta recentemente por Pires e colaboradores
(2013). A vantagem deste em relação ao CarbaNP é a possibilidade de detecção da atividade de
carbapenemase diretamente da colônia bacteriana, sem a necessidade de lise celular. Segundo
os autores, esta modificação foi alcançada pela substituição do indicador vermelho-fenol pelo
azul de bromotimol, com pH ótimo variando de 6,0 a 7,6 o que possibilita a melhor atividade
enzimática das carbapenemases (pH 6,8) (Pires et al., 2013). Entretanto, uma maior variação
das possíveis colorações do teste negativo e positivo pode ser um fator de dificuldade na prática,
de azul para amarelo, de verde para amarelo ou ainda de azul para verde, respectivamente. O
teste apresentou 100% de sensibilidade e especificidade para carbapenemases das classes A, B
e D, revelando o resultado entre 30 minutos e 2 horas, entretanto nenhuma variante de GES foi
testada (Pires et al., 2013).
70
2.5.5.2. Espectrofotometria
Este método é utilizado para a detecção da atividade hidrolítica de diversos substratos,
inclusive carbapenens, utilizando a luz ultravioleta em comprimentos de ondas específicos para
cada substrato, em um equipamento de espectrofotometria. O teste, utilizado nos laboratórios de
referência, é capaz de detectar e quantificar a velocidade da reação de hidrólise. Entretanto, é
um método trabalhoso, que requer o crescimento bacteriano em meio líquido por 16 a 20 horas,
a extração do conteúdo proteico e visualização em tempo real da curva de hidrólise após mistura
com o substrato. Bernabeu e colaboradores (2012) reportaram 100% de sensibilidade e 98,5%
de especificidade para detecção de carbapenemases (Bernabeu et al., 2012). Porém, isolados
produtores de carbapenemase com baixa atividade hidrolítica podem não ser detectados a não
ser que intensos inóculos sejam utilizados e maiores períodos de avaliação sejam utilizados
(Queenan & Bush, 2007).
2.5.5.3. Espectrometria de Massa - MALDI-TOF MS
A espectrometria de massa através da técnica de MALDI-TOF MS foi inicialmente
utilizada para a detecção da atividade enzimática de carbapenemases por dois pesquisadores
europeus, concomitantemente (Hrábak et al., 2011; Burckhardt & Zimmermann, 2011). O
princípio do teste baseia-se na detecção dos produtos de degradação do antimicrobiano em
questão e do desaparecimento de sua molécula íntegra após a incubação com bactérias
produtoras de carbapenemase. A metodologia requer que esta solução, depositada em
superfície sólida, seja misturada a uma matriz, que confere carga às moléculas do
antimicrobiano presentes na amostra e as cristalizam. Estas, através da incidência do laser,
sofrem um processo de dessorção, ou seja, desprendimento da superfície onde se encontram e
adentram um campo elétrico a vácuo, onde um detector no final do campo negativo atrairá as
moléculas ionizadas positivamente (Fenselau & Demirev, 2001). Estas migraram pelo campo
71
elétrico até alcançarem o detector, com velocidades inversamente proporcionais às suas massas
(tempo de vôo). Todo este processo ocorre de forma muito rápida, em menos de 1 minuto por
amostra.
A calibração prévia com moléculas de massas conhecidas na faixa de detecção da
amostra em questão é necessária para que o equipamento converta o tempo de vôo adquirido
pelo detector em picos no espectro de massa/íon (m/z) correspondente (Fenselau & Demirev,
2001). Outros importantes fatores relacionados à técnica são: (i) a capacidade das moléculas
presentes na amostra em adquirir cargas elétricas, pois moléculas com maior capacidade terão
maior chance de dessorção e alcançarão o detector em maior quantidade resultando em pico de
maior intensidade, sendo importante a razão entre amostra e matriz; (ii) a quantidade de amostra
presente; (iii) a intensidade e a frequência do laser empregada sobre a amostra, o que relacionase também com a capacidade e frequência com que as moléculas alcançarão o detector; (iv) o
ajuste do intervalo de valores de m/z utilizado para a obtenção do espectro; e, (v) a automação
da aquisição do espectro através de software, que torna o espectro obtido menos subjetivo
(Fenselau & Demirev, 2001). Portanto, todos estes fatores podem interferir na qualidade da
aquisição dos espectros e impedem a quantificação direta de cada pico presente na amostra por
esta metodologia.
Apesar do espectro fornecer uma intensidade do pico, é importante ressaltar que esta
intensidade é relativa aos demais picos presentes na mesma amostra. Portanto, não é uma
técnica quantitativa, e sim qualitativa, sendo que os critérios adotados até a presente data para
categorizar os resultados em positivos ou negativos baseiam-se na presença ou ausência de
determinados picos de massa esperados (Hrábak et al., 2014). A técnica requer ainda a
expertise na interpretação dos resultados, uma vez que o conhecimento prévio das massas das
moléculas intactas, de seus aditivos em solução (moléculas de Na+, K+ e/ou H+), e dos produtos
correspondentes após a reação de hidrólise são requeridos para a interpretação dos resultados
72
(Zboromyrska et al., 2014). As empresas, fabricantes dos equipamentos atualmente disponíveis,
estão desenvolvendo uma programação que permita a identificação automática da atividade
enzimática para facilitar a sua implantação nos laboratórios de rotina.
As vantagens desta metodologia são: (i) a rapidez com que o teste fornece um
resultado. O tempo requerido refere-se ao período de incubação das amostras com a solução
contendo o antimicrobiano para que a reação ocorra, este tempo é dependente da capacidade
da enzima em hidrolizar o substrato, da quantidade do inóculo e da concentração do
antimicrobiano adicionado; (ii) a capacidade de detectar qualquer enzima que apresente
capacidade de hidrolisar o substrato, seja esta conhecida ou não; e, (iii) uma vez adquirido o
equipamento, o teste para detecção de carbapenemase requer poucos insumos e de baixo custo
(Kostrzewa et al., 2013). Entre suas limitações, pode-se citar: (i) a incapacidade do teste de
identificar a enzima presente, porém, esta limitação pode ser superada, em parte, pela a adição
de inibidores específicos, resultando na classificação desta enzima quanto à sua classe; (ii) a
necessidade de profissionais capacitados para interpretação dos resultados, fator que deve ser
superado no futuro próximo, com a automação da análise e interpretação dos resultados; e (iii) a
realização apenas em laboratório que disponha do equipamento de MALDI-TOF MS (Kostrzewa
et al., 2013).
A acurácia desta metodologia foi avaliada por Burckhardt e Zimmermann (2011) para
detecção de carbapenemases utilizando um ensaio com ertapenem. Neste, uma alça
bacteriológica de 10 µL contendo as colônias bacterianas crescidas por uma noite em ágar
sangue foi adicionada a 1 mL de solução de NaCl 0,45%, com ou sem 0,5 g/L de ertapenem. A
mistura foi então incubada a 36°C por até 2 horas e meia. A solução foi centrifugada e analisada
no equipamento de MALDI-TOF MS após adição da matriz (HCCA). Os autores detectaram a
atividade de carbapenemase em todos os isolados testados (n=47), os quais consistiam em
enterobactérias e P. aeruginosa produtoras de diferentes carbapenemases (NDM-1, IMP-1 e
73
IMP-2, KPC-2, VIM-1 e VIM-2). O tempo de incubação para a detecção de diferentes enzimas
variou de 1 hora para IMP-1 e NDM-1, 1 hora de meia para IMP-2, KPC-2 e VIM-1, e de 2 horas
e meia para VIM-2 (Burckhardt & Zimmermann, 2011).
No mesmo período, Hrábak e colaboradores (2011) avaliaram a acurácia da
metodologia, agora empregando como substrato o meropenem. Os resultados obtidos no
MALDI-TOF MS foram comparados àqueles obtidos por espectrofotometria. A solução na qual foi
diluida o meropenem, Tris-HCl 20 mM com pH 6,8, diferiu daquela utilizada pelo estudo anterior,
assim como o calibrante. Neste estudo o pico correspondente ao próprio meropenem foi utilizado
como calibrante, enquanto que no primeiro estudo, os picos conhecidos da matriz HCCA foram
utilizados com este propósito. Outras diferenças foram o meio de crescimento bacteriano
previamente a execução do teste, que neste estudo foi o Müeller-Hinton ágar, o inóculo
bacteriano, escala 8 de MacFarland, a matriz utilizada, ácido 2,5-dihidroxi-benzóico (DHT), e o
tempo de incubação de 3 horas. Excelentes resultados foram obtidos (97% de especificidade e
98% de sensibilidade) quando foram testados 14 isolados de P. aeruginosa e 16 isolados de
diferentes espécies de enterobactérias, sendo todos produtores de carbapenemases (VIM, IMP,
NDM-1 e KPC-2). Apenas um resultado falso-negativo foi observado em P. aeruginosa produtora
de VIM-2 e dois resultados falso-positivos em P. aeruginosa resistente a carbapenem. Segundo
os autores, não foi possível a visualização do pico correspondente à molécula do meropenem
degradado (Hrábak et al., 2011). Frente a estes únicos estudos publicados, com inúmeras
variações metodológicas entre si, iniciamos a padronização do teste para a detecção de
carbapenemase com isolados produtores de enzimas não antes testadas pelos estudos
apresentados. Adicionalmente, a padronização de um protocolo para identificação precoce de
micro-organismos causadores de ICS, e que permitisse a detecção de atividade de
carbapenemase diretamente do frasco de hemocultura foi o segundo objetivo deste estudo.
74
Objetivos
3. OBJETIVOS
75
Objetivos
 Padronizar a detecção de carbapenemase pela técnica de espectrometria de massa por
MALDI-TOF MS;
 Avaliar a acurácia da metodologia na detecção de carbapenemases em isolados clínicos
de bacilos Gram-negativos;
 Padronizar a detecção de carbapenemases e identificação bacteriana diretamente de
amostras de hemocultura de pacientes com ICS pela técnica de espectrometria de
massa por MALDI-TOF MS.
76
Artigos Científicos
4. ARTIGOS CIENTÍFICOS
77
Artigos Científicos
4.1. Artigo Científico 1. Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and
Class D β-Lactamase-Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry. Publicado em Janeiro de 2013 no periódico Journal of
Clinical Microbiology - JCM, volume 51, número 1, páginas 287-290. Os resultados parciais
desse estudo também foram apresentados na forma de poster (D-731a) na seção de MALDI-ToF
Mass Spectrometry and Identification and Susceptibility Testing no 52th Interscience Conference
on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC, realizado no período de 9 a 12 de setembro
de 2012 na cidade de San Francisco, EUA.
4.2. Artigo Científico 2. Detection of carbapenemase activity directly from blood culture
vials using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision. Publicado em Agosto de
2014 no periódico Journal of Antimicrobial Chemotherapy - JAC, volume 69, número 8, páginas
2132-2136. Os resultados parciais desse estudo também foram apresentados na forma de
eposter (eP680) na seção de Rapid detection of carbapenemases no 23th European Congress of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID, realizado no período de 27 a 30 de Abril
de 2013 na cidade de Berlin, Alemanha.
4.3. Artigo Científico 3. Detection of carbapenemase activity using Vitek ® MS: Interplay of
carbapenemase type and period of incubation. Os resultados parciais desse estudo foram
apresentados na de pôster (D-897) na no 54h Interscience Conference on Antimicrobial Agents
and Chemotherapy - ICAAC, realizado no período de 5 a 9 de setembro de 2014 na cidade de
Washington, EUA. O presente será submetido ao periódico Jornal of Global Antimicrobial
Resistance no formato de New-Data Letter.
78
Artigo Científico 1
1
Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and Class D β-Lactamase-
2
Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid Chromatography-Mass
3
Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass
4
Spectrometry
5
6
Cecilia G. Carvalhaes,a Rodrigo Cayô,a Diego M. Assis,b Evelin R. Martins,a Luiz Juliano,b,c Maria
7
A. Juliano,b Ana C. Gales.a
8
9
aLaboratório
Alerta, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal
10
de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, São Paulo, Brazil.
11
bDepartamento
12
Paulo, Brazil.
13
cFundação
de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, São
Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo, Brazil.
14
15
*Corresponding author.
16
Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua
17
Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo - SP, Brazil. Phone/Fax.:
18
+55 11 5576-4748. E-mail: [email protected].
79
19
Abstract
20
This study evaluates the accuracy of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and
21
matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for
22
detecting carbapenem hydrolytic activity among SPM-1-, GIM-1-, and GES-5-producing
23
Pseudomonas aeruginosa isolates and OXA-143-, IMP-10-, and OXA-58-producing
24
Acinetobacter baumannii isolates. Class A and B carbapenemase activities were rapidly detected
25
by MALDI-TOF MS in a 2-h assay. However, an extended incubation time was necessary for
26
detection of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL) activity in Acinetobacter spp.
80
27
Over the last two decades, the therapeutic options to treat infections caused by Gram-
28
negative rods have been narrowed by bacterial acquisition of carbapenemase-encoding genes
29
(1). The rapid detection of clinically significant carbapenemases is important for establishing
30
adequate therapy and controlling their spread. Recently, the detection of class A or B
31
carbapenemase activity has been accomplished by matrix-assisted laser desorption ionization-
32
time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (2,3). Although MALDI-TOF MS seems to be a
33
promising tool, there is a lack of evidence showing its usefulness in testing a broader range of
34
carbapenemases. To date, the published studies have mainly focused on KPC-2- and NDM-1-
35
producing Enterobacteriaceae, IMP-1-, VIM-1-, and VIM-2-producing Pseudomonas aeruginosa,
36
and OXA-23- and OXA-24-producing Acinetobacter baumannii isolates (2–4). In the current
37
study, we evaluated the performance of the MALDI-TOF MS assay in detecting carbapenemase
38
activity of GES-5-, GIM-1-, or SPM-1-producing P. aeruginosa and IMP-10-, OXA-58-, or OXA-
39
143-producing A. baumannii isolates which had not been tested previously. The detection of
40
carbapenemase by MALDI-TOF MS was compared to that of the modified Hodge test (MHT) and
41
hydrolysis assay. Additionally, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was used to
42
confirm the results of carbapenem hydrolysis obtained by MALDI-TOF MS.
43
A total of 73 carbapenemase-producing and non-carbapenemase- producing bacterial
44
clinical isolates were studied and molecularly characterized as shown in Table 1. Generally, no
45
carbapenemase- producing isolates were susceptible to imipenem (IPM) and meropenem (MEM),
46
except for three A. baumannii isolates (one OXA-23 and two IMP-10 producers) that showed
47
imipenem and/or meropenem MICs of 4 _g/ml by the agar dilution technique (5,6). In our study,
48
MHT using ertapenem (ETP) disks (10 µg), following CLSI guidelines, detected 55%, 100%, and
49
68% of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL) and class A and class B
50
carbapenemases, respectively. No additional carbapenemase producers were identified by
51
testing with meropenem disks (7). Recently, MHT was reported to have poor sensitivity and
81
52
specificity for detecting class B and D carbapenemase activity in carbapenem-resistant A.
53
baumannii isolates (8). Indeterminate and false-positive results by MHT were observed in our
54
study
55
ESβL/ΔOmpK36 isolates, respectively, as was observed previously (9,10,11). All carbapenemase
56
isolates hydrolyzed imipenem according to a UV spectrometric assay using 100 mM phosphate
57
buffer (pH 7.0) (9).
fornon-carbapenemase-producing
P.
aeruginosa
and
Klebsiella
pneumoniae
58
The LC-MS and MALDI-TOF MS assays were performed by incubating fresh bacterial
59
inoculums from Mueller-Hinton agar plates (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom) in a buffer-
60
adjusted solution (20 mM Tris-HCl, pH 6.8) with or without serial dilutions of ertapenem (0.12 to
61
0.5 µg/ml; Merck Sharp & Dohme, NJ) for periods of 2 and 4 h. This buffer solution was selected
62
since a NaCl solution could inhibit the CHDL activity. After centrifugation, 1-_l aliquots of each
63
sample were overlaid with 1 µl of -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (HCCA; Bruker
64
Daltonics, Bremen, Germany) and spotted onto a stainless steel MALDI target plate as
65
recommended by the manufacturer. The mass spectrum was obtained by using a Bruker
66
Daltonics Microflex LT instrument operating in linear, positive ion mode and using the Flex
67
Control 3.3 software with the following instrument parameters: pulsed ion extraction delay, 30 ns;
68
ion source voltage one, 20 kV; ion source voltage two, 18.65 kV; and ion source lens voltage,
69
7.00 kV. The mass spectrometer was calibrated using the HCCA matrix peaks ([M+H]+ = 189.17;
70
[2 M+H]+ = 379.35) and bradykinin fragment 1-7 ([M+H]+ = 757.40). For each sample, mass
71
spectra were acquired by accumulating 100 laser shots at 45% to 60% laser power in the m/z
72
range of 200 to 600 Da. Carbapenem hydrolysis was considered positive if the ertapenem intact-
73
molecule mass peak (475 m/z) and that of its monosodium salt (497 m/z) disappeared completely
74
(Fig. 1A and B2) (2).
75
LC-MS was performed in an LCMS-2020 instrument equipped with an electrospray
76
ionization probe (ESI-145; Shimadzu, Kyoto, Japan). Aliquots of 15 µl from each reaction tube
82
77
were applied directly into the instrument. The analytical LC-MS conditions were as follows: an
78
XR-ODS C18 column (2 µm, 3.0 by 100 mm) was eluted with solvent system A
79
(water/trifluoroacetic acid[TFA], 1:1,000) and B (acetonitrile/water/TFA 900:100:1) at a flow rate of
80
1 ml/min and a 0-to-80% gradient for 10 min, monitored by absorbance at 220 nm. The mass
81
spectrum profile was considered positive using the same interpretative criteria established for the
82
MALDI-TOF MS assay.
83
The performance of the MALDI-TOF MS, LC-MS and hydrolysis assays in detecting class
84
A (KPC-2 and GES-5) and B (SPM-1, IMP-1, IMP-10, VIM-1, GIM-1, and NDM-1)
85
carbapenemase activity was excellent for both 2- and 4-h incubation times (100% sensitivity and
86
100% specificity). A similar result was observed by Burckhardt and colleagues, who tested an
87
ertapenem MALDITOF MS assay to detect carbapenemase activity of NDM-1, VIM-1, VIM-2, and
88
KPC-2 enzymes in P. aeruginosa isolates and Enterobacteriaceae (2). In our study, an extended
89
incubation period (4 h) was necessary to detect carbapenemase activity in 100% of the CHDL-
90
producing A. baumannii isolates, mainly due to OXA-23-producing isolates (Table 1). Probably an
91
extended incubation period was necessary for detection of the carbapenemase activity in CHDL-
92
producing isolates because these enzymes usually show a low level of carbapenem hydrolysis
93
due to poor turnover of these β-lactams, as previously noticed by Queenan and Bush (12). In
94
addition, the expression of CHDL-encoding genes is driven by an upstream-inserted insertion
95
sequence, ISAba1 (13). LC-MS confirmed all MALDI-TOF MS results. Recently, Kempf and
96
colleagues observed a similar detection rate (95% sensitivity) in a collection of OXA-23- and/or
97
OXA-24-producing A. baumannii isolates by MALDI-TOF MS using imipenem and HCCA as the
98
substrate and matrix, respectively (4). In the present study, imipenem was not selected for the
99
MALDI-TOF MS because the mass spectrum profile obtained did not show good resolution with
100
overlap of mass peaks, even when different matrices were tested. It could be due to the MALDI-
101
TOFMSsystem tested in our study, the Microflex LT instrument, since Kempf and colleagues
83
102
tested the Ultraflex I mass spectrometer. However, the Microflex LT instrument has been the
103
apparatus mostly available in the European clinical laboratories.
104
Although the hydrolysis assay yielded excellent results, this method is laborious to
105
implement in routine clinical laboratories. To our knowledge, this is the first study to evaluate the
106
performance of MALDI-TOF MS in detecting carbapenemase activity in a collection of SPM-1-,
107
GES-5-, and GIM-1-producing P. aeruginosa isolates, as well as OXA-143-, IMP-10-, and OXA-
108
58-producing A. baumannii isolates. In addition, the MALDI-TOF MS results were confirmed by
109
using LC-MS. MALDI-TOF MS is a rapid tool to detect class A and B carbapenemase activity,
110
including that of SPM-1-producing P. aeruginosa, in a 2-h assay. However, an extended
111
incubation period of 4 h must be used for detection of CHDL activity. MALDI-TOF MS has been
112
shown to be an easy, rapid, and cheap methodology for the detection of carbapenemase activity.
113
It can yield results before those of antimicrobial susceptibility testing can be available and
114
constitutes a very attractive methodology, especially for clinical laboratories that have already
115
used this technique for bacterial identification.
84
116
Acknowledgments
117
The authors declare no conflicts of interest. The study was carried out as part of our routine work.
118
A.C.G. is a researcher from the National Council for Science and Technological Development
119
(CNPq), Ministry of Science and Technology, Brazil (process number 307816/2009-5).
85
120
121
122
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153
A simple test for the detection of KPC and metallo-β-lactamase carbapenemase-
154
producing Pseudomonas aeruginosa isolates with the use of meropenem disks
155
supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin.
156
Microbiol. Infect. 17:1438-1441.
157
158
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161
expressing the blaOXA-23 gene associated with ISAba4 in Belgium. Antimicrob. Agents
162
Chemother. 52:4205-4206.
87
163
Table 1. Characterization of the 73 clinical isolates and performance of carbapenemase detection by different methodologies.
MIC range (μg/mL)
Percentage of isolates detected as carbapenemase producers (n° positive isolates/ total isolates)
n°
Isolates
ETP
IMP
MEM
MHT
IMP Hydrolysis
MALDI-TOF 2
hours
MALDI-TOF 4
hours
LCMS 2 hours
LCMS 4 hours
Oxa-23
Oxa-23 and Oxa-143
Oxa-24 and Oxa-143
Oxa-25
Oxa-26
Oxa-58
Oxa-23, Oxa-143 and IMP-1
IMP-10
31
16
4
1
1
1
3
1
3
16 - >256
256 - >256
> 256
> 256
> 256
64 - 128
> 256
8 - 128
0.5 - 128
32 - 256
256
256
256
8 - 32
256
4 - 64
56% (9/16)
100% (4/4)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
0% (0/3)
100% (1/1)
67% (2/3)
100% (16/16)
100% (4/4)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (3/3)
100% (1/1)
100% (3/3)
19% (3/16)
75% (3/4)
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/3)
100% (1/1)
100% (3/3)
100% (16/16)
100% (4/4)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (3/3)
100% (1/1)
100% (3/3)
19% (3/16)
75% (3/4)
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/3)
100% (1/1)
100% (3/3)
100% (16/16)
100% (4/4)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (3/3)
100% (1/1)
100% (3/3)
Negative control
11
2-8
4 - 64
32 - 256
128
128
128
16
128
0.5 - 31
< 0.06 0.25
0.25 - 1
0% (0/11)
0% (0/11)
0% (0/11)
0% (0/11)
0% (0/11)
0% (0/11)
KPC-2
NDM-1
8
1
1
32
128
8
64
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
100% (1/1)
ESBL/∆OmpK36a
4
0.25
0.25 - 2
8
32
<0.06 16
0% (0/4)
0% (0/4)
0% (0/4)
0% (0/4)
0% (0/4)
0% (0/4)
GES-5
GES-1
26
1
1
256
64
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/1)
100% (1/1)
0% (0/1)
11
>256
64% (7/11)
100% (11/11)
100% (11/11)
100% (11/11)
100% (11/11)
100% (11/11)
IMP-1
VIM-1
1
2
>256
256 - >256
100% (1/1)
0% (0/2)
100% (1/1)
100% (2/2)
100% (1/1)
100% (2/2)
100% (1/1)
100% (2/2)
100% (1/1)
100% (2/2)
100% (1/1)
100% (2/2)
GIM-1
4
>256
128 - 256
100% (4/4)
100% (4/4)
100% (4/4)
100% (4/4)
100% (4/4)
100% (4/4)
Negative control
6
4 - >256
0.5 - 16
256
4
64 >256
>256
256
256 >256
<0.06 32
100% (1/1)
0% (0/1)
SPM-1
16
1
128 >256
32
256
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
0% (0/6)
Bacterial Species
Enzymes
Acinetobacter baumannii
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
88
164
a. ETP, ertapenem; IPM - imipenem; MEM - meropenem; MHT - modified Hodge test; MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight
165
mass spectrometry; LC-MS - liquid chromatography-mass spectrometry.
166
b. Isolates previously characterized by Carvalhaes et al. (5).
89
167
168
Figure 1. (A) The hydrolysis of ETP mediated by β-lactamases occurs in two steps: in the first
169
step, the ETP intact molecule (475 gmol-1) suffers a rupture on its β-lactam ring, resulting in a
170
hydrolyzed ETP molecule (493 gmol-1). In the second step, the hydrolyzed ETP molecule loses a
171
carboxyl group (-CO2), resulting in a metabolite with a molecular mass of 450 g mol-1 (hydrolyzed
172
and decarboxylated ETP molecule). (B) Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS. (B1)
173
Results for a negative-control strain incubated with ETP solution which appears ionized with
174
hydrogen ([ETP + H]+ = 475 gmol-1) and its sodium adduct ([ETP + Na]+ = 497 gmol-1). (B2)
90
175
Results for a hydrolyzed and decarboxylated ETP after incubation with SPM-1-producing P.
176
aeruginosa. Arrows represent HCCA matrix peaks. (C) Analysis of ETP degradation by LC-MS.
177
(C1) Results for a negative-control strain incubated with ETP which appears ionized with
178
hydrogen ([EPT + H]+ = 476 gmol-1). (C2) Hydrolyzed and decarboxylated ETP after incubation
179
with SPM-1-producing P. aeruginosa ([ETP + H]+ = 450 gmol-1).
91
1
Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials using MALDI-TOF
2
MS: a quick answer for the right decision
3
4
Cecilia G. Carvalhaes1*, Rodrigo Cayô1, Marina F. Visconde1, Talita Barone1, Eliete A. M.
5
Frigatto2, Debora Okamoto3, Diego M. Assis3,4, Luiz Juliano3, Antonia M. O. Machado2 and Ana
6
C. Gales1.
7
8
1Laboratório
9
de São Paulo - UNIFESP, São Paulo - SP, Brazil.
10
2Laboratório
Central, Hospital São Paulo, São Paulo - SP, Brazil.
11
3Departamento
12
Brazil.
13
4Bruker
de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, São Paulo - SP,
Daltonics, Atibaia - SP, Brazil.
14
15
Short running title: Carbapenemase detection in blood cultures by MALDI-TOF MS
16
17
*Corresponding author.
18
Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua
19
Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo - SP, Brazil. Phone/Fax.:
20
+55 11 5576-4748. E-mail: [email protected].
92
21
Abstract
22
Objectives:
23
spectrometry (MALDI-TOF MS) was successfully applied for the detection of carbapenemase
24
activity directly from Gram-negative colonies. Based on this principle, we evaluated the
25
performance of MALDI-TOF MS for rapid detection of carbapenemase activity directly from
26
positive blood culture vials.
27
Methods: A total of 100 blood culture vials were randomly selected. MALDI-TOF MS
28
carbapenemase assay results were confirmed by the detection of carbapenemase-encoding
29
genes.
30
Results: A total of 110 bacterial isolates were recovered. The MALDI-TOF MS carbapenemase
31
assay identified 21 of 29 (72.4%) of the carbapenemase-producing isolates directly from the
32
blood culture vials, especially those encoding KPC-2 (100%) and SPM-1 (100%), after a 4 h
33
incubation period. Although the majority of OXA-23-producing Acinetobacter baumannii isolates
34
were not identified on day 1, all isolates were identified as carbapenemase producers directly
35
from the colony on the next day.
36
Conclusions: The MALDI-TOF MS carbapenemase assay is a feasible and rapid test to identify
37
carbapenemase activity directly from blood culture vials. It may contribute to faster readjustment
38
of empirical antimicrobial therapy and implementation of infection control measures.
Recently,
matrix-assisted
laser
desorption
ionization–time-of-flight
mass
93
39
Introduction
40
Recently, matrix-assisted laser desorption ionization-time-offlight mass spectrometry
41
(MALDI-TOF MS) has emerged as an important tool in clinical microbiology laboratories. This
42
methodology is fast, simple, accurate and cost-effective to routinely identify bacterial isolates.1 In
43
addition, it has been also applied for rapid identification of pathogens directly from positive blood
44
culture vials.2,3 However, the time required for reporting antimicrobial susceptibility results is still
45
of crucial importance for readjustment of antimicrobial therapy. Although MALDI-TOF MS has
46
been integrated into automated antimicrobial susceptibility testing platforms, these systems
47
habitually do not accurately report the carbapenem MICs for carbapenemase-producing
48
Enterobacteriaceae.4-9 Thus, the accurate detection of carbapenemase production is still
49
necessary.
50
MALDI-TOF MS has detected activity of different carbapenemases directly from bacterial
51
colonies with great specificity and sensitivity.10-12 It has the potential to detect carbapenemase
52
activity independent of the enzyme produced, including novel enzymes. Based on these facts, we
53
focused on evaluating the performance of MALDI-TOF MS for the first time to rapidly detect
54
carbapenemase activity directly from blood culture vials.
94
55
Methods
56
Standardization of bacterial pellet for carbapenemase detection. Initially, three
57
carbapenemase-producing strains (KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705,
58
SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosa 48-1997A and OXA-23-producing Acinetobacter
59
baumannii 2387-08A) and a negative control strain (K. pneumoniae ATCC BAA 1706) were
60
inoculated into four BD BactecTM Plus Aerobic blood culture bottles (Becton Dickinson, USA)
61
with an inoculum corresponding to 1000 cfu for each strain.13,14 The vials were then introduced
62
into a Bactec 9240TM blood culture system.
63
64
Clinical samples and routine blood culture procedures. After optimization of the pellet
65
extraction and carbapenemase assay detection, clinical blood culture vials were selected
66
randomly for the study during a 2 month period (October and November 2012). Routine bacterial
67
identification and antimicrobial susceptibility testing were performed by the PhoenixTM automated
68
system (Becton Dickinson, USA) and confirmed by MALDI-TOF MS and CLSI agar dilution,
69
respectively.15
70
71
Bacterial extraction for MALDI-TOF MS experiments. The investigators were blinded to Gram
72
stain results during MALDI-TOF MS experiments. The positive blood culture vials were submitted
73
to bacterial extraction, MALDI-TOF MS carbapenemase assay and bacterial identification. An
74
aliquot of 8 mL was retrieved from each positive blood culture vial on the same day that the
75
bacterial growth was flagged on the Bactec 9240TM blood culture system and placed into a sterile
76
tube containing a separator gel and clot activator (BD Vacutainer SST II AdvanceTM, Becton
77
Dickinson, USA). The tubes were centrifuged at 10,000 rpm for 10 min. The bacterial pellet was
78
visible at the outer surface of the separator gel. The supernatant was removed and the bacterial
79
pellet was washed with 1 mL of sterile water to obtain the bacterial inoculum. This mixture was
95
80
transferred to a 1.5 mL sterile tube. The clear bacterial pellet was tested for carbapenemase
81
assay following whole bacterial protein extraction for the identification procedure as previously
82
described.2,10
83
84
Detection of carbapenemase activity by MALDI-TOF MS. A fresh ertapenem solution (0.5 g/L)
85
was prepared using Tris-HCl 20 mM pH adjusted, as previous reported.10 A 500 mL aliquot of
86
ertapenem solution was added to the bacterial pellet tube, gently mixed and incubated at 37°C
87
for 2 and 4 h. The tubes were then centrifuged at 13,000 rpm for 2 min and 1 mL of the
88
supernatant was spotted onto a stainless steel MALDI target plate (Bruker Daltonics, Bremen,
89
Germany). One microlitre of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (Bruker Daltonics,
90
Bremen, Germany) was placed on each spot and allowed to dry at room temperature. A mass
91
spectrum was obtained using a Bruker Daltonics Microflex LT instrument (Bruker Daltonics,
92
Bremen, Germany) operating in accordance with the manufacturer’s instructions as
93
recommended.10 Carbapenem hydrolysis was considered positive if the corresponding
94
ertapenem intact molecule mass peak (475 m/z and its monosodium salt, 497 m/z) completely
95
disappeared.10 In each assay, a fresh inoculum of K. pneumoniae ATCC BAA1705 and of K.
96
pneumoniae ATCC BAA1706 were tested as the positive and negative controls, respectively, as
97
well as a tube containing only the ertapenem solution. The detection of carbapenemase activity
98
by MALDI-TOF MS was also performed directly from the colonies of all Gram-negative isolates to
99
confirm the initial results.
100
101
Molecular characterization of carbapenemases. PCRs targeting genes encoding KPC-like,
102
NDM-1, OXA-48, metallo-β-lactamases and carbapenem-hydrolysing class D b-lactamases
103
(CHDLs) were performed using primers previously described followed by DNA sequencing of the
104
respective amplicons.13,16-19
96
105
Results
106
During the study period, 100 blood culture vials were flagged as positive and were further
107
evaluated. Among them, the presence of two different pathogens was detected in 10 positive
108
blood culture vials resulting in a total of 110 bacterial isolates. K. pneumoniae (27; 24.5%) was
109
the most frequent pathogen isolated, followed by coagulase-negative Staphylococcus (19; 17.3%)
110
and Escherichia coli (18; 16.4%). Overall, MALDI-TOF MS correctly identified 81.8% (90/110) of
111
bacterial isolates tested directly from blood culture vials and 97.2% (107/110) after colony
112
isolation. All positive blood culture vials were submitted to carbapenemase assay, including those
113
where Gram-positive bacteria were subsequently isolated. The MALDI-TOF MS carbapenemase
114
assay detected 21 isolates as carbapenemase producers directly from blood culture vials at the
115
time of positivity (day 1). Among those, 17 isolates (13 K. pneumoniae, 2 Enterobacter cloacae, 1
116
P. aeruginosa and 1 A. baumannii) were detected within a 2 h incubation period, while the
117
remaining 4 isolates (2 K. pneumoniae and 2 A. baumannii) required an extended incubation
118
period (Table 1 and Figure 1). Among the 11 carbapenemase-producing A. baumannii isolates,
119
only 3 isolates were directly detected from blood culture vials on day 1. The eight remaining
120
isolates were successfully identified as carbapenemase producers only by testing bacterial
121
colonies on the next day (day 2), making a total of 29 carbapenemase-producing Gram-negative
122
isolates detected by MALDI-TOF MS. As expected, all Gram-positive isolates yielded negative
123
results. Molecular characterization of carbapenemase genes was performed among the Gram-
124
negative isolates (76/110; 69.1%). Among these, all 29 isolates (38.2%) detected by MALDI-TOF
125
MS as carbapenemase producers were confirmed to carry carbapenemase-encoding genes by
126
PCR and DNA sequencing (Table 1). The blaKPC-2 gene was detected in 17 Enterobacteriaceae
127
isolates (15 K. pneumoniae and 2 E. cloacae), followed by CHDL-encoding genes in 11 A.
128
baumannii isolates (blaOXA-23, n=10; blaOXA-72, n=1) and the blaSPM-1 gene in 1 P. aeruginosa
129
isolate (Table 1). The carbapenem MICs for carbapenemase-producing isolates are described in
97
130
Table 1. All CHDL-producing A. baumannii and SPM-1-producing P. aeruginosa isolates were not
131
susceptible to imipenem and meropenem by agar dilution and Phoenix. Moreover, all KPC-
132
producing Enterobacteriaceae were not susceptible to ertapenemby either methodology. In
133
contrast, 7 of 17 KPC-producing isolates were susceptible to imipenem and meropenem by the
134
Phoenix system (MIC ≤1 mg/L). According to CLSI agar dilution, only a single isolate was
135
confirmed to be resistant to meropenem (MIC 64 mg/L) while six isolates were not susceptible to
136
imipenem (MICs 2-32 mg/L).
98
137
Discussion
138
Currently, according to CLSI and EUCAST guidelines, clinical laboratories should report
139
the category of susceptibility to carbapenems without confirming the production of
140
carbapenemases, since Gram-negative bacteria may possess other mechanisms of carbapenem
141
resistance. However, automated systems habitually fail to determine carbapenem MICs for
142
carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Consequently, based only on antimicrobial
143
susceptibility results, carbapenem prescription may be disregarded, leading to the use of more
144
toxic compounds. Recently, EUCAST developed a new guideline for the detection of resistance
145
mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. Phenotypic
146
double-disc synergy tests have been recommended by EUCAST to detect carbapenemase
147
activity among Enterobacteriaceae isolates. However, these tests require an overnight incubation
148
period and molecular confirmation of the results is usually necessary. Molecular-based methods,
149
although more rapid and accurate, are unable to detect new carbapenemase-encoding genes,
150
require a high degree of expertise and are still expensive for routine use in some geographic
151
regions. In addition, the detection of a carbapenemase-encoding gene by PCR does not
152
guarantee its expression.20 MALDI-TOF MS is the latest advance to detect carbapenemase
153
activity. Recently, it was successfully employed to identify carbapenem hydrolysis products
154
directly from Gram-negative bacterial colonies.10-12 In our study, we report for the first time that
155
MALDI-TOF MS was able to detect carbapenemase activity directly from positive blood culture
156
vials for all KPC-2-producing and SPM-1-producing isolates. This is in accordance with previous
157
studies that demonstrated the high sensitivity (100%) and specificity (100%) of MALDI-TOF MS
158
for detecting the carbapenemase activity of KPC-2-, KPC-3- or SPM-1-producing isolates from
159
bacterial colonies.10-12 In contrast, the detection of CHDL activitywas not so easily achieved with
160
this methodology. Carbapenem resistance in Acinetobacter spp. is mainly mediated by the
161
production of CHDLs.21,22 In our study, all but one CHDL detected was OXA-23, which is the most
99
162
disseminated CHDL in A. baumannii worldwide.23 The majority of CHDLs weakly hydrolyse
163
carbapenems, which may compromise their detection by susceptibility testing and other
164
phenotypic tests. Therefore, PCR-based methods remain the “gold standard” for the identification
165
of CHDLs.22 In our study, the MALDI-TOF MS methodology was able to identify the
166
carbapenemase activity of all CHDL-producing Acinetobacter spp. isolates only when bacterial
167
colonies were tested and the assay was incubated for an extended period (4 h) as previously
168
observed.10 Therefore, MALDI-TOF MS may constitute an alternative to PCR-based methods for
169
the detection of CHDLs, but only after isolation of bacterial colonies.
100
170
Conclusions
171
MALDI-TOF MS has been revolutionizing bacterial identification in clinical laboratories, especially
172
due to its simplicity and rapid turnaround time. Similarly, the detection of carbapenemase activity
173
by MALDI-TOF MS directly from clinical blood culture vials may provide a quick answer for faster
174
readjustment of antimicrobial therapy and implementation of infection control measures. In
175
summary, MALDI-TOF MS empowers clinical laboratories to address a clinical demand for faster
176
results.
101
177
Acknowledgements
178
This work was presented in part as an ePoster (eP680) at the Twenty-third European Congress
179
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, Germany, 2013. We thank Dr Jussimara
180
Monteiro and Dr Lygia Schandert for their valuable support during initial tests.
181
182
Funding
183
The study was carried out as part of our routine work. A. C. G. is a researcher from the National
184
Council for Science and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and
185
Technology, Brazil (Process number: 307816/2009-5).
186
187
Transparency declarations
188
D. M. A. is an employee of Bruker Daltonics, Brazil, but he does not own stocks or options in the
189
company. A. C. G. has received research funding and/or consultation fees from Janssen-Cilag,
190
Wyeth/Pfizer, Novartis and Sanofi-Aventis. All other authors: none to declare.
102
191
192
193
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105
258
259
Figure 1. Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS from carbapenemase-producing
260
isolate and non-carbapenemase-producing isolate. (A) Results for a non-carbapenemase
261
producing K. pneumoniae incubated with ETP solution which appears ionized with hydrogen
262
([ETP+H] = 475 g mol-1) and its sodium adduct ([ETP+Na] = 497 g mol-1) (light grey bars). The
263
hydrolyzed and decarboxylated ETP corresponding mass peak ([M+H = 449] – dark grey bars
264
may be present. The inserted structure represents the intact ETP. (B) Results for a hydrolyzed
265
and decarboxylated ETP ([M+H = 449] – dark grey bars) represented by inserted structure after
266
incubation with SPM-1-producing P. aeruginosa Arrows indicate the β-lactam ring where the
267
hydrolysis and decarboxylation reactions occur. Note that [ETP+H] = 475 g mol -1 and its sodium
268
adduct [ETP+Na] = 497 g mol-1 (light grey bars) have complete disappear.
106
269
Table 1. Carbapenem susceptibility profile and time in days for detection of carbapenemase-producing isolates by MALDI-TOF MS.
Isolates detected as carbapenemase
producers by MALDI-TOF MS (n°)
MIC range (µg/mL)
Enzyme
Microrganism (n°)
KPC-2
Phoenix system
Agar dilution
Day 1a
Day 2b
ERT
IMI
MER
ERT
IMI
MER
2h
4h
2h
4h
K. pneumoniae (15)
>4
<=1 - >8
<=1 - >8
2 - >256
1 - 128
1 - 128
13
15
15
15
KPC-2
E. cloacae (2)
>4
>8
>8
>256
64 - 128
128
2
2
2
2
SPM-1
P. aeruginosa (1)
-
>8
>8
64
32
16
1
1
1
1
OXA-23
A. baumannii (10)
-
>8
>8
32 - 256
8 - 128
8 - 64
0
2
9
10
OXA-72
A. baumannii (1)
-
>8
>8
>256
64
128
1
1
1
1
270
ETP, ertapenem; IPM, imipenem; MEM, meropenem.
271
a.Day 1, direct from positive blood culture vials.
272
b.Day 2, direct from bacterial colony.
107
1
Detection of carbapenemase activity using VITEK® MS: Interplay of carbapenemase type
2
and period of incubation
3
4
Cecilia Godoy Carvalhaesa,b*, Ana Carolina Ramos da Silvaa, Ana Paula Strelinga, Rodrigo
5
Cayôa, Anna Carolina Rockstrohc, Antonia Maria Oliveira Machadob, Ana Cristina Galesa.
6
7
Short running title: Carbapenemase detection by VITEK® MS.
8
9
aLaboratório
10
de São Paulo - UNIFESP/EPM, São Paulo - SP, Brazil.
11
bLaboratório
12
Medicina, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP/EPM, São Paulo - SP, Brazil.
13
cbioMérieux
de Microbiologia Clínica, Disciplina de Medicina Laboratorial, Departamento de
do Brasil, Brooklin Novo, Rua Ponta Delgada, São Paulo - SP, Brazil.
14
15
*Corresponding author. Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São
16
Paulo - UNIFESP, Rua Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo -
17
SP, Brazil. Phone/Fax.: +55 11 55764748. E-mail: [email protected].
108
18
Dear Editor,
19
Recently, carbapenemase activity of Gram-negative bacilli has been detected by matrix-
20
assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (1-3). This
21
method relies on the modification of mass spectrum profile of the carbapenem molecule by
22
carbapenemases (4). Most studies have evaluated ertapenem hydrolysis by testing the Microflex
23
LT instrument (Bruker Daltonics, Dremen, Germany) (1,4,6-8). To the best of our knowledge, only
24
one recently published study evaluated the detection of carbapenemase activity by using VITEK®
25
MS instrument (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) (5). The authors reported a lack of sensitivity
26
(87%) by testing imipenem as substrate. Recently, we have accessed the performance of VITEK®
27
MS for detection of carbapenemase activity by testing a well characterized collection of
28
carbapenemase-producing strains against ertapenem activity. In addition, since carbapenem
29
hydrolysis may depend on many factors, especially carbapenemase type and time required for
30
complete β-lactam hydrolysis (4), the interplay among different classes of carbapenemases and
31
period of incubation required for carbapenemase detection by VITEK® MS instrument were also
32
addressed in the present study.
33
A collection of 73 carbapenem-producing and 28 non-carbapenemase-producing Gram-
34
negative clinical isolates, previously characterized, were evaluated (Table 1) (4,9). The MALDI-
35
TOF MS carbapenem hydrolysis assays were performed incubating 1 µL loop of fresh bacterial
36
colonies from Müeller-Hinton agar plates (bioMérieux S/A, Rio de Janeiro, Brazil) in 100 µL of a
37
buffer adjusted solution [Tris-HCl 20 mM pH 6.8] with or without ertapenem (ETP 0.25 µg/mL;
38
Merck Sharp & Dohme, NJ, USA), as previously described (4). The mass spectrum was obtained
39
by VITEK® MS instrument using SARAMIS software v.4.1.2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France)
40
operating in linear, positive ion mode. Mass spectra were acquired by accumulating 200 laser
41
shots at 50-55% laser power in the m/z range of 400 to 600 Da, after instrument calibration using
42
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (HCCA; bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) and
109
43
ertapenem solution. Carbapenem hydrolysis was considered positive if the ertapenem intact-
44
molecule mass peak ([M+H+], 476 m/z) and that of its monosodium salt ([M+Na+], 498 m/z)
45
completely disappeared.
46
The majority of classes A (62%) and B (61%) carbapenemase-producing isolates could
47
be detected after 15 minutes of incubation. Increasing detection rates of carbapenemase-
48
producing isolates were directly proportional to the incubation period for all β-lactamases classes,
49
with significant improvement after 60 minutes of incubation for class A (95%) and B (87%)
50
carbapenemases. Corroborating the findings of previous studies, all carbapenem-hydrolyzing
51
class D β-lactamases (CHDLs) could be detected only after a 4h-incubation period, including an
52
Acinetobacter baumannii isolate possessing ISAba1 upstream blaOXA-51 (Fig. 1) (4,10). All KPC-2-
53
producing isolates and all metallo-β-lactamases (MβL)-producing isolates, except for one IMP-1-
54
producing A. baumannii isolates were detected after 2h-incubation period. A new Class A
55
enzyme, Brazilian Klebsiella Carbapenemase (BKC) showed poor carbapenemase activity and
56
could only be detected by VITEK® MS after an extended incubation period (4 hours) (11). No
57
false positive results were observed even after a 4-hour incubation period.
58
The VITEK® MS platform showed excellent performance in detecting carbapenemase-
59
producing isolates using ertapenem. The majority of KPC and MβL-producing isolates were
60
detected by testing 1-h incubation period. However, a 4-h incubation period was necessary to
61
exclude carbapenemase activity in strains producing weak carbapenemases like BKC-producing
62
K. pneumoniae and OXA-producing A. baumannii.
110
63
Funding
64
65
Council for Science and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and
66
Technology, Brazil (Process number: 307816/2009-5). We are grateful to the Fundação de
67
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), which gave a Post-doctoral grant to R.C.
68
(protocol 2012/15459-6).
69
70
Transparency Declarations
71
A.C.G. has recently received research funding and/or consultation fees from AstraZeneca, Merck
72
Sharp & Dhome, and Novartis. A. C. R. is an employee of bioMérieux Brazil, but she does not
73
own stocks or options in the company. Other authors have nothing to declare. This study was
74
presented in part as poster (poster number D-897) at the 54th Interscience Conference on
75
Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC, in Washington, DC, USA, 5-9 September
76
2014.
111
77
REFERENCES
78
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79
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118
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119
Intersci. Conf. Antimicrob. Agents and Chemother., abstr C1-1593c.
113
120
FIGURE LEGENDS
121
Figure1. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of
122
carbapenemase activity by testing VITEK® MS.
114
123
FIG. 1
124
115
Table 1. Interplay between the bacterial characteristics and incubation period required to detect the different classes of carbapenemase tested by VITEK® MS.
125
Ambler Class
Carbapenemase-producing isolates
Class A
Class B
CHDL
β-Lactamases
Bacterial isolates
Nº
Nº of isolates detected as carbapenemase-producers by Vitek® MS according
to the incubation period (min)
KPC-2
KPC-2
KPC-2
KPC-2
BKC
Subtotal
Serratia marcescens
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
13
26
1
1
1
42
15'
12
12
1
1
0
26
30'
13
16
1
1
0
31
60'
13
25
1
1
0
40
120'
13
26
1
1
0
41
240'
13
26
1
1
1
42
IMP-1
IMP-1
IMP-1
IMP-1
NDM-1
NDM-1
GIM-1
VIM-1
SPM-1
Subtotal
Serratia marcescens
Escherichia coli
1
1
6
3
1
1
1
1
8
23
1
1
1
0
1
1
1
1
7
14
1
1
1
1
1
1
1
1
7
15
1
1
6
1
1
1
1
1
7
20
1
1
6
2
1
1
1
1
8
22
1
1
6
3
1
1
1
1
8
23
OXA-51*
OXA-23, OXA-143
OXA-58
1
2
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
1
116
Non-Carbapenemaseproducing isolates
OXA-25
OXA-26
OXA-72
OXA-231
Subtotal
Total
CTX-M2 + Δ
OmpK35/OmpK36
ESβL (CTX-M15)
OXA-51 only
none
none
none
none
Total
1
1
1
1
8
73
0
0
0
0
0
40
0
0
0
0
0
46
0
1
0
0
1
61
1
1
0
0
2
65
1
1
1
1
8
73
8
0
0
0
0
0
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Burkholderia cenocepacia
2
2
12
2
1
1
28
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
126
117
Discussão
5. DISCUSSÃO
118
Discussão
No Brasil, o primeiro relato de um isolado de K. pneumoniae produtor de KPC ocorreu
em 2006 (Monteiro et al., 2009). Até então, a resistência aos carbapenens em bactérias Gramnegativas era mais comumente descrita em isolados de P. aeruginosa e A. baumannii produtores
de ML e/ou CHDLs (Sader et al., 2004), os quais eram facilmente reconhecidos pelos testes de
sensibilidade empregados. Em 2009, os laboratórios brasileiros, seguindo a recomendação do
CLSI (CLSI, 2009), passaram a realizar o MHT para confirmação da produção de
carbapenemase em isolados de enterobactérias que apresentassem redução de sensibilidade
para ao menos um carbapenem, já que cepas produtoras de KPC poderiam se apresentar como
sensíveis a estes compostos no antibiograma habitualmente realizado.
Com a disseminação de enterobactérias resistentes aos carbapenens pelo país, o
Laboratório ALERTA passou a receber diversos isolados positivos no MHT para a confirmação
molecular da produção de carbapenemases. Sendo assim, um total de 28 isolados de K.
pneumoniae, provenientes de oito hospitais brasileiros, apresentando redução de sensibilidade
aos carbapenens foram investigados em nosso laboratório (ANEXO 1). Estes isolados foram
distribuídos em 7 diferentes genótipos através da técnica de eletroforese em gel de campo
pulsado (PFGE). Embora o teste de MHT tenha sido realizado segundo as recomendações do
CLSI, optamos por também realizar o teste com inóculo maior. Nesse estudo, um total de 25% e
54% dos isolados testados com o inóculo padrão e o inóculo mais alto, respectivamente,
apresentaram MHT positivo quando utilizado o disco de ertapenem. Entretanto, nenhum desses
isolados apresentou hidrólise pela espectrofotometria ou carreavam os genes codificadores de
carbapenemase. Os resultados falso-positivos do MHT foram atribuídos à produção de ESL,
confirmada por PCR e sequenciamento dos genes relacionados, principalmente o gene blaCTX-M-2
(86%), associada à alteração de permeabilidade devido à ausência de uma (18%) ou ambas
(79%) as porinas, OmpK35 e OmpK36 (ANEXO 1).
119
Discussão
Resultados similares ao nosso estudo foram reportados por Pasteran e colaboradores
(2009) que descreveram 25% de resultados falso-positivos no MHT associados à produção de
CTX-M ou à hiperprodução de AmpC (Pasteran et al., 2009). Entretanto, segundo os autores,
apesar da baixa especificidade, o MHT apresentava elevada sensibilidade para detecção de
carbapenemases da classe A, especificamente KPC (Pasteran et al., 2009). Em outro estudo,
Girlich e colaboradores (2012) reportaram 100% de sensibilidade do MHT para a detecção de
carbapenemases das classes A e D em enterobactérias. Apesar disso no mesmo estudo,
resultados falso-positivos também foram reportados (55%; 11/20) entre os isolados produtores
de ESL ou hiperprodutores de AmpC (Girlich et al., 2012). No Brasil, a prevalência de
enterobactérias produtoras de ESL é elevada, chegando a 50% em isolados clínicos
hospitalares de K. pneumoniae (Gales et al., 2012), sendo a maioria destes (>90%) produtores
de CTX-M (Seki et al., 2013).
Com o objetivo de melhorar a especificidade do MHT para isolados brasileiros, Cury e
colaboradores (2012) estratificaram os resultados positivos em “verdadeiros-positivos”, quando o
crescimento da cepa de E. coli ATCC 25922 tocava o halo do disco de ertapenem, e
“inconclusivo” quando o crescimento não chegava a tocar o disco (Cury et al., 2012). Apesar de
elevar a especificidade do teste (>90%) nos isolados classificados como “verdadeiramentepositivos”, o gene blaKPC-2 foi detectado em apenas 51% dos isolados incluidos no grupo
“inconclusivo” (N=154; 28%). Consequentemente, apesar de muitos laboratórios no Brasil ainda
utilizarem o MHT para detecção de carbapenemase, este deve ser utilizado com parcimônia em
regiões onde a produção de CTX-M é endêmica, pois outros testes serão ainda necessários para
a confirmação da produção de carbapenemases, o que poderia retardar ainda mais a liberação
dos resultados.
Após relatos de resultados falso-negativos pelo MHT para isolados de enterobactérias
produtores de NDM-1, a confiabilidade na sensibilidade do teste diminuiu ainda mais
120
Discussão
(Castanheira et al., 2011; Girlich et al., 2012). Embora algumas tentativas de modificações no
MHT tenham sido realizadas, elevando a sensibilidade, a baixa especificidade ainda é um fator
limitante do uso clínico deste teste. Uma dessas modificações foi a execução do MHT em ágar
MacConkey ou com a adição de sulfato de zinco ao ágar Müeller-Hinton (Lee et al., 2010; Girlich
et al., 2012). Além disso, o MHT também foi avaliado para isolados de P. aeruginosa, porém um
grande número de resultados inconclusivos foi observado, devido à inibição do crescimento da
cepa de E. coli ATCC 25922 ao redor dos isolados de P. aeruginosa (Lee et al., 2003; Pasteran
et al., 2011). Desta forma, apesar do CLSI ainda recomendar o uso do MHT para fins
epidemiológicos e de controle de infecção (CLSI, 2014), o EUCAST, assim como a ANVISA,
optaram pela recomendação de testes baseados na inibição da atividade de carbapenemases
para cada uma das classes moleculares de -lactamases (ANVISA, 2013; EUCAST, 2013).
Os testes baseados na inibição de carbapenemases, utilizando discos combinados ou
por dupla difusão, foram amplamente descritos devido à sua fácil execução e alta sensibilidade
(Tsakris et al, 2009; Pasteran et al., 2011; Giske et al., 2011). Inicialmente, estes testes foram
propostos para detecção de ML em isolados de P. aeruginosa, as quais geralmente
apresentam elevadas CIMs para carbapenens (Picão et al., 2008). Entretanto, o mesmo não
ocorre com isolados de Acinetobacter spp. e espécies de enterobactérias, nos quais as MLs
podem variar tanto na habilidade de conferir resistência aos substratos, ceftazidima e imipenem,
comumente utilizados para triagem dessas enzimas, quanto no grau de inibição por certos
compostos (Walsh et al., 2005). Consequentemente, não há um inibidor perfeito para a detecção
de todas as MLs, e algumas destas carbapenemases podem não ser detectadas por
apresentarem-se sensíveis ou com discreta redução de sensibilidade aos carbapenens,
especialmente as amostras pertencentes à família Enterobacteriaceae (Walsh et al., 2005).
Segundo Lee e colaboradores (2003), o teste com discos de EDTA é o mais acurado
para detecção de ML em P. aeruginosa, enquanto que o ácido mercaptopropiônico obteve
121
Discussão
melhores resultados para Acinetobacter spp. Entretanto, quando os dois inibidores foram
testados em conjunto em um único disco observou-se maior sensibilidade comparado ao teste
com cada composto isoladamente (Lee et al., 2003). Com o aumento do número de isolados de
enterobactérias coprodutoras de MLs (VIM e IMP) e KPC na Grécia, e relatos na Alemanha,
Itália, China e Colombia, a combinação de inibidores, como o EDTA e o APBA, foi proposta para
evitar resultados falso-negativos com os inibidores utilizados isoladamente (Giakkoupi et al.,
2009; Miriagou et al., 2013; Rojas et al., 2013). Apesar do tempo necessário de 24 horas para a
leitura dos resultados, os testes com inibidores são uma alternativa para a detecção de
carbapenemases em enterobactérias. Baseado nestes dados, o EUCAST recomendou o uso de
discos de meropenem associados ou não aos seguintes inibidores: (i) EDTA ou ácido dipicolínico
(DPA) para triagem de ML; (ii) PBA ou APBA para a detecção de carbapenemases da classe
A; e (iii) cloxacilina para distinguir isolados hiperprodutores de AmpC que poderiam falsear o
teste com PBA ou APBA (EUCAST, 2013). Segundo o estudo de Giske e colaboradores (2011),
o DPA apresentou menos resultados falso-positivos para isolados produtores de KPC, OXA-48 e
CTX-M-15 associada à alteração de porina em enterobactérias do que o EDTA (Giske et al.,
2011).
Embora discos combinados com inibidores estejam disponíveis comercialmente na
Europa, Doyle e colaboradores (2012) observaram baixa sensibilidade (78-80%) para a detecção
de ML em enterobactérias, devido ao grande número de isolados produtores de IMP e VIM (4250%) não terem sido detectados, apesar de alcançarem 100% de sensibilidade e especificidade
para aqueles isolados produtores de NDM-1 e 98-100% de sensibilidade e 93% de
especificidade para detecção de KPC (Doyle et al., 2012). Igualmente, Giske e colaboradores
(2011) reportaram 100% de sensibilidade do teste com APBA para a detecção de KPC, apesar
de resultados falso-positivos terem sido observados em isolados apresentando hiperprodução de
AmpC associado à alteração de porina. Entretanto, os autores relataram que tais isolados foram
122
Discussão
discriminados quando a cloxacilina foi testada, alcançando uma especificidade de 98% (Giske et
al., 2011).
Atualmente, não existe um inibidor eficiente capaz de detectar todas as CHDLs.
Entretanto, segundo van Dijk e colaboradores (2014), a presença de OXA-48 pode ser sugerida
pela ausência de sinergismo com inibidores de classe A e B, associada à resistência de alto grau
à temocilina (CIM ≥ 32 µg/mL) (van Dijk et al., 2014; Hartl et al., 2013; EUCAST, 2013).
Recentemente, a associação desse antimicrobiano ao novo inibidor de β-lactamase avibactam
(potente para classe A e alguns representantes da classe D, como a OXA-48) pode se tornar
uma alternativa para detecção de isolados produtores de OXA-48 em um futuro próximo (Huang
et al., 2014).
Atualmente, o récem-criado Comitê Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos
Antimicrobianos (BrCAST) recomendará as diretrizes nacionais para a execução e interpretação
do teste de sensibilidade aos antimicrobianos. O BrCAST é composto por representantes das
quatro sociedades brasileiras, Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial
(SBPC), Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM), Sociedade Brasileira de Infectologia (SBI)
e Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC). Além disso, o comitê brasileiro traduzirá e
publicará os documentos do EUCAST para o público brasileiro, permitindo a ampla divulgação
dessas informações no âmbito nacional. As recomendações deste comitê para a suspeita e
confirmação da produção de carbapenemases ainda não estão disponíveis.
Até o momento, de acordo com as recomendações da ANVISA, testes com os inibidores
PBA e EDTA devem ser utilizados para a detecção inicial de cepas produtoras de
carbapenemases das classes A e B, respectivamente. O teste com cloxacilina também é
indicado para inibir a atividade de AmpC plasmidial (ANVISA, 2013). Entretanto, a mesma nota
técnica recomenda que testes moleculares sejam utilizados quando houver suspeita de produção
de carbapenemase entre isolados produtores de AmpC cromossomais (grupo CESP -
123
Discussão
Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marscescens, Proteus vulgaris, Providencia spp.,
entre outros).
No Brasil, o uso de testes moleculares ainda está restrito a poucos laboratórios de
microbiologia. Como Enterobacter spp. constitui a segunda espécie mais frequente de isolados
produtores de KPC no Brasil, o uso do teste com inibidores tem seu valor limitado para os
laboratórios de microbiologia em geral. Além desta limitação, os testes com inibidores, assim
como o MHT, requer tempo prolongado para confirmação do resultado, o que prejudica a rápida
liberação dos resultados e, consequentemente, a introdução de terapia adequada e a aplicação
de medidas de controle de infecção. Dessa forma, testes alternativos que apresentem maior
sensibilidade, especificidade e rapidez são necessários na prática laboratorial (Carmeli et al.,
2010).
Dentro deste cenário, uma nova metodologia revolucionou a microbiologia clínica pela
sua rapidez e acurácia na identificação de patógenos, a espectrometria de massa. Porém, o
teste de sensibilidade aos antimicrobianos ainda constitui uma limitação dessa técnica, e por
isso, atualmente, a detecção de resistência em isolados bacterianos é um dos maiores desafios
para a espectrometria de massa por MALDI-TOF MS (Kostrzewa et al., 2013).
A maioria dos estudos da literatura se concentrou na detecção da hidrólise de
compostos β-lactâmicos, especialmente os carbapenens (ANEXO 2), provavelmente devido a
urgente demanda por testes rápidos e acurados para detecção de um dos mecanismos de
resistência bacterianos mais temidos na prática clínica. Diferentemente dos ensaios acima
propostos, este representa um ensaio funcional, baseado no monitoramento molecular da
atividade enzimática das β-lactamases (Kostrzewa et al., 2013). O teste baseia-se na clivagem
enzimática do anel β-lactâmico, caracterizada pela adição de uma molécula de H2O, resultando
em um acréscimo de 18 Da no peso molecular do antimicrobiano. Entretanto, para alguns
antimicrobianos o produto originado é instável e a reação química, após a hidrólise, se completa
124
Discussão
com a perda de um grupo carboxila (CO2), resultando em um decréscimo de 44 Da no peso
molecular do produto final do antimicrobiano. Esta mudança de massa pode ser facilmente
monitorada pelo MALDI-TOF MS (Sparbier et al., 2012; Kostrzewa et al., 2013), como
demonstrado na Figura 1 do Artigo Científico 1.
Como toda reação química, o tempo necesário para ocorrer a hidrólise de qualquer
antimicrobiano presente em uma solução depende: (i) da concentração inicial do antimicrobiano;
(ii) da quantidade de enzima presente na amostra; e (iii) da velocidade de hidrólise da enzima
em questão (kcat/Km). O pré-requisito desta reação é a presença da enzima com atividade
hidrolítica sobre a molécula do antimicrobiano testado, outros mecanismos de resistência como
alteração de porina ou efluxo não são detectados (Sparbier et al., 2012).
Alguns pontos são críticos em relação a utlização desta técnica para a detecção de
carbapenemases, e a falta de padronização entre os diversos estudos pode ser observada na
Tabela 9 (ANEXO 2). O primeiro deles é o ajuste inicial do equipamento de MALDI-TOF MS,
cujo software deve permitir a adequação da faixa de massa a ser analisada. A identificação de
micro-organismos nestes equipamentos utiliza a faixa de massa entre 2 000 e 20 000 Da, sendo
que a molécula dos antimicrobianos possuem peso molecular abaixo de 500 Da. A otimização do
equipamento é necessária para obter resolução e sensibilidade suficiente na faixa de 0 a 1.000
Da. A calibração nesta faixa de massa com três ou mais massas conhecidas torna-se crítico para
a máxima acurácia do teste (Sparbier et al., 2012). Em nosso estudo, três pontos foram
utilizados para a calibração do equipamento, permitindo uma elevada acurácia dos espectros de
massas observados.
Em seu estudo, Sparbier e colaboradores (2012) monitoraram a mudança de massa de
diferentes β-lactâmicos após incubação com cepas controles, caracterizadas como produtoras
de ESL e KPC, além de controles negativos (E. coli DH5α e K. pneumoniae não produtora de
KPC) (Sparbier et al., 2012). Neste estudo, os autores demonstraram as massas esperadas de
125
Discussão
cada molécula de antimicrobiano testada (ampicilina, piperacilina, cefotaxima, ceftazidima,
ertapenem, imipenem e meropenem), assim como de seus aditivos de cátions (Na + e K+) e
respectivos produtos após reação de hidrólise e descarboxilação. Ao testar os carbapenens, os
autores observaram diferentes comportamentos destes compostos em relação à adição de
cátions, descarboxilação das moléculas após a hidrólise e visualização dos produtos da hidrólise.
No momento da padronização de nosso ensaio de carbapenemase, os três compostos,
ertapenem, imipenem e meropenem foram testados e diluídos em concentrações crescentes
(Tris-HCl 20 mM), ajustando-se o pH para 6,8 (pH ideal para atividade das β-lactamases) (Artigo
Científico 1). A análise do espectro do imipenem mostrou um pico de 300 Da, correspondente a
sua massa molecular [M+H+]. Entretanto, não foram visualizadas adição de moléculas de cátions
(Na+ ou K+) ou dos seus produtos de hidrólise esperados após a incubação com isolados
produtores de carbapenemase (SPM-1 e KPC-2), apesar do pico de 300 Da ter claramente
desaparecido. Da mesma maneira, quando testado o meropenem, apesar da visualização dos
picos correspondentes a sua massa molecular ([M+H+], 384) e à adição de Na+ ([M+Na+], 406),
não foram visualizados picos esperados correspondentes aos produtos da hidrólise após
incubação com isolados produtores de KPC-2 e SPM-1. Porém os picos de 384 e 406 Da
desapareceram. Outros autores apresentaram resultados semelhantes, com desaparecimento
dos picos correspondentes às massas das moléculas intactas, porém sem visualização dos
produtos de hidrólise para imipenem e meropenem (Sparbier et al., 2012; Hrábak et al., 2011;
Knox et al., 2014). As possíveis explicações para este fenômeno são de que trata-se de produtos
instáveis ou de difícil ionização (o que seria um pré-requisito para a técnica de MALDI-TOF MS),
ou ainda que estes produtos poderiam se ligar às estruturas celulares e não estarem presentes
no sobrenadante analisado pela técnica (Sparbier et al., 2012).
Com o objetivo de melhorar a técnica, utilizando o ensaio com meropenem, Hrábak e
colaboradores (2012) sugeriram modificações na solução de diluição do meropenem,
126
Discussão
adicionando SDS a 0,01%, para evitar a aderência dos produtos às estruturas celulares.
Segundo o estudo, com este ajuste foi possível a visualização dos picos correspondentes às
moléculas de meropenem hidrolisada e descarboxilada adicionadas ou não a mol[eculas de
sódio ([Mhidr./desc.+H+], 358 Da; [Mhidr./desc.+Na+], 380 Da) (Hrábak et al., 2012). A interpretação dos
espectros de massas é o ponto mais crítico deste ensaio. Desta forma, a facilidade da clara
visualização dos picos das moléculas de ertapenem ([M.+ H+], 476 Da) assim como seu aditivo
de sódio ([M + Na+], 498 Da) e dos produtos de hidrólise correspondentes ([Mhidr.+H+], 494 Da;
[Mhidr./desc.+ H+], 450 Da e [Mhidr./desc.+ Na+], 472 Da), fazem com que este carbapenem seja a
molécula preferencial para ser testada contra isolados produtores de carbapenemases (K.
pneumoniae produtora de KPC-2, P. aeruginosa produtora de SPM-1 e Acinetobacter spp.
produtor de OXA-23) (Artigo Científico 1). O uso do ertapenem em um ensaio para detecção de
carbapenemases em isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. poderia ser questionável,
uma vez que este composto não tem atividade contra estes patógenos. Entretanto, a inatividade
deste composto ocorre por impermeabilidade da membrana nestes dois patógenos, sendo que
em P. aeruginosa é consequente à hiperexpressão de sistemas de efluxo e em Acinetobacter
spp. pela redução do tamanho das porinas. O princípio da detecção de carbapenemase pelo
MALDI-TOF MS está na capacidade das bactérias em modificar a molécula do ertapenem, o que
somente ocorrerá na presença de uma carbapenemase. Porém, como as β-lactamases
encontram-se no espaço periplasmático das bactérias Gram-negativas, o ertapenem precisa
entrar na célula bacteriana para sofrer modificação, o que pode justificar o maior tempo
necessário para a detecção de carbapenemases em isolados de Acinetobacter spp., onde o
influxo pode ser mais lento (Artigo Científico 1; Kempf et al., 2012; Lee et al., 2013). Este fato
associado à lenta capacidade hidrolítica das CHDL em geral, poderia explicar a demanda por um
período de incubação mais prolongado para isolados de Acinetobacter spp (Artigo Científico 1;
Queenan & Bush, 2007).
127
Discussão
Em nosso estudo, o ensaio utilizando o ertapenem como substrato durante 2 horas de
incubação, apresentou 100% de sensibilidade e especificidade para a detecção de
carbapenemase em enterobactérias e P. aeruginosa produtoras de diferentes enzimas, inclusive
as variantes de GES, para as quais resultados falso-negativos foram reportados com o teste
CarbaNP (Tijet et al., 2013; Artigo Científico 1). Até o momento, todos os estudos que
avaliaram a atividade de carbapenemase pela técninca de MALDI-TOF MS, utilizando o
ertapenem como substrato, reportaram 100% de sensibilidade e especificidade (Burkhradt &
Zimmermann, 2011; Sparbier et al., 2012; Hoyos-Mallecot et al., 2014; Lee et al., 2013; Vogne et
al., 2014). Portanto, este parece ser um excelente substrato para a detecção de
carbapenemases em enterobactérias e P. aeruginosa. Da mesma maneira, tais estudos
utilizaram o mesmo critério para a interpretação dos resultados, ou seja, a ausência dos picos
correspondentes à massa molecular do ertapenem e seus aditivos de cátion. Dessa forma, estes
estudos, apesar de diferirem em relação à concentração do antimicrobiano (de 0,25 a 0,5 g/L, ou
disco de 10 µg em 1 mL de solução), à solução utilizada (Tris-HCl 20 mM pH ajustado, NaCl
0,45% ou citrato de amônio) e ao tempo de incubação (de 1 a 12 horas), tornam-se comparáveis
quanto aos critérios interpretativos. Tornando-os mais próximos de uma possível padronização
inter-laboratorial do que aqueles que utilizaram como substrato o imipenem ou meropenem.
Os estudos que utilizaram imipenem como substrato, além de variarem quanto à
concentração do antimicrobiano (de 0,25 a 0,5 g/L), à solução utilizada (Tris-HCl 20 mM pH
ajustado ou NaCl 0,45% ou citrato de amônio) ou ao tempo de incubação (de 1 a 4 horas),
também diferiram quanto aos critérios de interpretação de positividade, possivelmente em
consequência à dificuldade de visualização dos picos correspondentes às moléculas
hidrolisadas, o que torna difícil a comparação entre os seus resultados (Sparbier et al., 2012;
Kempf et al., 2012; Alvarez-Buylla et al., 2013; Sauget et al., 2014; Knox et al., 2014). Entretanto,
a seleção deste substrato poderia trazer benefício para a detecção de CHDLs, especialmente em
128
Discussão
isolados de Acinetobacter spp., uma vez que constitui-se no substrato preferencial destas
enzimas (Queenan & Bush, 2007).
Entre os cinco estudos que avaliaram isolados de Acinetobacter spp., apenas dois
utilizaram imipenem como substrato (Kempf et al., 2012; Alvarez-Buylla et al., 2013). Kempf e
colaboradores (2012) testaram 63 isolados de Acinetobacter spp. produtores de OXA-23 (n=57),
OXA-24 (n=3) e coprodutores de OXA-23 e OXA-24 (n=3), alcançando 95% de sensibilidade
após duas horas de incubação e 100% quando o período de incubaçao foi ampliado para 4 horas
(Kempf et al., 2012). Da mesma forma, em nosso estudo, a incubação por quatro horas foi
suficiente para detecção de todos os isolados de Acinetobacter spp. produtores de CHDLs (OXA23, OXA-24, OXA-143, OXA-25, OXA-26 e OXA-58) utilizando ertapenem como substrato.
Porém, com duas horas de incubação, apenas 33% destes isolados teriam sido reconhecidos
como produtores de carbapenemase. O mesmo período foi reportado por Lee e colaboradores
(2013), em ensaio semelhante ao nosso (Lee et al., 2013). Já no estudo de Alvarez-Buylla e
colaboradores (2013), os autores compararam diferentes soluções, inóculos bacterianos e
concentrações de imipenem com objetivo de potencializar a reação e minimizar o tempo de
detecção de isolados de Acinetobacter spp. produtores de IMP e diferentes CHDLs (AlvarezBuylla et al., 2013). A melhor combinação encontrada, segundo os autores, constituiu-se no
conjunto de Tris-HCl ou NaCl, 1 g/L de imipenem e 1010 UFC/mL de inóculo bacteriano com uma
hora de incubação. Nessas condições, os autores detectaram 100% dos isolados testados.
Entretanto, diferentemente do critério utilizado por Kempf e colaboradores (2012)
(desparecimento do pico 300 Da), Alvarez-Buylla e colaboradores (2013) utilizaram critérios mais
subjetivos, como a redução significativa dos picos de 300 Da e 489 Da, sendo a massa de 489
Da correspondente à composição do imipenem com a matriz. Esta modificação no critério de
positividade poderia explicar a diferença no tempo de detecção entre os dois estudos, uma vez
129
Discussão
que no estudo de Alvarez-Buylla e colaboradores (2013) a hidrólise de todo conteúdo de
imipenem pela amostra foi necessária para classificá-la como positiva.
Entre os estudos que avaliaram a detecção da atividade de carbapenemase de isolados
produtores de OXA-48, dois utilizaram o imipenem como substrato. Sauget e colaboradores
(2014) detectaram 99% dos 92 isolados de enterobactérias produtoras de OXA-48, com 97% de
especificidade, utilizando uma hora de incubação, e a razão entre as áreas dos picos do
imipenem e de seu metabólito como critério de positividade (Sauget et al., 2014). Entretanto,
este é o único estudo na literatura que reporta o pico de 254 Da como correspondente a um
metabólito da hidrólise do imipenem. Knox e colaboradores (2014) também utilizaram o
imipenem para detectar a produção de carbapenemases em enterobactérias, dentre as quais a
OXA-48 (n=4). Naquele estudo, os autores compararam estes resultados com o teste CarbaNP
(Knox et al., 2014). Os autores consideraram apenas o desaparecimento do pico de 300 Da,
como critério de positividade. Todos os isolados produtores de OXA-48 foram detectados pela
técnica de MALDI-TOF, enquanto que três destes não foram detectados pelo teste CarbaNP.
O ensaio com meropenem foi utilizado apenas por dois estudos desenvolvidos pelo
mesmo grupo de pesquisa (Hrábak et al., 2011; Hrábak et al., 2012). No segundo estudo, Hrábak
e colaboradores (2012) realizaram modificações no ensaio, como diminuição do inóculo
bacteriano testado, adição de SDS à solução tampão e redução no tempo de incubação de 3
para 2 horas. Estas modificações aprimoraram o desempenho do teste, resultando em 100% de
sensibilidade e especificidade para detecção de carbapenemases em 110 isolados de
enterobactérias e Acinetobacter spp. produtores de diferentes enzimas, incluindo OXA-48 (n=6)
(Hrábak et al., 2011; Hrábak et al., 2012).
Recentemente, Vogne e colaboradores (2014) mostraram excelente desempenho do
MALDI-TOF MS quando comparado às metodologias fenotípicas, como MHT e Etest, e
genotípicas, como os painéis comerciais Check MDR Carba e o Check MDR CT103 microarray
130
Discussão
(Vogne et al., 2014). Além de ser o primeiro estudo a utilizar o equipamento VITEK MS para esta
finalidade, foi também testado um disco de ertapenem de 10 µg, comumente utilizado pelos
laboratórios de microbiologia, como fonte deste antimicrobiano, em uma solução de 1 mL de
NaCl 0,45% em tubo de vidro. Os autores ainda relatam que a técnica de MALDI-TOF MS foi a
única a alcançar 100% de sensibilidade e especificidade. Os painéis moleculares não detectaram
dois isolados de Aeromomas spp. produdores da MβL cromossomal CphA (Vogne et al., 2014).
Outro importante fator é o meio de cultura utilizado para o crescimento das colônias
bacterianas, que pode resultar em variação no desempenho do teste. Em nosso primeiro estudo
(dados não mostrados), inicialmente todas as colônias bacterianas haviam crescido em ágar
MacConkey e testadas para o ensaio de carbapenemase no MALDI-TOF MS, sendo que apenas
35% dos isolados produtores de CHDLs haviam sido detectados. Entretanto, ao repetirmos os
testes com colônias isoladas no ágar Müeller-Hinton, todas foram positivas (Artigo Científico 1).
Baseados nesses dados, a influência de outros meios de cultura utilizados nos laboratórios de
rotina poderiam influir no desempenho deste teste. Com o objetivo de esclarecer esta hipótese,
no pôster apresentado no 54th ICAAC, em Washington - DC, avaliamos 64 isolados produtores
de carbapenemase e 32 não produtores de carbapenemase, com crescimento em diferentes
meios de cultura (ágar sangue, ágar MacConkey, ágar Müeller-Hinton e ágar cromogênico CPS) e observamos uma sensibilidade de 100% para todos os meios, exceto ágar MacConkey
(81%) (Ramos et al., 2014).
Apesar das grandes variações metodológicas entre os estudos que avaliaram a hidrólise
dos carbapenens por carbapenemases, a detecção de carbapenemase por MALDI-TOF MS é
bastante promissora, principalmente pela sua rapidez e acurácia em detectar diferentes enzimas.
A rapidez do ensaio pode estar relacionada à enzima presente na amostra, como observado no
estudo de Burkhardt & Zimmermann (2011), no qual diferentes tempos de positividade foram
atribuídos para as enzimas IMP-2, KPC-2 e VIM-1 (1,5 horas) e VIM-2 (2,5 horas) (Burkhardt &
131
Discussão
Zimmermann, 2011). Da mesma maneira, em nosso terceiro estudo, avaliamos a detecção de
diferentes classes moleculares de carbapenemases (A, B e D), para a validação do equipamento
VITEK MS, variando o tempo de detecção de 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas e 4 horas.
Para esse estudo, utilizamos o software Saramis (v.4.1.2). A detecção da maioria das enzimas
de classe A (63%) e B (56%) ocorreu em apenas 15 minutos, seguido de 95% (classe A) e 81%
(classe B) em 1 hora, e finalmente 100% de todas as enzimas, incluindo as CHDLs, em 4 horas
(Artigo Científico 3).
A identificação de micro-organismos pela técnica de MALDI-TOF MS diretamente de
amostras clínicas foi reportada por diversos autores, tanto de urina como de hemocultura. O
maior desafio é a obtenção de quantidade suficiente do micro-organismo com menos
interferentes, como proteínas humanas e células sanguíneas. Os protocolos utilizaram uma série
de centrifugações e lavagens com este fim. Adicionalmente, a maioria dos autores preconizou o
uso de uma solução de lise para melhorar a recuperação de micro-organismos, especialmente
de patógenos intracelulares (Prod’hom et al., 2010; Stevenson et al., 2010; Martiny et al., 2012).
As taxas de identificação correta de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura
variaram de 62% a 97% para os protocolos que utilizaram métodos “in house” com solução de
lise (Tabela 1). Todos os estudos mostraram que a identificação de bactérias Gram positivas era
inferior aquelas obtidas para bactérias Gram-negativas. Entretanto, as taxas obtidas por esses
estudos foram determinadas após a exclusão de hemoculturas polimicrobianas e daquelas, cujo
espectro de massa não foi obtido pela escassez de material para análise, demonstrando,
portanto, um viés na análise dos resultados.
No estudo realizado por Stevenson e colaboradores (2010) foram utilizadas diluições
seriadas e foi reportado que ao menos 106 UFC/mL devem estar presentes na amostra para a
obtenção de espectro de massa com score acima de 1,7 (Stevenson et al., 2010). Em nosso
estudo, a contagem de células bacterianas foi realizada após a separação e limpeza do inóculo
132
Discussão
do frasco de hemocultura. A contagem para isolados Gram-negativos variou de 107 a >108
UFC/mL, entretanto; porém, contagens de UFC inferiores foram observadas para isolados Gram
positivos (105 a 107 UFC/mL) (dado não publicado). Esta diferença poderia explicar a melhor
performance do método para a identificação de bactérias Gram-negativas diretamente dos frasco
de hemocultura.
O desempenho do MALDI-TOF MS em nosso estudo foi semelhante ao previamente
reportado. O MALDI-TOF MS identificou corretamente 86% dos 110 isolados bacterianos
recuperados de bacteremias, incluindo oito de 10 amostras polimicrobianas, onde o MALDI-TOF
MS obteve a correta identificação de pelo menos um dos agentes presentes (Artigo Científico
2). Uma adaptação do protocolo de Stevenson e colaboradores (2010) foi realizada para a
obtenção do inóculo bacteriano no nosso estudo, no qual o tubo contendo gel separador auxilia
na separação das células sanguíneas, e as células dos micro-organismos permanecem em uma
camada logo acima do gel separador, facilitando a sua recuperação e limpeza com apenas uma
lavagem com água estéril. Este método é simples e rápido para ser implantado facilmente na
rotina do laboratório de microbiologia. No estudo de Stevenson e colaboradores (2010), os
autores obtiveram 80% de identificação correta, realizando cinco etapas de lavagem e
centrifugação, em uma delas com adição de solução de lise (NH 4Cl, NAHCO3 e EDTA), além do
uso do tubo com gel separador (Stevenson et al., 2010).
Alguns estudos avaliaram o kit comercial Sepsityper® (Bruker Daltonics) para a extração
do inóculo bacteriano dos frascos de hemocultura. Entretanto, além de honeroso, o mesmo
apresentou desempenho similar ou inferior aos métodos desenvolvidos “in house” (68-94% de
identificação correta) (Kok et al., 2011; Chen et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012)
demonstraram discreta melhora na identificação de bactérias Gram positivas quando o
Sepsityper (73%) foi comparado ao método “in house” (62%), porém, este último foi muito
133
Discussão
superior ao Sepsityper para identificação de bactérias Gram-negativas (90% versus 68%)
(Martiny et al., 2012).
A maioria dos estudos reportados na literatura comparou o desempenho do MALDI-TOF
MS aos métodos automatizados rotineiramente utilizados nos laboratórios de microbiologia
(VITEK 2 e PHOENIX). Entretanto, assim como o estudo aqui apresentado, quando resultados
discordantes entre estas metodologias foram comparados com métodos moleculares
considerados padrão-ouro para identificação de micro-organismos, o desempenho da
espectrometria de massa foi superior ao dos sistemas automatizados rotineiramente
empregados pelos laboratórios de rotina (Artigo Cientifico 2; Patel et al., 2013).
Apesar de poucos estudos na literatura terem avaliado o impacto clínico da rápida
intervenção na identificação de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura, eles
apresentaram muitas diferenças. Entre elas, diferentes end-points, inclusão de todas as
hemoculturas positivas ou apenas aquelas com presença de bactérias Gram-negativas e a
associação da intervenção ou não da equipe de infectologia após o resultado do MALDI-TOF MS
(Huang et al., 2013). Os resultados destes estudos podem ainda ser altamente dependentes das
taxas de resistência apresentadas por cada região geográfica.
Em nossa instituição, a prevalência de enterobactérias produtoras de KPC é elevada,
Durante o período de 01 de janeiro a 30 de setembro de 2014, foram recuperados 457 (6,8%)
isolados de enterobactérias produtoras de KPC de um total de 6759 enterobactérias isoladas
neste período, confirmados por biologia molecular, provenientes de 308 pacientes, dos quais 62
apresentaram ICS (dados não publicados). No Artigo Científico 2 propusemos a identificação
do agente causador de ICS associada à detecção precoce de carbapenemase diretamente do
frasco de hemocultura. Os objetivos desse estudo foram motivados pelo fato de que o
reconhecimento da expressão de carbapenemase é fundamental para o manejo de infecções
causadas por bactérias Gram-negativas resistentes aos carbapenens (Kanj & Kanafi, 2011) Além
134
Discussão
disso, o atraso na adequação da terapia correlaciona-se com o aumento na mortalidade, mesmo
quando o paciente é considerado estável em sua avaliação inicial (Tam et al., 2010). Utilizandose de um protocolo simples de extração do inóculo bacteriano a partir dos frascos de
hemocultura, e incubação com ertapenem, todos os isolados produtores de KPC-2 e SPM-1
foram detectados após duas horas de incubação, totalizando três horas de ensaio até a liberação
do resultado. Entretanto, isolados de Acinetobacter spp. produtores de CHDLs somente foram
identificados quando testados a partir da colônia bacteriana. O teste apresentou 100% de
especificidade (Artigo Científico 2).
Recentemente, Hoyos-Mallecot e colaboradores (2014) avaliaram a detecção de
carbapenemase a partir de frascos de hemocultura inoculados com cepas caracterizadas como
produtoras e não produtoras de carbapenemases, entre elas IMP, VIM, KPC e OXA-48 (HoyosMallecot et al., 2014). Os autores observaram 100% de sensibilidade para as enzimas testadas,
entretanto, em dois isolados, de E. cloacae e E. coli, para os quais os testes moleculares para
enzimas acima foram negativos, o MALDI-TOF MS apresentou atividade de carbapenemase.
Apesar dos autores considerarem estes como resultados falso-positivos, os mesmos deveriam
terem sido confirmados por outra metodologia, preferencialmente por espectrofotometria, uma
vez que a presença de outra carbapenemase não pode ser descartada.
Recentemente, Oviaño e colaboradores (2014) realizaram um ensaio de detecção de
ESβL e AmpC pelo MALDI-TOF MS inoculando 128 frascos de hemocultura (Oviaño et al.,
2014). Os autores utilizaram ceftaxima e ceftazidima como substrasto e ácido clavulânico como
inibidor para confirmar a presença de ESβL. O ensaio não foi capaz de detectar apenas um
isolado produtor de CTX-M-14 e dois isolados produtores de CMY-2. Os isolados produtores de
CMY-2 não apresentaram hidrólise no teste confirmatório através da espectrofotometria, e o
isolado produtor de CTX-M-14 apresentou apenas uma fraca hidrólise utilizando-se cefotaxima.
Neste caso, o ensaio de MALDI-TOF MS poderia ser realizado extendendo-se o tempo de
135
Discussão
incubação com cefotaxima (apenas de uma hora) para detecção de isolados com menor taxa de
hidrólise. No total, os autores observaram 99% de sensibilidade e 100% de especificidade para
isolados produtores de ESβL, e 83% e 100% para isolados produtores de AmpC,
respectivamente.
A utilização da técnica de MALDI-TOF MS para a detecção diretamente dos frascos de
hemocultura de isolados produtores de carbapenemase ou ESβL e AmpC, dependendo da
epidemiologia local, traz rápidos resultados sem necessitar da execução de técnicas
moleculares, que limitam o número de alvos. A técnica de MALDI-TOF MS tem a vantagem de
ser capaz de detectar novas enzimas ou variantes, desde que apresentem o perfil hidrolítico
estudado. Adicionalmente, quando apropriadamente transferida para a rotina laboratorial,
caracteriza-se por um método simples e de baixa demanda. A presença de carbapenemases,
ESβL ou AmpC são determinantes da escolha terapêutica em isolados de bactérias Gramnegativas, principlamente na presença de infecções graves, como infecção de corrente
sanguínea. Entretanto, a realização do teste de sensibilidade para determinação da CIM, não
apenas dos carbapenens como também de outros antimicrobianos que possam constituir-se em
alternativas terapêuticas, ainda será necessária para a melhor adequação da terapia
antimicrobiana prescrita e suas doses.
Diante de todos estes fatores, a possibilidade de padronização e avaliação de um teste
rápido, de fácil execução e capaz de detectar todos os representantes do grupo de
carbapenemases diretamente de hemocultura, motivou a execução deste trabalho. Isso representa
um grande potencial para a redução, a baixo custo, da mortalidade associada à infecção. A
detecção de carbapenemases direto de colônias bacterianas ou mesmo diretamente de amostras
clínicas, pode ser utilizada nos laboratórios de microbiologia clínica, onde a identificação de microorganismos por MALDI-TOF MS já estiver implantada, fato que é realidade na Europa e EUA, e
está em crescente expansão na América Latina, inclusive no Brasil. O real impacto deste teste no
136
Discussão
desfecho clínico do paciente, assim como no tempo de hospitalização e modificação da terapia
antimicrobiana constituem nossos futuros projetos.
137
Conclusões
6. CONCLUSÕES
138
Conclusões

A espectrometria de massa por MALDI-TOF MS, através do ensaio com ertapenem,
demonstrou ser uma metodologia rápida e acurada para detecção de carbapenemase em
bactérias Gram-negativas. Porém, a interpretação dos espectros requer ainda a expertise de
profissionais treinados;

A técnica de MALDI-TOF MS apresentou uma excelente sensibilidade e especificidade
para a detecção de carbapenemases das classes moleculares A e B em duas horas. Já os
isolados de Acinetobacter spp. requerem um período de incubação maior chegando a quatro
horas;

A sensibilidade do método pode variar de acordo com o meio de cultura utilizado, sendo
o ágar MacConkey o que apresentou maior taxa de resultados falso-negativos e, portanto, não
deve ser recomendado para o cultivo das amostras antes da realização dos experimentos de
MALDI-TOF MS;

A detecção da atividade de carbapenemase pode ser realizada diretamente do frasco
positivo de hemocultura para enterobactérias e P. aeruginosa, porém, resultados negativos
devem ser confirmados para os isolados de Acinetobacter spp. após o isolamento da colônia
bacteriana.

A metodologia de MALDI-TOF MS apresentou boa acurácia para identificação de
bactérias diretamente dos frascos positivos de hemocultura.
139
Referências Bibliográficas
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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164
Anexos
8. ANEXOS
165
Anexos
8.1. Anexo 1. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase
production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. Publicado em
Fevereiro de 2010 no periódico Journal of Antimicrobial Chemotherapy - JAC, volume 65, número
2, páginas 249-251.
166
Anexo 1
1
Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in
2
Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results
3
4
Cecilia G. Carvalhaes1*, Renata C. Picão1, Adriana G. Nicoletti1, Danilo E. Xavier1 and Ana C.
5
Gales1.
6
7
1Laboratório
Alerta, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil.
8
9
Running title: False-positive carbapenemase detection in Klebsiella pneumoniae.
10
11
*Corresponding author. Mailing adrress: Laboratório ALERTA, Rua Pedro de Toledo, n°781,
12
6°andar, fundos. Vila Clementino, São Paulo-SP. CEP 04039-032. Phone: 55-11-5084-6538.
13
Fax: 55-11-5081-2965. E-mail: [email protected].
167
Anexo 1
14
Abstract
15
Objectives: The aim of this study was to evaluate the presence of carbapenemases in a
16
Klebsiella pneumoniae collection and the performance of the modified Hodge test (MHT) to
17
correctly identify this phenotype.
18
Methods: Twenty-eight K. pneumoniae clinical isolates with reduced susceptibility to
19
carbapenems were evaluated. Antimicrobial susceptibility and molecular typing were performed
20
by agar dilution and PFGE, respectively. The MHT was performed using both standard and high
21
inoculum of test organisms. Imipenem hydrolysis was investigated by spectrophotometric assays
22
and carbapenemase-encoding genes were identified by PCR and amplicon sequencing. Porin
23
loss was investigated by both PCR and SDS-PAGE.
24
Results: Susceptibility rates for imipenem, meropenem and ertapenem were 93%, 57% and
25
11%, respectively. The PFGE analysis showed seven unrelated genotypes. By testing standard
26
inoculum and ertapenem or meropenem discs, 25% (n=7) and 21% (n=6) of the isolates were
27
classified as carbapenemase producers, respectively. When a higher inoculum was employed,
28
these rates increased to 54% (n=15) and 43% (n=12), respectively. No imipenem hydrolysis was
29
detected. PCRs identified blaCTX-M in 27 (96%) isolates, of which 2 isolates also carried blaGES-1.
30
SDS-PAGE and PCR assays revealed that all isolates had lost at least one outer membrane
31
protein, except for a single isolate that was found to express both OmpK35 and OmpK36.
32
Conclusions: False detection of carbapenemase production was observed by the MHT possibly
33
as a result of extended-spectrum β-lactamase (ESβL) production coupled with porin loss as
34
reported before. Clinical laboratories must be aware of this fact, especially in geographical areas
35
where ESβL-producing isolates are highly prevalent.
168
Anexo 1
36
Introduction
37
Infections due to Klebsiella pneumoniae have emerged as an important challenge in
38
healthcare settings. In Brazil, K. pneumoniae has been the fourth most frequent pathogen
39
isolated from bloodstream infections according to the SENTRY Antimicrobial Surveillance
40
Program.1 High rates of extended-spectrum β-lactamase (ESβL) production have been observed
41
in this species, making the carbapenems the main therapeutic option for treatment of serious
42
infections caused by such pathogens. Although the rates of resistance to carbapenems are low,
43
they have been increasing. The most common mechanism for carbapenem resistance in
44
Klebsiella spp. is the production of carbapenemases belonging to Ambler class A, especially K.
45
pneumoniae carbapenemase (KPC), or B, metallo-β-lactamases (MβLs) such as IMP and VIM
46
types. Production of ESβL and/or AmpC β-lactamases coupled with porin loss has also been
47
shown to be responsible for carbapenem resistance.2,3
48
The detection of KPC has become a real challenge for clinical laboratories since some
49
carbapenemase-producing Enterobacteriaceae may have carbapenem MICs that are elevated
50
but still within the susceptible category according to currently defined breakpoints. 4 To address
51
this challenge, in January 2009, the CLSI published a recommendation in which carbapenem-
52
susceptible Enterobacteriaceae with elevated MICs or reduced disc diffusion inhibition zones
53
should be tested for the production of carbapenemases. 4 For this purpose, the Cloverleaf test5
54
[modified Hodge test (MHT)] was suggested due to its acceptable sensitivity and specificity for
55
carbapenemase detection.4,5 To date, the BSAC and the European Committee on Antimicrobial
56
Susceptibility Testing (EUCAST) do not routinely recommend carbapenemase detection in
57
Enterobacteriaceae.
58
The aim of this study was to evaluate the presence of carbapenemase production in a K.
59
pneumoniae collection with reduced susceptibility to carbapenem, and the performance of the
60
MHT in correctly identifying the presence of such resistance determinants.
169
Anexo 1
61
Methods
62
Collection. In 2009, the Laboratório ALERTA, a research laboratory from the Universidade
63
Federal de São Paulo, received 28 K. pneumoniae clinical isolates with reduced susceptibility to
64
carbapenems. These isolates were recovered from eight hospitals located in three distinct
65
Brazilian regions. A PFGE assay was performed to study the genetic relatedness among these
66
isolates.
67
68
Antimicrobial susceptibility testing and MHT. Antimicrobial susceptibility testing was
69
performed using the CLSI agar dilution technique. Cefepime, ceftazidime, ertapenem, imipenem
70
and meropenem MICs were interpreted following the CLSI recommendations.4 All isolates fulfilled
71
the CLSI criterion for performing carbapenemase detection by the MHT. MHT was performed with
72
both a CLSI standard inoculum (three to five colonies) and a high inoculum (a full 1 µL loop) of
73
test organisms. Results were interpreted by two blinded observers.
74
75
β-Lactamase detection. Investigation of carbapenemase activity in crude extracts was
76
performed by UV spectrophotometric assays. Briefly, a full 10 mL loop of the test organism was
77
inoculated into 500 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) and disrupted by sonication. The
78
cells were removed by centrifugation and the supernatants were used for further experiments.
79
Protein quantification in crude extracts was performed using the Bradford stain, and the results
80
were used to normalize the volume to be tested for each isolate. The hydrolytic activity of crude
81
extracts was determined against 100 mM imipenem in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and
82
measurements were carried out at a wavelength of 297 nm. Positive controls included SPM-1-
83
producing Pseudomonas aeruginosa and GES-5-producing P. aeruginosa for high- and low-level
84
hydrolysis, respectively. CTX-M-2-producing P. aeruginosa was included as a negative control.6
85
PCRs targeting genes encoding CTX-M, GES, KPC, plasmid-mediated AmpCs, MBL and OXA-
170
Anexo 1
86
type carbapenemases were performed using primers described previously.6,7 For direct DNA
87
sequencing, PCR productswere purified using PCR purification columns (Qiagen, Hilden,
88
Germany). Sequencing reactions were performed using the Big Dye Terminator v3.1/1.1 cycle
89
sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and an automated ABI 3130
90
sequencer (Applied Biosystems). The nucleotide and deduced protein sequences were analysed
91
with software available at the National Center for Biotechnology Information website
92
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
93
94
Outer membrane proteins.The presence of outer membrane proteins (OMPs) was analysed by
95
SDS-PAGE as previously described.8 Altered OmpK35- and OmpK36-encoding genes were
96
investigated by PCR.7
171
Anexo 1
97
Results
98
Twenty-eight K. pneumoniae clinical isolates were investigated. None of these isolates
99
was susceptible to cefepime but 7% were susceptible to ceftazidime. Susceptibility rates for
100
imipenem, meropenem and ertapenem were 93%, 57% and 11%, respectively. MIC50/MIC90
101
values (mg/L) were as follows: cefepime, 128/.256; ceftazidime, 32/128; ertapenem, 16/64;
102
imipenem, 2/4; and meropenem, 4/16. PFGE, interpreted according to Tenover et al.,9 showed
103
seven unrelated genotypes. By testing standard inoculums and ertapenem or meropenem discs,
104
25% (n=7) and 21% (n=6) of the isolates were classified as carbapenemase producers,
105
respectively. When a higher inoculum was employed, these rates increased to 54% (n=15) and
106
43% (n=12), respectively. Carbapenemase production by MHT was detected among K.
107
pneumoniae isolates belonging to distinct genotypes. No imipenem hydrolysis was detected
108
among the isolates classified as carbapenemase producers by the MHT. PCRs targeting genes
109
encoding KPC, plasmid-mediated AmpCs, MBL and OXA-type carbapenemases did not show
110
any amplicons. blaCTX-M was detected in 27 (96%) isolates, in which 24 (89%) were blaCTX-M-2, 2
111
(7%) were blaCTX-M-15 and 1 (4%) was blaCTX-M-59. Two blaCTX-M-2-positive isolates also carried
112
blaGES-1. Both OmpK35 and OmpK36 were expressed in a single isolate (Kpn 27) according to the
113
SDS-PAGE results. Interestingly the MICs of imipenem, meropenem and ertapenem for this
114
isolate were ≤ 0.12 mg/L, ≤ 0.12 mg/L and 2 mg/L, respectively. Five isolates (18%) presented
115
two bands, probably corresponding to OmpA and either OmpK35 or OmpK36. Finally, 22 isolates
116
(79%) presented one single band, probably corresponding to OmpA, suggesting that they have
117
lost both porins. These findings were corroborated by PCR analysis of OMP-encoding genes, in
118
which 24 isolates (86%) presented altered amplicons of at least one OMP-encoding gene, being
119
either the lack of amplification or enhanced amplicon size.
172
Anexo 1
120
Discussion
121
In this study, we have observed the occurrence of false detection of carbapenemase
122
production by the MHT among isolates in which carbapenem reduced susceptibility or resistance
123
was detected. Therefore, a false positive MHT probably results from low-level carbapenem
124
hydrolysis by ESβLs, particularly those of the CTX-M type.10 This hypothesis is strengthened by
125
the fact that the frequency of false positive results was directly related to the inoculum tested. 11
126
Our results corroborated with those observed by Doumith et al.3 in which carbapenem resistance
127
due to ESβL production coupled with porin loss was reported.
128
When testing true carbapenemase producers, Escherichia coli ATCC 25922 usually
129
grows better within the carbapenem disc inhibition zones. For this reason, we thought that the
130
true production of carbapenemase could be discriminated by looking at the growth size produced
131
in the MHT. However, we have observed that KPC-producing K. pneumoniae isolates might also
132
show a weak positive result on MHT, as shown in Figure 1.
133
Clinical laboratories must be aware that false positive results may occur, especially in
134
geographical areas where ESβL-producing isolates are prevalent. Currently, a new study is being
135
carried out to determine the frequency of false detection of carbapenemase production in
136
Enterobacteriaceae by the MHT in the clinical microbiology routine setting.
173
Anexo 1
137
Funding
138
139
Council for Scientific and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and
140
Technology, Brazil (307714/2006-3).
141
142
Transparency declarations
143
None to declare.
174
Anexo 1
144
References
145
1. Andrade S, Sader HS, Barth A et al. Antimicrobial susceptibility of Gram-negative bacilli
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175
Anexo 1
169
170
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174
Microbiol 2004; 42: 269-75.
176
Anexo 1
(A)
(A)
(B)
(A)
4
(A)
3
(A)
1
(A)
2
(A)
4
(A)
1
(A)
3
(A)
2
(A)
175
176
177
Figure 1. Phenotypic carbapenemase detection by MHT applying the inoculum recommended by
178
CLSI for ertapenem (a) and meropenem discs (b). 1, K. pneumoniae ATCC BAA-1705, positive
179
result; 2, K. pneumoniae ATCC BAA-1706, negative result; 3, CTX-M-producing K. pneumoniae
180
clinical isolate; 4, KPC-producing K. pneumoniae clinical isolate. Arrows indicate the similar size
181
of E. coli ATCC 25922 grown within the carbapenem disc inhibition zones when testing both
182
carbapenemase producer and carbapenemase non-producer isolates.
177
Anexo 2
Tabela 9. Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de MALDI-TOF MS.
Tempo de
incubação
Matriz
Equipamento
Calibração
Range
de
massa
Critério de
Positividade
Resultados
(Sens/Esp)
Ertapenem
0,5 g/L
2,5 horas
HCCA
Microflex LT
HCCA
438-530
Δ 476, 498 e
521 Da
100%/100%
-
Meropenem
0,1 mM
3 horas
DHB
Microflex LT
?
375-475
Δ 383 ou 405
Da
97%/98%
APBA
Ertapenem, 0,5
g/L; Imipenem,
0,5 g/L;
Meropenem,
0,5 g/L
Microflex LT
HCCA;
Bradicinina (15) e
Bradicinina (17)
100 1000
Picos M/ Picos
Mh; R, I, S
100%/100%
Estudo
Bactérias
N
Enzimas
Meio de
cultura
Inóculo
Solução
Inibidores
Burkhardt &
Zimmermann,
2011
Enterobactérias e P.
aeruginosa; cepas
controles
87
NDM, IMP, KPC,
VIM, nãocarbapenemases
ágar
sangue
alça 10 µL
1 mL 0,45%
NaCl
-
Hrábak et al.,
2011
aeruginosa; cepas
controles
124
NDM, IMP, KPC,
VIM, nãocarbapenemases
ágar MH
sç adicional McFarland 8
50 µL 20 mM
Tris-HCl pH 6,8
Sparbier et al.,
2012
Enterobactérias; cepas
controles
3
KPN,
6 E.
coli
alça 1 µL
Citrato de
amônio 10 mM
pH 7,0
Kempf et al.,
2012
Acinetobacter
spp.,Enterobactérias, P.
aeruginosa (cepas
controles)
ágar
sangue
3 horas
HCCA
149
OXA-23; OXA-24;
OXA-23 e 24
ágar
sangue
alça 10 µL
1 mL 0,45%
NaCl
-
Imipenemcilastatina 0,25
- 2 g/L
4 horas
HCCA
Ultraflex
Imipenem
0 - 1000
Δ 300 e
aumenta 254
Da
Sensibilidade
95% em 2 horas
100% em 4
horas;
Especificidade
100%
ágar MH
alça 10 µL
1 mL 20 mM
Tris-HCl pH 6,8
-
Ertapenem
0,12 - 0,5 g/L
2 e 4 horas
HCCA
Microflex LT
HCCA; e
Bradicinina (17)
400-600
Δ 476 e 498 Da
100% Classe A e
B em 2 horas;
CHDL em 4 horas
ágar MH
sç adicional McFarland 3
50 µL 20 mM
Tris-HCl pH 7,0
+ 0,01% SDS
-
Meropenem
0,1 mM
2 horas
DHB
Microflex LT
Meropenem
350-480
Δ 383 ou 405
Da; e presença
358 e 380
100%/100%
?
50 µL 20 mM
Tris-HCl pH 7,0
+ 0,01% SDS
Microflex LT
HCCA;
Bradicinina (15) e
Bradicinina (17)
100 1000
Δ 476, 498 e
521 Da
100%/100%
alça 1 µL
20 e 50 µL 20
mM Tris-HCl pH
7,0; ou 0,45%
NaCl
?
Δ 476, 498 e
521 Da
20 µL Tris-HCL
100% Classe A e
B em 2 horas; e
100% CHDL em
4 horas
Carvalhaes et
al., 2012
Acinetobacter spp., P.
aeruginosa,
Enterobactérias (cepas
controles)
61
OXA-23; OXA-23 e
143; OXA-24 e 143;
OXA-25; OXA-26;
OXA-58; IMP-1; IMP10; GES-5; SPM-1;
VIM-1; GIM-1; KPC2; NDM-1
Hrábak et al.,
2012
Enterobactéria e
Acinetobacter spp.
145
NDM-1, KPC 2 e 3,
VIM-1, OXA-48 e
OXA-162
Hoyos-Mallecot
et al., 2013
aeruginosa; cepas
controles
Lee et al., 2013
aeruginosa,
controles)
63
IMP, VIM, KPC
101
IMP, SIM, VIM, OXA23, NDM, KPC,
ISAba1-OXA-51
ágar MH
ágar MH
EDTA
Ertapenem
0,25 g/L
4 horas
-
Ertapenem
0,5 g/L
2, 4, 6 e 12
horas
HCCA
HCCA
Microflex LT
HCCA
178
Anexo 2
Alvarez-Buylla
et al., 2013
Acinetobacter spp.
70
IMP, OXA-23, OXA24, OXA-58, ISAba1OXA-51
?
109-1010
UFC/mL
0,45% NaCl; ou
20 mM Tris-HCl
pH 7,0; ou
Citrato de
amônio 10 mM
pH 7,0;
todos ± SDS
Sauget et al.,
2014
Enterobactérias
372
OXA-48
ágar MH
alça 10 µL
1 mL 0,45%
NaCl
-
g/L
1 hora
HCCA
Microflex LT
HCCA
200-500
Razão das
áreas M/Mh;
positivo ≤ 0,46
99% / 97%
Vogne et al.,
2014
aeruginosa,
controles)
47
KPC, VIM,NDM,
OXA-48
ágar
sangue
McFarland 7
1 mL 0,45%
NaCl (tubo de
vidro)
-
Disco
ertapenem
10 µg
1 hora
HCCA
Microflex LT
?
400-600
Δ 476 e 498; e
presença do
478, 496
100%/100%
Knox et al.,
2014
Enterobactérias
105
KPC, NDM, IMP,
VIM,OXA-48
ágar
sangue
alça 1 µL
100 µl 0,45%
NaCl
-
Imipenem 0,25
g/L
4 horas
HCCA
Vitek MS
Imipenem
200-700
Δ 300 Da; AUC
300 < 5% AUC
controle
87%/100%
8 mL
Tubo gel
separador, H2O
estéril
-
Ertapenem 0,5
g/L
Microflex LT
HCCA; e
Bradicinina (17)
400-600
Δ 476 e 498 Da
D1: 100% classe
A e B em 4 horas,
D2: 100% CHDL
em 4 horas
8 mL
4 passos de
centrifugação e
lavagem com
H2O estéril
-
Ertapenem
0,25 g/L
Microflex LT
HCCA;
Bradicinina (15) e
Bradicinina (17)
100 1000
Δ 476, 498 e
521 Da
100%/95%
KPC-2, OXA-23,
OXA-72, SPM-1
Carvalhaes et
al., 2014
Frascos positivos de HMC
Hoyos-Mallecot
et al., 2014
Frascos de HMC
inoculados com cepas
controles
100
39
-
IMP, VIM, KPC,
OXA-48
-
DPA
- 5 g/L
1 hora
HCCA
2 e 4 horas
4 horas
HCCA
HCCA
Microflex LT
HCCA;
Bradicinina (15) e
Bradicinina (17)
100 1000
Redução
significativa dos
picos 300 e 489
Da
Melhor: Tris-HCl
ou NaCl sem
SDS; 1g/L
imipenem/
inóculo 1010
UFC/mL; 1 hora
de incubação
179

CECILIA HELENA VIEIRA FRANCO DE GODOY CARVALHAES

Transcrição

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