BB. Extração líquido-líquido da Proteína Verde

ISSN 1808-4532
e-ISSN: 2179-443X
Rev Ciên Farm Básica Apl., Araraquara, v. 37 Supl. 1, Agosto 2016
BB. Extração líquido-líquido da Proteína Verde Fluorescente (GFP) recombinante produzida por
Escherichia coli utilizando sistemas aquosos bifásicos compostos por polímeros
Nathalia Vieira dos Santos1, Camila Lopes1, Sandro Roberto Valentini1, Fernando Lucas Primo1, Jorge
Fernando Brandão Pereira1.
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Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP.
Introdução: A GFP possui ótimas propriedades para atuar como biossensor e biomarcador, mas seu preço
elevado limita seu uso. O estudo de novas metodologias de extração líquido-líquido pode solucionar essa
limitação. Dentre as técnicas de baixa resolução de purificação industrial de proteínas, os sistemas aquosos
bifásicos (SABs) vêm ganhando espaço na recuperação de biomoléculas de interesse, visto que apresentam
bom custo-benefício, facilidade de escalonamento, biocompatibilidade e facilidade de integração com outras
técnicas de downstream, o que os torna promissores para uma extração mais barata e efetiva da GFP. Objetivo:
Desenvolver um processo alternativo de extração líquido-líquido para a recuperação da GFP a partir de lisados
celulares de E. coli recombinante, utilizando SABs compostos pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e
poliacrilato de sódio (NaPA). Metodologia: Cepas de E. coli BL21(DE3) com os plasmídeos pET28(a) e
pLysS foram utilizadas para a produção da GFP. A fermentação ocorreu em meio de cultura Luria-Bertani
com os antibióticos canamicina (50 µg/mL) e cloranfenicol (50 µg/mL), a temperatura de 30 ºC, agitação de
150 rpm, com 6 horas de fermentação e cultivo induzido por IPTG (0,5 mM). O caldo fermentado foi
submetido a processos de congelamento e descongelamento (4 ciclos) para lise celular e liberação da GFP. Os
SABs foram constituídos por diferentes misturas de agentes formadores de fase preparados em tubos graduados
de 15 mL, contendo 10% de lisado celular em 5 g de massa total de sistema. Foram preparados seis SABs que
tiveram concentração (m/m) fixa de poliacrilato de sódio com massa molecular (MM) de 8000 g/mol (NaPA8000, 15%) e concentrações variadas de polietilenoglicol com MM de 600 g/mol (PEG-600, 15% ou 20%) e
cloreto de colina (ChCl, 1%, 3% ou 5%). Após o tempo de equilíbrio (1 h), as fases aquosas imiscíveis foram
separadas (fase topo e fase fundo), e avaliadas na efetividade de recuperação da GFP por análise de intensidade
de fluorescência (excitação a 395 nm e emissão a 509 nm) e na eficiência de extração (massa de GFP
recuperada na fase de topo relativa à massa total presente no sistema). A composição das fases foi identificada
por análise de condutividade e pH. Resultados e discussão: A partir dos dados de condutividade foi
identificado que a fase topo era rica em PEG-600 e a fase fundo rica em NaPA-8000. A análise da intensidade
de fluorescência mostrou que todos os sistemas apresentaram capacidade para recuperar toda a GFP na fase
rica em PEG, tendo sido observadas eficiências de extração da GFP superiores a 99% (extração completa). Os
SABs não apresentaram diferenças na extração da GFP, sendo promissores para a recuperação e concentração
da GFP. Conclusão: Todos os SABs estudados apresentaram extração completa da GFP na fase PEG-600,
sendo opções válidas para recuperação da proteína de meios fermentados. No entanto, estudos de quantificação
de proteínas totais são necessários para avaliar se além da recuperação, esses SABs também promovem uma
pré-purificação da GFP.
Palavras-chave: GFP, SABs, Purificação de Proteínas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES.