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Aus dem Institut für Kreislaufforschung und Sportmedizin
Abteilung molekulare und zelluläre Sportmedizin
der Deutschen Sporthochschule Köln
Leiter: Univ. –Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch
Einfluss von körperlicher Aktivität auf antioxidative Enzyme und
mitochondriale Signalproteine in der Skelettmuskulatur
von TypII-Diabetikern
von der Deutschen Sporthochschule Köln
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Sportwissenschaft
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Nana Chung
aus
Seoul/Korea
Köln 2012
Erster Referent:
Univ.-Prof. Dr. med. W. Bloch
Zweiter Referent:
Prof. Dr. rer. nat. Klara Brixius
Vorsitzende des Promotionsausschusses:
Univ.-Prof. Dr. med. W. Bloch
Tag der Disputation:
28.02.2012
Eidesstattliche Versicherung
Hierdurch versichere ich an Eides Statt: Ich habe diese Dissertationsarbeit
selbständig und nur unter Benutzung der angegebenen Quellen
angefertigt; sie hat noch keiner anderen Stelle zur Prüfung vorgelegen.
Wörtlich übernommene Textstellen, auch Einzelsätze oder Teile davon,
sind als Zitate kenntlich gemacht.
____________________________
Nana Chung
DANKSAGUNG
An erster Stelle bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. Wilhelm Bloch für die
Bereitstellung des Themas und die langjährige wissenschaftliche Betreuung.
Ebenfalls danke ich Frau Prof. Dr. Klara Brixius für die Forschungs- und
Arbeitsmöglichkeiten. Sie hat mir mit vielen Ratschlägen, hinsichtlich der
inhaltlichen als auch der formalen Aspekte wesentlich geholfen, so dass ich in
den Stoffmassen nicht untergegangen bin.
Darüber hinaus möchte ich Anika Voß , Mojgan Ghilav und Bianca Collins und
allen weiteren beteiligten Kolleginnen und Kollegen des Instituts für
Kreislaufforschung und Sportmedizin für die freundschaftliche Zusammenarbeit,
für die gute Stimmung, die netten Gespräche und ihre Hilfsbereitschaft danken.
Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir diesen Weg ermöglicht und mich
jederzeit unterstützt und motiviert haben. Außerdem möchte ich mich bei meiner
Freundin Helena Kwon bedanken, die mir in anstrengenden Zeiten Kraft gab
und mich jederzeit unterstützt hat.
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG.................................................................................................. 1
1.1 Diabetes, Skelettmuskel und körperliche Aktivität ............................................ 1
1.2 Diabetes und oxidativer Stress ........................................................................... 4
1.3 Antioxidative Schutzmechanismen Superoxiddismutase, Katalase und
Glutathionperoxidase ................................................................................... 9
1.4 Peroxiredoxine als Teil des antioxidativen Systems ...................................... 10
1.5 Oxidativer Stress und mitochondriale Signalproteine..................................... 13
1.6 Fragestellung der Arbeit .................................................................................... 17
2. MATERIAL UND METHODEN..................................................................... 18
2.1 Probandenkollektiv ............................................................................................ 18
2.2 Studienaufbau und Trainingsmonitoring .......................................................... 19
2.3 Herzfrequenz und Watt bei Laktat 2 und 4mmol/l als Leistungsparameter . 21
2.4 Anfertigung von Kryoschnitten .......................................................................... 23
2.5 ATPase-Färbung ................................................................................................ 24
2.5.1 Gebrauchslösungen ............................................................................. 25
2.5.2 Färbevorgang ....................................................................................... 25
2.6 Immunhistochemie............................................................................................. 26
2.6.1 Gebrauchslösungen ............................................................................. 27
2.6.2 Verwendete Antikörper ......................................................................... 28
2.6.3 Färbevorgang ....................................................................................... 30
2.7 Auswertung ......................................................................................................... 33
2.7.1 Auswertung der Fasertypisierung und Faserquerschnitte..................... 33
2.7.2 Auswertung der Immunhistochemie...................................................... 34
I
3. ERGEBNISSE .............................................................................................. 36
3.1 Herzfrequenz und Watt bei Laktat 2 und 4mmol/l als Leistungsparameter in
der Ausdauer- und Kraftrgruppe ................................................................ 36
3.2 Muskelfasertypisierung ..................................................................................... 38
3.3 Faserquerschnitt ................................................................................................ 41
3.4 Immunchistochemischer Nachweis von ROS durch 8-Isoprostan ................ 43
3.5 Immunchistochemischer Nachweis Superoxiddismutase (SOD) .................. 47
3.6 Immunhistochemischer Nachweis Glutathinperoxidase (GPx) ..................... 50
3.7 Immunhistochemischer Nachweis Proxiredoxine ........................................... 53
3.7.1 Immunhistochemischer Nachweis Peroxiredoxin 1 .............................. 54
3.8 Immunhistochemischer Nachweis der mitochondrialen Signalproteine ....... 72
3.8.1 Immunhistochemischer Nachweis PGC1α ........................................... 73
3.8.2 Immunhistochemischer Nachweis NRF1 .............................................. 76
3.8.3 Immunhistochemischer Nachweis TFAM .............................................. 79
4. DISKUSSION ............................................................................................... 82
4.1 Herzfrequenz und Watt bei Laktat 2 und 4 mmol/l als Leistungsparameter in
der Ausdauer- und Kraftgruppe ................................................................. 82
4.2 Muskelfaserverschiebung ................................................................................. 86
4.3 Muskelfaserquerschnitt ..................................................................................... 88
4.4 Trainingsinduzierte Veränderung der Superoxiddismutase (MnSOD) und
Glutathionperoxidase (GPx) im Skelettmuskelgewebe bei TypIIDiabetikern .................................................................................................. 89
II
4.5
Trainingsinduzierte Veränderung der Peroxiredoxin-Isoformen im
Skelettmuskelgewebe bei TypII-Diabetikern ............................................ 92
4.6 Trainingsinduzierte Veränderung der mitochondrialen Proteine (PGC1α,
NRF1, TFAM) im Skelettmuskelgewebe bei TypII-Diabetikern .............. 97
4.7 Die mögliche Bedeutung der beobachteten Veränderungen für den
Diabetiker .................................................................................................. 101
5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................. 106
6. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................... 108
7. ANHANG.................................................................................................... 145
7.1 Abbildungsverzeichnis..................................................................................... 145
7.2 Tabellenverzeichnis ......................................................................................... 150
7.3 Abstacht ................................................................................................... 154
III
Abkü rzungsverzeichnis
Abb.
ADP
AGEs
AK
AMPK
AMPKK
ATP
Abbildung
Adenosin di Phosphat
advanced glycation endproducts
Antikörper
AMP-aktivierten Proteinkinase
AMP-Kinase-Kinasen
Adenosintriphosphat
BMI
BSA
bzgl.
bzw.
°C
ca.
COPD
COX
Cu
Body Mass Index
bovines Serumalbumin
bezüglich
beziehungsweise
Grad Celsius
circa
chronic obstructive pulmonary disease
Cyclooxygenase
Kupfer
Cys.
DAB
dest.
d.h.
DNA
DU
EKG
et al.
Fe
FADH2
Cysteinreste
Diaminobenzidin
destilliert
das heiß t
Desoxyribonukleinsäure
Densitometric Unit
Elektrokardiogramm
et alii (und andere)
Ferrum
Reduzierte Flavin Adenine Dinucleotide
g
GAPDH
GLUT-4
GPx
GR
GSH
GSSG
HCl
Gramm
Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
Glukosetransporter 4
Glutathionperoxidase
Glutathionre-Reduktase
Glutathion
Glutathion-Disulfid
Salzsäure
IV
H2O
H2O2
HF
HRP
IDF
IHC
JNK
Kap.
KAT
Wasser
Wasserstoffperoxid
Herzfrequenz
Horseradish Peroxidase
International Diabetes Federation
Immunhistochemie
c-Jun N-Terminale Kinase
Kapitel
Katalase
kDa
Kg
L
m
M
Min
µl
ml
µm
mmol
Kilodalton
Kilogramm
Liter
Meter
Molare Masse
Minute
Mikroliter
Milliliter
Micrometer
Millimol
Mn
mRNA
mtRNA-Pol
NADPH
NDM
NIDDM
NF-kB
NRF
n.s.
Mangan
Boten-Ribonucleinsäure (messenger-RNA)
mitochondriale RNA-Polymerase
reduziertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
Nicht-Diabetiker (non-diabetic men)
nicht insulinpflichtiger Diabetiker (non-insulin-dependent
diabetic men)
Nuclear factor-kB
Nuclear respiratory factor
nicht signifikant
NO
ONOO¯
O2-OHP
PBS
PFA
Stickstoffmonoxid (Nitric oxide)
Peroxynitrite
Superoxid-Anion
Hydroxyl-Radikal
Signifikanzniveau
Phosphate buffered saline solution (Phosphatpuffer)
Paraformaldehyd
V
PGC
PKC
PPAR
Prx
RNA
RNS
Peroxisome
Proliferator-activated
Receptor
Gamma
Coactivator
pondus hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der
Hydrogenium-Ionen-Konzentration)
Proteinkinase C
peroxisome proliferator activated receptor
Peroxiredoxin
ribonucleic acid
reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species)
ROOH
ROS
SAPK
SD
SOD
Srx
Std.
Tab.
TBS
TFAM
Lipidhydroperoxid
reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
Stress-Activated Protein Kinases
Standard Deviation (Standardabweichung)
Superoxiddismutase
Sulfiredoxin
Stunde
Tabelle
Tris-Buffered Saline (Tris(hydroxymethyl-)aminomethan
mitochondriale Transkriptionsfaktor A
TFB
Transkriptionsfaktor B
pH
1/2
TIMs
1/2
TPx
TRX
TRXR
u.a.
Translokase der äußeren Membran (translocase of the outer
membrane)
Translokase der inneren Membran (translocase of the inner
membrane)
Thioredoxinperoxidase
Thioredoxin
Thioredoxin-Reduktase
unter anderem
UV
vgl.
vs
WHO
z.B.
Zn
*
Ultraviolett
vergleiche
gegen (versus)
World Health Organisation
zum Beispiel
Zink
Significant
TOMs
VI
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Diabetes, Skelettmuskel und kö rperliche Aktivität
Zurzeit gibt es weltweit mehr als 194 Millionen Menschen mit Diabetes mellitus,
das sind 5,1 % der erwachsenen Bevölkerung. In Deutschland wird die Zahl auf
zurzeit ca. 6.9 Millionen Diabetiker geschätzt (HAUNER et al., 2007). Allerdings
geht man von einer Lücke von 40-50 % unerkannter Diabetiker aus
(HOFFMEISTER et al., 1996). Die Häufigkeit des unentdeckten Diabetes
mellitus
ist
vermutlich
in
der
unspezifischen,
symptomarmen
Krankheitsentwicklung von TypII-Diabetes begründet, an dem 90-95 % aller
Diabetiker leiden. Demnach dürfte die tatsächliche Zahl weit höher sein. Die
WHO (World Health Organisation) und die IDF (International Diabetes
Federation) rechnen mit einem Anstieg dieser Zahl bis zum Jahr 2025 auf 333
Millionen weltweit (6,3 % der erwachsenen Bevölkerung). Es wird geschätzt,
dass der Diabetes mellitus zwischen 5 % und 10 % der jeweiligen nationalen
Gesundheitsbudgets in Anspruch nimmt. Verantwortlich für die hohen Kosten
sind in erster Linie diabetesbedingte Komplikationen und Folgeerkrankungen
(HAUNER, 2006). So könnte Diabetes mellitus in Bezug auf die medizinische
Versorgung gravierende sozioökonomische Probleme in der Gesellschaft
verursachen. Daher werden adäquate präventive und gesundheitsförderliche
Gegenmaß nahmen dringend gefordert.
Der Diabetes mellitus TypII ist eine sogenannte Wohlstandserkrankung, die
hauptsächlich als Folge einer immer älter werdenden Bevölkerung, der
hyperkalorischen Ernährungsgewohnheiten und der körperlichen Inaktivität
sowie der hieraus resultierenden Adipositas zu sehen ist (MOKDAD et al., 2001;
KÖ NIG et al., 2006; WEI et al., 2008). Der am häufigsten vertretene Diabetes
mellitus TypII tritt vor allem bei Personen über 65 Jahren auf. Allerdings wird der
Diabetes TypII auch bei immer mehr jüngeren Menschen diagnostiziert
(KERNER et al., 2004). Ü bergewicht und körperliche Inaktivität (veränderte
Körperkomposition mit abnehmendem Muskelanteil und zunehmendem
Fettanteil) stören die Insulinwirkung am Gewebe, hauptsächlich Muskel, Leber
und Fettgewebe, in empfindlichem Maß e und können zur Insulinresistenz
führen (TUOMILEHTO et al., 2001; FERRARA et al., 2006). Die Folge der
mangelnden Reaktion des Gewebes auf Insulin ist ein Anstieg der
1
Einleitung
Glukosekonzentration im Blut. Um das verminderte Ansprechen der Zielorgane
zu kompensieren, schütten die ß -Zellen des Pankreas vermehrt Insulin aus. Mit
dieser Mehrsekretion gelingt es zunächst den Glukosespiegel im Normbereich
zu halten. Irgendwann kann das Pankreas die überhöhte Insulinproduktion aber
nicht mehr aufrechterhalten. Die produzierte Insulinmenge reicht dann nicht
mehr aus, um die Glukosekonzentration im Blut zu kontrollieren und der
Diabetes mellitus TypII wird manifest (TUOMILEHTO et al., 2001; POITOUT &
ROBERTSON, 2008).
Die Insulinresistenz beim metabolischen Syndrom betrifft primär die
insulinstimulierte Glukoseaufnahme im Muskel, da dieser für ca. 80 % der
postprandialen Glukoseverwertung verantwortlich ist (YKI-JÄ RVINEN, 2005).
Durch körperliche Aktivität kann die Insulinsensitivität der Muskelzellen über
verschiedene metabolische und strukturelle Adaptationsmechanismen erhöht
werden. An diesem Anstieg der Insulinsensitivität in der Muskulatur sind sowohl
vor allem stärkere Insulinbindung an Insulinrezeptoren der Muskelzellen als
auch eine Zunahme der muskulären Insulinrezeptoren, die gesteigerte Aktivität
zytoplasmatischer und mitochondrialer Enzyme und die Zunahme der
Kapillardichte beteiligt (BUTZ et al., 2004; SIGAL et al., 2004). Der muskuläre
Glukoseverbrauch steigt zum einen wegen des vermehrten Angebotes über den
gesteigerten Blutfluss. Die verstärkte Durchblutung der Muskulatur sorgt dafür,
dass das im Blut vorhandene Insulin mehr Insulinrezeptoren erreicht. Zum
anderen
führt die körperliche Belastung zu einer Verbesserung des
Glukosetransporters (so genannte GLUT4-Proteine) in die Zelle, welcher
insulinabhängig ist (O'GORMAN et al., 2006). Aber auch eine
trainingsinduzierte Vermehrung der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) führt
insulinunabhängig zu einer Erhöhung der GLUT4-Translokation in die
Muskelzelle, da ein Abfall des Verhältnisses ATP/AMP während körperlicher
Belastung die Aktivität der AMPK steigert (JESSEN & GOODYEAR, 2005).
Aufgrund der sowohl durch Insulin als auch durch kontraktile Aktivität
stimulierten GLUT4-vermittelten Glukoseaufnahme ist die Muskelzelle in der
Lage, einen groß en Teil der mit der Nahrung zugeführten Glukose
aufzunehmen, als Brennstoff zu verwenden oder in Form von Glykogen zu
speichern. Somit kann die Zelle mit der gleichen Menge an Insulin mehr
Glukose aus dem Blut aufnehmen (SALTIEL & KAHN, 2001). Auß erdem
werden noch weitere Mechanismen wie die vermehrte intrazelluläre
2
Einleitung
Kalziumfreisetzung, NO oder Bradykinin für eine erhöhte GLUT4-Translokation
und damit eine Verbesserung der Insulinresistenz diskutiert (JENSSEN &
GOODYEAR, 2005).
Zusätzlich stehen Skelettmuskeleigenschaften in Verbindung mit Diabetes
mellitus TypII (SALTIN & HELGE, 2000). Insulinresistente Personen verfügen
über weniger Muskelfasern vom TypI, die mehr Mitochondrien enthalten und die
Energieversorgung mittels Oxidation gewährleisten, während die Muskelfasern
vom TypII glykolytisch funktionieren (GASTER et al., 2001; STEINACKER et al.,
2002; VAN LOON, 2004). Hierzu stellten Gaster et al. 2001 in ihrer Studie, eine
positive Korrelation zwischen dem Insulinstoffwechsel und dem Prozentsatz an
TypI-Muskelfasern im M. vastus lateralis fest. Ihre Untersuchung ergab, dass
die GLUT4-Dichte in den langsamen TypI-Fasern höher als bei den schnellen
TypII-Fasern war. Bei den TypII-Diabetikern war die GLUT4-Dichte in den
langsamen TypI-Fasern um 9% reduziert im Vergleich mit den adipösen
Probanden und um 18% im Vergleich mit den normalgewichtigen Probanden.
Zudem fanden sie heraus, dass die Anzahl der langsamen TypI-Fasern bei den
Adipösen um 86% und bei den TypII-Diabetikern um 75% geringer ist als bei
den Normalgewichtigen. Andere Untersuchungen von Nyholm et al. 1997 und
Lowell und Shulman, 2005 zeigten, dass Nachkommen von TypII-Diabetikern
zu einer erhöhten TypIIx-Muskelfaserverteilung neigen. Die Verteilung der
restlichen Muskelfasern und der Kapillardichte zeigte aber keine Veränderung.
Die aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse deuten einerseits auf einen
genetischen Defekt hin, könnten aber andererseits auch nur die Folge von
mangelnder körperlicher Aktivität sein. In der Studie von Thamer et al. 2003
zeigte auß erdem, dass die TypII-Diabetikern eine signifikant niedrigere VO2max
hatten. Eine Erklärung für dieses Ergebnis könnte auch das Verteilungsmuster
von TypI- und TypII-Muskelfasern sein. TypI-Muskelfasern sind maß geblich an
der Sauerstoffverwertung im Organismus beteiligt. Dadurch könnte sich bei
einer Verteilung zugunsten von TypIIx-Fasern die VO2max verringern und so
einen Beitrag zu einer schlechteren Lipidverwertung leisten. Obwohl die
beschriebene Studie die reduzierte Anzahl an TypI-Fasern und die verminderte
GLUT4-Expression für die Entwicklung der muskulären Insulinresistenz
verantwortlich machen, scheint aber das Fasertypenverhältnis eines Muskels in
gewissen Grenzen erblich bedingt zu sein (SIMONEAU & BOUCHARD, 1995;
KRIKETOS et al., 1996; TANNER et al., 2002). Dies ist jedoch unter dem
Einfluss physischer Belastungen modulierbar. Je nach Intensität und Umfang
3
Einleitung
einer Belastung kann es zu Umwandlungen von Fasertypen kommen, die einen
positiven oder negativen Einfluss bei TypII-Diabetikern haben können (PETTE,
2001; PETTE & STARON, 2001; WIDMAIER et al., 2004; SZENKUTI, 2004;
FRESE et al., 2010).
Wie bereits erwähnt, sind die Mechanismen, über die ein vermehrtes
körperliches Training zu einer Erhöhung der Insulinsensitivität führen kann,
vielfältig. Zum einen wurde eine erhöhte GLUT4-Bildung gefunden, zum
anderen wurden eine Umverteilung von Muskelfasertypen und eine
Durchblutungssteigerung in der Muskulatur festgestellt (DUNSTAN et al., 2002;
DI LORETO et al., 2005; YASPELKIS, 2006). Auß erdem verändert körperliches
Training die Körperzusammensetzung durch eine Reduktion der Fettmasse und
Erhöhung der Muskelmasse (WILMORE et al., 1999; DUNSTAN et al., 2002;
CUFF et al., 2003; BALDUCCI et al., 2004; DI LORETO et al., 2005).
Körperliche Aktivität kann somit in verschiedener Hinsicht positiv beeinflussen
und somit kommt eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Krankheit
und dem Schutz vor Komplikationen des Diabetes zu.
1.2 Diabetes und oxidativer Stress
Wichtige Stoffwechselprozesse zur Energiegewinnung sind ohne Sauerstoff
nicht möglich. Während dieser komplexen Vorgänge entstehen in der Zelle
unvermeidbare Nebenprodukte des Sauerstoffes (DAVIS et al., 1982; REZNICK
et al., 1992). Man nennt sie „freie Radikale“. Unter freien Radikalen werden
hochreaktive Atome oder Moleküle verstanden, die ein oder mehrere
ungepaarte Elektronen aufweisen (CHEESEMAN & SLATER, 1993; ASMUS et
al., 2000) und die überwiegend vom Sauerstoff stammen (FRIDOVICH, 1978;
KODAMA, 1988). Freie Radikale können aufgrund der hohen Reaktivität
verschiedene biologische Moleküle oxidieren, wie Lipide, Protein oder DNA
(STADTMAN & LEVINE, 2000; DRÖ GE, 2002), welche die intrazelluläre und
extrazelluläre Umgebung verändern können. Hierdurch kann die lebenswichtige
Funktion dieser Umgebung ungünstig verändert werden (DRÖ GE, 2002;
RENSING et al., 2005; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007). Zu den freien
Radikalen gehören das Superoxid, das Hydroxylradikal, das Perhydroxylradikal,
das Alkoxylradikal und das Peroxylradikal und zu deren nicht radikalischen
Derivaten Singulettsauerstoff, Hydroperoxid und Wasserstoffsuperoxid (CAI &
4
Einleitung
HARRISON, 2000; NIESS et al., 2002; WOLIN et al., 2002; ELMADFA &
LEITZMANN, 2004). Freie Radikale sind aber nicht nur aggressive
Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können Teil eines normalen
biologischen Prozesses sein und auch in niedrigen oder moderaten
Konzentrationen ein nützlicher physiologischer second messenger sein und als
Vermittler der zellulären Immunantwort bei intrazellulären Signaltransduktionswegen mittels Modifikation der Zielproteine oder durch Veränderung des
intrazellulären Redoxzustandes fungieren (FINKEL, 1998; RHEE, 1999;
THANNIKAL et al., 2000; RENSING et al., 2005; VALKO et al., 2007; BARTOSZ,
2009).
Prooxidative Substanzen im Körper, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und
reaktive Stickstoffspezies (RNS) entstehen durch Oxidationsreaktionen. Sobald
die körpereigenen Antioxidantien die Konzentration an freien Radikalen nicht
mehr hinreichend kontrollieren können, kann dies auf zellulärer Ebene zu
erheblichen Schäden führen. Die Wirkung dieser Schädigung wird als oxidativer
Stress bezeichnet. Oxidativer Stress ist also ein Zustand, bei dem das zelluläre
Redoxgleichgewicht zwischen Oxidantien und Antioxidantien gestört ist
(DALLE-DONNE et al., 2006); er kann begünstigt werden durch die
unvollständige Reduktion von Sauerstoff in der mitochondrialen Atmungskette
und als Nebenprodukte normaler metabolischer Reaktionen im Zytoplasma, im
endoplasmatischen Retikulum, in der Plasmamembran und in den Peroxisomen
(OHLENSCHLÄ GER, 2000; RABILLOUD et al., 2002). Darüber hinaus
bewirken Erkrankungen, Lebensstilfaktoren (Nikotin, Alkohol etc.) und auch
Umweltfaktoren, z. B. (Ozon, UV-Licht, Strahlung, Hitze etc.) eine übermäß ige
Bildung freier Radikale (JACOB & BURRI, 1996; BLOCK, 1999; HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2007). Immer klarer deuten experimentelle und klinische
Studien darauf hin, dass vermehrte freie Radikale und oxidativer Stress
langfristig zahlreiche, meist altersassoziierte Krankheiten sowie chronische
Erkrankungen auslösen oder in ihrer Entwicklung beschleunigen, wie z. B.
Tumorerkrankungen,
arteriosklerotische
Herzkreislauferkrankungen,
Altersdiabetes (CHRISTEN, 2000; FRIDLYAND & PHILIPSON, 2006),
chronisch degenerative Erkrankungen des ZNS, der Lunge, des Intestinums,
der Gelenke und des Auges sowie Alterungsprozesse (SALGANIK, 2001;
RAHMAN, 2007). Aus diesem Grunde gewinnt die diagnostische Beurteilung
und therapeutische Beeinflussung des oxidativen Stresses zunehmend an
5
Einleitung
Bedeutung (BERG & KÖ NIG, 2000).
Die intrazelluläre Hyperglykämie scheint der Auslöser für die Aktivierung
verschiedener Stoffwechselwege zu sein, die zu einer gesteigerten ROSProduktion führen (NISHIKAWA et al., 2000). Die genauen Mechanismen, die
zur erhöhten Bildung von ROS beim Diabetes mellitus bzw. bei einer
Hyperglykämie führen, sind bisher nicht komplett geklärt und sind
wahrscheinlich multifaktoriell bedingt (BERNEBURG et al., 2006; BUSIK et al.,
2008). Diskutiert werden einerseits eine erhöhte Bildung von ROS durch
Autooxidation von Glukose und Glukosemetaboliten. Autoxidation findet von
freier Glukose unter Anwesenheit von Ü bergangsmetallen statt, dabei wird O2
reduziert und es entsteht O2-- bzw. in weiterer Folge H2O2. In Gegenwart von
Ü bergangsmetallen kann in Folge auch das hochreaktive OH- entstehen
(BONNEFONT-ROUSSELOT et al., 2000; RÖ SEN et al., 2001; POITOUT &
ROBERTSON, 2008; KANETO et al., 2010).
Unter hyperglykämischen Bedingungen kommt es zu einer vermehrten
Glykolyse. Ü ber den Citratcyclus werden insgesamt mehr Reduktionsäquivalente wie NADH und FADH2 gebildet, die die Energie für die ATPProduktion durch die oxidative Phosphorylierung durch die Atmungskette zur
Verfügung stellen (BROWNLEE, 2001; CERIELLO & MOTZ, 2004; JAY et al.,
2006). Bei Ü berlastung der Atmungskette durch Ü bersteigen eines
Schwellenwertes an einfließ enden Reduktionsäquivalenten kommt es zu einer
Erhöhung der elektrochemischen Potentialdifferenz, die durch den
Protonengradienten generiert wird, entlang der inneren Mitochondrienmembran,
woraus eine verlängerte Halbwertzeit von superoxidbildenden Elektronentransportintermediaten wie z. B. Ubisemichinon resultiert (DU et al., 2001;
YOREK, 2003; FRIDLYAND & PHILIPSON, 2005). Dies führt zu einem
massiven Anstieg von Sauerstoffradikalen, deren Konzentration über weitere
Stoffwechselwege im Glukosemetabolismus noch erhöht wird. Die am
häufigsten diskutierten Stoffwechselwege, die auf die erhöhte ROS-Bildung
zurückgehen und diabetische Folgeschäden resultieren, sind dabei die erhöhte
Aktivität des Polyolstoffwechsels (CAMERON et al., 1994), gesteigerte
Produktion von AGEs (advanced glycation endproducts), erhöhte Aktivität von
PKC (Proteinkinase C)-Isoformen wie z. B. der PKC-β (NISHIKAWA et al.,
2000; BROWNLEE, 2001; EVANS, 2007) sowie die gesteigerte Aktivität des
Hexosamin-Stoffwechselweges (BROWNLEE, 2001). Die Aktivierung der
genannten Mechanismen ist entweder eine direkte Folge der ROS oder der
6
Einleitung
ROS-bedingten
Inhibition
der
GAPDH
(Glyceraldehyd-3-phosphatDehydrogenase) (DU et al., 2003; ROLO & PALMEIRA, 2006; NISHIKAWA &
ARAKI, 2007). Ihre Hemmung führt zur Anreicherung von Glukose und
Zwischenprodukten der Glykolyse. Dieses wird zum einen der Bildung von AGE
und zum anderen der Aktivierung der PKC zugeführt. Ein weiteres
Zwischenprodukt der Glycolyse, Fruktose-6-Phosphat, wird zur Synthese von
Hexosaminen verwendet (POITOUT & ROBERTSON, 2008). Die angereicherte
Glukose wird im Polyol-Weg verstoffwechselt (ROLO & PALMEIRA, 2006).
Andererseits kann ROS selbst als Signalmoleküle mehrere stresssensitive
Signalwege aktivieren. Darüber hinaus gibt es bei TypII-Diabetes zunehmend
Anzeichen, dass die Aktivierung stresssensitiver Signalwege, wie NF-kB
(Nuclear factor-kB), p38 MAPK (p38-mitogenaktivierte Proteinkinasen), JNK (cJun N-Terminale Kinase) / SAPK (Stress-Activated Protein Kinases) und
Hexosamin, durch übermäß ige Produktion von ROS zur Insulinresistenz führen
und die Insulinsekretion stören kann (Abb.1) (BLOCH-DAMTI & BASHAN,
2005; KANETO et al., 2005; KRAMER & GOODYEAR, 2007; RAGEHB et al.,
2009).
Hyperglykämie
ROS in Mitochondrien↑
Oxidativer Stress
•
•
•
•
•
•
•
•
Vaskuläre
Komplikationen
O₂‾ ↑ ₂‾
NO↓
NF-kB↑
p38 MAPK↑
JNK/SAPK↑
Hexosamine↑
PKC↑
AGEs↑
Insulinresistenz
Untergang von β-Zellen
Abb.1: Zellbiologische und molekularbiologische Konzequenzen der Hyperglykämie
induzierten Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
7
Einleitung
Der Körper passt sich bei regelmäß iger körperlicher Aktivität im Sinne eines
Trainingseffekts an. Regelmäß ige körperliche Aktivität wird unter anderem für
die Verbesserung der körpereigenen Schutzmechanismen gegen freie Radikale
verantwortlich gemacht, obwohl intensive körperliche Belastung über den
mitochondrialen
Energiestoffwechsel
mit
einer
Steigerung
der
Sauerstoffaufnahme einhergeht; demzufolge werden Superoxide verstärkt
gebildet. Die positiven Effekte durch körperliche Aktivität scheinen hierbei
zumindest teilweise auf die Steigerung des Gehalts an Antioxidantien und
antioxidativen Enzymen zurückzugehen (LEEUWENBURGH et al., 1994; JI,
1995; LAWLER et al., 2007; BRINKMANN et al., 2010). Tatsächlich wurde in
Untersuchungen von JENKINS et al. 1984 darauf hingewiesen, dass
Ausdauertraining die Widerstandsfähigkeit des Muskels gegenüber
Sauerstoffradikalen erhöht und antioxidative Enzyme mit der oxidativen
Kapazität des Skelettmuskels korrelieren. Obwohl der genaue Mechanismus
der Adaptation des Körpers an oxidativen Stress noch nicht vollständig geklärt
ist, ist jedoch belegt, dass ein Anstieg der freien Radikale die Produktion
spezifischer Transkriptionsfaktoren aktiviert, die in der Folge an die
Promotorregionen ihrer Zielgene binden und somit die Synthese von
antioxidativ wirkenden Enzymen verstärken (BLOCH & SCHMIDT, 2004;
HERSPRING et al., 2008).
Zusammengenommen lässt sich schließ en, dass akute intensive körperliche
Belastungen mit vermehrtem oxidativem Stress verbunden sind, während
regelmäß ige submaximale körperliche Aktivität eine Verbesserung der
körpereigenen Abwehr erreichen kann, beispielsweise eine Verringerung der
Produktion freier Radikale und eine Heraufregulation von antioxidativen
Enzymen (BERG & KÖ NIG, 2000; LAWLER et al., 2007; RENNER, 2008;
MELIKOGLU et al., 2008). Wenn durch körperliches Training die Expression
von antioxidativen Enzymen beeinflusst wird, kann damit eine Grundlage für
eine zukünftige mögliche Nutzung körperlichen Trainings in der Prävention und
Rehabilitation geschaffen werden.
8
Einleitung
1.3
Antioxidative
Schutzmechanismen
Katalase und Glutathionperoxidase
Superoxiddismutase,
Die Entstehung von ROS ist innerhalb des aeroben Stoffwechsels unvermeidlich. So besitzen aerob lebende Zellen Systeme, die dem oxidativen Stress
reparierend entgegenwirken. Ihre Aufgabe besteht darin, schädliche Radikale in
weniger reaktionsfähige Moleküle zu transformieren, um die Kettenreaktion der
Lipidperoxidation wirkungsvoll zu unterbrechen (POWERS & SEN, 2000). Die
Entgiftung von ROS kann dabei sowohl über endogene antioxidative Schutzmechanismen durch die Enzyme Superoxiddismutase (SOD), Katalase (KAT),
Glutathionperoxidase (GPx) und Peroxiredoxine (Prx) erfolgen als auch auf
nicht enzymatischem Wege durch Antioxidantien, wie z. B. β-Karotine,
Glutathion, α-Tocopherol, Ascorbat und Bilirubin.
Endogene Faktoren
O₂
Exogene Faktoren
O₂
Oxidasen
H₂O
Atmungskette
H₂O₂
O₂-
O₂-
Peroxisomen
Mitochondrium
Katalase
MnSOD
H₂O
O₂
H₂O₂
GPx
GSH
CuZnSOD
GSSG
Gu
Fe
GR
OH
Abb.2: Abbauwege der reaktiven Sauerstoffspezies durch die antioxidativen Enzyme
der Zelle.
Die Superoxiddismutasen bilden die erste Verteidigungslinie gegen Angriffe
durch das Superoxidanion, indem sie die Dismutation des Superoxidanions zu
9
Einleitung
Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysieren, welches wiederum durch
Katalase und Gluthationperoxidase in physiologischen Konzentrationen gehalten wird (RISTER & BAUERMEISTER, 1982; MACHIN & BENDICH, 1987;
NOZIK-GRAYCK et al., 2005). Für ihre Aktivität benötigt die SOD verschiedene
Metall-Ionen als Co-Faktoren. Aufgrund der Abhängigkeit von verschiedenen
Co-Faktoren werden Untergruppen des Metallproteinenzyms unterschieden.
Die Mangan-superoxiddismutase (MnSOD), SOD2 genannt, befindet sich
vorwiegend in den Mitochondrien, während die Gu/Zn-SOD (kupfer- und
zinkabhängig) primär im Zytosol (SOD1) und im Extrazellularraum (SOD3) zu
finden ist. Da die Mitochondrien eine der Hauptquellen von freien Radikalen
sind, ist die MnSOD ein sehr wichtiges antioxidatives Enzym (GREEN & REED,
1998). Das durch Superoxiddismutase entstandene Wasserstoffperoxid wird
weiter mit Hilfe der Enzyme Katalase und Glutathionperoxidase unschädlich
gemacht, indem es zu Wasser und Sauerstoff entgiftet wird. Die Glutathionperoxidase kommt sowohl im Zytosol als auch in den Mitochondrien vor. Bei der
Reaktion der Glutathionperoxidase wird reduziertes Glutathion (GSH) zu
oxidiertem Glutathion-Disulfid (GSSG) in eine weniger reaktive Verbindung
umgewandelt. Verbrauchtes reduziertes Glutathion wird durch GlutathionReduktase (GR) wieder regeneriert (CHARIZANIS et al., 1999). Nicht
umgesetztes Wasserstoffperoxid kann durch Wechselwirkung mit Fe2+ oder Cu+
oder durch Reaktion mit Superoxid (Haber-Weiss-Reaktion, Fenton-Reaktion)
zum Hydroxylradikal disproportionieren, welches oxidative Schäden wie DNASchäden, Protein-Oxidation und Lipid-Peroxidation verursachen kann (Abb. 2).
1.4 Peroxiredoxine als Teil des antioxidativen Systems
Neben der Superoxiddismutase, der Katalase und der Glutathionperoxidase
sind die Peroxiredoxin eine weitere Gruppe der antioxidativen Enzyme, die
besonders unter Stressbedingungen auftreten (HOFMANN et al., 2002; RHEE
et al., 2005). Peroxiredoxine (Prx), die auch als Thioredoxin-Peroxidasen (TPx)
oder Alkyl Hydroperoxid-Reduktase (C22) bezeichnet werden, sind in der Natur
ubiquitär vorkommende Enzyme, die mit ihrer Peroxidase-Aktivität Zellen vor
Schädigung durch oxidativen Stress schützen (MC GONIGLE et al., 1998;
WOOD et al., 2002). Bestandteil dieses Enzymsystems ist ein ca. 22 kDa
groß es Protein. Die werden in groß er Menge produziert, in Säugerzellen
10
Einleitung
machen sie 0,1 bis 0,8 % des löslichen Proteins aus, in Erythrozyten sind Prx
sogar die zweit- oder dritthäufigsten Proteine (MOORE et al., 1991). Für die
Säuger-Prx ist aufgrund von Sequenzhomologien ferner die Einteilung in sechs
Isoformen gebräuchlich (I-VI) (RHEE et al., 1999; HOFMAN et al., 2002). Jede
Isoform befindet sich in ihrem bevorzugten Zellkompartiment (MC GONIGLE et
al., 1998; BAAR & GEDAMU, 2003) (Tab. 1).
Prx.-
Prx.1
Prx.2
Prx.3
Prx.4
Prx.5
Prx.6
Klasse
2-Cystein
2-Cystein
2-Cystein
2-Cystein
atypisches
1-Cystein
2-Cystein
zelluläre
Zytosol
Zytosol
Loka-
Zellkern
Zellmembran
Mitochondrien
Zytosol
Zytosol
Golgiapparat
Mitochondrien
Zytosol
Peroxisomen
lisation
Tab.1: Die sechs Peroxiredoxine (Prx. I-VI), Lokalisation bei Mammaliern (modifiziert
nach Wood et al., 2003).
Sie unterscheiden sich von den klassischen Enzymen Superoxiddismutase,
Glutathionperoxidase und Katalase dadurch, dass sie z. B. keine Metallionen
oder auß er einem Thio-haltigen redoxaktiven Zentrum keine Redox-Cofaktoren
benötigen (KIM et al., 1988) und keinerlei Sequenzhomologien zu Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase oder Katalase aufweisen (CHAE et al., 1993;
VERDOUCQ et al., 1999; AHN et al., 2000). In der ruhenden Zelle halten
Peroxiredoxine durch ihre starke Präsenz und hohe Affinität für Peroxide (Km
für H2O2 < 10 μM vgl. mit 25 μM der Katalase, mit GPx 14 μM) die
Konzentration Letzterer sehr gering (CHAE, 1999; LEE et al., 2001). Dahingegen sind Enzyme wie GPx und Katalase mit ihrer niedrigeren Affinität, aber
höheren Umsatzrate dafür zuständig, den Peroxidüberschuss wieder
abzubauen.
Für diese antioxidative Schutzfunktion der Prx und ihre Struktur spielen intramolekulare, hochkonservierte Cysteinreste eine entscheidende Rolle. Je nach
deren Anzahl und Lokalisation von entweder einem oder zwei konservierten
Cysteinen werden innerhalb der Peroxiredoxinfamilie drei Klassen unterschieden: die 1-Cys-Prx, die typischen 2-Cys-Prx und die atypischen 2-Cys-Prx. Zu
den typischen 2-Cys-Prx gehören dabei die Klassen I-IV; die atypischen 2-CysPrx bilden Klasse V, die 1-Cys-Prx Klasse VI (MC GONIGLE et al., 1998;
HOFMANN et al., 2002; WOOD et al., 2003).
11
Einleitung
1-Cys Prx
2RSH
RSSR +HOH
Cys-SPOH
ROH
Cys-SPH
ROOH
typische 2-Cys Prx
2Cys
2RSH
SP
HOH
2Cys
SR
RSSR
2Cys
atypische 2-Cys Prx
atypische
2RSH
2Cys
RSSR
atypische
2Cys
SPOH
ROH
SRH
SPH
ROOH
SRH
HOH
SP
atypische
2Cys
SR
SPOH
ROH
SRH
SPH
ROOH
SPH
Abb.3: Der katalytische Mechanismus der drei Prx-Typen
A: Typische 2-Cys Prxs , B: Atypische 2-Cys Prxs , C: 1-Cys Prxs.
Während die typischen 2-Cys-Prx Homodimere bilden (ALPHEY et al., 2000;
SCHRÖ DER et al., 2000; SEO et al., 2001), kommen die Peroxiredoxine der
anderen beiden Klassen nur als Monomer vor. Der erste Schritt zum Abbau der
reaktiven Sauerstoffverbindungen läuft bei allen Prx-Klassen gleich ab: In ihrem
katalytisch aktiven Zentrum befindet sich ein konserviertes Cystein im Nterminalen Bereich der Polypeptidkette, welches essentiell für die enzymatische
Aktivität ist, also durch eine Peroxidverbindung zu einer Sulfensäure (CysS OH) oxidiert wird (CHAE et al., 1993; JEONG et al., 1999; KONG et al.,
P
2000). Der weitere Reaktionsmechanismus mit nachfolgender Regeneration
des Cys-S H ist jedoch innerhalb der verschiedenen Klassen von Prx
P
unterschiedlich.
Die
typischen
2-Cys-Prx
(Prx
I-IV)
besitzen
hohe
Sequenzhomologien zu 1-Cys-Prx, weisen jedoch neben dem Cys-S H
P
zusätzlich einen zweiten an der Peroxidasereaktion beteiligten Cysteinrest auf,
der im C-terminalen Abschnitt des Proteins lokalisiert ist (JACOBSON et al.,
12
Einleitung
1989; CHAE et al., 1993). Atypische 2-Cys-Prx (Prx V) besitzen ebenfalls ein
zweites redoxaktives Cystein; dieses befindet sich jedoch auch im N-terminalen
Bereich des Proteins (JEONG et al., 1999). Im zweiten Schritt wird unter
Wasserspaltung die Sulfensäure reduziert. Unter Wasserabspaltung wird daher
nun mit einem verfügbaren Thiol eine Disulfidbrücke gebildet und in Bezug auf
die Reduktion der Sulfensäure unterscheiden sich die drei Prx-Klassen. Bei den
typischen 2-Cys-Prxs kommt es zur Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke zwischen dem Cys-S OH und dem C-terminalen Cysteinrest der
P
anderen Untereinheit (SEO et al., 2001; CHOI et al., 2003), während sich bei
den monomeren atypischen 2-Cys-Prxs eine intramolekulare Disulfidbrücke
ausbildet (MONTEMARTINI et al., 1999). Bei beiden 2-Cys Prx-Klassen kann
die entstandene intra- bzw. intermolekulare Disulfidbindung durch Thioredoxine
wieder in den reduzierten Ausgangszustand überführt werden (POPITZ, 2003).
Die Klasse der 1-Cys-Prx verfügt nur über ein konserviertes Cystein. Bei den 1Cys-Prxs erfolgt die Regeneration des Cys-S H über bisher nicht identifizierte
P
Oxidantien (WOOD et al., 2003).
1.5 Oxidativer Stress und mitochondriale Signalproteine
Die Regulation der mitochondrialen Biogenese ist äußerst komplex, die
genauen Zusammenhänge sind bislang noch unklar. In den letzten Jahren
wurden jedoch einige Regulationsmechanismen (Signalmoleküle, -wege und –
kaskaden) entdeckt, die für die Biogenese des Mitochondriums verantwortlich
sind. Demnach kommt es durch körperliche Aktivität zu einer Vermehrung und
zu einer Vergröß erung der Mitochondrien, wobei Diabetes mellitus TypII mit
reduzierter mitochondrialen Anzahl, Größ e und Funktion assoziert ist. Eine
entscheidende Rolle in diesem Zusammenhang spielen eine Reihe von
signalvermittelnden Proteinen. Zu deren Aktivierung führen Stoffwechselgröß en
wie leistungsabhängige AMP-Produktion, Glykogenentzug und Hypoxie, aber
auch mechanische Reize und die belastungsinduzierte Zunahme des
intrazellulären Ca (HOOD et al., 2006; GEHLERT et al., 2007), sowie die
Produktion ROS an der inneren Mitochondrienmembran (FRESE, 2008). Im
Folgenden werden die Proteine einzeln aufgeführt und deren Funktion
13
Einleitung
beschrieben.
PGC1α ist zum einen ein Protein, das mit Proteinen aus der Familie der
nukleären Hormonrezeptoren (PPARα, PPARγ, TRβ u. a.) interagiert
(PUIGSERVER et al., 1998; KNUTTI et al., 2001; IRRCHER et al., 2003), und
zum anderen der Coaktivator von Transkriptionsfaktoren, die metabolisch
bedeutsame Prozesse stimulieren, wie den Glukosetransporter im Muskel,
Glukoneogenese in Leberzellen (GOFFART, 2002; PUIGSERVER & SPIEGELMAN, 2003), Fettsäureoxidation, oxidative Phosphorylierung, Thermogenese
und die mitochondriale Biogenese bei Ä nderungen der Energieanforderungen
im Muskel (PUIGSERVER et al., 1999; LEHMAN et al., 2000; LOWELL &
SCHULMAN, 2005). Die PGC1α-Regulation der mitochondrialen Biogenese
wird über den Nuclear respiratory factor 1/2 (NRF1/2) und den mitochondrialen
Transkriptionsfaktor A (TFAM) vermittelt. NRF1/2 sind Transkriptionsfaktoren,
die durch PGC1α vermehrt exprimiert oder coaktiviert werden, um sich dann an
Promotorbindungsstellen gewisser Gene, die vorwiegend für Proteine des
Atmungsapparates kodieren, zu binden und deren Expression zu erhöhen
(VIRBASIUS & SCARPULLA, 1994). Für NRF1/2 wurden bereits
Promotorbindungsstellen auf zahlreichen nukleär kodierten Genen gefunden,
die für mitochondriale Proteine kodieren (EVANS & SCARPULLA, 1989;
SCARPULLA, 2002). Letztere stimulieren die Expression von nuklear kodierten
Stoffwechselenzymen und des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (TFAM)
im Zellkern. TFAM ist zusammen mit dem Transkriptionsfaktor B
1/2
(TFB ) und
1/2
der mitochondrialen RNA-Polymerase (mtRNA-Pol) ein notwendiger Faktor des
Transkriptionsapparates, der für die Expression mitochondrial kodierter Gene
verantwortlich ist (CLAYTON, 1991; LARSSON et al., 1994; LARSSON et al.,
1998). TFAM kann direkt durch PGC1α, aber auch indirekt durch seine
Promotorbindungsstelle für NRFs reguliert werden (BRAIDOTTI et al., 1993).
Nach seiner Synthese im Zellkern muss TFAM über die Translokasen der
äuß eren und inneren Mitochondrienmembran (TOMs, TIMs) in das
Mitochondrium transportiert werden, um dann dort seine Wirkung entfalten zu
können (BUGGER, 2006).
14
Einleitung
Muskelarbeit
Hypoxie
Substratdepletion
Leptin
AMP
AMPKK
Glykogen
AMPK
Ca2+
PGC-1
Zellkern
PPAR-α,γ,NRF-1,2
Hemmt:
Proteinsynthese
Cholesterinsynthese
Fettsäuresynthese
Clukose-abhängige Gen-Transkription
mTFA
Mitochondrien
Aktiviert:
GLUT4
PFK, Glykolyse
β-Oxidation, Lipolyse
eNOS
TypⅠ Ausprägung
Abb.4: Signalwege der mitochondrialen Biogenese.
Die wichtigsten trainingsinduzierten Signale zur Steuerung der Genexpression
in der Muskelzelle sind die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration,
mechanische Reize durch die Muskelkontraktion selbst, und die Ä nderung des
Zellstoffwechsels z.B. Spaltprodukte des ATP, Glukose, Glykogen, Sauerstoff
und Sauerstoffradikale. Die durchschnittliche zelluläre Ca-Konzentration ist
selbst bei Belastungen niedriger Intensität erhöht. Ca2+ bindet an das Ca2+Bindungsprotein Calmodulin und aktiviert Ca2+-Calmodulin-abhängige
Proteinkinasen (CaMK). CaMK-abhängige Reaktionen werden über
extrazelluläre Signale, meist Hormone, und durch andere Proteinkinasen (z.B.
PKA, PKC, MAPK, ERK) beeinflusst (HAWLEY & ZIERATH, 2004; HAWLEY et
al., 2005). Eine erhöhte zytosolische Ca2+-Konzentration aktiviert aber auch die
Phosphatase Calcineurin, die die Expression des Transkriptionsfaktors PGC1,
einem Coaktivator für die Bildung weiterer Transkriptionsfaktoren NRFs und
TFAM erhöht (SCHIAFFINO & SERRANO, 2002). Aber nicht nur durch erhöhte
Ca, sondern um die gesteigerten Energieanforderungen durch körperliche
Belastung zu bewältigen, steigert sich die enzymatische Aktivität der PGC1. Die
AMPK ist ein regulatorisches Enzym des gesamten zellulären
15
Einleitung
Energiestoffwechsels und spielt eine Rolle bei den Anpassungen hinsichtlich
der mitochondrialen Biogenese beziehungsweise der Regulation von
Fasertypusmodulen (LIN et al., 2002; WINDER, 2002; HARDIE, 2004;
REZNICK & SCHULMAN, 2006). AMPK wird durch Glykogendepletion, AMPabhängige und -unabhängige AMP-Kinase-Kinasen (AMPKK) und AMP
stimuliert, wobei ein Anstieg der zellulären AMP-Konzentration durch
Muskelarbeit, Substratdepletion (Glukose, Glykogen), Hypoxie und Leptin
beeinflusst werden kann. Die beschriebenen Signalwege könnten jedoch auch
durch unspezifische Signale beeinflusst werden, wie z. B. durch ROS (MARSIN
et al., 2000) und stressinduzierte Hormone (Abb. 4) (HOOD et al., 2006).
Zudem spielen die Belastungsintensität und der Energiestatus vor und während
der Belastung eine groß e Rolle, da in verschiedenen Muskeln bei
vergleichbarer
Glykogendepletion
nach
Belastung
unterschiedliche
Expressionsmuster von Genen beobachtet wurden. Daher implizieren diese
Anpassungsmechanismen durch körperliches Training jedoch die Frage nach
der Differenzierung der Expressionsmuster z. B. in Abhängigkeit von der
Trainingsdauer und der -Intensität, also auch nach Unterschieden zwischen
verschiedenen Trainingsformen wie Ausdauer- und Krafttraining.
Zusammengenommen lässt sich schließ en, dass regelmäß ige submaximale
körperliche Aktivität als Anpassungsmechanismus zu einer Ä nderung der
Expression
von
mitochondrialen
Proteinen
mit
Ä nderungen
der
Signaltransduktion führen kann. Diese Ä nderung könnte eine entscheidende
Rolle bei dem verbesserten Schutz gegen oxidativem Stress und einer
Erhöhung der Stoffwechselkapazität für den Schutz vor Komplikationen des
Diabetes spielen, bei denen die vermehrte ROS-Produktion und verminderte
Stoffwechselkapazität bedingt ist.
16
Einleitung
1.6 Fragestellung der Arbeit
Der gegenwärtige Stand in der Erforschung der pathologisch bedingten
Veränderungen in der Skelettmuskulatur bei Diabetes mellitus TypII lässt eine
genaue Untersuchung der muskulären Adaptation auf körperliche Aktivität im
Hinblick auf die antioxidative Kapazität und die mitochondriale Anpassung als
wichtig erscheinen.
In der vorliegenden Arbeit sollte anhand morphologischer und histochemischer
Untersuchungen von Biopsien aus dem Musculus vastus lateralis geprüft
werden, ob bei körperlicher Aktivität in Form von Ausdauer- oder Krafttraining
bei nicht insulinpflichtigen TypII-Diabetikern (NIDDM) in der Skelettmuskulatur
nach 12 Wochen auf molekularer und zellulärer Ebene Veränderungen oder
Adaptationsmechanismen im Hinblick auf verschiedene antioxidative Enzyme
(MnSOD, GPx und Peroxiredoxine 1-6) und auf die mitochondrialen
Signalproteine (PGC1α, NRF1 und TFAM) nachweisbar sind. Hierzu wurden bei
jeder Untersuchung Probanden mit nicht insulinpflichtigem Diabetes mit nicht
erkrankten übergewichtigen (NDM) Probanden in der basalen Situation
verglichen.
Konkret sollen folgende Fragestellungen beantwortet werden:

Führt Ausdauer- oder Krafttraining bei TypII-Diabetikern zu
Adaptationsmechanismen
in
der
Skelettmuskulatur
(Faserzusammensetzung und Faserquerschnitt) und zu einem
Leistungszuwachs (Watt) und einer niedrigeren Herzfrequenz bei Laktat
2 und 4 mmol/l als Parameter der Leistungsverbesserung?

Führt Ausdauer- oder Krafttraining zu einer Veränderung der Expression
der SOD, GPx und Prx 1-6?

Werden durch Ausdauer- oder Krafttraining die Signalproteine (PGC1α,
NRF1 und TFAM) der mitochondrialen Biogenese verändert?

Ist das Anpassungsvermögen der Skelettmuskulatur fasertypspezifisch?
17
Material und Methoden
2. Material und Methoden
Diese Arbeit entstand im Rahmen der „Ü-50-Studie“ (NDM: 7 Nicht- Diabetiker,
Alter: 53±6 Jahre, BMI: 30±4 kg/m2) und der „DiabetesAktiv-Studie“ (NIDDM) an
der Deutschen Sporthochschule in Köln. Die Probanden und Kontrollpersonen
sollten adipös sein, einen Body-Mass-Index (BMI) von über 30 kg/m2 aufweisen,
um den möglichen Einfluss des Ü bergewichtes/Adipositas bei der
Basalmessung von uns gewählten Parametern zwischen NDM und NIDDM
auszuschließ en, um gezielt diabetes bedingte Unterschiede aufzudecken.
Jedoch konnte dieses Kriterieum (BMI über 30 kg/m2) bei der Probanden
rekrutierung nicht vollständig erfüllt werden.
2.1 Probandenkollektiv
Die Probanden der Zielgruppe waren 32 zuvor inaktive Männer über 30 Jahren,
die nicht insulinpflichtige TypII-Diabetiker (NIDDM) waren, wobei ein Patient
wegen unregelmäß iger Teilnahme und weitere vier aus gesundheitlichen
Gründen aus der Studie ausgeschlossen wurden. Insgesamt haben 27
Probanden (13 in der Ausdauer- und 14 in der Kraftgruppe) die Studie
abgeschlossen, davon wurde bei 7 in der Ausdauer- und 9 Probanden in der
Kraftgruppe eine Muskelbiopsie am Musculus vastus lateralis entnommen. Das
durchschnittliche Alter der Ausdauergruppe betrug 61.0±8.7Jahre und das der
Kraftgruppe 61.5±8.4 Jahre. Das mittlere Gewicht zu Beginn der Studie lag in
der Ausdauergruppe bei 89.6±11.6 kg und in der Kraftgruppe bei 99.7±11.5 kg.
Der durchschnittliche BMI lag in der Ausdauergruppe bei 28.4±3.5 kg/m2 und in
der Kraftgruppe bei 31.1±3.5 kg/m2 (Tab. 2). Die Manifestation der Erkrankung
lag im Durchschnitt 7 Jahre zurück. Inhalt war ein 2 x pro Woche stattfindendes
Ausdauer- oder Krafttraining. Die einzelnen Trainingseinheiten dauerten
zwischen 60 bis 75 Minuten. Zur wissenschaftlichen Evaluation und
Dokumentation der Interventionseffekte wurden im Verlauf des Projektes
insgesamt drei medizinische und wissenschaftliche Untersuchungen
durchgeführt. Die Voruntersuchung T1 fand Mitte Januar 2007 statt. Nach einer
6-wöchigen Ruhephase wurde im März 2007 eine zweite Untersuchung T2
durchgeführt. Im Anschluss begann die 3-monatige Trainingsphase. Kurz vor
Beendigung des Interventionszeitraumes wurde Mitte Juni 2007 die
Abschlussuntersuchung T3 vorgenommen.
18
Alter
Gewicht
BMI
Ausdauergruppe
61.0±8.7
89.6±11.6
28.4±3.5
Kraftgruppe
61.5±8.4
99.7±11.5
31.1±3.5
Tab.2: Tabellarische Darstellung des Probandenkollektives.
Ausschlusskriterien waren, ein insulinpflichtiger TypII-Diabetes, akute und
unbehandelte
diabetische
Gefäß komplikationen,
Nephrophathie
und
Retinopathie, Anämie oder COPD, sowie Alkohol- und Drogenmissbrauch.
2.2 Studienaufbau und Trainingsmonitoring
Sowohl die „Ü50-Studie (NDM)“ als auch die „DiabetesAktiv-Studie
(NIDDM)“ waren analog aufgebaut. Bei jeder Untersuchung wurden die nichtinsulinpflichtigen TypII-Diabetiker (NIDDM) mit nicht an Diabetes erkrankten
übergewichtigen Männern (NDM) als Kontrollgruppe nur in der basalen
Situation miteinander verglichen. Vor der zweiten Untersuchung wurden
Probanden (NIDDM) randomisiert in eine Ausdauer- und eine
Krafttrainingsgruppe eingeteilt. Zudem wurden bei beiden Trainingsgruppen in
der ersten und letzten Trainingswoche isometrische Kraftmessungen
durchgeführt.
Das
sporttherapeutische
Ausdauertraining
fand
im
Ergometerraum der Sporthochschule Köln statt. Vor und während des Trainings
wurde bei jedem Probanden sowohl der Blutdruck als auch die Herzfrequenz
gemessen sowie nach dem subjektiven Empfinden (BORG-Skala) gefragt.
Die
Trainingsbelastung
wurde
individuell
basierend
auf
dem
Untersuchungsprotokoll des Belastungs-EKGs der Eingangsuntersuchung bei
einer Intensität von ca. 2 mmol/ l Laktat festgelegt, um so ein Training unter der
aeroben Schwelle anzustreben. Jede einzelne Trainingseinheit war in 4 Phasen
eingeteilt. Zu Beginn gab es eine 2-minütigen Aufwärmphase (< 50% der
empfohlenen Trainingswattbelastung), folgte eine zweite 5-minütige
Aufwärmphase
mit
progredienter
Belastung
bis
die
festgelegte
Trainingsbelastung gesteigert wurde. Die 3. Trainingsphase (eigentliche
Trainingsphase) dauerte beginnend 15 Minuten und wurde progressiv bis zum
Ende des Interventionszeitraumes auf 40 Minuten gesteigert. Das subjektive
Belastungsempfinden sollte zu Beginn als leicht und später bis maximal
anstrengend
empfunden werden. Eine 3-minütige Erholungsphase, die
19
Belastung in dieser Phase allmählich auf null Watt heruntergefahren wurde,
beendete jedes Training. Zusätzlich wurden den Teilnehmern der
Ausdauergruppe während der Studie die richtigen Bewegungsabläufe des
Nordic Walkings vermittelt, so dass dieses eine Möglichkeit des individuellen
wöchentlichen Heimattrainings darstellen konnte.
Das Krafttraining beinhaltete die Nutzung von anfangs 8, später 10 bis 11
Geräten im Kraftraum des Instituts für Trainingswissenschaft und
Sportinformatik der Sporthochschule Köln. Folgende Ü bungen wurden von den
Probanden durchgeführt: Brustpresse (M. pectoralis major); Latissimuszug (M.
latissimus dorsi, M. bizeps brachii); Beinpresse (M. quadrizeps femoris, M.
glutaeus maximus); Beinstrecker (M. quadrizeps femoris); Beinbeuger (M.
bizeps femoris) ; Hyperextensionsbank (M. erector spinae); Crunches (M.
rectus abdominis). Die Ü bungen für die Bauchmuskulatur und
Rückenmuskulatur wurden mit dem eigenen Körpergewicht bis zur muskulären
Erschöpfung durchgeführt. Nach sechs Wochen wurden die folgenden beiden
Trainingsgeräte noch zusätzlich in den Trainingsplan der Probanden
aufgenommen, um das Training noch vielseitiger und abwechslungsreicher für
die Teilnehmer zu gestalten: Ruderzug (M. latissimus dorsi, M. bizeps brachii,
Mm. rhomboidei); Schulterpresse (M. deltoideus, M.trapezius).
Das Trainingsgewicht wurde zu Beginn der Intervention über das 1RM und im
weiteren
Verlauf
über
das
subjektive
Belastungsempfinden
der
Teilnehmerfestgelegt. Zur Vermeidung von zu hohen Blutdruckanstiegen
trainierten die Teilnehmer im mittleren bis maximal schweren Bereich ihres
subjektiven Belastungsempfindens. Die Pausenzeiten zwischen den einzelnen
Trainingssätzen dauerten zwischen ein und zwei Minuten. Bei der Durchführung des Krafttrainings wurde das Trainingsprinzip der progressiven
Belastungs-steigerung angewendet, damit sich die Trainingsbelastung
kontinuierlich dem neuen Kraftniveau des Teilnehmers anpasst. Das
Krafttraining gliederte sich in 3 Phasen (Gewöhnungs-, Kraftausdauer- und
Muskelaufbauphase). Zuerst stand im 3-wöchigen Vortraining das Erlernen und
Einüben der richtigen Bewegungsausführung an den Geräten, das
Trainingsgewicht, die Wiederholungszahl und die Schülung des subjektiven
Belastungsempfindens im Vordergrund. Das Training wurde nach dem
Aufwärmsatz bei einer geringen Belastungsintensität (< 30% 1RM) mit 2 Sätzen
a` 20 Wiederholungen durchgeführt. Das darauf folgende 3-wöchige
20
Kraftausdauertraining zielte auf die Verbesserung der lokalen aeroben
Ausdauer der Probanden ab. In der dritten und vierten Woche wurden 3 Sätze
mit 20 Wiederholungen durchgeführt und ab der fünften bis sechsten Woche die
Wiederholungszahl auf 15 Wiederholungen reduziert. Das Gewicht wurde auf
30-60% des 1RM gesteigert. Die Teilnehmer trainierten im mittelschweren
Bereich ihres subjektiven Belastungsempfindens. Schließ lich wurde im 6wöchigen Muskelaufbautraining an der Verbesserung der intramuskulären
Koordination und an der Vergröß erung des Muskelquerschnitts gearbeitet.
Während der 3. Trainingsstufen wurde die Zahl der Wiederholungen von
zweimal 20 über zweimal 15 auf zweimal 12 gesenkt, wobei gleichzeitig die
aufzuwendende Kraft pro Wiederholung von ca. 50% über 70% bis ca. 80 % der
individuellen Maximalkraft gesteigert wurde. An jedem Gerät wurde dabei zum
Aufwärmen und zur Gewöhnung an den jeweiligen Bewegungsablauf ein
Durchgang von 20 (bzw. 15 oder 12) Wiederholungen bei wesentlich
geringerem Kraftaufwand durchgeführt. Die Teilnehmer der Krafttrainingsgruppe
erhielten ein aus acht Ü bungen benstehenden Kräftigungsübungen (Theraband:
oberer Rücken; unterer Rücken; Bauchmuskulatur; Rückenstrecker;
Schultergürtelmuskulatur; Liegestütze auf den Knien/Wand; Knie-beugen;
Wadenmuskulatur) im Rahmen des Heimtrainingsprogramms.
Während des Studienzeitraumes erhielten die Teilnehmer keine begleitenden
Ernährungsempfehlungen. Des Weiteren sollten die Teilnehmern nicht
zusätzlich mit anderen sportlichen Aktivitäten im Studienverlauf beginnen, damit
eine kausale Zuordnung der Trainingseffekte zur durchgeführten Trainingsform
und den erhobenen Parametern erfolgen konnte.
2.3 Herzfrequenz und
Leistungsparameter
Watt
bei
Laktat
2
und
4mmol/l
als
Einer
Leistungsverbesserung
liegt
eine
adäquate
Anpassung
in
leistungsbestimmenden Funktionssystemen zugrunde. Die Wirkung des
Trainings kann sich in einer Zunahme oder auch Abnahme von Herzfrequenz
und Laktatkonzentration äuß ern. Anhand vieler Studien lässt sich gut erkennen,
dass bei ausdauerleistungsfähigen Personen bei gleicher Leistungsintensität
sowohl die Herzfrequenzwerte als auch die Blutlaktatkonzentrationen niedriger
waren (WELTMAN, 1995; MARLIN & NANKERVIS, 2003; LEE et al., 2008).
21
Diese Effekte werden u.a. der Dichte und Lage der Mitochondrien in der Zelle,
dem Kapillarisierungsgrad des Muskels, dem Füllungszustand der
Glycogenspeicher, der Diffusionskapazität für Sauerstoff durch die
Zellmembranen, der vermehrten enzymatischen Aktivität der Muskulatur und
der Sauerstoffbindungs- und Sauerstofftransportkapazität zugeschrieben (IVY
et al., 1980; TESCH et al., 1998; JUEL et al., 2004; MEYER et al., 2005). Diese
Befunde geben Hinweis darauf, dass die Herzfrequenz im Verhältnis zur
Laktatkonzentration als Leistungsparameter zur Einschätzung und Beurteilung
der metabolischen oder enzymatischen Beanspruchung, bei körperlicher Arbeit,
Bedeutung erlangte (BENTLEY et al., 2001) und somit zur Ausdauerleistungsfähigkeitsermittlung und zur Trainingsteuerung und Beurteilung durchgeführter
Trainingsinterventionen neben der Herzfrequenz am aufschlussreichsten ist.
Bei jedem der drei Untersuchungstermine in der Studie wurde mit den
Probanden eine Belastungsuntersuchung auf dem drehzahlunabhängigen
Ergometer durchgeführt, um zu erkennen, ob Probanden unter körperlicher
Belastung Beschwerden ausweisen würden. Die Belastung auf dem
Fahrradergometer (Ergometrics ER900, Ergoline® , Bitz) fand nach dem WHOSchema statt. Die Untersuchung begann mit einer Belastung von 25 Watt, die
nach jeweils 2 Minuten ohne Pause um 25 Watt bis zur Ausbelastung gesteigert
wurde. Während der Belastung wurde ein kontinuierliches EKG (Ergoscript
EK3012, Ergoline® , Bitz), sowie Herzfrequenz und Blutdruck (PolarElektro,
Finnland) registriert. Des weiteren wurde die subjektive Einschätzung der
Belastung eines jeden Probanden am Ende jeder Stufe während der
Untersuchung anhand der BORG-Skala festgehalten. Am Ende jeder
Belastungsstufe wurden 20μl Kapillarblut aus dem Ohrläppchen mit Hilfe einer
standardisierten End-to-End Kapillaren (EKFGmbH, Barleben) zur
Bestimmung der Laktatkonzentration entnommen und in ein mit 1ml
Hämolyselösung vorgefülltes 2ml Eppendorfröhrchen (Eppendorf Hamburg)
überführt und 10 s lang geschüttelt. Die Proben wurden bis zur weiteren
Analyse bei 4°C gekühlt aufbewahrt. Die Analyse der Blutlaktatkonzentrationen
konnte
mit
Hilfe
des
enzymatisch-amperometrischen
Meß prinzips
(elektrochemische oder polarographische Methode) unter Gebrauch des
Labormessgerätes Ebio-Plus (Eppendorf Hamburg) ermittelt werden. Laktat
wird mittels des Enzyms Laktatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxidase
(H2O2) umgewandelt. H2O2 wird an einer ionenselektiven Elektrode oxidiert. Der
22
dabei entstehende Strom ist proportional zur eingesetzten Laktatmenge
(MASSEN, 2008). Anhand der unter Belastung ermittelten Parameter konnte die
Leistungsfähigkeit und die Trainingswirkung quantifiziert werden.
2.4 Anfertigung von Kryoschnitten
Zur Etablierung der Trainingseffekte in der Skelettmuskulatur der Probanden
wurde bei 7 Probanden in der Ausdauer- und 9 Probanden in der Kraftgruppe
eine Muskelbiopsie am Musculus vastus lateralis entnommen. Nach der
Präparation wurde das Muskelgewebe sofort mit Fixerkleber auf einem
Objektträger fixiert und in einem mit flüssigen N2 gefüllten Becherglas auf ca. 196°C tiefgefroren. Anschieß end wurde das mit Tissue Tec® (Sakura Finetek
USA., Inc, Torrance, CA, USA) ummandelte schockgefrorene Gewebe in ein
Gewebekästchen überführt und für die Dauer der Sektion in einem Behälter mit
flüssigem Stickstoff zwischen gelagert. Nach der Präparation wurden die
Proben zur Verwahrung bei -80°C weggefroren. Die Herstellung von
Kryoschnitten erfolgte an einem Kryostaten (Frigocut 2700, Reichenberg-Jung,
Nussion). Um eine optimale Schneidequalität zu erreichen und die
Gewebequalität zu erhalten, wurden die Proben im Kryostaten während des
Schneidens bei -25°C gekühlt. Nachdem die Proben zur besseren Handhabung
in Tissue Tec® eingebettet wurden, erfolgte das Einspannen des Gewebeblocks.
Durch manuelle Bedienung des Geräts wurde die Geschwindigkeit des
Schneidevorgangs bestimmt. Die Präparate wurden bei einer Einstellung von 710μm (ATPase-10μm, Immuno-7μm) geschnitten und anschließ end auf einen
Objektträger (PolysineTM, VWR international, Darmstadt) überführt. Die
Kryostatschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop (B3 OPTECH,
Exacta+Optech GmbH, München) auf Schnittqualität und Faserausrichtung
überprüft. Für die histochemische ATPase-Färbung werden serielle
quergeschnittene Muskelschnitte benötigt Die fertigen Objektträger wurden bis
zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
23
2.5 ATPase-Färbung
Skelettmuskelfasern lassen sich histologisch aber auch biochemisch nach ihren
Anforderungen beim Menschen in drei Haupttypen (TypI-, TypIIa- und TypIIxFasern) einteilen. Unterschiede hinsichtlich der molekularen Zusammensetzung
ihres Myofibrillenapparates, metabolisch in ihrer enzymatischen Ausstattung
und funktionell in ihren Kontraktionsgeschwindigkeiten unterscheiden (PETTE
et al., 1999). Einzelfaser haben TypI-Fasern als langsam kontrahierend, TypIIaFasern als schneller und TypIIx-Fasern als am schnellsten kontrahierende
Fasern der menschlichen Skelettmuskulatur charakterisiert (HARRIDGE et al.,
1996; LARSSON et al., 1997). Und morphologisch spiegeln sie sich in
unterschiedlichem Gehalt ihrer Mitochondrien und unterschiedlicher
Kapillardichte wider. Folglich sind TypI- und TypIIa-Fasern stärker aeroboxidativ ausgerichtet, während TypIIx-Fasern mit geringerer Kapazität der
aerob-oxidativen
Stoffwechselwege
eher
auf
einen
glykolytischen
Energiestoffwechsel angewiesen sind (GRAZOTTI et al., 2001; TONIOLO et al.,
2004; QUIROZ-ROTHE & RIVERO, 2004).
Muskelfasertypisierung erfolgt in dieser Arbeit mittels eines histochemischen
Aktivitätsnachweises der myofibrilliären Adenosintriphosphatase (mATPase)
nach dem Protokoll von Richard Jonkers (BROOKE & KAISER, 1970;
MABUCHI & SRETER, 1980; PETTE & STARON, 2001). Sie basiert auf drei
unterschiedlichen Myosin-Isoformen, deren ATPase unterschiedlich auf pHVeränderungen reagieren. In den gefärbten Präparaten lassen sich drei
verschiedene Farbstufen, TypI-Fasern in Schwarz, TypIIa-Fasern Weiß und
TypIIx-Fasern intermediate, also dunkelbraun oder grau, erkennen.
Abb.5: Lichtmikroskopische Aufnahme, ATPase gefärbter Kryostatschnitt von M.
Vastus lateralis des Quadriceps (Querschnitt): Faser-TypI Dunkelbraun bis Schwarz,
Faser-TypIIa Weiß bis sehr hell, Faser-TypIIx intermediate.
24
2.5.1 Gebrauchslö sungen
Chemikalien
Chemikalie
Hersteller
Adenosine-5’-triphosphat (ATP)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Steinheim
Ammoniumsulfid
Merck, Darmstadt
Calciumchlorid (CaCl2.2H2O)
Merck, Darmstadt
Cobaltchlorid (CoCl2)
Merck, Darmstadt
Entellan
Merck, Darmstadt
Essigsäure
Merck-Schuchrdt, Hohenbrun
Ethanol(C2H5OH)
Hoffmann GmbH & Co., Düsseldorf
Glycin
Potassiumchlorid (KCl)
Merck, Darmstadt
Salzsäure (HCl)
Merck, Darmstadt
Sodiumacetat (C2H3O2Na)
Merck, Darmstadt
Sodiumchlorid (NaCl)
Merck, Darmstadt
Sodiumhydroxid (HNaO)
Merck, Darmstadt
TRIS
VWR International GmbH, Darmstadt
Xylol
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Diessenhofen
2.5.2 Färbevorgang
Verwendetes Standard- Protokoll
1.Saurer Präinkubationspuffer
• 1.95g Sodiumacetat (0.01M) und 1.85g
Potassiumchlorid (0.01M) in 250ml mQ-Wasser
lösen
• Mit 5M Essigsäure diese Lösung auf pH 4.5
(Typ I: Schwarz ,Typ IIa: Weiss,
Typ IIx : dazwischenliegend ) einstellen
2. Waschpuffer
•
12.10g
TRIS
(0.01M)
und
2.60g
Calciumchlorid (0.015M) in 1L mQ-Wasser
lösen
• Mit Salzsäure (HCl) diese Lösung auf pH. 7.8
einstellen
25
3. Glycin Puffer
• 0.79g Glycin, 0.84g Caciumchlorid, 0.76g
Sodiumchlorid und 0.38g Sodiumhydroxid in
200 ml mQ-Waaser lösen
4. ATP- Inkubationslösung
• 340mg ATP in 200ml Glycin buffer 3 lösen
• Mit Salzsäure diese Lösung auf pH 9.4
einstellen
5. 1% Calciumchlorid Lösung
• 2g Calciumchlorid in 200ml mQ-Waaser lösen
6. 1% Cobaltchlorid Lösung
• 2g Cobaltchlorid in 200ml mQ-Waaser lösen
7. 1% Ammoniumsulphid Lösung
• 2ml Ammoniumsulfid zu 200ml mQ-Waaser
hinzufügen
Zuerst wurden die Objektträger 45sec in Lösung 1 mit pH 4,5 inkubiert. Dann
wurden sie in Lösung 2 mit pH.7.8 (3x1min) eingetaucht und anschließ end in
Aqua dest. (3x1min) gewaschen. Zunächst wurden die Schnitte 25min. in
Lösung 4 mit pH. 9.4 inkubiert. Danach wurden sie schnell in Lösung 5
eingetaucht, folgend in Aqua dest. (3x1min) gespült und schließ lich 3min in
Lösung 6 inkubiert. Da die Cobaltchlorid Lösung schädliche und giftige Dämpfe
enthält, muss dieser Schritt unter dem Abzug durchgeführt werden. Nach einem
Spülgang in Aqua dest. (3x1min) wurden die Muskelschnitte schließ lich 1min in
Lösung 7 als schwarze unlösliche Verbindung von der Ammoniumsulfid gefärbt
und wurden letztlich in Aqua dest. (3x1min) gespült. Zum Schluss wurden die
Schnitte in aufsteigender Alkohlreihe (in 70%, 96%, 100% Ethanol) entwässert,
in 100% Xylol aufgehellt und mit 1-2 Tropfen Entellan benetzt dann mit einem
Deckglas eingedeckt. Bei dieser ATPase-Färbung ist allerdings der pH-Wert
aller Lösungen und das Timing von entscheidender Bedeutung, um eine gute
Fasertyp-Differenzierung zu erreichen.
2.6 Immunhistochemie
Ziel dieser Verfahren ist der Nachweis und die Identifikation von antigenen
Komponenten (Epitope) in Zellen und Gewebeschnitten durch spezifische
Antikörper,
die
durch
nachweisbare
Markersubstanzen,
wie
z.B
Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme markiert sind. Mit Hilfe von spezifischen
Antikörpern werden eine gewebegebundene Antigen-Antikörper-Reaktion
sichtbar gemacht und quantitativ ausgewertet.
26
2.6.1 Gebrauchslö sungen
Chemikalien:
Chemikalie
Hersteller
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
BSA (Bovines Serum Albumin)
PAA Laboratories GMBH, Cölbe
Diaminobenzidin (DAB)
Merck, Darmstadt
β-D-Glucose
Merck, Darmstadt
Dinatrium-hydrogenphosphat-Monohydrat
Merck, Darmstadt
(Na2HPO4 x 2H2O)
Entellan
Merck, Darmstadt
Ethanol
Glucoseoxidase
Merck, Darmstadt
Natrium-Dihydrogenphosphat-Monohydrat
Merck, Darmstadt
(NaH2PO4 x H2O)
Nickel-II-Sulfat (NiSO4)
Merck, Darmstadt
Methanol
Merck, Darmstadt
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
VWR International GmbH, Darmstadt
Triton-X
Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA
Wasserstoffperoxid (30%)
Merck, Darmstadt
Xylol
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Diessenhofen
Rezepte fü r die verwendeten Standardlö sungen
Trispuffer (TBS) 0,05 mol pH 7.6:
(100mM Tris; 150nM NaCl)
6.05g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan in 250ml Aqua dest. Lösen
8.766g NaCl (=150 mmol) dazugeben
Mit HCl (Hydrochlorid=1N) auf pH7.6 einstellen
Mit a. dest. auf 1000ml auffüllen
pH 7.6-Kontrolle
Phosphatpuffer (PB) 0.1 mol pH 7.4:
14.4g/l Dinatrium-Hydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O)
2.6g/l Natrium-Dihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x H2O)
27
Mit a. dest. auf 1000ml auffüllen
auf pH 7.4 einstellen
Paraformaldehydlö sung (PFA) 4 %, pH 7,4:
4 g Paraformaldehyd werden bei 60°C in 50 ml Aqua bidestillata vollständig
gelöst. Danach wird die Lösung mit 1 mol/l Natronlauge (NaOH) geklärt,
langsam abgekühlt und filtriert. Anschließ end wird das Gemisch mit 50 ml 0,2
mol/l PBS gemischt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt.
Diaminobenzidin (DAB)- Lö sung 15ml 0.1mol PB [pH 7.4]:
150µl Diaminobenzidin (DAB) = 7.5mg
150µl Ammoniumchlorid (NH4Cl) = 6.0mg
300µl Nickel-II-Sulfat (NiSO4) = 0.05mol
300µl 10% β-D-Glucose
50µl Glucoseoxidase
Filtrieren
Stammlö sung der Substanzen fü r die DAB-Entwicklung
DAB
5000mg/100ml A. dest.
NH4Cl
NiSO46H2O
10% Glucose
Glucose-Oxidase
4000mg/100ml A. dest.
130mg/10ml A. dest.
1g β-D-Glucose/10ml A. dest.
1.2 mg/1ml A. dest.
2.6.2 Verwendete Antikö rper
Die für die Studie ausgewählten Antikörper waren 8-Isoprostan,
Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase, Peroxiredoxine I-VI, PGC1α, NRF1
und TFAM. Als zweiter Antikörper dienten je nach Wahl des ersten Antikörpers.
Die für die immunchistochemischen Analysen verwendeten primären und
sekundären Antikörper, die Verdünnung, die entsprechenden Zielproteine und
die Immungenität sind in der folgenden Tabelle (Tab.3 und 4) genauer
dargestellt.
28
Primäre Antikö rper
Host
Verdü nnung
Hersteller
Anti-8-epi-PGF2α lgG Polyclonal,
Rabbit
1:1500
Natutec, Oxford Biomedica
IS20
Reserch, Oxford,Mi,USA
Superoxide
Dismutase2
lgG
Rabbit
1:500
Abcam, Cambridge, UK
lgG
Rabbit
1:1000
Abcam, Cambridge, UK
Rabbit
1:1000
Acris Antibodies, Hiddenhausen,
Polyclonal, Ab13534
Glutathione
Peroxidase1
Polyclonal,Ab16798
Peroxiredoxin1 lgG Polyclonal,
SP563
Germany
Rabbit
1:1000
LF-PA0007
Korea
Rabbit
1:1000
LF-PA0030
LabFrontier, Daehyundong,
Korea
Rabbit
1:1000
LF-PA0009
Korea
Rabbit
1:1000
LF-PA0010
Korea
Rabbit
1:1000
LF-PA0011
PGC1
Korea
Rabbit
lgG Polyclonal,
1:750
NB100-1750
NOVUS BIOLOGICALS,
Littelton, USA
NRF1 lgG Polyclonal,
Rabbit
1:500
H00004899-A01
Abnova corporation, Niehu,
Taiwan
TFAM lgG Polyclonal,
Rabbit
1:1000
ARP31400-P100
AVIVA SYSTEMS BIOLOGY,
San Diego, USA
Tab.3: Für die immunhistochemische Untersuchung (IHC) verwendete primäre
Antikörper mit Verdünnung.
Sekundäre Antikö rper
Host
Verdü nnung
Hersteller
Goat
1:400
Dako, Glostrup, Hamburg,D
Goat Anti-Mouse HRP
Goat
1:400
Santa Cruz Biotechnology, USA
Goat Anti-Rabbit HRP
Goat
1:400
Santa Cruz Biotechnology, USA
Polyclonal Goat Anti-Rabbit
IgG
ED432
Tab.4: Für die immunhistochemische Untersuchung verwendete sekundäre Antikörper
mit Verdünnung.
29
2.6.3 Färbevorgang
Für die immunhistochemischen Färbungen wurden Kryoschnitte verwendet und
nach einer drei-Schritt-Methode, der Streptavidin-Biotin-Methode gefärbt.
Streptavidin besitzt vier Bindungsstellen für Biotinmoleküle, welche aufgrund
der molekularen Ausrichtung jedoch nicht alle gleichzeitig besetzt werden
können. Zuerst wird ein unkonjugierter Primärantikörper, dann ein
biotinmarkierter Sekundärantikörper und in einem dritten Schritt ein AvidinBiotin-Enzymkomplex verwendet. Abgeschlossen wird dieser Weg auch mit der
Visualisierung durch eine Substrat-Chromogenlösung (DAB) (Abb. 6).
Abb.6:
Immundetektion
(mit
(Strept)Avidin-Biotin-Enzym-Komplex,
biotinylierten
Sekundärantikörpern und 3,3´-Diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB)) (nach
Luttmann et al. 2004).
30
Das Färbeverfahren erstreckte sich über einen Zeitraum von 2 Tagen und lief
nach folgendem Protokoll ab.
Verwendetes Standard- Protokoll
1.Tag
1x20 min.
Inkubation in PFA
3x 5 min.
mit TBS waschen
1x20 min
20ml Methanol＋5µl 30% H2O2+4500µl A.dest.
3x 5 min.
mit TBS waschen
1x10 min.
0.5M Ammoniumchlorid＋0.25% TritonX in TBS
0.59g Ammoniumchlorid＋50µl TritonX＋20ml TBS
3x 5 min
mit TBS waschen
1x60 min
5% BSA (Rinderalbumin) in TBS
(auf dem Schüttler lösen,
BSA kann sonst kaputt
gehen)
Nicht mehr mit TBS waschen
Ü ber Nacht
bei 4°C Inkubation mit 1. Antikörper
(Verdünnung in 0.8% in TBS)
2.Tag
4x5 min.
mit TBS waschen
1x60 min.
Inkubation mit 2. Antikörper
(Verdünnung 1:400 in TBS)
4x5 min.
mit TBS waschen
1x60 min.
Horseradish Peroxidase-Komplex (Verdünnung 1:150)
4x5 min.
mit TBS waschen
DAB- Entwicklung
Die benötigte Zeit muss gestoppt und vor allem
dokumentiert werden.
4x5 min.
mit TBS waschen
je 1x5 min.
In 70%, 96%, 100% Ethanol
1x10 min.
In Xylol
Eindecken
mit Entellan
Zuerst wurden die Gewebeschnitte auf den Objektträgern mit einem
hydrophoben PAP-Pen Markierstift (Polysciences, Warrington, USA) als
Flüssigkeitsbarriere umrandet, um im Folgenden nicht die gesamte Oberfläche
31
des Objektträgers in die einzelnen Behandlungs- und Waschschritte mit
einbeziehen zu müssen. Danach wurden sie 20 Minuten in PFA fixiert. Nach
drei Waschgängen (je 5 min.) mit TBS erfolgte eine 20-minutige Inaktivierung
der eventuell vorhandenen endogenen Peroxidase durch die Methanol/ H2O2Lösung, welche zu einem falsch-positiven Ergebnis führt. Nach drei
Waschschritten (je 5 min.) mit TBS wurde für 10 Minuten auf die Schnitte eine
Lösung aus Ammoniumchlorid/ TritonX Lösung inkubiert. In diesem Schritt
wurden die Fasern durch das TritonX-100 permeabilisiert, d.h. die Membranen
wurden löchrig gemacht, die in den späteren Schritten das Eindringen der
Antikörper in die Zelle ermöglichten. Nach drei weiteren Waschgängen (je 5
min.) mit TBS erfolgte die Blockierung potentieller unspezifischer
Antikörperbindungsstellen mit einer Block-Lösung für eine Stunde (5% BSA
(Rinderalbumin) in TBS). In diesem Blockierungsschritt wurden unspezifische
Bindungsstellen mit dem Protein besetzt, so dass diese nicht mehr vom
primären Antikörper gebunden werden konnten. Damit war die Vorbehandlung
der Präparate abgeschlossen und es konnte mit der eigentlichen
Immundetektion begonnen werden. Zunächst kam es zur Inkubation des
Gewebes
mit
dem
gewünschten
Primärantikörper
(8–Isoprostan,
Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase, Peroxiredoxin I-VI, PGC1α, NRF1
und TFAM), mit Diluent verdünnt in 0.8% BSA/TBS Lösung, 200 μl pro Schnitt,
im Kühlschrank bei 4°C über Nacht. Hier wurde zur Kontrolle eine
immunhistochemische Kontrollfärbung (IHC) durchgeführt. Hier bindete der
Antikörper spezifisch gegen das Antigen, welches nachgewiesen werden soll.
Dabei wurden alle Schritte des immunhistochemischen Standardprotokolls
durchgeführt, nur statt des primären Antikörpers wurde 0.8% BSA aufgetragen,
wodurch dieses keine Färbung erfahren sollte. Generell gilt, dass längere
Inkubationszeiten deutlich unpraktischer sind, dafür aber gerade bei niedrig
affinen Antikörpern weniger Hintergrund-Färbungen erzeugen (SPRICH, 2006).
Am 2.Tag erfolgten vier Waschschritte (je 5 min.) in TBS und die Inkubation mit
dem spezies-spezifischen Sekundärantikörper (biotinlated polyclonal goat-anti
rabbit IgG, DAKO, Hamburg, D, Vernünnung 1:400) in TBS. Als zweiter
Antikörper dienten je nach Wahl des ersten Antikörpers und wurde für eine
Stunde aufgetragen. Der sekundäre Antikörper bindet an das freie Ende des
primären Antikörpers. Im Anschluss wurden die Zellen vier weitere Male (je 5
min.) mit TBS gewaschen und mit einem Verhältnis 1:150 in mit TBS
32
angesetzter
Horseradisch-Peroxidase
(HRP)-Komplex
(Streptavindin
biotinylated Horserdisch Peroxidas complexe. Amersham Biosciences, Freiburg,
Germany) für eine Stunde behandelt, um die enzymatische Färbereaktion
mittels einer Entwicklungsmethode DAB (3,3´-Diamino-Benzidin) (SigmaAdrich) nachweisen zu können. Damit waren die notwendigen Antikörpern und
gekoppelten Enzymlabeln für die Immundetektion (Abb. 6) vervollständigt. Nach
vier Waschgängen (je 5 min.) mit TBS wurde eine DAB-Lösung in
Phosphatpuffer (PB) auf die Schnitte aufgetragen. In diesem Schritt wurde das
DAB durch den HRP-Komplex umgesetzt, was eine bräunliche Färbereaktion
an den untersuchten Proteinen im Gewebe auslöste. Hierbei wurde die
Farbintensität der Proben unter dem Lichtmikroskop ständig beobachtet. Nach
der benötigten Zeit für die Erreichung einer ausreichenden Farbintensität wurde
die Entwicklung durch Abnahme der DAB-Lösung und Waschung in TBS
gestoppt. Schließ lich wurden die Schnitte in einer Alkoholreihe mit
aufsteigenden Konzentrationen (in 70%, 96%, 100% und in Xylol) dehydriert.
Dieser Schritt ist wichtig, da auch das Eindeckmittel Entellan vollkommen
wasserfrei ist, und so die Schnitte lange haltbar sind. Anschließ end wurden sie
mit 1-2 Tropfen Entellan benetzt und dann mit einem Deckglas auf dem
Objektträger eingedeckt.
2.7 Auswertung
2.7.1 Auswertung der Fasertypisierung und Faserquerschnitte
Zur
Messung
der
Fasertypisierung
und
Faserquerschnitte
der
Skelettmuskelzellen wurden pro Probanden die Daten von 400 Muskelfasern
randomisiert aus verschiedenen Gesichtsfeldern ausgewertet. Es wurden
mindestens 10 Gesichtsfelder in die Messung einbezogen. Die Auswertung
erfolgte am Mikroskop (Axiophot, Zeiss, Jena, D) mit dem 20er-Objektiv,
welches an eine digitale Kamera (3CCD, Sony, J) und einen Computer
angeschlossen ist. Zur Vermessung des Faserquerschnitts wurde das
Programm Scion Image (Scion Corporation, MA, USA) verwendet und
standardisiert und die aufgenommenen Fotos als TIFF-Datei unkomprimiert
gespeichert, so dass es nun zur Ausmessung an Hand von Scion Image
verwendet werden konnte. Es wurden Zellen in Querschnitten manuell
33
umfahren. Diese Daten wurden in Microsoft Excel-Tabellen übertragen.
Anschließ end wurden die gewonnen Daten statistisch aufgearbeitet und
visualisiert.
2.7.2 Auswertung der Immunhistochemie
Bei der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen wurden
mittels Graustufendifferenzwertmethode (Densitometrie) unterschiedlicher
Zellabschnitte (Zelle als Einheit, Zellkern und Zytoplasma) analysiert. Als
Standardisierung erfolgte eine dreimalige Hintergrundmessung, zellfreier
Bereich des Gewebeausschnittes. Aus dem gebildeten Mittelwert sollte bei
einer Intensität von 210±5 DU (Densitometric Unit) liegen. Durch die Färbung
wurden Areale mit hohem Proteinanteil dunkeler abgebildet, als Bereich mit
geringerem Anteil. Je größ er die Differenz des densitometrisch gemessenen
Zellwerts zum Hintergrundwert war, desto höher war das Zielprotein innerhalb
der Zelle. Somit standen die berechneten densitometrischen Werte in direktem
Verhältnis zur Proteinexpression des Zielproteins im untersuchten Gewebe. Die
bildliche Dokumentation der angefärbten Gewebeschnitte wurde mit dem
Mikroskop (Axiophot, Zeiss, Jena, D) bei 20-facher Vergröß erung mit digitalen
Kamera (3CCD, Sony, J) und einen Computer durchgeführt. Hierbei wurde im
Hinblick auf die weitere Auswertung darauf geachtet, dass die Einstellungen am
Mikroskop (identische Vergröß erung und Belichtung) und Computer zu jeder
Zeit einheitlich waren, um die Bildbeschaffenheit der Zellabschnitte unverfälscht
beurteilen und vergleichen zu können. Das eingehende Bild wurde unter
Verwendung der Bildbearbeitungsprogramme Image J (Image J 1.33u, National
Institute of Health, USA) standardisiert als TIFF-Datei gespeichert, so dass es
nun zur Ausmessung an Hand von Image J verwendet werden konnte. Pro
gefärbtes Präparat wurden je 40 Faseranschnitte von drei bis vier
Gewebeschnitten ausgemessen. Pro Gesichtsfeld wurden maximal 10 Werte
gemessen. Diese Daten wurden in Microsoft Excel-Tabellen übertragen.
Anschließ end wurden die gewonnen Daten statistisch aufgearbeitet und
visualisiert.
34
2.8 Statistik/Statistische Analyse
Gemessene Werte wurden weiter mittels Microsoft Excel® und SPSS Version
17.0 für Windows statistisch bearbeitet, der Mittelwert und die
Standardabweichung der gemessenen Zelle jedes Probanden, sowie beider
Gruppe berechnet. Zahlenangaben in den einzelnen Tabellen erfolgten als
arithmetischer Mittelwert mit Standardabweichung (x ± s). Um eine Aussage
über die Signifikanz zu treffen, erfolgt eine statistische Auswertung der beiden
Gruppenmittelwerte mit dem Wilcoxon-Test. Sind die Voraussetzungen zum
abhängigen t-Test nicht erfüllt oder fraglich, so bietet der Wilcoxon-Test eine
nichtparametrische Alternative. Dieser Test ist ein verteilungsfreier Test für
abhängige Stichproben. Der Wilcoxon-Test überprüft die bestehende Signifikanz
bezüglich der Veränderungen vor und nach 12 wöchiger Trainingsintervention.
Bei Signifikanzprüfungen wurden Ergebnisse mit der Irrtumswahrscheinlichkeit
von p≤ 0.05 als signifikant angesehen. Mittelwertunterschiede zwischen
Gruppen über die Messzeitpunkte wurden anhand einer ANOVA geprüft. Dieses
sollte Aufschluss über eventuelle Veränderungen des Skelettmuskels, bedingt
durch das 12-wöchige Ausdauer- und Krafttraining, geben.
35
Ergebnisse
3. Ergebnisse
Zur Beurteilung der Leistungveränderung wurden sowohl die Herzfrequenz, als
auch die Leistung (Watt) in der Ausdauer- und Kraftgruppe Vor- und
Nachtraining miteinander verglichen. Um eine bessere Ü bersicht zu schaffen,
wurden die Werte der bei 2 mmol/l Laktat liegenden aereoben und bei 4 mmol/l
Laktat liegenden anaeroben Schwelle herangezogen.
3.1 Herzfrequenz und Watt bei Laktat 2 und 4mmol/l
Leistungsparameter in der Ausdauer- und Kraftrgruppe
als
Abb.7: Mittelwerte und Standardabweichung der Herzfrequenz und der Leistung (Watt)
der TypII-Diabetiker vor und nach 12-wöchigem Ausdauer- und Krafttraining an der
2mmol/l und bei 4mmol/l Laktatschwelle. *mit p≤ o.o5
36
Ergebnisse
Ausdauergruppe 2 mmol/l
4mmol/l
Herzfrequenz
Watt
Herzfrequenz
Watt
Eingangstest
105.6±12.2
75.6 ±21.4
128.1±16.1
124.0±15.0
Ausgangstest
112.7±14.6
100.5±16.1
131.8±19.0
140.9±25.7
Kraftgruppe
2 mmol/l
4mmol/l
Herzfrequenz Watt
Herzfrequenz
Watt
Eingangstest
115.1±11.2
87.5±26.1
136.2±12.5
126.5±36.1
Ausgangstest
112.8±16.2
91.8±41.3
133.2±18.9
147.1±30.4
Tab.5: Ü bersicht der Herzfrequenz und Leistung (Watt) der TypII-Diabetiker vor und
nach 12-wöchigem Ausdauer- und Krafttraining an der
2mmol/l und 4mmol/l
Laktatschwelle (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Bei der Betrachtung der Mittelwerte der Leistungsparameter Blutlaktat 2 und
4mmol/l und Herzfrequenz wird deutlich, dass in der Ausdauergruppe die WattWerte beim Ausgangstest signifikant (mit p≤ 0.01) höher liegen als beim
Eingangstest. Dies spricht für eine Verbesserung der Ausdauerleistungsfähigkeit der Ausdauergruppe. Die mittlere Herzfrequenz stieg gegenüber dem
Vortest signifikant an (mit p≤ 0.05).
In einem Unterschiedstest zwischen Eingangs- und Ausgangstest in der
Kraftgruppe wurde in der bewältigten Belastungsintensität (Watt) nach dem 12wöchigen Training für die Laktatkonzentration 2 und 4 mmol/l ein signifikanter
Unterschied (mit p≤ 0.05) festgestellt, was eine Verbesserung der Ausdauerleistungsfähigkeit der Probanden darstellt. Anders waren in der
Ausdauergruppe die Mittelwerte der Herzfrequenz bei Laktat 2 und 4 mmol/l,
die hier signifikant p≤ 0.05 erhöht im Nachtest gemessen wurden, wohingegen
eine Minderung der Herzfrequenz in der Kraftgruppe gezeigt wurde.
37
Ergebnisse
3.2 Muskelfasertypisierung
Muskelfasern weisen unterschiedliche metabolische und kontraktile
Eigenschaften auf und variieren bezüglich Faserdurchmesser und -länge. Sie
können sich an (patho-)physiologische Zustände, die mit einer veränderten
funktionellen Beanspruchung einhergehen, anpassen. Mögliche Anpassungen
umfassen die Zu- oder Abnahme in Faserlänge und/oder -durchmesser sowie
die Regulation von Genmodulen, welche den Fasertyp determinieren. Je nach
Belastungsart, -intensität und -umfang kann es zu Umwandlungen von
Fasertypen kommen (LEFAUCHEUR et al., 1998; PETTE, 2001; PETTE &
STARON, 2001; WIDMAIER et al., 2004; SZENKUTI, 2004). Je höher die
Intensität einer Belastung, desto mehr Energie wird anaerob gewonnen. Dies
hängt auch mit der unterschiedlichen Rekrutierung der verschiedenen
Muskelfasertypen zusammen. Bei leichter Belastung werden hauptsächlich
TypI-Fasern genutzt. Energie wird aerob erzeugt, die geringen Mengen an
Laktat, die dennoch gebildet werden, werden in der Zelle direkt verstoffwechselt
und erscheinen gar nicht erst im Blut. Nimmt die Belastung zu, werden
zusätzlich TypIIa-Fasern beansprucht, und es überwiegt anfangs die anaerobe
Glykolyse (EATON, 1994). Die Muskelfaserverschiebung gehen sowohl mit
Anpassungsvorgängen hinsichtlich der Mitochondriendichte und der Aktivität
bestimmter Markerenzyme des Energiestoffwechsels, als auch mit
Veränderungen hinsichtlich des Expressionsmusters von MHC-Isoformen
einher (PETTE & STARON, 2001; SPANGENBURG & BOOTH, 2003).
Im Mittelpunkt dieser Nachweise steht die Auswertung der Fasertypisierung von
jeweils 400 Muskelzellen der Probanden. Die Typisierung erfolgte aufgrund des
visuellen Vergleichs der Färbeintensität der Muskelfasern nach Inkubation
serieller Gefrierschnitte bei unterschiedlichen pH’s.
38
Ergebnisse
Muskelfasertypisierung in der Ausdauer- und Kraftgruppe
Abb.8: Veränderung der Muskelfasertypen vor und nach 12-wöchigem Ausdauer-und
Krafttraining bei TypII-Diabetikern.
Ausdauergruppe
Typ I
Typ IIa
Typ IIx
Eingangstest
46.9±5.8
26.7±7.1
26.2±3.8
Ausgangstest
49.0±6.7
24.7±5.2
26.2±5.1
Kraftgruppe
Typ I
Typ IIa
Typ IIx
Eingangstest
55.8±10.8
19.2±4.3
24.9±9.3
Ausgangstest
51.7±6.9
21.6±5.1
26.6±5.3
Tab.6: Ü bersicht der Fasertypverschiebung vor und nach 12-wöchigem Ausdauer-und
Krafttraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
39
Ergebnisse
Innerhalb der Ausdauergruppe gab es eine Tendenz zu einem Anstieg des
Anteils an TypI-Fasern (p=0.06) und einer Verminderung des Anteils an TypIIaFasern (p=0.14). Tendenziell weisen diese Untersuchungen darauf hin, dass
Ausdauertraining die Umwandlung von schnellen TypII-Fasern in langsame
TypI-Fasern
induzieren
kann,
was
zur
Veränderung
der
Faserzusammensetzung führt.
In der Kraftgruppe konnte keine Veränderung der Verteilung der einzelnen
Muskelfasertypen beobachtet werden.
Die Varianzanalyse (ANOVA) ergab allerdings keinen signifikanten Unterschied
zwischen beiden Gruppen.
40
Ergebnisse
3.3 Faserquerschnitt
Im Mittelpunkt dieser Nachweise steht die Auswertung des maximalen
Faserquerschnitts von jeweils 100 Muskelfasern der Probanden. Das Ergebnis
sollte eine Aussage über die eventuell erzielte, trainingsbedingte
Faserhypertrophie sein.
Faserquerschnitt in der Ausdauer- und Kraftgruppe
Abb.9: Veränderung des Skelettmuskelfaserquerschnitts vor und nach 12-wöchigem
Ausdauer- und Krafttraining bei TypII-Diabetikern.
41
Ergebnisse
Ausdauergruppe
Typ I
Typ IIa
Typ IIx
Eingangstest
81.6±5.1
78.8±8.2
84.1±9.9
Ausgangstest
78.5±6.8
77.1±7.3
87.3±7.6
Kraftgruppe
Typ I
Typ IIa
Typ IIx
Eingangstest
81.2±10.8
78.1±14.4
89.3±18.8
Ausgangstest
78.4±7.1
81.6±7.4
86.7±4.1
Tab.7: Ü bersicht der Veränderung des Skelettmuskelfaserquerschnitts vor und nach
12-wöchigem Ausdauer- und Krafttraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und
Standardabweichungen.
Innerhalb der Ausdauergruppe gab es eine Tendenz zu einer Verkleinerung des
an TypI-Fasern (p= 0.06). Auß er TypI-Fasern in der Ausdauergruppe wies die
histologische Analyse mittels ATPase-Färbung im Vor und Nach Vergleich aller
Fasern in beiden Gruppen keine Größ eänderungen der Faserquerschnitte auf.
Es bestanden keine gruppenspezifischen Effekte.
42
Ergebnisse
3.4 Immunchistochemischer Nachweis von ROS durch 8-Isoprostan
Die Beurteilung des oxidativen Status erfolgt beim Menschen durch indirekte
Messung, da der direkte Nachweis von ROS aufgrund der enormen
Reaktionsfreudigkeit und der extrem kurzen Halbwertszeit (z.B. 10-5, 10-9
Sekunden für Superoxidradikal und Hydroxylradikal, jeweils) der Freien
Radikale in der Regel nicht möglich ist (DRÖ GE, 2002). In der vorliegenden
Studie wurde für einen Parameter des Stresses, dem 8-Isoprostan (8-epiPGF2α), genutzt. Das 8-Isoprostan entsteht als spezifische Produkte aus der
Peroxidation ungesättigter Fettsäuren in Lipiden (MALLAT et al., 1998; DAVI et
al., 1999), ihre Konzentration gilt somit als aussagekräftiger Marker für
Oxidativen Stress (DELANTY et al., 1996; MORROW & ROBERTS, 1996). Das
8-Isoprostan hat gegenüber anderen Parametern als Marker der
Lipidperoxidation in vivo günstige Eigenschaften, weil es sich erstens um stabile,
spezifische Produkte der Lipidperoxidation handelt, es zweitens in allen
Körperflüssigkeiten und Geweben in detektierbaren Menge vorkommt und
drittens seine Konzentration abhängig von oxidativem und antioxidativem
Status ist (LONGMIRE et al., 1994).
Bei der Messung der 8-Isoprostan wird in der vorliegenden Studie festgestellt
werden, inwieweit eine Schädigung der Zellmembran durch freie Radikale
bereits stattgefunden hat und ob 12-wöchiges Training zu einer Veränderung
des oxidativen Status führen kann. Die Abb. 10-12 und Tab. 8–10 zeigen die
Ergebnisse für 8-Isoprostan.
43
Ergebnisse
Abb.10: Expression von 8-Isoprostan im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern im
basalen Vergleich zur Expression bei Nicht-Diabetikern nach immunhistochemischer
Analyse mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5
8-Isoprostan
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
25.9±7.2
16.6±6.5
Tab.8: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es wurde eine signifikant (p≤ 0.05) niedrigere basale 8-Isoprostankonzentration
bei TypII-Diabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern, festgestellt.
44
Ergebnisse
Abb.11: Expression von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei
TypII-Diabetikern
nach
immunhistochemischer
Analyse
mit
densitometrischer
Auswertung.
8-Isoprostan
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
18.9±9.1
14.6±3.9
Tab.9: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei
TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Innerhalb der Ausdauergruppen gab es zwar eine Tendenz (p=0.13) zu einer
Verminderung der 8-Isoprostankonzentration durch Training, diese war jedoch
nicht signifikant.
45
Ergebnisse
Abb.12: Expression von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Kraftrtraining bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
densitometrischer
Auswertung.
8-Isoprostan
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
14.9±2.8
14.4±1.4
Tab.10: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die 8-Isoprostan in der Kraftgruppe zeigte sich unverändert zum Ausgangswert.
46
Ergebnisse
3.5 Immunchistochemischer Nachweis Superoxiddismutase (SOD)
Mit immunhistochemischen Nachweisen wurde der Einfluss von körperlicher
Aktivität auf die humane Skelettmuskelzelle, dem Musculus vatus lateralis
untersucht. Es wurde die durch das Training induzierte Veränderung der
Superoxiddismutase analysiert. Die Abb. 13-15 und Tab. 11–13 zeigen die
Ergebnisse für Superoxiddismutase (SOD).
Abb.13: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern
im basalen Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Analyse mit densitometrischer Auswertung.
SOD2
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
9.0±2.0
8.8±2.9
Tab.11: Ü bersicht von Superoxiddismutase vor dem Training, Vergleich zwischen
Nicht-Diabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Superoxiddismutase wies im basalen Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII-Diabetikern keine signifikanten Unterschiede auf.
47
Ergebnisse
Abb.14: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung *mit p≤ o.o5
SOD2
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
8.6±3.3
15.1±4.2
Tab.12:
Ü bersicht
von
Superoxiddismutase
vor
und
nach
12-wöchigem
Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Werte von Superoxiddismutase zeigten sich signifikant (p≤ 0.05) beeinflusst
von dem 12-wöchigen Ausdauertraining.
48
Ergebnisse
Abb.15: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse mit densitometrischer Auswertung *mit p≤ o.o5
SOD2
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
9.0±2.9
14.1±5.2
Tab.13: Ü bersicht von Superoxiddismutase vor und nach 12-wöchigem Krafttraining
bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Superoxiddismutase in der Kraftgruppe zeigte einen signifikanten (p≤ 0.05)
Aktivitätsanstieg nach 12 Wochen.
49
Ergebnisse
3.6 Immunhistochemischer Nachweis Glutathinperoxidase (GPx)
Mit immunhistochemischen Nachweisen wurde der Einfluss von körperlicher
Aktivität auf die humane Skelettmuskelzelle, den Musculus vatus lateralis,
untersucht. Es wurde die durch das Training induzierte Veränderung der
Glutathinperoxidase analysiert. Die Abb. 16-18 und Tab. 14–16 zeigen die
Ergebnisse für Glutathinperoxidase (GPx).
Abb.16: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern
im basalen Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
GPx
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
10.6±3.7
6.9±1.7
Tab.14: Ü bersicht von Glutathionperoxidase vor dem Training, Vergleich zwischen
Nicht-Diabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es wurde eine signifikant (p≤ 0.05) geringere Glutathionexpression bei TypIIDiabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern festgestellt.
50
Ergebnisse
Abb.17: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5
GPx
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
7.0±1.3
11.5±0.7
Tab.15:
Ü bersicht
von
vor
und
nach
12-wöchigem
Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Glutathionperoxidasekonzentration war
Ausdauertraining signifikant (p≤ 0.05) erhöht.
51
nach
dem
12-wöchigen
Ergebnisse
Abb.18: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Krafttraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse mit
densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5
GPx
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
6.9±2.2
11.1±2.8
Tab.16: Ü bersicht von Glutathionperoxidase vor und nach 12-wöchigem Krafttraining
bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Im Vergleich zum Eingangstest war Glutathionperoxidase Expression in der
Kraftgruppe signifikant (p≤ 0.05) erhöht.
52
Ergebnisse
3.7 Immunhistochemischer Nachweis Proxiredoxine
Nachfolgend werden die Ergebnisse der Expression von Peroxiredoxin (Prx) als
Teil des antioxidativen Systems in der Skelettmuskulatur vorgestellt. Es wurde
untersucht, wie sich die Expression der Peroxiredoxin-Isoformen bei TypIIDiabetikern unter körperlicher Aktivität verändert.
Um eine Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Proteine zu
ermöglichen, wurden in dieser Arbeit Analysen mit der Methode der
Immunhistochemie durchgeführt. Die verwendeten Untersuchungsmethoden
sind im Kapitel 2 „Material und Methoden“ detailliert beschrieben.
Es wurde untersucht, ob die Peroxiredoxine 1-6 im menschlichen Skelettmuskel
bei TypII-Diabetikern durch 12-wöchige körperliche Aktivität in Form von
Ausdauer- oder Krafttraining reguliert werden.
Die Abb. 19-36 und Tab. 17-34 zeigen die Ergebnisse der Immunhistochemie
mit Nachweis von Peroxiredoxin 1-6. In den Darstellungen sind jeweils die
Mittelwerte und Standardabweichungen wiedergegeben.
53
Ergebnisse
3.7.1 Immunhistochemischer Nachweis Peroxiredoxin 1
Abb.19: Expression von Peroxiredoxin1 im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern im
basalen Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunchistochemischer
Prx.1
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
24.5±12.8
19.5±6.7
Tab.17: Ü bersicht von Peroxiredoxin1 vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Bei der Untersuchung zu Peroxiredoxin1 lagen in basalen Vergleich keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Nicht-Diabetikern und TypIIDiabetikern vor.
54
Ergebnisse
Abb.20: Expression von Peroxiredoxin1 im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse mit
Prx.1
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
18.4±5.7
23.3±7.8
Tab.18: Ü bersicht von Peroxiredoxin1 vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei
Peroxiredoxin1 in der Ausdauergruppe zeigte einen signifikanten (p≤ 0.05)
Expressionsanstieg nach 12 Wochen.
55
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
densitometrischer Auswertung.
Prx.1
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
20.3±7.6
24.1±10.6
Tab.19: Ü bersicht von Peroxiredoxin1 vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei
Peroxiredoxin1
Ausgangswert.
in
der
Ausdauergruppe
56
zeigte
sich
unverändert
zum
Ergebnisse
basalen Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Prx.2
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
17.9±6.4
32.8±9.8
Es wurde eine signifikant (p≤ 0.05) höhere Peroxiredoxin2-Expression bei TypIIDiabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern, festgestellt.
57
Ergebnisse
Prx.2
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
28.5±7.8
33.7±11.0
Peroxiredoxin2 in der Ausdauergruppe zeigte bei der Analyse keine
signifikanten Veränderungen.
58
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
Prx.2
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
35.8±10.5
37.7±12.8
Peroxiredoxin2 in der Kraftgruppe zeigte sich unverändert zum Ausgangswert.
59
Ergebnisse
Prx.3
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
39.1±9.0
38.7±11.5
60
Ergebnisse
Prx.3
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
32.7±14.4
40.3±9.8
Peroxiredoxin3 in der Kraftgruppe zeigte sich unverändert zum Ausgangswert.
61
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
Prx.3
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
41.1±11.9
39.6±10.5
Nach 12-wöchigem Krafttraining kam es zu keiner Veränderung der
Peroxiredoxin3-Expression.
62
Ergebnisse
Abb.28: Expression von Peroxiredoxin4
im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern im
Prx.4
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
20.9±8.0
20.6±10.5
Tab.26: Ü bersicht der Peroxiredoxin4 vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
63
Ergebnisse
Prx.4
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
12.6±5.1
19.3±5.8
Im Vergleich zum Vortraining war die Peroxiredoxin4-Expression am
Skelettmuskel nach regelmäß igem Ausdauertraining erhöht (p= 0.09), dieser
war jedoch nicht signifikant.
64
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
Prx.4
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
18.8±6.7
15.9±4.3
Nach 12-wöchigem Krafttraining kam es zu keiner signifikanten Veränderung
der Peroxiredoxin3-Expression.
65
Ergebnisse
Abb.31: Expression von Peroxiredoxin5 im Skelettmuskel
bei TypII-Diabetikern im
basalen Vergleich zur Expression bei Nicht-Diabetikern nach immunhistochemischer
Prx.5
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
17.4±5.7
15.1±5.5
Es lagen keine signifikanten basalen Unterschiede zwischen den NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern vor.
66
Ergebnisse
Prx.5
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
15.4±7.7
22.0±6.8
Innerhalb der Ausdauergruppen gab es zwar eine Tendenz (p= 0.12) zu einer
Erhöhung der Peroxiredoxin5-Expression durch Training, diese war jedoch nicht
signifikant.
67
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
Prx.5
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
14.8±3.9
19.8±7.5
Im Vergleich zum Vortraining war die Peroxiredoxin5-Expression am
Skelettmuskel nach 12-wöchigem Krafttraining erhöht (p= 0.06), dieser war
jedoch nicht signifikant.
68
Ergebnisse
Prx.6
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
10.7±1.3
20.0±5.6
TypII-Diabetiker zeigten einen höheren Basalwert (p≤ 0.05) im Vergleich zu
Nicht-Diabetikern.
69
Ergebnisse
Prx.6
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
19.0±6.3
24.1±6.2
Tab.33: Ü bersicht von Proteinexpression vor und nach 12-wöchigem Trainig bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte undStandardabweichungen).
Innerhalb der Ausdauergruppen gab es zwar eine Tendenz (p= 0.15) zu einer
Erhöhung der Peroxiredoxin6-Expression durch Training, diese war jedoch nicht
signifikant.
70
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
Prx.6
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
20.5±5.9
19.8±11.9
Für Peroxiredoxin6 ließ sich keine Veränderung zwischen vor und nach dem
Krafttraining feststellen.
71
Ergebnisse
3.8
Immunhistochemischer
Signalproteine
Nachweis
der
mitochondrialen
Die Regulation der mitochondrialen Biogenese ist ein äußerst komplexer
Prozess,
der
durch
das
Zusammenspiel
von
verschiedenen
Transkriptionsfaktoren und Coactivatoren zustande kommt. Obwohl die
genauen Zusammenhänge bisher nicht bekannt sind, wurden in den letzten
Jahren jedoch einige Regulationsmechanismen entdeckt, die für die Biogenese
des Mitochondriums verantwortlich sind, dass es zu einer Vermehrung und zu
einer Vergröß erung der Mitochondrien durch körperliche Aktivität kommt.
In dieser Arbeit wird auf die Signalproteine (PGC1α, NRF1 und TFAM) zur
Adaptation der Mitochondrien eingegangen, welche durch körperliche Aktivität
induziert wird.
Die Abb. 37-45 und Tab. 35-43 zeigen die Ergebnisse der Immunhistochemie
mit Nachweis von PGC1α, NRF1 und TFAM. In den Darstellungen sind jeweils
die Mittelwerte und Standardabweichungen wiedergegeben.
72
Ergebnisse
3.8.1 Immunhistochemischer Nachweis PGC1α
Abb.37: Expression von PGC1α im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern in basalen
Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunchistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5
PGC1
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
25.1±2.5
18.3±4.4
Tab.35: Ü bersicht von PGC1α vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es wurde eine niedrigere basale PGC1α-Expression (p≤ 0.05) bei TypIIDiabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern, beobachtet.
73
Ergebnisse
Abb.38: Expression von PGC1α im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
PGC1
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
18.8±3.8
21.0±6.4
Tab.36: Ü bersicht von PGC1α vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es konnte keine signifikante Auffälligkeit der PGC1α–Expression nach dem
Ausdauertraining festgestellt werden.
74
Ergebnisse
Abb.39: Expression von PGC1α im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
PGC1
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
18.0±5.0
19.8±6.5
Tab.37: Ü bersicht von PGC1α vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Analyse von PGC1α in der Kraftgruppe zeigte keine Veränderungen der
Expression im Vergleich vor und nach dem Krafttraining.
75
Ergebnisse
3.8.2 Immunhistochemischer Nachweis NRF1
Abb.40: Expression von NRF1 im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern im basalen
Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung.
NRF1
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
18.1±3.4
23.1±11.4
Tab.38: Ü bersicht von NRF1 vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der basalen NRF1-Expression
bei TypII-Diabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern, festgestellt.
76
Ergebnisse
Abb.41: Expression von NRF1 im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
densitometrischer Auswertung *mit p≤ o.o5
NRF1
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
23.9±11.9
15.3±1.5
Tab.39: Ü bersicht von NRF1 vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es zeigte sich eine im Vergleich zum Ausgangswert signifikant (p≤ 0.05)
verminderte NRF1-Expression in der Ausdauergruppe.
77
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
NRF1
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
22.5±11.7
14.5±0.9
Tab.40: Ü bersicht von NRF1 vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Bei der Untersuchung zu NRF1 zeigte sich eine signifikante (p≤ 0.05)
Herunterregulation durch 12-wöchiges Krafttraining im Skelettmuskel.
78
Ergebnisse
3.8.3 Immunhistochemischer Nachweis TFAM
Abb.43: Expression von TFAM im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern im basalen
Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung *mit p≤ o.o5
TFAM
Nicht-Diabetiker
Typ II-Diabetiker
Eingangstest
32.2±5.8
24.4±6.3
Tab.41: Ü bersicht von TFAM vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Es wurde eine signifikant (p≤ 0.05) niedrigere basale TFAM-Expression bei
TypII-Diabetikern, verglichen mit den Nicht-Diabetikern, festgestellt.
79
Ergebnisse
Abb.44: Expression von TFAM im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
TFAM
Eingangstest
Ausgangstest
Ausdauergruppe
22.8±5.0
24.1±2.7
Tab.42: Ü bersicht von TFAM vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die TFAM in der Ausdauergruppe zeigte sich unverändert zum Ausgangswert.
80
Ergebnisse
Krafttraining
bei
TypII-Diabetikern
nach
Analyse
mit
TFAM
Eingangstest
Ausgangstest
Kraftgruppe
25.7±7.2
23.5±9.1
Tab.43: Ü bersicht von TFAM vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen).
Die Analyse von TFAM in der Kraftgruppe zeigte keine Veränderungen der
Expression im Vergleich vor und nach dem Krafttraining.
81
Diskussion
4. Diskussion
Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf muskulären Veränderungen oder
Adaptationsmechanismen durch 12-wöchige körperliche Aktivität in Form von
Ausdauer- oder Krafttraining bei TypII-Diabetikern, die anhand morphologischer
und histochemischer Untersuchungen des Musculus vastus lateralis
nachgewiesen wurden. Daher wurden der Leistungszuwachs bei Laktat 2 und
4 mmol/l und die Herzfrequenz als Parameter der Leistungsverbesserung, der
Isoformshift der Skelettmuskelfasern, die Muskelfaserquerschnitte und 8Isoprostan als Marker für oxidativen Stress untersucht. Weitere
Untersuchungen zeigten den Einfluss von körperlichem Training auf
Adaptationsvorgänge in Bezug auf antioxidative Mechanismen (MnSOD, GPx
und Peroxiredoxine1-6) und auf die mitochondrialen Signalproteine (PGC1α,
NRF1 und TFAM) im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern. Zudem wurden bei
jeder Untersuchung die nicht-insulinpflichtigen TypII-Diabetiker (NIDDM) mit
nicht an Diabetes erkrankten übergewichtigen Männern (NDM) als
Kontrollgruppe in der basalen Situation miteinander verglichen, um gezielt
diabetesbedingte Unterschiede aufzudecken, d. h. ob die NIDDM-Probanden
veränderte funktionelle und morphologische Eigenschaften, z. B. erhöhte ROSKonzentration, verminderte antioxidative Enyzme und reduzierte mitochondriale
Signalproteine in der Skelettmuskulatur, aufwiesen.
4.1 Herzfrequenz und Watt bei Laktat 2 und 4 mmol/l als
Leistungsparameter in der Ausdauer- und Kraftgruppe
In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob Ausdauer- und Krafttraining bei
TypII-Diabetikern zur Auslösung funktioneller und morphologischer
Adaptationsvorgänge
und
somit
zur
Verbesserung
der
Ausdauerleistungsfähigkeit beitragen kann. Wir setzten deshalb ein gezieltes
Ergometer- oder Muskelaufbautraining zur Intervention ein und ermittelten die
Herzfrequenz und Wattleistung bei einer Laktatkonzentration von 2 und 4
mmol/l. In diesem Bereich führt Training zu einer Abnahme der glykolytischen
Enzymaktivität und damit auch der Laktatbildung, ausgleichend zu einer
Zunahme des aeroben Energiestoffwechsels sowie zu einer Vergröß erung der
für Ausdauerleistung nutzbaren maximalen Sauerstoffaufnahme (VO 2max), was
sich bei einer Anhebung der Leistung an der aerob-anaeroben Schwelle
82
Diskussion
(Rechtsverschiebung der Laktat-Leistungskurve) manifestiert (NEUMANN et al.,
1999).
Die Leistungsfähigkeit verbesserten sich in beiden Gruppen signifikant (Abb.7,
Tab. 5), welches sich auch in anderen Ausdauertrainingsstudien mit TypIIDiabetikern zeigte (CUFF et al., 2003; CAUZA et al., 2005; KADOGLOU et al.,
2007).
Ein regelmäß iges, ausdauerorientiertes Training führt einerseits zu einer
Ö konomisierung der Herzarbeit, die auf einer Erhöhung des Vagotonus, auf
einer Senkung des Ruhe- und Arbeitspulses und auf einer Verminderung des
Sauerstoffbedarfs des Herzmuskels beruht (MEYER & KINDERMANN, 1999;
PERINI & VEICESTEINAS, 2003; KINDERMANN, 2004; KETELHUT et al.,
2004; VONBANK et al., 2005). Andererseits kommt es zu einer
Leistungserhöhung der Herzarbeit durch eine Größ enzunahme des Herzens
und einer Vergröß erung des Schlagvolumens, in diesem Fall der Blutmenge,
die das Herz bei einem einzelnen Schlag in die Peripherie pumpt (ZINTL &
EISENHUT, 2001). Wenn mehr Blut pro Schlag vorhanden ist, erhöht sich auch
die für die Ausdauerleistungsfähigkeit wichtige maximale Sauerstoffaufnahmefähigkeit.
Dies
führt
gleichzeitig
zu
einem
erhöhten
Herzminutenvolumen, während durch Training die Herzfrequenz bei gleicher
Belastungsintensität sinkt (MARLIN & NANKERVIS, 2003; LEE et al., 2008).
Ein Unterschied gegenüber der Ausdauergruppe waren in der Untersuchung die
Herzfrequenzwerte, die in der Kraftgruppe niedriger gemessen wurden.
Inwieweit sich Krafttraining auf das Herzkreislaufsystem auswirkt, ist bis heute
noch nicht vollständig geklärt. Es scheint hingegen gesichert, dass durch ein
Krafttraining funktionelle und morphologische Herzkreislauf-Parameter wie
Blutdruck, Herzfrequenz etc. sowohl temporär als auch chronisch beeinflusst
werden (KRAMER et al., 1998; BUSKIES, 1999; KRAEMER & HÄ KKINEN,
2002; ACSM, 2006). Obwohl noch unterschiedliche Berichte existieren, gehen
Metaanalysen davon aus, dass auch durch Krafttraining der Ruheblutdruck
signifikant gesenkt werden kann (KELLEY, 1997; CORNELISSEN et al., 2005).
Zudem wurde jedoch sichergestellt, dass regelmäß iges Krafttraining mittlerer
Intensität und Wiederholungszahl zu keinem oder einem nur moderaten Anstieg
des Blutdrucks führt (GRAVES & FRANKLIN, 2001; MC CARTNEY, 2001).
Blutdruck- und Herzfrequenzverhalten dürften auf einen verstärkten
parasympathischen und verminderten sympatischen Einfluss zurückzuführen
83
Diskussion
sein (SCHMIDT et al., 2005; MC ARDLE et al, 2006). Demgemäß kann auch
das Produkt von Herzschlagzahl und systolischem Blutdruck vermindert werden
(VONBANK et al., 2005; HOLLMANN & STRÜ DER, 2009). Daraus lässt sich
ein niedrigerer myokardialer O2-Bedarf bei Krafttraining ableiten. Die
Sauerstoffaufnahme verbessert sich und durch die bessere Füllung der linken
Herzkammer wird das Schlagvolumen erhöht. Gleichzeitig wird die
Ruheherzfrequenz als Indikator für Ausdauerfähigkeit gesenkt (ROST, 1986;
HAMBRECHT et al., 2000; AHN & KO, 2002; KO, 2004). Jedoch scheint die
wichtige Komponente beim Erzielen eines positiven Effektes des Krafttrainings
die Anzahl der Wiederholungen bzw. die Belastungsdauer sowie, die Größ e der
eingesetzten Muskulatur zu sein (ZIMMERMANN, 2000; MC CARTNEY, 2001;
WONISCH et al., 2009). Je mehr ein Krafttrainingsprogramm sich aeroben
Trainingsmethoden annähert, desto stärker werden seine Auswirkungen im
Sinne von kardiovaskulären Adaptationen (HOLLMANN & STRÜ DER, 2009).
Da es sich bei unserer Krafttrainingsintervention nicht um reines Krafttraining,
sondern eher um Kraftausdauertraining handelt, könnte durch Krafttraining
ebenfalls eine Entlastung des Herzkreislaufsystems und die Reduktion der
Gefahr einer kardialen Ü berlastung durch muskuläre Anforderung erzielt
werden. Da in der vorliegenden Studie die Ausdauerleistungsfähigkeit über die
Wattleistung bestimmt wurde, kann dennoch vermutet werden, dass für die
signifikante Verbesserung der Ausdauerleistungsfähigkeit der Kraftgruppe die
Zunahme der Muskelkraft mitverantwortlich ist.
Eine gut ausdauertrainierte Muskulatur zeichnet sich darüber hinaus vor allem
durch die Fähigkeit aus, während der Belastung groß e Mengen von Laktat zu
oxidieren und dabei Energie zu gewinnen. Die sinkende Laktatakkumulation
aus der Zelle nach einer Trainingsphase korreliert vor allem positiv mit dem
MCT (Monocarboxylattransporter)-Gehalt (DUBOUCHAUD et al., 2000; AOI et
al., 2004). Eine Steigerung der MCT bewirkt eine schnellere Verteilung des
Laktats in den Körperzellen (z. B. Skelett- und Herzmuskelzellen), die das
Laktat im Rahmen der aeroben Energiegewinnung nutzen können (JUEL et al.,
2004; MEYER et al., 2005). In mehreren Studien an Menschen und Tieren
wurde nachgewiesen, dass sowohl Ausdauer- als auch Krafttraining den MCT1und MCT4-Gehalt erhöhen (BONEN et al., 2000; DUBOUCHAUD et al., 2000;
COLES et al., 2004; YOSHIDA et al., 2004; METZ et al., 2005; JUEL, 2006).
Jedoch adaptiert die Proteinexpression der MCT-Proteine unterschiedlich an
84
Diskussion
körperliche Belastung, wobei es schon bei moderaten Belastungsstufen zu
einer erhöhten MCT1-Proteinexpression kam, wohingegen der MCT4 erst bei
höheren Belastungen vermehrt zusammen mit dem MCT1 exprimiert wurde
(BONEN et al., 2000; TONOUCH et al., 2002; JUEL et al., 2006; MOHR et al.,
2007). Da sich eine erhöhte Expressionsrate der MCT1-Isoform in den
langsamen, oxidativen TypI-Fasern und der MCT4-Isoform in den schnellen,
glykolytischen TypII-Fasern beobachten lässt (BONEN, 2000; DUBOUCHAUD
et al., 2000; BONEN et al., 2001; HALESTRAP & MEREDITH, 2004; JUEL,
2004; KOBAYSHI, 2004), ist anzunehmen, dass der MCT1 früher als MCT4 bei
niedrigeren Laktatkonzentrationen zu transportieren beginnt (JUEL et al., 1999;
DIMMER et al., 2000). Hierbei ist aber anzumerken, dass die sinkende
Laktatakkumulation nicht nur alleine Folge der gesteigerten MCT, sondern auch
andere Ursachen wie u.a. ein verbesserter Blutfluss und eine Steigerung der
Kapillardichte für die erhöhte Laktattransportkapazität mitverantwortlich sind
(JUEL et al., 2004; BUTZ et al. 2004; MEYER et al., 2005).
Insgesamt lässt sich aus unseren Beobachtungen erkennen, dass 12-wöchiges
Ausdauer- und Krafttraining mit moderaten Intensitäten die Leistungsfähigkeit
bei TypII-Diabetikern verbessern kann. Da viele Untersuchungen eine
reduzierte Leistungsfähigkeit der Diabetiker festgestellt haben (NYHOLM et al.,
1997; OZDIRENCE et al., 2003), könnte die verbesserte Ausdauerfähigkeit
durch körperliches Training eine günstige Auswirkung im Hinblick auf muskuläre
Leistung und das Herzkreislaufsystem leisten. Darüber hinaus ist aber
anzumerken, dass die Verbesserung der Leistungsfähigkeit auß erdem von
verschiedenen trainierbaren Faktoren abhängt, wie schon in Kapitel 2. 3 dargestellt wurde, z. B. von der Dichte und Lage der Mitochondrien in der Zelle, der
Kapillarisierung des Muskels, dem Füllungszustand der Glykogenspeicher, der
Diffusionskapazität für Sauerstoff durch die Zellmembranen, der Aktivität der
Enzyme der Atmungskette und der Sauerstoffbindungs- und Sauerstofftransportkapazität (BERG & KÖ NIG, 2000; JUEL et al., 2004; REES et al., 2004;
WEINECK, 2004; LEE et al., 2008).
85
Diskussion
4.2 Muskelfaserverschiebung
Skelettmuskeleigenschaften stehen in Verbindung mit Diabetes mellitus TypII
(SALTIN & HELGE, 2000). Diabetiker verfügen über weniger Muskelfasern vom
TypI, die mehr Mitochondrien enthalten und die Energieversorgung mittels
Oxidation gewährleisten, während die Muskelfasern vom TypII glykolytisch
funktionieren (GASTER et al. 2001; STEINACKER et al., 2002; VAN LOON,
2004). Obwohl das Fasertypenverhältnis bzw. die oxidative oder glykolytische
Kapazität eines Muskels in gewissen Grenzen erblich bedingt zu sein scheint
(SIMONEAU & BOUCHARD, 1995; KRIKETOS et al., 1996; TANNER et al.,
2002), ist dies jedoch unter dem Einfluss physischer Belastungen modulierbar,
da die Skelettmuskulatur eine ausgeprägte Fähigkeit besitzt, sich strukturell wie
auch funktionell an Trainingsreize anzupassen. Die Muskelfaserverschiebungen
gehen in diesem Kontext vor allem mit Anpassungsvorgängen hinsichtlich der
Mitochondriendichte und der Aktivität bestimmter Markerenzyme des
Energiestoffwechsels einher, aber auch mit Veränderungen hinsichtlich des
Expressionsmusters von MHC-Isoformen (PETTE & STARON, 2001; FLUCK &
HOPPELER, 2003; SPANGENBURG & BOOTH, 2003; FLUCK et al., 2005).
Die histologische Analyse des Muskelfaserspektrums mittels ATPase-Färbung
wies in unserer Untersuchung keine signifikanten Veränderungen aller Fasertypen im Vorher- und Nachher-Vergleich auf (Abb. 8, Tab. 6). Dies bedeutet
aber nicht, dass keine Umbau- oder Adaptationsprozesse stattgefunden haben.
Bemerkenswert war jedoch das Ergebnis, dass Ausdauertraining die
tendenzielle Umwandlung von schnellen TypII- in langsame TypI-Fasern
induzieren kann, wobei in der Kraftgruppe der Anteil an TypI-Fasern leicht
gesunken und der Anteil der TypII-Fasern leicht gestiegen ist. Ä hnliche
Ergebnisse konnten von Gollnick et al. 1973, Andersen und Henriksson 1977
und Ingjer 1979 beobachtet werden. In einer anderen Untersuchung von Staron
et al. 1994 wurde nach einem 8-wöchigen intensiven Krafttraining eine
Verringerung des Anteils an TypIIx-Fasern nachgewiesen. Dagegen
beobachteten Schmidtbleicher und Haralambie 1981, dass ein Krafttraining mit
wenigen Wiederholungen und maximalen Lasten hauptsächlich die schnellen
TypIIx-Fasern einbezieht, während ein Krafttraining mit mehr Wiederholungen
und weniger Gewichtsbelastung sowohl die schnellen als auch die TypIIa- und
TypI-Fasern beansprucht. Ebenfalls beachtenswert ist die Studie von Frese et al.
2009, der zufolge im Verlauf der Wettkampfsaison bei Junioren86
Diskussion
Radrennsportlern beim Wechsel von einem umfangsorientierten extensiven
Ausdauertraining zu einem belastungsorientierten intensiven Ausdauertraining
weniger die TypI-Fasern beansprucht wurden, sondern vielmehr die TypIIFasern. Die uneinheitlichen Ergebnisse der verschiedenen Studien könnten
daraus resultieren, dass die Muskelfasertypveränderung mit der Belastungsart,
der Intensität und dem Umfang des Trainings korreliert (POWERS et al., 1994;
TOIGO, 2006), was Einfluss auf Anpassungen der mitochondrialen und
myofibrillären Struktur der Skelettmuskulatur hat und in der Konsequenz den
Phänotyp eines Muskels bestimmt. In der DiabetesAktiv-Studie muss die
Trainingshäufigkeit mit zwei betreuten einstündigen Trainingseinheiten und
einem freiwilligen Heimtraining in der Woche als zu gering eingestuft werden,
um eine Verschiebung der Muskelfasertypen über die 12-wöchige Trainingszeit
zu erreichen. Zudem scheint auch die Dauer der einzelnen Trainingseinheiten in
der DiabetesAktiv-Studie zu kurz gewesen zu sein, die ausgehend von 15
Minuten progressiv auf 40 Minuten zum Interventionsende gesteigert wurde.
Interessant wäre es zu untersuchen, ob ein längeres oder anders gestaltetes
Training stärkere Auffälligkeiten zeigen würde und ob Tendenzen wie die angedeutete Fasertypverschiebung mit Steigerung des Trainingsumfangs und/oder
der Trainingsintensität deutlicher werden würden.
Obwohl unsere Studie keine Verschiebung der Muskelfasern durch 12-wöchiges
Ausdauer- und Krattraining zeigte, ist es dennoch möglich, dass bei genügend
langer Trainingsdauer und ausreichender Trainingsintensität eine Umwandlung
des Fasertyps entsteht. Theoretisch erfolgen Fasertypübergänge im
menschlichen Skelettmuskel sequentiell von langsam nach schnell bzw. von
schnell nach langsam in folgender geordneter Reihenfolge: TypI ⇔ TypIIa ⇔
TypIIx-Fasern. Diesbezüglich ist hinlänglich bekannt, dass eine Langsam-zuschnell-Verschiebung schwieriger zu steuern ist als ein inverser
Muskelfasershift von schnell zu langsam (FRESE et al., 2008).
87
Diskussion
4.3 Muskelfaserquerschnitt
Ein über mindestens mehrere Wochen regelmäß ig ausgeübtes Training bewirkt
morphologische Anpassungsreaktionen des Skelettmuskels mit Entwicklung
einer Muskelhypertrophie und Zunahme des Anteils der einzelnen Muskelfasern.
Grundsätzlich ist die Hypertrophie eines Muskels in erster Linie einer
gesteigerten Anzahl an Myofibrillen und somit einer Querschnittszunahme der
einzelnen Muskelfasern, die wiederum von der Zunahme an Satellitenzellen
abhängt, zuzuschreiben (LUETHI et al., 1986; WILLIAMSON et al., 2001).
Diese Anpassungsreaktionen werden durch mechanische Reize, Stoffwechselreaktionen und hormonelle Veränderungen ausgelöst und auf molekularer
Ebene durch Ä nderungen in der Translation und Transkription sowie durch eine
Vermehrung und Inkorporation von Satellitenzellen bewirkt (HESPEL et al.,
2001; HOOD, 2001).
Es wurde in dieser Arbeit festgestellt, dass die Faserquerschnitte durch 12wöchige körperliche Aktivität innerhalb beider Gruppen keine signifikanten
Ä nderungen erfuhren, wobei die Querschnittsfläche an TypI-Fasern nach dem
Ausdauertraining tendenziell verringert wurde (Abb. 9, Tab. 7). In der Literatur
lässt sich keine einheitliche Aussage über trainingsinduzierte Veränderungen
des Muskelfaserquerschnittes finden. Obwohl in Querschnittsstudien zu
Unterschieden im Muskelfaserquerschnitt von Kraft- und Schnellkraftsportlern
im Vergleich zu Normalpersonen oder zu Ausdauersportlern generell eine
signifikant größ ere Muskelfaserquerschnittsfläche der schnellen TypII-Fasern
bei Kraft- und Schnellkraftsportlern beschrieben wird (EDSTRÖ M & EKBLOM,
1972; STARON et al., 1994; NARICI et al., 1996; ANDERSEN & AAGAARD,
2000; BILLETER et al., 2002; SHOEPE et al., 2003), konnte die Untersuchung
von LIU et al. 2001 nachweisen, dass sich nach einem 6-wöchigen Krafttraining
der Querschnitt der TypIIa-Fasern signifikant vergröß erte, während die TypIund die TypIIx-Fasern signifikant den Durchmesser verringerten. In mehreren
Studien wurde sogar nach einem mehrwöchigen konzentrisch/exzentrischen
Maximalkrafttraining eine signifikante Zunahme sowohl der Querschnitte der
TypI- als auch der TypII-Fasern beobachtet (MC CALL et al., 1996;
HORTOBAGYI et al., 2000; CAMPOS et al., 2002). Dagegen fanden Sale et al.
1990 bei Personen nach einem 22-wöchigen Krafttraining keine signifikanten
Veränderungen des Muskelfaserquerschnittes bei TypI-Fasern und TypII-Fasern.
88
Diskussion
Zusammenfassend könnte angenommen werden, dass der entsprechende Reiz
für eine Zunahme des Muskelfaserquerschnittes bei einer optimalen
Wirkungskombination
durch
die
Intensität
und
die
Dauer
der
Muskelkontraktionen erreicht wird. Dabei konnte in zahlreichen Untersuchungen
der Nachweis erbracht werden, dass der Muskelfaserquerschnitt der TypIIFasern deutlicher gewachsen ist als derjenige der TypI-Fasern (MACDOUGALL,
1992).
4.4 Trainingsinduzierte Veränderung der Superoxiddismutase
(MnSOD) und Glutathionperoxidase (GPx) im Skelettmuskelgewebe
bei TypII-Diabetikern
Hyperglykämische Zustände führen zu einer stärkeren Generierung freier
Radikale, wie schon in Kap. 1. 2 erläutert, über eine vermehrte Autoxidation von
Glukose
und
Glykierungsreaktionen,
eine
Substratüberladung
der
mitochondrialen Atmungsketten oder über die Aktivierung zellulärer NADPHOxidasen. Messungen des oxidativen Stresses bei TypII-Diabetikern im
Vergleich zu gesunden nicht-diabetischen Personen zeigen daher deutlich
erhöhte Werte (FRIDLYAND & PHILIPSON, 2005). Es konnte jedoch bereits
nachgewiesen werden, dass durch regelmäß ige körperliche Belastung mit
moderaten Intensitäten die körpereigene Abwehr gegen freie Radikale durch
Hochregulierung von antioxidativen Enzymen verbessert wird. Hier stellt sich
die Frage, ob durch körperliches Training bei TypII-Diabetikern ebenfalls eine
Hochregulierung der antioxidativen Kapazität erzielt werden kann. Um den
Einfluss von 12-wöchiger körperlicher Aktivität in Form von Ausdauer- und Krafttraining auf die Veränderung der Expression von der Superoxiddismutase
(MnSOD) und der Glutathionperoxidase (GPx) bei TypII-Diabetikern zu
analysieren, wurde in der vorliegenden Studie zuerst -als ein Parameter des
oxidativen Stresses- 8-Isoprostan (8-epi-PGF2α) untersucht.
Das 8-Isoprostan ist ein Indikator für vermehrtes intrazelluläres Vorkommen von
reaktiven Sauerstoffverbindungen, wodurch man den Status des oxidativen
Stresses beurteilen kann (MORROW & ROBERTS, 1991). In der Untersuchung
zeigte sich eine signifikant niedrigere 8-Isoprostan-Konzentration bei TypIIDiabetikern im basalen Vergleich zu Nicht-Diabetikern (Abb.10, Tab. 8). Dieses
Ergebnis ist sehr überraschend, weil in anderen Untersuchungen bisher
89
Diskussion
erhöhter oxidativer Stress im Skelettmuskel von TypII-Diabetikern
nachgewiesen wurde (TORRES et al., 2004; SCHEED-BERGDAHL et al.,
2005). Eine Erklärung für unser Ergebnis wäre, dass ROS effektiv durch eine
wesentliche Hochregulation der zellulären antioxidativen Abwehrsysteme im
Skelettmuskel von TypII-Diabetikern kompensiert wird, wie in der vorliegenden
Studie durch die signifikante Hochregulation der Prx 2 und Prx 6 gezeigt (Abb.
22, 34, Tab. 20, 32). Da die Anti-Diabetes-Medikamente (Metformin,
Sulfonyharnstoff, Thiazolidindion, etc.) bekannt dafür sind, Blutglukose und
ROS-Produktion zu reduzieren (OUSLIMANI et al., 2005; CHOI et al., 2008;
FUJISAWA et al., 2009), könnte dies auch erklären, warum in unserer Studie
niedrigere basale 8-Isoprostan-Werte bei TypII-Diabetikern gegenüber der
Kontrollgruppe gemessen wurden. Schließ lich wäre es interessant, zu den hier
verglichenen Studiengruppen –übergewichtige NIDDM und übergewichtige
NDM– die oxidativen Stress-Daten der normalgewichtigen gesunden
Kontrollgruppe zu analysieren, um gezielt diabetesbedingte Unterschiede
aufzudecken. Dies würde zu einer genaueren Schlussfolgerung führen, wie die
ROS-Variablen bei NIDDM im Vergleich zu den normalgewichtigen gesunden
NDM hoch- und bzw. unterreguliert sind.
Darüber hinaus zeigen sich im basalen Vergleich keine Unterschiede bei der
Expression von SOD, aber eine signifikant geringere Expression von GPx bei
TypII-Diabetikern. Und in beiden Trainingsformen konnten die Expression von
SOD und GPx gesteigert werden (Tab. 44).
NDM vs NIDDM
Diabetes
Diabetes
Ausdauergruppe
Kraftgruppe
SOD
=
↑*
↑*
GPx
↓*
↑*
↑*
Tab.44: Ü bersicht aller Untersuchungen mit spezifischer Regulation der SOD und GPx
(↑ = Heraufregulierung der Expression, ↓ = Herabregulierung der Expression).
Eine Vielzahl von Trainingsstudien der vergangenen Jahre zeigt, dass
vermehrtes körperliches Training zu einer Hochregulierung der antioxidativien
Enzyme im Skelettmuskel führt (JENKINS et al., 1984; POWERS et al., 1994;
LAWLER et al., 2007; CHEN et al., 2008). Eine Untersuchung von Gonenc
2000 weist ähnliche Veränderungen wie in unseren Ergebnissen auf. Es zeigt
sich in seiner Studie, dass nach 4-wöchigem Schwimmtraining die SOD und
90
Diskussion
GPx deutlich erhöht waren. In einigen Tieruntersuchungen wurde ebenfalls ein
Anstieg von SOD, KAT und GPx-Expression unter moderater körperlicher
Belastung festgestellt (FRANK et al., 1978; CRAPO et al., 1984; VAN DER
VALK et al., 1985; ANURADHA & BALAKRISCHAN, 1998). Dagegen gibt es
widersprüchliche Studien: Ihre Ergebnisse belegen keine Ä nderung oder eine
Herunterregulierung sowohl der SOD (TONKONOGI et al., 2000; MIYAZAKI et
al., 2001; VIDER et al., 2001; TAULER et al., 2006) als auch keine Ä nderung
der GPx nach dem Training (MIYAZAKI et al., 2001; VIDER et al., 2001; RUSH
& SANDIFORD, 2003; MORIKAWA et al., 2004; TAULER et al., 2006). Die teils
widersprüchlichen Ergebnisse könnten damit zusammenhängen, dass die
Expression mit der Dauer und der Intensität des Trainings und dem Zeitpunkt
der Probenahme korreliert (POWERS et al., 1994). Somit konnten Studien mit
leichterem/kürzerem oder intensiverem/langem Training keine signifikanten
Veränderungen oder eine Herunterregulierung der antioxidativen Enzyme
nachweisen. Es gibt bisher keine eindeutigen Erkenntnisse zum optimalen
Training für die antioxidativen Schutzmechanismen. Dies liegt zum einen daran,
dass eine Reihe von weiteren Faktoren mit in die Bildung, die Wirkung und die
Abwehr von ROS hineinspielen, wie etwa die Ernährung, das Alter und
insbesondere auch das Geschlecht (VENDITTI et al., 1996; TIIDUS et al., 1999;
FUKAI et al., 2000; RENSING et al., 2005). Vor allem hinsichtlich der
antioxidativen Kapazität werden geschlechtsspezifische Unterschiede berichtet.
Als eine Ursache für diese Unterschiede bei dem Schutz vor ROS werden die
Ö strogene angesehen, für die eine entsprechende antioxidative Wirkung
aufgezeigt werden konnte (TIIDUS, 2000; GINSBURG et al., 2001;
BRONIKOWSKI et al., 2002; RUSH & SANDIFORD, 2003).
Die Expressionserhöhung von antioxidativen Enzymen in der Untersuchung
könnte daraus resultieren, dass durch trainingsinduzierte SOD-Expression als
erste Verteidigung gegen ROS mehr Wasserstoffperoxid gebildet wurde und
diese Steigerung zu einer Enzymstimulation von GPx geführt hat. Trotzdem
könnte eine erhöhte SOD kritisch gesehen werden, da sie zwar zu einer
Reduktion von Superoxidradikalen führt, aber auch zu einer Zunahme von
Wasserstoffperoxid, was durch eine Erhöhung weiterer antioxidativer Enzyme
(GPx, KAT und Peroxiredoxine) kompensiert werden muss, um vermehrte
oxidative Zellschäden zu vermeiden (RENNER, 2008).
Auß erdem konnte durch die bisher durchgeführten Untersuchungen eine
91
Diskussion
Korrelation zwischen der Veränderung der antioxidativen Enzymexpression und
dem Muskelfasertyp nachgewiesen werden (NEUFER et al., 1996; POWERS &
LEEUWENBURGH, 1999; TUPLING et al., 2007); wir konnten aber eine
erhöhte Expression von SOD und GPx ohne Muskelfasertypänderungen
beobachten. Damit scheint diese Verbesserung unabhängig vom
Muskelfasershift zu sein.
Insgesamt lässt sich aus unseren Beobachtungen eindeutig erkennen, dass
regelmäß iges Ausdauer- und Krafttraining eine Heraufregulation der SOD und
GPx im Skelettmuskel bewirken. Da der TypII-Diabetes mit einer systemisch
erhöhten Bildung von ROS bei gleichzeitig verminderter antioxidativer Kapazität
einhergeht (MAXWELL et al., 1997; BROWNLEE, 2001; BHATIA et al., 2003;
PANDEY et al., 2010), könnte die verbesserte antioxidative Kapazität durch
körperliches Training zu einem besseren Schutz vor freien Radikalen und
oxidativem Stress führen (HOLLANDER et al., 1997; OH-ISHI et al., 1997;
POWERS et al., 1999; MELIKOGLU et al., 2008). Darüber hinaus wäre es
interessant, in weiteren Studien bei TypII-Diabetikern zu untersuchen, wie
andere Marker des oxidativen Stresses (wie z. B. 8-oxiguanine, nitrotyrosine)
und andere antioxidative Enzyme (wie z. B. KAT oder andere SOD/GPxIsoformen), die nicht in der vorliegenden Studie aufgenommen wurden,
zwischen NIDDM und NDM unterschiedlich detektierbar sind und inwieweit
regelmäß iges körperliches Training diese positiv beeinflussen kann.
4.5 Trainingsinduzierte Veränderung der Peroxiredoxin-Isoformen
im Skelettmuskelgewebe bei TypII-Diabetikern
Neben den klassischen körpereigenen enzymatischen Schutzsystemen (SOD,
KAT und GPx) sind die Peroxiredoxine (Prx) eine weitere Gruppe der antioxidativen Enzyme, die insbesondere in Situationen von hoher Radikalenbelastung (z. B. Entzündungsreaktionen, körperliche Belastung) von Bedeutung sind
(HOFMANN et al., 2002; RHEE et al., 2005; CHEN et al., 2008), weil die
molekulare Leistungsfähigkeit von Peroxiredoxinen im Vergleich zu der KAT und
der GPx geringer ist. Einerseits haben die Peroxiredoxine eine Schutzfunktion,
da sie H2O2 bis zu bestimmten Konzentrationen abbauen. Zuviel dieser
Wasserstoffverbindung dagegen stört die Prxs, was dazu führt, dass der Körper
92
Diskussion
H2O2 als Signal einsetzen kann, z. B. um bestimmte Körperzellen zu
veranlassen, sich zu teilen oder die Apoptose zu starten (FLOHE et al., 2003;
WOOD et al., 2003). In der Literatur lässt sich bisher keine einheitliche Aussage
über die Wirkung von Diabetes auf die antioxidative Kapazität finden. In
Tierversuchen mit Streptozocin-induzierten diabetischen Ratten wurde sowohl
eine Hoch- als auch eine Runter-Regulation der antioxidativen Enzyme in
verschiedenen Organen (z. B. Niere, Leber und Herz) berichtet (MARTIM et al.,
2003; FINAUD et al., 2006). So scheint die Anpassung der antioxidativen
Enzyme als Antwort auf Diabetes in verschiedenen Organen unterschiedlich zu
sein. Es bleibt unbeantwortet, ob dies auch bei TypII-Diabetikern der Fall ist
(BRINKMANN et al., 2010). Allerdings wurden die meisten Studien über die
Zusammenhänge von TypII-Diabetes und antioxidativer Kapazität an
Blutproben durchgeführt (MAXWELL et al., 1997; BHATIA et al., 2003; OPITZ et
al., 2009; PANDEY et al., 2010), weil sich die Muskulatur aufgrund ihrer
beschränkten Zugänglichkeit im Vergleich zu den eher leicht isolierbaren
Erythrozyten nur aufwendiger untersuchen lässt. Hier stellt sich die Frage, ob
durch körperliches Training bei TypII-Diabetikern eine Hochregulierung der
antioxidativen Enzyme im Skelettmuskel erzielt werden kann. Um den Einfluss
von körperlicher Aktivität in Form von Ausdauer- und Krafttraining durch eine
12-wöchige Trainingsintervention auf antioxidative Mechanismen im
Skelettmuskel, dem Musculus vastus lateralis, zu untersuchen, wurde die
trainingsinduzierte Veränderung der Expression von Peroxiredoxin-Isofomen bei
TypII-Diabetikern analysiert. Weiterhin wurde die Basalexpression der
Peroxiredoxine bei Diabetikern und Nicht-Diabetikern verglichen.
Die Expression von Prx 2 und 6 war bei den TypII-Diabetikern signifikant zur
Kontrolle erhöht. Diese erhöhte basale Expression von Prx 2 und 6 könnte
aufgrund verminderter GPx (Abb. 16, Tab. 14) ein Kompensationsmechanismus
sein. Es wurde aber keine weitere Erhöhung der Expression durch Training
beobachtet. Ebenfalls war auß er bei Peroxiredoxin 1 in der Ausdauergruppe bei
beiden Trainingsgruppen keine signifikante Zu- bzw. Abnahme der Expression
von Peroxiredoxin-Isoformen durch Training zu erkennen (Tab. 45). Des
Weiteren kam es bei der Ausdauergruppe zu einer tendenziellen Erhöhung der
Expression von Peroxiredoxin 4-6, während sich in der Kraftgruppe nur bei
Peroxiredoxin 5 eine tendenzielle Zunahme der Expression zeigte.
93
Diskussion
NDM vs NIDDM
Diabetes
Diabetes
Ausdauergruppe
Kraftgruppe
Peroxiredoxin 1
=
↑*
=
Peroxiredoxin 2
↑*
=
=
Peroxiredoxin 3
=
=
=
Peroxiredoxin 4
=
↑
=
Peroxiredoxin 5
=
↑
↑
Peroxiredoxin 6
↑*
↑
=
Tab.45: Ü bersicht aller Untersuchungen mit spezifischer Regulation der PeroxiredoxinIsoformen 1-6 (↑ = Heraufregulierung der Expression, ↓ = Herabregulierung der
Expression, * = p ≤ 0.05).
Interessanterweise war bei den Untersuchungen von Peroxiredoxin 5 in beiden
Gruppen eine tendenziell erhöhte Expression zu erkennen. Hierfür könnten
unter anderem die verschiedenen Lokalisationen der Peroxiredoxin-Isoformen
verantwortlich sein. Prx 5 nimmt innerhalb der Peroxiredoxin-Isoformen eine
Sonderstellung ein, da es eine vielfältige Verteilung zeigt, d. h. neben den
Mitochondrien auch in den Peroxisomen, aber auch im Zytosol zu finden ist.
Ein möglicher Erklärungsansatz für die nicht signifikanten Veränderungen der
Expression von Peroxiredoxinen im Skelettmuskel könnte zum einen darin
liegen, dass durch eine erhöhte SOD- und GPx-Expression weniger
Peroxiredoxin zum Schutz vor ROS benötigt wird. Zum anderen haben
bisherige Studien gezeigt, dass SOD und GPx in den Mitochondrien ein
höheres Potenzial zur trainingsinduzierten Verbesserung als andere
antioxidative Enzyme im Zytosol haben (HIGUCHI et al., 1985; JI et al., 1988; JI,
2000). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass bei körperlicher Aktivität
die Atmungsketten an der inneren Membran der Mitochondrien verstärkt freie
Radikale erzeugen (FISHER-WELLMAN & BLOOMER, 2009). Als Folge davon
sind Zell-Schutzmechanismen gegen ROS in den Mitochondrien von
besonderer Bedeutung (GREEN & REED, 1998). Jedoch weisen Powers und
Jackson, 2008 darauf hin, dass sich die Bildung von ROS auch aus einer Reihe
von potenziellen nicht-mitochondrialen Quellen während der Muskelkontraktion
ableitet.
Die selektive Regulierung der Peroxiredoxin-Isoformen lässt vermuten, dass
auß erdem auch noch andere antioxidative Enzyme reguliert werden, die nicht in
94
Diskussion
der vorliegenden Studie untersucht wurden. Dies könnte bedeuten, dass
abhängig
vom
basalen
antioxidativen
Schutz
unterschiedliche
Anpassungsmuster der einzelnen Peroxiredoxin-Isoformen zu beobachten sind.
Daher sollte in weiteren Trainingsstudien geklärt weden, ob die andere
Isoformen von SOD (SOD1: primär im Zytosol, SOD3: im Extrazellulärraum) bei
TypII-Diabetikern herunter reguliert sind und inwieweit regelmäß ige körperliche
Aktivität diese positiv beeinflussen kann. Diese Substratmängel könnten dazu
führen, dass das Wasserstoffperoxid reduzierende Enzym Peroxiredoxin reaktiv
im Zytosol herunter reguliert wird. Ein zusätzlicher Stressstimulus durch
Training könnte dagegen zu vermehrtem Anfall an Wasserstoffperoxid und
durch diese Steigerung, Mehrangebot an Substrat, zu einer Enzymstimulation
für zytosolische Peroxiredoxin-Isoformen führen. Wenn dies der Fall wäre,
könnte es als ein möglicher Erklärungsansatz für unsere Ergebnisse in der
Ausdauergruppe, eine signifikante bzw. tendenzielle Heraufregulierung der
zytosolischen Peroxiredoxin-Isoformen (1, 5 und 6) und der extrazellulären
Isoform 4, dienen. Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für die Ergebnisse
in der Ausdauergruppe könnte auch die trainingsinduzierte Verstärkung der
Hitzeschockproteine (HSP) in der Muskulatur sein (FEHRENBACH & NIESS,
1999; FEHRENBACH et al., 2000; KREGEL, 2002; RENSING et al., 2005;
VENOJARVI et al., 2007; BRINKMANN, 2010), weil sie eine Chaperonfunktion
haben, deren wichtige Funktion es ist, bei der korrekten Faltung und
Stabilisierung von Proteinen, bei der Einschleusung von wichtigen Proteinen in
Mitochondrien, beim Transport im Zytosol und an den Ribosomen zu helfen
(LIU et al., 2006; RENNER, 2008). Unter anderem ist HSP70 beschrieben als
Hilfsmolekül von Proteinen, die in die Mitochondrien transportiert werden
(STUART et al., 1994; NOBLE et al., 2006). HSP70 bindet an neu translatierte
Proteine und begleitet sie an die äuß ere Membran der Mitochondrien
(GEHRMANN, 2003). Dabei agiert HSP70 als Akzeptor für ungefaltete Proteine
und verhindert damit die Degradation der im Zytosol noch nicht funktionsfähig
gefalteten Proteine (HARTL & HAYER-HARTL, 2002; WALTER & BUCHNER,
2002). Mit Hilfe von HSP70 können die für den Transport in die Mitochondrien
bestimmte
Proteine
an
Transporterkomplexe
der
äuß eren
Mitochondrienmembran gelangen, so wird das transportierte Protein unter
Abspaltung des mitochondrialen Signalpeptids ATP-abhängig linearisiert und
durch die Membranen des Mitochondrium geschleust (CSERMELY, 2001;
HARTL & HAYER-HARTL, 2002). Im inneren des Mitochondriums wird das
95
Diskussion
linearisierte Molekül durch das mit einem Molekülkomplex an der inneren
Mitochondrienmembran assoziierte mtHSP70 in Empfang genommen.
MtHSP70 unterstützt das transportierte Protein bei der Faltung und stabilisiert
diese Struktur (STAUART et al., 1994; GEHRMANN, 2003). Zusätzlich zu seiner
Funktion als „stress sensoring“, führt die gesteigerte Expression von HSP70
auch
zu
einer
gesteigerten
Toleranz
gegenüber
nachfolgenden
Stressereignissen (LIU et al., 2006; VENOJARVI et al., 2007).
Angesichts der festgestellten tendenziellen Unterschiede der trainingsbedingten
Peroxiredoxin-Expression bei der Ausdauer- und Kraftgruppe ist jedoch
erklärungsbedürftig, ob die Peroxiredoxin-Expression mit den Muskelfasertypen
zusammenhängt. Es wurde in anderen Studien schon berichtet, dass es
möglich ist, dass trainingsinduzierte Veränderungen der Muskelfasertypzusammensetzung einen Einfluss auf die antioxidative Schutzfunktion haben
könnten (POWERS et al., 1994; NEUFER et al., 1996).
Zusammenfassend konnten alle sechs Peroxiredoxin-Isoformen im menschlichen Skelettmuskel nachgewiesen werden, und es zeigte sich eine
unterschiedliche Regulierung bei körperlichem Training. Auß er bei
Peroxiredoxin 1 in der Ausdauergruppe zeigte sich keine signifikante
Veränderung der Peroxiredoxin-Isoformen bei 12-wöchiger körperlicher Aktivität.
Trotz der meist fehlenden statistischen Signifikanz lassen sich einige
interessante Befunde erheben. Es zeigte sich tendenziell eine unterschiedliche
Regulation nach Trainingsformen. Ausdauertraining bewirkte bei den
Diabetikern einen signifikanten Anstieg von Prx 1 und eine tendenzielle
Zunahme der Prx 4-6, wobei sich in der Kraftgruppe nur bei Prx 5 eine
tendenzielle Zunahme der Expression zeigte. Dies wirft weitere Fragen auf. Zu
untersuchen ist beispielsweise, ob Peroxiredoxin-Isoformen in den TypI-Fasern
generell eine höhere Expression zeigen. Bei zukünftigen Studien sollte
auß erdem der Trainingszeitraum verlängert werden oder die Intensität und der
Umfang des Trainings erhöht werden, um aussagekräftigere Ergebnisse zu
erzielen.
96
Diskussion
4.6 Trainingsinduzierte Veränderung der mitochondrialen Proteine
(PGC1α, NRF1, TFAM) im Skelettmuskelgewebe bei TypII-Diabetikern
Mitochondriale
Funktionsstörungen
im
Skelettmuskelgewebe
sind
Begleiterscheinungen in der Pathogenese des Diabetes mellitus TypII
(BONNARD et al., 2008). Die mitochondrialen Funktionsstörungen im
Skelettmuskelgewebe können durch körperliches Training korrigiert werden.
Dabei kann die mitochondriale Biogenese gesteigert werden, die zu einer
vermehrten Anzahl der Mitochondrien pro Zelle, deren Funktionalität,
Stimulierbarkeit und Aktivität, führt (LI et al., 2007). Die Regulation der
mitochondrialen Biogenese ist ein äuß erst komplexer Prozess, der durch das
Zusammenspiel von verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren
zustande kommt. Die genauen Zusammenhänge sind bisher nicht ausreichend
geklärt. Darüber hinaus ist weitgehend undefiniert, welche Art der Belastung,
welcher Umfang und welche Intensität bei den Grundlagentrainingsprogrammen
umgesetzt werden müssen, um möglichst effiziente Aktivierungen bzw.
Expressionen mitochondrialer Signalproteine zu bewirken (TAYLOR et al.,
2005).
Um den Einfluss von 12-wöchiger körperlicher Aktivität in Form von Ausdauerund
Krafttraining
auf
die
mitochondrialen
Signalproteine
im
Skelettmuskelgewebe bei TypII-Diabetikern zu untersuchen, wurde die
trainingsinduzierte Veränderung der Expression von PGC1α, NRF1 und TFAM
bei TypII-Diabetikern analysiert.
NDM vs NIDDM
Diabetes
Diabetes
Ausdauergruppe
Kraftgruppe
PGC1
↓*
=
=
NRF1
=
↓*
↓*
TFAM
↓*
=
=
Tab.46: Ü bersicht aller Untersuchungen mit Regulation der Mitochondrienbiosynthese
(↑ = Heraufregulierung der Expression, ↓ = Herabregulierung der Expression,
* = p ≤ 0.05).
PGC1α- und TFAM verringerten sich basal bei TypII-Diabetikern gegenüber den
Nicht-Diabetikern und NRF1 war in beiden Gruppen gleich. Nach dem Training
97
Diskussion
bleibt sowohl die Expression von PGC1α als auch TFAM unverändert, während
eine signifikant verminderte Expression von NRF1 in beiden Trainingsgruppen
festgestellt wurde (Tab.46).
Eine mögliche Erklärung für unsere Ergebnisse wäre, dass die basale
Herabregulation von PGC1α nicht sofort zu einer Herabregulation der weiteren
Signalproteine führt, sondern lediglich eine vermehrte Expression der
Signalkaskade verhindert. Des Weiteren handelt es sich bei der unveränderten
Expression von PGC1α durch körperliche Aktivität möglicherweise nicht um
einen Anpassungsmechanismus an veränderte Energieanforderungen sondern
um eine Dysregulation, die in der mitochondrialen Homöostase während der
Entwicklung des Diabetes mellitus auftritt, welche in eine Herunterregulation der
mitochondrialen Signalproteine resultiert. Diese Veränderungen könnten zu
einem zunehmenden oxidativen Schaden und programmierten Zelltod
(Apoptose) von Mitochondrien
führen (SZENDRÖ DI & RODEN, 2009).
Bemerkenswert war auß erdem die TFAM-Expression, die je nach Fasertyp
unterschiedlich war. In der vorliegenden Untersuchung kam es bei der
Auswertung
der
Myosin-ATPase-Färbung
zu
keiner
signifikanten
gruppenspezifischen Verschiebung des prozentualen Muskelfasertyps, welches
als mögliche Ursache für die TFAM-Expression sein könnte, die trotz
fasertypunterschiedlich
angefärbte
Gewebeschnitte
bei
der
immunhistochemischen Untersuchung keine signifikanten trainingsformabhängigen Unterschiede angeführt werden kann. Es ist jedoch
erklärungsbedürftig, ob die TFAM in den TypI-Fasern generell eine höhere
Expression zeigt.
Eine Hauptlinie in der Kontrolle des mitochondrialen Energiestoffwechsels und
der Entwicklung diabetesbedingter pathologischer Konditionen beinhaltet die
Signalübertragung und die Regulation der mitochondrialen Biogenese im
Skelettmuskel durch die AMPK (TERADA et al., 2002; REZNICK & SCHULMAN,
2006; SRIWIJITKAMOL et al., 2006; IRRCHER et al., 2008). In verschiedenen
Studien konnte nachgewiesen werden, dass übergewichtige insulinresistente
Nagetiere eine abnorme AMPK-Signalisierung haben (BERGERON et al., 2001;
BARNES et al., 2002; ATHERTON et al., 2005; SRIWIJITKAMOL et al., 2006).
Ä hnliche Beobachtungen wurden in der Untersuchung von Sriwijitkamol et al.
2007 an Menschen gemacht, nämlich dass bei adipösen TypII-Diabetikern die
Stimulation der AMPK beeinträchtigt ist. In ihrer Untersuchung bei niedriger
98
Diskussion
(50 % VO2max) Intensität erhöhte sich zwar die AMPK-Aktivität in der Gruppe
von Normalgewichtigen signifikant, hatte aber keine Erhöhung der AMPKAktivität in der adipösen TypII-Diabetes-Gruppe zur Folge, wobei jedoch 40 min.
von moderater (70 % VO2max) Intensität AMPK-Phosphorylierung auf 3,5-fach
über basal erhöhte. Dieses Ergebnis führt zu der Frage, ob Ü bergewichtige und
diabetische Probanden eine höhere Intensität ausüben sollten, weil bei ihnen
die Stimulation der AMPK abgeschwächt ist, um diesen Signalweg bis zum
gleichen Niveau wie bei Normalgewichtigen in der Muskelzelle zu stimulieren. In
diesem Zusammenhang konnte dargestellt werden, dass die körperliche
Belastung eine intensität- und zeitabhängige Wirkung zur AMPK-Signalisierung
bei Normalgewichtigen, Ü bergewichtigen und TypII-Diabetikern stimuliert.
Allerdings ist nicht gesichert, dass Hyperglykämie die alleinige Ursache für
reduzierte Stimulation der AMPK ist. Zudem zeigte die Untersuchung von Short
et al. 2003, dass während der kürzeren Dauer des Training ein Anstieg der
PGC1α-Expression nicht immer mit einer Heraufregulation der nachgelagerten
Transkriptionsfaktoren, NRF1- und TFAM-Expression, verbunden war. Es wurde
in mehreren Trainingsstudien vorgeschlagen, eine nachhaltige kontraktile
Aktivität über 1 Stunde durchzuführen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen,
dass die PGC1α mRNA erhöht wird (YU et al., 2001; PILEGAARD et al., 2003;
TERADA et al., 2004; WATT et al., 2004; RUSSEL et al., 2005). Trotz des
Anstiegs von PGC1α mRNA beobachteten Martin et al. 2009 in ihrer
Untersuchung einen unveränderten PGC1α-Proteingehalt. Dieser Befund steht
im Einklang mit zwei weiteren Studien an Menschen, die keine Veränderung des
PGC1α-Proteingehalts trotz erhöhter mRNA-Expression zeigten (WATT et al.,
2004; COFFEY & HAWLEY, 2007). Im Vergleich dazu berichtete die neue
Studie von De Filippis et al. 2008, dass der PGC1α-Proteingehalt um 20 bis
40 % erhöht wird, wenn die Messungen 30 und 300 Minuten nach dem Training
durchgeführt werden.
Die uneinheitlichen Ergebnisse der oben beschriebenen Studien könnten damit
zusammenhängen, dass die AMPK-Signalisierung und die Expression von
mitochondrialen Proteinen mit der Intensität und der Dauer des Trainings und
dem Zeitpunkt der Messung korrelieren. In Ü bereinstimmung mit den
beschriebenen
Untersuchungsergebnissen
war
offensichtlich
die
Belastungsintensität des moderaten Ausdauer- und Krafttrainings in der
DiabetesAktiv-Studie zu gering, um über die Trainingsintensität eine erhöhte
Proteinexpression der mitochondrialen Signalproteine zu erreichen.
99
Diskussion
Interessanterweise konnte des Weiteren in verschiedenen Trainingsstudien
beobachtet werden, dass die PGC1α-Expression mit mitochondrialen
antioxidativen Enzymen korreliert (VALLE et al., 2005; ST. PIERRE et al., 2009).
Diese Erkenntnisse schaffen eine mögliche Verbindung zwischen ROS und
PGC1α, die die mitochondriale Anpassung begünstigen kann. In diesem
Zusammenhang haben Wu et al. 1999 geprüft, ob in Zellen durch erhöhte
Expression von PGC1α der Gehalt an zellulären Proteinen des antioxidativen
Enzymsystems geändert wird. Ihre Ergebnisse deuten tatsächlich darauf hin,
dass PGC1α das Niveau von MnSOD, KAT, Prx3, Prx5, UCP2, TRXR2 und
TRX2 bei normalen Glukose- und oxidativen Stress-Bedingungen steigert.
Somit stellt die Bildung von ROS einen ursächlichen Faktor für die Auslösung
einer vermehrten Expression von mitochondrialen Proteinen sowie wichtigen
Transkriptionsregulatoren einschließ lich PGC1α, NRF1 und TFAM dar und
diese Coaktivatoren wiederum regulieren ein komplexes und vielfältiges
Abwehrsystem gegenüber oxidativem Stress. In diesem Zusammenhang konnte
zudem dargestellt werden, dass PGC1α nicht nur als Aktivator der oxidativen
Energieumsetzung des Mitochondriums fungiert, sondern gleichzeitig
regulierend in die Expression von antioxidativen Enzymen gegenüber
oxidativem Stress eingreift. Da viele Untersuchungen eine Korrelation der
Expression mitochondrialer antioxidativer Enzyme mit der Erhöhung der
PGC1α-Expression nachgewiesen haben (ST. PIERRE et al., 2003; VALLE et
al., 2005; KUKIDOME et al., 2006), wurde in der vorliegenden Untersuchung
eine vermehrte Expression von PGC1α, NRF1 und TFAM mit
trainingsinduzierten erhöhten antioxidativen Enzymen (MnSOD, GPx und Prx)
erwartet. Aber entgegen den Erwartungen wurde in dieser Untersuchung keine
Erhöhung von mitochondrialen Signalproteinen beobachtet. Eine ebenso
unerwartete Beobachtung war die signifikant verminderte Expression von NRF1
bei den unveränderten PGC1α und TFAM in beiden Trainingsgruppen. Diese
unerwarteten Veränderungen von NRF1 könnten möglicherweise erklärt werden
durch eine Reihe zwischengeschalteter Signalmoleküle (z. B. CamKIV,
Calmodulin, PKC, p38MAPK) (HOOD et al., 2006; GEHLERT et al. 2007) und
durch einen weiteren alternativen Transkriptionsfaktor, der unabhängig von
PGC1α reguliert, oder durch einen bislang unentdeckten Mechanismus, der die
Stimulation für eine Herauf- bzw. Herabregulation erzeugen kann.
Obwohl Effekte der körperliche Aktivität auf eine Vielfalt von Ä nderungen der
100
Diskussion
Signaltransduktion und der Expression von mitochondrialen Proteinen in einer
Vielzahl von Studien beschrieben sind, ist es schwer, bei unterschiedliche
Trainingsart, -Intensität und -Dauer zu vergleichbaren Resultaten zu kommen.
Zusammenfassend könnte in Abhängigkeit von akutem oder chronischem
körperlichen Training in Abhängigkeit von der Art und Intensität der körperlichen
Belastung eine kompensatorische Zu- oder Abnahme der Expression bzw.
Aktivität oder Inhibition des Enzyms beobachtet werden. Es konnte in der
vorliegenden Studie gezeigt werden, dass das 12-wöchige Ausdauer- oder
Krafttraining zu den Messzeitpunkten keinen positiven Effekt auf die
mitochondrialen Signalproteine hatte. Es lässt sich aber nicht direkt belegen,
dass unsere Ergebnisse der bislang vermuteten Theorie, dass PGC1α die
mitochondriale Biogenese im Skelettmuskel entsprechend den veränderten
Energieanforderungen anpasst, widersprechen, weil wir die Werte nur am
Anfang und am Ende gemessen haben. Es stellt sich daher die Frage, ob ein
Vorher-Nachher-Vergleich der mitochondrialen Anpassung ausreichend ist, weil
es möglich sein könnte, dass in Bezug auf die Expression bzw. Aktivierung
mitochondrialer Signalproteine innerhalb und über den Interventionszeitraum in
beiden Gruppen zeitpunktabhängig positive und/oder negative Anpassungen
nachgewiesen werden könnten. Damit ist empfehlenswert, bei künftigen Untersuchungen mehrere Protokolle (von unterschiedlicher Intensität und Dauer) mit
mehreren Samples post-training (über verschiedene Zeitpunkte) in einen
Versuch zu nehmen, um gültige und aussagekräftige Ergebnisse zu einer
Erhöhung der transkriptionellen Mechanismen als Reaktion auf Training zu
erhalten. In weiteren Studien müsste auch geklärt werden, ob die TFAM in den
TypI-Fasern generell eine höhere Expression zeigt und ob die NRF1 und TFAM
durch einen weiteren alternativen Transkriptionsfaktor mitreguliert werden.
4.7 Die mö gliche Bedeutung der beobachteten Veränderungen fü r
den Diabetiker
Regelmäß ige körperlicher Aktivität im Sinne von sportlicher Betätigung wird in
der Primär- und Sekundärprävention bei TypII-Diabetikern in verschiedener
Hinsicht eine positive Wirkung auf die Muskelzellen zugeschrieben
(CASTANEDA et al., 2002; BOULE et al., 2003; CAUZA et al., 2005;
SNOWLING & HOPKINS, 2006). Hierfür wird unter anderem die Verbesserung
101
Diskussion
der Leistungsfähigkeit und der körpereigenen Abwehr gegen freie Radikale
verantwortlich gemacht, weil bisher durchgeführte Untersuchungen eine
geringere Leistungskapazität und eine deutlich verminderte antioxidative
Kapazität bzw. erhöhten oxidativen Stress bei TypII-Diabetikern festgestellt
haben (OZDIRENCE et al., 2003; PANDEY et al., 2010). Diese positive Wirkung
von körperlicher Aktivität konnte in der vorliegenden Studie auch festgestellt
werden.
Sowohl bei der Ausdauergruppe als auch bei der Kraftgruppe ließ sich in
vorliegender
Untersuchung
eine
signifikante
Verbesserung
der
Ausdauerleistungsfähigkeit nachweisen. Einerseits führt ein regelmäß iges
ausdauerorientiertes Training zu einer Ö konomisierung der Herzarbeit, die auf
einer Erhöhung des Vagotonus, auf einer Senkung des Ruhe- und
Belastungspulses und auf einer Verminderung des Sauerstoffbedarfs des
Herzmuskels beruht (MEYER & KINDERMANN, 1999; PERINI &
VEICESTEINAS, 2003; KETELHUT et al., 2004; KINDERMANN, 2004;
VONBANK et al., 2005). Andererseits kommt es zu einer Leistungserhöhung
der Herzarbeit durch eine Größenzunahme des Herzens und einer
Vergröß erung des Schlag- und Herzminutenvolumens in Ruhe und Belastung,
woraus eine erhöhte Sauerstoffaufnahmefähigkeit resultiert (MARLIN &
NANKERVIS, 2002; LEE et al., 2008). Das heiß t letztendlich, dass ein höheres
Schlagvolumen bei gleichzeitiger Verringerung der Herzfrequenz eine
Ö konomisierung der Herzleistung erkennen lässt (MEYER & KINDERMANN,
1999; PERINI & VEICESTEINAS, 2003; KETELHUT et al., 2004;
KINDERMANN, 2004; VONBANK et al., 2005). Ein gut ausdauertrainierter
Skelettmuskel zeichnet sich darüber hinaus vor allem durch die Fähigkeit aus,
auch während der Leistung groß e Mengen von Laktat zu oxidieren und dabei
Energie zu gewinnen (GOLLNER, 1991; STEGEMANN, 1991; HOLLANN &
HETTINGER, 2000). Die geringere Laktatakkumulation nach einer
Trainingsphase ist vermutlich die Folge der gestiegenen Mitochondriendichte
(BELARDINELLI et al., 1995; BUTZ et al., 2004; KOBAYASHI, 2004), der
größ eren oxidativen Kapazität und der gesteigerten Monocarboxylattransporter
(MCT) in der Skelettmuskulatur (HAMBRECHT et al., 1995; AOI et al., 2004;
JUEL et al., 2004; MEYER et al., 2005). Ein gesteigerter MCT bewirkt eine
schnellere Verteilung des Laktats in den Körperzellen (z. B. Skelett- und
Herzmuskelzellen), die das Laktat im Rahmen der aeroben Energiegewinnung
102
Diskussion
nutzen können.
Abb.46: Körperliches Training kann je nach Intensität zu einem Schutz führen oder die
Bildung von freien Radikalen beschleunigen (modifiziert nach Bloch & Schmidt, 2005).
Obwohl zahlreiche Studien eine Hochregulierung körpereigener antioxidativ
wirkender Enzyme durch regelmäß ige körperliche Belastung belegt haben,
kann körperliches Training je nachdem Intensität entweder zu einem Schutz vor
freien Radikalen führen oder die Bildung von freien Radikalen beschleunigen.
Während die akute intensive körperliche Belastung mit vermehrtem oxidativem
Stress über verschiedene Wege, u. a. durch die vermehrte Radikalenproduktion
in den Mitochondrien über den Cytochromoxidaseregulationsweg oder den
Xanthindehydrogenaseweg oder über die verstärkte Autoxidation von
Oxyhämoglobin, Oxymoglobin oder von Katecholaminen, verbunden ist, kann
jedoch davon ausgegangen werden, dass der Schutz vor oxidativem Stress, der
bei einer erhöhten Belastung mit freien Radikalen auftrittt, durch regelmaß iges
Training vor allem im Ausdauerbereich verbessert wird (Abb. 46) (REID, 2001;
JI, 2002; BLOCH & SCHMIDT, 2004; GOMEZ-CABRERA et al., 2005;
SCHULTZ JOHANSEN et al., 2005; HERSPRING et al., 2008). Hierfür spielen
freie Radikale eine Rolle als Signal- und Modulatormoleküle, sie beeinflussen
die
kontraktile
Funktion
und
die
Regulation
redoxsensitiver
Transkriptionsfaktoren des Skelettmuskels, die wiederum die Genexpression
antioxidativ wirksamer Proteine anschalten (REID, 2001; BLOCH & SCHMIDT,
2004; HERSPRING et al., 2008; POWERS & JACKSON, 2008). Es kann in der
103
Diskussion
vorliegenden Studie auch belegt werden, dass beide Trainingsformen über eine
Stärkung der endogenen antioxidativen Enzyme (MnSOD, GPx und Prx 5), vor
allem in den Mitochondrien, verfügen, die bei entsprechender Stressexposition
erhöht und vermehrt exprimiert werden. Die SOD bilden die erste
Verteidigungslinie gegen Angriffe durch das Superoxidanion, indem sie die
Dismutation des Superoxidanions zu Sauerstoff und Wasserstoffperoxid
katalysieren, welches wiederum durch weitere antioxidative Enzymen wie KAT,
GPx und Prx unschädlich gemacht wird, indem es in Wasser und Sauerstoff
umgewandelt wird (RISTER & BAYERMEISTER, 1982; MACHLIN & BENDICH,
1987; NOZIK-GRAYCK et al., 2005). Aus dieser Verteidigungslinie gegen freie
Radikale könnten unsere Ergebnisse erklärt werden, d. h. dass durch
trainingsinduzierte SOD-Expression mehr Wasserstoffperoxid gebildet wurde
und diese Steigerung zu einer Enzymstimulation von GPx und Prx geführt hat.
Zudem konnte ein interessanter Befund während unserer Untersuchungen bei
Peroxiredoxin-Isoformen beobachtet werden. Ausdauertraining bewirkte einen
signifikanten Anstieg von Prx 1 und eine tendenzielle Zunahme der Prx 4-6,
wobei sich in der Kraftgruppe nur bei Prx 5 eine tendenzielle Zunahme der
Expression zeigte, was hier auf eine unterschiedliche Regulierung der
Peroxiredoxin-Isoformen infolge von verschiedenen Trainingsformen schließ en
lässt.
Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich schließ en, dass TypII-Diabetiker
die Möglichkeit haben, dem oxidativen Stress zunächst durch eine Stärkung
endogener, vor allem mitochondrialer Reserven entgegenzuwirken und somit
ein regelmäß iges Training und eine kontinuierliche Adaptation an die Belastung
von hoher Relevanz bei der Verminderung von oxidativen Schäden ist. Obwohl
eine Reihe von Untersuchungen zur Bildung und Wirkung von sowie dem
Schutz vor freien Radikalen im Zusammenhang mit körperlicher Belastung
durchgeführt wurden, gibt es nur unzureichend valide Informationen zur
Intensität- und Umfangsmodulation, die zu einer Protektion führen (TAYLOR et
al., 2005). Dies liegt zum einen daran, dass die trainingsinduzierte Anpassung
der
antioxidativen
Mechanismen
vom
jeweiligen
Trainingsund
Gesundheitszustand, aber auch vom Alter und Geschlecht abhängig sind
(ALESSIO & GOLDFARB, 1988; OHNO et al., 1988; FUKAI et al., 2001; RUSH
& SANDIFORD, 2003; RENSING et al., 2005), zum anderen aber auch daran,
dass die kurzlebigen freien Radikale nur sehr schwierig in vivo nachgewiesen
104
Diskussion
werden können (BLOCH & SCHMIDT, 2004). Zukünftig sollte im Bereich von
oxidativem Stress und körperlichem Training diese Grenze zwischen protektiven
und schädlichen Auswirkungen der trainingsinduzierten ROS-Produktion erklärt
werden. Interessant wäre es weiter zu untersuchen, ob die fasertypspezifischen
Unterschiede der einzelnen antioxidativen Enzyme mit Steigerung des
Trainingsumfangs und/oder der Trainingsintensität deutlicher werden können.
Schließ lich ergab sich im Vergleich der beiden Interventionsgruppen kein
gruppenspezifischer Unterschied hinsichtlich der Verbesserung der körperlichen
Leistung und der Erhöhung der antioxidativen Enzyme (SOD, GPx), während
bei der Expression von Peroxiredoxin-Isoformen trotz der meist nur
tendenziellen Ergebnisse das Ausdauertraining eine effiziente Belastungsform
zu sein scheint. Eine Erklärung für die meist fehlenden trainingsartspezifischen
Unterschiede in unserer Untersuchungen könnte daraus resultieren, dass es
sich zum einen bei unserer Krafttrainingsintervention nicht um reines
Krafttraining, sondern eher um Kraftausdauertraining handelt und zum anderen
die Belastungsintensität, -einheiten (2 x Woche) des Ausdauer- und
Krafttraining zu gering ist, um über den Interventionszeitraum einen
trainingsartspezifischen Unterschied nachzuweisen. Zur Analyse des Einflusses
der Belastungsintensität und der Umfang beim Ausdauer- als auch Krafttraining
auf antioxidativen Enyzmen bedarf es weiterer Trainingsstudien sowohl mit
gesunden Kontrollgruppen als auch TypII-Diabetikern, um die Effizienz der
diabetes-, belastungsintensität- und belastungsumfangbedingten Unterschiede
hinsichtlich der zellulären Anpassungen zu überprüfen. Möglicherweise führen
höhere Belastungsintensitäten mit längeren Regenerationszeiten zu positiveren
zellulären Anpassungserscheinungen als geringere Belastungsintensitäten,
woraus sich in Zukunft neue, effizientere Trainingskonzepte für das Ausdauerund Krafttraining entwickeln ließ en.
105
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
TypII-Diabetes geht mit einer systemisch erhöhten Bildung von ROS bei
gleichzeitig verminderten antioxidativen Enzymen und mitochondrialen
Signalproteinen einher. Der Fokus dieser Arbeit lag daher auf muskulären
Veränderungen oder molekularen zellulären Adaptationsmechanismen durch
12-wöchige körperliche Aktivität in Form von Ausdauer- oder Krafttraining bei
TypII-Diabetikern. Zu Beginn und am Ende des dreimonatigen Ausdauer- und
Krafttrainings wurde den Studienteilnehmern eine Biopsie aus dem M. vastus
lateralis entnommen. An Gewebeschnitten wurden morphologische und
histochemische Untersuchungen durchgeführt. Es wurden der Isoformshift der
Skelettmuskelfasern, die Muskelfaserquerschnitte, der Leistungszuwachs und
die Herzfrequenz bei Laktat 2 und 4 mmol/l als Parameter der
Leistungsverbesserung untersucht. Weitere entscheidende Untersuchungen
dieser Arbeit waren die molekulare zelluläre Anpassung des oxidativen Stresses
(8-Isoprostan als Marker für oxidativen Stress), der antioxidativen Enzymen
(MnSOD, GPx und Prx 1-6) und der mitochondrialen Signalproteine (PGC1α,
NRF1 und TFAM) durch körperliche Aktivität in Form von Ausdauer- und
Krafttraining. Weiterhin wurden die Basalexpression der antioxidativen Enzyme
und mitochondrialen Signalproteine bei nicht-insulinpflichtigen TypII-Diabetikern
(NIDDM) und adipösen nicht-diabetischen Männern (NDM) verglichen.
Die körperliche Leistungsfähigkeit verbesserte sich in beiden Trainingsgruppen.
Die anderen erfassten morphologischen Parameter wie Muskelfasershift und
Faserquerschnitt erreichten über beide Gruppen hinweg keine signifikanten
Veränderungen. Das 8-Isoprostan als Marker für oxidativen Stress war vor dem
Training bei den TypII-Diabetikern signifikant gegenüber der Kontrollgruppe
vermindert und blieb jedoch nach dem Training unverändert. Bei der MnSOD
zeigte sich im basalen Vegleich kein Unterschied, aber eine signifikant
geringere GPx bei TypII-Diabetikern. Und die Expression von SOD und GPx
erhöhten sich signifikant in beiden Trainingsformen. Die Expression von Prx 2
und 6 war bei den TypII-Diabetikern signifikant zur Kontrolle erhöht.
Ausdauertraining bewirkte bei den TypII-Diabetikern einen signifikanten Anstieg
von Prx 1 und eine tendenzielle Zunahme der Prx 4-6, wobei sich in der
Kraftgruppe nur bei Prx 5 eine tendenzielle Zunahme der Expression zeigte.
PGC1α und TFAM verringerten sich vor dem Training bei den TypII-Diabetikern
106
Zusammenfassung
signifikant gegenüber der Kontrollgruppe und blieb nach dem Training
unverändert. NRF1 war vor Beginn des Trainings in allen Gruppen gleich,
verminderte sich signifikant in beiden Gruppen durch Training.
Im Vergleich der beiden Interventionsgruppen ergab sich kein
gruppenspezifischer Effekt hinsichtlich der Isoformshift der Skelettmuskelfasern,
der Muskelfaserquerschnitte, der Verbesserung der körperlichen Leistung,
Erhöhung der Expression von antioxidativen Enzymen (SOD, GPx) und
mitochondrialen Signalproteine (PGC1α, NRF1 und TFAM). Einzige
Unterschiede in den Trainingsgruppen waren die Expression von PeroxiredixinIsoformen, trotz der meist nur tendenziellen Ergebnisse scheint das
Ausdauertraining eine effiziente Belastungsform zu sein. Auß erdem lässt eine
signifikante oder teilweise tendenzielle Herauf- bzw. Herunterregulierung von
mitochondrialen Signalproteinen vermuten, dass körperliche Aktivität im Muskel
eine Regulierung der mitochondrialen Signalproteine beeinflussen kann. Daher
ist empfehlenswert, bei künftigen Untersuchungen mehrere Protokolle (von
unterschiedlicher Intensität und Dauer) mit mehreren Samples post-Training
(über verschiedene Zeitpunkte) in einen Versuch zu nehmen, um gültige und
aussagekräftige Ergebnisse zu Anpassungsmechanismen als Reaktion auf
Training zu erhalten. In weiteren Studien müsste auch nachgewiesen werden,
ob die Prx, TFAM in den TypI-Fasern generell eine höhere Expression zeigt und
ob die NRF1 und TFAM durch einen weiteren alternativen Transkriptionsfaktor
mitreguliert werden.
Zusammenfassend
lässt
sich
schließ en:
Systematisch
geplante
Trainingsinterventionen mit TypII-Diabetikern, die über 12 Wochen (2- bis 3-mal
die Woche) mit submaximalen Intensitäten durchgeführt werden, verbessern die
beim Diabetiker oftmals verminderte Leitungsfähigkeit und ungünstige oxidative
Stress-Situation durch Hochregulierung von antioxidativen Enzymen wie der
Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase sowie auch der antioxidativ
wirkenden Peroxiredoxine, vor allem auch in den Mitochondrien. Körperliche
Aktivität kann somit einen protektiven Beitrag im Hinblick auf die Entstehung der
Krankheit und die Progression diabetischer Sekundärkomplikationen leisten.
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Methoden,
Anhang
7. Anhang
7.1 Abbildungsverzeichnis
Abb.1: Zellbiologische und molekularbiologische Konzequenzen der Hyperglykämie
induzierten Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ...................... 7
Abb.2: Abbauwege der reaktiven Sauerstoffspezies durch die antioxidativen Enzyme
der Zelle. .......................................................................................................... 9
Abb.3: Die Katalytischer Mechanismus der drei Prx-Typen. ........................................ 12
Abb.4: Signalwege der mitochondrialen Biogenese. ................................................... 15
Abb.6:
Immundetektion
(mit
(Strept)Avidin-Biotin-Enzym-Komplex,
biotinylierten
Sekundärantikörpern und 3,3´-Diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB))
(nach Luttmann et al. 2004). ........................................................................... 30
Abb.7: Mittelwerte und Standardabweichung der Herzfrequenz und der Leistung (Watt)
der TypII-Diabetiker vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining an der
2mmol/l und bei 4mmol/l Laktatschwelle. ........................................................ 36
Abb.8: Veränderung der Muskelfasertypen vor und nach 12-wöchigem Ausdauer-und
Krafttraining bei TypII-Diabetikern. .................................................................. 39
Abb.9: Veränderung des Skelettmuskelfaserquerschnitts vor und nach 12-wöchigem
Ausdauer- und Krafttraining bei TypII-Diabetikern........................................... 41
Abb.10: Expression von 8-Isoprostan im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern im
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
Nicht-Diabetikern
nach
immunhistochemischer Analyse mit densitometrischer Auswertung ................ 44
Abb.11: Expression von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei
TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse mit densitometrischer
Auswertung .................................................................................................... 45
Abb.12: Expression von 8-Isoprostan vor und nach 12wöchigem Kraftrtraining bei
TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse mit densitometrischer
145
Anhang
Auswertung. ................................................................................................... 46
Abb.13: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern im
basalen Vergleich zur Expression bei Adipösen nach immunhistochemischer
Analyse mit densitometrischer Auswertung. ................................................... 47
Abb.14: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Ausdauertrraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Analyse mit densitometrischer Auswertung *mit p≤ o.o5 ................................. 48
Abb.15: Expression von Superoxiddismutase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Krafttraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Analyse mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5 ................................ 49
Abb.16: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern
im
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
TypII-Diabetikern
nach
immunhistochemischer Analyse mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤
o.o5 ................................................................................................................ 50
Abb.17: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Abb.18: Expression von Glutathionperoxidase im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem Krafttraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
TypII-Diabetikern
nach
immunchistochemischer Analyse mit densitometrischer Auswertung .............. 54
Ausdauertraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse
mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5 ............................................. 55
Abb.21: Expression von Peroxiredoxin1 im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem
Krafttraining bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer Analyse mit
densitometrischer Auswertung. ....................................................................... 56
Abb.22: Expression von Peroxiredoxin2 im Skelettmuskel
146
bei TypII-Diabetikern im
Anhang
mit densitometrischer Auswertung. ................................................................. 58
Abb.25: Expression von Peroxiredoxin3 im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern im
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
TypII-Diabetikern
nach
immunhistochemischer Analyse mit densitometrischer Auswertung. ............... 63
Abb.31: Expression von Peroxiredoxin5 im Skelettmuskel bei TypII-Diabetikern im
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
Nicht-Diabetikern
nach
147
Anhang
mit densitometrischer Auswertung . ................................................................ 67
basalen
Vergleich
zur
Expression
bei
TypII-Diabetikern
nach
Abb.37: Expression von PGC1 im Skelettmuskel
bei TypII-Diabetikern in basalen
Vergleich zur Expression bei Adipösen nach immunchistochemischer Analyse
Abb.38: Expression von PGC1 im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
Abb.39: Expression von PGC1 im Skelettmuskel vor und nach 12-wöchigem
Abb.40: Expression von NRF1 im Skelettmuskel
bei Nicht-Diabetikern im basalen
Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
mit densitometrischer Auswertung. *mit p≤ o.o5 ............................................. 77
Abb.42: Expression von NRF1 im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem
148
Anhang
densitometrischer Auswertung*mit p≤ o.o5. .................................................... 78
Abb.43: Expression von TFAM im Skelettmuskel bei Nicht-Diabetikern im basalen
Vergleich zur Expression bei TypII-Diabetikern nach immunhistochemischer
Abb.44: Expression von TFAM im Skelettmuskel vor und nach 12wöchigem
Abb.46: Körperliches Training kann je nach Intensität zu einem Schutz führen oder die
Bildung von freien Radikalen beschleunigen (modifiziert nach Bloch & Schmidt,
2005). ........................................................................................................... 103
149
Anhang
7.2 Tabellenverzeichnis
Tab.1: Die Sechs Peroxiredoxin(Prx.I- VI) Lokalisation bei Mammaliern (modifiziert
nach Wood et al., 2003).................................................................................. 11
Tab.2: Tabellarische Darstellung des Probandenkollektives. ....................................... 19
Tab.3: Für die immunhistochemische Untersuchung (IHC) verwendete primäre
Antikörper mit Verdünnung. ............................................................................ 29
Tab.4: Für die immunhistochemische Untersuchung verwendete sekundäre Antikörper
....................................................................................................................... 29
Tab.5: Ü bersicht der Herzfrequenz und Leistung (Watt) der TypII-Diabetiker vor und
nach 12-wöchigem Ausdauer- und Krafttraining an der 2mmol/l und 4mmol/l
Laktatschwelle (Mittelwerte und Standardabweichungen). .............................. 37
Tab.6: Ü bersicht der Fasertypverschiebung vor und nach 12-wöchigem Ausdauer-und
Krafttraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). 39
Tab.7: Ü bersicht der Veränderung des Skelettmuskelfaserquerschnitts
vor und nach
12-wöchigem Ausdauer- und Krafttraining bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte
und Standardabweichungen). ......................................................................... 42
Tab.8: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). 44
Tab.9: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei
TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). .......................... 45
Tab.10: Ü bersicht von 8-Isoprostan vor und nach 12wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 46
Tab.11: Ü bersicht von Superoxiddismutase vor dem Training, Vergleich zwischen
Nicht-Diabetikern
und
TypII-Diabetikern
(Mittelwerte
und
Standardabweichungen). ................................................................................ 47
Tab.12:
Ü bersicht
von
Ausdauertraining
Superoxiddismutase
bei
vor
TypII-Diabetikern
150
und
nach
12-wöchigem
(Mittelwerte
und
Anhang
Tab.13: Ü bersicht von Superoxiddismutase vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei
Tab.14: Ü bersicht von Glutathionperoxidase vor dem Training, Vergleich zwischen
Nicht-Diabetikern
und
TypII-Diabetikern
(Mittelwerte
und
Tab.15:
Ü bersicht
von
Ausdauertraining
bei
vor
TypII-Diabetikern
und
nach
12-wöchigem
(Mittelwerte
und
Tab.16: Ü bersicht von Glutathionperoxidase vor und nach 12-wöchigem Krafttraining
bei TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). .................... 52
Tab.17: Ü bersicht von Peroxiredoxin1 vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). 54
Tab.18: Ü bersicht von Peroxiredoxin1 vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei
Tab23.: Ü bersicht von Peroxiredoxin3 vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). 60
151
Anhang
Tab.26: Ü bersicht der Peroxiredoxin4 vor dem Training, Vergleich zwischen NichtDiabetikern und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). 63
Tab.30: Ü bersicht von Peroxiredoxin5 vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei
Tab.33: Ü bersicht von Proteinexpression vor und nach 12-wöchigem Trainig bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte undStandardabweichungen). .................................... 70
Tab.35: Ü bersicht von PGC1 vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII-Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................... 73
Tab.36: Ü bersicht von PGC1 vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 74
Tab.37: Ü bersicht von PGC1 vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 75
Tab.38: Ü bersicht von NRF1 vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................... 76
152
Anhang
Tab.39: Ü bersicht von NRF1 vor und nach 12-wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 77
Tab.40: Ü bersicht von NRF1 vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 78
Tab.41: Ü bersicht von TFAM vor dem Training, Vergleich zwischen Nicht-Diabetikern
und TypII Diabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................... 79
Tab.42: Ü bersicht von TFAM vor und nach 12wöchigem Ausdauertraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 80
Tab.43: Ü bersicht von TFAM vor und nach 12-wöchigem Krafttraining bei TypIIDiabetikern (Mittelwerte und Standardabweichungen). ................................... 81
Tab.44: Ü bersicht aller Untersuchungen mit spezifischer Regulation der SOD und GPx
(↑=Heraufregulierung der Expression, ↓=Herabregulierung der Expression)... 90
Tab.45: Ü bersicht aller Untersuchungen mit spezifischer Regulation der PeroxiredoxinIsoformen 1-6 (↑ = Heraufregulierung der Expression, ↓ = Herabregulierung der
Expression, * = p ≤ 0.05). ............................................................................... 94
Tab.46: Ü bersicht aller Untersuchungen mit Regulation der Mitochondrienbiosynthese
....................................................................................................................... 97
153
Anhang
7.3 Abstract
Type-II diabetes mellitus is associated with systemically increased formation of
ROS with simultaneously decreased antioxidative enzymes and mitochondrial
signal proteins. Consequently, the focus of this study was on muscular changes
or molecular cellular adaptation mechanisms as a result of 12 weeks of physical
activity in the form of endurance or strength training by type-II diabetics. At the
beginning and end of the three-month endurance and strength training a biopsy
was taken from the m. Vastus lateralis of the study participants. Morphological
and histochemical examinations were carried out on the tissue sections. The
isoform shift of the skeletal muscle fibers, muscle fiber cross-sections,
performance increase and heart frequency at lactate 2 and 4 mmol/l as
parameters of performance improvement were examined. Additional decisive
investigations of this study were the molecular cellular adaptation of oxidative
stress (8-isoprostane as marker for oxidative stress), of the antioxidative
enzymes (MnSOD, GPx and Prx 1-6) and the mitochondrial signal proteins
(PGC1α, NRF1 and TFAM) as a result of physical activity in the form of
endurance and strength training. Furthermore, the basal expression of
antioxidative enzymes and mitochondrial signal proteins in non-insulin
dependent type-II diabetics (NIDDM) and adipose non-diabetic men (NDM)
were compared.
Physical performance improved in both training groups. The other
morphological parameters recorded, like muscle fiber shift and fiber crosssection, did not achieve any significant changes across both groups. 8isoprostane as a marker for oxidative stress was significantly reduced among
the type-II diabetics compared to the control group and yet remained
unchanged after the training. There was no difference in the basal comparison
in the case of MnSOD, but GPx was significantly lower among type-II diabetics.
The expression of SOD and GPx increased significantly in both training forms.
Expression of Prx 2 and 6 was significantly increased among type-II diabetics
when controlled. Among type-II diabetics, endurance training produced a
significant increase in Prx 1 and a trend towards higher Prx 4-6; among the
strength group there was only a trend to higher Prx 5 expression. PGC1α and
TFAM decreased significantly before training among the type-II diabetics
154
Anhang
compared to the control group and remained unchanged after training. NRF1
was the same in all groups before training; it was reduced significantly in both
groups through training.
There was no specific group effect when comparing both intervention groups
regarding the isoform shift of the skeletal muscle fibers, the muscle fiber crosssections, improvement in physical performance, increase in expression of
antioxidative enzymes (SOD, GPx) and mitochondrial signal proteins (PGC1α,
NRF1 and TFAM). The only differences in the training groups were the
expression of peroxiredixin isoforms; despite the results being expressed mostly
as trends, the endurance training appears to be an efficient form of exertion.
Moreover, down- or up-regulation of mitochondrial signal proteins was in some
cases significant or in part evident as a trend, which may indicate that physical
activity in muscles can influence regulation of mitochondrial signal proteins.
Consequently, it would be advisable to include several protocols (of different
intensity and duration) in future studies with several post-training samples (at
various times) in an experiment to obtain valid and meaningful results on
adaptation mechanisms as reactions to training. It would also be necessary to
demonstrate in further studies whether Prx and TFAM generally show higher
expression in type-I fibers and whether NRF1 and TFAM are co-regulated
through another alternative transcription factor.
In summary, one may conclude that systematically planned training
interventions with type-II diabetics carried out over 12 weeks (two to three times
a week) with sub-maximum intensity, improve the frequently reduced
performance and unfavorable oxidative stress situation among diabetics
through up-regulation of antioxidative enzymes, such as superoxide dismutase,
glutathione peroxidase as well as the antioxidative peroxiredoxins, above all
also in the mitochondria. Hence physical activity can make a protective
contribution with regard to the origins of the illness and the progression of
diabetic secondary complications.
155
Lebenslauf
Lebenslauf
Persö nliche Daten:
Name: Nana Chung
Geburtsdatum: 04.02.1980
Geburtsort: Seoul/Korea
Schulausbildung:
1986 – 1992: Grundschule „Jam-Shin“ in Seoul
1992 – 1995: Mittelschule „Jam-Shin“ in Seoul
1995 – 1998: Oberschule „Jam-Shin“ in Seoul
Sportwissenschaftliche Hochschulausbildung
1999
–
2003:
Studium
an
der
Frauenuniversität
„Sung-Shin“
in
Seoul
(B.A.:Sportwissenschaft)
WS2003/2004 – WS2006/2007: Studium an der Deutschen Sporthochschule Köln
(Diplom Sportwissenschaften)
seit WS 2007/2008: Promotionsstudium an der Deutschen Sporthochschule Köln
156

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