Cromatografia líquida de alta eficiência

Cromatografia líquida
de alta eficiência
O que é cromatografia líquida?

A
cromatografia
fundamenta-se
na
migração
diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido
a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma
fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase
estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase
estacionária sendo chamada de fase móvel. Na cromatografia
líquida a fase móvel é líquida! (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS;
VIEIRA, 1998).
Principio da cromatografia líquida
AMOSTRA
Coluna
contendo fase
estacionária.
SOLVENTE
Ação da
gravidade!
Tempo
Tipos de cromatografia líquida:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
PLANAR
CCD
COLUNA
HPLC
CP
ADOSRÇÃO
PARTIÇÃO
IÔNICA
CONVENCIONAL
EXCLUSÃO
Primeiro, o que é HPLC?
•HPLC – É uma abreviação do nome em inglês : High Performance (Pressure)
Liquid Cromatography.
•Historia da HPLC:
- Década de 60 : O começo da HPLC como High pressure LC!
- Década de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentação, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Década de 80: A partir dessa década houve um “boom” do HPLC
- 2006- Evolução da técnica: UPLC, RRLC, UFLC...
Vantagens da HPLC

FE é utilizada inúmeras vezes.

Versatilidade: Único requisito é a solubilidade na FM.

Tempo reduzido de análise.

Alta resolução.

Análise qualitativa: tR , espectro de absorção no UV (DAD), MS.

Análise quantitativa: desvios menores do que 5%.

Boa detectabilidade:
Absorção de UV-Vis de comprimento de onda variável 10-10 g;
Fluorescência: 10-12 g;

Automatização
Limitações da HPLC

Alto custo do instrumento

Alto custo de manutenção

Alto custo de operação

Falta de detector universal sensível
Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estável.
Espectrômetro de massas: ~US$ 150.000,00

Necessidade de experiência no seu manuseio
Como é um HPLC comercial?
Reservatórios dos
solventes e
sistema de
degaseificação.
Bomba.
Injetor.
Coluna.
Detector.
Instrumentação para HPLC
Instrumentação para HPLC
Reservatório para a fase móvel
• Filtro do reservatório :
Captar a fase móvel e evitar que partículas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.
•
Filtros de 10 a 40 um
Limpeza periódica!!
Características da fase móvel

Ser de alto grau de pureza ou fácil purificação

Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

Não decompor ou dissolver a fase estacionária

Ter baixa viscosidade

Compatível com o tipo de detector

Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.

Degaseificação da FM:
Garanti a reprodutibilidade da vazão
Estabilidade da linha base.
Métodos de degaseificação
•
Ultrassom:
•
Vácuo + ultrassom: Rápido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.
•
Purga com Hélio:
Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o
pior método quando usado sozinho
Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a
.
aumento de vazamentos, maior custo operacional
•
Degaseificador on-line: Contínuo, remove o ar logo antes de entrar
na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo prazo)
Instrumentação para HPLC
Sistema de bombeamento
“Têm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutível de FM para o
sistema cromatográfico”
REQUISITOS:

Ser de material inerte

Pressões de até 6000 psi (~400 atm)

Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

Vazões de 0,1 a 10 ml/min (aplicações analíticas)

Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %
Sistema de bombeamento
 Tipos de bombas:
 Pneumática
 Deslocamento
 Recíproca
Bomba pneumática

Vantagens:
 Baixo custo
 Livre de pulsações

Desvantagens:
 Baixa pressão (até 2000 psi)
 Baixo volume
 Não permite gradiente
 Vazão depende da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel
Bomba de deslocamento
 Vantagens:
 Vazão independe da pressão de retorno e viscosidade da fase móvel
 Livre de pulsações
 Desvantagens:
 Baixo volume
 Não permite gradiente
Bomba recíproca

Vantagens:
 Pressão elevada (até 10 000 psi)
 Pequeno volume interno (35 a 400 µL)
 Permite gradiente

Desvantagem:
 Fluxo pulsado
 Alto custo
Sistema de bombeamento
 Isocrático :
+ A composição da fase móvel permanece constante ao longo da
análise.
+ Capaz de separa um número limitado de analitos.
 Gradiente
+ A composição da fase móvel varia durante a análise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes
na amostra , é muito diferente.
+ Separação de amostras complexas.
Separação isocrática e por gradiente
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de
solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente
rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição
por gradiente.
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Instrumentação para HPLC
Sistema de Injeção

INJEÇÃO MANUAL
- As amostras são introduzidas com seringas.
- Após virar a alça, a amostra é carregada pela fase móvel até o início
da coluna.
AMOSTRADOR AUTOMÁTICO
- As amostras são postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automático :
1- Mede o volume correto para injeção.
2- Injeta a amostra.
3 – Prepara o injetor para uma próxima amostra

Sistema de Injeção
LOAD
Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo
Bomba
Coluna
Bomba
Coluna
Sobrecarga de Volume da amostra
Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, não se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
𝑉𝑚𝑎𝑥 (µL)=π(raio)2(comprimento)(0,01)
Instrumentação para HPLC
Coluna

Geralmente em aço inox ( mais popular, maior pressão)
+ Coluna de vidro reforçado (até 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polímero ( biocompatível e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preço: > US$ 200.00
 Tipos de colunas
+ Analíticas : diâmetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d ˃ 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.
A escolha de uma coluna apropriada é o ponto crítico para o sucesso
da análise.
Pré-coluna

Localizada entre o injetor e a coluna
 Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.
 Mesma FE da coluna de separação.
 Protege a coluna
 Custo reduzido
Pré-coluna!
Coluna

Fase estacionária.
+ As colunas são “recheadas” com partículas porosas com diâmetro
de 1,8 – 5 μm.
+ Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada
quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da
amostra para separá-los um do outro.
Condicionamento da Coluna
Necessário para que haja um perfeito equilíbrio
da FM e da FE.



Coluna nova: 4- 8 horas
Coluna parada há alguns dias: 2 horas
Coluna de uso diário: 15 minutos.
Lembre-se: a coluna deve ser
guardada em solvente orgânico.
LC com fase quimicamente ligada
Síntese da FE.
Modos de HPLC
HPLC
Adsorção
Partição
Iônica
Exclusão
Tipos de cromatografia líquida:

Adsorção:
O mecanismo de separação: competição entre moléculas da
amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária,
sólido. (Sílica)
Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela
retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.

Partição: (CLL ou CFL)
CLL:
O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase
móvel e na fase estacionária.(sílica purificada)
O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase
estacionária na fase móvel.
CFL: A fase estacionária está imobilizada por meio de ligações
químicas. (Normal ou Reversa)
Fase normal x Fase reversa

Fase normal:
 fase estacionária polar;
 fase móvel apolar (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila);
 solutos neutros;
 polaridade soluto  t. retenção;
 mecanismo retenção: adsorção

Fase reversa:
 fase estacionária apolar;
 fase móvel polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF);
 solutos apolares, não-iônicos;
 polaridade f. móvel  t. retenção;
 mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna.
Fase Normal
Si-OH + R3SiCl
Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
••
OH
Si
Ciano (-C2H4CN)
R=
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (–C3H6NH2)
Polaridade da fase móvel
CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL
Polaridade do soluto:
a > b > c
c
c
b
b
a
a
tempo
•Nos trabalhos pioneiros usou-se
fases altamente polares, como
água
e
trietilenoglicol
adsorvidos sobre sílica ou
alumina e solventes apolares,
como
hexano
ou
éter
isopropílico, eram usados como
fase móvel; por razões históricas,
este tipo de cromatografia é
chamado de fase normal
tempo
•Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluição
Fase reversa
CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Polaridade da fase móvel
Polaridade do soluto: a > b > c
a
b
c
•Na cromatografia de fase reversa, a
fase estacionária é apolar, um
hidrocarboneto por exemplo (C18), e a
fase móvel é relativamente polar
(água, metanol, acetonitrila, etc)
tempo
a
b
c
tempo
•Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior
solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se
o tempo de eluição
Efeito do comprimento da cadeia na
retenção.
Tipos de cromatografia líquida:
 Iônica:
A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo,
-SO-3
trocadores fortes de cátion
-CO-2
trocadores fracos de cátion
-NR+3 trocadores fortes de ânions
-NH2R+ trocadores fracos de ânions
Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode
ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.

Exclusão:
A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
moléculas.
A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho
controlado. Onde, as moléculas menores penetram a maioria dos poros.
Instrumentação para HPLC
Características de um detector
 Sensibilidade e seletividade adequada
 Ampla faixa linear
 Baixo volume interno
 Resposta Rápida
 Boa estabilidade e reprodutibilidade
 Não destruir a amostra
Características de um detector


Baixo volume interno
 O volume do detector é a região do fluxo cromatográfico ao qual o detector
responde.
 Grande volume  alargamento dos picos registrados.
Resposta Rápida
 O sistema de detecção deve idealmente apresentar um sinal que represente
um exato instante de uma porção do caminho (volume do detector).
 Detector lento  picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
Características de um detector

Boa estabilidade e reprodutibilidade
 Alta confiabilidade e facilidade de uso

Não destruir a amostra para:
 Permite coletar o eluato
 Utilizar um segundo tipo de detector
Detector por espectrofotometria UVvisível
Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor
mede a luz que passa através da célula.
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrerá uma
alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
Essa alteração da quantidade de energia é amplificada
sistema de registro de dados.
e dirigida para um
Como resposta, um espectro de UV é obtido, o que pode ajudar na identificação
de alguns compostos.
Detector por espectrofotometria UVvisível
Detector por espectrofotometria
UV-visível
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
Detector por espectrofotometria UVvisível
Princípio de operação
Absorvância de luz na faixa UV-visível
tipo
Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detectável
(g/mL)
10-9
Sensib. a temperatura
Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos que absorvem no  selecionado
Detector por fluorescência
Em comparação com detectores de UV-Vis, os detectores de
fluorescência oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que
permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes
complexas em níveis extremamente baixos.
Os detectores de fluorescência detectam apenas substâncias que
apresentam fluorescência.
Detector por fluorescência
Detector por fluorescência
Princípio de operação
tipo
Min. quanti. detetável (g/mL)
Sensib. a temperatura
Excitação com luz produz emissão
fluorescente
Altamente seletivo
10-9 (excitação a laser: 10-12)
Baixa
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Sim
Aplicabilidade
Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por índice de refração
A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma
maneira de detectá-lo.
O IR é uma medida da capacidade de uma molécula em desviar a luz em
uma fase líquida.
A quantidade de deflexão é proporcional à concentração.
O detector IR é considerado universal porém, pouco sensível e sofre com a
variação da temperatura.
Detector por índice de refração
Detector por índice de refração
Princípio de operação
tipo
Mudança no índice de refração da fase móvel
Universal, depende de propriedade da f.
móvel
Min. quanti. detetável (g/mL)
10-7
Sensib. a temperatura
alta
Sensib. a vazão da f. móvel
Não
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Geral
Detector eletroquímico
Princípio de operação
Oxidação ou redução em potencial fixo
tipo
Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detetável (g/mL)
Sensib. a temperatura
10-12
Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Espécies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade elétrica
Detector por condutividade elétrica
Princípio de operação
tipo
Min. quanti. detetável (g/mL)
Sensib. a temperatura
Condutividade elétrica devida a presença de
íons
Seletivo, depende de propriedades do
composto
10-8
Média
Sensib. a vazão da f. móvel
Sim
Útil com gradientes
Não
Aplicabilidade
Soluções aquosas com compostos iônicos
E aqui termina a aula,
!!!!!
Referências bibliográficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.
Princípios de análise instrumental. 5ª. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.
Introdução a métodos cromatográficos.
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.

POLARIDADE DO SOLUTO
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
LÍQUIDO
insolúvel em água
não-polar
•espécies MM>104: cromatografia
por exclusão
•espécies iônicas de baixa MM:
cromatografia por troca iônica
•espécies não-polares:
cromatografia por adsorção
(isômeros estruturais,
hidrocarbonetos alifáticos)
iônico
polar não-iônico
102
103
massa molecular
•espécies pequenas e polares,
mas não-iônicas: métodos de
partição (série homóloga)
solúvel em água
104
105
106
ADSORÇÃO
PARTIÇÃO
fase
reversa
fase
normal
TROCA
IÔNICA
permeação
em gel
EXCLUSÃO
filtração
em gel
aplicações
Figura 28-1 Skoog p642 vp
HPLC x GC
Comparação entre as características de GC e HPLC
Fator
GC
HPLC
Requisito p/ amostra
volátil e termicamente
estável
solúvel na fase móvel
Tipos de amostra
gases, líquido e sólidos
líquidos e sólidos
Quantidade mínima
detectável
10-12 g (ECD)
10-9 g (UV)
Tempo de análise
minutos até poucas
horas
minutos até muitas
horas
Pratos teóricos por
coluna
2.000-300.000
500-25.000
Capacidade analítica
até 200 componentes
até 50 componentes
Tempo de treinamento
do operador
cerca de 3 meses
pelo menos 6 meses
(a)
(c)
(b)
(d)