+ 2 - Allgemeine Lebensmitteltechnologie
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+ 2 - Allgemeine Lebensmitteltechnologie
Lehrstuhl für Allgemeine Lebensmitteltechnologie Prof. Dr. K.-H. Engel Seminarunterlagen (W. Weiss) A 280 nm 250 nm 220 nm Lebensmittelchemisches Seminar Walter Weiss Wintersemester 2011/12 • Lebensmittelchemische Analytik: Notwendigkeit, Praxisanforderungen, Methoden • Versuchsvor- und Nachbereitung, Probenvorbereitung, Durchschnittsprobe, statistische Auswertung, Fehler • Mineralstoffbestimmung (Veraschung) • Wassergehalts- bzw. Trockenmasse-Bestimmung • Protein- und Aminosäureanalytik • Kohlenhydratanalytik • Fettanalytik (Fettgehalt; Kennzahlen; Fettsäurespektrum) • Enzymatische Analysen • Optische Methoden (UV/Vis-Photometrie) • Schnellmethoden (Teststäbchen, Reflektometrie) • Chromatographische Trenntechniken (DC, GC, HPLC) • Anwendungsbeispiele 2 Lebensmittelchemische Analysen Liefern objektive Kriterien zur Beurteilung eines Lebensmittels, z.B. hinsichtlich seines Genuss- bzw. Nährwerts, der Anwesenheit unerwünschter bzw. gesundheitsschädlicher Inhaltsstoffe, seiner Haltbarkeit/Lagerstabilität etc. Einsatz lebensmittelchemischer Analysen in der 1) amtlichen LM-Überwachung: Schutz der Gesundheit des Verbrauchers sowie Schutz vor Irreführung und Täuschung 2) LM-Produktion: Qualitätskontrolle, Rohstoff- und Endkontrolle, Prozessüberwachung, Anlagenreinigung etc. 3) LM-Forschung und -Entwicklung: Entwicklung neuartiger Produkte oder Herstellungsverfahren Rechtliche Aspekte: • Hersteller sind verpflichtet, ausschließlich sichere Lebensmittel in den Verkehr zu bringen • Verbraucherschutz und LM-Sicherheit liegen an erster Stelle in der Verantwortung des Herstellers (Produkthaftung!) -> umfassende Qualitätskontrollen (Eigenkontrollen) nötig • Hersteller trägt die Beweislast, dass nicht er einen Fehler seines Produktes verursacht hat! Lebensmittelchemische Analytik: • Hauptbestandteile eines Lebensmittels: Proteine, Fette, Kohlenhydrate, Mineralstoffe, Wasser; ggf. Alkohol u.a. • Spezielle Inhaltsstoffe, z.B. Vitamine, Spurenelemente, Coffein, Zusatzstoffe (Konservierungs-, Süß-, Farbstoffe; Antioxidantien), toxische Inhaltsstoffe, Schwermetalle, Allergene • Ausserdem: Verfälschungen; Frische- bzw. Verderbszustand; Lagerstabilität; Erhitzungsverfahren bei Milch etc. Begriffsbestimmung: „Nachweis“ = „vorhanden / nicht vorhanden“ (qualitativ) „Bestimmung“ = „wie viel?“ (quantitativ) 3 Methoden 1) „Klassische“, meist nasschemische Verfahren • meist gravimetrisch/titrimetrisch (Wägung: sehr präzise!) • oft: amtliche Methode (Schieds- oder Referenzmethode) • für „Notfälle“ (z.B. bei Ausfall eines Analysenautomaten) • niedrige Anschaffungs- und Gerätekosten • werden oft zur Kalibrierung von Schnellmethoden eingesetzt Nachteile / Einschränkungen: • meist nur Summenparameter (Fett, Protein etc.) bestimmbar • arbeits- und zeitaufwändig • z.T. hoher Chemikalienverbrauch; Abfallentsorgung (teuer) 2.) Schnellbestimmungsmethoden • z.B. Dichte- oder Volumenmessung; Refraktometrie; Teststäbchen (Dip-Stick); Reflektometrie; DC (halbquantitativ) • schnell, preiswert -> für Routineanalytik • meist zur Prozesskontrolle während der LM-Produktion • ideal zum Nachweis einer Grenzwertüber- oder Unterschreitung oder zur „Vorselektion“ von Analysenproben Nachteil: weniger präzise als Referenzmethoden 3) Instrumentelle (teil- bzw. vollautomatisierte) Verfahren • HPLC, GC, FT-IR, NMR, enzymatische Analysen, ELISA • z.T. simultane Bestimmung mehrerer Parameter (Fett, Zucker, Protein; z.B. mittels Milkoscan oder Winescan) • meist sehr schnell; z.T. auch sehr präzise • Nachteile • hohe Anschaffungs- (Geräte-) Kosten • z.T. häufige Kalibrierung erforderlich • z.T. komplizierte Auswertung 4 Beispiel: Dichtebestimmungsverfahren Pyknometer (Referenzmethode, gravimetrisch) Biegeschwinger (instrumentelle Analytik, vollautomatisiert) Aräometer (Schnellmethode, volumetrisch) 5 Vor- und Nachbereitung quantitativer Messungen • Auswahl der geeigneten Analysenmethode • Probenahme und Probenvorbereitung / -aufbereitung • eigentliche Bestimmung des Analyten • Auswertung Auswahl der Methode: je nach Anforderungsprofil • Routineanalytik (Zeitbedarf!) -> schnell; meist aber weniger exakt • falls hohe Präzision erforderlich -> Referenzmethoden; zur Kalibrierung • hoher Probendurchsatz -> parallele anstelle serieller Analysen • Sensitivität (Nachweisgrenze) und Spezifität • Analysenkosten (pro Analyse; Anschaffungskosten; Verbrauchsmaterial; Kosten für Abfallentsorgung etc. ) • Automatisierbarkeit • ist speziell ausgebildetes Personal erforderlich? • werden spezielle Laboreinrichtungen benötigt? (Abzug, Isotopenlabor) • Sicherheitsaspekte (-> toxische Chemikalien; Unfall- / Brandgefahr) Probenvorbereitung bzw. Probenaufbreitung • repräsentative Probe; Durchschnittsprobe -> zerkleinern, homogenisieren • Beispiele: Käse, Wurst, Milch • nach dem Homogenisieren: luftdicht verpacken (dicht schließendes Schraubdeckelgefäß); vor jeder Probeentnahme durchmischen! • ggf. Abtrennung störender Inhaltsstoffe (z.B. durch Carrez-Klärung) • ggf. Anreicherung bestimmter Inhaltsstoffe (Spurenbestandteile) Auswertung -> Mehrfachbestimmung, Durchschnittswert, Standardabweichung, Präzision und Richtigkeit, „wahrer“ Wert, Fehlererkennung ... 6 Repräsentative Probe / Durchschnittsprobe Käselaib: Segment („Kuchenstück“) homogenisieren Milch Milch: rahmt auf -> vorsichtig mischen (Lufteintrag vermeiden, sonst Dichteänderung!) Wurst; pflanzliche LM: nichtessbare Anteile (Pelle, Schale) entfernen! 7 Bestimmung von Mineralstoffen („Asche“) Hauptsächlich zwei Verfahren angewandt: • Trockene Veraschung • nasse (feuchte) Mineralisierung 1) Trockene Veraschung Asche = „der bei der vollständigen Verbrennung der organischen Substanz verbleibende Rückstand“ (= überwiegend Mineralstoffe; evtl. auch Sand!) Arbeitsweise • Porzellan- oder Platintiegel glühen und wiegen • Probe in den Porzellan- /Platintiegel einwiegen • Verkohlen mit IR-Strahler + Bunsenbrenner • dann Verbrennen der organischen Substanz im Muffelofen bei ca. 520-550°C; Zeitbedarf: 2-3 h • Temperatur: < 550°C, da Alkalihalogenide bei Temperaturen > 550°C flüchtig! (-> Salz-Verluste!) • Nach vollständiger Veraschung: Tiegel im Exsikkator abkühlen lassen und zurückwiegen • Meist: Zusatz von Reaktionsbeschleunigern („Veraschungshilfen“) z.B. H2O2, Mg-Acetat • Magnesiumacetat: - Peroxidbildung -> Sauerstoffüberträger - thermische Zersetzung -> Aufblähen -> Oberflächenvergrößerung -> besserer Luftzutritt -> schnellere Verbrennung der organischen Substanz Nachteil: Mg-Acetat verbrennt nicht rückstandsfrei -> „Blindversuch“ mit Mg-Acetat erforderlich Einschränkung Nicht geeignet zur Bestimmung leicht flüchtiger Metalle (insbesondere für toxische Spurenelemente, z.B. As-, Hg-, Cd-, Pb-Verbindungen), da zu hohe Verluste auftreten - > in diesem Fall: „nasse“ Mineralisierung durchführen 8 2) Nasse (feuchte) Mineralisierung („nasse Veraschung“) Bei der nassen (feuchten) Mineralisierung wird die Analysensubstanz mit flüchtigen Oxidationsmitteln in der Hitze behandelt, bis die gesamte organische Substanz zersetzt ist. Meist in einem Druckaufschlussgefäß oder unter Rückflusskühlung -> Verluste werden weitgehend vermieden Oxidationsmittel: • konz. Schwefelsäure + Salpetersäure • Perchlorsäure (60%) • 65%-ige Salpetersäure (HNO3) • seltener: 50%-iges Wasserstoffperoxid (H2O2) Hauptanwendungsgebiet: • Probenvorbereitung zur Bestimmung leicht flüchtiger (v.a. toxischer) Spurenelemente • Eigentliche quantitative Bestimmung: mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) Rückflussapparatur Zerstäuber Monochromator Detektor Linienstrahler (Hohlkathodenlampe) Prinzip der AAS Druckaufschlussgefäss Flamme ohne Probe Flamme mit salzhaltiger Probe Kontinuierliches, sowie Emissionsund Absorptionsspektrum 9 Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes (Wasser- bzw. Trockenmassebestimmung) • chemische Methoden (Wassergehalt direkt bestimmbar) • physikalische Methoden (nur indirekt, d.h. Trocknungsverlust) Chemische Methoden 1) “Carbid-Methode“ (selten angewandt) CaC2 + 2 H2O -> Ca(OH)2 + C2H2 Messung des Volumens oder Drucks Vorteile: • sehr schnelle und einfache Messung -> „Feldmethode“ bei pflanzlichen Produkten • Anhand der Einwaagemenge des Messgutes und dem angezeigten Druck kann der jeweilige Feuchtigkeitsgehalt direkt auf dem Manometer abgelesen werden Nachteil: Bestimmung ist nicht allzu genau 2) Karl-Fischer-Titration (in der Praxis von großer Bedeutung) SO2 + I2 + 2 H2O <--> H2SO4 + 2HI (Prinzip) Vorteile • sehr spezifisch und empfindlich • automatisierbar • ideal für geringe Wassermengen; Referenzmethode bei LM mit H2OGehalt < 10% (z.B. Mehl) • Kristallwasser wird mit erfasst (z.B. bei Glucose-Monohydrat) Nachteile • relativ langsam (Titration) • hohe Chemikalienkosten, insbesondere bei LM mit hohem Wassergehalt Karl-Fischer-Apparatur 10 Physikalische Wasserbestimmungmethoden (-> Bestimmung des Trocknungsverlustes) 1) Trocknen im Trockenschrank („Seesandmethode“) Prinzip: Es wird die Differenz zwischen dem Probengewicht (Masse) vor und nach dem Trocknen unter Normaldruck und erhöhter Temperatur (meist 103°C) ermittelt Durchführung: Glasstäbchen, an einem Ende abgeplattet Flache Alu-Schale mit Seesand, vorgetrocknet und genau gewogen • Probe homogenisieren und gut zerkleinern • flache Metallschale (Alu) mit Seesand (zwecks Oberflächenvergrößerung) sowie Glasstab mit abgeplattetem Ende bei 103°C vortrocknen und auf ± 1 mg genau wiegen • Probe auf ± 1 mg genau einwiegen und bei 103°C 2-3 h lang bis zur Massenkonstanz trocknen (-> Masse darf nicht mehr abnehmen) • eventuelle Massenzunahme (aufgrund von Fettoxidation) nicht berücksichtigen • Alu-Schale vor dem Zurückwiegen im Exsikkator abkühlen lassen Fehlermöglichkeiten: • Temperatur zu niedrig oder Zeit zu kurz gewählt (-> Wasser nicht vollständig verdampft) -> Kontrollthermometer! • Bildung von Wasser durch chemische Reaktionen (z.B. Maillard-Rkt.) -> ggf. Vakuumtrockenschrank bei ca. 70°C verwenden • Falls Gewichtszunahme während des Wägevorgangs: Hygroskopische Proben absorbieren [g] Feuchtigkeit aus der Luft -> Alu-Schale sofort nach der Entnahme X 101 X aus dem Exsikkator wiegen X -> notfalls Massezunahme gegen die Zeit X auftragen und graphisch oder rechnerisch 100 auf den Zeitpunkt t = 0 extrapolieren 0 Massenzunahme bei hygroskopischen Proben 2 5 t [min] 11 Vorteile • relativ preiswert (Trockenschrank, Waage, Alu-Schalen, Seesand) • „parallele“ Methode (simultane Analyse mehrerer Dutzend Proben) • relativ geringer Arbeitsaufwand • gute Reproduzierbarkeit der Werte -> vielfach als Referenzmethode (amtliche Methode) vorgeschrieben Nachteile • Hoher Zeitaufwand (3-4 h) • Andere flüchtige Stoffe (Alkohole, ätherische Öle) werden mit erfasst • Eigentlich wird nicht der Wassergehalt, sondern der Trocknungsverlust bestimmt -> ggf. Kalibrierung mit einer chemischen Wasserbestimmungsmethode (z.B. nach Karl-Fischer) empfehlenswert • Bei thermolabilen Stoffen (z.B. Honig) zu hohe Werte aufgrund von Zersetzungen bzw. chemischen Reaktionen (z.B. Maillard-Reaktion) • Variante: Vakuumtrockenschrank bei 70°C 2) Infrarot-Trocknung Vorteile • schneller als Trockenschrankmethode (10-30 min) • in Kombination mit integrierter Waage automatisierbar; On-line Messung Nachteile • Probe nur in dünner Schicht einbringen • Kalibrierung durch Referenzmethode (z.B. Trockenschrank-Seesand oder KarlFischer- Methode) erforderlich IR-Trockner Anwendungsgebiete • Schnellmethode, v.a. während der LMProduktion z.B. bei Fleischwaren, Fisch 3) Mikrowellen-Trocknung Vorteil: sehr geringer Zeitbedarf (5-10 min) Nachteile: ähnlich wie IR-Trocknung Mikrowellen-Trockner 12 4) Azeotrope Destillation Prinzip: Das im Lebensmittel enthaltene Wasser wird mit einer hydrophoben Flüssigkeit („Schlepper“), meist Toluol oder Xylol, aus der Analysenprobe abdestilliert. Nach Kondensation in einem graduierten Röhrchen kann das Volumen des abgeschiedenen Wassers abgelesen werden. Nachteil • relativ ungenau, da Volumenmessung kondensiertes Wasser Probe mit „Schlepper“ Skala Vorteil • Einsatz großer Probemengen möglich -> ideal für inhomogene Lebensmittel (z.B. Sauerkraut) oder fettreiche, hochviskose Proben (z.B. Cremes) Rückflusskühler Heizplatte 5) Spezielle Methoden zur Bestimmung eines Wasserzusatzes 5.1 Kryoskopie (Gefrierpunktsbestimmung) Prinzip: Durch Zusatz von Wasser wird der Gefrierpunkt einer Lösung (z.B. Milch) angehoben -> Nachweis / Quantifizierung einer Verwässerung Vorteile • prinzipiell sehr genau; beste Methode bei Milch • automatisierbar (in diesem Fall auch sehr schnell) Nachteil • sehr exakte Temperaturmessung nötig (bei Milch: < 0.01°C um 2% Wasserzusatz festzustellen) Beispiel: • Gefrierpunkt von unverfälschter Milch: - 0,53°C • Gefrierpunkt einer verwässerten Milch: - 0,48°C -> ca. 10% Wasserzusatz Kryoskop; 30 Proben/h 13 5.2 Weitere Methoden zum Nachweis eines Wasserzusatzes • Dichtemessung (Pyknometer, Aräometer, Biegeschwinger) • Refraktometrie (z.B. „Serumrefraktion“ bei Milch) • Prinzip: Dichte bzw. Brechungsindex einer Lösung verändern sich bei Wasserzusatz. Änderung ist (innerhalb gewisser Grenzen) proportional zur zugesetzten Wassermenge • Vorteil: sehr schnelle Messung (Ausnahme: Pyknometer) • Beachte: exakte Temperierung erforderlich, da Volumen (-messung) stark temperaturabhängig! ZUSAMMENFASSUNG: Wasserbestimmung - warum? • Nachweis von Verfälschungen bzw. Verwässerungen (Milch!) • Haltbarkeit eines LMs hängt vom Wassergehalt (exakter: von seiner Wasseraktivität) ab (-> Mikroorganismen; Enzymaktivitäten) • Zur Brennwertberechnung: Kohlenhydratbestimmungen sind meist schwierig -> daher oft: % KH = 100 - (Wasser + Fett + Protein + Asche), sofern keine größeren Mengen anderer Bestandteile im LM vorhanden sind (z.B. Ballaststoffe) 14 Protein- und Aminosäureanalytik • Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut; ihr Stickstoffgehalt schwankt nur innerhalb enger Grenzen (N 15-18%; ø 16%) • andere Stickstoffquellen im LM sind i.a. zu vernachlässigen • Aus diesen Gründen wird der Proteingehalt eines Lebensmittels üblicherweise über dessen Stickstoffgehalt bestimmt • In der Praxis zwei Verfahren: a) nach Kjeldahl b) nach Dumas Verfahren nach Kjeldahl + NaOH H3BO44 HCl Vereinfachte Darstellung! konz. H2SO4 + Kat. + T • Probe wird mit konz. Schwefelsäure in Gegenwart eines Katalysators (meist Kupfersulfat) oxidativ aufgeschlossen. Zusätzlich Zugabe von K2SO4 zur Erhöhung des Siedepunktes (ca. 370°C !) -> Proteinstickstoff wird in Ammoniumsulfat übergeführt: Proteinstickstoff konz. H2SO4 Katalysator, T (NH4)2SO4 • Nach beendetem Aufschluss: Kolben abkühlen (!) lassen. Nach Zugabe von dest. Wasser und NaOH im Überschuss (alkalische Reaktion überprüfen!) wird aus dem Ammoniumsulfat [(NH4)2SO4] Ammoniak (NH3) freigesetzt (die starke Base NaOH verdrängt die schwache Base NH3 aus ihrem Salz) und durch Wasserdampfdestillation in eine säurehaltige Vorlage (meist Borsäure) übergetrieben (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 H2O + 2 NH3 + Na2SO4 15 • NH3 wird durch die Borsäure (schwache Säure) in der Vorlage gebunden: H3BO3 + NH3 (NH4)H2BO3 (vereinfachte Darstellung) • Die Menge des gebundenen Ammoniaks (NH3) wird durch Titration mit 0.1 M Salzsäure (HCl) („Verdrängungstitration“) bestimmt (NH4)H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3 (vereinfachte Darstellung) Kü hle r NaOHÜberschuss H3BO3 KjeldahlKolben Wasserdampf-Destillation • Aus dem HCl-Verbrauch lässt sich der Stickstoffgehalt N der Probe, und aus diesem der Rohproteingehalt P unter Zuhilfenahme eines LM- bzw. proteinspezifischen Faktors F („Kjeldahlfaktor“) (meist 6,25) berechnen: Lebensmittel Milch Fleisch, Fisch, Ei Gelatine Nüsse LM-/proteinspezifischer Faktor F 6,38 6,25 5,55 5,40 P=NxF Beispiel: N-Gehalt (Ei) = 2,0% Proteingehalt = (2,0 x 6,25)% = 12,5% 16 Apparative Ausstattung Kjeldahl - Originalapparatur Konventionelle Apparatur für parallele Analysen Vollautomatische Apparatur für multiple Analysen 17 Hauptvorteile des Kjeldahl-Verfahrens • zuverlässige und robuste Methode; offizielles Referenzverfahren • preisgünstig bei Verwendung der „konventionellen“ Apparatur; kann ohne hohe Investitionskosten in kleineren Labors etabliert werden • sowohl für Serien- als auch für Einzelbestimmungen geeignet • „parallele Methode“ -> simultane Analyse von bis zu 24 Proben • Mikro-, Halbmikro- und Makroverfahren (0,1 - 5 g Probeneinwaage) Nachteile des Kjeldahl-Verfahrens • relativ hoher Chemikalienverbrauch (zusätzlich: Abfallentsorgung -> Kosten!) • umweltschädliche bzw. aggressive Chemikalien • beim Aufschluss werden saure/korrosive Dämpfe freigesetzt! Gesundheitsgefahr! -> spezielle Laborausstattung (Abzug, Absaugung) erforderlich • relativ lange Aufschlusszeit (ca. 120 min) -> Zeitbedarf ca. 3 h (aber: simultaner Aufschluss und Destillation von bis zu 24 Proben möglich) • hoher Arbeits- und Zeitaufwand bei nicht-automatisierten Verfahren So nicht! Fehlermöglichkeiten • unvollständiger Aufschluss (z.B. zu niedrige Temperatur; Schwefelsäure nicht konzentriert genug; ungeeignete Katalysatoren etc.) • N-Verluste beim Aufschluss durch Eindampfen bis zur Trockene (zu geringe Schwefelsäuremenge; Temperatur zu hoch gewählt) • Ammoniakverluste bei der Destillation (Destillationsapparatur undicht; Destillationszeit zu kurz; Ende des Kühlerröhrchens taucht nicht in die säurehaltige Vorlage ein) • pH-Wert der zu destillierenden Flüssigkeit nicht alkalisch -> pH-Wert mit Indikatorpapier überprüfen und ggf. ausreichend NaOH zugeben • methodischer Fehler bei Anwesenheit größerer Mengen anderer stickstoffhaltiger Verbindungen (z.B. Nucleinsäuren) (kommt in der Praxis jedoch kaum vor) • Vortäuschung eines höheren Proteingehaltes in Lebensmitteln durch einen (verbotenen!) Zusatz stickstoffhaltiger Verbindungen, wie z.B. Melamin in Milchpulver (China 2006/08) Melamin (Cyanursäuretriamid) 18 Stickstoffbestimmung nach Dumas Prinzip • Vollständige Oxidation des organischen Materials in der Probe durch Verbrennung in einer Sauerstoff-Atmosphäre bei Temperaturen von 900°C - 1000°C • Die Verbrennungsgase (CO2, H2O, NOx und N2 werden über heisses Kupfer geleitet um Sauerstoff zu entfernen und vorhandene Stickoxide (NOx) in Stickstoff (N2) umzuwandeln • Das resultierende Gasgemisch wird durch eine CO2- / H2O-Falle geleitet • Das verbliebene N2 wird volumetrisch (traditionelle Methode) oder -bei vollautomatischen- Apparaturen mittels eines Wärmeleitfähigkeitsdetektors bestimmt und aus der Stickstoffmenge der Proteingehalt anhand einer Umrechnungsformel ermittelt Apparativer Aufbau (Prinzip) O2 CO2 N2 CuO + Substanz CuO ca. 900°C Cu-Netz N2 O O 2 Cu + 2 NO 2 CuO + N2 50% KOH Vorteile im Vergleich zum Kjeldahl-Verfahren • Extrem kurze Analysenzeit (nur 3-5 min pro Probe) • Keine aggressiven Chemikalien erforderlich • Hoher Automatisierungsgrad • Ideal für Serienanalysen Nachteile • Hohe Investitionskosten; ausserdem hochreine Gase erforderlich • neben Amino- (Protein-) Stickstoff werden auch andere Stickstoffverbindungen (z.B. Nitroverbindungen (R-NO2) erfasst • für Einzelanalysen: Kjeldahl-Verfahren günstiger 19 Automatisierte Stickstoffbestimmung nach Dumas Probe Helium O2 Zufuhr Ofen WasserKondensator Kupfer WLD GC-Säule Detektor CuO CO2Entfernung 20 Spezielle Protein- und Aminosäurebestimmungsverfahren Beispiele: • kolorimetrisch-photometrische Proteinbestimmungsmethoden (z.B. nach Lowry oder Bradford) • Formoltitration • Hydroxyprolinbestimmung (Bindegewebe) Farbstoffbindungsmethode nach Bradford Prinzip: In Gegenwart von Proteinen und saurem pH-Wert -> Verschiebung des Absorptionsmaximums von CBB 250 G von 465 nm zu 595 nm (rot-violett) -> photometrische Bestimmung Kalibrierkurve Coomassie Brilliant Blue 250 G Einsatzgebiet: Vor allen in der klinischen Chemie und Biochemie; seltener in der LM-Analytik (früher: Proteingehaltsbestimmung von Milch) Formol-Titration • Zur summarischen Erfassung von freien Aminosäuren, z.B. in Fruchtsaft • Die Formolzahl bezeichnet die Menge an 0.1 M NaOH-Lösung in ml, die zur Neutralisation der H+-Ionen verbraucht wird, die bei der Reaktion von 100 ml Untersuchungsflüssigkeit mit einer wässrigen FormaldehydLösung freigesetzt werden R-CH-COO- + 2 HCHO I NH3 + Aminosäure Formaldehyd R-CH-COO - + H+ I N-(CH2OH)2 Titration mit 0.1 M NaOH 21 Hydroxyprolin-(Bindegewebs-)Bestimmung • Die Aminosäure 4-Hydroxyprolin kommt nur in Bindegewebe vor, und zwar in einem konstanten Anteil von ca. 12.5% • Sie kann somit zur Bestimmung des Bindegewebsanteils (Sehnen, Knorpel, Haut) in Fleischwaren dienen Prinzip • Hydroxyprolin (I) wird durch saure Hydrolyse aus dem Bindegewebseiweiß freigesetzt und durch Chloramin T zu einen Pyrrol (II) oxidiert • Dieses Oxidationsprodukt bildet mit zugesetztem p-Dimethylaminobenzaldehyd (III) ein rotgefärbtes Kondensationsprodukt (IV), dessen Konzentration bei 558 nm photometrisch bestimmt wird. Ox. (I) (II) (III) (IV) Farbreaktion (s.o.) + + 6N HCl Saure ProteinHydrolyse Photometrische Messung Hyp-Konzentration aus der Kalibrierkurve ablesen 22 Kohlenhydrat- / Zuckeranalytik • Gesamt-Kohlenhydratbestimmung: z.B. zur Brennwertberechnung eines Lebensmittels • Oder: Bestimmung einzelner Zucker (Glucose, Fructose etc.) zur Beurteilung der Eignung eines Lebensmittels für Diabetiker • Oft sehr komplexe Zucker- /Kohlenhydratzusammensetzung vieler LM (z.B. Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose, Stärke, Inulin) -> Analytik gestaltet sich demzufolge manchmal als schwierig • Meist einfacher: % KH = 100 - (Protein + Fett + Wasser + Asche) sofern im LM keine nennenswerten Mengen anderer Inhaltsstoffe (z.B. Ballaststoffe) enthalten sind • Zuverlässigste Bestimmungsmethoden: Enzymatik und HPLC Quantitative Zuckerbestimmung durch chemische Summenmethoden (z. B. Methode nach Luff-Schoorl) • Basieren auf dem Reduktionsvermögen verschiedener Zucker gegenüber Cu2+ - Ionen: Die reduzierenden Zucker reagieren mit den Cu2+Ionen und werden dabei oxidiert, während Cu2+ zu Cu+ reduziert wird: 2 Cu2+ Cu2O (blau -> rot) • Anschliessend: Bestimmung des Überschusses an Cu2+ -Ionen durch Zugabe von Kalium-Iodid -> Bildung von schwerlöslichem Kupfer(I)iodid, bei gleichzeitiger Oxidation von Iodid zu Iod, dessen Menge durch Titration mit Natriumthiosulfat-Maßlösung ermittelt wird: 2 Cu2+ + 4 I- 2 CuI + I2 Einschränkungen • exakte Einhaltung der Reaktionsbedingungen, da die Reaktion nicht exakt stöchiometrisch! • Störend wirken: Reduktone, Ascorbinsäure etc. • Saccharose: wirkt nicht reduzierend (s. Abb.) -> erst nach saurer Hydrolyse bestimmbar • 1 g Lactose oder Maltose 0.5 g Glucose -> wichtig für Analytik: Kenntnis der genauen Zuckerzusammensetzung des LMs -> dünnschichtchromatographische Analyse Titration mit Na2S2O3 Glc Frc Sacch Reduktionsvermögen einzelner Zucker 23 Dünnschichtchromatographischer Nachweis einzelner Zucker A V1 V2 A • Ermittlung der Zuckerzusammensetzung eines Lebensmittels • schnelle, einfach durchführbare, preiswerte und zuverlässige Methode • Fleckengröße und -intensität ermöglichen eine halbquantitative Abschätzung der Menge der einzelnen Zucker • oft auch zur „Vorselektion“ von Proben für weitere Analysen eingesetzt Enzymatische Bestimmung einzelner Zucker • UV-photometrische Tests zur Bestimmung von Monosacchariden (z.B. Glucose, Fructose), Disacchariden (Saccharose, Lactose, Maltose) und Polysacchariden (Stärke, Inulin) • Vorteile: hochspezifische Bestimmung einzelner Zuckerarten in Gemischen 24 Analytik von Speisefetten und -ölen 1) Bestimmung des Fettgehaltes (Gesamtfett oder „freies“ Fett) 2) Charakterisierung von Fetten und Ölen: chemische Kennzahlen; Fettsäurezusammensetzung; Frische- oder Verderbszustand etc. 3) Analytik von Fettbegleitstoffen (Sterole; fettlösliche Vitamine etc.) Methoden zur Erfassung der Lipide („Fettbestimmung“) • z.B. zur Nährwertberechnung: Früher galt Fett in LM als wertgebender Bestandteil; heute („Schlankheitskult“) eher als unerwünschter Bestandteil, den es zu minimieren gilt (Light-Produkte) • ausserdem: Isolierung des Fettanteils für weitergehende Analysen, z.B. zur Bestimmung des Milchfettanteils im LM, oder der Menge an essentiellen Fettsäuren (Linol-, Linolensäure) in Lebensmitteln Extraktionsverfahren Gesamtfett = [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett] • ohne Aufschluss: nur Bestimmung des „freien“ Fettes • mit Aufschluss: Bestimmung des Gesamtfettgehalts • kontinuierliche oder diskontinuierliche Extraktionsverfahrten Prinzip: • zerkleinerte, homogenisierte und getrocknete Probe mit einem organischem Lösungsmittel (z.B. Diethylether, Petroleumbenzin, Hexan, Dichlormethan etc.) extrahieren • dann fetthaltige Phase abtrennen, z.B. durch Zentrifugation, Filtration oder (nach Phasentrennung) im Scheidetrichter • Extraktion mehrmals wiederholen • Fettgehalt der org. Phase bestimmen: - Dichtemessung Schnellmethoden - Refraktometrie - gravimetrisch nach Abdampfen des organ. Lösungsmittels und Wiegen des Rückstands (genaueste Methode, aber zeitaufwendig) Fetthaltige Probe Lösungsmittelzugabe Extrakt Fettextraktion Dekantieren 25 Extraktionsverfahren nach Soxhlet Prinzip: • zerkleinerte, wasserfreie Analysenprobe mit organischem Lösungsmittel extrahieren • ca. 15 - 20 Durchläufe (entscheidend für die Effizienz ist nicht die Extraktionszeit, sondern die Anzahl der Durchlaufzyklen!) • Lösungsmittel abdampfen • Kolben mit Fett bei 103°C trocknen • Kolben zurückwiegen (Differenzwägung) Rückflusskühler Kühlwasseraustritt Kühlwassereintritt Hülse DampfIn der Extraktionshülse befindet sich das zu extramit rohr hierende Material. Durch das rechte Rohr (DampfExtrakrohr) steigt aus dem darunter befindlichen Kolben Hebertionsdas Lösungsmittel auf, das im Kühler (oben) konrohr gut densiert und dann in die Extraktionshülse tropft. Dort löst das Lösungsmittel das Fett aus der Probe heraus. Durch weiter zutropfendes Lösungsmittel steigt der Flüssigkeitsspiegel in dem Soxhlet-AufHeizsatz, bis er die Höhe der Biegung des dünnen Heberhaube Rundröhrchens erreicht hat. Auf Grund der dann auftrekolben tenden Saugheberwirkung wird die Flüssigkeit mit dem Fett in den darunter liegenden Kolben mit dem LösungsLösungsmittel überführt. Dieser Vorgang wird ca. mittel 15 - 20 mal wiederholt („erschöpfende“ Extraktion). Soxhlet-Extraktionsapparatur Vorteile der Methode • gute Erfassung der Lipide (in Abhängigkeit vom Extraktionsmittel) • vielfach als Referenzmethode empfohlen bzw. vorgeschrieben • liefert gut reproduzierbare Werte • in Kombination mit einem vorgeschalteten Aufschlussverfahren (z.B. nach Weibull-Stoldt) auch Gesamtfettgehaltsbestimmung möglich Nachteile • Brand-/Explosionsgefahr bei unsachgemäßem Arbeiten! • relativ arbeits- und zeitaufwendig Fehlermöglichkeiten • Falls Analysensubstanz ungenügend vorgetrocknet (nicht wasserfrei): -> evtl. Kohlenhydrate/Salze aus dem LM mit extrahiert -> zu hohe Werte • Nicht erschöpfend extrahiert (-> zu wenige Durchläufe; Temperatur zu niedrig oder Extraktionsmittel mit zu hohem Siedepunkt verwendet) • Kolben nach dem Abdampfen des Lösungsmittels nicht ausreichend lange oder bei zu niedriger Temperatur (< 103°C) getrocknet 26 Aufschlussverfahren zur Bestimmung des Gesamtfetts • Gesamtfett = [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett] • Fett liegt in manchen Lebensmitteln (Milch, Ei) in gebundener Form vor (z.B. von einer Protein- oder Lipoproteinhülle eingeschlossen) • Zur Bestimmung des Gesamtfettgehaltes muss diese Proteinhülle zerstört werden, um das gebundene Fett freizusetzen • anschliessend Fettextraktion, z.B. in einer Soxhlet-Apparatur Aufschluss mit: • Säuren (Salz-, Schwefel- oder Perchlorsäure) -> universell anwendbar (z. B. Verfahren nach Weibull-Stoldt oder Gerber) • Alkali (Ammoniak); v.a. bei Milch (Verfahren nach Röse-Gottlieb) • Enzymen (z. B. Proteasen); selten angewandt; jedoch sehr schonend Verfahren nach Weibull-Stoldt (Referenzmethode) Prinzip • zerkleinerte Probe ca. 20-30 min mit 12-14%-iger Salzsäure kochen • Aufschlusslösung durch ein angefeuchtetes (!) Faltenfilter filtrieren • Faltenfilter säurefrei (!) waschen und > 6 h bei 103°C trocknen • Filter (mit Fett) mit org. Lösungsmittel extrahieren (Soxhlet) • Lösungsmittel abdampfen und Kolben zurückwiegen 103°C Vorteile der Methode • zuverlässig und genau -> oft als Referenzmethode vorgeschrieben • nahezu universell einsetzbar Nachteile • Arbeiten mit aggressiver Salzsäure • sehr arbeits- und zeitaufwendig • Phospho- und Glykolipide (z.B. in Ei) werden z.T. zersetzt -> Verluste 27 Schnellmethode nach Gerber (Acidobutyrometrisches Verfahren) Prinzip • Probe in einem Butyrometer (= Spezialzentrifugenglas) mit Schwefelsäure (ca. 60-90%-ig, je nach Wassergehalt des Lebensmittels) versetzen und mischen, wobei Erwärmung eintritt • Butyrometer im Wasserbad bei 65°C erwärmen; mehrmals kräftig durchschütteln • Die heisse Schwefelsäure setzt die Lipide frei (-> saurer Aufschluß) • Nach Zugabe von Amylalkohol (zur besseren Phasentrennung) sammelt sich das geschmolzene Fett nach dem Zentrifugieren im oberen, graduierten Teil des Butyrometers • Nach Temperieren auf 65°C kann der Fettgehalt (Volumen) meist direkt abgelesen werden (Milch) ggf. Umrechnung auf genormte Einwaage (Käse) Vorteile der Methode • relativ schnell (15-30 min, je nach Lebensmittel) und wenig störanfällig • bis zu 48 Proben können simultan analysiert werden • gut für Serienanalysen geeignet • kostengünstig • für viele Lebensmittel tierischen Ursprungs einsetzbar (v.a. Milch, Milchpulver, Sahne, Rahm, Käse, Wurst) Butyrometer für Milch Butyrometer + Becher für Käse oder Wurst Nachteile • Verwendung stark ätzender H2SO4 • etwas weniger genau als die Verfahren nach Weibull-Stoldt oder Röse-Gottlieb Fehlermöglichkeiten • zu lange bei 65°C temperiert -> evtl. Hydrolyse der Triglyceride • Aufschlusszeit zu kurz -> Fettverlust • falsche Konzentration der H2SO4 (bei Milch 90%-ige H2SO4, bei Wurst und Käse ca. 60%-ige Schwefelsäure verwenden!) • falschen Amylalkohol verwendet Gerber-Zentrifuge für 48 Butyrometer-Röhrchen 28 Fettbestimmung nach Röse-Gottlieb Prinzip: • Der Aufschluß erfolgt mit Ammoniak bei Raumtemperatur • Alle Arbeitsschritte mit Ausnahme des Abdampfens des Lösungsmittels und dem Wiegen erfolgen in einem speziellen, gebogenen Glasgefäß, dem sog. Mojonnierrohr • Zur Vermeidung einer Emulsionsbildung wird Ethanol zugegeben, welches zum besseren Erkennen der Grenzschicht zwischen wässriger und organischer Phase mit Phenolphthalein versetzt wird (-> Rotfärbung der wässrigen Phase) • Das freigesetzte Fett wird anschliessend mit organischen Lösungsmitteln (Dietylether und Petrolether) durch Schütteln extrahiert und die obere Phase in einen getrockneten, gewogenen Kolben dekantiert • Extraktion 2 x wiederholen u. organische Phasen im Kolben sammeln • Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Kolben mit dem isolierten Fett bei 103°C getrocknet und anschließend gewogen (gravimetrische Bestimmung; Differenzwägung) KorkStopfen organische Phase wässrige Phase Abdekantieren der organ. Phase mit dem extrahieren Fett in einen gewogenen Kolben Mojonnierrohr Vorteile der Methode • Genauestes Verfahren zur Gesamtfettbestimmung bei Milch und Milchprodukten (Referenzmethode) Nachteile • für andere Lebensmittel nicht ohne weiteres anwendbar • zeit- und arbeitsaufwendiges Verfahren • Verwendung leichtentzündlicher Lösungsmittel -> Brandgefahr! Fehlermöglichkeiten • Fettverluste beim Schütteln aufgrund undichter Stopfen • versehentlich einen Teil der wässr. Phase in den Kolben dekantiert -> zu hoher „Fettgehalt“ 29 Fettgehaltsbestimmung mittels NIR-Spektrometrie • Instrumentelles Analysenverfahren • Schnelle, einfache, zerstörungsfreie Messung • unkomplizierte Probenaufbereitung • Einsatzbereiche: v.a. während der LM-Produktion u. für Serienanalysen • Aber: Kalibrierung anhand einer Referenzmethode erforderlich! CH2-Schwingungen von Fettsäuren Densitometrische Fettgehaltsbestimmung (Foss-Let Methode) Prinzip: • Probe mit Tetrechlorethen verrühren und filtrieren bzw. zentrifugieren • Bestimmung des spezifischen Gewichtes des Fett-TetrachlorethenGemisches durch einen Schwimmer mit einem Magnetkern, der von einem elektromagnetischen Feld umgeben ist • spezif. Gewicht von Fett: ca. 0.9 g/cm3, Tetrachlorethen: 1.614 g/ cm3 Fettgehaltsbestimmung: Zusammenfassung • Bestimmung des freien Fettes oder des Gesamtfetts • Aufschlussreagenzien zur Fettfreisetzung: Säure oder Alkali (je nach LM) • Fettabtrennung: meist durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln; ggf. auch durch Zentrifugation (-> Methode nach Gerber) • Eigentliche Bestimmung der freigesetzten Fettmenge: - wiegen (Gravimetrie): sehr genau, aber zeitaufwändig - Volumenmessung - Dichtemessung schnell, aber temperaturabhängig -> Fehlerquelle! - Brechungsindex • Konventions- / Schieds- /Referenzmethoden: - sehr genau, jedoch arbeits- und zeitaufwändig, Verfahren nach Weibull-Stoldt (universell einsetzbar) bzw. Röse-Gottlieb (v.a. bei Milch) • Schnellmethoden - Meist weniger genau als Referenzmethoden, jedoch erheblich schneller - v.a. für Serienanalysen während der LM-Produktion. Früher: Methoden nach Gerber (Volumenmessung) oder Foss-Let (Dichtemessung) - Heutzutage: zunehmend Einsatz von auf NIR- oder FT-IR- basierenden Verfahren. Nachteil: häufige Kalibration erforderlich! 30 Charakterisierung von Fetten und Ölen • z.B. Frische- bzw. Verderbszustand (Fettoxidation); Lagerstabilität, Rein- /Unverfälschtheit (Authentizitätsnachweis); technologische Behandlung (Hydrierung; Trans-Fettsäuren); Fettsäurespektrum • Analytik: früher meist mithilfe sog. „Fettkennzahlen“; heute überwiegend mittels GC / HPLC sowie mit spektroskopischen Verfahren Beispiele • Autoxidation -> Peroxidzahl (POZ); Epihydrin- bzw. Malondialdehyd • Hydrolyse von Triglyceriden -> freie Fettsäuren -> Säurezahl • Oxidationsbreitschaft -> POZ nach Wärmebehandlung oder Rancimat • Ungesättigter Charakter von Fetten/Ölen -> Iodzahl • Milchfettanteil am Gesamtfett -> Buttersäurezahl oder GC-FAME • Essentielle Fettsäuren (Linol-/Linolensäure) -> Enzymatik oder GC Frische- bzw. Verderbszustand eines Fettes; Lagerstabilität Hauptursachen für Fettverderb: • enzymatische Hydrolyse von Triglyceriden (durch Lipaseaktivität) -> Freisetzung von Fettsäuren -> ranziger Geschmack (v.a. bei Buttersäure); Nachweis u.a. mittels Säurezahl (-> Titration mit KOH) • autoxidative Vorgänge: Radikalketten-Reaktion -> Induktionsperiode, danach schneller Anstieg, v.a. bei mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Linol-, Linolensäure). Primärprodukte: Hydroperoxide, welche zu geruchsintensiven Aldehyden und Ketonen weiterreagieren können Nachweis: Peroxidzahl; Epihydrin- / Malondialdehyd; ggf. sensorisch Autoxidation Peroxidzahl • Hydroperoxide sind die bei der Autoxidation von Fetten entstehenden primären Oxidationsprodukte; Bestimmung mittels Peroxid-Zahl (POZ) • POZ ist ein Maß für den peroxidisch gebundenen Sauerstoff in Fetten • Die POZ ermöglicht innerhalb gewisser Grenzen Aussagen über den Verderbszustand bzw. die Lagerfähigkeit eines Fettes / Öls • POZ < 10: Fett genussfähig (Ausnahme: natives Olivenöl POZ < 20) • Achtung: Bei fortgeschrittenem Verderb zerfallen die Hydroperoxide wieder -> POZ kann folglich sinken! 31 Prinzip der Bestimmung der POZ • definierte Menge an Fettprobe in Chloroform / Eisessig lösen • mit Kaliumiodid (KI) versetzen • durch Redoxreaktion mit Hydroperoxiden entsteht freies Iod (I2) (-> Gelb-Braunfärbung) • Bestimmung der Menge des entstandenen I2 durch Titration mit Natriumthiosulfat-Maßlösung (Indikator: Stärke) R1 - CH-R2 + 2 I + 2 H+ I OOH I2 + 2 S2O32- R1 - CH - R2 + H2O + I2 I OH 2 I- + S4O62- Nachweis / Bestimmung von Epihydrin- bzw. Malondialdehyd • Weiterreaktion bzw. Zerfall der Hydroperoxide -> Aldehyde / Ketone • Nachweis einzelner Aldehyde am Ende der Abbaukette (v.a. Epihydrinund Malondialdehyd) erfolgt durch eine Farbreaktionen (je intensiver die Färbung, desto mehr Aldehyd ist vorhanden) oder mittels HPLC +2 Malondialdehyd (ist tautomer zu Epihydrinaldehyd) 2-Thiobarbitursäure farbiges / fluoreszierendes Kondensationsprodukt + + + 32 Oxidationsbereitschaft eines Öls / Fettes • POZ allein erlaubt nur begrenzte Aussagen zur Lagerstabilität eines Öls, da der Gehalt an Radikalfängern (z.B. Tocopherole, Vitamin E) ebenfalls eine wichtige Rolle spielt (diese Radikalfänger hemmen die Autoxidation) • Beschleunigung der Autoxidation nach Verbrauch dieser Antioxidantien -> Messung der Oxidationsbereitschaft nach Lagerung bei erhöhter Temperatur durch Bestimmung der POZ oder mittels Rancimat Bestimmung der Oxidationsstabilität von Fetten/Ölen mittels Rancimat • Durch die Probe bei 50–220 °C (je nach Fett/Öl) eine Luftstrom leiten • Die leichtflüchtigen Oxidationsprodukte (u.a. flüchtige Säuren) werden mit dem Luftstrom in ein Messgefäß mit einer Absorptionslösung überführt und anschließend durch eine Leitfähigkeitsmessung quantifiziert Lufteinlass 120°C 110°C 100°C Reaktionsgefäß Messsonde Messzelle mit Absorptionslösung (Wasser) Öl-/FettProbe 0 5h 15 h Induktionszeit bei ___ 120°C 3h ___ 110°C 6h ___ 100 °C 12 h Heizblock (50-200°C) Rancimat: schematischer Aufbau 10 h Induktionszeiten der Autoxidation in Abhängigkeit von der Temperaturbelastung eines Fettes/Öls Leitfähigkeit Rancimat- Messapparatur Zeit Induktionszeit 33 Iodzahl (IZ) • Die Iodzahl (IZ) charakterisiert den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren (-> ungefähre Anzahl der Doppelbindungen) • Definition: IZ = Menge an Halogen, berechnet als Iod, die von 100 g Fett gebunden wird. Je größer die Anzahl der -C=C-, desto größer die Iodzahl: Reine Ölsäure (1 x -C=C- ) IZ 90; reine Linolsäure (2 x -C=C-) IZ 180; reine Linolensäure (3 x -C=C-) IZ 270 Fette/Öle: Iodzahl zwischen 10 und 180, je nach FS-Zusammensetzung • Die IZ erlaubt Aussagen über Reinheit, Herkunft, Authentizität eines Fettes/Öls • Prinzip der Bestimmung: Elektrophile Addition eines Reagenzes (Br2) an die Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren • Durchführung: - Fett in CHCl3 lösen - Reagenzzugabe (im Überschuss) - nach 1-2 h (im Dunkeln): Freisetzung von I2 aus zugesetztem KI durch das unverbrauchte Reagenz - Rücktitration mit Natriumthiosulfat butter Iodzahlen typischer Fette und Öle Bestimmung essentieller Fettsäuren • Mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit einer cis-cis-1,4-Pentadienstruktur (Linol- und Linolensäure) können vom menschlichen Organismus nicht synthetisiert werden; sie haben Vitamincharakter und müssen daher mit der Nahrung zugeführt werden • Die Bestimmung der essentiellen Fettsäuren kann entweder enzymatisch (summarische Bestimmung) oder gaschromatographisch (GC) nach Umestern der Triglyceride zu Fettsäuremethylestern (FAME) erfolgen Linolsäure (Omega-6-Fettsäure) Linolensäure (Omega-3-Fettsäure) 34 Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren Prinzip der Bestimmung • Die cis-cis-1,4 Dienstruktur (isolierte Doppelbindungen) wird in Gegenwart des Enzyms Lipoxidase (auch als Lipoxygenase bezeichnet) und Luftsauerstoff (O2) zu Dienhydroperoxiden oxidiert (s.u.) • Hierbei bildet sich eine konjugierte Doppelbindung aus, deren charakteristische Absorption bei ca. 234 nm die Messgrundlage bildet • Doppelbindungen in isolierter Stellung weisen hingegen ein Absorptionsmaximum im kurzwelligeren UV-Bereich bei ca. 200 nm auf • Aus Linol-, Linolen- und Arachidonsäure entsteht jeweils nur ein Mol Dienhydroperoxid, d.h. sie werden summarisch erfasst Isolierte Doppelbindung -C=C-CH2-CH2-C=C max 200 nm konjugierte Doppelbindung -C=C-CH2-C=C-CH max 234 nm Durchführung • Da das Enzym Lipoxidase wasserlöslich ist, Fett (Triglycerid) jedoch nicht, muß das Fett zunächst mit alkoholischer KOH verseift werden • Es entstehen wasserlösliche Kalium-Salze der Fettsäuren (= Seifen) • Dann den Versuchsansatz mit HCl neutralisieren und pH-Wert mit einem Puffer auf das Optimum (pH 9) der Lipoxidase einstellen • Messung der Extinktion bei 234 nm (Quarzküvetten verwenden!) • Dann Aufteilen des Versuchsansatzes: zum Hauptversuch aktive Lipoxidase zugeben und einwirken lassen; zum Kontrollversuch („Blindwert“) inaktive (d.h. erhitzte) Lipoxidase geben • Nach 30 min erneute Messung der Extinktion bei 234 nm • Aus der Extinktionsdifferenz (nach und vor Enzymzugabe), abzüglich des Blindwertes den Gehalt an essentiellen Fettsäuren berechnen Gaschromatographische Bestimmung essentieller Fettsäuren Die gaschromatographische Bestimmung von Linol-, Linolen- und Arachidonsäure erfolgt prinzipiell genau so wie bei der Bestimmung der Buttersäure beschrieben (s. dort), nämlich nach Umesterung der Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern (FAME). 35 Bestimmung des Milchfettgehaltes Prinzip: • Buttersäure (CH3H7-COOH) ist eine kurzkettige Fettsäure, die fast ausschließlich in Milchfett vorkommt • Da ihr Gehalt in Milchfett relativ konstant ist (ca. 3.5%), wird sie häufig zur Bestimmung des Milchfettanteils in einer Fettmischung (z.B. in Buttersäure Butterkuchen, Butterkeks, Milchschokolade) herangezogen • Die Bestimmung der Buttersäure erfolgt entweder über die „Buttersäurezahl“ oder gaschromatographisch nach Umesterung zu FAMEs 1) Durch Bestimmung der Buttersäurezahl • Die „Buttersäurezahl“ (BsZ) ist ein Maß für den Gehalt eines Fettes (bzw. einer Fettmischung) an Milchfett • Die BsZ von reinem Milchfett (Butterschmalz) beträgt ca. 20, während alle anderen reinen Fette eine BsZ < 1 aufweisen Durchführung (vereinfachte Darstellung) • Fett (nach Isolierung z.B. mittes Soxhlet-Extraktion) mit alkoholischer KOH verseifen -> Kaliumsalze aller im Fett enthaltenen Fettsäuren • längerkettige Fettsäuren (> 10 C-Atome) durch Zugabe von Kaliumsulfat ausfällen („aussalzen“) und durch abfiltrieren entfernen • kurzkettige, leicht flüchtige Fettsäuren (v.a. Buttersäure) durch Ansäuren aus ihren Salzen freisetzen und durch Wasserdampfdestillation abtrennen • Bestimmung des Buttersäuregehaltes im Destillat durch Titration des Destillates mit 0,01 N NaOH. Blindwert ist erforderlich! Luftkühler Fett + alkohol. KOH Verseifung Heizpilz Filtration Destillation Titration 36 2) Durch GC-FAME (Fettsäurespektrum) • zur Bestimmung des Milchfettanteils in einer Fettmischung • auch: zur Tierartunterscheidung • Herkunfts- bzw. Authentizitätsnachweis von Fetten/Ölen • zur Bestimmung essentieller Fettsäuren in einem Fett oder Öl Prinzip: Fette sind Triglyceride = Ester von Fettsäuren mit dem dreiwertigen Alkohol Glycerol; sie weisen hohe Siedepunkte auf (schwerflüchtig) -> Umestern der Fettsäuren, z.B. mit Natriummethylat -> Methylester der Fettsäuren (= fatty acid methyl ester, FAME) -> niedrigere Siedepunkte als Triglyceride -> leicht flüchtig -> mittels GC analysierbar Triglycerid Fett/Öl Methanol + Katalysator bzw. NaMethylat Glycerol Fettsäuremethylester (FAME) • Bestimmung der FAME nach gaschromatographischer Auftrennung • Quantifizierung: über die Peakhöhen oder die Peakflächen, entweder mit Hilfe eines externen, oder - besser- eines internen Standards Buttersäuremethylester Quantifizierung mittels internem Standard (IS) Fettsäurespektrum von Milchfett (GC-FSME) 37 Enzymatische Analysen Haupteinsatzgebiete von Enzymen in der LM-chemischen Analytik: • Nachweis von Enzymaktivitäten als Indikatorreaktion zur Beurteilung der Beschaffenheit eines Lebensmittels (z.B. ausreichende Erhitzung von pasteurisierter Milch) • Zur quantitativen Bestimmung von Lebensmittelinhaltsstoffen (z.B. Glucose, Lactose) mit Hilfe von Enzymen • Als Indikatoren in Enzym-Immunoassays (ELISA) 1. Enzymaktivitätsbestimmung • Das im Lebensmittel enthaltene Enzym stellt hier den Analyten dar • Bestimmung der Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion durch Ermittlung des Substratumsatzes pro Zeiteinheit • Messung von Enzymaktivitäten: sowohl qualitativer Nachweis als auch quantitative Bestimmung möglich • meist photometrische Messung über ein gefärbtes Reaktionsprodukt • Beispiele: - Kurzzeit- oder Hocherhitzung von Milch (Nachweis der Aktivität der alkalischen Phosphatase bzw. Lactoperoxidase) - ausreichendes Blanchieren von Gemüse (-> Peroxidase-Aktivität) - Eutererkrankungen bei Milch (-> Katalase-Aktivität) - bakterielle Verunreinigungen in Milch (Anwesenheit von Reduktasen) Nachweis einer ausreichenden Kurzzeiterhitzung von Milch • Inaktivierung der alkalischen Phosphatase (71-74°C, 20-40 Sekunden) • Nachweis der Phosphatase-Aktivität mit Lactognost-Reagenz: Alkalische Phosphatase + H2 O - HCl Blaufärbung: Phosphatase stark positiv Grünfärbung: Phosphatase schwach positiv Graufärbung: Phosphatase negativ Farbstoff (blau) 38 Nachweis einer ausreichenden Hocherhitzung von Milch • Nachweis der Peroxidase-Aktivität: z.B. mit Guajak-Reagenz: • aktive Lactoperoxidase spaltet aus Wasserstoffperoxid (H2O2) atomaren Sauerstoff ab und überträgt ihn auf einen Akzeptor (z.B. Guajakol oder p-Phenylendiamin) unter Bildung einer farbigen Verbindung MHD • Lactoperoxidase wird bei Temperaturen > 85°C (10 Sekunden) inaktiviert • Achtung: Bei zu kurzer Erhitzungsdauer kann Peroxidase renaturieren! H2N NH2 p-Phenylendiamin H2N NH2 Guajakol Peroxidase + H2O2 HN = = NH + 2 H2O 2. Bestimmung von Substraten (Lebensmittelinhaltsstoffen) mit Hilfe von Enzymen • Vorreinigung: Flüssige Analysenprobe (Fruchtsaft, Wein, Milch) bzw. wässrigen Extrakt des Lebensmittels klären (z.B. mit Carrez-Reagenz) • Mit geeignetem Enzym, ggf. Co-Enzym, sowie Aktivatoren (z.B. Mg2+) und Puffer (zur Einstellung des optimalen pH-Werts) versetzen und Reaktion ablaufen lassen, bis das Substrat komplett verbraucht ist Messung - in den meisten Fällen eine photometrische Messung (UV/Vis) einer Substanz, deren Konzentration sich im Verlauf der Reaktion proportional zu der des Analyten ändert, z.B. das bei der Reaktion gebildete Produkt, die Abnahme des Edukts, oder das umgesetzte Co-Enzym (meist NAD(P)H) - aber auch andere Messtechniken möglich, z.B. Titrimetrie, falls eine Säure entsteht oder verbraucht wird (v.a. bei Analysenautomaten) 39 Beispiele Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren • photometrische Messung der Extinktionszunahme bei 234 nm Isolierte Doppelbindung max < 200 nm konjugierte Doppelbindung max 234 nm Enzymatische Bestimmung von Lactose in Milch/ -produkten (I) Lactose + H2O ß-Galactosidase Absorption bei 340 nm (II) Galactose + NAD+ GalactoseDehydrogenase Galactose + Glucose Galactonsäure + NADH + H + Vorteile enzymatischer Bestimmungen (I) (II) Extinktionszunahme E (-> NADH) Zeit (min) • hochspezifisch • hohe Sensitivität • gute Reproduzierbarkeit • einfache Probenvorbereitung • unkomplizierte Arbeitsweise • relativ schnell (20-30 min) • teil- bzw. vollautomatisierbar • keine toxischen Chemikalien erforderlich • umweltfreundlich Absorption Nachteile 340 nm • nur auf eine begrenzte Anzahl von Analyten anwendbar • Testkombinationen z.T. teuer • Störungen durch: - Schwermetallionen - oxidierende Substanzen - Gerbstoffe (Polyphenole) - unreine Enzyme Wellenlänge (nm) 40 Optische Verfahren Prinzip / Beispiele: Wechselwirkungen von elektromagnetischer Strahlung und Materie: • Absorption von Strahlung (UV/Vis - Photometrie) • Emission von Strahlung (z.B. Fluoreszenzmessung) • Messung von Streulicht (Nephelometrie, Turbidimetrie) • Brechung von Licht (Refraktometrie) • Drehung der Schwingungsebene polarisierten Lichtes (Polarimetrie) Photometer 0.257 Refraktometer Polarimeter Lichtquelle Polarisator Probenbehälter Analysator Unterscheidung: Spektrometrie und Spektroskopie (vereinfacht): „Spektrometrie“ = meist quantitative Messung (-> Intensität) „Spektroskopie“ = Spektrum aufnehmen (-> Lage der Linien) 41 Kolorimetrie / Photometrie Absorptionsmessung .. „Bouguer-Lambert-Beersches“ Gesetz: E = c d E = Extinktion; = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration der absorbierenden Substanz (meist in mol/l); d = Schichtdicke der Küvette • Schwächung der Strahlungsintensität E mit der Weglänge beim Durchgang durch eine absorbierende Substanz • Schwächung der Strahlungsintensität in Abhängigkeit von der Konzentration der absorbierenden Substanz • Gilt streng genommen nur für monochromatisches Licht und verdünnte, sowie klare (d.h. nicht-trübe) Lösungen (andernfalls Lichtstreuung) Beispiel: E = 1.0 -> 90% des einfallenden Lichtes werden absorbiert (für E = 2.0 -> 99%; für E = 3.0 -> 99.9% Absorption ) Photometrische Messungen 700 nm 10 200 nm 400 nm 2500 nm nm fernes UV nahes UV nahes Infrarot (IR) sichtbarer Bereich (Vis) Kolorimetrie • Konzentrationsbestimmung eines farbigen Stoffes durch Vergleich mit einer Referenzlösung bekannter Konzentration (i.d.R. visuell) • Veränderung der Schichtdicke, bis identische Farbintensitäten • in diesem Fall gilt: c1 x d1 = c2 x d2 • Vorteil: einfach und billig • Nachteil: nur für gefärbte Lösungen; Messung: teilweise subjektiv, v.a. bei unterschiedlichen Farbtönen d1 c2 c1 d2 c1 > c2 Kolorimetrie (Prinzip) 42 UV/Vis-Photometrie Vergleichende Messung von Lichtintensitäten Blende Intensitätseinstellung (Blende) Blende Detektor / Empfänger Signalmessung 0.257 Strahlungs quelle Anzeigeinstrument Probenbehälter (Küvette mit Probe) Monochromator zur Wellenlängeneinstellung Strahlungsquellen • Kontinuumstrahler: strahlen Licht kontinuierlich über einen bestimmten Wellenlängenbereich ab - Wolframfadenlampe (engl. „Tungsten“; Glühbirne); Bereich von 300 1000 nm; jedoch schwache Leistung im UV-Bereich < 340 nm - Deuteriumlampe: 180-360 nm; Einsatz im UV-Bereich 340 nm • Linienstrahler: strahlen nur Licht ganz bestimmter Wellenlängen ab, z.B. Hg-Lampe: 254, 265, 280, 334, 365, 405, 492, 578 nm etc. Werden meist nur in preisgünstigen Filter-Photometern eingesetzt Kontinuierliches Spektrum (Wolframfadenlampe) Linienspektrum (Hg-Lampe) Vorteile von Linienstrahlern gegenüber Kontinuumstrahlern • höhere Lichtintensität • schmale Wellenlängenbereiche, die mit relativ geringem Aufwand erhalten werden können (z.B. mit Interferenzfiltern) -> preisgünstig Nachteile von Linienstrahlern gegenüber Kontinuumstrahlern • es steht nur Licht bestimmter Wellenlängen zur Verfügung, die nicht immer mit der optimalen Absorption der zu messenden Substanz zusammenfallen (z.B. NADH: max = 340 nm; Hg-Lampe: 334 nm / 365 nm) Wichtig: Lampen mindestens 15 min vor der Messung einschalten, da sich die Strahlungsintensität bei Erwärmung verändert! 43 Intensitätseinstellung • verstellbarer Spalt, Kammblende etc. Je nach Spaltbreite oder Stellung der Kämme tritt mehr oder weniger Licht hindurch -> Intensitätseinstellung Herstellung von monochromatischem Licht • Isolierung von Licht einer genau definierten Wellenlänge • Entweder durch Filter (Absorptions- oder Interferenzfilter) Absorptionsfilter: (Gefärbte) Gläser, die nur Licht eines bestimmten, jedoch relativ breiten Wellenlängenbereichs (> 30 nm) durchlassen. Sinnvoll nur in Kombination mit Linienstrahlern (z.B. Hg-Lampe) • Oder durch Monochromatoren (Prisma, Beugungsgitter) -> Zerlegung von weissem Licht in seine Spektralfarben Interferenzfilter Absorptionsfilter Interferenz Prisma Beugungsgitter Spektrale Bandbreite: Ausschnitt des Spektrums, welcher durch die Meßküvette geschickt wird. Je enger die SB, desto besser: Prismen u. Gitter: < 5 nm; Interferenzfilter: 10-20 nm; Absorptionsfilter > 30 nm 44 Probenbehälter (Küvetten) • Küvettenmaterial: Glas, Quarzglas und Kunststoffe • Kriterien: - spektrale Durchlässigkeit (UV/Vis- oder nur Vis-Bereich) - Chemikalien- bzw. Lösungsmittelbeständigkeit - Preis: zwischen 0,05 (Kunststoffküvette) und 200,- (Quarzküvette) - Füllmenge (Mikro-, Halbmikro- und Makroküvetten) - Präzision (Schichtdicke: 10 mm oder 10.00 mm) - Länge des Strahlengangs (10 mm, 20 mm, 50 mm) Lichtdurchlässigkeit (Transmission) in Abhängigkeit von der Wellenlänge • Glasküvetten (optisches Spezialglas; Bezeichnung: „OS“): > 320 nm • Quarzglas („UV“ oder „QS“ = „Quarz-Suprasil“): > 180 nm • Kunststoff (z.B. „PS“ = Polystyrol) meist > 340 nm (je nach Kunststoff) Quarzglas (UV, QS) Transmission in % 100 80 Optisches Spezialglas (OS) Poystyrol (PS) 60 50 40 Spektrale Durchlässigkeit unterschiedlicher Glasund Kunsstoffsorten 20 200 300 400 500 600 nm Chemikalien- bzw. Lösungsmittelbeständigkeit: • Glasküvetten („OS“) +++ (ausser gegen starke Laugen) • Quarzglasküvetten („UV“, „QS“) • Kunststoff („PS“ u.a.): ±, je nach Material; z.B. Polystyrol (PS): - nicht beständig gegen organische Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Dioxan, DMF, Essigsäure (100%), Ethylacetat, Hexan) .... - beständig gegen: Ammoniak, Isopropanol, Natronlauge, Salzsäure 45 Signalmessung - Empfänger / Detektor • Detektor = lichtempfindliches Element, das das optische Signal in ein elektrisches Signal umwandelt. Die Stärke des elektrischen Stroms ist proportional zum einfallenden Licht • Photozelle, Photomultiplier, Photodiodenarray Fotozelle Diodenarray-Detektor (simultane Messung bei vielen Wellenlängen) Anzeige-Einrichtung • Digitalanzeige; Analoganzeige (Zeiger, Schreiber); Computerbildschirm 0.225 UV-/Vis-Spektroskopie • zur„qualitativen“ Analyse, d.h. zur Strukturaufklärung von Molekülen; • heute nur noch selten eingesetzt; v.a. zur Abschätzung der Anzahl konjugierter Doppelbindungen in einem Molekül R R max 220 nm A UV-Absorptionsspektrum von Benzene max 265 nm max 134 * n + 31 [nm] n = Anzahl konjugierter Doppelbindungen 220 240 260 280 nm 46 Photometrie: Quantitative Analyse • Lebensmittel enthalten oft Mischungen unterschiedlicher Substanzen, welche im UV- und/oder /Vis-Bereich Licht absorbieren -> entweder: Vortrennung erforderlich -> oder: spezifische Detektion nach Derivatisierung (-> „Farbreaktion“) Vortrennung • Extraktion (z.B. mittels Scheidetrichter; vgl. Chininbestimmung) oder Wasserdampfdestillation und anschließende photometrische Messung bei der für die Substanz charakteristischen Wellenlänge • Falls nach der Vortrennung ein Gemisch zweier Substanzen vorliegt (z.B. Sorbinsäure und Benzoesäure), die sich in ihren Absorptionsmaxima unterscheiden, ist eine Simultanbestimmung durch Messung bei zwei Wellenlängen möglich (-> Lösung von zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten) • Heutzutage: meist chromatographische Auftrennung (HPLC) und quantitative Bestimmung mittels UV/Vis-Durchflussphotometer Einzelkomponenten 280 220 nm 250nm 250 Wellenlänge 280nm nm 220 Spezifische Farbreaktionen Analyt Spezifische chemische Reaktion („Farbreaktion“) farbige Verbindung Beispiel • Nitrit-Bestimmung (-> Azofarbstoff) linearer Bereich + + + + Kalibrierkurve 47 Remissionsphotometrie • Prinzip: Teststäbchen („Dip-Stick“), basierend auf enzymatischer oder spezifischer chemischer Messmethodik (-> „Farbreaktion“) • Anschließend: Messung des an dem Teststäbchen reflektierten Lichts mit Hilfe eines Remissionsphotometers („Reflektometer“) • Bestimmung der Konzentration bestimmter LM-Inhaltsstoffe anhand der Intensitätsunterschiede zwischen emittiertem und reflektiertem Licht • Vorteile: - (sehr) schnell (15 sek - 5 min); einfache Handhabung - niedrige Analysen- und Anschaffungskosten; umweltfreundlich - Ideal für vor-Ort-Analysen zur schnellen Ermittlung wichtiger Parameter • Genauigkeit: Messfehler i.d.R. < 10 % • Einsatzbereiche: Rohstoffuntersuchung, Prozess- und Produktkontrolle, Einhaltung von Grenzwerten, Überprüfung von Reinigung / Desinfektion, zur Vorselektion von Proben für exakte Analysen etc. Teststäbchen in die zu untersuchende Flüssigkeit eintauchen Das Testfeld mit der Farbskala auf der Dose vergleichen Ireflektiert (< 100%) Io = 100% Photozelle Reaktionszone Kunststoff-Trägerfolie Remissionsmessung (Prinzip) Reflektometer (Merck) 48 Chromatographische Trenntechniken Chromatographie = Verfahren zur Stofftrennung, die auf unterschiedlich starken Wechselwirkungen des Analyten mit einer mobilen Phase und einer stationären Phase beruhen • Mobile Phase: Flüssigkeit oder Gas (-> Flüssig- /GasChromatographie) • Stationäre Phase: - Feststoffe, z.B. Kieselgel (-> Adsorptionschromatographie) - dünner Flüssigkeitsfilm (-> Verteilungschromatographie) • Besitzen die zu analysierenden Komponenten der Probe unterschiedliche Affinität zur mobilen bzw. stationären Phase, so können sie voneinander getrennt werden • Sind die Wechselwirkungen mit der stationären Phase stark, so bewegt sich die Substanz langsam, im umgekehrten Fall schnell • Anschließend müssen die getrennten Substanzen detektiert / visualisiert werden Chromatographische Trennverfahren in der LM-Analytik • Niederdruck-Säulenchromatographie (SC) (selten eingesetzt) • Dünnschicht- bzw. Papierchromatographie (DC bzw. PC) • Gaschromatographie (GC) • Hochleistungs- (bzw. Hochdruck-)Flüssigchromatographie (HPLC) Probengemisch, z.B Farbstoffe Säulenchromatographische Trennung und Isolierung von Pflanzenfarbstoffen M. Tswett 49 Dünnschichtchromatographie (DC) • entweder als Adsorptionschromatographie (stationäre Phase: Kieselgel) • oder als Verteilungschromatographie (stationäre Phase: Cellulose mit dünnem Flüssigkeitsfilm) • Papierchromatographie: Verteilungschromatographie; jedoch auf Chromatographiepapier anstelle von mit Cellulose beschichteten DC-Platten • überwiegend für qualitativen Nachweis / halbquantitative Bestimmung Durchführung • Probenauftragung: möglichst kleiner Startpunkt; ggf. mehrmals kleine Volumina (1-2 l) auftragen und zwischendurch mit dem Fön trocknen • Eigentliche chromatographische Trennung („Entwicklung“): 10-90 min, je nach Fließmittel, stationärer Phase und Länge der Trennstrecke • Nach der Entwicklung: Trocknen mit dem Fön (Abzug!); ggf. bei 100°C • Nachweis (Detektion) der getrennten Substanzen - selten: direkt sichtbar (nur bei farbigen / fluoreszierenden Substanzen) - meistens: Besprühen mit einem Farbreagenz + Erhitzen bei ca. 100°C Deckel DCPlatte Fließmittelfront Fließmittel- Auftragen der Probe Entwicklung Rf-Wert Nachweisreagenzien • universelle Nachweis-Reagenzien (z.B. KMnO4 oder konz. H2SO4) -> (fast) alle Bestandteile des Extrakts detektierbar (selten angewandt) • spezifische (selektive) Nachweisreagenzien -> nur bestimmte Komponenten werden gezielt detektiert (Beispiel: AmmoniummolybdatReagenz zum Nachweis kondensierter Phosphate in Wurst) 50 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) • wesentlich höhere Trennleistung als die DC • deutlich schneller als DC durch Anwendung hoher Drücke (5 - 25 MPa) • ausgezeichnete Quantifizierbarkeit der getrennten Substanzen • vor allem für Verbindungen, die nicht flüchtig sind bzw. die sich nicht unzersetzt verdampfen lassen -> polare Substanzen (Zucker, Aminosäuren, organische Säuren etc.) Aufbau einer HPLC-Anlage Pumpe Probenaufgabevorrichtung Trennsäule Probenaufgabevorrichtung (Probenschleife) Elutionsmittel Rekorder / Computer Detektor SignalVerstärker/Umwandler Elutionsmittelabfall HPLC-Anlage • Säulenfüllung: überwiegend „Umkehrphasen“ (Reversed-Phase) = modifiziertes Kieselgel (z.B. RP-8, RP-18); seltener „Normalphasen“ • Elutionsmittel: meist Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril-Gemische • Trennzeiten: je nach Säulenlänge (10 - 25 cm), Druck (5-25 MPa) und Elutionsmittelzusammenstzung: 2 - 40 min • Detektor: meist UV-/Vis-Durchflussphotometer; seltener RI-Detektor • Quantifizierung: meist mittels Kalibrierkurve über „externen“ Standard“ = Vergleichssubstanz bekannter Konzentration; Quantifizierung über die Peakhöhen oder -flächen. Voraussetzungen hierfür: - identische Trennbedingungen (Elutionsmittelzusammensetzung, Druck, Flussrate, Temperatur, Säulenfüllung etc.) - identische Probenauftragevolumina (Probenschleife, 10 oder 20 l) 51 Gaschromatographie (GC) • Trennverfahren für Stoffgemische, die gasförmig vorliegen, oder die sich unzersetzt verdampfen lassen; v.a. für (unpolare) Substanzen mit niedrigen Siedepunkten, z.B. Kohlenwasserstoffe, kurzkettige Alkohole • Nichtflüchtige, polare Verbindungen (z.B. Zucker, Aminosäuren) lassen sich nach Derivatisierung (z.B. Methylierung, Umesterung, Silylierung) so weit stabilisieren, daß sie ebenfalls analysiert werden können • Extrem hohe Trennleistung, v.a. bei Verwendung von Kapillarsäulen • Detektoren: Flammenionisationsdetektor (FID), Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD), Elektroneneinfangdetektor (ECD), Stickstoff-Phosphordetektor (NPD), oder Massenspektrometer (MS) Aufbau einer GC-Anlage Gepackte Säule (oben) Kapillarsäule (unten) Qualitative Analyse (Identifizierung unbekannter Substanzen) • Vergleich der Retentionszeiten bekannter Substanzen („Standards“) • Zumischung von bekannten Substanzen („Aufstocken“) • Identifizierung mit Hilfe homologer Reihen (z.B. Alkohole) • Identifizierung mit Hilfe unterschiedlicher Detektoren (z.B. FID/ECD) • Identifizierung mit Hilfe anderer Analysenverfahren ( z.B. Massenspektrometrie (MS), NMR- oder IR-Spektroskopie) Quantitive Analyse • Mit externem Standard (= Vergleichssubstanz bekannter Konzentration) Voraussetzung: identische Probenvolumina und Trennbedingungen • Mit internem Standard = zusätzliche Substanz, die in der Probe natürlicherweise nicht vorkommt, und die sich von den Probenkomponenten gut trennen lässt, wird der Analyse und dem Vergleichsstandard zur Normalisierung der Peakflächen zugesetzt. 52