XVII Simpósio de Genética

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XVII Simpósio de Genética
29 a 31 de outubro de 2014
EQUIPE DE EXECUÇÃO:
Comissão Organizadora
Coordenadora: Profª. Drª. Mary Massumi Itoyama
Discentes: Ana Beatriz Bortolozo de Oliveira
Cecília Artico Banho
Dante Bruno Avanso Rosan
Fernando Cesar Silva Junior
Heloisa Trindade Moreira
Janesly Prates
Jéssica Zani Lacerda
Jéssika Viviani Okumura
Kaio Cesar Chaboli Alevi
Luis Lenin Vicente Pereira
Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa
Natalia Maria Candido
Patrícia Pereira do Nascimento
Renan Garcia de Oliveira
Tatiani Seni de Souza Firmino
Examinadores dos trabalhos científicos:
1. Biologia Celular e Molecular
Bruno Moreira Carneiro
Caroline Measso do Bonfim
Danilo Grünig Humberto Da Silva
Lilian Hiromi Tomonari Yamasaki
Maria Etelvina Pinto Fochi
Patricia Simone Leite Vilamaior
Ricardo Alexandre Fochi
Silvana Gisele Pegorin de Campos
2. Genética Animal e Evolução
Bruna Victorasso Jardim
Letícia Do Nascimento Andrade De Almeida Rego
Márcia Maria Urbanin Castanhole
Mariana Oliveira Gomes
Yuri Campanholo Grandinete
3. Genética Humana e Médica
Danilo Grünig Humberto Da Silva
Édis Belini Junior
Gustavo Capatti Cassiano
Paola Jocelan Provazzi Trabulsi
Rodrigo Castro
4. Genética Vegetal
Letícia do Nascimento Andrade de Almeida Rego
Lilian Hiromi Tomonari Yamasaki
Silvana Gisele Pegorin de Campos
PROGRAMAÇÃO CIENTÍFICA
Dia 29/10 (Quarta-feira)
8h
Entrega de materiais
9h
Abertura
9h30
Palestra: Cromatina e Epigenética
Profª. Drª. Maria Luiza Silveira Mello (UNICAMP/Campinas/São Paulo)
10h30
Coffee break
11h
Palestra: Maconha e Canabinóides: Etnobotânica, Potenciais Terapêuticos e Efeitos
Adversos
Prof. Dr. Raphael Guimarães dos Santos (USP/Ribeirão Preto/São Paulo)
12h
Almoço
14h
Roda Viva: Empreendedorismo na Biologia
Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro (UNESP/Jaboticabal/São Paulo)
Entrevistadores:
Renan Garcia de Oliveira (Biólogo – UNESP/São José do Rio Preto/São Paulo)
Prof. Dr. Paulo Cesar Naoum (Academia de Ciência e Tecnologia/São José do Rio
Preto/São Paulo)
Artur Shoiti Santos Takesawa (Consultor do Sebrae)
Paulo Peitl Júnior (Sócio-diretor da DNApta)
Moderador:
Fabiano Ferreira (Apresentador do Talk Show "Gente e Negócios" da TV Cidade)
20h
Coquetel de Abertura
Local: Tiquinho Buffet
Dia 30/10 (Quinta-feira)
9h
Café da manhã
10h
Palestra: Genetics and Epigenetics of Sickle Cell Disease and its Management
Prof. Dr. Samir Ballas (American University of Beirut-Faculty of Medicine/Philadelphia/
Pensilvânia/ EUA)
11h
Palestra: Citotaxonomia e evolução cromossômica vegetal
Prof. Dr. Marcelo dos Santos Guerra Filho (UFPE/Recife/ Pernambuco)
12h
Almoço
14h
Palestra: MicroRNAs e a regulação da embriogênese em sistema haplodiploide
Drª. Camilla Valente Pires (USP/Ribeirão Preto/São Paulo)
15h
Palestra: Vacinas Antitumorais: estratégias atuais para seu desenho e avaliação
Prof. Dr. Alexander Baptista Duharte (Universidad de Ciencias Médicas de Santiago de
Cuba. Centro de Toxicología y Biomedicina. Profesor Visitante do Exterior Facultade
Ciencias Farmacéuticas. UNESP/Araraquara/São Paulo)
16h
Coffee break
16h30
Palestra: Melhoramento genético animal
Prof. Dr. Raphael Bermal Costa (UNESP/Jaboticabal/São Paulo)
Dia 31/10 (Sexta-feira)
8h
Exposição de trabalhos científicos
9h30
Coffee break
10h
Palestra: Avanços em Genômica para Diagnósticos Moleculares no Esporte
Prof. Dr. Rodrigo Gonçalves Dias (USP/São Paulo)
11h
Palestra: TaqmanArrays e PCR Digital
André Camargo (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)
12h
Revelação dos ganhadores dos prêmios e Encerramento
12h30
14h
Almoço
Minicursos:
Pipetas Gilson: como aumentar a vida útil e obter melhores resultados
Me. Eduardo Fontana de Oliveira (Nova Analítica)
Filogeografia
Profª. Drª. Adriana Coletto Morales Corrêa e Castro (UNESP-Jaboticabal)
"Existe realmente um relógio molecular evolutivo?"
Dr. José Salvatore Leister Patané (Instituto Butantan – São Paulo)
Genética do câncer e suas interfaces biológicas
Prof. Dr. Paulo Cesar Naoum (Academia de Ciências e Tecnologia/São José do Rio Preto/
São Paulo)
Didática em genética para o Ensino Fundamental e Médio
Profª. Drª. Joseli Maria Piranha (UNESP/IBILCE/DQCA)
TRABALHOS CIENTÍFICOS
Biologia Celular e Molecular
1. Avaliação do efeito genotóxico e mutagênico de amostras de água da Bacia do Alto
Paraná pelo teste de aberrações cromossômicas, em Allium cepa .......................................
10
2. Diversidade de transposases em amostras de solo com cultivo de cana-de-açúcar e solo
de floresta ...............................................................................................................................
13
3. Análise do perfil citotóxico de derivados semi-sintéticos de curcumina em células de
carcinoma cervical humano HPV positivas .............................................................................
15
4. Alterações morfológicas e imunohistoquímicas no lobodorsolateral da próstata de
gerbilos após exposição prolongada ao BisfenolA e a dieta hiperlipídica ..............................
18
5. Formação do acrossomo durante a espermiogênese de Leptoglossus zonatus
(Heteroptera: Coreidae) ..........................................................................................................
21
6. Efeitos genotóxicos em Oreochromis niloticus após exposição a metais em
concentrações recomendadas pela legislação brasileira e a substância húmica aquática ....
23
7. Proteína anexina A1: um alvo potencial para a terapia angiogênica ..................................
26
8. Co-cultura de fibroblastos associados ao câncer (CAFS) com a linhagem tumoral
mamária triplo negativa e a resposta terapêutica ao uso da melatonina ................................
29
9. Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae), por meio do
gene nuclear D2 ......................................................................................................................
32
10. Perfil de metilação e modificação de histona em carcinoma renal de células claras .......
34
11. Eficácia da melatonina como agente pró-apoptótico e anti-angiogênico no câncer de
mama ......................................................................................................................................
37
12. Mastócitos modulam o microambiente tumoral e favorecem o desenvolvimento de
lesões colorretais quimicamente induzidas .............................................................................
40
13. Avaliação do efeito citotóxico e genotóxico do preparado sólido artificial para refresco
em cebola (Allium cepa) ..........................................................................................................
43
14. Subexpressão de fatores angiogênicos após tratamento com metformina e inibidor
LY294002 em linhagem tumoral mamária canina ...................................................................
46
15. Nanocápsulas biocompatíveis como agentes antitumorais no tratamento do câncer de
mama metastático: estudo in vitro ..........................................................................................
49
16. Ação da melatonina, curcumina e Y27632 sobre a expressão de ROCK-1 na
metastatização do câncer de mama .......................................................................................
52
Genética Animal e Evolução
17. Divergência genética entre touros Tabapuã em rebanhos do Paraná ..............................
56
18. Conjunto cromossômico diploide de Triatoma wygodzinskyi (Hemiptera, Triatominae) ...
59
19. Homogeneidade gamética em diferentes populações de Rhodnius neglectus e
Panstrongylus megistus do Brasil ...........................................................................................
61
20. Medidas não paramétricas da estabilidade genotípica de bovinos da raça Tabapuã
para característica peso aos 240 dias de idade ......................................................................
63
21. Divergência genética entre touros Tabapuã avaliados em rebanhos de Minas Gerais ....
66
22. Espermatogênese em Triatoma rubrofasciata (Hemiptera, Triatominae) .........................
69
23. Relação filogenética do Grupo trispinosus e seus subgrupos (Isoptera, Termitidae,
Termitinae) ..............................................................................................................................
71
24. Perfil hemoglobínico como parâmetro de análise taxonômica e possíveis inferências
sobre a evolução dos Testudinidae brasileiros .......................................................................
73
25. Análise da espermatogênese de Triatoma sordida teratogênicos (Hemiptera,
Triatominae) ............................................................................................................................
76
26. Estrutura populacional de Nasuitermes corniger (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae)
na região Neotropical ..............................................................................................................
78
27. Análises de isoenzimas esterásicas em camarões dulcícolas do gênero Macrobrachium
(Decapoda: Palaemonidae) ....................................................................................................
81
28. Morfometria do edeago e da asa em populações de Drosophila sturtevanti do bioma
Mata Atlântica de Santa Catarina ...........................................................................................
84
29. Identificação de novo, caracterização e anotação dos elementos de transposição no
genoma da broca-do-café (Hypothenemus hampei) ...............................................................
87
30. Reorganização do genoma durante a evolução do grupo pallescens (Hemiptera,
Triatominae) ............................................................................................................................
90
31. Caracterização molecular de Chrysoperla externa (Hagen, 1861) (Neuroptera:
Chrysopidae) por meio de sítios de restrição no gene COI ....................................................
92
Genética Humana e Médica
32. Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg em uma população do Sudoeste do Paraná,
utilizando o gene do tipo sanguíneo (sistema ABO) ...............................................................
96
33. Investigação de associação do polimorfismo no microRNA-499 T>C com o risco de
desenvolvimento de câncer gástrico .......................................................................................
99
34. Efeito da erradicação da Helicobacter pylori na expressão de mediadores inflamatórios
e microRNAs ...........................................................................................................................
102
35. Associação do polimorfismo do microRNA-196a2 com o risco aumentado de câncer
gástrico ....................................................................................................................................
105
36. Associação de fatores genéticos relacionados à angiogênese e vasculatura com a
doença renal policística autossômica dominante ....................................................................
108
37. Proteína Anexina A1: alternativa terapêutica em câncer de colo uterino .........................
110
38. Associação do Complemento do Fator H na Degeneração Macular Relacionada à
Idade .......................................................................................................................................
112
39. Manifestações clínicas em crianças com Doença Falciforme ...........................................
115
40. Polimorfismos nos genes TLR2 e TLR4 associados com risco de câncer colorretal e
influência na expressão gênica e protéica ..............................................................................
118
41. Associação de polimorfismos do receptor TCR com a infecção por Plasmodium vivax
no município de Goianésia do Pará, Estado do Pará .............................................................
121
42. Aumento da expressão da proteína antiinflamatória Anexina-A1 no câncer gástrico .......
124
Genética Vegetal
43. Estimação de parâmetros genéticos de caracteres de desenvolvimento inicial de
progênies de castanha-do-brasil .............................................................................................
128
44. Sequenciamento e análise de genótipos de cana-de-açúcar submetida à prolongada
limitação hídrica ......................................................................................................................
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Biologia Celular e Molecular
(BCM)
__________________________________________________
Iniciação Científica (BCM)
1. Avaliação do efeito genotóxico e mutagênico de amostras de água da Bacia
do Alto Paraná pelo teste de aberrações cromossômicas, em Allium cepa.
1
1
SILVA, I.C.P ; FERREIRA, M.A.M.M.
1
Universidade Federal do Mato Grosso do Sul - UFMS/CPTL
Introdução
O crescimento populacional desordenado vem gerando uma série de
impactos sobre as paisagens dos ecossistemas naturais e que acabam também
direta ou indiretamente afetando a dinâmica dos recursos hídricos.
Grandes quantidades de resíduos provenientes de atividades domésticas,
hospitalares, e principalmente agrícolas e industriais vem sendo despejados
diretamente em ambientes aquáticos. Adicionalmente, a crescente necessidade em
fornecer alimentos e energia gera uma maior devastação pela agricultura e pecuária,
pondo em risco as nascentes e rios (ESPÍNDOLA e BRIGANTE, 2003).
Conhecida como “Cidade das Águas” e grande produtora de papel e celulose,
Três Lagoas, está localizada no estado de Mato Grosso do Sul e que vem se
transformando muito na última década, não apenas com o crescimento populacional,
mas também com a grande expansão industrial.
O aumento significativo da instalação de indústrias no município trouxe muitos
pontos economicamente positivos, mas por outro lado, vem atuando de maneira
negativa em alguns aspectos para o meio ambiente. Entre os novos desafios para a
política ambiental municipal encontra-se a chegada do Grupo Fibria (resultante da
fusão do Grupo Votorantim com a Aracruz Celulose), que atua na produção de papel
e celulose e lida com processos químicos altamente poluentes ao ambiente. Apesar
dos licenciamentos e medidas mitigadoras terem sido aprovadas por órgãos
ambientais responsáveis, é sabido que uma parte de resíduos poluentes continua
sendo emitida no solo, ar e água.
Consequentemente, estudos sobre a citotoxicidade de substâncias e
elementos químicos, se revestem de grande importância, pois permitem determinar
as respostas de um dado organismo à contaminação por estes, bem como avaliar o
impacto e o efeito destes sobre células, tecidos e órgãos (PADRANGI et al., 1995).
Objetivos
Este trabalho teve por objetivo avaliar se amostras das águas superficiais dos
rios que formam a Bacia do Alto Paraná (Três Lagoas, MS), tiveram efeito
genotóxico e mutagênico, pelo teste de aberrações cromossômicas usando células
meristemáticas de Allium cepa L e também através da comparação da frequência de
micronúcleo.
Materiais e Métodos
As amostras de água foram coletadas em rios que formam a Bacia do Alto
Paraná próximo ao município de Três Lagoas, MS, em seis pontos préestabelecidos, onde sabidamente estes rios recebem efluentes desta indústria de
papel e celulose (Fibria).
Para a realização deste estudo foram utilizadas sementes de cebola, sendo
que cerca de 100 sementes foram colocadas para germinar em placas de Petri
cobertas com papel de filtro umedecido com amostras de água dos diferentes pontos
de coleta. Como controle negativo, sementes de cebola foram colocadas para
germinar em água ultra pura. Quando as raízes atingiram 1,5cm de comprimento
foram fixadas em Carnoy 3:1 (etanol: ácido acético) por 12 horas. Como controle
positivo, foram processados ensaios de germinação de sementes de A. cepa em
metil metano-sulfonato (4 x 10-4 M).
10
__________________________________________________
As raízes fixadas foram coradas com reativo de Schiff, como descrito por
MELLO e VIDAL (1978). Na preparação das lâminas, a região meristemática foi
sobreposta por uma lamínula e esmagada delicadamente em orceína acética 2%. As
lamínulas foram retiradas em nitrogênio líquido e as lâminas montadas em Entellan,
para posterior análise.
Resultados e Discussões
A partir das células observadas foram encontrados diferentes tipos de
aberrações cromossômicas, sendo as mais comuns analisadas nos pontos de coleta
foram: metáfases com aderência cromossômica; metáfases poliplóides; C-metáfases
e anáfases com pontes cromossômicas, não sendo encontrados micronúcleos.
Nos pontos P1, P2, P3, P4, P5 e P6 as células meristemáticas de Allium cepa
exibiram uma alta frequência de alterações cromossômicas em comparação ao
controle negativo.
Com base nas análises, concluímos que não ocorreu ação genotóxica, pois
foram encontradas células com anormalidades durante os processos de divisões
celulares e não foram encontrados micronúcleos, portanto, não houve indicativo de
mutagenicidade. Foi observada também, a alta frequência de núcleos interfásicos
em todos os pontos durante as análises o que pode ser indicativo de citotoxicidade
das águas.
Tabela: Número, núcleos interfásicos, fases da mitose normais e células anormais.
Amostra
Pontos
Número de
Núcleos
Fases da mitose
células
Interfásicos
normais
analisadas
normais
FIBRIA
P
M A T
Controle
2000
1978
5
3 - positivo
Ponto 1
2000
1804
83 34 30 14
Células
anormais
14
35
Ponto 2
2000
1862
76 19 8
12
23
Ponto 3
2000
1925
32 18 4
2
19
Ponto 4
2000
1875
28 33 19 14
31
Ponto 5
2000
1921
22 28
5
4
20
Ponto 6
2000
1946
13 11
6
5
19
72 44 32 8
18
Controle
2000
1826
negativo
Abreviaturas: P, Prófase; M, Metáfase; A, Anáfase; T, Telófase.
Conclusão
A partir dos resultados concluiu-se que apesar de Allium cepa, ser um
organismo-teste muito eficiente para estudos de biomonitoramento ambiental, os
prováveis efeitos mutagênicos observados nas amostras não pôde ser comprovado,
sendo necessários novos estudos para a confirmação do potencial mutagênico e
genotóxico dessas águas.
Auxilio Financeiro: UFMS/CPq.
11
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Referências Bibliográficas
ESPÍNDOLA, E. L. G.; BRIGANTE, J. (Eds.) Limnologia fluvial: um estudo no rio Mogi-Guaçu. São
Carlos: Rima, 278 p., 2003.
PADRANGI, R.; PETRAS, M.; RALPH, S.; VRZOC, M. Alkaline single cell (coment): assay and
genotoxicity monitoring using bulhead and carp. Environmental and Molecular Mutagenesis, v. 26,
p. 345-356, 1995.
MELLO, M. L. S.; VIDAL, B. C. A reação de Feulgen. Ciência e Cultura, São Paulo, v.30, p. 665-676,
1978.
12
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Mestrado (BCM)
2. Diversidade de transposases em amostras de solo com cultivo de cana- de açúcar e solo de floresta.
1
1
PINTO, A. S. ; PEDRINHO, E.A.N.¹; VARANI, A.M.
1
Aluna do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agropecuária na Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP - Campus de Jaboticabal
¹Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP - Campus de Jaboticabal
Introdução
Sequências de inserção (IS) são os menores e mais simples elementos
genéticos móveis (EGM) de procariotos. Desempenham um importante papel na
evolução de genomas, atuando como mediadores de eventos de transferência
gênica horizontal (TGL). A enzima transposase é responsável por catalisar seu
movimento e realizar a transposição. Estudos recentes sugerem que a transposase
é o gene mais abundante presente nos bancos de dados públicos de genomas e
metagenomas (AZIZ et al., 2010). A análise da abundância e distribuição
taxonômica das transposases existentes na microbiota do solo pode auxiliar na
compreensão do impacto que os eventos de TGL pode ocasionar nas populações
bacterianas presentes nestes ambientes, assim como auxiliar na classificação de
novas famílias de transposases.
Objetivos
Analisar a diversidade, abundância e distribuição taxonômica de
transposases em amostras de solo com cultivo de cana-de-açúcar e floresta nativa
provenientes de estação climáticas distintas (seca e chuva).
As amostras coletadas de solo com cultivo de cana-de-açúcar foram
denominadas SCW (Sugarcane Wet) e SCD (Sugarcane Dry), e as amostras
coletadas de solo de floresta foram denominadas FW (Forest Wet) e FD (Forest
Dry). As bibliotecas metagenômicas foram construídas utilizando o protocolo “pairedend” (2x100bp) e sequenciadas utilizando a plataforma HiScanSQ Illumina®. As
análises de abundância e distribuição taxonômica foram conduzidas através da
plataforma MG-RAST, utilizando-se o banco de dados RefSeq como referência.
Resultados e Discussão
Foram obtidos um total de 60.606.976 e 79.208.498 reads das amostras
SCW e SCD, respectivamente; enquanto 63.679.540 e 64.384.450 foram obtidos
das amostras FW e FD, respectivamente. Dentre este conjunto de dados, os reads
que codificam para transposases foram prospectados e classificados. Foram
classificados como transposases pertencentes as mais diferentes famílias um total
de 101.981 (0,17%) e 298.036 (0.38%) reads das amostras SCW e SCD,
respectivamente; e 248.645 (0,39%) e 254.320 (0,40%) reads das amostras FW
e FD, respectivamente. Em relação à organização taxonômica destas transposases;
o filo Proteobacteria foi o mais abundante em SCW e SCD, contendo 20.618
(52,6%) e 58.118 (48,9%), respectivamente. O segundo filo mais abundante
presente nas amostras SCW e SCD foi das Actinobacteria com 5.113 (13,1%) e
21.405 (18%), respectivamente. Os gêneros bacterianos mais abundantes em SCW
são os gêneros Azospirillum e Mesorhizobium, com 2.102 (5,37%) e 1.885 (4,81%),
respectivamente; enquanto que em SCD o gênero bacteriano mais abundante foi
Streptomyces pertencente ao filo Actinobacteria, com 6.090 (5,12%) transposases,
seguido do gênero Mesorhizobium, com 5.991 (5,04%) transposases. De acordo
com Pisa et al. (2011), Azospirillum e Mesorhizobium são bactérias Gram-negativas
relacionadas à fixação de nitrogênio e podem desempenhar importante papel no
13
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
crescimento de plantas. Streptomyces são bactérias Gram-positivas filamentosas,
abundante em solos, caracterizadas pela capacidade de suprimir o crescimento de
outros microrganismos através da produção de metabólitos secundários, dessa
forma, possui destaque em estudos de bioprospecção, devido sua variabilidade na
produção de produtos naturais de ampla atividade biológica (HODGSON, 2000;
OSBURNE et al., 2000). Em FW e FD, os filos bacterianos mais abundantes
também foram Proteobacteria com 48.734 (44,6%) e 51.411 (48,9%) transposases,
respectivamente, e Actinobacteria com 31.893 (29,2%) e 23.258 (22,1%),
respectivamente. Em FW e FD, o gênero bacteriano mais abundante foi
Mycobacterium, com 11.885 (10,9%) e 6.592 (6,27%) transposases,
respectivamente. Bactérias do gênero Mycobacterium são Gram-positivas,
encontradas nos mais diversos ambientes, saprófitas de vida livre ou potenciais
patógenos humanos (PONTIROLI et al., 2013).
Conclusão
Estes resultados forneceram um importante conjunto de dados a respeito da
quantidade e diversidade taxonômica de transposases em solos cultivados com
cana-de-açúcar e solo de floresta. Uma segunda etapa de análise será realizada,
utilizando-se estes metagenomas montados (de novo assembly) em associação a
utilização de ferramentas de genômica comparativa, visando à classificação das
famílias destas transposases, assim como anotação e identificação de sequências
de inserção completas e parciais, e estudo do contexto genômico.
Auxílio Financeiro: CNPQ – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico
AZIZ, R.K.; BREITBART, M.; EDWARDS, R.A. Transposases are the most abundant, most ubiquitous
genes in nature. Nucleic Acids Res., v.13, p. 4.207-4.217, 2010.
HODGSON, D.A. Primary metabolism and its control in streptomycetes: a most unusual group of
bacteria. Adv Microb Physiol, v. 42, p.47-238, 2000.
OSBURNE, MS; GROSSMAN, T.H.; AUGUST, T.R.; MACNEIL, I.A. Tapping into microbial
diversity for natural products drug discovery. ASM News, v. 66, p. 411-417, 2000.
PISA, G.; MAGNANI, G.S.; WEBER, H.; SOUZA, E.M.; FAORO, H.; MONTEIRO, R.A.; DAROS, E.;
BAURA, V.; BESPALHOK, J.P.; PEDROSA, F.O.; CRUZ, L.M. Diversity of 16S rRNA genes from
bacteria of sugarcane rizhosphere soil. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 12, p. 1215-1221, 2011.
PONTIROLI, A.; KHERA, T.T.; OAKLEY B.B.; MASON, S.; DOWD, S.E.; TRAVIS, E.R.; ERENSO, G.;
ASEFFA, A.; COURTENAY, O.; WELLINGTON, E.M. Prospecting environmental mycobacteria:
combined molecular approaches reveal unprecedented diversity. PloS One, v. 7, 2013.
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_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
3. Análise do perfil citotóxico de derivados semi-sintéticos de curcumina em
células de carcinoma cervical humano HPV positivas
1
1
1
1
1
OLIVEIRA, A. B. B. ; STUQUI, B. ; POLAQUINI, C. R. ; VANZATO, Y. P. ; REGASINI, L. O. ;
1
1
CALMON, M. F. ; RAHAL, P.
1
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - UNESP/IBILCE
Introdução
Os papilomavírus humanos (HPVs) são vírus de DNA pertencentes à família
Papillomaviridae, com tropismo por tecidos epiteliais, podendo ser divididos em
HPVs de baixo e de alto risco de acordo com o potencial oncogênico (GOLDSTEIN
et al., 2009). Os de alto risco estão associados a diversos tipos de cânceres,
principalmente o cervical e, dentre suas proteínas, a E6 e a E7 são as principais
responsáveis pela transformação celular (BADULESCU, et al., 2010; DOORBAR et
al., 2012; STANLEY, 2012). Entretanto, embora apresentem grande importância
clínica, ainda não há um agente antiviral para os HPVs, de modo que pesquisas com
compostos naturais tem ganhado atenção, focando principalmente em E6 e E7
(YALLAPU, JAGGI, CHAUHAN, 2013; VICI et al., 2014). Nesse contexto, estudos
relatam que a curcumina é uma substância capaz de inibir a expressão dessas
oncoproteínas virais (DIVYA, PILLAI, 2006; MAHER et al., 2011). No entanto,
desvantagens como o rápido metabolismo e a baixa biodisponibilidade tem gerado a
busca por derivados semi-sintéticos de curcumina que superem essas limitações
(PADHYE et al., 2010; VYAS et al., 2013).
Objetivos
Esse estudo teve como objetivo avaliar in vitro a citotoxicidade de cinco
derivados semi-sintéticos de curcumina (AC1, AC2, AC7, AC10 e AC13) em
linhagem celular de carcinoma cervical humano HPV 16 positiva (CasKi).
Células da linhagem CasKi foram incubadas com meio de cultura contendo
derivados semi-sintéticos de curcumina em diferentes concentrações (10, 20, 40 e
80 µM). A curcumina foi utilizada como controle A viabilidade das células incubadas
com cada composto foi analisada por meio de ensaio MTT após 24, 48 e 72 horas
de incubação.
Dentre os cinco derivados semi-sintéticos de curcumina avaliados, AC1 e AC2
demonstraram ser altamente citotóxicos para as células CasKi mesmo na
concentração mais baixa utilizada (Figura 1). Os demais compostos (AC7, AC10 e
AC13) mantiveram a viabilidade celular acima de 80% na concentração de 10 µm
(Figura 1) e, por isso, foram selecionados para próxima etapa do trabalho, onde será
avaliado, por PCR quantitativo, se esses compostos são capazes de inibir a
expressão dos oncogenes E6 e E7.
15
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
Figura 1. Viabilidade de células CasKi após 24, 48 e 72 horas de incubação com a curcumina e com
os derivados semi-sintéticos de curcumina.
Conclusão
Considerando as inúmeras atividades anticâncer da curcumina já descritas
em diversos estudos, a busca por compostos que consigam solucionar as limitações
que esse composto apresenta é uma importante e promissora estratégia a ser
utilizada no desenvolvimento de terapias antivirais.
Auxílio Financeiro: CAPES e FAPESP (Processo nº 2014/04395-2)
BADULESCU, F.; CRISAN, A.; BADULESCU, A.; SCHENKER, M. Recent data about the role of
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16
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
VICI, P.; MARIANI, L.; PIZZUTI, L.; SERGI, D.; DI LAURO, L.; VIZZA, E.; TOMAO, S.; MANCINI, E.;
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17
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
4. Alterações morfológicas e imunohistoquímicas no lobodorsolateral da
próstata de gerbilos após exposição prolongada ao BisfenolA e a dieta
hiperlipídica
1
2
1
FACINA, C.H ; GONÇALVES, B.F ; TABOGA, S.R .
1
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, IBILCE/UNESP, São
José do Rio Preto, SP, Brasil.
2
Instituto de Biociências IBB/UNESP, Botucatu, SP, Brasil.
Introdução
A próstata é uma glândula acessória do sistema genital masculino que
juntamente com a vesícula seminal contribui com a produção de nutrientes para o
fluido seminal e promove a manutenção do gradiente iônico e pH adequado desta
secreção (UNTERGASSER et al., 2005). Pesquisas recentes têm demonstrado que
a exposição a diversas substâncias químicas presentes no meio ambiente, os
chamados desreguladores endócrinos, pode causar alterações morfofisiológicas
permanentes na próstata. Muitos destes desreguladores endócrinos pertencem à
classe dos xenoestrógenos, que são estrógenos sintéticos produzidos pelo homem.
Atualmente é conhecida uma infinidade de xenoestrógenos com ação de
desreguladores endócrino, como, por exemplo, o Bisfenol-A (BPA). O BPA é uma
substância que tem potencial estrogênico, podendo mimetizar os estrógenos
endógenos, se ligando aos receptores de estrógenos e ativando as vias de
sinalização dos mesmos. Outro fator ambiental potencialmente associado com
alterações prostáticas é a dieta rica em lipídeos. Há um consenso entre estudos
correlacionando dietas ricas em gorduras e a patogênese prostática, os quais
asseguram que o consumo de ácidos graxos saturados está relacionado com o
desenvolvimento do câncer prostático (FLESHNER et al., 2004). O consumo de
nutrientes com alta densidade calórica pode resultar em uma síndrome metabólica
com sintomas associados com a resistência à insulina, hiperinsulinemia,
dislipidemia, e certo grau de obesidade. Por conseguinte, é pensado que esta
síndrome metabólica seja um dos principais contribuintes para o desenvolvimento da
diabetes, complicações cardiovasculares, e uma variedade de desordens urológicas,
incluindo a incontinência urinária, disfunção erétil, hiperplasia benigna da próstata, e
câncer prostático (SHANKAR et al., 2012). As causas mais comuns da obesidade
têm sido geralmente atribuídas ao alto teor calórico, dietas ricas em gorduras e a
falta de exercício combinada com uma predisposição genética para a doença. No
entanto, o aumento alarmante da obesidade não pode ser apenas explicado por
esses fatores; um componente ambiental deve estar envolvido (NADAL, 2013).
Objetivo
Avaliar por métodos histopatológicos qualitativos e quantitativos, se a
exposição prolongada ao desregulador endócrino Bisfenol A e a dieta hiperlipídica
promove alterações morfofisiológicas no lobo Dorsolateral prostático de gerbilos
adultos.
Foram utilizados 24 animais (n= 6 por grupo), divididos de maneira aleatória
em 4 grupos: Controle (C), Dieta Hiperlipídica (D), Bisfenol A (BPA) e Dieta
Hiperlipídica + Bisfenol A (D+BPA). Animais do grupo D e D+BPA foram submetidos
a uma dieta hiperlipídica e hipercalórica. Esses animais receberam ração com
elevado teor de lipídios e calorias, contendo 20% de lipídeos saturados. Aos grupos
C e BPA foi oferecida a ração controle. Adicionalmente os grupos BPA e D+BPA
receberam água ad libitum contendo BPA na concentração de 50μg/kg/dia e os
grupos C e D receberam água filtrada ad libitum. Todos os animais foram pesados
18
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
no início e ao final do experimento para o monitoramento do ganho de peso.
Adicionalmente, foi avaliado o consumo semanal médio de ração por animal para
todos os grupos para determinação da ingestão calórica e a ingestão de BPA para
os grupos BPA e D+BPA. O sacrifício dos animais aconteceu 6 meses após o início
do experimento. As metodologias utilizadas envolveram análises do peso corpóreo
dos animais, ingestão calórica semanal, consumo de Bisfenol A e análise dos
depósitos de gordura corporal, incidência e multiplicidade de lesões prostáticas, bem
como análises morfológicas por meio de técnicas citoquímicas (HE, Picrossírius e
Reticulina de Gömöri) e imunohistoquímicas (PCNA, Alfa-actina). Os testes
estatísticos utilizados para averiguação da significância foram o teste de KruskalWallis para dados não paramétricos e o teste ANOVA para dados paramétricos, por
meio do software GraphPad Prism 5.00 (significância com valor de p < 0.05).
A análise dos dados provenientes de animais submetidos a diferentes
tratamentos durante o período de 6 meses mostrou que, a ingestão calórica foi
superior nos grupos submetidos à dieta hiperlipídica. O grupo Intacto e o grupo BPA
permaneceram ingerindo uma quantidade menor de calorias. Consequentemente, o
ganho de peso foi superior no grupo Dieta e BPA+D. Adicionalmente, verificou-se
uma maior deposição de gordura corporal nos animais que receberam a dieta
hiperlipídica. Os resultados encontrados indicam, portanto, que a metodologia
utilizada foi eficaz em gerar alterações metabólicas, as quais comprometem
diretamente a homeostasia prostática. Os animais que receberam Bisfenol A tiveram
um aumento de peso, mas este não foi significativo em relação ao grupo controle.
Foi possível observar uma maior deposição de gordura corporal no grupo BPA
quando comparado ao grupo Controle. O consumo de Bisfenol A na água de beber
foi semelhante entre os grupos BPA e BPA+D, não apresentando diferenças
estatísticas entre os grupos que ingeriram este composto. A análise histológica
permitiu avaliar a incidência, multiplicidade, fenótipo e distribuição das lesões
histopatológicas que acometeram o tecido prostático após 6 meses de tratamento.
Lesões de caráter pré-maligno e maligno foram constatadas no lobo Dorsolateral. No
entanto, os animais submetidos à dieta hiperlipídica, ao Bisfenol A e a associação
entre esses compostos, apresentaram uma maior incidência e multiplicidade de
lesões prostáticas. Quando comparado ao grupo controle, os grupos BPA, BPA+D e
D apresentaram maior número de inflamações subepiteliais, inflamações
intraluminais e inflamações periductais, além de lesões pré-malignas (Neoplasia
Intraepitelial Prostática (PIN)) e malignas (Carcinomas Microinvasivos). Nestes
grupos foi possível notar aumento do volume epitelial seguido de redução luminal.
As células apresentaram diversas atipias, tais como: aumento da área nuclear e
nucléolo bastante evidente. O compartimento estromal dos grupos tratados
apresentou remodelação das fibras de colágeno, além de diversos pontos de
desestruturação da camada de células musculares lisas, favorecendo a invasão
estromal. Quando comparado ao grupo Controle, a atividade proliferativa das células
secretoras prostáticas aumentou nos grupos experimentais. O lobo Dorsolateral do
grupo Dieta apresentou apenas lesões de caráter pré-maligno. Já nos grupos BPA e
BPA+D foi constatado o desenvolvimento de lesões pré-malignas e malignas. A
multiplicidade de lesões evidenciou um aumento significativo no número de lesões
pré-malignas no grupo BPA+D, quando comparado com o grupo controle. Apesar
dos grupos D e BPA não terem apresentado diferenças estatisticamente
significantes em relação ao controle, estes grupos também apresentaram um
incremento no número desta classe de lesões. Ao se tratar das lesões malignas,
estas foram observadas nos grupos BPA e BPA+D.
19
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
Lobo Dorsolateral da próstata de gerbilos adultos, A e B. Epitélio prostático
íntegro. C. Epitélio prostático atípico onde é possível observar a presença de
Neoplasia Intraepitelial Prostática, com invaginação do epitélio para o interior do
lúmen. Além disso, é possível notar uma extensa Inflamação Periductal (IPD).
D. Detalhe da figura C. É possível observar células atípicas com núcleos
aumentados e nucléolos evidentes. E. Ácino com Inflamação Intraluminal (IIL).
F. Epitélio prostático atípico onde é possível observar a presença de Neoplasia
Intraepitelial Prostática G. Epitélio prostático atípico (*). Notar extensa
inflamação subepitelial e a presença de inúmeras células inflamatórias no lúmen
acinar. H. Ácino acometido por Neoplasia Intraepitelial Prostática. Notar
Inflamação Intraluminal. I. Epitélio prostático atípico. J. Extensa Inflamação
Periductal. K. Ácino acometido por Neoplasia Intraepitelial Prostática. L. Ácino
com Neoplasia Intraepitelial Prostática. M. Ácino acometido por Carcinoma
Microinvasivo. Notar o epitélio anômalo e a diminuição da área luminal. N.
Inflamação Intraluminal. Observa-se um grande número de células inflamatórias
no lúmen. O. Carcinoma microinvasivo acometendo um ácino. A-O. HE
Conclusão
A partir dos dados acima conclui-se que, o BPA e a dieta hiperlipídica altera a
morfofisiologia prostática contribuindo para o desenvolvimento de lesões prémalignas e malignas nesta glândula.
Auxílio Financeiro: FAPESP; Capes
FLESHNER N., BAGNELL P.S., KLOTZ L., VENKATESWARAN V. Dietary fat and prostate cancer. J
Urol, v.171, p.19–24, 2004.
NADAL, A. Fat from plastics? Linking bisphenol A exposure and obesity. Rev. Endocrinol., v. 9, p.9–
10, 2013.
SHANKAR E., VYKHOVANETS E.V., VYKHOVANETS O.V., MACLENNAN G.T., SINGH R.,
BHASKARAN N., SHUKLA S., GUPTA S. High-Fat Diet Activates Pro-Inflammatory Response in the
Prostate Through Association of Stat-3 and NF-Kb. The Prostate, v. 72, 233-243, 2012.
UNTERGASSER G., PLAS E., MADERSBACHER S., BERGER. Benign prostatic hyperplasia: agerelated tissue-remodeling. Exp Gerontol. v. 40, p.121-128, 2005.
20
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
5. Formação do acrossomo durante a espermiogênese de Leptoglossus
zonatus (Heteroptera: Coreidae)
SILISTINO-SOUZA, E. R.¹, SILVA JUNIOR, F. C.¹, SILISTINO-SOUZA, R.¹, PEREIRA, L. L. V.¹,
TABOGA, S. R.¹, ITOYAMA, M. M.¹
¹Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - UNESP/IBILCE
Introdução
A subordem Heteroptera é um dos maiores e mais diverso grupo de insetos
(SCHUH; SLATER, 1995), possuindo cerca de 75 famílias (LANZONE; SOUZA,
2006). Dentre estas, a Coreidae, possui atualmente pelo menos 1800 espécies de
ampla distribuição geográfica. Os indivíduos desta família são fitófagos e alguns
causam danos às plantas de valor econômico.
Objetivo
O objetivo deste trabalho foi o de analisar a formação do acrossomo,
envolvendo o complexo de Golgi e o núcleo durante a espermiogênese da espécie
Leptoglossus zonatus, com ênfase aos aspectos ultraestruturais. Apesar de sua
importância, ainda não há estudos de características ultraestruturais nessa espécie,
com isso visamos aumentar o conhecimento sobre o assunto.
Material e Métodos
Machos adultos da espécie Leptoglossus zonatus foram coletados em São
José do Rio Preto, SP. Após dissecção, os testículos foram fixados em solução de
Karnovsky, por 72 horas, em seguida, lavados duas vezes com tampão Milloning e
pós-fixados, por 2 horas, no Tetróxido de Ósmio a 1%. Posteriormente, o material foi
lavado com água bidestilada e desidratado em soluções crescentes de acetona.
Após esse processo, foi dado inicio a pré-infiltração em araldite:acetona (1:1)
overnight, em temperatura ambiente, em seguida o material passou pela infiltração
em araldite, por 2 horas, a 37°C e, logo após, a inclusão em araldite, por 72 horas, a
60°C. Os cortes semifinos (500 nm) e ultrafinos (50 nm) foram obtidos em
ultramicrótomo (Leica). A análise foi realizada em microscópio eletrônico de
transmissão ZEISS-LEO 906 – IBILCE/UNESP, São José do Rio Preto.
Durante a espermiogênese ocorrem vários eventos específicos de
especialização da célula para dar origem aos espermatozóides, dentre os quais
podemos citar a formação do acrossomo. O Acrossomo é uma estrutura importante
e essencial para a fecundação, pois em seu interior há a presença de enzimas
capazes de transpor barreiras naturais do gameta feminino (FAWCETT; ITO, 1965).
O desenvolvimento do acrossomo envolveu o complexo de Golgi e o núcleo,
ambas estruturas se posicionam próximas uma da outra. O complexo de Golgi
iniciou então um processo de liberação de vesículas contendo substâncias, estas
vesículas se fundiram, dando origem ao grânulo pró-acrossomal. No interior deste
grânulo ocorreu a formação de uma região mais eletrodensa localizado em sua
periferia. O grânulo então, migrou em direção ao núcleo até se encostar nele.
Transformações químicas ocorreram e o grânulo se tornou bem eletrodenso e se
posicionou desde a lateral até a região apical do núcleo, recebendo então, o nome
de acrossomo.
Conclusão
Concluímos a partir das análises desta espécie, que o comportamento destas
ultraestruturas assemelha-se ao apresentado pelos indivíduos do grupo Coreidae.
Este trabalho amplia o conhecimento da biologia reprodutiva desta espécie, porém
21
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
outros estudos são necessários para elucidar com detalhes o processo de formação
do acrossomo.
Auxílio Financeiro: FAPESP, CAPES
FAWCETT, D. W.; ITO, S. The fine structure of bat spermatozoa. The American journal of anatomy,
v. 116, p. 567-610, 1965.
LANZONE, C; SOUZA, M. J. Chromosome complement and meiosis in three species of the
Neotropical bug genus Antiteuchus (Heteroptera, Pentatomidae, Discocephalinae). Genet. Mol. Bio.,
v. 29, p. 49-55, 2006.
SCHUH, T. T.; SLATER, J.A. True bugs of the world (Hemiptera: Heteroptera) Classification and
natural history, Cornell UNIVERSITY press, Ithaca, New York, v. 12, 338 p., 1995.
22
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
6. Efeitos genotóxicos em Oreochromis niloticus após exposição a metais em
concentrações recomendadas pela legislação brasileira e a substância húmica
aquática
1
1
1
1
BATALHÃO, I. G.¹; ALMEIDA, E. A. ; MARTINS, F. C. ; BISINOTI, M. C. ; MASCHIO, L. R. ;
CASTIGLIONI, L.²
1
²Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP
Introdução
A poluição dos recursos hídricos por compostos químicos é um grave e
crescente problema que, apesar da existência de legislações específicas com o
intuito de minimizarem os impactos aos ecossistemas, continua a ocorrer de forma
indiscriminada (CLAXTON et al., 1998). No ecossistema aquático, os metais têm
recebido uma atenção considerável, devido à sua toxicidade e acúmulo na biota
(SAJWAN et al, 2008).
A resolução do Conselho Nacional do Meio Ambiente 357/2005 estabelece
concentrações limites para alguns metais presentes no meio ambiente. Porém estes
limites são considerados para os metais isoladamente, e esses raramente ocorrem
de forma isolada no ambiente, estando os organismos aquáticos expostos a
misturas deles. Deste modo, é de suma importância predizer o impacto que os
poluentes causam nos organismos, considerando as interações entre eles.
No entanto, outras substâncias presentes no meio aquático podem interferir
na biodisponibilidade de compostos tóxicos para os organismos aquáticos. Entre
elas, as substâncias húmicas aquáticas (SHA) são importantes para estudos de
toxicologia, uma vez que possuem a capacidade de se complexar com as espécies
metálicas e as tornarem menos tóxicas aos organismos que habitam os
ecossistemas aquáticos (HIROSE, 2007).
Portanto, avaliações genotoxicológicas, como o teste do micronúcleo e das
anormalidades nucleares, nos permitem diagnosticar os efeitos que esses
contaminantes podem causar nos organismos aquáticos, contribuindo com os
estudos de biomonitoramento ambiental e com a definição de leis que visam
proteger esses ecossistemas.
Objetivo
Avaliar o potencial mutagênico e genotóxico, por meio do teste do
micronúcleo e das anormalidades nucleares, que os metais isolados (Fe, Cd, Pb e
Cu) e em mistura, na ausência e na presença de 1,5 mg/L e 5,0 mg/L de SHA,
podem gerar no DNA de eritrócitos de Oreochromis niloticus.
Material biológico
Os organismos-teste usados para a realização da pesquisa foram peixes da
espécie Oreochromis niloticus, conhecidas como tilápias do Nilo. Os espécimes
foram obtidos junto à piscicultura da UNESP, aclimatados por uma semana em
temperatura média de 26°C, para posteriormente serem usados nos experimentos.
Foram realizados três experimentos, sendo que, para o experimento sem
SHA, foram utilizados 30 espécimes, enquanto que para os experimentos com SHA,
por ter um grupo controle com SHA, foram utilizados 35 espécimes, com cerca de 12
cm de comprimento, para evitar diferenças relacionadas ao tamanho e idade dos
peixes.
23
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
Exposição laboratorial a misturas de metais e a metais isolados
Para cada experimento (peixes expostos aos contaminantes nas
concentrações de 0,01mg/L para o cádmio; 0,033mg/L para o chumbo; 0,013 mg/L
para o cobre; 5,0 mg/L para o ferro) foram utilizados 30 aquários de plástico para o
experimento sem SHA e 35 para cada um dos experimentos com SHA, com
capacidade de 20 litros, sendo que cada aquário recebeu apenas um peixe. Cada
grupo experimental foi composto de cinco aquários (N=5). No primeiro experimento
foi avaliado o efeito dos metais na ausência da SHA. O segundo e o terceiro
experimento foram idênticos ao primeiro, exceto pelo fato de que as exposições aos
metais, isolados e em mistura, foram feitas na presença de 1,5 mg/L e 5 mg/L de
SHA extraída e caracterizada do Rio Preto. Um grupo controle contendo SHA foi
também usado para fins comparativos. Os peixes permaneceram por 7 dias
expostos aos tratamentos e, após esse período, os mesmos foram anestesiados
com fenoxietanol (2 ml/L) e o sangue foi retirado para as análises do teste do
micronúcleo. Nenhum alimento foi fornecido aos peixes durante o experimento.
Teste do micronúcleo
Para a realização do teste do micronúcleo (MN), foi realizada uma punção
cardíaca, com seringa heparinizada, para a retirada de cerca de 3cc de sangue de
cada espécime. Para o preparo das lâminas, a primeira gota de sangue da seringa
foi descartada, com o intuito de evitar a contaminação do sangue com o líquido
corporal e muco.
Duas lâminas foram confeccionadas, pela técnica de esfregaço (extensões
sanguíneas), para cada indivíduo. As lâminas foram coradas pela reação de
Feulgen.
Um total de 3.000 eritrócitos (1500 por lâmina), selecionados aleatoriamente,
foram analisados para cada peixe do estudo, sob objetiva de imersão (100x).
Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que não ocorreu
diferença estatisticamente significante para a formação de micronúcleos tanto para o
experimento na ausência de SHA quanto para os experimentos na presença de SHA
em eritrócitos de O. niloticus.
Em relação ao somatório das anormalidades nucleares, obtivemos um
aumento estatisticamente significante em relação ao controle para o experimento na
ausência da SHA, ocorrendo para os animais expostos ao chumbo e à mistura de
metais. Uma diminuição estatisticamente significante ocorreu para o cádmio, em
relação ao controle sem SHA e também para animais expostos ao chumbo e ao
cádmio, em relação ao controle com SHA no experimento na presença de 1,5 mg/L
de SHA. Já no experimento onde os animais foram expostos aos metais na
presença de 5mg/L de SHA, não houve diferenças significantes para nenhum dos
grupos.
As anormalidades nucleares, quando analisadas individualmente, nos
permitiram constatar um aumento estatisticamente significante para alterações do
tipo notched, entre animais do grupo controle e os animais expostos à mistura dos
metais no experimento na ausência de SHA e uma diminuição estatisticamente
significante entre animais expostos ao cádmio em relação ao controle sem SHA e
expostos ao chumbo e ao cádmio em relação ao controle com SHA para o
experimento na presença de 1,5 mg/L de SHA.
No nosso estudo, os valores inalterados das frequências de micronúcleos nos
animais expostos aos metais nos permitem inferir que as concentrações
recomendadas pelo CONAMA para águas de Classe 3, na ausência e na presença
24
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
de SHA, e de acordo com as condições experimentais usadas, não apresentaram
efeitos mutagênicos nos peixes, mas são genotóxicas, uma vez que houve aumento
das anormalidades nucleares para o experimento na ausência de SHA .
Dessa forma, deve-se levar em conta que, após 7 dias de exposição, os
animais puderam ativar mecanismos de defesa e reparo contra as lesões em DNA,
assim como puderam metabolizar os metais a substâncias menos tóxicas ou ainda
bioacumular os metais em seus tecidos, tornando-os menos biodisponíveis aos
organismos para exercerem seus efeitos genotóxicos ao longo do tempo de
exposição.
Conclusão
Os metais, nas condições experimentais testadas, não causaram efeitos
mutagênicos em espécies de O. niloticus após 7 dias de exposição. Por outro lado,
causaram efeitos genotóxicos aos peixes, devido um aumento de anormalidades
nucleares observado no experimento na ausência de SHA.
Nos experimentos realizados, as SHA se complexaram com os metais
diminuindo as anormalidades nucleares encontradas nos peixes, confirmando a sua
capacidade de complexação com espécies metálicas, reduzindo os efeitos tóxicos
causados pelos mesmos.
Auxílio Financeiro: CAPES E FAPESP
CLAXTON L.D.; HOUK V. S.; HUGLES T. J. Genotoxicity of industrial wastes and effluens, Mutation
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HIROSE K., Metal-organic matter interaction: Ecological roles of ligands in oceanic DOM; Applied
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SAJWAN K. S., SENTHILKUMAR, K, PARAMASIVAM, S., COMPTON, S.S., RICHARDSON, J.P.,
Elemental status in sediment and American oyster collected from Savannah marsh/estuarine
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Toxicology, v. 54, p.245-258, 2008.
25
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
7. Proteína anexina A1: um alvo potencial para a terapia angiogênica
1
2
2
1
LACERDA, J.Z. ; DREWES, C.C. ; FARSKY, S.H.P. ; OLIANI, S.M.
¹Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP/IBILCE
2
Universidade de São Paulo – USP
Introdução
A proteína anexina A1 (ANXA1) está envolvida na regulação da inflamação
(GASTARDELO et al., 2009), apoptose (EL KEBIR; JÓZSEF; FILEP, 2008),
crescimento (CÔTÉ et al., 2010) e diferenciação celular (BIZZARRO et al., 2010).
Embora esses efeitos tenham sido explorados em diversas investigações, são raros
os estudos na angiogênese (YI, M.; SCHNITZER, 2009). A formação de novos vasos
sanguíneos apresenta um papel crucial em vários processos fisiológicos como no
desenvolvimento fetal, reparo e regeneração tecidual, cicatrização de feridas,
transplantes e recuperação pós-isquemia (YI, M.; SCHNITZER, 2009). Dessa forma,
a terapia angiogênica, que consiste na manipulação do crescimento vascular, pode
ser benéfica no tratamento de várias doenças, e a descoberta da ação da ANXA1
nesse processo pode resultar em novos procedimentos terapêuticos.
Objetivos
Em função da importância no entendimento da ação reguladora da proteína
ANXA1 na formação de novos vasos, avaliamos, in vivo e in vitro, os efeitos do
peptídeo ANXA12-26 (região N-terminal da ANXA1) sobre a angiogênese na vigência
do fator de crescimento do endotélio vascular do subtipo A (VEGF-A).
Material e Métodos
Nas investigações in vivo avaliamos os efeitos da ANXA1 sobre a cinética de
formação de novos vasos da rede microcirculatória da região dorsal da pele de
camundongos BALB/c machos selvagens (WT) e destituídos do gene para ANXA1
(AnxA1-/-). A câmara dorsal foi implantada nesses animais e, após, ocorreu a
administração tópica de PBS, VEGF (10ng/10µL) e/ou ANXA12-26 (1mg/kg) nos dias
4, 5 e 6. As imagens obtidas antes (dia 4) e após os tratamentos (dia 9) foram
usadas para quantificação dos vasos da rede microcirculatória.Nas investigações in
vitro, células endoteliais de veias umbilicais humanas (linhagem HUVEC) foram
tratadas com PBS, VEGF (10, 25 ou 50 ng/mL) e/ou ANXA12-26(1, 10 ou 30 µM). A
proliferação celular foi avaliada pelo Countess® Automated Cell Counter; a migração
celular e tubulogênese por microscopia de luz e a aderência celular por
espectrofotometria.
O número de vasos recém-formados aumenta nos animais WT tratados com
ANXA12-26 (1 mg/kg) e VEGF (10 ng/10 µL) e nos AnxA1-/-tratados com VEGF (10
ng/10 µL) (Figura 1 A, B e C). Nos resultados in vitro, a proliferação celular aumenta
com o VEGF e/ou tratamento com ANXA12-26 (1 µM) (Figura 1 D). No entanto, a
migração celular aumenta após o tratamento com ANXA1 2-26 (10 µM) e, associado
ao VEGF, nas concentrações de 10 e 30 µM (Figura 1 E). O processo de
tubulogênese aumenta após indução com VEGF e não altera após tratamento com
ANXA12-26 (1, 10 ou 30 µM). Diferentemente, VEGF associado com ANXA1 2-26 (10
µM) intensificam a formação das estruturas tubulares (Figura 1 F). Os ensaios de
aderência celular mostram que o tratamento com VEGF aumenta esse processo nas
células endoteliais ao Matrigel®, enquanto VEGF e ANXA12-26, juntos, inibem a
aderência promovida somente pelo VEGF (Figura 1 G).Assim,nossos dados indicam
que a ANXA1, na angiogênese, participa das seguintes etapas: induz a formação de
26
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
novos vasos, aumenta a proliferação emigração celular e, na presença do VEGF,
acentua o processo de tubulogênese e diminui a aderência nas células endoteliais.
A
C
50
índice do número de vasos
(antes vs depois do tratamento)
Índice do número de vasos
(antes vs depois do tratamento)
B
***
40
30
*
20
10
0
Controle
VEGF
ANXA12-26
D
VEGF +
ANXA12-26
40
*
30
20
10
0
Controle
VEGF
E
200
Controle
150
*
***
50
50
800
Nº de células migradas
Nº células x10
4
100
***
VEGF
ANXA12-26 (1 µM)
VEGF+ANXA12-26
40
30
20
10
**
**
*
600
400
200
0
0
Controle VEGF
24 h
48 h
1
10
72 h
30
1
10
30
ANXA12-26 (M)
VEGF (50 ng/mL)
G
F
150
1.5
#
100
#
*
50
Densidade óptica
Nº de tubos
*
1.0
***
&&&
*
&&&
&&&
1
10
30
0.5
0.0
0
Controle VEGF
1
10
30
1
10
30
ANXA12-26 (µM)
VEGF (50 ng/mL)
Controle VEGF
1
10
30
ANXA12-26 (µM)
VEGF (50 ng/mL)
Figura 1. Efeitos do peptídeo ANXA12-26na angiogênese. [A] Imagens representativas do efeito do
tratamento tópico com o peptídeo ANXA12-26sobre a rede microcirculatória dos camundongos BALB/c
WT. Índice expressa o número de vasos da microcirculação subcutânea dorsal dos camundongos WT
-/[B] e ANXA1 [C] após tratamentos. Os valores expressam a média ± S.E.M. de 5 animais por grupo
(n = 5). * p<0,05 e *** p<0,001 versus controle. Efeitos do peptídeo ANXA12-26sobre a proliferação
celular [D], migração celular [E], tubulogênese [F] e aderência [G] nas células HUVEC.Os resultados
expressam a média ± S.E.M. de células de três ensaios independentes em triplicata. *p<0,05,
**p<0,01, *** p<0,001 versus controle, # p<0,05 versus ANXA12-26 (10 e 30 µM respectivamente), &&&
p<0,001 versus VEGF.
27
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
Conclusão
Nossos dados revelam ações pró-angiogênicas da proteína ANXA1 na
formação de novos vasos, podendo originar novo alvo biológico na intervenção
terapêutica da angiogênese.
Auxílio Financeiro: Processo FAPESP 2013/07487-2; CAPES.
BIZZARRO, V.; FONTANELLA, B.; FRANCESCHELLI, S.; PIROZZI, M.; CHRISTIAN, H.; PARENTE,
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annexin A1-null mice. Proceedings of the National Academy Sciences, v. 106, n. 42, p. 17886-91,
2009.
28
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
8. Co-cultura de fibroblastos associados ao câncer (CAFS) com a linhagem
tumoral mamária triplo negativa e a resposta terapêutica ao uso da melatonina
1,2
1,2
1,2
MASCHIO, L.B. , GELALETI, G.B. , ZUCCARI, D.A.P.C.
1
Departamento de Biologia, Programa de Pós-graduação em Genética/Universidade Estadual
Paulista - UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto (SP).
2
Laboratório de Investigação Molecular do Câncer, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
- FAMERP, São José do Rio Preto (SP).
Introdução
O câncer de mama representa a neoplasia mais comum entre as mulheres
(INCA, 2014). A glândula mamária é formada pelo epitélio ramificado e o
microambiente circundante, composto por diversos tipos celulares, incluindo células
inflamatórias, endoteliais e fibroblastos (LÜHR et al., 2012). A interconexão entre
células epiteliais malignas e o microambiente modulam o comportamento das
células tumorais (PORRETTI et al., 2014). CAFs são uma subpopulação de
fibroblastos ativados, que secretam proteínas da matriz extracelular, fatores de
crescimento e interleucinas, atuando na promoção da angiogênese e proliferação
celular (KALLURI e ZEISBERG, 2006). A melatonina, um hormônio natural, tem sido
associada a diversos mecanismos de ação oncostáticas (JARDIM-PERASSI et al.,
2014), atuando na progressão do câncer controlando a ação dos fibroblastos no
microambiente tumoral (ALVAREZ-GARCÍA et al., 2012).
Objetivos
Avaliar a ação da melatonina no controle da proliferação celular na linhagem
tumoral triplo negativa (MDA-MB-231), CAFs e no sistema de co-cultivo entre essas
células e sua atuação no microambiente tumoral, pela expressão diferencial de
proteínas relacionadas à angiogênese, inflamação e indução da apoptose.
Para o cultivo celular de CAFs, foram coletados fragmentos tumorais
mamários, cultivados pela técnica de explante celular, mantidos em estufa a 37 °C e
5 % CO2. Após atingirem a confluência celular de 90%, as células foram imunomarcadas por imunocitoquímica com os anticorpos anti-vimentina, anti-TGFβ, anti-α
smooth muscle actin (α-SMA) e anti-citoqueratina para caracterização celular. A
linhagem MDA-MB-231 foi cultivada em meio próprio, em estufa a 37 °C e 5 % CO2
até atingirem confluência celular de 90%. As células foram plaqueadas isoladas e
em co-cultivo e realizado o tratamento com melatonina, na concentração de 1 mM,
por 24 e 48 horas para avaliação da viabilidade celular. Posteriormente, foi realizada
a técnica de Antibody array, a fim de avaliar a expressão diferencial de proteínas
relacionadas aos processos de angiogênese, inflamação e apoptose celular após
tratamento com 1 mM de melatonina.
Os marcadores para caracterização celular dos CAFs foram analisados
qualitativamente sendo encontrada marcação expressiva da vimentina, potencial
marcador do citoesqueleto de células mesenquimais como fibroblastos, anti-TGFβ e
anti-α-SMA, marcadores característicos de CAFs (ASTEKAR et al., 2013) e baixa
expressão da citoqueratina (AE1/AE3), marcador de células epiteliais. A melatonina
na concentração farmacológica de 1 mM foi capaz de reduzir significantemente a
viabilidade celular da linhagem MDA-MB-231 e CAFs em 24 e 48 horas (p<0,05), e
na co-cultura em 48 horas (p<0,05). O papel oncostático da melatonina tem sido
comprovado em diversos estudos, sendo que Jardim-Perassi et al. (2014) também
demonstraram redução da viabilidade celular na concentração de 1 mM na linhagem
29
_________________________________________________________
Mestrado (BCM)
MDA-MB-231. Alvarez-Garcia et al. (2012), observaram redução na taxa de
proliferação celular em fibroblastos diferenciados de pré-adipócitos em tratamento
com melatonina. Observamos nesse estudo, que CAFs co-cultivados com a
linhagem MDA-MB-231 apresentaram diminuição na viabilidade celular, porém o
efeito não foi sinérgico comparado ao cultivo celular isolado. Acreditamos que a
modulação dos CAFs no microambiente tumoral, em contato com a linhagem triplo
negativa, ocasione a liberação de fatores de crescimento, atuantes na estimulação
das células epiteliais, tornando-as mais resistentes aos efeitos oncostáticos e antiproliferativos da melatonina. A técnica de Antibody array mostrou que o tratamento
com melatonina foi capaz de alterar a expressão de proteínas atuantes nos
processos de angiogênese, inflamação e apoptose celular. Diversos estudos têm
mostrado que citocinas desempenham papel chave na carcinogênese, atuando
como fatores de crescimento, uma vez que podem ser produzidas por células
tumorais (NICOLINI et al., 2006). O crescimento e progressão tumoral dependem da
angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de um
endotélio vascular preexistente (RYKALA et al. 2011). As proteínas ativas na
angiogênese, leptina e MCP-1, tiveram sua expressão diminuída após o tratamento
com melatonina. Corroborando ao nosso estudo, Jardim-Perassi et al. (2014)
demonstraram que a melatonina é capaz de diminuir fatores envolvidos no processo
de angiogênese tumoral em modelo de câncer de mama. Sabe-se que o processo
inflamatório contribui em todos os aspectos da carcinogênese (SANSONE &
BROMBERG, 2011) promovendo uma resposta fisiológica à proliferação e
remodelação tecidual, facilitando assim a progressão neoplásica (SERVAIS & EREZ,
2013). Assim, as proteínas atuantes nesse processo, MMP-9, PECAM-1, TIE-2,
TNF-α, uPAR, IL-12 e oncostatina tiveram seus níveis reduzidos ao tratamento com
melatonina. Confirmando os nossos achados, alguns estudos demonstram que a
melatonina minimiza a inflamação, bloqueando fatores de transcrição como o NF-kβ,
inibindo a expressão de citocinas e interleucinas pró-inflamatórias (KORKMAZ et al.,
2012). Além disso, foi encontrado aumento da expressão das proteínas próapoptóticas DR6, IGFBP-5, IGFBP-6, HTRA, HPs27 e IGF-R1sr. Estudos
demonstram que a melatonina pode proteger as células normais da apoptose (YU et
al., 2000), e inversamente, induzi-la em células de vários tipos tumorais. Jung et al.
(2013) também confirmam que a melatonina atua como um indutor de apoptose.
Conclusão
Foi confirmada a influência dos CAFs no microambiente tumoral, uma vez que
a melatonina foi capaz de diminuir a expressão de proteínas inflamatórias e
angiogênicas e aumentar a expressão de proteínas apoptóticas, comprovando assim
a ação anti-proliferativa e oncostática, sendo possível determinar seu potencial valor
terapêutico no câncer de mama.
Auxilio Financeiro: FAPESP
Referencias Bibliográficas
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30
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Mestrado (BCM)
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31
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
9. Análise molecular do subcomplexo Brasiliensis (Hemiptera, Triatominae),
por meio do gene nuclear D2
1
1
1
GUERRA, A.L. ; ALEVI, K. C. C. ; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
¹UNESP/IBILCE - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”.
Introdução
Os triatomíneos pertencem à Ordem Hemiptera, Subordem Heteroptera,
Família Reduviidae e Subfamília Triatominae. Todas as espécies são consideradas
potenciais vetores da doença de Chagas. Schofield e Galvão, em 2009, propuseram
a classificação destes insetos em complexos e subcomplexos específicos e, para
agrupá-los utilizaram como parâmetros a disposição geográfica e os caracteres
morfológicos. O subcomplexo Brasiliensis é composto pelas espécies Triatoma
brasiliensis, T. b. macromelanosoma, T. juazeirensis, T. melanica, T. petrochiae, T.
lenti e T. sherlocki (SCHOFIELD e GALVÃO, 2009), uma vez que, recentemente,
T. melanocephala, T. vitticeps e T. tibiamaculata foram excluídos do subcomplexo
(ALEVI et al. 2012a). A posição de T. lenti no subcomplexo, embora fundamentada
em estudos citogenéticos (ALEVI et al., 2012b, 2013), ainda é incerta. Análises
moleculares tem se mostrado como importantes ferramentas para resgatar a
monofilia dos subcomplexos.
Objetivos
Assim, o presente trabalho tem como objetivo reavaliar a posição taxonômica
das espécies do subcomplexo Brasiliensis por meio do marcador molecular D2
(região variável do 28S rDNA), um gene nuclear.
No presente trabalho, foram analisados dois machos adultos de cada
espécie do subcomplexo Brasiliensis e, como outgroup, foram utilizados dois
indivíduos adultos da espécie T. infestans. Os insetos foram provenientes de
colônias mantidas pelo insetário instalado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Câmpus de Araraquara, São Paulo. Os insetos adultos foram dissecados e as
pernas foram utilizadas para extração material genético por meio do kit PureLink
Genomic DNA Mini kit (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Em
seguida, foram realizadas as reações de PCR utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores para amplificação da região variável D2 do gene 28S (rDNA), de
acordo com Porter e Collins (1996). Após a eletroforese, os fragmentos foram
purificados utilizando o kit GFX PCR DNA & Gel Band (GE Healthcare and Life
Technology), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de PCR
purificados foram submetidos ao sequenciamento direto, às amostras foram
enviadas ao Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, USP
- SP. As sequências de todos os indivíduos foram analisadas pelo software BioEdit
7.0.5, e uma sequência consenso foi obtida para cada segmento de DNA. As
sequências foram alinhadas utilizando o editor ClustalW. Posteriormente,
utilizamos o programa MEGA 6.0 para construção de um dendrograma preliminar,
baseado no método de Neighbor- Joining (NJ) para se obter uma representação
gráfica do padrão de distribuição genética dessas espécies. A reamostragem por
bootstrap foi aplicada para avaliar o suporte para os nós individuais (1000
repetições).
O dendrograma gerado a partir das sequências do gene D2 evidenciou
que todas as espécies analisadas estão intimamente relacionadas, sendo o clado
32
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
suportado com 63% de bootstrap e T. infestans foi relacionado como outgroup. Os
dados suportam a monofilia do subcomplexo Brasiliensis. Mendonça et al. (2009)
analisaram sequências dos genes 16S rDNA e Cytb para avaliar a posição de T.
sherlocki dentro do subcomplexo Brasiliensis e, por meio da reconstrução
filogenética, agruparam a espécie como membro do subcomplexo. Da mesma
forma, Gardim et al. (2014) avaliaram a posição taxonômica de T.
melanocephala, T. vitticeps e T. tibiamaculata no subcomplexo e corroboraram a
exclusão dos membros. No entanto, a posição taxonômica das espécies T.
petrochiae e T. lenti nunca havia sido analisada por meio de dados moleculares,
apenas pela morfologia, distribuição geográfica e citogenética.
Conclusão
Sendo assim, até o momento, podemos concluir que o clado do
subcomplexo Brasiliensis é monofilético (suportado com 63% de bootstrap),
confirmando a posição de T. lenti e T. petrochiae como membros do subcomplexo.
No entanto, para que a filogenia fique mais robusta, outros genes e uma
amostragem maior das espécies desse subcomplexo deverão ser realizadas.
Auxílio Financeiro: CAPES e CNPq.
Referências
SCHOFIELD, C.J.; GALVÃO, C. Classification, evolution, and species groups within the Triatominae.
Acta Tropica v.110, p. 88-100, 2009.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P.; PEREIRA, N.P.; ROSA, J.A.; AZEREDO- OLIVEIRA, M.T.V.
Karyotype of Triatoma melanocephala Neiva and Pinto (1923). Does this species fit in the Brasiliensis
subcomplex? Infection, Genetics and Evolution v. 12, p. 1652–1653, 2012a.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P.; SUCCI, M.; PEREIRA, N.P.; ROSA, J.A.; AZEREDO-OLIVEIRA,
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Molecular Research, v.
11, p. 4278–4284, 2012b.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P.; PEREIRA, N.P.; GUERRA, A.L.; FACINA, C.H.; ROSA, J.A.;
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Carcavallo, Cerqueira & Barata (2002) Infection, Genetics and Evolution, v. 13, p. 301–303, 2013.
MENDONÇA, V.J.; SILVA, M.T.A.; ARAUJO, R.F.; JUNIOR, J.M.,; JUNIOR, M.B.; ALMEIDA,
C.E.; COSTA, J.; GRAMINHA, M.A.S.; CICARELLI, R.M.B.; ROSA, J.A. Phylogeny of Triatoma
sherlocki (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae) inferred from two mitochondrial genes suggests its
location within the Triatoma brasiliensis complex. The American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene, v. 81, p. 858–864, 2009.
GARDIM, S.; ALMEIDA, C.E.; TAKIYA, D.M.; OLIVEIRA, J.; ARAÚJO, R.F.; CICARELLI
R.M.B.; ROSA, J.A. Multiple mitochondrial genes of some sylvatic Brazilian Triatoma: Non-monophyly
of the T. brasiliensis subcomplex and the need for a generic revision in the Triatomini. Infection,
Genetics and Evolution, v. 23, p. 74–79, 2014.
33
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
10. Perfil de metilação e modificação de histona em carcinoma renal de células
claras
1
2
2
1
CONCEIÇÃO A.L.G. ; SILVA, C.T. ; JASIULIONIS, M.G. ; CALMON, M.F. ; RAHAL, P.
1
2
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP
1
Introdução
O tumor renal é o oitavo câncer mais comum e altamente letal. É uma doença
histologicamente heterogênea, sendo o carcinoma de células claras (ccRCC) o
subtipo histológico mais comum, compreendendo 70% a 80% dos tumores renais
(XU et al., 2011). Embora a nefrectomia seja um tratamento bem estabelecido,
muitos pacientes desenvolvem metástases (NAGATA et al., 2011). O ccRCC, em
estágios iniciais, pode sofrer alterações biológicas perdendo a diferenciação
epitelial, processo denominado transição epitélio mesênquima (EMT) (REDOVA et
al., 2011). A EMT é uma mudança molecular e celular coordenada, definida como
uma redução na adesão célula-célula, das zonas de oclusão, da polaridade apicalbasolateral, bem como a aquisição de mobilidade, auxiliando no processo de
metástase (TSUJI et al., 2009; LIU, 2010; JANG et al., 2011). Os genes OCLN e
GAS1 participam do processo de adesão célula-célula e crescimento celular, a
perda da expressão desses genes contribui para a EMT conferindo as
características tumorais, como a invasão e metástase (KATOH & KATOH, 2008;
HARTEN et al., 2009).
Objetivos
O objetivo desse estudo foi avaliar se a baixa expressão dos genes OCLN e
GAS1 está relacionada com o perfil de metilação da região promotora ou com a
modificação de histonas.
Material e Métodos
A análise de metilação global foi realizada por sequenciamento da região rica
em dinucleotídeos CGs do OCLN (-438 até +1232; 164 dinucleotídeos CGs) e
GAS1 (-485 até +1518; 269 dinucleotídeos CGs) da linhagem 786-O antes e após o
tratamento com o agente inibidor de metilação 5-aza-2’- desoxicitidina (DAC).
Já a análise de modificação de histona foi realizada por meio da
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) para quatro marcas de histonas, das
quais três são marcas de ativação (H3K4me3, H3K4me2 e H3K9ac) e uma é
marca de repressão (H3K27me3). Em seguida realizamos a PCR quantitativo
(qPCR) para os genes alvos.
A análise de metilação global antes do tratamento com DAC na linhagem 786O do gene OCLN apresentou 24,39% de metilação, já o gene GAS1 apresentou
22,5% de metilação. Após o tratamento com DAC observamos que o gene OCLN
apresentou 22,19% de metilação, já o gene GAS1 apresentou 22,23% de
metilação. Por meio da análise de metilação global percebemos que não houve
mudanças consideráveis na porcentagem de metilação global antes e após o
tratamento com DAC para ambos os genes (variação de 2,2% para o OCLN;
variação de 0,29% para o GAS1).
Uma vez que os resultados de metilação não revelaram associação com a
regulação dos genes de interesse, a investigação de outro mecanismo que altere
a expressão gênica faz-se necessário. Dessa forma, a imunoprecipitação da
cromatina foi realizada com a finalidade de revelar se a modificação das proteínas
34
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
histonas presente no DNA estariam alterando a expressão dos dois genes de
interesse e consequentemente proporcionando condições para o desenvolvimento
do carcinoma renal.
As regiões analisadas referentes ao gene OCLN apresentaram uma baixa
ocupação relativa tanto para a marca de repressão quanto para a marca de ativação.
Já a análise da imunoprecipitação da região correspondente ao gene GAS1 revelou
a presença tanto de marcas de ativação quanto da marca de repressão,
evidenciando um predomínio de marcas de ativação.
Diversos estudos já mostraram a importância da modificação de histonas em
carcinoma de células renais (SELIGSON et al. 2009; ELLINGER et al., 2010;
ROGENHOFER et al., 2012). Seligson e colaboradores (2009) mostraram que
alterações do tipo H3K4me2, H3K18Ac e H3K9me2 estão correlacionadas com um
prognóstico mais reservado e com uma baixa probabilidade de sobrevivência. Um
trabalho em larga escala com amostras de ccRCC revelou os níveis de metilação de
H3K4 estão inversamente relacionados com o estágio avançado, grau e metástase
nesta doença (ELLINGER et al., 2010).
Para que o ChIP mostre o real papel das modificações de histonas na
linhagem de carcinoma renal será necessário uma contraposição com uma linhagem
normal.
Conclusão
Não houve alteração no perfil de metilação da linhagem 786-O após o
tratamento com o agente DAC. Além disso, é necessária a avaliação da linhagem
celular normal para conclusão dos resultados de modificação de histonas.
ELLINGER, J.; KAHL, P.; MERTENS, C. et al. Prognostic relevance of global histone H3 lysine 4
(H3K4) methylation in renal cell carcinoma. Int J Cancer. v. 127, p. 2360-2366, 2010.
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35
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
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36
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
11. Eficácia da melatonina como agente pró-apoptótico e anti-angiogênico no
câncer de mama
1,2
1,2
2
2
2
GELALETI, G.B. ; MASCHIO, L.B. ; BORIN, T.F. ; MARTINS, G.R. ; MOSCHETTA, M.G. ;
1,2
1,2
LEONEL, C. ; ZUCCARI, D.A.P.C.
1
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP/IBILCE/Programa de Pósgraduação em genética, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
2
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP. Laboratório de Investigação Molecular
do Câncer, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
Introdução
O câncer de mama é uma preocupação mundial, sendo a neoplasia mais
comum entre as mulheres e a quinta maior causa de morte relacionada ao câncer
(INCA, 2014). As neoplasias mamárias também são freqüentes na espécie canina,
sendo que a maioria das estratégicas terapêuticas não é eficaz na prevenção da
recidiva. Essas espécies compartilham características patológicas e de evolução
clínica semelhantes, sendo os tumores mamários caninos excelentes modelo de
comparação. O desenvolvimento de tumores envolve a alteração de receptores
hormonais, apoptose insuficiente, desregulação da diferenciação celular e
neovascularização (HAHN; WEINBERG, 2000). Acredita-se que tais efeitos possam
ser modulados pela melatonina, hormônio naturalmente produzido pela glândula
pineal, que possui ação oncostática no câncer (Di BELLA et al., 2013).
Objetivos
Verificar a ação da melatonina no tratamento das linhagens tumorais
mamárias caninas (CF-41 e CMT-U229), e em co-cultivo com a linhagem
linfoblástica (JURKAT), visando verificar sua ação oncostática, pró-apoptótica e antiangiogênica.
Metodologia
As linhagens tumorais mamárias caninas, metastática (CF-41) e nãometastática (CMT-U229) e a linhagem linfoblástica proveniente de linfócitos T
(JURKAT) foram cultivadas em monocamada e em modelo tridimensional. O cocultivo celular foi estabelecido entre as linhagens tumorais caninas e a JURKAT com
adição do lipopolissacarídeo (LPS), no intuito de ativar linfócitos e estimular a
produção de citocinas pró-inflamatórias, mimetizando assim o microambiente
tumoral inflamatório. Após confluência celular, foi realizado o tratamento com
melatonina por 48 horas, a viabilidade celular mensurada pelo ensaio MTT, a
expressão gênica e a quantificação protéica da caspase-3 e do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF-A) por qPCR-RT e imunocitoquímica/imunofluorescência,
respectivamente.
Resultados
A concentração farmacológica de 1 mM de melatonina reduziu a viabilidade
celular nas linhagens CF-41 e CMT-U229 (p <0,05) e o mesmo pôde ser observado
durante o co-cultivo entre as células CF-41 e CMT-U229 com JURKAT (p <0,01; p
<0,05, respectivamente). O tratamento com melatonina aumentou a expressão
gênica e protéica da caspase-3 e sua forma clivada nas células CF-41 (p <0,0003 e
p <0,0001, respectivamente) e, diminuiu a expressão gênica e protéica do VEGF-A
(p =0,0004 e p <0,05, respectivamente). Da mesma forma, verificou-se nas células
CMT-U229, alta expressão gênica e protéica da caspase-3 em resposta ao
tratamento com melatonina (p =0,0003 e p =0,01, respectivamente) e redução da
expressão gênica e protéica do VEGF-A (p =0,01 e p =0,001, respectivamente),
comprovando o efeito oncostático da melatonina. O co-cultivo das células CF-41
37
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
com JURKAT evidenciou menor expressão gênica e protéica de caspase-3 quando
tratada com LPS (p =0,02 e p <0,0001, respectivamente), comprovando a
malignidade celular por adição do mitógeno. O tratamento com 1 mM de melatonina
durante o co-cultivo das células CF-41/JURKAT, também foi capaz de aumentar a
expressão gênica e protéica da caspase-3 (p =0,004 e p =0,02, respectivamente) e
diminuir a expressão gênica do VEGF-A (p =0,01). Para as células CMT-U229 em
co-cultivo com JURKAT, também foi encontrado aumento do potencial maligno
celular por adição do LPS. Em contraste, foi verificada diminuição da expressão
gênica de caspase-3 após o tratamento com melatonina (p =0,01). Já a expressão
gênica do VEGF-A diminuiu após o tratamento (p <0,0001). Para validar esses
resultados, foi realizado o cultivo celular tridimensional, sendo encontrada expressão
protéica da caspase clivada-3 em ambas as linhagens tumorais ao tratamento com
melatonina.
Discussão
Nossos resultados reforçam a atividade antitumoral da melatonina. Diversos
estudos têm mostrado que a melatonina, por meio de suas propriedades antiproliferativas, atua inibindo ou bloqueando o ciclo celular (Di BELLA et al., 2013,
JARDIM-PERASSI et al. 2014), induzindo a apoptose e reduzindo o potencial
metastático das células (JABLONSKA et al., 2012). Sabe-se que a correlação entre
a inflamação, a imunidade inata e o desenvolvimento tumoral é bem estabelecida
(PEDROSA et al., 2010). Receptores de melatonina estão presentes em neutrófilos,
monócitos e linfócitos e vários estudos relatam a ação desse hormônio nas
atividades imunomoduladoras autócrinas e parácrinas (COUSSENS & WERB, 2002).
Assim, quando mimetizamos o microambiente inflamatório pelo co-cultivo celular, a
ação da melatonina foi potencializada. Esses dados corroboram com Carrilo-Vico et
al. (2004), que afirmam que a administração da melatonina in vitro e in vivo gera
efeitos na resposta imune não-específica celular e humoral estando diretamente
relacionada à modulação da atividade imunológica sobre a produção de citocinas. Di
Bella et al. (2013) afirmam ainda que a ação direta da melatonina na inibição da
proliferação e crescimento de células tumorais ocorre pelo direcionamento das
células à via das caspases. Também tem sido demonstrado que a melatonina pode
atuar na angiogênese direta ou indiretamente, inibindo a proliferação de células
endoteliais e fatores pró-angiogênicos em diferentes tipos tumorais (DAI et al.,
2008). A validação dos resultados pelo cultivo tridimensional evidenciou a expressiva
marcação protéica da caspase clivada-3 no interior do esferóide, mimetizando os
processos de apoptose e necrose celular nos organismos in vivo.
Conclusão
Nossos resultados reforçam as propriedades antitumorais, pró-apoptótica e
anti-angiogênicas da melatonina, viabilizando seu uso como agente terapêutico e
antiinflamatório no câncer de mama.
Auxílio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP)
Referências bibliográficas:
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Doutorado (BCM)
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Rio de Janeiro: Ministério da Saúde, 2014.
JABLONSKA, K.; PULA, B.; ZEMLA, A.; OWCZAREK, T.; WOJNAR, A.; RYS, J.; AMBICKA, A.;
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39
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
12. Mastócitos modulam o microambiente tumoral e favorecem
desenvolvimento de lesões colorretais quimicamente induzidas
1
2
2
o
1
AZEVEDO, L.R ; MIRANDA, D.O. , BISSON, G.S. ; OLIANI, S.M.
1
2
Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto - USP/EERP
3
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP/FMRP
Introdução
O câncer colorretal (CCR) é o terceiro mais comum no mundo e o segundo
maior causador de morte no ocidente (SIEGEL et al., 2012). Dos modelos de estudo
disponíveis, a instilação intrarretal do composto metil-N’-Nitro-N-Nitroso-Guanidina
(MNNG) é uma técnica confiável e eficiente para a indução de tumores de forma
seletiva na área exposta ao carcinógeno após 4 a 5 meses (MCLELLAN et al., 2006;
MAURIN et al., 2006). Entre as células imunes associadas ao microambiente tumoral
colônico, os mastócitos são células residentes de origem mielóide abundantes no
estroma (HEIJMANS et al., 2012). No cólon normal, os mastócitos são encontrados
no mesênquima adjacente ao epitélio intestinal e liberam proteases, citocinas e
outros mediadores que afetam diretamente a organização da membrana basal e a
função do epitélio colônico (GROSCHWITZ et al., 2009).
Camundongos deficientes de mastócitos (KitW-sh/W-sh) possuem alterações
na arquitetura do órgão, como aumento na profundidade das criptas, diminuição da
migração de células epiteliais até as vilosidades e redução da expressão de
proteínas de junção intercelular, em comparação aos animais selvagens (C57BL/6).
Essas características são profundamente alteradas na carcinogênese do cólon,
evidenciando o potencial envolvimento dos mastócitos nesse processo
(CHICHLOWSKIET al., 2010).
Objetivos
Avaliar os mastócitos no estabelecimento de lesões neoplásicas colorretais
quimicamente induzidas por MNNGe sua influência sobre a proliferação e morte de
células epiteliais e, ainda, o perfil de citocinas produzidas no microambiente tumoral.
A carcinogênese foi induzida em camundongos C57/BL6 e Kit W/W-v
(deficientes de mastócitos), de aproximadamente 25g, n=3 por grupo, utilizando
quatro instilações intra-retais de 0,02 mg/Kg de MNNG (Sigma-Aldrich),a 3 cm da
margem anal, por meio de uma sonda metálica. Os animais foram observados por
12 semanas até o estabelecimento das lesões pré-neoplásicas. Após a eutanásia,
foram coletados os fragmentos colônicos para a macrodissecção. O cólon distal foi
fixado em formol 10% e incluído em parafina para realização das análises
histológicas. Cortes de 4 µm foram corados com hematoxilina-eosina e azul de
toluidina 0,5% para quantificação dos mastócitos intactos e desgranulados.Outros
segmentos colônicos foram utilizados nas reações imuno-histoquímicas para
Caspase-3 e o antígeno nuclear de proliferação celular – PCNA. Para os controles
negativos, o anticorpo primário foi excluído. A coloração imuno-histoquímica foi
realizada utilizando o método de detecção avidina-biotina. A porcentagem de células
positivas nas criptas colônicas foi calculada em razão do número de células positivas
por 100 criptas. Os fragmentos colônicos utilizados para as dosagens de citocinas
foram imediatamente lavados em solução salina e congelados em nitrogênio líquido.
As amostras homogeneizadas (10% peso/volume) foram centrifugadas a 4°C, por 15
min, a 12000g. A concentração de proteínas do sobrenadante foi quantificada pelo
ensaio de Coomassiee, após, os ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA)
para a quantificação da produção das citocinas. IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12,
40
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
TGF-β e IL-10. Quanto às análises estatísticas, uma vez reconhecida a normalidade
dos dados obtidos pelo teste de Kolmogorov-Smirnov (teste K-S), as diferenças
estatísticas das variáveis com distribuição normal foram determinadas por análise de
variância (ANOVA). O teste de Bonferroni (post hoc) foi utilizado para analisar a
significância estatística das comparações individuais. As diferenças estatísticas dos
dados não-normais foram analisadas pelo Teste de Friedman. Os valores de P
menores que 0,05 foram considerados significantes. O projeto de pesquisa obteve a
aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMRP/USP (n.º
1456/2012).
Inicialmente, verificamos a completa ausência de lesões MNNNG-induzidas
no cólon dos animais deficientes de mastócitos e aumento do número dessas
células, desgranuladas, nos animais selvagens expostos ao MNNG. Os mastócitos
liberam diversos mediadores que podem favorecer o desenvolvimento tumoral.
Dados da literatura demonstram que a histamina, as peptidases triptase e quimase,
IL-8, IL10, além de regularem a produção de TNF-α, os quais estimulam a
vasodilatação, angiogênese, degradação tecidual, proliferação, morfogênese e
metástase, promovendo um ambiente propício para o processo neoplásico
(SUEKANE et al., 2010).
As análises imunohistoquímicas mostram a proliferação e a morte celular nas
criptas colônicas. PCNA e caspase-3foram observados fracamente expressos nos
tecidos do cólon controle e aumentados após a indução com MNNG, o que confere
aumento da celularidade nas criptas colônicas e desenvolvimento das lesões. Nos
animais deficientes de mastócitos não observamos aumento no número de células
PCNA positivas, indicando manutenção dos níveis de proliferação celular, associada
à expressão regular de caspase-3, condicionando a homeostasia do órgão.
Quanto às citocinas avaliadas, os mastócitos se mostraram um importante
modulador da expressão do fator de necrose tumoral (TNF-α) einterleucinas1β, 6 e
12 (IL-1β, IL-6 e IL-12). Estes mediadores são apontados como inibidores do
desenvolvimento tumoral, além de induzirem a apoptose das células tumorais e
quimiotaxia dos leucócitos, estimulando a morte e/ou retardando o crescimento do
tumor (PILIPONSKY et al., 2012). Os nossos resultados também sugerem que os
mastócitos são importantes na regulação das citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e
TGF β) produzidas no cólon.Este fato corrobora com os efeitos imunomoduladores
dessa célula no microambiente (TANAKA; ISHIKAWA, 2013).
Conclusão
Nossos resultados apontam os mastócitos como células fundamentais para o
estabelecimento de lesões neoplásicas quimicamente induzidas, uma vez que
influenciam na proliferação de células epiteliais intestinais expostas ao carcinógeno
e interferem no microambiente imunológico, propiciando o desenvolvimento tumoral.
Auxílio Financeiro: CNPq e FAPESP.
CHICHLOWSKI, M. et al. Role of Mast Cells in Inflammatory Bowel Disease and InflammationAssociated Colorectal Neoplasia in IL-10-Deficient Mice.PLoS ONE.5(8), e12220, 2010.
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Doutorado (BCM)
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42
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
13. Avaliação do efeito citotóxico e genotóxico do preparado sólido artificial
para refresco em cebola (Allium cepa)
1
1
2
PEREIRA, L.L.V. ; ITOYAMA, M.M. ; CASTIGLIONI, L.
1
2
Centro Universitário de Rio Preto - UNIRP
Introdução
Os seres vivos estão expostos às ações de numerosos agentes
potencialmente tóxicos, estes agentes podem ser físicos, químicos ou biológicos,
sendo assim a genética toxicológica investiga agentes tóxicos ou mutagênicos que
são capazes de induzir alterações no DNA, podendo resultar em danos genéticos
(MATSUMOTO et al., 2006). Métodos para avaliação citotóxicas e genotóxicas
utilizando raízes de Allium cepa perfazem uma vasta literatura, sendo utilizada como
um organismo padrão para testes rápidos de várias substâncias por apresentar boa
correlação com sistemas teste de mamífero (MATSUMOTO et al., 2006). Poucos
são os trabalhos referentes aos preparados sólidos artificiais para refresco (PSAR)
na literatura. Oliveira et al. (2006) relatam que os PSAR apresentam substâncias
que podem desencadear reações adversas como urticária, angioedema,
broncoespasmo, e até choque anafilático em alguns indivíduos justificando, portanto,
o seu estudo com possível causador de dano ao DNA.
Objetivos
Avaliar o potencial citotóxico e genotóxico dos PSAR comparando diferentes
tipos de marcas e sabores aos controles positivo e negativo, por meio de bioensaios
realizados com o sistema teste Allium cepa.
Para as análises foram utilizados bulbos de Allium cepa e PSAR, sabores
Limão e Morango de três marcas diferentes (que por motivos éticos não vamos
fornecer), sendo identificados da seguinte forma: TL, TM, SL, SM e CL e CM (T, S, C
= Marcas; L = limão, M= morango).
Os
bulbos
foram
submetidos
ao
enraizamento nas amostras de PSAR, em água Milli-Q (controle negativo) e
trifluralina 1,67ppm (controle positivo). As raízes foram coletadas e fixadas em
Carnoy 3:1 (metanol : ácido acético), por 20 minutos; posteriormente foram
hidrolisadas por 10 minutos (1 HCl 1N: 1 etanol 95%); retornaram ao fixador por
mais 10 minutos, logo após, foram confeccionadas lâminas das raízes utilizando
orceína lacto-acética como corante. O parâmetro do efeito citotóxico foi obtido pelas
análises do índice de divisão celular, dividindo o número de células em processo de
divisão pelo total de células observadas e multiplicando o resultado por cem para
obtenção da porcentagem.
Resultados
As análises das amostras incubadas em água Milli-Q mostraram um
crescimento médio das raízes de 1,8 cm, após 3 dias de incubação. Já as
enraizadas no suco ou trifluralina permaneceram incubadas por sete dias e
cresceram, em média, 0,3 e 0,5 cm, respectivamente. O índice mitótico observado
para o controle negativo foi de 21,8%, já o controle positivo foi de 16,8%. Todos os
sucos analisados tiveram uma porcentagem de índice mitótico abaixo do controle
positivo sendo o maior índice encontrado na amostra SL de 8,2% e o menor na
amostra TM de 4,4% (Gráfico 1).
43
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
Índice Mitótico
Série1
21.8 16.8
Água Trif
7.02 4.4
TL
TM
7.2
5.8
8.2
5.2
CL
CM
SL
SM
Gráfico 1. Índice mitótico dos controles negativo
(Água) e positivo (Trifluralina) e das amostras de
preparado sólido para refresco TL, TM, CL, CM,
SL e SM.
Com relação à divisão mitótica, o controle negativo apresentou as diferentes
fases da mitose sem qualquer tipo de alteração, já as raízes tratadas com a
Trifluralina (controle positivo) apresentaram todas as alterações esperadas. Nas
raízes tratadas com os seis PSAR foi possível observar as seguintes alterações:
células com brotos nucleares (Figuras 1a), núcleos amebóides (Figura 1b),
interfases com perda cromossômica e pontes cromossômicas (Figuras 1c),
micronúcleos (Figuras 1d), C-metáfase (Figura 1e), anáfases com pontes
cromossômicas (Figuras 1f) e telófases com ponte cromossômica (Figura 1g).
Figura 1. Células das raízes de cebola tratadas
com PSAR. a) células com broto nuclear (seta)
(TL); b) núcleo amebóide (TM); c) interfases com
perda
cromossômica
(seta)
e
pontes
cromossômicas (cabeça de seta) (TM); d)
micronúcleo (seta) (SL); e) C-metáfase (CM); f)
anáfases com pontes cromossômicas (seta) (SM);
g) telófases com ponte cromossômica (seta) (CM).
Barra 10 µm
Discussão
As raízes tratadas com os PSAR apresentaram a maioria das células em
interfase, sendo este, o motivo do não crescimento das mesmas, além disso, as
células nas demais fases de divisão apresentaram várias alterações, tanto no
padrão de migração dos cromossomos quanto em perda de material genético por
formação dos micronúcleos, o que indica uma ação direta de uma ou mais
substâncias presentes no PSAR sobre o DNA das células. Os micronúcleos são
resultados de fragmentos acêntricos decorrentes de quebras cromossômicas
durante o processo de divisão devido à inativação do fuso mitótico (FENECH;
CROTT, 2002). Todas as alterações encontradas nos PSAR foram semelhantes aos
controle positivo (Trifluralina) um agrotóxico da classe dos herbicidas, com
classificação de risco classe III (mediamente tóxico) (Anvisa). Os níveis de
44
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
citotoxicidade de um composto podem ser determinados pelo aumento ou
decréscimo do índice mitótico (FERNANDES et al., 2007), no presente estudo o
teste de índice mitótico dos PSAR mostraram resultados menores que o controle
negativo comprovando a citotoxicidade. Todos as 6 amostras de PSAR foram
genotóxicas uma vez que apresentaram elevada frequência de aberrações
cromossômicas, essas aberrações são caracterizadas por mudanças no número ou
estrutura cromossômica, que podem ocorrer por exposição a agentes físicos ou
químicos (LEME et al., 2008). Uma das substâncias encontrada nos PSAR, é o
Dióxido de titânio (TiO2), Gheshlaghi et al. (2008) mostram que nanopartículas de
Dióxido de titânio podem inibir a formação de microtúbulos que são essenciais para
divisão celular, uma hipótese é que as anomalias como a C-metáfase encontrada
nos nossos resultados seja devido sua presença.
Conclusão
Após a análise dos resultados do bioensaio Allium cepa, concluiu-se que
todos os PSAR mostraram um alto grau de citotoxicidade e genotoxicidade um
levantamento bibliográfico das substâncias utilizadas no PSAR sugeriu que o
Dióxido de titânio pode ser um dos responsáveis por algumas alterações, porem
uma análises de cada matéria prima devem ser realizada com a finalidade de
determinar quais são os compostos citotóxicos e genotóxicos ou se há um
sinergismo destes.
Auxilio Financeiro: FAPESP e FUNDUNESP
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Agrotóxicos e Toxicologia - Trifluralina. Disponível
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45
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
14. Subexpressão de fatores angiogênicos após tratamento com metformina e
inibidor LY294002 em linhagem tumoral mamária canina
1
2
3
2
MOSCHETTA, M.G. ; MASCHIO, L.B. ; JARDIM-PERASSI, B.V. ; GELALETI, G.B. ; GONÇALVES,
1
2
2
2
3
N.N. ; LEONEL, C. ; FERREIRA, L.C. ; LOPES, J.R. ; ZUCCARI, D.A.P.C.
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina de São José do Rio
Preto, FAMERP, São José do Rio Preto, SP, Brasil.
2
Programa de Pós-Graduação em Genética, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
– UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, SP, Brasil.
3
Laboratório de Investigação Molecular do Câncer, Departamento de Biologia Molecular, Faculdade
de Medicina de São José do Rio Preto, FAMERP, São José do Rio Preto, SP, Brasil.
Introdução
O processo de angiogênese é regulado por inúmeros fatores, sendo os mais
importantes o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator induzido por
hipóxia - 1α (HIF-1α) (HIGASHIMURA et. al., 2011). O VEGF é uma glicoproteína
ligante à heparina capaz de promover a angiogênese através do crescimento,
migração e invasão de células endoteliais; sua expressão está sob o controle do
HIF-1α, um fator de transcrição de importância funcional no câncer de mama
(MIMEAULT; BATRA, 2013). As vias de sinalização PI3K-MAPK/Akt/mTOR são as
principais vias envolvidas no processo de angiogênese e quando ativadas são
capazes de estimular a expressão do VEGF através do aumento da expressão do
HIF-1α (TREINS et al., 2006). Nesse sentido, diversas pesquisas têm como foco
desenvolver estratégias de tratamento que possam intervir nessas vias de
sinalização, na tentativa de inibir a progressão tumoral (XIONG et al., 2014). A
metformina, um derivado de biguanidas (N', N'dimetilbiguanida), utilizado por via oral
para reduzir a concentração de glicose no sangue de pacientes com diabetes tipo 2,
é também capaz de inibir o crescimento celular através da via de sinalização
MAPK/Akt/mTOR (PHOENIX et al., 2009). O LY294002, um importante inibidor da
via de sinalização PI3K/Akt/mTOR, possui propriedades anti-angiogênicas capaz de
diminuir a liberação de fatores de crescimento como o VEGF (DU et al., 2011).
Objetivos
Avaliar a influência do tratamento com metformina e com o inibidor LY294002
na angiogênese tumoral.
Materiais e métodos
As células procedentes da linhagem tumoral mamária canina RE-positiva
(CMT-U229) foram cultivadas em incubadora a 37ºC e 5% de CO 2, em meio de
cultura HAM-F12. A viabilidade celular foi verificada pelo ensaio colorimétrico MTT, a
partir do tratamento das células com cinco concentrações diferentes de metformina
(0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM e 5 mM) e LY294002 (1µM, 2µM, 5µM, 8µM e 10µM),
pelo período de 24 horas. Para a concentração de 1mM de metformina e 5µM de
LY294002, a expressão protéica e gênica do HIF-1α e VEGF foram detectadas por
imunocitoquímica e PCR em Tempo Real, respectivamente. Para a técnica de
imunocitoquímica, foi utilizado o kit REVEAL Sistema de Detecção (Biogen).
Resumidamente, as lâminas foram incubadas em panela à vapor com tampão citrato
(pH 6,0) para recuperação antigênica seguida de água oxigenada 10V e incubação
com os anticorpos primários anti-HIF-1α (1:50 – Santa Cruz) e anti-VEGF (1:500 –
Santa Cruz) a 4ºC, overnight. A revelação foi realizada com substrato cromogênico
DAB e a contra-coloração com Hematoxilina. A imunomarcação foi quantificada pela
técnica de densitometria óptica, as lâminas foram analisadas e fotografadas ao
microscópio Nikon Eclipse E200 em objetiva de 40X,e as proteínas foram
quantificadas pelo analisador de imagens software ImageJ. Para o desenvolvimento
da técnica de PCR em Tempo Real, a extração de RNA total foi realizada utilizando46
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Doutorado (BCM)
se o reagente Trizol (Invitrogen Life Technologies) e a obtenção do cDNA, pela
técnica de RT-PCR utilizando-se o Kit High Capacity cDNA (Applied Biosystems). O
valor da expressão relativa dos genes de interesse foi determinado com auxílio do
software DataAssist v3.0, pelo método de quantificação em relação à média dos
genes normalizadores utilizados como controle endógeno (ΔΔCt).
Os resultados do ensaio MTT mostraram que no período de 24 horas todas as
concentrações, com exceção de 0,5 mM de metformina, foram capazes de reduzir
significantemente a viabilidade celular, quando comparadas as células controle (sem
tratamento) (p<0,05). Enquanto apenas as concentrações de 5uM e 10uM do
tratamento com inibidor LY294002 foram capazes de reduzir a viabilidade celular em
43% e 66%, respectivamente (p<0,05). A imunomarcação do HIF-1α diminuiu
significantemente nos grupos tratados com apenas 1mM de metformina e 5µM de
LY294002, e no grupo tratado com 1mM de metformina em combinação com
LY294002, quando comparados ao grupo controle (p<0,05). Com relação ao VEGF,
houve diferença estatisticamente significante da imunomarcação quando
comparados os grupos controle e tratado apenas com 1 mM de metformina ou 5µM
LY294002 (p<0,05). Com relação a expressão gênica, o VEGFA apresentou-se
subexpresso em todos os grupos tratados quando comparados ao grupo controle
(p<0,05). Assim, a diferença da expressão do VEGFA entre as células tratadas
apenas com 1mM de metformina, 5µM de LY294002 e o grupo controle foi de 0,1537 ± 0,01588 (média ± desvio padrão) e -0,1113 ± 0,02142, respectivamente.
Para o grupo tratado apenas com LY294002 em combinação com 1mM de
metformina, a diferença da expressão do VEGFA foi de -0,1943 ± 0,02689. O HIF1A
apresentou-se subexpresso nos grupos tratados apenas com 1mM de metformina,
5µM de LY294002 quando comparados ao grupo controle (p<0,05), o tratamento em
combinação não apresentou diferença estatisticamente significante (p>0,05). Assim,
a diferença da expressão do HIF1A entre as células tratadas apenas com 1mM de
metformina, 5µM de LY294002 e o grupo controle foi de -0,0735 ± 0,03138 (média ±
desvio padrão) e --0,06383 ± 0,007472, respectivamente. No presente estudo, a
concentração de 1mM de metformina e 5µM de LY294002, assim como a
combinação dos tratamentos foram eficazes em diminuir a expressão protéica e
gênica do VEGF e HIF-1α nas células da linhagem tumoral mamária CMT-U229,
demonstrando assim a importante ação desses agentes no processo de
angiogênese. De acordo com os nossos resultados, Soraya et al. (2012)
demonstraram que o tratamento com metformina foi capaz de diminuir a expressão
do gene VEGFA em linhagem de células endoteliais HUVECs. Da mesma forma,
Treins et al. (2006) demonstraram que a metformina foi capaz de inibir a expressão
do HIF-1α em células epiteliais. Além disso, Du et al. (2011) demonstraram que o
tratamento com LY294002 diminuiu a expressão do HIF-1α e VEGF na linhagem
celular de câncer de mama MCF-7. No entanto, pouco se sabe quanto à influência
do tratamento com metformina em combinação com o inibidor LY294002 na
angiogênese tumoral, apenas os trabalhos de Liu et al. (2011) e Li et al. (2012)
demonstraram que o tratamento com LY294002 em combinação com a metformina
foi eficaz em diminuir a proliferação celular em câncer de ovário e no tratamento do
câncer de mama, porém sem relação com o processo de angiogênese.
Conclusão
Nossos resultados sugerem que o tratamento apenas com metformina e com
o inibidor LY294002, ou uso destes em combinação, pode ter um papel importante
47
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Doutorado (BCM)
na supressão tumoral, criando assim, um caminho promissor para a utilização como
agentes terapêuticos no tratamento do câncer.
Auxílio Financeiro: FAPESP
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Doutorado (BCM)
15. Nanocápsulas biocompatíveis como agentes antitumorais no tratamento do
câncer de mama metastático: estudo in vitro
1
1
2
2
2
1
CANDIDO, N. M. ; CALMON, M. F. ; PRIMO, F. L. ; DE MELO, M. T. ; TEDESCO, A. C. ; RAHAL, P.
1
Laboratório de Estudos Genômicos; Instituto de Biociência, Letras e Ciências Exatas –
IBILCE/UNESP; São José do Rio Preto, SP, Brasil.
2
Grupo de Pesquisa em Fotobiologia e Fotomedicina; Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto – FFCLRP/USP; Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Introdução
Há mais de três décadas as neoplasias da mama representam a principal
causa de morte por câncer nas mulheres brasileiras e tem-se observado um
acréscimo nesta taxa de mortalidade. Por ser uma doença de etiologia multifatorial,
quanto maior a exposição aos fatores de risco e mais tardio o diagnóstico, pior o
prognóstico. Sendo assim, uma via comum diretamente relacionada à mortalidade
do câncer de mama é o desenvolvimento de metástases (INCA, 2014). Os sítios
acometidos mais comuns são os pulmões, fígado, ossos, cérebro e linfonodos e
apenas uma pequena minoria das pacientes diagnosticadas com câncer metastático
alcança a cura a longo prazo utilizando-se das combinações terapêuticas
contemporâneas (GOLD; WINER, 2009).
A terapia sistêmica de primeira linha para o câncer de mama metastático, em
indivíduos com tumores negativos para receptor de estrogênio, é a quimioterapia
(geralmente um regime contendo doxorrubicina ou epirrubicina associadas a taxanos
e fluorouracil) e terapia hormonal para os indivíduos com receptor de estrogênio
positivo (JONES et al., 2004). A quimioterapia é também geralmente preferida
particularmente quando há metástase para sítios críticos ou quando o intervalo
desde o tratamento prévio para doença em estágio inicial é curto. Além disso,
normalmente, o tratamento visa o manejo dos sintomas e o aumento de sobrevida
com qualidade de vida, sendo que a ressecção cirúrgica pode ser considerada
paliativa, quando possível (PRONZATO; RONDINI, 2006).
Portanto, o tratamento deste tipo de câncer envolve a utilização de recursos
terapêuticos complexos, com resultados estéticos pouco satisfatórios que implicam,
consequentemente, no comprometimento social e psicológico da paciente devido às
mutilações originadas na região das mamas (PAULINELLI; MOREIRA; JÚNIOR,
2004). Sendo assim, outros delineamentos terapêuticos são almejados a fim de
reverter o quadro insatisfatório de qualidade de vida, amenizando os efeitos
colaterais e aperfeiçoando as terapias já existentes, para a escolha de um
tratamento eficiente em todos os sentidos.
As novas terapias envolvendo sistemas nanoestruturados aplicados ao
tratamento do câncer vêm evoluindo rapidamente e estão sendo implementadas
como técnicas alternativas a fim de resolver limitações das estratégias terapêuticas
convencionais. Para isso, ativos veiculados aos mais diferentes sistemas
nanoestruturados demonstram vantagens sobre outros sistemas de veiculação
devido à sua estrutura em escala nanométrica com propriedades singulares, sendo
que suas aplicações se estendem desde a entrega de fármacos a sistemas
complexos até procedimentos clínicos envolvendo fotoprocessos e nanotecnologia,
como a terapia fotodinâmica.
Recentemente, nanopartículas desenhadas como sistemas de entrega de
fármacos (drug delivery systems), que contêm agentes anticarcinogênicos, bem
como inúmeros outros ativos, tem recebido grande atenção devido ao seu
comportamento único de acúmulo no local do tumor e elevada sítio-especificidade
(BRANNON-PEPPAS; BLANCHETTE, 2012). Vários sistemas de veiculação
nanoparticulados podem ser utilizados para se alcançar esses objetivos, tais como
as nanocápsulas que, juntamente aos lipossomas, são os carreadores mais
49
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Doutorado (BCM)
utilizados para entrega de drogas. Devido ao pequeno tamanho, sistemas
nanoestruturados apresentam maior área de superfície por unidade de volume,
permitindo a associação de quantidades maiores de drogas ou biomoléculas
adsorvidas. Uma das grandes vantagens do uso de sistemas carreadores de drogas
é a possibilidade de aumentar a concentração do fármaco no local de interesse, no
tumor, maximizando a resposta terapêutica ao mesmo tempo em que diminui os
danos às células normais (MISRA; ACHARYA; SAHOO, 2010).
Entretanto, o uso de alguns tipos de sistemas nanoestruturados pode ser
limitado por induzir alterações na morfologia e viabilidade celulares, permeabilidade
da membrana plasmática ou desencadear processo apoptótico. Sendo assim, este
trabalho torna-se importante para uma melhor compreensão em relação à
biocompatibilidade e ação antitumoral das nanocápsulas recém sintetizadas,
potencialmente comerciais e úteis, tanto nas pesquisas in vitro quanto in vivo.
Objetivos
O presente trabalho tem como objetivo geral verificar a ação de diferentes
sistemas nanoestruturados em linhagens celulares murinas de mama normal
(células 3T3) e de câncer de mama metastático (células 4T1).
Quatro diferentes nanocápsulas (NC) foram sintetizadas e caracterizadas:
nanocápsulas vazias (V); nanocápsulas revestidas por ácido fólico (AF), que é
encontrado com aumento de expressão em diversos tipos de câncer; nanocápsulas
contendo ftalocianina de cloro-alumínio (AlClPc), que é um agente fotossensível; e,
por fim, nanocápsulas revestidas por ácido fólico contendo ftalocianina (AF+AlClPc).
Estes sistemas nanoestruturados foram incubados com células 3T3 e 4T1 sob
diferentes concentrações (0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e 1,25µM) e analisados após 3, 6, 9,
12, 24 e 48 horas. Depois da incubação, análises de captação intracelular, ensaio de
migração e ensaio MTT foram realizados para garantir a entrada das NCs nas
células alvo e para avaliar a biocompatibilidade e citotoxicidade.
De acordo com o ensaio MTT, pôde-se observar que os sistemas
nanoestruturados vazios (V) não apresentaram citotoxicidade para células de câncer
de mama 4T1 em nenhuma das concentrações avaliadas, mesmo após 48 horas de
incubação. Apesar do decréscimo percentual visualizado ao longo do tempo
conforme o aumento de concentração das NCs, tal diminuição de viabilidade celular
não ultrapassou o limiar aceitável de toxicidade (valor referente a 80% de
viabilidade), chegando a 80,62% na maior quantidade de NCs (1,25µM) e período de
exposição (48 horas). Tal fato sugere que os nanocompostos que constituem a
nanoestrutura estudada não desencadeiam processos indesejados de toxicidade.
A mesma situação foi visualizada para os demais tipos de NCs (AF, AlClPc e
AF+AlClPc) incubadas com as linhagens celulares 4T1 e 3T3. Um dado muito
importante foi o resultado obtido de que os sistemas nanoestruturados AF não
apresentaram toxicidade para a linhagem estudada, uma vez que se propõe o uso
do ácido fólico nas formulações somente como agente vetorizador e não é de
interesse que acarrete distúrbios na dinâmica celular.
O experimento de motilidade celular avaliou a capacidade de repopulação das
células 4T1 após a ruptura da camada celular em placa de cultura. Além disso, por
meio da microscopia por contraste de fase, foi possível averiguar a morfologia das
células, que permaneceram inalteradas independentemente do tipo e concentração
de NC bem como do tempo de exposição avaliados. O mesmo perfil de migração
50
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Doutorado (BCM)
celular foi observado para todos os sistemas nanoestruturados nas diferentes
concentrações e tempos de incubação. Portanto, as NCs não apresentaram caráter
tóxico e, consequentemente, não afetaram a viabilidade e migração celular na
ausência do laser utilizado em terapia fotodinâmica.
Foram escolhidas as células normais 3T3 para os estudos de comparação
com as células 4T1, pois em tecidos saudáveis o receptor folato é expresso nas
células em concentrações menores que quando comparados às células neoplásicas,
em especial no caso das células mamárias. Os resultados obtidos por microscopia
de fluorescência para as células 3T3 e 4T1 mostraram o perfil de distribuição
intracelular do fármaco fotossensível AlClPc, preferencialmente encontrado em
células de câncer, reafirmando o caráter direcionador do revestimento com ácido
fólico nestas NCs.
Conclusão
As
formulações
nanoencapsuladas
mostraram-se
biocompatíveis,
apresentando viabilidade celular em torno de 80 a 100%, uma faixa percentual
considerada não tóxica para células em cultivo in vitro. A biocompatibilidade, aliada
a uma biodistribuição adequada, leva a resultados que favorecem o emprego destes
processos em protocolos in vivo. Consequentemente, uma baixa citotoxicidade em
relação às células normais está diretamente relacionada à redução de efeitos
colaterais ocasionados após a administração sistêmica, tópica ou transdérmica de
formulações.
Desta forma, o potencial da terapia mediada por NCs é encorajadora e pode
aperfeiçoar as metodologias terapêuticas disponíveis para tratamento do câncer de
mama metastático, uma doença que necessita grande atenção. Entretanto, mais
estudos devem ser conduzidos a fim de certificar os mecanismos celulares e
sistêmicos destas novas NCs sintetizadas.
Auxílio Financeiro: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
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51
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Doutorado (BCM)
16. Ação da melatonina, curcumina e Y27632 sobre a expressão de ROCK-1 na
metastatização do câncer de mama
1
2
2
2
1
BORIN, T. F. ; FERREIRA, L. C. ;GELALETI, G. B. ; MASCHIO, L. B. ; MOSCHETTA, G. M. ;
1,2
ZUCCARI, D. A. P. C.
1
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP. Laboratório de Investigação Molecular
do Câncer, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP/IBILCE/Programa de Pósgraduação em genética, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
Introdução
O câncer de mama representa a neoplasia mais comum entre as mulheres,
com alta taxa de mortalidade devido principalmente à invasão tumoral e ocorrência
de metástases (INCA, 2014). As células metastáticas possuem um esqueleto pouco
estruturado e a baixa ancoragem que permite a invasividade celular (LIOTTA et al.,
1991). Tanto a migração como a ancoragem das células no substrato ocorre através
dos rearranjos da actina do citoesqueleto, e estes são processos regulados por
sinalização externa e efetores intracelulares, entre eles a proteína-quinase
associada à Rho (ROCK-1) (ORTÍZ-LÓPEZ et al., 2009). A expressão de ROCK-1
está, portanto, relacionada à metástase (LIU et al., 2009), sendo a sua expressão
gênica possivelmente modulada por melatonina (BENÍTEZ-KING, 2006), curcumina
e seu inibidor específico (Y27632). Para controle de tais efeitos, estudos com a
melatonina (hormônio secretado pela glândula pineal) e curcumina (componente do
extrato de Curcuma longa L) demonstram ações oncostática e anti-metastática
(OTALORA et al., 2008; SU et al., 2010).
Objetivo
Avaliar os efeitos in vitro e in vivo dos tratamentos com melatonina, curcumina
e Y27632 na metástase do câncer de mama mediada pelo ROCK-1.
Linhagens de células de câncer de mama metastático (MDA-MB-231) e nãometastático (MCF-7) foram tratadas com melatonina, curcumina e Y27632. A
viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT, a migração e invasão celular, para
determinar o potencial metastático das células tumorais em resposta aos
tratamentos, por ensaios de invasão em câmara de Boyden e a expressão gênica e
protéica verificadas por PCR em tempo real e western blotting, respectivamente.
Além disso, um estudo in vivo foi realizado desenvolvendo um modelo de metástase
pulmonar. A metástase foi induzida pela injeção de 2 x105 células viáveis via
endovenosa, mantida por 3 semanas. Os animais após uma semana de indução
metastática foram tratados com melatonina, curcumina e Y27632 cinco vezes por
semana durante duas semanas. A análise do crescimento metastático foi verificada
pela tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) com a
utilização do radiofármaco para detecção de metástase pulmonar, Tc-99mtetrosfomin, que permitiu avaliar a extensão da metástase no modelo experimental.
Foram realizadas análises histológicas e da expressão protéica de ROCK-1 por
imunohistoquímica.
Resultados
Os tratamentos com melatonina, curcumina e Y27632 reduziram a viabilidade
das células e a taxa de migração e invasão de ambas as linhagens celulares
(p<0,05).O uso de melatonina e Y27632, em associação ou não, diminuiu a
expressão protéica de ROCK-1 em células metastáticas, mas não alteraram a
expressão na linhagem não-metastática (p>0,05). Uma redução estatisticamente
52
_________________________________________________________
Doutorado (BCM)
significante da expressão gênica de ROCK-1 foi observada em todos os grupos de
tratamento (p<0,05) das células MDA-MB-231, exceto no grupo tratado com
curcumina. As imagens cintilográficas captadas por SPECT in vivo, mostraram
múltiplos focos de metástases nos pulmões (em imagens de Tc-99-tetrofomin) dos
animais controles positivo quando comparados aos controles negativo. A análise
semi-quantitativa mostrou menor atividade nos pulmões dos animais que receberam
o tratamento com melatonina, curcumina e Y27632 (p<0,05).
Discussão
Segundo Liu et al. (2009), o aumento da expressão de ROCK-1 promove o
crescimento de tumores e metástases, sendo limitado quando associado ao seu
inibidor específico, o Y27632, que foi capaz de afetar a motilidade celular in vitro e a
metástase in vivo. Linet al. (2010) mostraram a diminuição da expressão gênica e
protéica de ROCK-1 correlacionado-as à diminuição da migração e invasão celular
após tratamentos in vitro com curcumina. Em um estudo desenvolvido por Cos et al.
(1998), camundongos nude atímicos tratados com melatonina durante 10 semanas
apresentaram menor tamanho tumoral em comparação aos animais controle. Além
disso, neste mesmo estudo foi demonstrado que o tratamento com melatonina levou
a redução do desenvolvimento de metástase à distância e ao aumento de sobrevida
dos animais. Acredita-se que a melatonina possa atuar como um modulador do
citoesqueleto celular, por reorganizar as fibras envolvidas neste processo (BENÍTEZKING, 2006).
Conclusão
Melatonina e Y27632 são agentes eficazes no tratamento in vitro do câncer
de mama metastático, confirmando seus efeitos na diminuição da viabilidade celular,
invasão, migração e expressão protéica de ROCK-1 nestas células. In vivo, os
tratamentos com melatonina, curcumina e Y27632 parecem ser eficazes na redução
das metástases pulmonares. A melatonina, em particular, é mais eficaz quando
combinada com inibidor de ROCK-1. Já a curcumina não possui resposta como um
agente anti-metastático.
Auxílio Financeiro: FAPESP e FAPERP.
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53
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54
Genética Animal e Evolução
(GAE)
__________________________________________________
Iniciação Científica (GAE)
17. Divergência genética entre touros Tabapuã em rebanhos do Paraná
1
1
1
PLAZAS, B.M. ; SILVA, I.C.P. ; FERRAZ-FILHO, P.B.
1
Universidade Federal de Mato Grasso do Sul - UFMS
Introdução
Em programas de melhoramento genético animal, o estudo da distância
genética entre progenitores tem se composto em uma ferramenta importante, pois
segundo Ferraz-Filho (2008) a dissimilaridade entre progenitores pode ser útil para a
previsão de cruzamentos que almejam a heterose. Alguns estudos de discordâncias
genéticas possibilitam identificar progenitores que induziriam altos índices de
coeficiente de endogamia, de acordo com Silva (2001) tornando possível maior
controle endogâmico do rebanho, possibilitando cruzamentos com combinações
hibridas com maior efeito heterótico.
Objetivos
Identificar grupos de touros da raça Tabapuã, com progênies em rebanhos do
Paraná, com similaridade e dissimilaridade através das técnicas de análises
multivariadas a partir de caracteres ponderais e reprodutivos, para orientar
acasalamentos que visem à endogamia ou a heterose.
Material e Métodos
Foram efetuadas análises multivariadas por meio de informações obtidas das
médias das progênies de cinco reprodutores da raça Tabapuã, em fazendas
situadas no Estado do Paraná. Os dados aplicados são relativos as Diferenças
Esperadas nas Progênies para peso aos 120 dias de idade, efeito materno (P120M),
peso aos 120 dias, efeito total materno (P120TM), aos 240 dias, efeito direto, (P240),
peso aos 240 dias, total materno (P240TM), peso aos 420 dias (P420), ganho de
peso pré-desmama (GPRED), total maternal de ganho de peso pré-desmama
(TMGPD), ganho de peso pós- desmama (GPPSD), Intervalo primeiro parto, em dias
(IPP), intervalo entre o primeiro e o segundo parto (INT12P) intervalo entre outros
partos (IOP) e perímetro escrotal (PE).
As medidas de dissimilaridade foram obtidas através das distâncias
Euclidianas médias, sendo que estas foram utilizadas para a formação dos grupos
de dissimilaridade pelo Método de Otimização de Tocher. Coeficientes de
ponderação de componentes principais foram estimados para avaliar a importância
relativa dos caracteres sobre a divergência. Os dados foram processados pelo
Programa Genes – Aplicativo Computacional em Genética e Estatística, versão
Windows (Cruz, 2001).
Resultados e discussão
As aferições das distâncias Euclidianas médias mostrou que a maior
dissimilaridade ocorreu entre os touros 2 e 5 (distância de 0,8438) e a menor
similaridade entre os touros 3 e 4 (distância de 0.3093).
O agrupamento genético, pelo Método de Tocher, com base nas distâncias
Euclidianas médias padronizadas, permitiu o estabelecimento de 2 grupos
homogêneos de similaridade, Tabela 1
Tabela 1. Grupos de touros da raça Tabapuã, com progênies em rebanhos do Estado do Paraná,
estabelecidos pelo método de Tocher, com base nas distâncias euclidianas médias.
Grupos
Touros
I
3, 4, 1 e 5
II
2
*Limite intergrupos = 0,5383
56
__________________________________________________
A partir da aferição dos autovalores e autovetores, verificou-se serem
necessários os três primeiros componentes principais para explicar 94,51% da
variação total entre os touros, o primeiro explicou 58,96%, o segundo respondeu por
28,10% e o terceiro por 07,45% da variância.
Neste caso optou-se pela dispersão gráfica tridimensional (Figura 1), na qual
são considerados simultaneamente os escores dos três primeiros componentes
principais, o que confirma que os genótipos 2 e 5 apresentam a máxima diversidade,
por situarem-se graficamente mais distantes, e que os touros 3 e 4 são os mais
similares,, confirmando a eficiência do método de componentes principais, em que
os três primeiros componentes foram suficientes para representar a formação dos
grupos.
Figura 1. Relações entre os três primeiros componentes principais para uma avaliação
genética da diversidade entre os cinco touros
A análise por componentes principais cujo autovalor não excedeu a 0,7 (Cruz
e Carneiro, 2003), foram identificadas, em ordem crescente, as variáveis de maior
coeficiente na última função linear, TMGPD, PE, GPPSD, P20TM, P420, IPP,
P120M,GPRED, INT12P, respectivamente, como passíveis de descarte.
Conclusão
As distâncias genéticas obtidas permitiram identificar touros similares e
dissimilares para o conjunto das características analisadas.
Referencias
CRUZ, C.D. Programa Genes: versão Windows; aplicativo computacional em genética e estatística,
2001. 648p.
CRUZ, C.D. CARNEIRO, P.C.S. Modelos Biométricos Aplicados ao Melhoramento Genético.Vol. 2,
Viçosa: UFV.2003, 585p.
57
__________________________________________________
FERRAZ FILHO, P.B.; SILVA, L.O.C.; SOUZA, J.C.; MALHADO, C.H.M. Divergência genética de
touros Nelore com sêmen disponível em centrais de inseminação no Brasil. Archivos
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SILVA, M.V.G.B.; FERREIRA, W.J.; COBUCI, J.A.; GUARAGNA, G.P.; OLIVEIRA, P.RP. Efeito da
endogamia sobre características produtivas e reprodutivas de bovinos do ecótipo Mantiqueira.
Revista Brasileira de Zootecnia, v.30, n.4, p.1236-1242, 2001.
58
__________________________________________________
18. Conjunto cromossômico diploide de Triatoma wygodzinskyi (Hemiptera,
Triatominae)
1
1
IMPERADOR, C.H.L ; ALEVI, K.C.C. ; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
1
1
Introdução
Os triatomíneos pertencem à ordem Hemiptera, subordem Heteroptera,
família Reduviidae e subfamília Triatominae. Esses insetos hematófagos apresentam
grande importância para a saúde pública, uma vez que todas as espécies são
potenciais vetoras do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença
de Chagas. Schofield e Galvão (2009), baseados, principalmente, em caracteres
morfológicos e na distribuição geográfica, agruparam os triatomíneos em complexos
e subcomplexos específicos. Triatoma arthurneivai, T. maculata, T. pseudomaculata
e T. wygodzinskyi foram agrupados no complexo Infestans e subcomplexo Maculata.
T. wygodzinskyi foi descrita por Lent, em 1951, e apresenta poucas informações na
literatura, restringindo-se à biologia (CARBAJAL DE LA FUENTE et al., 2010),
morfometria (CARBAJAL DE LA FUENTE et al., 2011) e distribuição geográfica
(CARBAJAL DE LA FUENTE et al., 2009). Assim, novas análises devem ser
realizadas nesse vetor, com ênfase, nas relações evolutivas de T. wygodzinskyi com
o subcomplexo Maculata.
Objetivo
Descrever o cariótipo de T. wygodzinskyi, com ênfase citotaxonômica.
Dois machos adultos da espécie T. wygodzinskyi foram analisados
citogeneticamente. Os insetos foram cedidos pelo “Laboratório de Referência em
Triatomíneos e Epidemiologia da doença de Chagas”, instalado no
Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz, Minas Gerais. As lâminas com o
material biológico (túbulos seminíferos) foram preparadas pela técnica de
esmagamento celular e coradas com Orceína lacto-acética. As lâminas foram
analisadas ao microscópio de luz Jenaval (Zeiss), acoplado à câmera digital e ao
sistema analisador de imagens Axio Vision LE 4.8 (Copyright ©2006-2009 Carl Zeiss
Imaging Solutions Gmb H), com aumento de 100 vezes.
Por meio da análise das metáfases meióticas, foi possível descrever o número
de cromossomos de T. wygodzinskyi, a saber, 2n = 22, sendo 20 autossomos e dois
cromossomos sexuais (X e Y). Esse cariótipo é observado em 46 das 86 espécies de
triatomíneos com o número de cromossomos descrito (ALEVI et al., 2013), incluindo
as outras três espécies quem compõem o subcomplexo Maculata. O cariótipo pode
ser uma importante ferramenta para avaliar a relação evolutiva das espécies
agrupadas nos subcomplexos. Alevi et al. (2012), por meio da descrição do número
de cromossomos, propôs a exclusão de T. melanocephala, T. vitticeps e T.
tibiamaculata do subcomplexo Brasiliensis, uma vez que as espécies apresentam
fragmentação do cromossomos sexual X e, com isso, assemelham-se aos
triatomíneos da América do Norte.
Conclusão
Sendo assim, o presente trabalho corrobora a inclusão de T. wygodzinskyi no
subcomplexo Maculata, uma vez que as quatro espécies do subcomplexo
apresentam homogeneidade cariotípica.
59
__________________________________________________
Auxílio Financeiro: FAPESP e CNPq.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P.; PEREIRA, N.P.; ROSA, J.A.; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
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Sociedade Brasileira de Medicina Tropical v. 43, p. 15-18, 2010.
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Misidentification of two Brazilian triatomes, Triatoma arthurneivai and Triatoma wygodzinskyi, revealed
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CARBAJAL DE LA FUENTE, A.L.; PORCASI, X.; NOIREAU, F.; DIOTAIUTI, L.; GORLA, D.E. The
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SCHOFIELD, C.J.; GALVÃO, C. Classification, evolution, and species groups within the Triatominae.
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60
__________________________________________________
19. Homogeneidade gamética em diferentes populações de Rhodnius
neglectus e Panstrongylus megistus do Brasil
1
1
1
NUNES, G.M ; ALEVI, K.C.C ; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
1
Introdução
Os triatomíneos são insetos hematófagos vetores do protozoário
Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Seis espécies
apresentam maior importância vetorial, principalmente, por estarem associadas a
regiões domiciliares, a saber, Triatoma infestans, Panstrongylus megistus, T.
brasiliensis, T. sordida, T. pseudomaculata e Rhodnius neglectus (DIAS e COURA,
1997; SILISTINO-SOUZA, et al., 2013). As espécies P. megistus e R. neglectus
estão amplamente distribuídos no Brasil, sendo que foram registradas em vinte e
dois e treze Estados brasileiros, respectivamente. Recentemente, análises
citogenéticas intraespecíficas foram realizadas para P. megistus e R. neglectus e os
resultados demonstraram que ambas as espécies apresentam estabilidade
cromossômica, ou seja, todas as populações analisadas apresentaram as mesmas
características. Variações interespecíficas nos gametas de hemípteros machos já
foram relatadas na literatura (CHAWANJI et al. 2005, 2006; ALEVI et al., 2013a;
ALEVI et al., 2013b).
Objetivos
Assim, o presente trabalho tem como objetivo comparar as espermátides de
R. neglectus e P. megistus provenientes de diferentes populações, com o objetivo de
avaliar possíveis variações intraespecíficas nos gametas desses insetos.
Metodologia
No estudo, foram utilizados cinco indivíduos machos adultos da espécie P.
megistus, provenientes dos Estados do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul,
Paraná, São Paulo e Minas Gerais e cinco indivíduos machos adultos da espécie R.
neglectus, provenientes dos Estados do Rio Grande do Norte, Goiás, Minas Gerais e
São Paulo. Os insetos foram cedidos pelo “Insetário de Triatominae”, instalado no
Departamento de Ciências Biológicas, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Câmpus de Araraquara. Os túbulos seminíferos dos machos adultos, depois de
dilacerados e fixados na lâmina, foram submetidos às técnicas citogenéticas de
orceína lacto-acética (DE VAIO et al., 1985, com modificações de acordo com ALEVI
et al., 2012). O material biológico foi analisado ao microscópio de luz Jenaval (Zeiss),
acoplado à câmera digital e ao sistema analisador de imagens Axio Vision LE 4.8
(Copyright ©2006-2009 Carl Zeiss Imaging Solutions Gmb H), com aumento de 100
vezes.
Variação intraespecífica, durante a formação dos gametas masculinos, foi
observada em três espécies de heterópteros: Antiteuchus tripterus, Platycarenus
umbractulatus e Euschistus heros (SOUZA e ITOYAMA, 2010). As análises
citogenéticas das espermátides de R. neglectus e P. megistus possibilitaram
observar que as diferentes populações não apresentam variação na morfologia das
células haplóides. Além disso, variações interespecíficas também não foram
observadas. Análises da morfologia da espermátide já foram utilizadas para
diferencias Triatoma melanocephala e T. vitticeps (ALEVI et al., 2013a) T. lenti e T.
sherlocki (ALEVI et al., 2013b) e T. guazu e T. williami (REIS et al., 2014). Além
disso, também foram utilizadas para corroborar a composição do complexo T.
brasiliensis (ALEVI et al., 2014).
61
__________________________________________________
Conclusões
Sendo assim, foi possível observar que as diferentes populações de R.
neglectus e P. megistus apresentam homogeneidade na morfologia dos gametas.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P..; PEREIRA, N.P.; FERNANDES, A.L.V.Z.; ROSA, J.A.; AZEREDOOLIVEIRA, M.T.V. Analysis of spermiogenesis like a tool in the study of the triatomines of the
Brasiliensis subcomplex. Comp. R. Biol. v. 336, p. 46-50, 2013b.
ALEVI, K.C.C.; MENDONÇA, P.P.; PEREIRA, N.P.; ROSA, J.A.; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
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Testicular Lobes of Some Pentatomid Species. J. Insect Sci. v. 10, p. 132, 2010.
62
__________________________________________________
20. Medidas não paramétricas da estabilidade genotípica de bovinos da raça
Tabapuã para característica peso aos 240 dias de idade.
MARTINS, H.H.D¹; PLAZAS, B.M.¹; SILVA, I.C.P¹; FERRAZ FILHO, P.B.¹
¹Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS
Introdução
A interação genótipos x ambientes constitui-se num dos maiores problemas
dos programas de melhoramento genético de bovinos de corte, seja na fase de
seleção ou na recomendação de indivíduos geneticamente superiores. Entre as
alternativas para se amenizar a influência desta interação tem sido recomendado o
emprego de animais com ampla adaptabilidade e boa estabilidade (CRUZ E
CARNEIRO, 2003).
Objetivo
O objetivo deste trabalho foi identificar dentro de cinco reprodutores da raça
Tabapuã, com progênies em quatro regiões do Brasil, aqueles que responderiam
vantajosamente à melhoria do ambiente, por intermédio de um método não
paramétrico de avaliação da performance genotípica.
Metodologia
A característica de desenvolvimento ponderal utilizada para o estudo da
estabilidade e adaptabilidade é referente à população de bovinos compostas por
progênies de cinco touros da raça Tabapuã, criadas em quatro rebanhos, em três
diferentes regiões do Brasil, Bahia (rebanhos 1 e 2), Paraná (rebanho 3) e Minas
Gerais (rebanho 4), descritas em Marçal et al., 2014. As estimativas dos parâmetros
de foram feitas a partir de médias oriundas das Diferenças Esperadas nas Progênies
(DEPs) para peso (kg) aos 240 dias de idade.
Para estimar a adaptabilidade e a estabilidade foi utilizado o método de análise
o de Huehn (1990). Esse consiste na classificação dos touros nos vários ambientes
em relação aos dados dos efeitos da interação genótipo x ambiente ( ĜAij ).As
estimativas dos efeitos da interação genótipos x ambientes foram obtidas pelo meio
da expressão:
𝑮𝑨𝒊𝒋 = 𝒀𝒊𝒋 + 𝒀𝒊. + 𝒀.𝒋 + 𝒀..
em que:
𝒀𝒊𝒋
𝒀𝒊.
𝒀.𝒋
𝒀..
= média do i-ésimo touro no j-ésimo ambiente (região);
= média geral do i-ésimo touro
= média geral do j-ésimo ambiente
= média geral do ensaio.
Para desenvolvermos a metodologia de Huehn (1990) serão obtidos; a) as
estimativas dos efeitos da interação genótipos x ambientes; b) a classificação de
cada touro nos vários ambientes, em relação aos respectivos valores de ĜAij ; e c)
as medidas não-paramétricas da estabilidade, denotadas por S1i, S2i e S3i.
Neste caso, têm-se:
S1i : média das diferenças absolutas entre as classificações do touro i nos ambientes
rij  rij '

j j '
S1i 
a(a  1) / 2
63
__________________________________________________
em que
rij: classificação do genótipo i no ambiente j.
a : número de ambiente.
S2i, : variância das classificações do touro i nos ambientes
j (rij  ri. ) 2
S 2i 
a 1
em que
j rij
ri 
a
S3i : soma dos desvios absolutos de cada classificação em relação à média das
classificações
 rij  ri.
S 3i 
jj '
ri.
O touro de máxima estabilidade será aquele que apresentar S 1i, S2i e S3i iguais
a zero ou mais próximo desse valor.
Para as análises, foi utilizado programa Genes- aplicativo computacional em
genética e estatística, versão Windows (CRUZ , 2001).
Resultado e Discussão
Inicialmente foram obtidos os valores dos efeitos da interação genótipo x
locais e respectivas classificações resultantes da avaliação em quatro regiões, a
partir dos quais foram calculadas as medidas de estabilidade, de forma que os
resultados estão apresentados na Tabela 1.
As significâncias das estatísticas Z1i e Z2i indicam que houve diferenças entre
os touros avaliados quanto as medidas de estabilidade expressas por S 1 e S2,
respectivamente, constatando que o touro 5 foi o que apresentou maior estabilidade
para o peso aos 240 dias de idade, além de apresentar a vantagem de ter um bom
desempenho.
Tabela 1. Medidas de estabilidade de cinco touros avaliados em quatro rebanhos do Brasil, de acordo
com a metodologia proposta por Huenh (1990), com os efeitos genótipos x locais.
Touros
S1
Z1i
S2
Z2i
S3
r
i
1
2
3
4
5
𝝌2 (total)
3,00
2,50
2,75
2,75
4,25
2.67
1.67
1.50
1.17
1.17
3.61582
.014124
.03178
.596752
.596752
4,86
5.33
1.67
1.58
0,92
0,92
P=0,30
8.13
0,08
0,13
0,86
0,86
10,06
2,67
1,60
1,27
1,09
0,71
P=0,04
Conclusões
A metodologia não-paramétrica utilizada é simples, porém bastante prática
para inferir acerca da estabilidade de touros, possibilitando descartar genótipos
indesejáveis, para concentrar os esforços naqueles potencialmente superiores.
CRUZ, C.D.; CARNEIRO, P.C.S. Modelos biométricos aplicados ao melhoramento genético. Imprensa
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p.195-201, 1990
MARÇAL, M.F, Estabilidade e adaptabilidade de touros Tabapuã para característica de desempenho
em função do índice de rebanhos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.66, n.1, p.195-202, 2014.
65
__________________________________________________
21. Divergência genética entre touros Tabapuã avaliados em rebanhos de
Minas Gerais
1
1
1
1
BARBOSA, J.V.B ; SILVA, I.C.P. ; PLAZAS, B.M. ; FERRAZ FILHO, P.B. ; TINO, C.R.S.
1
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul - UFMS/CPTL
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP
2
Introdução
No campo do melhoramento genético, estudos de diversidade genética entre
grupos de reprodutores têm como meta identificar vigor híbrido diferenciado, de
modo que haja maior possibilidade de recuperar genótipos superiores nas gerações
segregantes.
A fim de aproveitar melhor as vantagens fornecidas pela heterose, a
identificação de genótipos divergentes vem sendo satisfatoriamente aplicada por
meio de técnicas como analises de agrupamento e por componentes principais
(FERRAZ FILHO et al. 2006).
Apesar de fornecerem importantes informações, a análise de divergência
genética tem sido pouco empregada em programas de melhoramento genético
animal. Dessa forma o presente trabalho utilizou dados de cinco reprodutores da
raça Tabapuã, com o objetivo de comparar e avaliar a dissimilaridade entre os
animais, por intermédios das distâncias euclidianas médias, a eficiência de técnicas
de agrupamento pelo Método de Tocher, além das técnicas de análise por
componentes principais.
Objetivos
Identificar grupos de touros da raça Tabapuã, com progênies em rebanhos do
Paraná, com similaridade e dissimilaridade através das técnicas de analises
multivariadas a partir de caracteres ponderais e reprodutivos, para orientar
acasalamentos que visem à endogamia ou a heterose.
Material e Métodos
Foram realizadas análises multivariadas por intermédio de informações
obtidas do desenvolvimento ponderal de progênies de cinco reprodutores da raça
Tabapuã, em fazendas localizadas no Estado de Minas Gerais. Os dados utilizados
são oriundos das Diferenças Esperadas nas Progênies (DEPs) para peso (kg) aos
120 dias de idade, efeito materno (P120M), peso aos 120 dias, efeito total materno
(P120TM), aos 240 dias, efeito direto, (P240), peso aos 240 dias, total materno
(P240TM), peso aos 420 dias (P420), ganho de peso pré-desmama (GPRED), total
maternal de ganho de peso pré-desmama (TMGPD), ganho de peso pós- desmama
(GPPSD), Intervalo primeiro parto, em dias (IPP), intervalo entre o primeiro e o
segundo parto (INT12P) intervalo entre outros partos (IOP) e perímetro escrotal (PE).
Foram consideradas as médias de cada uma das características, obtidas das
progênies dos touros, nas análises.
As medidas de dissimilaridade foram obtidas através das distâncias
Euclidianas médias, sendo que estas foram utilizadas para a formação dos grupos
de dissimilaridade pelo Método de Otimização de Tocher. Coeficientes de
ponderação de componentes principais foram estimados para avaliar a importância
relativa dos caracteres sobre a divergência. Os dados foram processados pelo
Programa Genes – Aplicativo Computacional em Genética e Estatística, versão
Windows (CRUZ, 2001).
66
__________________________________________________
As estimativas das distâncias Euclidianas médias mostrou que a maior
dissimilaridade ocorre entre os touros 2 e 5 (distância de 0,8454) e a maior
similaridade entre os touros 3 e 4 (distância de 0.3555).
O agrupamento genético, pelo Método de Tocher, com base nas distâncias
Euclidianas médias padronizadas, permitiu o estabelecimento de 2 grupos
homogêneos de similaridade, Figura 1.
Tabela 1 – Grupos de touros da raça Tabapuã, avaliados por meio de progênies criadas em rebanhos
do Estado de Minas Gerais, estabelecidos pelo método de Tocher, com base na dissimilaridade
expressa pela distância euclidiana média padronizada.
Grupos
Touros
I
3, 4, 1 e 5
II
2
*Limite intergrupos = 0,5620
A partir da estimativa dos autovalores e autovetores, verificou-se serem
necessários os três primeiros componentes principais para explicar 97,75% da
variação total entre os touros, o primeiro explicou 44,76%, o segundo respondeu por
36,55% e o terceiro por 16,43% da variância.
Neste caso optou-se pela dispersão gráfica tridimensional (Figura 1), na qual
são considerados simultaneamente os escores dos três primeiros componentes
principais o que, confirma que os genótipos 2 e 5 apresentam a máxima diversidade
por situarem-se graficamente mais distante e os mais próximos, genótipos 3 e 4,
como as menores diversidades. A dispersão gráfica, resultante dos componentes
principais, deverá ser utilizada tanto na identificação de cruzamentos promissores
quanto aqueles cuja variabilidade disponível em gerações segregantes deve ser
restrita (CRUZ E REGAZZI, 1994).
A análise por componentes principais cujo autovalor não excedeu a 0,7 (CRUZ
E CARNEIRO, 2003), foram identificadas, em ordem crescente, as variáveis de
maior coeficiente na última função linear, PE, P240TM, P120TM, P240, GPRED,
P120M, IPP, GPPSD e INT12P, respectivamente, como passíveis de descarte.
Figura 1. Dispersão gráfica de 5 touros da raça Tabapuã, em relação aos
três primeiros componentes principais, estabelecidos pela combinação
linear de doze características incluídas na avaliação da dissimilaridade .
67
__________________________________________________
Conclusão
As estimativas de divergência genética encontrada permitem definir grupos
genéticos, permitindo que a utilização de cruzamentos envolvendo suas progênies
podem produzir ganhos significativos em função da heterose.
CRUZ, C.D. REGAZZI, A.J. Modelos Biométricos Aplicados ao Melhoramento Genético. Viçosa: UFV,
Impr. Univ., 1994. 390 p.
CRUZ, C.D. CARNEIRO, P.C.S. Modelos Biométricos Aplicados ao Melhoramento Genético.Vol. 2,
Viçosa: UFV.2003, 585p.
CRUZ, C.D. Programa Genes: versão Windows; aplicativo computacional em genética e estatística,
2001. 648p.
FERRAZ FILHO, P.B., SILVA, L.O.C., SOUZA, J.C. E MALHADO, C.H.M. 2006. Divergência genética
de touros Nelores com sêmen. Disponível em Centrais de Inseminação no Brasil. In: 43 Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia. Anais SBZ. Joao Pessoa:SBZ. Viçosa. v. 1.
68
__________________________________________________
22. Espermatogênese em Triatoma rubrofasciata (Hemiptera, Triatominae)
1
1
1
BORSATTO, K.C. ; ALEVI, K.C.C ; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
1
Introdução
Os triatomíneos são insetos hematófagos vetores da doença de Chagas. A
doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Embora seja
uma das principais doenças parasitárias da América Latina, a doença de Chagas é
negligenciada e, infelizmente, ainda não tem cura (WHO, 2014). A principal forma de
minimizar os casos da doença é por meio do controle das populações de vetores. O
conhecimento da biologia da reprodução desses insetos pode gerar subsídios para
auxiliar na profilaxia da doença de Chagas. Triatoma rubrofasciata é uma espécie
cosmopolita que já foi encontrada em, pelo menos, 45 países diferentes (GALVÃO et
al., 2003). Por ser cosmopolita, credita-se que T. rubrofasciata possa ser a espécie
ancestral do gênero Linshcosteus presente apenas na índia (HYPSA et al., 2012).
Objetivo
Assim, o presente trabalho tem como objetivo descrever a espermatogênese
de T. rubrofasciata.
Três machos adultos de Triatoma rubrofasciata foram analisados
citogeneticamente. Os insetos foram cedidos pelo “Insetário de Triatominae”,
instalado no Departamento de Ciências Biológicas, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Câmpus de Araraquara. As lâminas com o material biológico (túbulos
seminíferos) foram preparadas pela técnica de esmagamento celular e coradas com
Orceína lacto-acética. As lâminas foram analisadas ao microscópio de luz Jenaval
(Zeiss), acoplado à câmera digital e ao sistema analisador de imagens Axio Vision
LE 4.8 (Copyright ©2006-2009 Carl Zeiss Imaging Solutions Gmb H), com aumento
de 100 vezes.
Por meio da análise a espermatogênese de T. rubrofasciata, foi possível
descrever as fases da meiose e o processo de espermiogênese. Durante a prófase
inicial, observou-se um cromocentro formado pelos cromossomos sexuais e blocos
heteropicnóticos dispersos no núcleo. A presença de blocos heteropicnóticos na
cromatina do núcleo demonstra que essa espécie apresentará blocos
heteropicnóticos e heterocromáticos em alguns autossomos, assim como observado,
por exemplo, nas espécies do subcomplexo Brasiliensis (ALEVI et al., 2014). A
análise das metáfases possibilitou descrever o número de cromossomos da espécie,
a saber, 2n = 25 (22 autossomos +X1X2Y). Esse número de cromossomos é
bastante peculiar na subfamília Triatominae e diferencia T. rubrofasciata de todas as
outras espécies com o cariótipo descrito (ALEVI et al., 2013). Além disso, também foi
possível visualizar as fases de anáfases e telófase. Durante a espermiogênese, foi
possível observar todas as fases do alongamento das espermátides. Essas células
haplóides apresentaram dois filamentos heteropicnóticos esféricos. Devido a
dificuldade de coleta das espécies do gênero Linshcosteus, não existem estudos
citogenéticos desses vetores do Novo Mundo. No entanto, a análise comparativa dos
cromossomos e da meiose desses vetores seria de extrema importância para
compreender a evolução desses vetores.
69
__________________________________________________
Conclusão
Sendo assim, o presente trabalho descreve a espermatogênese da espécie e
demonstra que embora a espécie apresente um número de cromossomos peculiar
(2n = 25), o comportamento meiótico foi bastante semelhante aos outros
triatomíneos.
ALEVI, K.C.C.; ROSA, J.A.; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V. Mini review: Karyotypic survey in
Triatominae subfamily (Hemiptera, Heteroptera). Entomol. Ornithol. Herpetol, v.2, p. 106, 2013.
ALEVI, K.C.C; ROSA, J.A.; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V. Cytotaxonomy of the Brasiliensis
subcomplex and the Triatoma brasiliensis complex (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae). Zootaxa v.
3838, p. 583-589, 2014.
GALVÃO, C.; CARCAVALLO, R.U.; ROCHA, D.S.; JURBERG, J. A checklist of the current valid
species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera, Reduviidae) and their geographical
distribution, with nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa v. 202, p. 1-36, 2003.
HYPSA, V.; TIETZ, D.F.; ZRZAVÝ, J.; REGO, R.O.M.; GALVÃO, C.; JURBERG, J. Phylogeny and
biogeography of Triatominae (Hemiptera: Reduviidae): molecular evidence of a New World origin of
the Asiatic clade. Molec. Phylog. Syst. v. 23, p. 447-457, 2002.
70
__________________________________________________
23. Relação filogenética do Grupo trispinosus e seus subgrupos (Isoptera,
Termitidae, Termitinae)
PEREIRA, M.C¹; CARRIJO,T.F²; CORRÊA E CASTRO, A.C.M¹
¹Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias/UNESP
²Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo - MZUSP
Introdução
O grupo Isoptera é formado por mais de 2933 espécies, dentro de 282
gêneros e nove famílias reconhecidas atualmente (KRISHNA et al., 2013). Sendo
que 70% destas espécies ocorrem em uma única família, Termitidae (ENGEL &
KRISHNA, 2004). O gênero de cupim sul-americano Spinitermes foi hipotetizado
como parafilético na filogenia mais abrangente em número de táxons feita com
cupins até hoje (INWARD et al., 2007), com um dos seus representantes agrupados
com o gênero Cavitermes, e os demais com Dihoplotermes. Da mesma forma, a
recente revisão taxonômica do gênero corroborou os resultados encontrados pela
filogenia, verificando uma grande amplitude na variação morfológica contida neste
gênero e possibilitando a distinção de três grupos de espécies dentro de
Spinitermes.
Até 2011, eram reconhecidas seis espécies de Spinitermes: S. allognathus; S.
brevicornutus; S. longiceps; S. nigrostomus; S. robustus e S. trispinosus. Entretanto,
após uma revisão taxonômica do gênero, (CARRIJO, 2009) distribuiu estas seis
espécies em três grupos baseado em caracteres morfológicos: Grupo allognathus,
Grupo robustus, e Grupo trispinosus, que ainda pode ser divido em dois
subgrupos de acordo com as características das válvulas entéricas: subgrupo de
V.E. lisa (S. longiceps, S. nigrostomus, S. trispinosus e uma espécie nova) e
subgrupo de V.E. rugosa (S. brevicornutus). Entretanto, apesar da revisão, dentro
dos subgrupos do Grupo trispinosus existe uma variação muito grande nos
caracteres morfológicos, e a taxonomia ainda não está definida.
Objetivos
Elucidar as relações dentro do Grupo trispinosus validando a existência dos
dois subgrupos – válvula lisa e rugosa e espécies associadas aos subgrupos.
Testar molecularmente a validade das espécies pertencentes aos subgrupos
do grupo trispinosus.
Material e método
Como grupo interno serão utilizadas uma amostra de Dihoplotermes
inusitatus, uma de Cavitermes sp. e 11 amostras de Spinitermes, sendo uma
amostra do grupo robustus (S. robustus), 4 do grupo trispinosus subgrupo VE lisa,
com uma ampla distribuição geográfica (GO, MG, MT e RO) e 5 do subgrupo VE
rugosa também com ampla distribuição (MG, MS, MT e PA).
Um indivíduo de cada amostra teve o DNA total extraído com uso do kit de
extração Dneasy Blood & Tissues Kit (Qiagen). A Reação de Polimerase em Cadeia
(PCR) foi utilizada para amplificar o gene mitocondrial COII. Seguidos de purificação
e checagem em gel de agarose 1% para a verificação da presença das bandas
esperadas e sequenciamento.
A visualização da matriz de dados e eventuais equívocos de alinhamento
foram corrigidos manualmente utilizado o programa BioEdit v7.0.9.0. Para
reconstrução filogenética deste conjunto de dados foi utilizado método de análise da
parcimônia pelo programa PAUP. As topologias obtidas dessa análise foram
visualizada e editada no programa FigTree 1.3.1.
71
__________________________________________________
Vários estudos filogenéticos têm sido realizados para se entender as relações
filogenéticas de Isoptera (INWARD et al, 2007). 70% das espécies de cupins
pertencem à família Termitidae, de modo que é importante o entendimento de suas
relações filogenéticas para se entender a história evolutiva do grupo em questão. Na
filogenia proposta por Inward (2007), o Grupo-Spinitermes dentro de Termitinae é
tido como não monofilético, mas suas relações não foram bem elucidadas.
Spinitermes abriga o Grupo trispinosus que pode ser dividido em dois outros
subgrupos devido a morfologia da válvula entérica. Nossos resultados utilizando
sequências de DNA mitocondrial validam os dois subgrupos morfológicos como
distintos geneticamente, evidenciando que há variação tanto genética quanto
morfológica para validação dos destes dois subgrupos. O subgrupo de V.E. rugosa
se apresenta na filogenia como monofilético e grupo irmão de [(Cavitermes sp +D.
inusitatus) + S. robustus]. O subgrupo de V.E. lisa também é monofilético e mais
basal na filogenia molecular (Figura 1). A morfologia da válvula entérica lisa pode ser
confirmada para as espécies S. longiceps de S. trispinosus as quais formaram um
grupo também monofilético com o táxon não identificado Inward et al. (2007).
Figura 1: Filogenia molecular do Grupo Spinitermes, ênfase nos subgrupos de trispinosus
Conclusão
Assim, os resultados moleculares validam os dois subgrupos dentro do Grupo
trispinosus como também os táxons pertencentes a estes subgrupos.
CARRIJO, T.F. 2009. Revisão taxonômica do gênero Spinitermes Wasmann, 1897 (Isoptera,
Termitidae, Termitinae). Master thesis, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil: University of São Paulo,
2009.
ENGEL, M.S. & KRISHNA, K. Family-Group Names for Termites (Isoptera). American Museum
Novitates, n. 3432, p.1-9, 2004.
INWARD, D.J.G.; VOGLER, A.P.; EGGLETON, P. A comprehensive phylogenetic analysis of termites
(Isoptera) illuminates key aspects of their evolutionary biology. Molecular Phylogenetics and
Evolution, n.44, p. 953–967, 2007. doi:10.1016/j.ympev.2007.05.014
KRISHNA, K.; GRIMALDI, D.A.; KRISHNA, V.; ENGEL, M.S. Treatise on the Isoptera of the world.
Bulletin of the American Museum of Natural History, n.377, p. 1–200, 2013.
72
__________________________________________________
24. Perfil hemoglobínico como parâmetro de análise taxonômica e possíveis
inferências sobre a evolução dos Testudinidae brasileiros
1
2
1
1
1
COSTA, N. R. A. ; SILVA, T. L. ; CARDOSO, V. L. ; VENANCIO, L. P. R. ; CARROCINI, G. C. S. ;
1
BONINI-DOMINGOS, C.R.
1
2
Universidade Federal do Acre - UFAC
Introdução
No Brasil, são oficialmente conhecidas apenas duas espécies de jabutis
(Testudinidae), Chelonoidis carbonaria e C. denticulata. No entanto, estudos
recentes observaram populações de C. carbonaria divergentes entre si em relação à
haplótipos de DNA mitocondrial e características morfológicas, o que questiona as
referências vigentes de que a espécie C. carbonaria corresponda a uma única
unidade taxonômica (VARGAS-RAMÍREZ et al., 2010). Baseando-se em dados
morfológicos e citogenéticos, Silva (2011) sugeriu que um morfotipo previamente
denominado C. carbonaria* fosse, na verdade, uma nova espécie. No entanto, para
que a separação entre C. carbonaria e o morfotipo C. carbonaria* seja comprovada
de forma inequívoca, resultados de análises com outras metodologias devem ser
empregadas. O estudo do comportamento eletroforético das hemoglobinas e das
cadeias de globina consistem em uma alternativa para diferenciação entre espécies,
podendo somar novos dados aos resultados das metodologias convencionais
(SULLIVAN; RIGGS, 1967). As hemoglobinas apresentam conservação de genes em
vertebrados e seu estudo tem importância na diferenciação entre espécies, podendo
auxiliar a análise taxonômica (DESSAUER et al., 1957). Análises morfológicas,
citogenéticas e de padrão de proteínas, enriquecem os estudos taxonômicos e
geram resultados que permitem a caracterização adequada das espécies.
Objetivos
Fornecer dados à elucidação da taxonomia dos Testudinidae brasileiros, por
meio dos resultados do perfil hemoglobínico das espécies C. carbonaria, C.
denticulata e do morfotipo C. carbonaria*.
Foram coletados aproximadamente 1 ml de sangue da veia margino costal
(SILVA et al., 2012) de 15 animais provenientes do Zoológico Municipal de São José
do Rio Preto e do Zoológico Municipal de Araçatuba “Dr. Flávio Leite Ribeiro”. O
perfil hemoglobínico foi obtido por meio de eletroforese em pH alcalino em fitas de
acetato de celulose e eletroforese em pH ácido em gel de ágar-fosfato. A
quantificação das frações e confirmação do perfil eletroforético foram determinados
por HPLC. Para determinação das globinas, foram realizadas eletroforese de
cadeias polipeptídicas em pH alcalino em acetato de celulose, e em pH ácido em gel
de poliacrilamida.
Na eletroforese em pH alcalino em acetato de celulose foi possível a
visualização de diferenças no perfil eletroforético entre os três grupos avaliados. C.
denticulata diferenciou-se dos outros dois, e apresentou quatro frações, sendo duas
delas majoritárias. C. carbonaria e C. carbonaria* apresentaram seis frações, duas
delas majoritárias, mas ambas localizam-se em regiões distintas na fita de acetato
de celulose, estando uma das frações majoritárias de C. carbonaria* mais próxima
do pólo negativo sugerindo ponto isoelétrico mais eletropositivo, enquanto as duas
frações majoritárias de C. carbonaria encontram-se na porção mediana - o que
sugere que essas frações sejam mais eletronegativas. Na eletroforese em pH ácido
73
__________________________________________________
em gel de ágar-fosfato observou-se novamente diferenças no perfil de corrida
eletroforética entre C. denticulata (uma fração) e C. carbonaria e C. carbonaria*
(duas frações), mas nenhuma diferença entre as duas últimas. A cromatografia
líquida de alta performance (HPLC) permitiu a observação de cinco frações,
identificadas por picos de retenção, nas hemoglobinas de C. carbonaria e C.
carbonaria*, evidenciando semelhanças entre os dois grupos. Ambas diferenciaramse do perfil de C. denticulata, no qual foi possível observar quatro picos de retenção.
Os resultados das eletroforeses de cadeias polipeptídicas foram iguais entre todos
os grupos, o que sugere semelhança na composição das globinas para a formação
dos tetrâmeros funcionais. No perfil de cadeias polipeptídicas em pH ácido foram
observadas seis globinas, e na eletroforese de cadeias em pH alcalino, duas
globinas. No entanto, observamos a existência de uma fração a mais nos machos de
C. denticulata, totalizando três frações. Essa observação provavelmente está
relacionada a um possível padrão de dimorfismo sexual nesta espécie. Essas
divergências podem ser devidas ao fato de que as cadeias globínicas (tipo alfa e não
alfa) se unem de forma distinta em cada tetrâmero de hemoglobina, com
modificações na carga elétrica da molécula, permitindo a observação de diferenças
na eletroforese. Quando as globinas são separadas no tetrâmero, observa-se a
migração das frações alfa e não alfa globina separadamente. A composição dos
aminoácidos que compõem as cadeias globínicas não é a mesma para as globinas
alfa e não alfa, e consequentemente as diferentes combinações entre elas formam
moléculas com cargas elétricas diferentes, resultando em mobilidades diferentes
durante a corrida eletroforética. Destacamos ainda que o pH e o substrato exercem
influência sobre a corrida eletroforética, pois determinam as condições nas quais se
deseja observar o comportamento das hemoglobinas. É possível que as diferenças
entre os perfis hemoglobínicos de C. denticulata e C. carbonaria estejam
relacionadas ao ambiente em que essas espécies são encontradas: a primeira
geralmente em florestas tropicais, e a segunda em regiões de cerrado (PRITCHARD;
TREBBAU, 1984). As diferenças na conformação do tetrâmero, visualizadas nas
eletrofores em pH alcalino em acetato de celulose e em pH ácido em gel de ágarfosfato, ocorrem provavelmente de acordo com a necessidade e eficiência do
transporte de O2 ao tecidos, conforme a demanda em relação ao habitat em que as
espécies estão inseridas. C. carbonaria e C. denticulata possuem características
mais perceptivelmente distintas, tanto morfológica como molecularmente, devido ao
fato de essas espécies terem divergido há milhares de anos em um evento vicariante
ocorrido durante o Pleistoceno, que resultou na fragmentação da floresta amazônica
(VARGAS-RAMÍREZ et al., 2010). Eventos de hibridização não podem ser
confirmados neste estudo, visto que os animais utilizados são provenientes de
cativeiro e possuem origem incerta, o que também dificulta o estabelecimento
correto de fatores como idade e tempo de geração de cada animal estudado. Assim,
as diferenças observadas no perfil eletroforético de C. carbonaria e C. carbonaria*
em pH alcalino provavelmente são devidas a uma possível pressão evolutiva que
pode estar relacionada a requerimentos fisiológicos que envolvem as hemoglobinas,
bem como ao habitat desconhecido de onde os espécimes estudados originaram-se,
o que pode estar resultando na separação de C. carbonaria a outras linhagens,
como C. carbonaria*.
Conclusão
Existem diferenças na mobilidade eletroforética das moléculas de
hemoglobina entre C. denticulata, C. carbonaria e C. carbonaria* na eletroforese em
pH alcalino. A cromatografia líquida de alta performance evidenciou diferentes
74
__________________________________________________
tempos de retenção nas frações de globina de C. denticulata e C. carbonaria, mas
não entre C. carbonaria e C. carbonaria*.
O comportamento eletroforético das cadeias de globina é semelhante nos três
grupos.
Auxílio Financeiro: Universal CNPQ – Processo: 475074/2012-2
VARGAS-RAMÍREZ, M. et al. Red- and yellow-footed tortoises, Chelonoidis carbonaria and C.
denticulata (Reptilia: Testudines: Testudinidae), in South American savannahs and forests: do their
phylogeographies reflect distinct habitats? Organisms Diversity & Evolution, v.10, p.161-172. 2010.
SILVA, T.L. Estudo morfológico e citogenético em duas espécies de jabutis do gênero Chelonoidis
(Testudines). Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Animal,
para obtenção do Título de Mestre em Biologia Animal, 2011.
SULLIVAN, B.; RIGGS, A. Structure, function and evolution of turtle hemoglobins. II. Electrophoretic
studies. Comparative Biochemistry Physiology, v.23, p.449-458, 1967.
SILVA, T. L. et al. Blood Sampling in Testudinidae and Chelidae. Herpetological Review, v.43 (1),
p. 64-65, 2012.
PRITCHARD, P.C.H.; TREBBAU, P. The Turtles of Venezuela, Fundación de Internados Rurales
(Venezuela). Society for the study of Amphibians and Reptiles, p.111-117, 1984.
DESSAUER, H.C.; FOX, W.; RAMIREZ, J.R. Preliminary attempt to correlate paper-electrophoretic
migration of hemoglobins with phylogeny in Amphibia and Reptilia. Archives of Biochemistry and
Biophysics, v.71, p.11-16, 1957.
75
__________________________________________________
25. Análise da espermatogênese
(Hemiptera, Triatominae)
de
Triatoma
sordida
teratogênicos
REIS, Y.V¹; ALEVI, K.C.C¹; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V¹.
Introdução
A doença de Chagas é uma tripanossomíase causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) que afeta, principalmente, a
América do Norte. Esse protozoário é transmitido aos humanos por meio das fezes
de triatomíneos contaminados, uma vez que os triatomíneos são insetos
hematófagos que tem o hábito de defecar durante o repasto (NOIREAU et al., 2009).
Triatoma sordida é um importante vetor da doença de Chagas, pois apresenta
grande distribuição geográfica, podendo ser encontrado em, pelo menos, 13 Estados
brasileiros (GURGUEL-GONÇALVES et al., 2012) e já foi encontrado infectado em
regiões de peridomicilio e intradomicilio (DIOTAIUTI et al., 1998; SILISTINO-SOUZA
et al., 2013). Alterações morfológicas, principalmente das asas, já foram observadas
para T. sordida (CARCAVALLO et al.,1998).
Objetivo
Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar a espermatogênese de
exemplares teratogênicos de T. sordida, com o objetivo de avaliar a viabilidade dos
gametas desses triatomíneos.
Material e métodos
Foram utilizados 3 machos adultos teratogênicos da espécie T. sordida,
cedidos pelo “Insetário de Triatominae”, instalado no Departamento de Ciências
Biológicas, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Câmpus de Araraquara. Os
túbulos seminíferos dos machos adultos, depois de dilacerados e fixados na lâmina,
foram submetidos à técnica citogenética de orceína lacto-acética (DE VAIO et al.,
1985, com modificações de acordo com ALEVI et al., 2012). O material biológico foi
analisado ao microscópio de luz Jenaval (Zeiss), acoplado à câmera digital e ao
sistema analisador de imagens Axio Vision LE 4.8 (Copyright ©2006-2009 Carl Zeiss
Imaging Solutions Gmb H), com aumento de 100 vezes.
Resultados
Por meio das análises citogenéticas, algumas peculiaridades puderam ser
observadas durante a meiose dos exemplares de T. sordida, como um grande
cromocentro heteropicnótico na prófase inicial, ausência de recombinação entre
alguns homólogos no diplóteno, pontes cromatínicas na diacinese e ausência de
pareamento entre alguns cromossomos homólogos durante a metáfase, resultando
em monovalentes.
Discussões
Em 1998, Noireau e colaboradores propuseram que pudesse estar ocorrendo
um fenômeno de especiação críptica em algumas populações de T. sordida, uma
vez que os autores observaram isolamento reprodutivo entre diferentes populações.
Os autores sugeriram que havia uma divergência evolutiva recente entre as
populações, pois o índice de hibridização foi de apenas 3%.
T. sordida apresenta um conjunto diploide de 22 cromossomos (20 autossomos +
XY) (SCHREIBER e PELLEGRINO, 1950). Peculiaridades observadas no presente
estudo, como cromossomos condensados e quiasmas, presença de pontes de
cromatina entre os cromossomos em diacinese, bem como o não pareamento de
alguns cromossomos metafásicos, nunca haviam sido descritas na literatura.
76
__________________________________________________
Possivelmente, as teratogêneses e a meiose incomum sejam resultantes do
cruzamento de populações de T. sordida isoladas reprodutivamente, resultando em
uma F1 que, embora tenha conseguido chegar à fase adulta, apresente um baixo
valor adaptativo e produza gametas inviáveis.
Conclusões
A partir dos resultados observados, é possível propor que o fenômeno de
especiação críptica também esteja ocorrendo nas populações de T. sordida do
Brasil. No entanto, ressaltamos a importância de estudos nessa área a fim de
entender os mecanismos que conduzem esse fenômeno.
Referências bibliográficas
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disease in northwest São Paulo and cytogenetic analysis of its main vector, Triatoma sordida
(Hemiptera: Triatominae). Gen Mol Res v. 12, p. 5810-5819, 2013.
77
__________________________________________________________
Mestrado (GAE)
26. Estrutura populacional de Nasutitermes corniger (Isoptera: Termitidae:
Nasutitermitinae) na região Neotropical
SANTOS, A.F.¹; MORALES-CORRÊA e CASTRO, A.C.¹; CARRIJO, T.F.²; CANCELLO, E.M.²
¹Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias/UNESP
²Museu de Zoologia da USP – São Paulo
Introdução
Os cupins (infraordem Isoptera) são insetos eussociais, e desempenham
papéis importantes no ecossistema, como o de “super decompositores” e auxiliares
no balanço Carbono-Nitrogênio. Além disso, os cupins participam do processo de
ciclagem de nutrientes, formação e aeração do solo, podendo ser chamados de
“engenheiros do ecossistema” (LAWTON, 1994; LAVELLE et al., 1997).
Recentemente, Isoptera foi posicionado dentro da ordem Blattaria, assumindo
a posição de infraordem. Atualmente são conhecidos 92 gêneros e 562 espécies que
ocorrem na região Neotropical (CONSTANTINO, 2014), área deste estudo. Isoptera
apresenta nove famílias, dentre as quais Termitidae é a maior e mais diversa do
mundo, abrangendo atualmente 70 gêneros, 399 espécies e oito subfamílias. Dentre
essas, Nasutitermitinae é a subfamília mais diversa, contendo atualmente 28
gêneros e 161 espécies na região Neotropical (CONSTANTINO, 2014), e abrange a
espécie deste estudo, Nasutitermes corniger. A distribuição da espécie nessa região
é bastante ampla, abrangendo mais de 6000km de distância, desde o sul do México
ao norte da Argentina, incluindo regiões como Colômbia, Venezuela, Guiana, Brasil,
Equador e Bolívia (SNYDER, 1926; 1949; ARAUJO, 1977; TORALES e ARMUA,
1986; CONSTANTINO,1998; apud SCHEFFRAHN et al., 2005a, p. 273).
Apesar da ampla distribuição, a evolução dos cupins ainda é pouco conhecida
em relação a outros grupos de insetos eussociais. Marcadores moleculares, tanto
nucleares como mitocondriais, vêm sendo utilizados para inferência de relações
filogenéticas de Isoptera, em diferentes níveis hierárquicos, como também para a
compreensão da estrutura populacional destes insetos, obtidas através da
quantificação da variação genética dentro e entre as colônias (PAMILO et al., 1997;
ROSS, 2001).
Objetivos
Este trabalho teve como objetivo geral analisar, através de gene mitocondrial
16S rRNA, variantes populacionais de N. corniger de ocorrência no alto rio Madeira,
Rondônia, bem como compará-las com variantes populacionais de espécimes
ocorrentes em Jaboticabal, SP, Corumbá, MS, e em outras localidades – distribuídas
entre a América Central e norte da América do Sul – cujas sequências foram obtidas
no GenBank. Para verificar a possível estruturação das populações analisadas,
utilizou-se um enfoque filogeográfico, verificando se eventos recorrentes, como fluxo
gênico e/ou históricos (tais como vicariância ou expansão de área), contribuem para
a estrutura destas populações.
Foram amostradas 45 colônias de N. corniger, cujos locais de procedência
dos indivíduos estão relacionados na Tabela 1. As amostras de DNA dos indivíduos
foram extraídas utilizando-se a metodologia de Liu e Beckenbach (1992). O gene
16S rRNA foi amplificado utilizando-se PCR, de acordo com a metodologia proposta
por Legendre et al. (2008). O produto de PCR foi purificado com o kit
NucleoSpin®Geland PCR Clean-up. A amostras foram sequenciadas através do
conjunto de reagentes “Big Dye” (Perkin-Elmer) no sequenciador automático de DNA
ABI PrismTM377. Esta reação foi submetida aos mesmos ciclos da reação de
amplificação do fragmento do gene mitocondrial.
78
__________________________________________________________
Mestrado (GAE)
As sequências de nucleotídeos foram lidas no programa Chromas Lite versão
2.01, e alinhadas no BioEdit v. 7.0.9.0 pelo método ClustalWMultipleAlignment, e
através de inspeção manual. Através do programa DnaSP v. 5.10.01 estimou-se os
seguintes parâmetros: quantidade de sítios polimórficos (S); diversidade nucleotídica
(π) e haplotípica (Hd) e número médio de diferenças nucleotídicas. A análise de
similaridade genética Neighbor-joining e a distância genética entre as populações
foram obtidos com o programa MEGA v.4. Através do programa Arlequim v. 3.11, foi
realizada a análise de variância molecular (AMOVA), para a qual foram utilizados
dois grupos: um contendo todas as populações brasileiras e outro contendo as
populações estrangeiras. Para as análises filogeográficas foi utilizada a NCPA
(Nested Clade Phylogeografic Analysis). Para esta análise, uma rede haplotípica foi
obtida com o programa TCS v.1.21. Por meio do programa GeoDis v.2.5 foram
calculados os valores de Dc (distância do clado), Dn (distância do clado agrupado) e
I-T (interior-extremidade) para os clados formados na rede haplotípica. Os índices
calculados e sua significância foram testados na chave de inferência filogeográfica
de Templeton (2004).
Resultados e discussão
As populações de N. corniger analisadas demonstraram elevada diversidade
genética, observada pelo alto número de sítios polimórficos (S), número de
haplótipos, 18 no total, e alta diversidade haplotípica (Hd=0,909). De acordo com a
árvore de similaridade genética Neighbor-Joining (Figura 1), essa variabilidade
parece estar bastante individualizada pelas quatro grandes áreas de amostragem –
Jaboticabal, SP, Rondônia, Corumbá, MS e países da América Central, México,
Equador, e Suriname, pois os haplótipos encontrados nestas áreas não são
extensamente compartilhados entre si, de modo que cada uma destas áreas pode
ser caracterizada pelos haplótipos que possuem. A árvore de Neighbor-Joining
evidencia esta subdivisão populacional presente nesta espécie, quando se observa
que os grandes ramos desta topologia são formados por indivíduos de mesma
localidade geográfica, não havendo compartilhamento de haplótipos entre as
localidades. Desse modo, é possível afirmar que esta espécie se apresenta
estruturada geneticamente nas populações analisadas. A maior parte dos indivíduos
que representam os outros países formou um grupo coeso entre si, posicionado na
extremidade da árvore equivalente a um grupo externo se analisados
filogeneticamente. Este padrão de estruturação pode ser decorrente da grande
distância geográfica que os separa, de modo que outras populações intermediárias
podem ser futuramente analisadas para se corroborar ou não o resultado aqui
apresentado.
Pode-se inferir a ausência de fluxo gênico entre as grandes áreas de
amostragem, fato suportado pelos valores obtidos na análise da AMOVA. Os altos
valores significativos de Фst=0,58590 nessa análise indicam estruturação
populacional dentro das áreas, demonstrando que as populações são diferentes
geneticamente e, portanto, que não há compartilhamento haplotípico entre elas,
nesse caso. Em relação às análises filogeográficas, para o clado da rede haplotípica
que inclui todas as amostras de todas as regiões, os resultados indicaram expansão
contígua de área, colonização a longa distância ou fragmentação passada. A
amostragem não foi suficiente para discriminar entre estas três hipóteses, pois há a
necessidade de se amostrar regiões intermediárias às amostradas. Contudo, a
hipótese de expansão contígua de área é mais parcimoniosa, levando-se em conta a
ampla distribuição da família Termitidae. Além disso, sabe-se, através de outros
trabalhos, que o gênero Nasutitermes ocorre em regiões intermediárias às
amostradas.
79
__________________________________________________________
Nº do
indivíduo
88, 89, 90,
91, 92, 93,
94, 95
156, 158,
159, 161, 162
163, 164
Mestrado (GAE)
Local de procedência
Jaboticabal – SP
Ilha de Búfalos, (Porto Velho) Jaci Paraná - RO
Teotônio, Porto Velho – RO
165, 166, 167
(Porto Velho) Abunã – RO
168, 170
171, 172,
173, 174,
175, 176,
177, 178
179, 180,
181, 182,
183, 184, 185
194
Caiçara, (Porto Velho) Mutum Paraná - RO
195
Porto Rico*
196
Jamaica*
197
México*
198
Guadalupe*
199
Saint Kiss e Nevis*
200
Suriname*
201
Dominica*
202
Equador*
203
West Indies*
(Porto Velho) Mutum-Paraná/Mutum - RO
Passo do Lontra, Corumbá - MS
República Dominicana*
*Sequências nucleotídica obtidas no GenBank.
Figura 2. Árvore de similaridade genética
Tabela 1. Número dos indivíduos amostrados com seu respectivo
Neighbor-joining não enraizada.
local de procedência.
Conclusão
Verificou-se que as populações de N. corniger analisadas possuem elevada
variabilidade genética, a qual parece estar bastante individualizada nas quatro
grandes áreas de amostragem: Jaboticabal, SP, Rondônia, Corumbá, MS e países
da América Central, México, Equador e Suriname. Os haplótipos encontrados nas
áreas de estudo não são compartilhados entre si, portanto cada uma das áreas pode
ser caracterizada pelos haplótipos que possuem, demonstrando que as populações
estão estruturadas geneticamente. Para uma melhor compreensão dos fatores
filogeográficos das áreas deste estudo, deve ser feita uma amostragem das regiões
intermediárias que ocorrem entre as populações amostradas.
Auxílio Financeiro: Pró-Reitoria de Pesquisa.
LEGENDRE, F.; WHITING, M. F.; BORDEREAU, C.; CANCELLO, E. M.; EVANS, T. A.;
GRANDCOLAS, P. The phylogeny of termites (Dictyoptera: Isoptera) based on mitochondrial and
nuclear markers: Implications for the evolution of the worker and pseudergate castes, and foraging
behaviors. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 48, p. 615-627, 2008.
SCHEFFRAHN, R. H.; KRECEK, J.; SZALANSKI, A. L.; AUSTIN, J. W. Synonymy of Neotropical
arboreal termites Nasutitermes corniger and N. costalis (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), with
evidence from morphology, genetics, and biogeography. Annals of the Entomological Society of
America, v. 98, n. 3, p. 273–281, 2005 (a).
80
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
27. Análises de isoenzimas esterásicas em camarões dulcícolas do gênero
Macrobrachium (Decapoda: Palaemonidae)
1,2
1,2
1,2
1,2
LOPES, A.G ; LIMA, A.V.B ; GUERRA, A.L. ; CASTIGLIONI, L.
1
2
Centro Universitário de Rio Preto - UNIRP
Introdução
Os camarões dulcícolas do gênero Macrobrachium pertencem à Família
Palaemonídae. Com ampla distribuição geográfica, esses camarões habitam água
doce e salobra, ocorrendo em rios, lagos, represas, pântanos e estuários.
Apresentam hábitos crípticos, com maior atividade no fim da tarde e à noite,
permanecendo no período diurno em abrigos formados por fendas, buracos ou
raízes e folhas submersas. As espécies desse gênero possuem um potencial valor
econômico, pois constituem fontes de proteína animal para a dieta humana e,
também, são muito utilizadas como iscas vivas na prática de pesca esportiva. Além
dos fatores econômicos, podemos destacar a importância dos mesmos nos
ecossistemas aquáticos, onde atuam como predadores de peixes e de outros
invertebrados, ou como presas de peixes, aves, répteis etc. Entretanto, pouco se
sabe a respeito da biologia desses organismos, uma vez que os trabalhos
encontrados na literatura abordam, principalmente, aspectos ecológicos e do manejo
de espécies com potencial comercial (MAGALHÃES et al., 2005). Até o presente,
poucos estudos para a caracterização de enzimas esterásicas foram realizados em
crustáceos, mesmo sabendo-se da importância fisiológica das mesmas. As
esterases são enzimas que hidrolisam ésteres de ácidos carboxílicos, pertencentes
a uma grande família multigênica, conservada evolutivamente. Diferentes tipos de
esterases têm sido caracterizados em inúmeros organismos, desde bactérias,
insetos, aves, répteis e mamíferos (FRASCO et al., 2006; GUNNING, 2006). Outro
aspecto importante é a problemática taxonômica existente entre M. jelskii e M.
amazonicum, os quais são espécies sintópicas e morfologicamente muito
semelhantes.
Objetivos
O presente trabalho teve como objetivo geral estudar a variabilidade genética
de três espécies de camarões de água doce, pertencentes ao gênero
Macrobrachium (M. jelskii, M. amazonicume, M. brasiliense), utilizando-se o padrão
de isoenzimasesterásicas envolvendo órgãos como: cérebro, olhos e gônadas.
Como objetivos específicos, pretendeu-se: caracterizar o padrão isoenzimático das
esterases nas três espécies em questão; obter os padrões de esterases sexoespecíficos e órgão-específicos e inferir seus prováveis papéis fisiológicos; obter
resultados pioneiros acerca da variabilidade genética das mesmas, as quais
permitirão, futuramente, a aplicação de outras metodologias.
As amostras de M. jelskii (Mj) e M. amazonicum (Ma) analisadas no presente
estudo foram coletadas na Represa Barra Mansa, Mendonça, SP (21º14’27”S e
49º56’28”W). As amostras de M. brasiliense (Mb) foram coletadas no córrego
Talhadinho, em Talhados, SP (20º47’07”S e 49º20’35”W). Nas coletas foram
utilizadas peneiras (2mm de diâmetro), passadas sob a vegetação subaquática e
marginal. Os animais coletados foram armazenados em caixas de isopor e, então,
transportados para o Laboratório de Zoologia da UNIRP, onde foram identificados
segundo Melo (2003). Após a identificação e a separação por sexo, as amostras
foram dissecadas e os órgãos congelados, para posterior análise. Os órgãos
analisados foram cérebro, gônadas e olhos provenientes de 90 indivíduos de cada
81
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
espécie (30 machos e 60 fêmeas). Os procedimentos para a eletroforese foram os
desenvolvidos de acordo com a técnica descrita por Ceron (1988). Após a corrida,
os géis foram pré-incubados por 1 hora em 100 ml de tampão fosfato 0,1M pH 6,2, à
temperatura ambiente. Após a remoção do tampão, foi adicionada uma solução de
coloração contendo 60 mg de -naftilacetato, 40 mg de -naftilacetato, 120 mg de
Fast Blue RR em 100 ml de Tampão Fosfato 0,1M pH 6,2, por 1 hora, na ausência
de luz. Em seguida, os géis foram tratados por 24 horas com solução descorante
(etanol-ácido acético) e mantidos em recipientes plásticos contendo solução
conservante (glicerina-ácido-acético), para a documentação fotográfica ou
aguardando o processo de secagem. Para a realização destes testes, foram
utilizados os seguintes inibidores: malathion (0,4mM), pOHMB (parahidroximercuribenzoato, 1mM) e sulfato de eserina (1 mM). As concentrações
utilizadas foram padronizadas previamente, e estão de acordo com dados da
literatura, descritos por diversos autores (LIMA-CATELANI et. al., 2004;
CASTIGLIONI; BICUDO, 2005). Para as comparações das freqüências das bandas
esterásicas entre fêmeas e machos das três espécies analisadas e, também para as
comparações interespecíficas, foi utilizado o teste de Qui-quadrado (X2), com nível
de significância de p< 0,05.
Com relação ao padrão esterásico observado no cérebro, foram visualizadas
11 bandas esterásicas nas três espécies, denominadas EST1 a EST11, a partir da
extremidade mais anódica do gel. Não foram observadas diferenças qualitativas na
presença de bandas interespecíficas, e nem quanto ao sexo. Essas diferenças
existem apenas nas freqüências das mesmas. As bandas que apresentaram
maiores freqüências foram a EST3, EST5 e EST6, nas três espécies, com variação
de 60,00% a 93,33%. As bandas EST7, EST8, EST9, EST10 e EST11 apresentaram
freqüências um pouco menores, variando de 30,00% a 86,66%. Já as bandas EST1,
EST2 e EST4 apresentaram as freqüências mais baixas, com variação de 6,66% a
30,00%. Com relação ao padrão esterásico observado no olho, foram visualizadas
11 bandas nas três espécies analisadas, com diferenças na ocorrência das mesmas:
9 bandas em Mj, 8 em Ma, e 7 em Mb. Denominadas EST1 a EST11, a partir da
extremidade mais anódica do gel. As diferenças qualitativas interessantes foram
detectadas entre as três espécies. Com relação às bandas exclusivas, podemos
destacar EST2 e EST3 exclusivas de Ma, com freqüências que variaram de 33,33%
a 40,00% e 20,00 a 26,66%, entre machos e fêmeas, respectivamente para as duas
bandas; a banda EST9 exclusiva de Mj, com variação de 13,33% a 20,00%, em
machos e fêmeas, respectivamente; a ausência da banda EST1 em Ma, sendo a
mesma encontrada nas outras espécies, com variação de 33,33% a 53,33%;
ausência de EST8 nesta mesma espécie, está sendo encontrada nas outras duas
espécies, com baixa freqüência (variando de 10,00% a 13,33% em machos e
fêmeas de Mj, respectivamente, e de 20,00% a 26,66% machos e fêmeas de Mb,
respectivamente); e, ainda, ausência de EST4 em Mb sendo a mesma encontrada
em frequências moderadas nas outras duas espécies (20,00% em Mj, para ambos
os sexos e com variação de 30,00% a 33,33% em machos e fêmeas de Ma,
respectivamente). Algumas bandas esterásicas apresentaram 100,00% de
freqüência nas amostras analisadas, para ambos os sexos: EST5 e EST7 nas três
espécies, para ambos os sexos, e a EST6 também nas três espécies, para ambos
os sexos, exceto em fêmeas de Mj (93,00%). Também com alta freqüência podemos
destacar as bandas EST10 e EST11 (90,00% nas três espécies, para ambos os
sexos). Quanto ao sexo, não foram observadas diferenças qualitativas na presença
de bandas. Essas diferenças existem apenas nas freqüências das mesmas. Nas
82
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
gônadas analisadas foram detectadas 11 bandas esterásicas, nas três espécies
analisadas. Denominadas EST1 a EST11. Não foram observadas diferenças
qualitativas interespecíifcas. As diferenças existem apenas quanto às freqüências
das mesmas.A banda EST3 foi encontrada em 100% dos indivíduos analisados, nas
três espécies. As demais bandas apresentaram frequências variadas: as bandas
EST4 e EST5 variaram de 46,66% a 93,33%; com frequências médias encontramos
as demais bandas (EST1, EST2 e EST6), variando de 10,00% a 73,33%. As bandas
EST7 à EST11 foram encontradas apenas nas fêmeas das três espécies analisadas,
com frequências que variaram de 26,66% a 73,33%. No cérebro foram detectadas
onze bandas esterásicas, encontradas em ambos os sexos, nas três espécies
analisadas. Os dados relacionados ao uso de inibidores mostraram que todas as
bandas analisadas (EST3, EST5, EST6 a EST11) podem ser classificadas como
sendo colinesterases, uma vez que todas foram sensíveis ao malathion e ao sulfato
de eserina, independentemente do grau de inibição das mesmas. Na estrutura
ocular foram observadas onze bandas esterásicas, encontradas em ambos os
sexos, mas com variações interespecíficas. Os dados relacionados ao uso de
inibidores mostraram que todas as bandas analisadas podem ser classificadas como
colinesterases, uma vez que todas foram sensíveis ao malathion. Nas gônadas dos
machos e fêmeas analisados foram detectadas onze bandas esterásicas. Quanto ao
padrão de inibição, para as três espécies analisadas, as bandas EST1 (exceto em
Mb, não detectada nestes experimentos devido à baixa freqüência), EST5, EST8 e
EST9 foram inibidas de moderada a totalmente pelo pOHMB, indicando serem
arilesterases. No presente trabalho, apesar do alto polimorfismo verificado nas três
espécies analisadas, poucas variações interespecíficas foram detectadas.
Provavelmente este achado esteja relacionado à importância fisiológica destas
enzimas, uma vez que as mesmas são conservadas evolutivamente e, também, à
maior proximidade genética entre Mj e Ma e a menor entre essas duas espécies em
relação a Mb. As comparações interespecíficas dos valores de X2 mostraram que as
diferenças nas freqüências das bandas esterásicas são significativas em todos os
órgãos analisados, com exceção de apenas da estrutura ocular.
Conclusão
O alto grau de polimorfimoesterásico evidenciado no presente trabalho requer
novos estudos capazes de aprofundar o conhecimento a cerca dos aspectos
bioquímicos, genéticos e evolutivos que controlam a expressão dos genes
pertencentes à família das esterases nestas espécies.
Auxílio Financeiro: FAPESP
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Haematobiairritans (horn fly) populations, by RAPD-PCR.Genetica, v. 124, p. 11-21, 2005.
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MELO, G.A.S. Manual de identificação dos Crustacea Decapoda de água doce do Brasil., 2003.
83
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
28. Morfometria do edeago e da asa em populações de Drosophila sturtevanti
do bioma Mata Atlântica de Santa Catarina
1
TRAVA, B.M. ; MADI-RAVAZZI, L.
1
UNESP/IBILCE
1
Introdução
A diferenciação populacional é uma etapa fundamental do processo de
especiação. Dois marcadores morfológicos têm sido amplamente utilizados nesse
tipo de abordagem em populações de espécies de Drosophila, que são o edeago e a
asa. O edeago constitui uma das estruturas da terminália mais importantes para
diagnóstico de muitas espécies do grupo, além de apresentar evolução muito rápida
e divergente quando comparada com outras características morfológicas (SOTO et
al, 2007). O desenvolvimento da asa tem sido amplamente estudado e é
relativamente bem compreendido (DE CELIS, 2003) e apresenta altos níveis de
plasticidade fenotípica em relação a diferentes fontes de variação ambiental
(CARREIRA et al., 2008; SOTO et al., 2008). Drosophila sturtervanti, subgrupo
sturtevanti, grupo saltans, apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde
o do México ao sul do Brasil e nas ilhas Caribenhas. Mecanismos pré e pós
zigóticos foram encontrados atuando entre as espécies desse subgrupo
(BICUDO,1979; HOSAKI-KOBAYASHI E BICUDO, 1997) e um isolamento sexual
incipiente entre linhagens geográficas de D. sturtevanti foi obtido por DOBZHANSKY
(HOSAKI-KOBAYASHI E BICUDO, 1994). Dados preliminares, obtidos no nosso
grupo de pesquisa têm indicado uma variação considerável da forma do edeago em
populações de D. sturtevanti que pode estar relacionada com a estruturação
populacional dessa espécie.
Objetivo
Avaliar a estrutura populacional de Drosophila sturtevanti em domínios da
Mata Atlântica utilizando marcadores morfológicos
Neste trabalho foram analisados amostras de D. sturtevanti de três
populações naturais localizadas em Santa Catarina (Reserva Biológica Estadual do
Aguaí – AG, Piraí – PI e Ribeirão da Ilha – RI). A identificação da espécie foi
realizada pela análise do edeago. As asas direitas e os edeagos são
correspondentes de 35 indivíduos de cada população que foram utilizados nas
análises. As lâminas contendo as asas foram fotografadas no microscópio
estereoscópico (Leica MZ16) e os edeagos no microscópio (Leica DM 4000B). As
análises morfométricas das asas foram realizadas utilizando o programa MorphoJ
(KLINGENBERG, 2011), obtendo as diferenças de tamanho e forma da asa pela
ANOVA, as distâncias de Procruste entre as populações e a análise das variáveis
canônicas (CVA). Para a análise morfométrica do edeago foi utilizado o programa
SHAPE v1.3, sendo possível avaliar o contorno de formas baseadas em Descritores
Elípticos de Fourier (DEFs) (KUHL E GIARDINA, 1982). Após a determinação dos
componentes principais (PCs), os valores encontrados foram submetidos ao teste de
normalidade de Shapiro-Wilk (W). Os PCs com distribuição normal foram analisados
por meio da ANOVA e aqueles que não apresentaram tal distribuição foram
analisados utilizando o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. A análise de
agrupamento Mclust foi realizada pelo programa R para o edeago.
84
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Doutorado (GAE)
Variação do Tamanho e na Forma da Asa e da Forma do edeago
A ANOVA revelou diferença significativa no tamanho das asas entre as três
populações de D. sturtevanti (F=5,37; p=0,0053). Na análise da forma das asas
também foi observada diferença significativa entre as populações (F=2,48;
p<0,0001). Na análise da forma do edeago, cinco PCs foram eficazes e descreveram
91,7% da variação total. A análise de normalidade dos dados mostrou que PC1,
PC2, PC3 e PC5 apresentaram distribuição normal, sendo analisados por ANOVA,
enquanto PC4, que não apresentou distribuição normal, foi analisado pelo teste de
Kruskal-Wallis. Sendo significativos PC1 e PC4 (<0,0001 e 0,006).
As populações apresentaram diferenças significativas para o tamanho e para
a forma de suas asas e para a forma de seus edeagos, o que corrobora o poder
taxonômico destes caracteres morfológicos, que já havia sido demonstrado para
outras espécies de Drosophila (SHORROCKS, 1972), inclusive para espécies
crípticas.
Distância de Procrustes e Análise das Variáveis Canônicas das Asas
Os maiores valores de distância de Procrustes foram observados entre as
populações de Aguaí e Piraí e Aguaí e Ribeirão da Ilha (0,0072 e 0,0075,
respectivamente) e, a menor distância foi encontrada entre Ribeirão da Ilha e Piraí
(0,0058), todas significativas (p<0,01). Para a análise das variáveis canônicas, os
valores médios de CV1 e CV2 representaram 78,93% da variância total da forma
entre as populações. A distribuição de cada população no espaço das variáveis
canônicas mostrou que, para CV1, Aguaí apresenta um deslocamento do
posicionamento dos marcos 5 e 6 quando comparada com as demais populações.
Sendo possível reconhecer diferentes formas da asa em compartimentos distintos,
onde os indivíduos de D. sturtevanti de Aguaí demonstraram uma maior distância e
diferenciação quando comparada entre os indivíduos das demais populações na
Região Intervenal D (IVRD) localizada perto da região distal da asa. Estes resultados
também foram obtidos por Cavicchi e colaboradores (1985) para D. melanogaster, o
qual demonstrou que a parte posterior da asa exibe uma resposta plástica para a
variação na temperatura do ambiente. Quando há movimentação das veias
transversais, como ocorreu nos marcos anatômicos equivalentes ao marco 4 e 5, em
direção à porção proximal da asa ou em direção à porção mais distal, está
relacionado à variação de temperatura como também observado nos estudos com
D. cardini (RIBEIRO et al, 2014) e D. melanogaster (DEBAT et al, 2009).
Análise de agrupamento MCLUST
A análise de agrupamento MCLUST, realizada para verificar a existência de
estruturação morfológica nos edeagos de D. sturtevanti sem uma suposição a priori
da existência de qualquer agrupamento , resultou em quatro modelos que melhor
explicaram a dispersão dos dados para a forma
. Estes modelos foram : " EEE":
distribuição elipsoidal ; volume, forma e orientação iguais; "EEV": distribuição
elipsoidal; volume e forma iguais; "EVI": distribuição diagonal; volume igual e forma
variável, e; "VVI": distribuição diagonal ; volume e forma variáveis . Dentre estes
agrupamentos, observa-se seis grupos reconhecidos a partir da variabilidade
morfológica total dos edeagos analisados onde o maior número de indivíduos de
Piraí (14) e Ribeirão da Ilha (11) foram agrupados no grupo 1, e a maioria dos
indivíduos de Aguaí (10) foram agrupados no grupo 4 conforme mostra a tabela. A
variação no tamanho e forma do edeago de diversas espécies de Drosophila pode
ser influenciada pela temperatura e o tipo de substrato larval, o que poderia ser
responsável pelos resultados encontrados (SOTO et al, 2007).
85
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Doutorado (GAE)
Conclusão
As populações de Drosophila sturtevanti analisadas diferem significativamente
uma maior diferenciação em comparação com as populações de Ribeirão da Ilha e
Piraí. A variação observada pode estar relacionada a diferentes pressões seletivas
das populações ou apenas uma plasticidade fenotípica dos caracteres analisados.
Isso deverá ser analisado juntamente com novos estudos com marcadores
moleculares e do isolamento reprodutivo para um melhor entendimento da estrutura
dessas populações.
Auxílio Financeiro: FAPESC, CNPq.
BICUDO, H.E. M.C. Reproductive isolation in the saltans group of Drosophila. IV. The sturtevanti
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86
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
29. Identificação de novo, caracterização e anotação dos elementos de
transposição no genoma da broca-do-café (Hypothenemus hampei)
1
2
2,3
HERNÀNDEZ, E. M ; BENAVIDES , P; NAVARRO L. ; CARARETO, C. M. A.
1
2
Centro Nacional de Investigaciones del Café, CENICAFÉ. Colombia.
3
Department of Entomology, Purdue University. EUA.
1
Introdução
A Broca-do-Café (bdC) Hypothenemus hampei (Ferrari) é a praga mais
devastadora da produção cafeeira já que gera uma redução na produção e
qualidade da bebida. Seu estrago principal é sobre o grão do café o qual é o produto
comercial do cultivo, o qual gera perdidas econômicas que perdidas anais que
excedem os U$500 milhões, afetando mais de 20 milhões de famílias agricultoras
em cerda de 80 países. O comportamento da BdC é caracterizado pela endogamia e
por conseguinte tem uma variabilidade genética baixa, embora isto não tenha sido
uma limitante para sua bem-sucedida colonização em cultivos novos e sua
dispersão por todos os países produtores de café. Devido a sua importância como
praga para o café, o Centro Nacional de Pesquisa do Café (Cenicafé) na Colômbia
iniciou o projeto do genoma da espécie o qual ainda esta em curso e do qual esta
pesquisa faz parte. Uma fração importante e altamente diversa dos genomas está
representada pelos elementos de transposição (TEs), que são sequências ubíquas
de DNA com a capacidade de se movimentar e de se propagar de um local para
outro no genoma e são classificados em duas classes principais em base a se
precisam de um passo de transcrição reversa (Classe 1) o se não (Classe 2). Os
TEs como entidades dinâmicas que são têm efeitos relevantes no genoma
hospedeiro que vão desde efeitos deletérios por interrupção de genes durante o
processo de inserção, passando por mudanças no tamanho do genoma pela
propagação deles, até ser parte importante na regulação genômica e geração de
diversidade genética adaptativa; por outro lado, como os TEs estão distribuídos por
o genoma tudo, os padrões de inserção gerados constituem uma fonte poderosa de
marcadores para análises genéticos de diversidade, inclusive no âmbito intrapopulacional. A baixa variabilidade genética da BdC poderia ser um indicador de
uma reduzida capacidade de resposta a novas estratégias de controle genético e o
conhecimento do "mobiloma" em esta espécie ganha importância como contribuição
para o entendimento futuro da sua influencia na estrutura e função do genoma.
Objetivo
Construir uma biblioteca de sequências de referencia dos TEs especifica da
espécie e classificá-los hierarquicamente em ordem, superfamílias e famílias de
elementos.
Anotar os elementos de transposição no genoma da broca-do-café e avaliar a
frequência, distribuição e variação estrutural dos TEs.
O rascunho do genoma da BdC procede do sequenciamento de alto
desempenho 454-FLX de reads únicos e pareados, assim como do sequenciamento
Illumina baseado em tags de BACs. A montagem tem 218.3Mb representados em
25,643 scaffolds com tamanho médio de 8,511pb, um N50 de 27,956 e um conteúdo
de 38% de GC.
A identificação dos TEs de referência foi feita por meio de análises estruturais
e por homologia. Estruturalmente a procura de repetições terminais longas (LTRs)
para os LTR-Retrotransposons foram feitas com LTRharvest e a suas sequências
87
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
internas anotadas com LTRdigest usando modelos protéicos pHMMs. Foram
identificadas as ORFs dos elementos e com BLASTp corroborados os domínios das
proteínas da maquinaria de transposição. Apos, para classificação das sequências
em superfamílias, foram clusterizadas sob critério 80-80-80 em nível de nucleotídeos
e distancia p em aminoácidos.
A busca da presença de transcriptase reversa, endonuclease e ribonuclease
com posterior alinhamento das sequências com estes domínios foram feitas para a
identificação dos NLTR-retrotransposons e a clusterização baseada em similaridade
nucleotídica e protéica foi realizada para obtenção das sequências consenso. A
classificação nos diferentes clados de NLTRs foi feita por relação filogenética com
os elementos presentes na base de dados Repbase.
Elementos de DNA não autônomos (MITEs e DNA transposons degradados)
foram identificados estruturalmente pela presença de repetições terminais invertidas
(TIRs) e baseados em estas sequências suas contrapartes autônomas foram
procuradas pela presencia de domínios associados com a enzima transposase.
Igualmente, as sequências identificadas foram agrupadas pela sua homologia em
nucleotídeos e sequência traduzida em aminoácidos.
As sequências com estrutura similar a Helitrons foram identificadas com
ferramentas bioinformáticas específicas para este tipo de TEs. A anotação do
genoma foi realizada usando RepeatMasker e análise de elementos possivelmente
ativos foi feita.
A biblioteca de sequências de referência foi conformada por 53, 14 e 7
famílias para as superfamílias dos LTR-retrotransposons Gypsy, Bel-Pao e Copia,
respectivamente, estes elementos junto com duas sequências similares a DIRS
conformaram um 46% da biblioteca.
Os NLTR-retrotransposons representaram o 20% dos elementos presentes na
biblioteca e incluíram 78 sequências consenso nos diferentes clados com
predomínio dos clados R1 e Jockey, mas incluindo nove dos 12 clados que são
geralmente encontrados em insetos.
A maioria dos transposons identificados pertence à superfamília Tc1-Mariner
com 36 sequências representativas e das sequências pequenas e não autônomas
MITEs, 104 sequências foram agrupadas em 38 famílias.
O conteúdo de TEs em Hypothenemus hampei cobrem uma porção genômica
de 18.1Mb correspondente ao 8,2% do total do genoma. A fração mais importante
de elementos é conformada por MITEs atingindo quase o 50% do conteúdo total de
TEs. Os elementos mais frequentes na biblioteca de repetições foram os LTRsretrotransposons, no entanto, estas sequências representam o 16,7% do total do
mobiloma da BdC.
A maioria dos elementos encontra-se em alto grado de deterioração indicado
pelo grande numero de fragmentos isolados e os graus de divergência em relação
às sequências de referencia.
Conclusão
A proporção de TEs encontrada no genoma é similar ao conteúdo reportado
para as espécies de coleópteros com genoma sequenciado (Tribolium castaneum e
Dendroctonus ponderosae). A pesar do baixo conteúdo de TEs, o genoma da BdC
apresenta uma alta diversidade de elementos e superfamílias, embora que a maioria
das sequências estão degeneradas foi possível identificar elementos com pelo
menos uma copia intacta estruturalmente o qual sugere transposição recente e
consequentemente atividade.
88
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
Auxílio Financeiro: Este trabalho é desenvolvido com o apoio dos processos
2013/15070-4 da linha de fomento Auxílios a Pesquisa e 2012/24813-8 da linha de
fomento Bolsa Doutorado.
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89
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
30. Reorganização do genoma durante a evolução do grupo pallescens (Hemiptera,
Triatominae)
1
1
ALEVI, K.C.C ; AZEREDO-OLIVEIRA, M.T.V.
1
Introdução
Os triatomíneos são insetos hematófagos vetores da doença de Chagas. A
subfamília Triatominae é composta por seis tribos (GALVÃO et al., 2003). A tribo
Rhodniini é composta por 22 espécies, sendo 19 do gênero Rhodnius e três do
gênero Pasammolestes. As espécies do gênero Rhodnius foram dividas em três
principais grupos: pallescens, prolixus e pictipes. R. colombiensis, em conjunto com
R. pallescens e R. ecuadoriensis formam o grupo monofilético pallescens (ABADFRANCH et al., 2009, DÍAZ et al., 2014). Abad-Franch and Monteiro (2007)
propuseram que análises citogenéticas entre as três espécies que compões o grupo
pallescens poderia auxiliar no entendimento da evolução do grupo.
Objetivo
Assim, o presente trabalho descreve o padrão de heterocromatina nas três
espécies do grupo pallescens, com ênfase na evolução cromossômica do grupo.
Três machos adultos de cada espécie (R. colombiensis, R. pallescens e R.
ecuadoriensis) foram analisados citogeneticamente. Os insetos foram cedidos pelo
“Insetário de Triatominae”, instalado no Departamento de Ciências Biológicas, da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Câmpus de Araraquara. As lâminas com o
material biológico (túbulos seminíferos) foram preparadas pela técnica de
esmagamento celular e coradas com Bandamento C. As lâminas foram analisadas
ao microscópio de luz Jenaval (Zeiss), acoplado à câmera digital e ao sistema
analisador de imagens Axio Vision LE 4.8 (Copyright ©2006-2009 Carl Zeiss Imaging
Solutions Gmb H), com aumento de 100 vezes.
Por meio da análise citogenética das metáfases meióticas, foi possível
descrever o padrão de heterocromatina das espécies do grupo pallescens. R.
pallensces, apresentou blocos heterocromatina em uma ou ambas extremidades de
todos os autossomos, R. colombiensis apresentou blocos C nas extremidades em 5
pares de autossomos e R. ecuadoriensis não apresentou blocos heterocromáticos
nos autossomos. Acredita-se que R. colombiensis e R. ecuadoriensis derivaram de
R. pallensces, sendo que a primeira divergência está associada ao Istmo do
Panamá (mais recente) (DÍAZ et al., 2014) e a segunda com o surgimento dos
Andes no Plioceno (mais antigo) (ABAD-FRANCH et al., 2009). Assim, durante a
especiação, ocorreu perda de heterocromatina nos autossomos desses insetos.
Panzera et al. (2004) sugere que a perda de heterocromatina está relacionada com
mudanças adaptativas do genoma que contribuem para a sobrevivência, reprodução
e dispersão para novos ambientes.
Conclusão
Sendo assim, o presente trabalho demonstra que durante a especiação de
colombiensis e R. ecuadoriensis a partir de R. pallensces ocorreu perda de
heterocromatina. Propomos que esse fenômeno esteja relacionado com o processo
de adaptação das espécies aos novos ambientes.
90
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
GALVÃO, C.; CARCAVALLO, R.U.; ROCHA, D.S.; JURBERG, J. A checklist of the current valid
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91
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
31. Caracterização molecular de Chrysoperla externa (Hagen,
(Neuroptera: Chrysopidae) por meio de sítios de restrição no gene COI.
1
2
BARBOSA, N.C.C.P. ; SILVA, N.I.O. ; CORRÊA E CASTRO, A.C.M.
1
2
Universidade Federal de Alfenas - UNIFAL-MG
3
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP/FCAV
1861)
1,3
Introdução
Os crisopídeos são insetos predadores e suas larvas se alimentam de
diversas espécies consideradas pragas agrícolas. No Brasil ocorrem quatro espécies
do gênero Chrysoperla, sendo C. externa a mais frequente (FREITAS, 2001). Sua
identificação é baseada em caracteres morfológicos e, muitas vezes, é incerta,
devido à grande semelhança dos mesmos (BROOKS; BARNARD, 1990).
A utilização de técnicas moleculares, como RFLP, vem sendo empregada
para estudos de taxonomia molecular de diversas espécies de insetos, incluindo
crisopídeos (CLARK, et. al., 2001; LUCHETTI; MANTOVANI; TRENTINI, 2005;
MURAJI; NAKAHARA, 2002; CADENA et. al., 2007), utilizando-se diferentes genes.
Desse modo, conhecer as características genéticas de cada espécie se torna
importante na escolha dos genes mais adequados para estudos taxonômicos de um
grupo.
Objetivo
Este trabalho teve como objetivo geral, realizar a caracterização molecular de
C. externa, utilizando os sítios de restrição presentes no gene mitocondrial citocromo
oxidase subunidade I (COI), a fim de auxiliar estudos amplos de taxonomia
molecular de crisopídeos.
A espécie C. externa foi analisada por meio de 477 sequências do gene
mitocondrial COI, a partir de espécimes provenientes de 118 localidades brasileiras,
distribuídas nos estados de SP (107), MG (7), PR (2), GO (1) e RN (1) e uma
localidade no Paraguai. A região mitocondrial analisada, com 730pb, corresponde ao
segmento de 2255bp a 2985bp do genoma de referência de Chrysoperla
nipponensis (Okamoto, 1914) (número de acesso AP011623). Os haplótipos foram
submetidos à digestão virtual com a ferramenta NEBcutter V2.0
(http://tools.neb.com/NEBcutter2/).
Foram observados 66 padrões de restrição para C. externa, formados por 43
enzimas diferentes. Destes padrões, o mais frequente incluiu 76 haplótipos (364
sequências), enquanto os demais compreenderam de um a seis haplótipos cada. O
padrão mais frequente apresentou sítios para 31 enzimas (Figura 1), os quais
estavam presentes em pelo menos um padrão dentre os demais, não havendo
nenhum sítio exclusivo do padrão mais frequente. Neste padrão, 15 enzimas
apresentaram apenas um sítio por sequência, enquanto o sítio reconhecido pela
enzima MluCI (^AATT_) apareceu 15 vezes na mesma sequência.
92
_________________________________________________________
Doutorado (GAE)
Figura 1: Mapa representando o padrão de restrição mais frequente para o gene COI de
Chrysoperla externa. A: comprimento da sequência; B-E: sítios de restrição e respectivas
enzimas.
Apenas quatro sítios foram compartilhados por todas as sequências, sendo
um reconhecido pela enzima AluI na posição 312 e os demais pela enzima MluCI
nas posições 55, 228 e 474.
Vinte e seis padrões diferiram do mais frequente pela ausência de um a sete
sítios, 16 diferiram pela presença de um a cinco novos sítios e 22 por ausência de
um a cinco sítios e presença de um a quatro sítios extras. As doze enzimas que não
foram observadas no padrão mais frequente (Acc65I, AciI, BseYI, BspGI, BssIMI,
CdiI, EcoRI, EcoRV, EsaSSI, HaeIII, HindIII, KpnI) apresentaram um sítio cada e
formaram 10 padrões de restrição.
Não houve correlação entre a distribuição geográfica e o padrão de restrição
apresentado pelos haplótipos, de modo que o padrão de restrição mais comum, bem
como o haplótipo mais frequente, aparecem distribuídos por todas as localidades
amostradas.
Os padrões de restrição mostraram-se semelhantes, diferindo em poucos
sítios e/ou enzimas em relação ao padrão mais frequente. Além disso, muitos
padrões incluíram apenas um haplótipo, o qual era representado por um espécime,
de modo que o grande número de padrões foi formado por haplótipos exclusivos e,
portanto, mais raros.
Conclusão
O padrão de restrição mais frequente representa de forma satisfatória o
padrão da espécie, uma vez que engloba o maior número de haplótipos e, dentre
eles, os mais frequentes, os quais estão distribuídos em todas as regiões
amostradas. Além disso, o padrão mais frequente foi obtido por meio das enzimas
que reconhecem sítios de restrição no maior número de haplótipos, apresentando
poucos sítios distintos em relação aos demais.
Auxílio Financeiro: CNPq e FAPESP (processo nº 2006/03494-0).
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93
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Doutorado (GAE)
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94
Genética Humana e Médica
(GHM)
_________________________________________________
Iniciação Científica (GHM)
32. Estudo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg em uma população do Sudoeste
do Paraná, utilizando o gene do tipo sanguíneo (sistema ABO)
1
ROSA, F. M. C .; MENIN, L. E.; CUTCHMA, T. R.; PONTES, L. J. P. O.; STURMER, S.; PERETTO,
1*
E.; BATTISTI, L.; LOCATELI, B. T.; BERLATTO, A. F.; GHISI, N.C .
1
Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), Câmpus Dois Vizinhos
Introdução
A cidade de Francisco Beltrão fundada em 1951 e situa-se na região
sudoeste do Paraná. Os registros mostram que desde o século XIX, esta região já
era habitada por indígenas, caboclos e também argentinos interessados na riqueza
natural – erva-mate e madeira, além de refugiados maragatos, desempregados sem
terra da Ferrovia São Paulo – Rio Grande e, mais tarde, derrotados da Guerra do
Contestado (SILVA 2010). O povoamento se efetivou em 1943 no bairro conhecido
como Cango, onde muitas famílias de agricultores foram estabelecidas. Estas
receberam ofertas de terra e suporte para a produção agrícola, com isso, houve a
construção de barracões às margens do Rio Marrecas. Devido à valiosa reserva
florestal nativa, os migrantes descendentes ítalo – germânicos tomaram posse das
terras, grande parte vinda dos estados de Santa Catarina e do Rio Grande do Sul
(SILVA, 2010).
Em populações regionais diversas como a do sudoeste do Paraná, sabe-se
que existem numerosos polimorfismos nos componentes do sangue humano. O
sistema sanguíneo ABO é considerado o mais importante na prática transfusional
(BATISSOCO, 2003). Este foi descoberto por Landsteiner no começo do século XX,
que atribuiu quatro tipos ao sangue humano: A, B, AB e O (THOMPSON et al.,
1993). É possível determinar o fenótipo ABO, com reagentes imuno-hematológicos,
através da detecção sorológica, onde ocorre a identificação dos açúcares
específicos das hemácias (BATISSOCO, 2003). Os grupos sanguíneos ABO são
controlados por um único gene no cromossomo 9 (locus 9q31.3-qter), e são
representados por três alelos, dois co-dominantes (IA e IB) e o terceiro recessivo (i).
As proporções relativas dos tipos A, B, AB e O diferem nas diversas populações, por
exemplo, o alelo IB é comum em asiáticos, mas ausente nas populações americanas
nativas (THOMPSON et al., 1993).
Usando-se o teorema de Hardy-Weinberg, é possível estimar as frequências
populacionais dos alelos do sistema ABO, a partir do conhecimento da distribuição
fenotípica, isto é, de seus grupos sanguíneos. Essas estimativas podem ser obtidas
com o emprego do método de verossimilhança máxima proposto por Bernstein
(1924,1925,1930). Desta forma, os dados dos tipos sanguíneos ABO podem ser
utilizados para verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg em determinado grupo
de pessoas. Este equilíbrio preconiza que: “caso não existam fatores evolutivos
atuantes na população, as frequências alélicas se mantém inalteradas e as
proporções dos alelos atingem um equilíbrio estável, com frequências constantes ao
longo do tempo”. A relação matemática proposta por eles, entre as frequências
alélicas e as frequências genotípicas, nos permite prever as frequências genotípicas
da população de acordo com as frequências alélicas (SNUSTAD, 2010). Existem
alguns fatores que podem perturbar este equilíbrio, que podem ser os ditos fatores
evolutivos: mutação, migração, seleção natural e deriva genética aleatória
(SNUSTAD, 2010).
Objetivos
O objetivo do presente trabalho constituiu-se em verificar se o equilíbrio de
Hardy-Weinberg está ocorrendo na população da região de Francisco Beltrão
(Paraná), usando as frequências dos alelos IA e IB e i do sistema ABO.
96
_________________________________________________
Os dados usados para realização do teste do equilíbrio de Hardy-Weinberg
foram obtidos através do Hemonúcleo de Francisco Beltrão. Este hemonúcleo
atende toda a 8ª Regional de Saúde, são 27 municípios do sudoeste do Paraná e
mais um município de Santa Catarina, a listar: Ampére, Barracão, Bela Vista da
Caroba, Boa Esperança do Iguaçu, Bom Jesus do Sul, Capanema, Cruzeiro do
Iguaçu, Dionísio Cerqueira, Dois Vizinhos, Enéas Marques, Flor da Serra do Sul,
Francisco Beltrão, Manfrinópolis, Marmeleiro, Nova Esperança do Sudoeste, Nova
Prata do Iguaçu, Pérola D'Oeste, Pinhal de São Bento, Planalto, Pranchita, Realeza,
Renascença, Salgado Filho, Salto do Lontra, Santa Izabel D'Oeste, Santo Antonio do
Sudoeste, São Jorge D'Oeste e Verê.
O hemonúcleo mantém registros dos doadores desde sua abertura em 1999.
Foram obtidos um total de 7.0342 registros de doadores. Os dados foram
catalogados de acordo com o tipo sanguíneo e submetido a tratamento estatístico
para obtenção das estimativas das frequências dos alelos IA, IB e i. Estas estimativas
foram corrigidas de acordo com o Ajuste de Bernstein (BEIGUELMAN, 2008). As
estimativas corrigidas foram comparadas aos dados observados realizando-se um
teste do X2. O número obtido neste teste foi lançado na tabela do X 2 para obtenção
de uma probabilidade (p). O nível de significância considerável como significativo foi
p< 0,05.
A partir das análises de máxima verossimilhança de Bernstein foram
estimadas as freqüências alélicas de IA (0,247256) e IB (0,068212) e i (0,684531). O
resultado obtido no teste do X2 foi 10,35, que para 1 grau de liberdade gera um
p<<0,001. Visto um desvio tão grande, rejeita-se a hipótese de que esta população
está em Equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Uma vez que o Equilíbrio não ocorre em um determinado lócus, deve-se
investigar por que estes alelos e seus genótipos estão sofrendo alteração nas suas
frequências esperadas. A Lei de Hardy-Weinberg é baseada em várias suposições:
1) a população é grande e a reprodução é aleatória em relação ao lócus em
questão; 2) as frequências alélicas permanecem constantes com o tempo, pois (i)
não há taxa apreciável de mutação; (ii) não há seleção contra nenhum genótipo em
particular; (iii) não houve imigração significativa de indivíduos de uma população
com frequências alélicas muito diferentes da população endógena (THOMPSON et
al., 1993).
A razão clara para a discrepância no Equilíbrio de Hardy-Weinberg não é
conhecida, mas uma possibilidade provável é a migração para dentro da população
de pessoas com frequências alélicas significativamente diferentes. A migração
interfere na frequência alélica, uma vez que frequência alélica de imigrante difere de
forma expressiva na população inicial. Neste sentido, a população esteve recebendo
constantemente indivíduos oriundos de outros locais. Com isso, a população não se
manteve fechada para que o equilíbrio de Hardy-Weinberg fosse atingido
(THOMPSON et al., 1993).
Com relação à migração na cidade em que se situa o Hemonúcleo,
Francisco Beltrão teve um crescimento populacional relevante. Os dados para 1960
indicam que a cidade possuía 55.253 habitantes. Segundo o Instituto Brasileiro de
Geografia e Estatística (IBGE, 2014), somente no intervalo de 1992 a 2012, a
população da cidade de Francisco Beltrão aumentou 25.485 habitantes, estimandose uma população de 85.486 em 2014. Sabe se que deste número, parte dos
moradores são descendentes dos pioneiros desta região, mas, que segundo Hartl &
Clark (2010), são raras as populações que sejam completamente isoladas.
97
_________________________________________________
As frequências dos tipos sanguíneos observadas na região de Francisco
Beltrão foram as seguintes: O (47%), A (40%), B (10%) e AB (3%). Estas
frequências fenotípicas são muito semelhantes às frequências observadas em
populações europeias, mostrando a origem ítalo-germânica colonizadora da região.
Segundo Thompson et. al. (1993) as frequências dos tipos sanguíneos em europeus
ocidentais são: O (46%), A (42%), B (9%) e AB (3%).
Conclusão
As estimativas realizadas demonstraram que a probabilidade de que a
população da região de Francisco Beltrão esteja em equilíbrio de Hardy-Weinberg é
muito baixa. Desta forma, é possível considerar que a diferença é significante e a
hipótese deve ser rejeitada. Dentre os fatores que interferem no equilíbrio,
possivelmente o mais atuante foi a migração de um grande número de indivíduos
com frequências alélicas distintas em relação á população inicial, até os dias atuais.
Para obtenção resultados adicionais, sugerem-se estudos posteriores,
principalmente utilizando marcadores moleculares.
Agradecimentos: Os autores agradecem ao Hemonúcleo de Francisco Beltrão (8ª
Regional de Saúde) pela concessão dos dados relativos aos tipos sanguíneos.
Referências bibliográficas
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Revista brasileira de hematologia e hematoterapia. 2003; v. 25, nº1, p 47-58.
BEIGUELMAN, B. Genética de Populações Humanas. Ribeirão Preto: SBG, 2009, 236p.
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Editora Senac: São Paulo, 2002. Página 121.
HARTL, D. L.; CLARK, A. G. Princípios de Genética de Populações. 4ª Edição. Editora Artmed:
São Paulo, 2010. Página 310.
IBGE- Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2014, disponível em:
<http://www.ibge.gov.br/home/>, acessado em 10 de out de 2014.
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dissertação, Departamento de História. Universidade Federal do Paraná, 2010.
SNUSTAD, D. Peter, 1940 – Fundamentos de genética/ D. Peter Snusted, Michael J. Simmons;
tradução Paulo A. Motta. – 4 ª ed. – [Reimpr.]. – Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010; pag. 774.
THOMPSON, M. W.; MCINNES, R. R.; WILLAD, H. Thompson e Thompson: Genética Médica. 5ª
ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1993.
98
_________________________________________________
33. Investigação de associação do polimorfismo no microRNA-499 T>C com o
risco de desenvolvimento de câncer gástrico
MADEIRA, F.F.¹; RODRIGUES, G.H.¹; POLTRONIERI, A.B.¹, SILVA, A.E.¹
¹Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE-UNESP), São José do Rio Preto,SP.
Introdução
O câncer gástrico (CG) apresenta alta incidência mundialmente,
representando a segunda principal causa de morte por neoplasia maligna. A
progressão dessa neoplasia é influenciada por fatores genéticos e ambientais.
Dentre os fatores genéticos, podem ser destacadas alterações em oncogenes,
genes supressores de tumor e em genes de reparo do DNA envolvidos na
carcinogênese do estômago. A regulação da expressão desses genes ocorre por
meio de eventos epigenéticos, a exemplo do silenciamento gênico pós-transcricional
promovido pelos microRNAs (miRNAs) que atuam em processos biológicos
importantes, como proliferação celular, diferenciação e apoptose. Porém, os genes
de miRNAs estão sujeitos a ocorrência de polimorfismos em nucleotídeos únicos
(SNP), que podem alterar sua capacidade de regular seus genes alvos e, assim,
estes têm sido associados ao risco de desenvolvimento de alguns tipos de câncer.
Objetivos
Determinar a frequência do polimorfismo miRNA-499 (rs3746444, C/T) em
pacientes com câncer gástrico em comparação com indivíduos sem a doença, e a
ocorrência de associação desse polimorfismo com suscetibilidade a esta neoplasia,
bem como avaliar a associação deste com os fatores de risco gênero, idade,
tabagismo e etilismo.
Foram genotipadas 345 amostras de DNA extraído de sangue periférico,
sendo 197 de indivíduos sem a doença (grupo controle) e 148 com câncer gástrico
(grupo CG). A amostragem foi constituída de 111 mulheres e 109 homens para o
grupo caso e, para o grupo controle, 75 mulheres e 35 homens. Para a genotipagem
do polimorfismo miRNA-499 foi utilizada a técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain
Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism), com a enzima de restrição
BclI, seguida de eletroforese em gel de agarose a 3% (Figura 1). A análise do SNP
foi realizada nos modelos dominante, recessivo e log-aditivo, ajustados aos fatores
de risco (sexo, idade, tabagismo e etilismo).
As frequências genotípicas e alélicas para este polimorfismo estão
apresentadas na Tabela 1. Tanto o grupo controle (p = 0,064) como o grupo caso (p
= 0,81) tem suas frequências em equilíbrio de Hardy-Weinberg. No modelo
dominante (homozigotos selvagens vs heterozigotos + homozigotos polimórficos),
não foi observada associação dos genótipos TC e CC com risco de desenvolvimento
de CG (OR= 0,73; IC95% 0,44 – 1,19; p = 0,21). Da mesma forma, pelos modelos
recessivo (homozigotos selvagens + heterozigotos vs homozigotos polimórficos) e
log-aditivo (homozigotos selvagens vs heterozigotos vs homozigotos polimórficos)
também não foram encontradas diferenças significantes (OR= 1,18; IC95% 0,29 –
4,84; p = 0,82 e OR= 0,79; IC95% 0,51 – 1,23; p = 0,29, respectivamente) (Tabela
1). Os fatores de risco gênero, idade, tabagismo e etilismo foram avaliados em 328
das amostras genotipadas. A regressão logística múltipla mostrou que o sexo
masculino (OR =1,81; IC95% = 1,03 – 3,21; p = 0,040) e a idade avançada (>57
anos) (OR = 4,87; IC95% = 3,00 – 7,91; p = 0,000) estão associados a um maior
risco de desenvolvimento desta neoplasia.
99
_________________________________________________
Figura 1. Padrão eletroforético dos fragmentos gerados na técnica de PCR-RFLP com a
enzima BclI para a avaliação do polimorfismo miRNA-499 (rs3746444). As colunas 1, 2, 5 a 7
representam indivíduos heterozigotos (TC), com fragmentos de 146 pb (alelo C), 120 pb e 20
pb (não visível) (alelo T). As colunas 4 e 8 representam indivíduos homozigotos selvagens (TT),
com fragmentos de 120 pb e 20 pb (não visível). A coluna 3 representa um indivíduo
homozigoto polimórfico (CC), com fragmentos de 146 pb. L: marcador de peso molecular de
100 pb.
Tabela 1. Distribuição das frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo miRNA-499 (rs3746444,
C/T) e análise de regressão logística múltipla entre os grupos controle (C) e câncer gástrico (CG),
ajustada aos fatores de risco idade, gênero, tabagismo e etilismo.
Polimorfismo
Modelo
Estatístico
miRNA-499
(rs3746444)
Dominante
Genótipo/
Alelos
C
CG
T/T
T/C
C/C
n= 197
115 (58%)
77 (29%)
5 (3%)
N= 148
92 (62%)
49 (33%)
7 (5%)
T
C
307 (78%)
87 (22%)
233 (79%)
63 (21%)
T/T
T/C + C/C
108 (58,4%)
91 (63,6%)
77 (41,6%)
52 (36,4%)
0,73 (0,44 - 1,19)
0,21
T/T + T/C
C/C
180 (97,3%)
138 (96,5%)
5 (2,7%)
5 (3,5%)
1,18 (0,29 - 4,84)
0,82
T/T
T/C
C/C
115 (58%)
92 (62%)
77 (39%)
49 (33%)
5 (3%)
7 (5%)
0,79 (0,51 - 1,23)
OR (IC95%)
Recessivo
OR (IC95%)
Log-aditivo
P
OR (IC95%)
OR: Odds ratio. IC95%: Intervalo de confiança de 95%.
0,29
Conclusão
Nossos dados evidenciam uma ausência de associação entre as variantes do
polimorfismo no microRNA-499 com o risco de desenvolvimento do câncer gástrico.
Contudo, foi evidenciada uma associação dos fatores sexo masculino e idade
avançada com maior risco para essa neoplasia na população de estudo.
100
_________________________________________________
GAL-YAM, E.N.; SAITO, Y.; EGGER, G.; JONES, P.A. Cancer Epigenetics: Modifications, Screening
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101
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
34. Efeito da erradicação da Helicobacter pylori na expressão de mediadores
inflamatórios e microRNAs
ROSSI, A.F.T.¹; CADAMURO, A.C.T.¹; BISELLI-PÉRICO, J.M.¹; SILVA, A.E.
Introdução
Infecção persistente da mucosa gástrica pela Helicobacter pylori promove
inflamação crônica que propicia um microambiente favorável para o desenvolvimento
e progressão do câncer de estômago a partir de lesões precursoras (CHIBA;
MARUSAWA; USHIJIMA, 2012). A resposta inflamatória desencadeada por esta
bactéria é caracterizada por expressão desregulada de vários mediadores
inflamatórios, como IL-1β, TNFα, IL-8 e IL-6 (WILSON; CRABTREE, 2007). Esta
desregulação de genes inflamatórios pode modificar a resposta imune causada pelo
patógeno, contribuindo para a manutenção da infecção por longo período (WILSON;
CRABTREE, 2007). Alteração na expressão gênica também pode ser resultante de
mecanismos epigenéticos pela atuação dos microRNAs (miRNAs). Estes pequenos
RNAs não codificantes regulam a expressão gênica, influenciando várias funções
celulares, como apoptose e proliferação, e sistêmicas, como a inflamação (RANJHA;
PAUL, 2013). Além disto, estudos apontam que a infecção por H. pylori é capaz de
desregular a expressão de miRNAs, alterando, por consequência, a expressão de
genes regulados por ele, como os codificantes de interleucinas (NOTO; PEEK,
2012). A erradicação da H. pylori tem sido a estratégia adotada para prevenção do
câncer gástrico, por ser capaz de reverter lesões pré-cancerosas e, assim, prevenir
a transformação maligna (TSAI et al., 2006). Estudos mostrando a expressão de
genes e miRNAs antes e após o tratamento para erradicação desta bactéria são
escassos e importantes para compreender os efeitos causados pela infecção por H.
pylori na mucosa gástrica.
Objetivos
Os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão quantitativa do
mRNA dos genes das citocinas TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 e TGFBRII e a
expressão dos miRNAS hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-223-3p, hsamiR-370-3p e hsa-miR-375 em tecido gástrico de pacientes com dispepsia H. pyloripositivos antes e após o tratamento de erradicação da bactéria, em comparação
com um grupo com dispepsia sem infecção pela bactéria.
Material e Métodos
Um total de 51 biópsias coletadas da região do antro de pacientes com
dispepsia gástrica foram avaliadas: 31 de indivíduos H. pylori-positivos (Hp+) antes e
três meses após o tratamento de erradicação da bactéria e 20 de indivíduos H.
pylori-negativos (Hp-). Quatro biópsias de indivíduos com mucosa gástrica
histologicamente normal e sem infecção pela H. pylori foram utilizadas para a
calibração das análises. A infecção pela H. pylori foi avaliada por dois métodos
distintos: coloração com Giemsa para diagnóstico histopatológico por um patologista
e PCR multiplex utilizando iniciadores para os genes ureA e tsaA bacterianos e para
CYP1A1 humano para diagnóstico molecular. A presença ou ausência de infecção
foi considerada quando os dois métodos apresentavam resultados concordantes. A
partir do RNA foi realizada a síntese de DNA complementar (cDNA) utilizando High
Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) para os genes de citocinas e do
receptor e TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) para
os miRNAs. Posteriormente, ambos foram submetidos a pré-amplificação específica
com TaqMan® PreAmp Master Mix (Applied Biosystems). A quantificação relativa
(RQ) dos mRNAs e dos miRNAs foi realizada por PCR quantitativa em tempo real
102
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
(qPCR) usando ensaio TaqMan® e sondas específicas (TaqMan® gene expression
- Ct
assay e TaqMan® microRNA assay, respectivamente). O método do 2
(LIVAK;
SCHMITTGEN, 2001) foi utilizado para obter o valor de RQ, usando como calibrador
um pool das amostras do grupo de mucosa normal Hp-. Para normalização, os
genes ACTB e GAPDH e os RNAs RNU6B e RNU48 foram utilizados como
referência para os genes de interleucinas e miRNAs, respectivamente. A
comparação entre os grupos foi realizada pelo Teste de Mann-Whitney e o Teste de
Wilcoxon foi utilizado para avaliar aumento ou redução na expressão, considerando
como mediana teórica o valor 1, referente ao pool de amostras normais Hp-. Foram
considerados significantes valores de p≤0,05.
Os genes TNFA, IL6, IL1B e IL12A apresentaram expressão gênica relativa
elevada no grupo Hp+ antes do tratamento (RQ= 3,23, 6,66, 1,79 e 2,05,
respectivamente), mas apenas TNFA e IL6 mostraram redução significante de
expressão após a erradicação da H. pylori (p<0,001 e p=0,029, respectivamente)
(Figura 1A). De modo contrário, os genes IL2 e TGFBRII mostraram expressão
relativa reduzida antes do tratamento (RQ= 0,65 e 0,62, respectivamente) e TGFBRII
apresentou aumento de expressão após a erradicação (p=0,019) (Figura 1A).
Figura 1: Quantificação relativa (RQ) do mRNA dos genes TNFA, IL6, IL1B, IL12A, IL2 e
TGFBRII (A) e dos microRNAs hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR370-3p e hsa-miR-375 (B) nos grupos Hp- e Hp+ antes e após o tratamento de erradicação
(erradicado e não erradicado), mostrando diferença significante entre os grupos. * p≤0,05; **
p<0,01; *** p<0,001.
Dos pacientes tratados, 10 permaneceram infectados e a expressão dos
genes TNFA, IL6, IL1B e IL12A manteve-se aumentada (RQ= 2,72, 4,34, 2,38 e
2,37, respectivamente) e de TGFBRII reduzida (RQ=0,77). O grupo Hp- apresentou
expressão aumentada apenas para TNFA (RQ= 1,35) e IL1B (RQ=1,58), não sendo
observada diferença significante na expressão de IL1B neste grupo em comparação
ao Hp+ antes do tratamento. Estes resultados indicam que a resposta inflamatória
desencadeada pela H. pylori é atenuada após sua erradicação, o que pode ser
indicado pela redução na expressão de TNFA e IL6 e aumento na expressão de
TGFBRII, principal receptor da citocina anti-inflamatória TGF-β. Embora reduzida, a
resposta inflamatória não foi totalmente resolvida na ausência da bactéria, pois
IL12A e IL1B permaneceram com expressão elevada. Além disto, aumento de
expressão de IL1B no grupo Hp- evidencia o papel do processo inflamatório
decorrente da gastrite e independente da infecção pela bactéria, visto que a
expressão deste mediador não foi alterada na presença do patógeno.
Os microRNAs miR-103, miR-181c, miR-370 e miR-375 apresentaram
103
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
expressão relativa reduzida nos grupos Hp+ antes do tratamento (RQ= 0,33, 0,12,
0,21 e 0,13, respectivamente) e após tratamento tanto no grupo erradicado (RQ=
0,68, 0,23, 0,45 e 0,34, respectivamente) como no não erradicado (RQ= 0,60, 0,11,
0,29 e 0,18, respectivamente). Contudo, todos eles mostraram aumento significante
de expressão no grupo após a erradicação da H. pylori quando comparado com o
grupo Hp+ antes do tratamento (p<0,001, p=0,045, p=0,002 e p<0,001,
respectivamente) (Figura 1B). O grupo Hp- também apresentou expressão reduzida
para estes microRNAs (RQ= 0,46, 0,09, 0,33 e 0,12, respectivamente), não sendo
observada diferença entre este grupo e o Hp+ antes do tratamento (p=0,118,
p=0,836, p=0,056 e p= 0,682, respectivamente). O miR-223 apresentou expressão
relativa reduzida para o grupo Hp- (RQ= 0,27), mas expressão basal para o grupo
Hp+ antes do tratamento (RQ= 0,89), evidenciando diferença significante entre a
mediana destes grupos (p=0,001) (Figura 1B). Contudo, não foram observadas
diferenças significantes entre a mediana de expressão após a erradicação e antes
do tratamento (RQ= 0,62; p= 0,177).
Conclusão
A infecção pela H. pylori aumenta a expressão de genes de mediadores
inflamatórios que regulam a inflamação crônica, como TNFA, IL6, IL1B e IL12A e,
após a erradicação, a diminuição na expressão de alguns destes mediadores indica
uma redução da resposta inflamatória. Do mesmo modo, a eliminação desta bactéria
é capaz de aumentar a expressão de alguns microRNAs relacionados ao processo
inflamatório, como miR-103, miR-181c, miR-370 e miR-375. Assim, a terapia de
erradicação da H. pylori é uma estratégia relevante para reduzir o processo
inflamatório e possivelmente prevenir a progressão maligna, embora não normalize a
expressão de todos os mediadores avaliados neste período de tempo.
Auxílio Financeiro: FAPESP (Processo nº 2013/03625-1) e CNPq.
CHIBA, T.; MARUSAWA, H.; USHIJIMA, T. Inflammation-Associated Cancer Development in
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104
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
35. Associação do polimorfismo do microRNA-196a2 com o risco aumentado
de câncer gástrico
1
2
1
1
POLTRONIERI-OLIVEIRA, A.B. ; OLIVEIRA, J.G. ; RODRIGUES, G.H. ; BISELLI-PÉRICO, J.M. ;
1
SILVA, A.E .
1
2
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – Unesp, São José do Rio Preto, SP Universidade
do Sagrado Coração – USC, Bauru, SP
Introdução
O câncer é o principal problema de saúde pública mundialmente (SIEGEL et
al., 2012), responsável pela morte de 7,6 milhões de pessoas em 2008. O câncer
gástrico (CG) apresenta incidência elevada, representando a segunda causa de
morte por neoplasia maligna, inclusive no Brasil (INCA, 2014). Neste tipo de câncer,
observa-se uma interação complexa entre os componentes ambientais e genéticos,
a exemplo dos polimorfismos genéticos (PANDEY et al., 2010). Os polimorfismos de
nucleotídeo único (SNPs) são a forma mais comum de variantes genéticas no
genoma humano, alguns dos quais têm potencial influência funcional na
suscetibilidade a doenças humanas. SNPs podem alterar o processamento de genes
importantes, como os de microRNAs (miRs), podendo influenciar na transcrição de
seus miRNAs primários (pri-miRNAs) ou em sua maturação (KONTOROVICH et al.,
2010). Os miRNAs são pequenas moléculas de RNAs de fita simples não-codantes
que atuam como potentes reguladores pós-transcricionais (RICARTE-FILHO;
KIMURA, 2006) de múltiplos mRNAs alvos, degradando-os ou inibindo sua tradução
(CALIN; CROCE, 2006; RICARTE-FILHO; KIMURA, 2006). Assim, SNPs podem
modificar sua habilidade de regulação transcricional devido a capacidade diminuída
de reconhecer seus mRNA alvos (HOFFMAN et al., 2009; SUN et al., 2010). Nesse
sentido, o miRNA-196a2 apresenta um SNP funcional (rs11614913) decorrente da
substituição de citosina por timina (C>T), que apresenta potencial habilidade de
modificar o risco de desenvolvimento de cânceres (GUO et al., 2012).
Objetivo
Determinar a frequência do polimorfismo miRNA-196a2 (rs11614913) em
pacientes com câncer gástrico em comparação com indivíduos saudáveis e a
ocorrência de associação desses polimorfismos com suscetibilidade ao câncer
gástrico; avaliar a ocorrência de associação dos fatores de risco gênero, idade,
tabagismo e etilismo no desenvolvimento dessa neoplasia.
Material e Métodos
Um total de 313 amostras de DNA extraído de sangue periférico foram
genotipadas para o polimorfismo do miR-196a2 (rs11614913), sendo 169 de
indivíduos saudáveis (grupo controle; média de idade: 46 ± 16 anos) e 144 de
pacientes com CG (grupo caso; média de idade: 63 ± 12 anos). Para isto, foi
empregada a técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction / Restriction
Fragment Length Polymorphism). Inicialmente, as amostras foram submetidas a
reações
de
PCR
utilizando
primers
específicos
(F:
CCCCTTCCCTTCTCCTCCAGATA; R: CGAAAACCGACTGATGTAACTCCG) para
amplificar a região gênica contendo o SNP com 149 pb de comprimento. Após, os
produtos de PCR gerados foram submetidos a restrição enzimática utilizando a
enzima MspI resultando fragmentos de 149 pb (alelo T) e 125 pb (alelo C), os quais
foram visualizados em gel de agarose a 3%. As análises estatísticas dos genótipos
foram realizadas no programa SNPStats nos modelos dominante, recessivo e log
aditivo. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado utilizando teste Qui-quadrado, e
a regressão logística múltipla foi utilizada para avaliar a associação dos fatores de
risco idade, gênero, hábitos tabagista e etilista no desenvolvimento do câncer.
105
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
Valores de p≤0,05 foram considerados significantes. O projeto foi aprovado pelo
CEP/IBILCE/UNESP conforme parecer n° 117/08.
As frequências genotípicas nos grupos caso e controle foram 42% e 42%
(CC), 39% e 49% (CT) e 19% e 9% (TT), respectivamente. Os resultados mostraram
que no grupo caso a distribuição dos genótipos não estavam em equilíbrio de HardyWeinberg (p=0,02), com uma maior proporção de homozigotos CC e TT do que o
esperado. A análise dos genótipos revelou que o genótipo polimórfico TT esta
associado com o risco de desenvolvimento do CG, de acordo com o modelo
recessivo (OR=2,78; IC95%=1,30-5,98; p=0,00). Também, idade avançada
(OR=5,23; IC95%=3,17-8,64, p=0,00), hábito tabagista (OR=1,78; IC95%=1,03-3,90;
p=0,03) e gênero masculino (OR=1,86; IC95%=1,05-3,30; p=0,03) estão associados
com o risco de desenvolvimento desta neoplasia (Tabela 1). Estes resultados
indicam que a presença do genótipo TT pode ser preditiva para a ocorrência de CG
em indivíduos saudáveis, podendo servir como biomarcador de diagnóstico precoce.
Além disso, ressalta a relevância da idade avançada, do hábito tabagista e do
gênero masculino como fatores de risco para o desenvolvimento desta neoplasia.
Tabela 1. Frequência alélica e genotípica do miR-196a2 (rs11614913) nos grupos câncer gástrico
(CG) e controle comparados no modelo recessivo (TT vs CC + CT), e sua associação com o
desenvolvimento CG. Cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg.
n° de indivíduos
Genótipo
Total
Grupo CG
313
144
Total Frequência
Grupo Controle
169
Valor de
(95%
IC)
P
Total Frequência Total Frequência
CC
131
40%
62
42%
71
42%
CT
137
43%
55
39%
82
49%
TT
43
17%
27
19%
16
9%
Alelo
OR
2,78
(1.305.98)
0.00
Total Frequência
Total Frequência Total Frequência
C
399
69%
211
72%
224
70%
--
--
T
180
31%
82
38%
98
30%
--
--
Fatores de
risco
Grupo CG
Grupo controle
OR (95% IC)
Valor de P
Idade avançada
(>56 anos)
101
56
5,23 (3,17-8,64)
0,00
Hábito tabagista
103
86
1,78 (1,03-3,90)
0,03
Gênero masculino
107
97
1,86 (1,05-3,30)
0,03
Equilíbrio de Hardy-Weinberg
P
Grupo Controle
0,35
Grupo CG
0,002
106
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
Conclusão
O genótipo polimórfico do miR-196a2 (rs11614913) TT apresenta associação
com o risco aumentado de ocorrência do câncer gástrico. Além disso, idade
avançada, hábito tabagista e o gênero masculino também estão associados ao
desenvolvimento desta neoplasia.
Auxílio Financeiro: FAPESP (Processo nº 2013/03625-1) e CNPq (Processo n°
474.776/2013-1).
CALIN, G.A.; CROCE, C.M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, v. 6, p. 857866, 2006.
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107
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
36. Associação de fatores genéticos relacionados à angiogênese e vasculatura
com a doença renal policística autossômica dominante
1
1
1
1
1
1
TENANI, G.D ; MARTINS, D.P ; CALDAS, H.C ; SOUZA, M.A ; BAITELLO, M.E.L ; NOGUEIRA, V ;
1
1
1
ANDRADE, D.O ; SOUZA, D.R.S ; ABBUD FILHO,M .
1
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
Introdução
A doença renal policística autossômica dominante (DRPAD), de caráter
hereditário, evolui para insuficiência renal crônica terminal, podendo apresentar
influência de genes modificadores. Nesse contexto, destaca-se o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF), importante regulador da angiogênese (LI et
al., 2012), processo responsável pela formação de novos vasos diretamente
relacionado ao suprimento sanguíneo das células císticas em franca proliferação
(REED et al., 2011), além do Colágeno tipo 1 alfa 2 (COL1α2) componente da matriz
extracelular, envolvido na ampliação, estabilização, maturação e remodelação
vascular (LIU et al., 2012; ZUO et al., 2012). Estudos envolvendo variantes
genéticas na DRPAD possibilitam perspectivas de diagnóstico, prognóstico e
tratamento da doença.
Objetivo
Avaliar a associação dos polimorfismos VEGF-C936T e COL1α2-G1645C
com DRPAD.
Metodologia
Foram estudados 302 indivíduos distribuídos em dois grupos: G1 - 73
pacientes com diagnóstico de DRPAD e G2 - 229 indivíduos sem a doença. Todos
foram submetidos a um questionário, considerando perfil demográfico, antecedentes
pessoais e história familiar de DRPAD, além de coleta de amostra de sangue
periférico para extração de DNA, seguido de análise dos referidos polimorfismos por
PCR/RFLP (polymerase chain reaction / restriction fragment slenght polymorphisms).
Admitiu-se nível de significância para valor–P<0,05.
Resultados
Polimorfismo VEGF-C936T: prevaleceram o alelo C e o genótipo homozigoto
selvagem CC em G1 (0,89; 78%, respectivamente) e G2 (0,89; 79%,
respectivamente), sem diferença significante entre os grupos (P>0,05). Polimorfismo
COL1α2-G1645C: notou-se maior frequência do alelo C e genótipo homozigoto
mutante CC em G1 (0,59; 19%, respectivamente) comparado a G2 (0,37; 9%,
p=0,0001; p=0,02, respectivamente).
Discussão
O polimorfismo VEGF-C936T não se mostrou associado à doença no
presente estudo, corroborando Reiterová et al. (2008) em análises de haplótipos de
VEGF em casuística Tcheca. São escassos os estudos que avaliam a influência de
variantes genéticas de VEGF na DRPAD ou sua progressão, dificultando a
comparação entre as populações. O COL1α2-G1645C no modelo recessivo (C/C
versus C/G+G/G) ora analisado, mostrou prevalência do genótipo homozigoto
mutante C/C nos pacientes, fortalecendo os achados da literatura que relacionam a
presença dos cistos que podem surgir em qualquer porção do túbulo renal a
aumento dos níveis de colágeno, sugerindo que a expressão de colágeno tipo I nos
rins de portadores de DRPAD pode desempenhar um papel crucial na formação e
alargamento de cistos renais (REED et al., 2011).
108
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
Conclusão
O polimorfismo VEGF-C936T não se associa com a DRPAD, porém COL1α2G1645C, representado pelo genótipo homozigoto mutante, parece influenciar na
doença, o que deve ser confirmado em estudo prospectivo e casuísticas mais
numerosas.
Auxílio Financeiro: BAP/FAMERP
LI Y, LIANG J, LIU X, et al. Correlation of polymorphisms of the vascular endothelial growth factor
gene and the risk of lung cancer in an ethnic Han group of North China. ExpTher Med. v. 3, n. 4, p.
673-6, 2012.
LIU B, LI C, LIU Z, et al. Increasing extracellular matrix collagen level and MMP activity induces cyst
development in polycystic kidney disease. BMC Nephrol. v. 13, p. 109, 2012.
REED BY, MASOUMI A, ELWALEED E, et al. Angiogenic growth factors correlate with disease
severity in young patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. Kidney International,
v. 79, p. 128-134, 2011.
REITEROVÁ J, OBEIDOVÁ H, LENÍCEK M, STEKROVÁ J, MERTA M, MAIXNEROVÁ D, et al.
Influence of VEGF polymorphism on progression of autosomal dominant polycystic kidney disease.
Kid Blood Press Res.,v. 31, n. 6, p. 398-403, 2008.
ZUO C, WEN F, LI M, et al. COL1A2 polymorphic markers confer an increased risk of neovascular
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109
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
37. Proteína Anexina A1: alternativa terapêutica em câncer de colo uterino
1
1
1
2
1
2
MOREIRA, H. T. ; LACERDA, J.Z. ; PRATES, J. ; CUNHA, B. R. ; OLIANI, S.M. ; TAJARA, E.H. ;
3
RODRIGUES-LISONI, F. C.
1
2
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP
3
Faculdade de Engenharia - UNESP/FEIS
Introdução
O câncer cervical é comum entre as mulheres jovens, especialmente em
populações imunocomprometidas. Os fatores de risco para o desenvolvimento do
câncerdo colo do útero são: sexo em idade precoce, múltiplos parceiros sexuais,
tabagismo, contraceptivos hormonais, imunossupressão, infecções e a
contaminaçãopelo HPV (ROUZIER, 2014). A carcinogênese de colo de útero
também está relacionada com angiogênese, processos inflamatórios e a abundância
de células inflamatórias, que é uma característica do microambiente tumoral, sendo
seu papel na progressão neoplásica foco de muita discussão (ZIJLMANS et al.,
2009). A resposta inflamatória é controlada pela ação de mediadores antiinflamatórios, que atuam para manter a homeostasia da resposta imunológica e
prevenir a lesão tecidual. Entre esses mediadores destacamos a anexina-A1
(ANXA1), proteína de 37 kDa, que é expressa pelas células tumorais e atua como
moduladora do processo inflamatório (ALVES et al., 2008; SILISTINO-SOUZA et al.,
2007). Diante dessas considerações, investigamos, in vitro, a ação da proteína antiinflamatória ANXA1 sobre as células tumorais SiHa, avaliando a proliferação e a
migração celular etambém a expressão dos genes COX-2, EP3, EP4, MMP2 e
MMP9, TIMP1 e TIMP2para determinar como a ANXA1 atua na expressão desses
genes e como essas alterações podem participar do processo tumorigênico.
Objetivos
Investigar, in vitro, a influência da proteína anti-inflamatória ANXA1 exógena
na proliferação e migração celular e na expressão dos genes COX-2, EP3, EP4,
MMP2, MMP9, TIMP1 e TIMP2nas células SiHa.
Nas investigações in vitro, células derivadas de carcinoma epidermóide de
cérvix (linhagem celular SiHa) foram tratadas com o peptídeo ANXA12-26 (região Nterminal da ANXA1)na concentração de 2 µM. A proliferação celular foi avaliada pelo
Countess® Automated Cell Counter; migração celular por microscopia de luz e
expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real.
Os resultados in vitro mostram que a migração celular foi reduzida após o
tratamento com ANXA12-26 (2 µM) nos tempos de 48h e 72h (Figura 1A). A
proliferação celular foi reduzida no tempo de 72 horas de tratamento com ANXA12-26
(2 µM) (Figura 1B). A redução significante da expressão dos genes COX-2, EP4
eTIMP1 foi observada após a realização da técnica de PCR quantitativo em tempo
real (Figura 1C). Então, nossos dados indicam que a proteína anti-inflamatória
ANXA1, no câncer de colo de útero, participa das seguintes etapas: reduz a
proliferação e a migração celular, além de reduzir significantemente a expressão dos
genes COX-2, EP4 eTIMP2.
110
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
Figura 1. Efeitos do peptídeo ANXA12-26 sobre as células SiHa. O efeito do tratamento
com o peptídeo ANXA12-26 sobre a migração celular [A], proliferação celular [B]e
expressão gênica [C] em células derivadas de carcinoma epidermóide de cérvix
(linhagem SiHa). Os resultados expressam a média ± S.E.M. de células de três ensaios
independentes em triplicata. *** p<0,001 versus controle (migração celular); P ≤ 0,05 na
proliferação celular e a expressão gênica foi considerada significante exibindo valores ≥
1.0 ou ≤ -1.0 versus controle.
Conclusão
Nossos dados revelam ações da proteína ANXA1 exógena no tratamento em
linhagem de células de câncer de colo uterino podendo representar um avanço nas
investigações terapêuticas.
Auxílio Financeiro: CAPES; CNPq; FAPESP.
ALVES, V.A.F. et al. Annexin A1 subcellular expression in laryngeal squamous cell carcinoma.
Histopathology, Oxford. v.53, p.715 - 27, 2008.
ROUZIER, R. Epidemiology and risk factors for cancer of the uterus. Rev Prat. v.64, p. 774-779,
2014.
SILISTINO-SOUZA, R. et al. Annexin 1: differential expression in tumor and mast cells in human
larynx cancer. International journal of cancer, New York. v. 120, n.12, p. 2582-9. 2007.
ZIJLMANS, H.J. et al. Expression of endoglin (CD105) in cervical cancer. British journal of cancer,
London. v.100, n.10, p.1617-26, 2009.
111
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
38. Associação do Complemento do Fator H na Degeneração Macular
Relacionada à Idade
1
1
1
2
2
2
CALASTRI, M.C.J ; CEZARIO, S.M ; OLIVEIRA, C.I.F ; COTRIM, C.C ; PINHEL, M.A.S ; JORGE, R ;
1
1, 2
SOUZA, D.R.S ; SIQUEIRA, R.C .
1
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP
2
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP
Introdução
Degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é a principal causa da
perda de visão acima de 50 anos de idade, sendo responsável por metade de todos
os novos casos de cegueira nos paises desenvolvidos (NGAI et al., 2011; FURTADO
et al., 2012). Fatores genéticos envolvidos na desregulação do sistema
complemento (SC), principal mediador do processo imunoinflamatório, que se
caracteriza como conjunto de proteínas solúveis no plasma ou expressas na
membrana celular ativado por diversos mecanismos, incluem-se entre as causas da
doença (KLEIN et al., 2005; GANGNON et al., 2012). Nesse contexto, destacam-se
variantes genéticas do fator H do sistema complemento (CFH) (DIKMETAS;
KADAYIFCILAR; ELDEM, 2013), proteína reguladora do SC cuja deficiência
associa-se a maior susceptibilidade a infecções (WEISMANN et al., 2011; SHAW et
al., 2012). Desse modo, a identifcação de fatores genéticos relacionados à
patogênese de DRMI poderá contribuir para diagnóstico, prognóstico e tratamento
da doença, combatendo, consequentemente, a perda da visão.
Objetivos
Avaliar a associação do polimorfismo CFH-Y402H da proteina regulatória
Fator H do SC humano e hábitos de vida em pacientes com DMRI.
Metodologia
Foram estudados 254 indivíduos distribuidos em dois grupos: Grupo Estudo
(GE) – 146 pacientes com DMRI (idade: 50 a 89 anos; 52,1% sexo feminino); Grupo
Controle (GC) – 108 indivíduos sem a doença (idade: 50 a 84 anos; 55,0% sexo
feminino). A genotipagem de CFH-Y402H foi analisada por PCR/RFLP (polymerase
chain reaction/restriction fragment lenght polymorphism), identificando-se os
genótipos CC (de risco), CT e TT. Admitiu-se nível de significância para valorP<0,05. Hábitos de vida, incluindo tabagismo e etilismo, além de perfil demográfico
foram obtidos por meio de entrevista e questionário.
O genótipo de risco (CC) e o alelo C prevaleceram em GE (22%; 0,42,
respectivamente), comparado a GC (9%; 0,31; P=0,03; P=0,01, respectivamente).
Entre os pacientes 32 (22%) relataram consumo frequente de álcool, comparado a 9
(8%) indivíduos sem a doença (P=0,006), no entanto, houve semelhança entre os
grupos considerando o hábito tabagista (GE=40%; GC=34%; P=0,047). A
associação do polimorfismo CFH-Y402H (ora representada pelo genótipo de risco
CC) com DMRI, corrobora outros estudos (HAGEMAN et al., 2005; KLEIN et al.,
2005). Isso sugere alteração nos mecanismos de ação do fator H conferindo,
consequentemente, maior suscetibilidade a inflamação, fator de risco para DMRI
(GEHRS et al., 2010; HECKER et al., 2010; GANGNON et al., 2012).
Reconhecidamente, o fator H controla a ativação da via alternativa do complemento,
que proporciona meio de resistência contra infecção sem a participação de
anticorpos e, portanto, fornece a primeira linha de defesa contra uma variedade de
agentes infecciosos (CHARBEL ISSA; CHONG; SCHOLL, 2011). Adicionalmente,
fatores ambientais são relevantes na patogenia de DMRI incluindo o etilismo,
112
_________________________________________________________
Mestrado (GHM)
observado com maior frequência no grupo de pacientes, comparado a controles,
relatado também por outros autores (ARNARSSON et al., 2006; CHONG et al.,
2008), enquanto tabagismo não diferenciou os grupos neste e em outro estudo (TAN
et al., 2007), embora há referência de sua associação com a doença (SEDDON et
al., 2009; CHAKRAVARTHY et al., 2010). Nesse contexto, destaca-se a relação dos
referidos hábitos com a produção de radicais livres desencadeando processo
inflamatório e, consequentemente, desenvolvimento e evolução de DMRI
(HOLLYFIELD et al., 2008; PATEL; CHAN, 2008; THURMAN et al., 2009).
Conclusão
O polimorfismo CFH-Y402H associa-se com DMRI, assim como etilismo,
sugerindo a influência desses fatores na sua patogênese, o que deve ser avaliado
também em estudos prospectivos considerando a gravidade e evolução da doença.
Auxílio Financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –
FAPESP
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Immunopathol. 2008;30(2):97-110.
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WEISMANN D, HARTVIGSEN K, LAUER N, et al. Complement factor H binds malondialdehyde
epitopes and protects from oxidative stress. Nature. 2011; 478(7367):76-81.
114
________________________________________________________
39. Manifestações clínicas em crianças com Doença Falciforme
1
1
1
1
Doutorado (GHM)
1
OKUMURA, J.V ; SILVA, D.G.H ; TORRES, L.S ; BELINI-JUNIOR, E ; OLIVEIRA, R.G ;
1
2
1
SALVARANI, M ; LOBO, C.C.L ; BONINI-DOMINGOS, C.R .
1
Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” - Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas (UNESP/IBILCE)
2
Instituto estadual de Hematologia “Arthur Siqueira Cavalcanti” (HEMORIO)
Introdução
A Doença Falciforme (DF) é caracterizada pela presença da hemoglobina
(Hb) S (HBB:c.20A>T – rs334), sendo mais frequente em homozigose, denominada
de Anemia Falciforme (AF), e menos frequente em interação com outras Hb
alteradas como a Hb C, D e a beta-talassemia (WEATHERALL; CLEGG, 2001). Por
se tratarem de mutações no gene da beta-globina (HBB), os principais sintomas
começam a aparecer após o sexto mês de vida, quando há troca das cadeias
globínicas, principalmente das gamas (γ) por betas (β) para formar as Hb adultas
(SCHECHTER, 2008). As principais ocorrências clínicas em uma criança com DF
são: infecções, sequestro esplênico (SE), síndrome torácica aguda (STA), crises de
dores e síndrome mão-pé (dactilite) (BALLAS et al., 2010; MEIER; MILLER, 2012).
Juntamente com estas ocorrências as crianças são internadas e geralmente
recebem transfusões como forma de tratamento. Os genótipos que caracterizam a
clínica mais grave são os SS e Sβ0 (MEIER; MILLER, 2012). No Brasil nascem
aproximadamente 3.500 crianças por ano com AF, sendo 1:1200 com DF nascidas
vivas no Rio de Janeiro (CANÇADO; JESUS, 2007).
Objetivo
Avaliar as manifestações clínicas de recém-nascidos com DF que fazem
acompanhamento no HEMORIO.
O resultado apresentado faz parte de um estudo de doutorado intitulado
“Vaso-oclusão em Doença Falciforme: interação gênica e/ou características
intrínsecas da manifestação clínica?”. O grupo de estudo foi composto por 103
recém nascidos com DF provenientes do HEMORIO. A última avaliação das
manifestações clínicas ocorreu em março de 2014 e as crianças apresentavam
média de idade de 17,0±6,54 meses (mínimo seis meses - máximo 48 meses). O
levantamento clínico se baseou na consulta aos prontuários, do banco de dados do
HEMORIO (SASH) e em parceria com a pediatra responsável. Foram verificados a
ocorrência de febre, SE, esplenomegalia, pneumonia (PNM), STA, crises de dor e
dactilite e também o número de internações e transfusões. A caracterização da
presença das hemoglobinas ocorreu por meio de eletroforese alcalina e ácida,
resistência globular osmótica, análise da morfologia eritrocitária e quantificação das
frações globínicas por HPLC. A confirmação genotípica foi realizada por PCR-RFLP
para a detecção das mutações HBB:c.20A>T – rs334 para Hb S com a enzima de
restrição DdeI, da mutação HBB:c.19G>A – rs33930165 para Hb C com a enzima
BseRI e da HBB:c.364G>C – rs33946267 para Hb D com a enzima EcoRI. Para a
detecção das beta-talassemias foi utilizado a técnica de PCR-AE. No presente
trabalho, não separamos os indivíduos de acordo com as mutações de betatalassemia para a análise das manifestações clínicas. Os resultados foram
apresentados como média ± desvio padrão. A análise estatística de Qui-quadrado foi
realizada no software Statistica 9.0 (Statsoft Inc.) e o nível de significância foi fixado
em p<0.05.
115
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Dos 103 indivíduos com DF, 98 estão genotipados para a presença da Hb S
sendo 73 (74,5%) homozigotos para a Hb S (possuem AF), 17 (17,3%) com Hb SC,
sete (7,2%) com Hb Sβ talassemia e um (1,0%) com Hb SD. O evento mais
frequente foi a internação (83,67%), seguido da transfusão (77,55%), provavelmente
devido a ocorrência das manifestações clínicas de febre (75,51%) e PNM (68,36%).
As crises de dor (32,65%), dactilite (17,34%), não foram acentuadas devido aos
níveis elevados de Hb F(média de 67,96 ± 15,9; mín 1,3 e máx 91,4). Até este
momento, faz parte do grupo amostral apenas um paciente com Hb SD e este
possui um dos piores fenótipos encontrados, pois apresentou cinco ocorrências de
febre, cinco internações, duas transfusões, uma dactilite, duas PNM, uma crise de
dor e dois SE com 22 meses de idade. Não foi relatado, mas um paciente dos 73
com Hb SS foi a óbito por bronco aspiração com sete meses de idade. O indivíduo
com Hb SD não foi incluído nas análises. A figura 1 apresenta os eventos clínicos e
de procedimento em cada grupo amostral.
Figura 1. Manifestações e procedimentos clínicos nas crianças com DF. A. Ocorrência das
manifestações clínicas entre os genótipos da Doença Falciforme. B. Ocorrência dos procedimentos
adotados como tratamento contra as manifestações clínicas. IVAS: insuficiência das vias aéreas
superiores; PNM: pneumonia; SE: seqüestro esplênico; STA: síndrome torácica aguda.
Podemos verificar que nos Sβ as ocorrências de febre, PNM, crises de dor e
SE foram maiores em relação aos outros grupos amostrais. O que mais se destacou
foi o SE, pois, por ser uma doença hemolítica grave, desde cedo o SE é presente
nos pacientes com Sβ. O grupo SC apresentou menos ocorrência de todas as
manifestações clínicas em relação aos outros grupos, o que era esperado. A
combinação do alelo S, considerado a complicação mais grave, com o alelo C, que
causa clínica mais branda, ameniza a ocorrência das complicações. Porém aumenta
a viscosidade sanguínea, podendo acarretar nos indivíduos adultos a retinopatia. O
grupo SS apresentou a ocorrência de dactilite, IVAS e STA maiores que os outros
grupos amostrais. A tabela 1 apresenta a comparação das manifestações clínicas
entre os genótipos da DF. Esta comparação ressalta a semelhança entre indivíduos
com o genótipo SS e Sβ, sendo responsáveis pelas maiores ocorrências das
manifestações clínicas ao indivíduo, como mostra a figura 1B, sendo os genótipos
que mais necessitam de tratamento. O contrário ocorre nos indivíduos com genótipo
SC que apresentam uma clínica mais branda em relação aos outros genótipos da
DF refletido com menos internações e transfusões.
116
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Tabela 1. Comparação da ocorrência das manifestações clínicas de acordo com os genótipos da DF no grupo de
estudo prospectivo
Manifestações
Freq.
Freq.
Freq.
Genótipos
p
Genótipos
p
Genótipos
p
Clínicas
(100%)
(100%)
(100%)
SS
71.23
SS
71.23
SC
41.17
Febre
0.18
0.41
0.04*
SC
41.17
Sβ
85.71
Sβ
85.71
Dactilite
SS
SC
21.91
0
-
SS
Sβ
21.91
0
-
SC
Sβ
0
0
-
IVAS
SS
SC
35.61
5.88
0.015*
SS
Sβ
35.61
0
-
SC
Sβ
5.88
0
-
PNM
SS
SC
61.54
41.17
0.12
SS
Sβ
61.54
71.42
0.60
SC
Sβ
41.17
71.42
0.17
Esplenomegalia
SS
SC
6.84
5.88
0.88
SS
Sβ
6.84
0
-
SC
Sβ
5.88
0
-
Crises de dor
SS
SC
35.61
5.88
0.015*
SS
Sβ
35.61
42.85
0.70
SC
Sβ
5.88
42.85
0.02*
SE
SS
SC
28.76
11.76
0.14
SS
Sβ
28.76
71.42
0.02*
SC
Sβ
11.76
71.42
<0.01*
SS
2.73
SS
2.73
SC
0
SC
0
Sβ
0
Sβ
0
IVAS: infecção das vias aéreas superiores; PNM: pneumonia; SE: seqüestro esplênico; STA: síndrome torácica
aguda; N: número de ocorrências; Freq.: freqüência; p: valor de p; * valor de p significativo <0.05.
STA
Conclusão
As ocorrências das manifestações clínicas em indivíduos com DF iniciam-se
desde a primeira infância e o genótipo SS e Sβ são responsáveis por causar as mais
graves manifestações clínicas. Já a presença da Hb C juntamente com a Hb S torna
a clínica mais branda nestes indivíduos. Nada podemos inferir sobre a co-herança
do alelo D com S.
BALLAS, S.K.; LIEFF, S.; BENJAMIN, L.J., et al. Definitions of the phenotypic manifestations of sickle
cell disease. American Journal of Hematology. p.1-8, 2010.
CANÇADO, R.D.; JESUS, J.A. A doença falciforme no Brasil. Revista Brasileira de Hematologia e
Hemoterapia. v. 29, n. 3, p. 203-206, 2007.
MEIER, E. R.; MILLER, J.L. Sickle cell disease in children. Drugs. v.72, n.7, p. 896-906, 2012.
SCHECHTER, A.N. Hemoglobin research and the origins of molecular medicine. Blood. v. 112, n. 10,
p. 3927-3938, 2008.
WEATHERALL, D.J.; CLEGG, J.B. Inherited haemoglobin disorders: an increasing global health
problem. Bulletin of the World Health Organization. v.78, n. 8, p. 704-712, 2001.
117
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
40. Polimorfismos nos genes TLR2 e TLR4 associados com risco de câncer
colorretal e influência na expressão gênica e protéica
1
1,2
1
1
3
PROENÇA, M. A. , OLIVEIRA, J. G. , CADAMURO, A. C. T. , SUCCI, M. , NETINHO, J. G. ,
3
3
1
GOLONI-BERTOLO, E. M. , PAVARINO, É. C. , SILVA, A. E.
1
UNESP, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto,
SP.
2
USC, Univesidade do Sagrado Coração, Bauru, SP.
3
FAMERP, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, SP.
Introdução
O câncer colorretal (CCR) é um dos principais modelos de associação
inflamação-câncer devido a constante exposição a microrganismos e à doença
inflamatória intestinal (COUSSENS; WERB, 2002; WOGAN et al., 2012). Diferentes
classes de genes participam ativamente do processo inflamatório, como receptores
de membrana e de citocinas pró- e anti-inflamatórias, e quando desregulados ou
alterados podem estar relacionados ao desenvolvimento do câncer. Os receptores
Toll-like (TLRs) tem um papel essencial no reconhecimento direto dos agentes
infecciosos, levando à ativação das respostas imune inata e adaptativa. Assim,
polimorfismos em genes que desempenham um papel importante na suscetibilidade
a doenças inflamatórias, como os receptores TLR2 e TLR4 podem ser alvos
interessantes para estudos de possíveis marcadores moleculares para CCR
(NIHON-YANAGI et al., 2012).
Objetivos
Avaliar a associação dos polimorfismos TLR2 -196 a -174del, TLR4 -1607 T/C
(rs10759932) e TLR4 +896 A/G (rs4986790) com o desenvolvimento de CCR, assim
como determinar os níveis de expressão de RNAm e proteínas no tecido tumoral e a
influência dos polimorfismos funcionais sobre esses níveis de expressão.
Foram genotipadas 434 amostras (194 de pacientes com CCR e 240 de
indivíduos saudáveis) de DNA de leucócitos de sangue periférico ou de células de
tecido tumoral (DNA e RNA), por meio das técnicas de PCR alelo-específico e PCRRFLP. A análise de regressão logística múltipla foi utilizada para avaliar a
associação dos polimorfismos com risco de CCR, aplicando os modelos log-aditivo,
dominante e recessivo, ajustados para os fatores de risco (gênero, idade, tabagismo
e etilismo). Para a quantificação relativa (RQ) do RNAm foi utilizada a técnica de
PCR quantitativa em tempo real (qPCR) em 40 amostras de tecido tumoral. As
análises de expressão protéica foram realizadas pela técnica de imunohistoquímica
(anticorpo policlonal de coelho anti-TLR2 - 06-1119, 1:50, Millipore e anticorpo
monoclonal de camundongo anti-TLR4 -76B357.1, 1:200, Abcam) e em seguida
quantificadas por densitometria.
A variante polimórfica TLR2 -196 a -174del foi associada com risco
aumentado de desenvolvimento de CCR de acordo com os modelos dominante
(OR=1,72, IC95%=1,03-2,89; p=0,038) e log-aditivo (OR=1,59, IC95%=1,02-2,48;
p=0,039), porém para os polimorfismos TLR4 -1607 T/C e TLR4 +896 A/G não foram
encontradas associações.
A análise de quantificação relativa (RQ) do RNAm evidenciou aumento
significante na expressão de TLR2 (RQ=2,36) no tecido tumoral quando comparado
118
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
com o tecido normal adjacente (p<0,0001), enquanto para o gene TLR4 não foi
observada diferença significante (RQ=0,74; p=0,452). Quando as amostras de tecido
tumoral foram estratificadas conforme os polimorfismos em região promotora, os
portadores da variante TLR2 -196 a -174 del apresentaram mediana de RQ do
RNAm cerca de 2,19 vezes maior em comparação com o genótipo selvagem,
indicando que o alelo polimórfico del pode estar influenciando no aumento da
expressão gênica de TLR2. Contudo, não foi observada influência do polimorfismo
TLR4 -1607 T/C sobre os níveis de expressão gênica.
Os resultados de imunohistoquímica mostraram expressão protéica maior de
TLR2 no tecido tumoral quando comparado com a mucosa normal adjacente (Figura
1 A-C). Porém não foi observada diferença entre a expressão protéica de TLR4
entre o tecido tumoral e o normal adjacente (Figura 1 D-F). Quando as amostras
foram estratificadas de acordo com o polimorfismo, os portadores do alelo
polimórfico del para o polimorfismo TLR2 -196 a -174 del também apresentaram
expressão protéica maior do que os homozigotos selvagens (Figura 1 G), assim
confirmando os resultados da expressão gênica.
A deleção -196 a -174 do gene TLR2 na região promotora deve aumentar os
níveis de transcrição gênica no tecido tumoral, assim acentuando o processo
inflamatório e consequententemente favorecendo a progressão tumoral.
Conclusão
O polimorfismo funcional TLR2 -196 a -174del encontra-se associado com
risco de CCR, e parece exercer influência sobre os níveis de expressão gênica e
protéica, aumentando a expressão do gene e da proteína TLR2 no tecido tumoral,
evidenciando seu papel importante na carcinogênese colorretal esporádica.
COUSSENS, L M.; WERB, Z. Inflammation and cancer. Nature, v. 420, n. 6917, p. 860-867,
2002.
NIHON-YANAGI, Y. et al. Tissue expression of Toll-like receptors 2 and 4 in sporadic human
colorectal cancer. Cancer Immunol Immunother, v. 61, p. 71-77, 2012.
WOGAN, G. N. et al. Infection, inflammation and colon carcinogenesis. Oncotarget, v. 3, n. 8, p. 737738, 2012.
119
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Figura 1. Expressão protéica de TLR2 e TLR4 no citoplasma do epitélio da mucosa intestinal (seta)
por imunohistoquímica. (A) Expressão moderada de TLR2 na mucosa normal adjacente (NT),
comparada com (B) uma forte imunomarcação no tecido de câncer colorretal. (C) Baixa expressão de
TLR4 na mucosa normal adjacente, comparada com (E) uma moderada imunomarcação de TLR4 no
tecido de câncer colorretal. (C e F) Análise de densitometria (média ± SE) evidenciando uma
diferença significante entre o tecido normal e tumoral para a proteína TLR2 (p <0,001), mas não para
TLR4. (G) Valores de densitometria estratificados de acordo com os polimorfismos. Portadores do
genótipo polimórfico ins/del apresentaram expressão protéica maior do que os homozigotos
selvagens ins/ins (p=0,03). Nenhuma diferença estatística foi encontrada para os valores da proteína
TLR4. A.U.= unidade arbitrária. Todas as imagens são de um mesmo paciente.
120
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
41. Associação de polimorfismos do receptor TCR com a infecção por
Plasmodium vivax no município de Goianésia do Pará, Estado do Pará
1,2
1,2
2
2
CAPOBIANCO, M. P. ; CASSIANO, G. C. ; FURINI, A. A. C. ; TOMAZ, F.M.M.B. ; TRINDADE,
2
2
2
1
1,2,3
P.C.A. ; FRAGA, V. D. ; CONCEIÇÃO, L. M. ; BONINI-DOMINGOS, C. R.. ; MACHADO, R. L. D.
1
Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, UNESP/IBILCE.
2
Centro de Investigação de Microrganismos – CIM – FAMERP.
3
Instituto Evandro Chagas, Pará, Brasil.
Introdução
A migração humana é uma realidade entre as diferentes regiões do país, e a
pouca habilidade no manejo clínico da doença pelos diversos profissionais da área
de saúde se constitui em um sério agravante para a saúde pública. Associado a
estes aspectos sociais o surgimento da resistência às drogas pelo Plasmodium vivax
nos últimos anos é uma realidade (SHEEHY, et al., 2013). Ademais, as evidências
recentes de complicações clínicas associadas com casos fatais, justificam a busca
pelo desenvolvimento de uma vacina para malária (ALECRIM et al.; 2006;
LACERDA et al., 2008; ANDRADE et al., 2010).
Estudos de resposta sorológica a diferentes peptídeos do Plasmodium spp.
tem apresentado resultados variáveis dependentes do antígeno utilizado e da
população analisada e o componente genético do hospedeiro também é importante
na modulação da resposta imune (MEDINA et al., 2011). Polimorfismos em genes de
moléculas envolvidas na resposta imunológica podem influenciar no
desenvolvimento da resposta imune e consequentemente no estabelecimento do
parasito. O receptor do linfócitos T (TCR) é um heterodímero formado por duas
cadeias polipeptídicas unidas entre si por pontes dissulfídicas, que na superfície dos
linfócitos T, estão ligados a uma molécula sinalizadora, denominada CD3. Estas
cadeias apresentam regiões constantes e variáveis, que atribuem especificidade ao
antígeno e se diferenciam entre os clones celulares (LAROCQUE et al. 1996).
Primeiramente, polimorfismos nos genes que codificam as cadeias variáveis podem
resultar em diferenças no número de segmentos gênicos expressos ou em
mudanças na sequência de aminoácidos do produto do gene. Em segundo lugar, as
células T no processo de seleção clonal podem estar aptas a resposta imune em
uma seleção positiva, ou sofrerem apoptose na seleção negativa dependendo do
tipo de TCR que apresentam e de sua afinidade com as moléculas do complexo
maior de histocompatibilidade (MALHOTRA et al., 1992). Alguns dos polimorfismos
de nucleotídeo único (SNP) são identificados no gene do TCR e observados na
cadeia beta. Nesta região, o TCRBV20S1 (C/T) e o TCRBV3S1 (C/T) têm sido
amplamente investigados, pois parecem afetar significativamente o repertório dos
receptores de células T por modificar a capacidade de desenvolvimento de uma
resposta imunológica ( POSNETT et al., 1994).
Objetivos
Identificar dois polimorfismos no gene TCR, estimar as freqüências alélicas e
genotípicas de variantes neste gene em amostras de pacientes infectados por P.
vivax no Estado do Pará e associar estes polimorfismos com a parasitemia do
indivíduo.
Área de estudo: Foram investigados indivíduos infectados por P. vivax provenientes
do município de Goianésia do Pará, Estado do Pará devido ao fato deste município
estar, atualmente, entre os 5 municípios que concentram 50% dos casos de malária
do Estado do Pará. Em 2012 foram registrados 1.136 casos de malária sendo a
maioria ocasionada pelo P. vivax (79,0%).
121
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Amostra: Foi constituída por 83 indivíduos infectados por P. vivax com mais de 18
anos de idade, residentes na localidade de abrangência do projeto, confirmadas
como diagnóstico positivo para malária por P. vivax pelo método da Gota Espessa e
por PCR aninhado. O projeto foi aprovado no CEP/UNESP (n° 331.162) em 10 de
julho de 2013.
Extração de DNA: O DNA foi extraído empregando-se o kit de extração/purificação
Easy DNATM (Invitrogen, Califórnia – USA).
Genotipagem do TCR: Foram avaliados dois polimorfismos em dois diferentes
segmentos gênicos codificadores de cadeias variáveis beta (TCRBV).
Para análise do polimorfismo do TCRBV20S1(C/T) foram utilizados os
seguintes
iniciadores:
5´
ATTCATCAATGGCCAGCGAC
3´
e
5´
GGAGCTTCTTAGAACTCAG 3´. O fragmento resultante foi de aproximadamente
235 bp e foi digerido com a endonuclease de restrição KpnI. Uma substituição de
Citosina por Timina leva a formação de um códon interruptor na sequência do
segmento gênico TCRBV20S1 e, simultaneamente, elimina um sítio de restrição
desta enzima. Sendo assim, indivíduos homozigotos para o alelo nulo poderão ser
identificados pela presença de um único fragmento de 235 bp quando o produto da
PCR for digerido com esta mesma endonuclease de restrição. No entanto, o DNA
dos homozigotos para o outro alelo foi identificado pela presença de dois fragmentos
de 100 e 135 bp e os indivíduos heterozigotos apresentaram três fragmentos cujos
tamanhos foram de 100, 135 e 235 bp (CHARMLEY et al., 1993).
Para análise do polimorfismo do TCRBV3S1(C/T), localizado na SSR deste
segmento gênico, as amostras de DNA foram amplificadas pela técnica de PCR
utilizando os seguintes iniciadores específicos: 5´ CCTTGATGGCCTGTTTTTCAC 3´
e 5´ GTGCCATCGGAGCCAGCAC 3´. O tamanho dos fragmentos resultantes da
amplificação foi de 431bp. Estes fragmentos foram digeridos com a endonuclease de
restrição Pvu. As duas variantes alélicas do TCRBV3S1 diferem somente em um
nucleotídeo (C/T) e a transição de Citosina para Timina gera um sítio para a enzima
PvuII dentro da SSR deste segmento gênico. Indivíduos homozigotos para este alelo
foram identificados pela presença de um único fragmento de 431 bp, refletindo
assim, a ausência do sítio de restrição. Mas, indivíduos homozigotos para o outro
alelo foram identificados pela presença de um fragmento de aproximadamente 352
bp e os heterozigotos foram identificados pela presença de dois fragmentos de 352 e
431 bp, respectivamente (POSNETT et al., 1994; CARPENTER et al.,2007).
Análises estatísticas: Toda a análise estatística foi realizada com o programa R v
2.11.1 (http://www.r-project.org). As frequências genotípicas e alélicas para cada
variante foram obtidas por meio do pacote genetics (WARNES et al., 2011).
Utilizando este pacote, foram avaliados desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg
pelo teste do Qui-quadrado. As diferenças nas medianas da parasitemia em relação
aos genótipos foram avaliadas utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney.
Valores de p < 0,05 foram considerados significantes.
Resultados
Para o polimorfismo no segmento gênico do TCRBV20S1, o genótipo mais
freqüente foi o CC (53,7%) e o alelo mais freqüente foi o C (88,3%). Para o
polimorfismo no segmento gênico do TCRBV3S1 o genótipo mais frequente foi o TC
(46,3%) e o alelo mais freqüente foi o C (82,5%). Ambos os genes se encontram em
equilíbrio de Hardy e Weinberg. A parasitemia variou de 15 a 70.000, com mediana
de 1.500 parasitos por microlitro de sangue. Não houve diferença na parasitemia em
relação aos genótipos de TCRBV20S1 (p = 0,63) e de TCRBV3S1 (p = 0,10). As
frequências genotípicas e associação com a parasitemia são apresentadas na
Tabela 1.
122
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Tabela 1. Frequência dos polimorfismos em TCRBV3S1 e TCRBV20S1 e associação com a
parasitemia.
Polimorfismo
Frequência
Parasitemia
p-value
TCRBV3S1
0.10
CC
35,4
2000
CT
46,3
1500
TT
18,3
1000
TCRBV20S1
0.63
CC
53,7
1500
CT
35,3
2000
TT
11,0
3000
Conclusão
Os resultados deste estudo sugerem que as variantes genéticas analisadas
nos diferentes segmentos gênicos do TCR não afetam a funcionalidade das
moléculas de modo que possa interferir na parasitemia da malária causada por P.
vivax.
Auxílio Financeiro: CAPES, UNESP/São José do Rio Preto/SP e Instituto Evandro Chagas/SVS/MS.
ALECRIM, M.G; LACERDA, M.V.; MOURÃO, M.P; ALECRIM, W.D.; PADILHA A.; CARDOSO, B.S.;
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123
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
42. Aumento da expressão da proteína antiinflamatória Anexina-A1 no câncer
gástrico
1
2
3,4
1
1
MANIEZZO-STUCHI, N.M ; OLIVEIRA-CARDOSO,M.F ; SANTI-NETO,D ; OLIANI,S.M ; SILVA,A.E
1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP-IBILCE), São José do Rio Preto,
São Paulo, Brasil
2
Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP),
São Paulo, Brasil.
3
Hospital de Base, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil
4
Faculdades Integradas Padre Albino (FIPA), Catanduva, São Paulo, Brasil.
Introdução
Existe uma forte associação entre estados de inflamação crônica e câncer, e
acredita-se que mediadores da inflamação possam estar associados a este
fenômeno (RASCH; ALGUL, 2014). Vários estudos indicaram a inflamação crônica
como um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de diversos tipos de
câncer, dentre eles, o câncer gástrico (VANNELLA et al., 2012).
Uma proteína que tem sido relacionada com processos inflamatórios crônicos
e com o câncer é a Anexina-A1 (AnxA1). Esta proteína se liga ao cálcio e a
fosfolipídeos e além da ação antiinflamatória apresenta também ação
antiproliferativa (ZHU et al., 2010). Outras funções da AnxA1 são o crescimento
celular, fusão de membrana, endocitose e exocitose, transdução de sinais,
diferenciação de queratinócitos e apoptose (HUO; ZANG, 2005; JONH et al, 2008).
Expressão alterada da AnxA1, tanto aumentada como reduzida, tem sido descrita
em diversos tipos de neoplasias como mama (KHAU et al., 2011), esôfago, próstata
e estômago, respectivamente, assim como correlacionada com progressão tumoral e
sobrevivência (PAWELETZ et al., 2000; WANG et al., 2006), com participação nos
estágios iniciais e progressão do câncer gástrico (ZHU et al., 2010), assim como
correlação entre a expressão elevada em tumores gástricos e parâmetros clínicopatológicos (ZHANG et al., 2013).
Objetivos
Avaliar a expressão da proteína AnxA1 nas amostras tumorais de pacientes
com adenocarcinoma gástrico comparando-as com as áreas metaplásicas e normal
adjacente ao mesmo.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) desse
Instituto (Parecer nº 122.117).
Caracterização da amostra: Foram processados 21 casos de adenocarcinoma
gástrico selecionados no setor de patologia do Hospital de Base de São José do Rio
Preto-SP. Os blocos com os tumores foram cedidos pelo médico patologista
responsável pelo setor, Dr.Dalisio de Santi Neto. O grupo amostral foi composto por
8 mulheres e 13 homens, e a média de idade para o grupo foi de 64 anos.
Imuno-histoquímica: A técnica de imuno-histoquímica foi realizada para avaliar a
expressão e localização da proteína Anexina-A1 nas amostras de adenocarcinoma
gástrico e tecido normal adjacente, ou metaplasia na ausência de tecido normal. Foi
utilizado o anticorpo primário da AnxA1 (Zymed Laboratories ) na concentração de
1:1000. A densitometria da proteína AnxA1 foi realizada utilizando-se o software
AXIOVISION Release 4.8 versão 15. Para cada amostra foram analisados o
citoplasma e o núcleo das células epiteliais e o estroma a partir de 20 pontos
distribuídos aleatoriamente em três diferentes campos de cada lâmina, totalizando
60 pontos em cada uma dessas três regiões. A análise densitométrica foi realizada
utilizando-se escala arbitrária de 0 a 255.
124
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
Foram processados 21 casos pareados (tecido tumoral x tecido normal
adjacente ou tecido tumoral x tecido metaplásico adjacente), que foram avaliados
pela técnica de imuno-histoquímica, para verificar a expressão e localização da
proteína AnxA1. Foi possível observar aumento significante da expressão da Anexina
A1 no citoplasma tumoral em relação ao citoplasma normal (p<0,01). Estes
resultados podem ser observados na Tabela 1 e Figura 1. A análise estatística foi
realizada por teste Kruskal- Wallis com pós-teste Dunn’s Multiple Comparison.
Tabela 1: Médias dos valores de densitometria da proteína AnxA1 para o citoplasma, núcleo e
estroma das células normais, metaplásicas e tumorais.
Média ± S.E.M
p
Normal
Metaplasia
Tumor
Nor/Met Nor/Tum Met/Tum
Citoplasma
170,3 ± 39,0
176,8 ± 39,3 182,7 ± 34,8
>0,05
<0,01*
>0,05
Núcleo
205,5 ± 32,8
209,3 ± 19,4
209,7 ± 29,7
>0,05
>0,05
>0,05
Estroma
180,7 ± 37,4
177,9 ± 36,9
180,0 ± 34,4
>0,05
>0,05
>0,05
Anxa1
u.a. (unidades arbitrárias)
Nor (Normal); Met (Metaplasia); Tum (Tumor); *diferença significante
250
200
Normal
**
Metaplásico
Tumor
150
100
50
0
Citoplasma
Estroma
Núcleo
Figura 1: Expressão da proteína anti-inflamatória anexina A1 em tecido gástrico (A-C).
(A) Mucosa normal com fraca expressão da proteína AnxA1 no citoplasma e estroma e com leve
aumento da expressão do núcleo das células epiteliais (seta branca). (B) Tecido gástrico
apresentando metaplasia intestinal com marcação fraca para a proteína no citoplasma (seta
vermelha) e estroma (seta amarela). (C) Amostra de adenocarcinoma gástrico com presença de
células mucinosas (círculo vermelho), mostrando aumento da marcação para a proteína AnxA1 no
núcleo (seta branca), citoplasma (seta vermelha) e estroma (seta amarela). Barras: 20 µm.
**
Análises densitométricas da AnxA1 (D). Resultados demonstrados como média ±S.E.M (n=21). ,
p<0,01 versus citoplasma normal.
Já está bem estabelecido que os níveis da proteína Anexina-A1 variam de
acordo com a patologia estudada, no caso de neoplasias a expressão da mesma
parece ser tecido específica (KANG et al., 2012), para o câncer gástrico a relação
entre a expressão da proteína e a progressão da doença permanece contraditória.
Entretanto, em recente estudo finalizado em nosso grupo de pesquisa os níveis de
expressão relativa para o mRNA do gene ANXA1 foi aumentado em relação a
mucosa normal em 90% dos casos de gastrite crônica (média de 4,26 ± 2,03),
similarmente ao observado em câncer gástrico (média de 4,38 ± 4,77), em que 80%
125
________________________________________________________
Doutorado (GHM)
dos casos apresentaram expressão elevada (JORGE et al., 2013). Neste mesmo
estudo foi encontrado expressão intensa da proteína AnxA1 no epitélio e estroma
tanto para os casos de gastrite crônica quanto para os casos de adenocarcinoma
gástrico. Em lesões pré-cancerosas nosso grupo encontrou aumento da expressão
relativa para o mRNA do gene ANXA1 em 100% das amostras de metaplasia
intestinal e úlcera gástrica, e por densitometria encontrou maior expressão da
proteína AnxA1 no núcleo, citoplasma e estroma nos casos de metaplasia intestinal
e úlcera gástrica em relação à mucosa normal (ROSSI et al., 2014).
Desta forma a proteína AnxA1 além de exercer papel anti-inflamatório já
confirmado na literatura, pode também participar nas fases iniciais da carcinogênese
gástrica, contribuindo para a progressão tumoral (ZHU et al., 2010), sendo indicada
como um possível biomarcador de prognóstico para esta neoplasia (ZHANG et al.,
2013).
Conclusão
As análises realizadas até o momento demonstraram aumento da expressão
da proteína AnxA1 no citoplasma tumoral em relação ao citoplasma normal, porém
as conclusões sobre a expressão da proteína AnxA1 neste grupo amostral poderão
ser definidas somente ao fim das análises, nas quais serão avaliadas também a
localização e quantificação da expressão desta proteína em relação aos achados
clínico-patológicos.
Auxílio Financeiro: FAPESP e CNPq
FERNANDES A.M., BABETO E., RAHAL P., PROVAZZI P.J., HIDALGO C.A., ANSELMO-LIMA W.T.
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126
Genética Vegetal
(GV)
___________________________________________________
Iniciação Científica (GV)
43. Estimação de parâmetros genéticos de caracteres de desenvolvimento
inicial de progênies de castanha-do-brasil
1
2
OLIVEIRA, V. X. A ; COSTA, E. K. L ; PEDROZO, C. A.
1
Faculdade Cathedral
2
Universidade Federal de Roraima
3
EMBRAPA/RR
3
Introdução
A castanheira-do-brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) pertence à família
Lecythidaceae e, no Brasil, é encontrada em Roraima, Rondônia, Acre, Amapá,
Amazonas, Pará, Maranhão e Mato Grosso. A espécie desempenha papel
importante na subsistência de milhares de famílias residentes na floresta, ou em
áreas próximas a estas (TONINI, 2011).
Apesar da grande importância socioeconômica da espécie, quase toda a
produção de castanha-do-brasil é oriunda do extrativismo, fato que justifica a
introdução de castanhais cultivados. No entanto, o cultivo é limitado pela
indisponibilidade de material genético selecionado, bem como pela dificuldade na
produção de mudas.
A qualidade das mudas produzidas, a qual é, geralmente, acessada por meio
de caracteres ligados ao desenvolvimento da raiz e da parte área, é essencial para
programas de melhoramento e, consequentemente, para o sucesso de qualquer
plantio florestal. Sendo assim, informações sobre a magnitude da variabilidade
genética, bem como da herdabilidade destes caracteres são necessárias.
Objetivo
Estimar parâmetros genéticos de caracteres de desenvolvimento inicial da
parte área de progênies de castanha-do-brasil.
O material genético utilizado no estudo consistiu de dezesseis progênies de
polinização livre de castanheira-do-brasil, selecionadas, com base em dados de
produção de sementes, em três populações nativas de Roraima. Uma das
populações está localizada no município de São João da Baliza, enquanto que as
outras duas estão localizadas em Caracaraí, sendo uma na região do Itã e a outra
na região do Cujubim. Quatro progênies foram selecionadas da população de São
João da Baliza, sete da população do Itã e sete da população do Cujubim.
Cinco frutos foram aleatoriamente coletados de cada uma das progênies na
safra 2013 e transportados para o Laboratório de Solos da Embrapa Roraima, onde
as sementes foram utilizadas para plantio.
Cerca de dez dias após a emergência, plântulas de cada uma das 16
progênies foram transplantadas para sacos de plástico preto com dimensões de 15
cm de largura, 26 cm de altura e 100 micras de espessura. O substrato utilizado no
transplantio foi constituído por solo + areia lavada + serragem curtida na proporção
volumétrica de 2:1:1. As plântulas foram levadas para viveiro com 50% de
sombreamento, com irrigação três vezes ao dia.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com 16
tratamentos (progênies) e quatro repetições, sendo cada parcela experimental
constituída por cinco plântulas. Três meses após o transplantio, as plântulas foram
avaliadas quanto ao número de folhas (NF), altura da plântula (ALT; cm) e diâmetro
do colo (DC; mm).
Os parâmetros genéticos de cada caractere de desenvolvimento foram
estimados usando o modelo 05 do Programa SELEGEN-REML/BLUP (Resende,
128
___________________________________________________
2002). Apesar de este modelo ser específico para avaliar experimentos de blocos ao
acaso, com progênies de meio-irmãos provenientes de várias populações e com
várias plantas por parcela, o mesmo foi adaptado para o delineamento inteiramente
casualizado.
Não há, na literatura, informações genéticas para caracteres de
desenvolvimento em castanheira-do-brasil. Pelas estimativas dos parâmetros
genéticos do NF, da AP e do DC apresentadas na Tabela 1, pode se observar que a
variância genética entre populações (Vpop) foi bastante reduzida (0,00; 1,12 e 0,06
para NF, AP e DC, respectivamente) e inferior à variância genética aditiva (V a) (8,16;
17,78 e 0,50 para NF, AP e DC, respectivamente). A superioridade das estimativas
da Vpop em relação à Va pode indicar predominância de alogamia nas populações
estudadas. Buckley et al. (1988) observaram elevado nível de variação genética
dentro populações de castanheira, consequência da elevada taxa de cruzamento
entre os indivíduos (O’MALLEY et al., 1988).
Tabela 1. Estimativas de parâmetros genéticos para os caracteres número de folhas (NF), altura (AP;
cm) e diâmetro do colo (DC; mm) de mudas de 16 progênies de castanheira-do-brasil pertencentes a
três populações nativas, avaliados aos três meses após o transplantio. Boa Vista – RR, 2014
Caracteres
Parâmetros
NF
AP
DC
Va
Vparc
8,16
0,12
17,78
0,08
0,50
0,00
Vpop
0,00
1,12
0,06
Ve
Vf
6,05
14,35
2,44
21,42
0,13
0,69
h2a
0,57
0,83
0,72
ICh2a
0,24
0,29
0,27
c2parc
0,01
0,00
0,00
c2pop
0,00
0,05
0,09
CVgi (%)
29,62
43,75
25,06
CVgp (%)
14,81
21,88
12,53
CVe (%)
16,58
18,67
11,33
Média geral
10
9,65
2,82
Va: variância genética aditiva; Vparc: variância ambiental entre parcelas; 2Vpop: variância genética entre
populações; Ve: variância
residual; Vf: variância fenotípica
individual;
h a: herdabilidade individual no
2
2
2
sentido restrito; ICh2 a:intervalo de confiança para a h a; c parc: coeficiente de determinação dos
efeitos de parcela; c pop: coeficiente de determinação dos efeitos de populações; CVgi: coeficiente de
variação genética aditiva individual; CVgp: coeficiente de variação genética entre progênies; CVe:
coeficiente de variação residual.
2
As estimativas de herdabilidade individual no sentido restrito (h a) foram
elevadas para os três caracteres (0,57; 0,83, e 0,72 para NF, AP e DC;
respectivamente), indicando expressivo controle genético sobre estes caracteres.
Estas estimativas elevadas devem também representar o reflexo das pequenas
variações ambientais que atuaram sob as plantas durante a condução do
experimento.
A variabilidade genética dentro de progênies foi, aproximadamente, duas
vezes maior que a variabilidade genética entre progênies para os três caracteres,
fato que pode ser observado pelos coeficientes de variação genética aditiva
129
___________________________________________________
individual e de variação genética entre progênies (CV gi e CVgp, respectivamente), os
quais representam, em porcentagem da média geral, a quantidade de variação
genética existente para cada um destes níveis. Estes coeficientes foram elevados e
variaram de 25,06% (DC) a 43,75% (AP) para o CVgi e de 12,53% (DC) a 21,88%
(AP) para o CVgp. Estes valores indicam que, para maximizar os ganhos genéticos e
manter a variabilidade genética em um programa de melhoramento, a seleção de
indivíduos deve ser priorizada.
A razão entre o CVgi e o coeficiente de variação experimental (CV e) é
também usada como indicador de sucesso obtido com a seleção de indivíduos,
devendo haver expectativa de progresso quando a razão é superior a 1,0
(VENCOVSKY, 1992; FALCONER, 1987). No presente estudo, a razão CVgi/CV e
variou de 1,79 para NF a 2,34 para AP.
Conclusão
Os elevados valores de herdabilidade obtidos indicam possibilidade de
seleção para caracteres da parte aérea na fase inicial de desenvolvimento. No
entanto, genótipos selecionados nesta fase devem ser avaliados em idades mais
avançadas para confirmar o desempenho dos mesmos.
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FALCONER, D. S. Introdução a genética quantitativa. Viçosa: Imprensa Universitária, 1987. 279 p.
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VENCOVSKY, R.; BARRIGA, P. Genética biométrica no fitomelhoramento. Ribeirão Preto:
Sociedade Brasileira de Genética, 1992.
130
__________________________________________________________
Mestrado (GV)
44. Sequenciamento e análise de genótipos de cana-de-açúcar submetida à
prolongada limitação hídrica
1
1
1
2
3
BELESINI, A.A. ; TELLES, B.R. ; PINHEIRO, D.G. ; GIACHETO, P.F .; CAVALLARI, S.D.C. ,
1
1
CAZETTA, J. O. , FERRO, M.I.T.
1
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP / FCAV – Jaboticabal
2
EMBRAPA Informática Agropecuária
3
APTA- Pólo Centro Oeste
Introdução
A cana-de-açúcar é uma importante cultura para a produção de açúcar e
etanol. A expansão do cultivo desta cultura no Brasil avançou nos últimos anos para
regiões conhecidas por apresentarem longos períodos de restrição hídrica durante o
ano (CARLIN & SANTOS, 2009). Para manter a produtividade vegetal sob condições
de pouca umidade nos solos, há um grande interesse na identificação de
características bioquímicas e moleculares durante a adaptação ao estresse que,
posteriormente, poderão ser utilizadas na produção de cultivares tolerantes em
programas de melhoramento genético (SILVA,2010).
Um poderoso recurso para a análise das respostas das plantas ao estresse, é
o estudo do transcriptoma (LESTARI et al., 2006), A técnica de RNA-Seq , uma das
técnicas para a identificação de genes diferencialmente expressos, permite o
mapeamento e quantificação de transcriptomas (RODRIGUES, 2011), e segundo
Ambrosone et al. (2012) essa ferramenta tem sido utilizada para descrever as
respostas genéticas das plantas aos estímulos ambientais. Os resultados obtidos
serão importantes para o melhor entendimento das respostas e mecanismos de
tolerância dessas plantas à deficiência hídrica e ajudarão a estabelecer métodos
seguros para identificar e recomendar cultivares que realmente sejam tolerantes a
esse estresse.
Objetivos
Sequenciar, pela técnica de RNA-Seq, dois genótipos de cana-de-açúcar
SP81-3250 (tolerante à seca) e RB855453 (suscetível à seca), em três períodos de
deficiência hídrica (90, 120 e 150 dias) e analisá-los por ferramentas de
bioinformática.
Instalação do Experimento
O experimento foi instalado e conduzido em casa de vegetação, com
delineamento experimental em blocos casualizados, no esquema fatorial 2×3 (duas
cultivares (C) × três tensões superficiais (T)), com três repetições, perfazendo um
total de 18 tratamentos. Foram utilizadas duas cultivares comerciais de cana-deaçúcar consideradas potenciais em produtividade: SP81-3250 (padrão de tolerância)
e RB855453 (padrão de suscetibilidade) (PINCELLI, 2010). Aos 60 dias após o
plantio, houve a diminuição da tensão superficial do solo, dando início a aplicação
dos tratamentos correspondentes, os quais serão mantidos e avaliados em três
épocas: E1 (30 dias após aplicação do estresse), E2 (60 dias após aplicação do
estresse) e E3 (90 dias após aplicação do estresse). Constituindo-se das idades de
90, 120 e 150 DAP, período dentro do qual aproximadamente 70 a 80% da produção
de cana é constituída (SINGH & RAO, 1987).
131
__________________________________________________________
Mestrado (GV)
Coleta das amostras
Para as avaliações moleculares, a folha+1 de cada uma das plantas foi
coletada, fragmentada, envolvidas em papel alumínio e imediatamente transferidos
para o nitrogênio líquido e armazenados em ultrafreezer – 80°C, até sua utilização.
Foram realizadas três coletas, aos 30, 60 e 90 dias após aplicação do estresse.
Extração do RNA Total 
Para extração do RNA total das folhas foi utilizado o kit PureLink® RNA Mini Kit
da Ambion, segundo as recomendações do fabricante. Para avaliações de
integridade, concentração e pureza do RNA utilizou-se respectivamente o
Bioanalyzer 2100 (Agilent), Qubit® 2.0 (Invitrogen) e NanoDrop ND-1000.
Sequenciamento do RNA
O sequenciamento dos mRNAs via RNA-Seq foi realizado na Facility de
sequenciamento da FCAV/UNESP utilizando a plataforma HiScanSQ System
Illumina, seguindo as instruções do fabricante para sequenciamento paired-end e
fragmentos de 100 bp.
Análise dos dados 
Os dados gerados no sequenciamento (sequenciador HiScanSQ, Illumina)
estão organizados por bibliotecas em arquivos no formato FASTQ, onde os dados
das leituras foram previamente processados, incluindo poda de adaptadores e
regiões de baixa qualidade.
Foi construído um banco de dados de referência com sequências já descritas e
armazenadas em bancos referente à cana-de-açúcar, bem como organismos
aparentados como sorgo e milho. Estes bancos de dados incluem sequências de
cloroplastos, RNA ribossomal e transportador, DNA e plasmídeo mitocondrial,
sequências de cana-de-açúcar descritas em artigos recentes, além daquelas
presentes no UNIGENE (NCBI). As bibliotecas foram confrontadas com tais bancos,
utilizando as ferramentas Bowtie e TopHat.
Após a extração do RNA total, os mesmos foram submetidos à quantificação.
As amostras de RNA, foram quantificadas em Nanodrop para verificação de
contaminação, e os mesmos se apresentaram dentro dos valores esperados, dando
suporte às etapas seguintes do projeto.
A análise da integridade do RNA total foi realizada através do equipamento
Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). O software do equipamento
expressa a integridade das amostras baseado em um sistema numérico de 1 a 10,
onde o 1 representa o perfil mais degradado e o 10 o mais intacto, chamado de RNA
Integrity Number (RIN) (BISELLI,2011). Os resultados do número de integridade do
RNA (RIN) de todas as amostras de RNA total apresentaram valores entre 7,3 a 8,2
demonstrando que todos os RNAs extraídos estavam íntegros e de qualidade.
Por fim, a fluorimetria (Qubit- Invitrogen) fornece uma quantificação mais
precisa pois utiliza um sistema de fluorescência altamente específico, onde
fluoróforos se intercalam apenas na fita de RNA e o sinal emitido por estes
fluoróforos é detectado pelo aparelho. As concentrações de RNA variaram de 38,10
a 250,0 ng/µL, tendo, portanto, uma concentração de RNA suficiente para se realizar
as bibliotecas e sequenciar os transcritos.
Após a seleção das melhores amostras de RNAs, realizou-se a confecção dos
cDNAs, clusterização e finalmente o sequenciamento. Ao fim do sequenciamento,
iniciou-se a análise de dados do mesmo. O primeiro passo, foi fazer um
132
__________________________________________________________
Mestrado (GV)
levantamento dos dados brutos, revelando assim, o número de leituras geradas para
cada uma das amostras, bem como o índice de qualidade. Posteriormente foi
realizada uma poda dos adaptadores, bem como a retirada de regiões de baixa
qualidade, os dados para cada uma das épocas amostrais estão apresentados na
Tabela 1.
Os dados do alinhamento ainda estão em andamento, e por esse motivo,
ainda não estão disponíveis.
Tabela 1. Somatória das leituras geradas em cada uma das épocas amostrais (30, 60 e 90 dias)
Conclusão
Os dados gerados até o momento sugerem uma discrepância no número de
leituras nas diferentes épocas amostrais. Um estudo detalhado está sendo realizado
a fim de identificar quais são os genes expressos envolvidos e qual sua função
diante do estresse a que a planta foi submetida.
AMBROSONE, A.; DI GIACOMO, M.; LEONE, A.; GRILLO, M. S.; COSTA, A. Identification of early
induced genes upon water deficit in potato cell cultures by cDNA-AFLP. Journal Plant ResearchRegular paper, 10p, 2012.
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periférico de crianças com síndrome de Down. São José do Rio Preto, 2011, 86p.Tese (
Doutorado em Ciências da Saúde; Eixo Temático: Medicina e Ciências Correlatas)- Faculdade de
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RODRIGUES, F.A.; GRAÇA, J.P.; LAIA, M.L.; NHANI-JR, A.; GALBIATI, J.A.; FERRO, M.I.T.;
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Agricultural Science, v.108, p.245-247, 1987.
133

XVII Simpósio de Genética

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