Arquivo - Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
FLÁVIA MARTINS DA SILVA
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO
SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO
BIOTECNOLÓGICA
Salvador
2014
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FLÁVIA MARTINS DA SILVA
AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO
SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO
BIOTECNOLÓGICA
Orientadora: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede
Co-orientadora: Profª Drª Suzana Telles da Cunha Lima
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal da Bahia, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência
de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.
Salvador
2014
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Sistema de Bibliotecas - UFBA
Silva, Flávia Martins da.
Avaliação do estresse etanólico em leveduras não Saccharomyces do gênero Hanseniaspora :
uma contribuição biotecnológica / Flávia Martins da Silva. - 2015.
61 f.: il.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Eugênia de Oliveira Mamede.
Co-orientadora: Profª. Drª. Suzana Telles da Cunha Lima.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador,
2014.
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AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO
SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO
BIOTECNOLÓGICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal da Bahia, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência
de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.
Aprovada em: ____/_____/______
Banca Examinadora:
Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamade – Orientação
Faculdade de Fármacia - (FFAR)
Universidade Federal da Bahia - (UFBA)
_____________________________________________
Prof. Dr. Celso Duarte Carvalho Filho
Faculdade de Farmácia (UFBA)
_____________________________________________
Profª Drª Adriana Oliveira Medeiros
Instituto de Biologia - (UFBA)
_____________________________________________
15
Dedico esta tese à minha mãe e ao meu pai, e
minha
irmã
incondicionais
que
através
tornaram
conquistas da minha vida.
do
apoio
possíveis
e
todas
amor
as
16
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede pelos
ensinamentos e confiança.
A Profº Drª Suzana Telles da Cunha Lima agradeço profundamente pela
delicadeza, profissionalismo, ética, integridade, paciência, dispensando vários
momentos do seu tempo em orientação e conversas que muito contribuíram para a
execução do meu trabalho. Tenho certeza que levarei para sempre os ensinamentos
dessa admirável profissional e pessoa humana extraordinária.
A Profª Drª Alaise Gil meu muito obrigado pelo carinho, dedicação e a forma
respeitosa que sempre me tratou.
Sou muito grata ao Departamento de Biologia, especialmente a Profª Paula
Ristow pela paciência e acolhimento ao LBM – Laboratório de Biologia Molecular.
A todos os meus queridos colegas que se transformaram em importantes
amigos
Adriana,
Willian,
Igor,
Candé
meu
sincero
muito
obrigada
pelo
companheirismo, parceria e cumplicidade.
Ao LAMUME (Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica), do
Laboratório de Física Nuclear Aplicada no Instituto de Física. Ao Professor Antônio
Ferreira por ceder a estrutura do (MEV) e a dedicação de Jessica Guerreiro, a eles o
meu muito obrigada.
A amiga Elizabeth pelos momentos do seu tempo que dedicou na sua ajuda,
carinho e atenção.
17
“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais
inteligente, mas o que melhor se adapta as
mudanças”
Charles Darwin
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SILVA,Flávia Martins. AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS
NÃO SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA
CONTRIBUIÇÃO BIOTECNOLÓGICA.61f.2014. Dissertação (Mestrado) –
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2014.
Orientadora: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede.
RESUMO
As leveduras do gênero Hanseniasporas contribuem durante a fermentação etanólica
do mosto uvas com a produção de compostos voláteis que proporcionam sabor, aroma e
características singulares ao vinho. O etanol produzido durante fermentação é um potente
fator de estresse, para as Hanseniasporas provocando inibição do crescimento e
inviabilidade celular, pois, estas não toleram concentrações crescentes de etanol no meio.
No entanto, as leveduras como Saccharomyceas são mais resistentes ao etanol, por
exibirem proteínas de choque térmico(HSPs) e adaptações em sua ultraestrutura celular que
permitem a sua resistência durante a fermentação etanólica. O objetivo deste estudo foi
avaliar o estresse etanólico das Hanseniaspora durante o processo fermentativo, analisando
crescimento celular, o perfil da expressão protéica e as modificações em sua ultraestrutura
em diferentes concentrações de etanol (0%.1%,2%,3%,6%,9%,12%) em cepas Ho
(Hanseniaspora
opuntiae)
e
Hg(
Hanseniaspora guillermondii). As alterações na
ultraestrutura foi analisada através da Microscopia eletrônica de Varredura (MEV).
A
expressão proteica foi avaliada a partir da análise eletroforética pelo método SDS PAGE
(poliacrilamida do tipo desnaturante). A análise morfológica mostrou alterações induzidas
pelo etanol com comprometimento da integridade da parede celular, plasmólise e autólise
celular a partir de 6% de etanol, no entanto, Scb (Saccharomyces cerevisiae da variedade
bayanus) manteve células viáveis a concentração de etanol até 12%. Os resultados indicam
que a expressão aumentada de peptídeos com pesos moleculares encontrados de 10kDa e
100kDa. Essas proteínas apresentam perfil eletroforético aproximado ao de HSPs e/ou
chaperonas moleculares sintetizadas em resposta às condições de estresse. Nas leveduras
Ho41 e Hg43 não foram encontradas respostas adaptativas ao estresse etanólico, como
pseudohifas ou formas esporuladas, estas em Scb apresentam como forma de resistência
ao estresse etanólico. A única proteína associada ao estresse etanolíco foi a 100kDa, que
apresentou um aumento de expressão durante o estresse etanólico na levedura Hg43 em
19
3% e 6% de etanol. A proteína 100 kDa, já vista associada anteriormente ao estresse
etanolíco. A ausência de outros marcadores protéicos relacionados a resistência etanólica
em
Hanseniasporas ( Ho41 e Hg43), possivelmente seria um dado que explicaria a
intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de etanol.
Palavras Chaves: HSPs, Hanseniaspora, Estresse, etanol
20
SILVA,Flávia Martins. STRESS EVALUATION IN ETHANOLIC YEAST
SACCHAROMYCES NOT GENDER HANSENIASPORA: A BIOTECHNOLOGY
CONTRIBUTION.61f.2014.Dissertation (Master ) - Faculty of Pharmacy, Federal
University of Bahia , Salvador , 2014 .
Guiding: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede.
ABSTRACT
The yeast genera Hanseniasporas contribute during the ethanol fermentation of
grapesmust, with the production of the volatile compounds that provide taste, flavor
and singular characteristics to the wine .The ethanol which is produced during
fermentation process, is a powerful stress factor to the Hanseniasporas and it has
caused inhibition of the growth and cell infeasibility, because, they do not tolerate (in
the middle) the ethanol increasing concentration. However, the yeasts such
Saccharomyces are more resistant to ethanol as they exhibit heat shock proteins
(HSPs) and adaptations in their cell ultrastructure that make them resistant during
ethanol fermentation. The aim of this study was evaluate the ethanol stress of the
Hanseniaspora, during the fermentation process. It analysis the cell growth, protein
expression profileand changes in the ultrastructure in different concentrations of the
ethanol (0% .1%, 2%, 3%, 6 %, 9%, 12%) in strains Ho ((Hanseniaspora opuntiae)
and Hg (Hanseniaspora guillermondii). About ultrastructure changes, it was analyzed
by Scanning electron microscopy (SEM). And referring toProtein expression, it was
evaluated from the electrophoretic analysis by the SDS PAGE method (denaturing
polyacrylamide). The morphological analysis showed changes induced by ethanol
compromising the cell wall integrity, and autolysis and plasmolysis cells from 6%
ethanol. However, Scb ((Saccharomyces cerevisiae bayanus variety) remained
viable cell and the concentration of ethanol until 12%. The results indicate increased
expression of peptides found with molecular weights of 10kDa and 100kDa.These
proteins have presented the electrophoretic profile approached of HSPs and /or
synthesized molecular chaperones, in response to stress conditions. In Ho41 and
Hg43 yeasts, were found adaptive responses to ethanol stress, as pseudohyphae or
sporulated forms, these in Scb present as a form of resistance to ethanol stress. The
only protein that could be associated to ethanol stress was a 100Da, which
presented an increased expression during ethanol stress in Hg43 yeast in 3% and
21
6% of ethanol. The 100 kDa’ protein, as seen previously associated to ethanol stress.
The
absence
of
other protein
markers related
to
ethanol resistance
in
Hanseniasporas (Ho41 and Hg43), possibly would be a given, that could explain
these yeasts intolerance to increasing ethanol concentration.
Key Words: HSPs, Hanseniaspora, Stress and Ethanol.
22
23
1 INTRODUÇÃO GERAL
A transformação do mosto em vinho é um processo microbiológico complexo,
caracterizado pela predominância sequencial de diferentes espécies de leveduras e
outros microrganismos. A qualidade e as características sensoriais do vinho estão
intimamente associadas com a biodiversidade da microbiota de leveduras. As
leveduras envolvidas na vinificação originam-se da microbiota na superfície da uva e
da flora secundária, que coloniza as superfícies de equipamentos e utensílios
aplicados na fabricação de vinhos. Na prática da vinicultura os principais organismos
responsáveis
pela
fermentação
etanólica
são
as
Saccharomyces
e
não-
Saccharomyces. No entanto existe um interesse crescente no papel destas
leveduras não Saccharomyces na produção de vinhos, pois elas conferem sabor e
aroma com qualidades e características singulares.
Comparativamente, a levedura fermentativa por excelência, Saccharomyces
cerevisiae, encontra-se em menor concentração no início da fermentação, mas
devido à sua elevada tolerância ao etanol consegue rapidamente predominar, após
os primeiros dias do processo, sendo geralmente a única espécie encontrada no
final da fermentação. No entanto, a transformação de uvas maceradas num produto
acabado, o vinho, envolve um série de complexas interações entre gêneros
relacionados Saccharomyces (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus,
Saccharomycesparadoxus),nãoSaccharomyces(Hanseniaspora,Hanseniaspora,Can
dida,Kluvyveromyces),fungos filamentosos (Aspergillus, Botrytis ePenicillium), e
outras bactérias. Juntos, a dinâmica, o desenvolvimento, a sucessão, e a atividade
metabólica durante fermentação geram uma variedade de metabolitos secundários,
álcoois superiores, ésteres, aldeídos, cetonas, compostos voláteis, ácidos orgânicos,
e enzimas, que interferem com propriedades organolépticas finais e aromáticas do
vinho.
As leveduras Hanseniaspora apresentam menor resistência ao etanol do que
as Saccharomyces, por processos complexos ainda pouco esclarecidos. O etanol é
o produto principal da fermentação e atua como potente fator de estresse para as
células das leveduras. Além do etanol, a temperatura e outros parâmetros físicos e
químicos considerados como fatores de estresse podem também interferir no
desempenho da fermentação como: pH, nutrientes, substâncias inibidoras e outros,
24
que irão influenciar diretamente na expressão de proteínas específicas, chamadas
de proteína de choque térmico(HSP) que contribuem para modificar a atividade
biológica da levedura durante a fermentação do mosto e no seu desempenho
fermentativo.
Há um interesse em saber quais as proteínas de choque (HSPs) são
expressas no momento em que as células das leveduras Hanseniasporas são
expostas á toxicidade etanólica, pois estas exercem um papel importante na
proteção da integridade biológica contra os fatores de estresse.
A proteômica em diferentes condições ambientais é importante para
identificar, as proteínas que estão diretamente relacionadas com a proteção contra
as determinadas variações no ambiente. Estudar determinantes e mecanismos de
adaptação e resistência a um determinado estresse seriam importantes, para
conhecer o porquê do baixo rendimento fermentativo das leveduras não
Saccharomyces. As proteínas de interesse podem também ser identificadas na base
do conhecimento do ponto isoelétrico e do peso molecular aparente, determinados a
partir dos géis bidimensionais.
Seria possível, admitir a hipótese de que, bioprospecção de espécies de
leveduras do grupo Hanseniasporas que tivessem maior expressão destas proteínas
de choque térmico, teriam uma maior proteção e capacidade de resistência ao
estresse, produzido pela toxicidade etanólica. Em consequência disto, teriam uma
maior tolerância á presença do etanol no mosto de uva, podendo-se estender o
tempo de fermentação, contribuindo para produção de compostos voláteis
conhecidos como produtos secundários da fermentação atribuindo qualidade
sensorial ao vinho.
Desta forma este estudo teve como propósito avaliar o comportamento das
leveduras Hanseniasporas em meio etanólico, as alterações na sua ultraestrutura
celular assim como a expressão das proteínas de choque térmico, em condições de
indução ao estresse etanólico , além de servir como bioprospecção e melhoramento
genético dessas espécies.
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o estresse etanólico das leveduras Hanseniaspora opuntiae e
Hanseniaspora guilliermondii durante o processo fermentativo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Avaliar o crescimento celular durante o estresse etanólico.
2 - Analisar o perfil da expressão protéica das leveduras no processo fermentativo
etanólico.
3 - Observar a ultraestrutura por Microscopia Eletrônica de Varredura das leveduras.
4 - Avaliar a síntese das HSPs nas diferentes concentrações de etanol.
26
CAPÍTULO I
REVISÃO DE LITERATURA
1. CARACTERÍSTICA GERAL DAS LEVEDURAS
A vinificação é uma arte milenar que existe desde período Neolítico. A
produção de vinho é o resultado de ações combinadas de diversas espécies de
microrganismos que crescem em diferentes proporções ao longo de uma
fermentação. Um dos mais importantes grupos de microrganismos comercialmente
explorados no processo de vinificação são as leveduras. Sua larga aplicação
biotecnológica tem alto valor comercial em diversas industrias, dentre as quais a de
maior importância é a que
utiliza processos fermentativos na fabricação de (pão,
cachaça, vinho,cerveja e álcool combustível) (BAMFORTH, 2005; CORTES, 2010).
Leveduras são microrganismos pertencentes ao reino Fungi, ao filo
Ascomycota e Basidiomycota à ordem Saccharomycetales. São parasitas ou
saprófitas e heterotróficos. Dependentes de carbono orgânico como fonte de energia
e podem estar associadas ao néctar de frutos frescos, vegetais, ou ainda no trato
digestivo de animais, ou em ambientes de baixo recurso hídrico, bem como
presentes em qualquer substrato que lhes forneça o açúcar. (CHENG et al, 2010 ).
A biomassa de levedura em ambientes naturais esta associada a substratos
ricos em açúcar ou compostos de carbono facilmente assimiláveis (flores e frutos).
Em suas necessidades nutricionais, elas utilizam fonte de carbono (mono e
dissacarídeos), nitrogênio, mineral e vitaminas (tiamina, biotina, ácido pantotênico)
para o seu desenvolvimento. Os compostos de nitrogênio (aminoácidos) são
prontamente utilizados como forma de energia. São mesófilas, crescem em faixa
ótima de temperatura de 25 a 28ºC, e em faixa ótima de pH entre 4,0 e 4,5.
(BAMFORTH, 2005).
27
2. PAREDE CELULAR
A parede celular fúngica pode ser caracterizada como uma estrutura
relativamente rígida, porém dinâmica, que participa de vários processos biológicos
essenciais à célula. A sua estrutura oferece suporte osmótico, proteção física, além
de estar relacionada a eventos de sinalização celular, adesão, formação de biofilme,
interações com o ambiente externo, reprodução, sendo por isso necessária para o
crescimento e desenvolvimento dos fungos nos ambientes onde são encontrados
(NIMRICHTER et al, 2005; PEREZ, 2006; MADDIA, et al, 2009).
Pesquisas sobre a composição e organização da parede da célula de
Saccharomyces
cerevisiae,
Candida
albicans,
Aspergillus
fumigatus,
Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa, Hanseniaspora uvarum e
Cryptococcus neoformans são comparados e contrastados (PEREZ,2006). Estas
paredes celulares contêm quitina, quitosano, β - 1, 3 - glucana, β - 1, 6 - glucano,
misturado β - 1, 3-/β-1, 4 - glucana, α - 1, 3 - glucana, a melanina, e glicoproteínas
como principais constituintes. Esses componentes são integrados em conjunto, para
gerar uma matriz de parede celular, na presença de enzimas. Free (2013) realizou
uma comparação entre essas paredes celulares, mostrando que, existe uma grande
quantidade de variabilidade, na organização e composição da parede da célula
fúngica entre as espécies. Isto sugere que esta variabilidade da parede celular pode
influenciar em elementos estruturais e receptores de estresse ambiental que protege
a célula de mudanças ambientais.
Pesquisas têm sido realizadas em torno do entendimento da parede celular
fúngica
e
sua
constituição
química,
principalmente
das
leveduras,
como
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe largamente utilizadas na
produção de alimentos (MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005; NOMBELA, 2006).
Além da Saccharomyces cerevisiae, outras leveduras de interesse biotecnológico,
têm se destacado: como Pichia pastoris utilizada para a produção de proteínas
heterólogas ou a Hansenula anomala grande produtora de acetato de etila utilizado
como solvente
na indústria química. Outras leveduras como a Cândida utilis
produtora de glicerol e a Hanseniaspora guilliermondii, Kloeckera apiculata a
Kloeckera apis caracterizam-se por serem grandes produtora de aroma de interesse
28
enológico. Os constituintes da parede celular fúngica contribuirá para o
conhecimento básico do microrganismo, o entendimento de suas relações com o
meio e comportamento desta em relação ao estresse etanólico durante a
fermentação.
2.1 MEMBRANA
As membranas são estruturas presentes em todos os organismos. É definida
como membranas flexíveis, dinâmicas e seletivamente permeáveis a solutos polares,
o que lhes confere a capacidade de controlar a homeostasia celular. Muitos
processos celulares são organizados ou estão associados à participação de
membranas, tais como transdução de sinal por proteínas de choque térmico (HSPs),
síntese proteíca, lipídica e transporte de metabólitos, e ainda outros que dependem
da capacidade das membranas de sofrerem fissão e se re-associarem, como divisão
celular e endocitose (NELSON, 2005; HENDERSON, 2014).
Em estudo admitiu-se que, características biofísicas das membranas são
resultantes das interações lipídio-lipídio e a sua modulação por interações lipídioproteína e proteína-proteína que se relacionam, estimulando respostas a vários tipos
de sinais e alterações de condições fisiológicas principalmente em processos
fermentativos (GROSSMANN et al, 2007; HOFMAN et al, 2008; GUAN et al, 2009).
Em pesquisa realizada com S. cerevisiae foi demonstrado que a membrana
desenvolveu estímulos e respostas adaptativas na presença do peróxido de
nitrogênio ( H2O2 ) realizando alterações na permeabilidade seletiva na presença
deste agente oxidante (SOUSA et al, 2004). Sendo assim as alterações na
composição proteica e lipídica da membrana plasmática é em consequência de suas
propriedades biofísicas a responder a estímulos do meio extracelular (PEDROSO,
2009; FOLMER et al, 2008).
29
2.2 CINÉTICA DE CRESCIMENTO
A cinética do crescimento de leveduras em fermentação segue a
padronização típica de cultivo em laboratório. O desenvolvimento espontâneo das
leveduras no mosto de uvas é acompanhado em três fases: Adaptação (lag),
exponencial (log), fase estacionária e declínio celular (LAGE et al, 2014).
A fase Lag que corresponde à adaptação das leveduras ao meio é a fase
que se caracteriza pela alteração da maquinaria celular e de ajuste às novas
condições ambientais para a multiplicação celular. Representa o período que as
leveduras no mosto se ajustam a um novo ambiente. Após a adaptação, a fase
exponencial é rápida, as leveduras no mosto são influenciadas pela temperatura,
disponibilidade de açúcar dentre outros fatores. Nesta fase as células entram em
crescimento exponencial (HORSEY, 2007).
Com relação a fase estacionária pode durar de 2 á 10 dias, a população de
leveduras se mantem estáveis. Após este período inicia-se o declínio celular.
Estudos mostram que a população de Hanseniaspora decresce gradativamente,
devido à limitação de nutrientes, aumento da concentração de etanol, presença de
fatores killer que contribuem para redução da biomassa de leveduras no mosto de
uvas (LAGE et al, 2014).
3. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DAS LEVEDURAS
Historicamente a biotecnologia já existia bem antes do homem entender
ciência da biologia, com o desenvolvimento da produção de pães e vinhos. Embora
os microrganismos já são utilizados há milhares de anos na produção de vinhos, a
biotecnologia atua em sistemas celulares para o desenvolvimento de processos e
produtos de interesse econômico e social. Os fungos são microrganismo de grande
interesse biotecnológico. Talvez eles estejam dentre os seres vivos, que mais geram
30
processos e produtos de importância fundamental para a sociedade (OLIVEIRA,
2009).
Segundo Andrieta (2007) a biotecnologia esta voltada para o estudo da
seleção de espécies que favoreçam o desenvolvimento de novos produtos ou
produtos com melhor qualidade. Isto inclui estudos moleculares, que podem ser
utilizados para melhoramento genético como também melhor seleção das espécies.
Durante a última década,as leveduras foram desenvolvidas para a produção
de proteínas heterólogas em rendimentos elevados e com as modificações póstraducionais equivalente ou similar às modificações realizadas nos seres humanos.
Avanços têm sido feitos no desenvolvimento de S. cerevisiae como o primeiro
organismo eucariótico para o desenvolvimento de genômica funcional e biologia de
sistemas. Espécies de levedura não Saccharomyces também têm uma enorme
utilidade e potencial para processos biotecnológicos, principalmente na vinificação
(MALAJOVICH, 2011).
Dentre os microrganismos envolvidos no mosto, as leveduras tem papel mais
importante, porque não só executam a fermentação etanólica, ou seja, a conversão
de açúcar da uva em etanol e CO2, mas também irão influênciar no aroma, sabor e
identidade ao vinho. A qualidade do vinho está diretamente relacionada com o
processo produtivo e a excreção de metabólitos durante o seu crescimento e
autólise subseqüente. No processo de vinificação a espécie S. cerevisiae apresenta
alta capacidade fermentativa, um crescimento rápido, eficiente metabolização de
açucares, habilidade na produção e resistência ao etanol e baixos níveis de
oxigênio, tolerância a grandes variações de temperatura. No entanto as leveduras do
gênero Hanseniaspora possibilita originar vinhos de alta qualidade com um caráter
regional único , fornecendo diferenciação e acrescentando um valor comercial em
um mercado altamente competitivo.(FLEET,2008;LAGE et al, 2013).
4. FERMENTAÇÃO ETANÓLICA POR LEVEDURAS
A fermentação em estágio inicial é realizada por uma sequencia de
microrganismos dentre eles as leveduras não-Saccharomyces que integram os
gêneros Kloeckera, Cryptococcus, Torulaspora, Hanseniaspora, Candida, Pichia,
31
Hansenula, Zygosaccharomyces, Metschinikowia, Debaromyces, Issatchenkia e
Rhodotorula caracterizadas por um baixo poder fermentativo , enquanto que a fase
final é dominado pela linhagens de Saccharomyces cerevisiae tolerantes ao etanol
(MARO et al, 2007).
O papel das espécies não-Saccharomyces durante a fermentação é muito
importante, uma vez que irá influenciar fortemente na composição química do
produto final o que sugere que estas leveduras nativas darão características
regionais atraentes e outros composto voláteis distintos para os vinhos . Para a
síntese desses componentes aromáticos, é necessário a ação enzimática que
transforma os compostos neutros da uva em compostos ativos que irão produzir
sabor ao vinho, através da ativação de metabólitos secundários (por exemplo,
ácidos, álcoois, polióis, ésteres, aldeídos, cetonas, ou compostos voláteis de
enxofre) que produzem aroma ao vinho (SENER et al, 2007).
Estudos, anteriores com Pretrorius (2003) e Capello et al (2004) em
experimentos realizados a partir da fermentação inoculada, afirmam que a utilização
de linhagens de leveduras não-Saccharomyces e Saccharomyces (cepa industrial)
asseguram a produção de vinhos de qualidade. No entanto, considera que a
qualidade do vinho está estritamente relacionada com a microbiota natural presente
nas uvas, o que confere ao vinho características típicas e representativas de cada
região vinífera e, portanto adaptadas ao seu habitat.
Nos últimos anos, pesquisadores observaram que as leveduras nãoSaccharomyces contribuem para características na composição sensorial do vinho,
assim, um interesse crescente na aplicação industrial das espécies de leveduras
não-Saccharomyces (HIERRO, 2007). De fato, a adição de leveduras nãoSaccharomyces, como parte de culturas mista com formulações, juntamente com os
de S. cerevisiae, tem sido recentemente indicada como uma maneira de aproveitar
fermentações espontâneas para melhorar a qualidade do vinho (KIM et al, 2010). A
tendência atual, das indústrias de vinhos é de desenvolver produtos originais e
peculiares, utilizando culturas mistas
que podem ser úteis para conferir um
determinado aroma e características singulares ao vinhos (MINGORANCECAZORLA et aI, 2003; ASSIS et al, 2012).
Estudos anteriores indicaram que o gênero Hanseniaspora a depender da
espécie se diferencia a partir da produção e tolerância aos níveis de etanol. E
principalmente a produção de outros metabólitos secundários, isto é, glicerol,
32
acetaldeído, acetato de etila e outros que darão características singuralidade a
diversos
vinhos
Saccharomyces,
(MOLINA,
a
exemplo
2007).
da
A
empregabilidade
Hanseniaspora
de
uvarum
leveduras
e
não-
Hanseniaspora
guilliermondii tornou objeto de interesse para muitos pesquisadores, particularmente
porque são espécies frequentemente identificadas em uvas nas fases iniciais da
fermentação (ROBINSON et al, 2014).
Nos últimos anos, tem havido grandes avanços em pesquisas sobre a
ecologia das leveduras, da fermentação do vinho . Leveduras não- Saccharomyces
crescem cerca de (106-107 UFC / ml), mas, após os primeiros dias da fermentação,
começam a declinar e morrer. Neste momento, S. cerevisiae torna-se predominante
(107-108 UFC / mL) e continua a fermentação até ao final do processo. Esta
diferença de comportamento fermentativo foi analisada anteriormente por Horsey
(2007), que estudou as leveduras Saccharomyces cerevisiae da variedade bayanus
por serem bem adaptadas aos processos fermentativos, e terem ampla utilização na
vinificação. A população de células Saccharomyces cerevisiae se manteve viáveis
durante as fases finais da fermentação, mesmo quando a concentração de açúcar
era baixa e o conteúdo de etanol alto até 15%v/v, resistiram a um baixo pH e
temperatura alta além de serem mais tolerantes ao dióxido de enxofre que outras
leveduras e bactérias.
Muitos fatores afetam no desenvolvimento da biomassa das leveduras
durante a fermentação etanólica, interferindo no desenvolvimento e na diversidade
das espécies.Os fatores interferentes podem ser: a composição química do mosto,
incluindo resíduos de fungicidas / pesticidas, as condições de processamento, a
concentração de etanol, dióxido de enxofre, a temperatura de fermentação, e as
interações entre as diferentes espécies de leveduras (SUN, 2009).
A produção de etanol por S. cerevisiae é considerada como fator killer
importante, pois influencia no declínio da biomassa celular de
espécies de não
Saccharomyces durante a fermentação. Geralmente, as espécies Hanseniaspora,
Candida, Pichia, Kluyveromyces, Metschnikowia e Issatchenkia encontradas no
mosto de uvas não são tolerantes as concentrações de etanol superiores a 5-7%,
isto explica, que o declínio e morte celular das leveduras não Saccharomyces,
depende do
avanço fermentativo e da produção de etanol (RODRIGUEZ et al,
2010). Contudo, estudos demonstram que temperaturas baixas podem diminuir a
sensibilidade destas espécies de leveduras ao etanol, e consequentemente,
33
fermentações realizadas em temperaturas inferiores a 15-20ºC podem mostrar uma
maior contribuição das leveduras Hanseniaspora e Candida. Em tais condições,
estas espécies podem aumentar a sua sobrevivência igualmente a S. cerevisiae que
predominam até o final
da fermentação e, consequentemente, terão um maior
impacto no aroma do vinho.
P'erez e Nevado et al (2006) estudaram o mecanismo envolvido na morte
celular das cepas
do gênero Hanseniaspora (Hanseniaspora guillermondii e
Hanseniaspora uvaru) durante fermentações mistas com S. cerevisiae sob
condições de crescimento enológico. Quando S. cerevisiae atingiu biomassa celular
em torno de 107 UFC/mL, foram observadas a redução na população de
Hanseniaspora independentemente da concentração de etanol. Os autores
acreditam na hipótese que, um ou mais compostos tóxicos produzidos pela S.
cerevisiae
podem
provocar
a
morte
prematura
das
células
do
gênero
Hanseniaspora, embora ainda não tenha sido possível identificar o natureza destes
compostos. Estudos tinham anteriormente demonstrado, que as células viáveis da
levedura S. cerevisiae em alta densidade podem causar a queda no crescimento de
algumas espécies não Saccharomyces em culturas mistas (ARNEBORG et al,
2005). Pesquisas tem demonstrado um consenso na importância da aplicação de
métodos moleculares para esclarecer o desempenho e desenvolvimento de
leveduras durante a fermentação de vinho (P'EREZ; NEVADO et al, 2006).
4.1 PRODUÇÃO DE COMPOSTOS
AROMÁTICOS
POR LEVEDURAS DO
GÊNERO HANSENIASPORA
Segundo Swiegers, (2005) o sabor e o aroma são as principais características
que definem as diferenças entre os estilos de vinho em todo o mundo. As práticas de
viticultura bem como de vinificação afetam estas características sensórias do vinho.
Baseado na definição da química orgânica, o vinho é uma mistura complexa de
inúmeros compostos, incluindo carboidratos, álcoois, aldeídos, ésteres, ácidos,
proteínas e vitaminas. Também contém compostos aromáticos e cromáticos, a
exemplo dos taninos, antocianinas e flavonóides que contribuem expressivamente
para cor e sabor (HORSEY, 2007).
34
Segundo a definição de Silva (2012) o vinho é o produto obtido
exclusivamente por fermentação etanólico, total ou parcial, de uvas frescas ou mosto
de uvas . De um modo geral o processo de vinificação corresponde ao conjunto de
operações mecânicas que levam à obtenção de vinho. A composição do vinho
também é influenciada por diversos fatores: tipo de casta, solo, clima, práticas de
cultivo, leveduras e pelas práticas de vinificação.
Os compostos aromáticos sintetizados pelas leveduras e bactérias presentes
no mosto de uva durante o processo fermentativo, contribuem para formação do
aroma do vinho. Enzimas como as glicosidases estão envolvidas no processo de
transformação bioquímica e são sintetizadas pelas leveduras. Muitos fatores podem
influenciar na composição do aroma, a exemplo da temperatura, teor de sólidos
solúveis existentes no mosto de uva, microbiota que conduz o processo
fermentativo, dentre outros fatores (SWIEGERS, 2005).
Mamede et al (2004) estudou a produção de composto voláteis durante a
fermentação espontanea do mosto de uvas Chardonnay pelas leveduras não
Saccharomyces Kloeckera apiculata e Saccharomyces cerevisiae
e obteve
resultados expressivos na produção de compostos importantes para a qualidade do
vinho como, o acetato de etila produzidos pela Kloeckera apiculata.
Leveduras
não
Saccharomyces,
principalmente
as
Hanseniaspora
guilliermondii e H. uvarum são de grande interesse tecnológico. Estudo realizados
por Pietrowski et al (2012) demonstraram que, em fermentação com o mosto de
maçã, as leveduras H. Guilliermondii e H. uvarum demonstraram grande produção
de ésteres, aldeídos, álcoois superiores.
Hong et al (2013) estudaram o desempenho de Hanseniaspora uvarum em
culturas mista com Saccharomyces cerevisiae
em fermentação espontanea e
observaram, grande produção aldeídos produzidos pela Hanseniaspora uvarum,
bem como uma maior pontuação na avaliação sensorial dos consumidores. Esses
dados demonstram
a importância da
Hanseniaspora spp.
nas características
aromáticas do vinho através da síntese de compostos aromáticos primários inativos,
transformando-os em compostos aromáticos ativos.
35
5. ABORDAGEM SOBRE AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO EM
LEVEDURAS DURANTE A FERMENTAÇÃO
Diversos parâmetros interferem no processo da fermentação. Os parâmetros
químicos são: disponibilidade e concentração de nutrientes, assimilação de
nitrogênio,
oxigênio,
vitaminas,
minerais,
ácidos insaturados;
presença de
substâncias inibidoras (etanol, ácido acético, sulfitos, fitoalexinas, micotoxinas,
toxinas das bactérias, resíduos agrotóxicos) e parâmetros físicos naturais:
temperatura, pH, e pressão osmótica (FERREIRA et al, 2006).
Quando a célula se adapta a um novo ambiente, a atividade biológica da
levedura aumenta, principalmente durante a fermentação etanólica, em que
inúmeras condições de estresse surgem, alguns de leve impacto, e outras
potencialmente severas. Dentro dos parâmetros citados, os mais importantes são: a
limitação de nutrientes, a toxicidade do etanol e as variações de temperatura durante
a fermentação (FOLCH-MALLOL et al, 2004).
Diferentes nutrientes podem ser limitados ou esgotados durante as fases da
fermentação, o que leva a uma redução da taxa de crescimento e diminuição da
eficiência da fermentação ou mesmo uma queda completa desta. Saleh et al, 2014,
observou que a trealose é importante para a manutenção da viabilidade celular da
levedura, contudo, é utilizada como carboidrato de reserva durante períodos em que
a sobrevivência da célula depende do nível de trealose e de glicogênio.
A relação entre a fermentação e a resistência ao estresse, está na habilidade
das leveduras de se adaptarem ao meio ambiente, e a fatores extracelulares durante
a fermentação. Estas respostas são transmitidas através de sinais extracelulares,
por receptores proteicos específicos, que se localizam em sua maioria na superfície
da membrana plasmática (BAUER; PETRORIUS, 2000; RODRIGUES, 2010).
As informações das mudanças ocorridas no meio são traduzidas e
interconectadas através de sinais que são relevantes para os mecanismos de
resposta ao estresse. Pesquisas focadas em contribuir no avanço dos mecanismos
moleculares, envolvendo resposta ao estresse são fundamentais para entender as
36
estratégias de adaptação biológica das leveduras durante a fermentação e seu ciclo
de vida (HOHMANN et al, 2003).
Os fatores de estresse como temperatura e concentração de etanol durante a
fermentação interferem no crescimento das leveduras, na sua composição lipídica e
na fluidez da membrana plasmática em resposta adaptativa a condição de estresse.
Em condições adversas do ambiente vários tipos de respostas adaptativas ao
estresse são induzidas. A resposta molecular para reparar danos e proteger
estruturas ocorre quando a célula
da levedura
Saccharomyces cerevisiae, é
submetida condições de estresse (ESTRUCH, 2000). Essa resposta é caracterizada
pela indução de síntese de trealose em caso de diminuição de nutrientes, síntese de
proteínas específicas, dentre outros parâmetros (MELO, 2006).
5.1 TOXICIDADE ETANÓLICA NAS LEVEDURAS
Durante o processo da fermentação, concentração de nutrientes diminui, pelo
consumo das leveduras e por outros microorganismos, e o etanol produzido se
acumula no meio. O etanol é tóxico para a maioria dos organismos em
concentrações relativamente baixas, a parti de 2% (v / v). A capacidade de romper
com eficiência biológica, processos e mecanismos de proteção aumentam com a
elevação das taxas de etanol. Segundo Silva et al (2008), com processo
fermentativo etanólico origina-se uma série de compostos que podem atuar como
inibidores potenciais. Entre eles podem ser citados os metabólitos secundários,
contaminantes totais e, o etanol produzido no processo. A natureza e concentração
desses compostos dependem das condições do processo, como temperatura do
meio e tempo de fermentação.
Segundo Neto A. (2006) o efeito biológico do etanol na diminuição das taxas
de crescimento e eficiência da fermentação, é em grande parte do resultado de
alterações nas propriedades das membranas celulares, em particular, no aumento
da permeabilidade e alterações na fluidez da membrana. O etanol age de maneira
sinergística
intoxicando
a
célula
da
levedura,
consequentemente diminuindo a viabilidade celular.
levando-a
a
morte
e
37
As estratégias moleculares das leveduras para inibir a desnaturação das
proteínas e os danos irreversíveis da membrana plasmática, é realizada através de
modificações bastante complexas na sua atividade funcional,principalmente na
permeabilidade seletiva. (SALES et al, 2000).
Os fosfolípidos presentes na membrana plasmática desempenham um papel
importante no mecanismo de tolerância ao etanol (SOUZA, 2009). Os efeitos tóxicos
do etanol durante a fermentação para a S. Cerevisiae, envolve modificações na
composição lipídica da membrana, redução da sua atividade metabolica, inibição do
transporte de nutrientes para dentro da célula, a inibição do crescimento e na
viabilidade, além da inibição da levedura na produção de etanol. A avaliação da
capacidade das células das leveduras sobreviverem a exposição ao etanol é útil,
pois seria uma ferramenta para comparar a tolerância de diferentes espécies de
leveduras. Pesquisas demonstram que o método para determinar a tolerância ao
etanol envolve avaliar o crescimento celular na presença de etanol e no meio. Essa
metodologia poderia ser uma ferramenta para avaliar melhor as espécies mais
tolerantes ao etanol (PINA et al, 2004).
O aumento da permeabilidade tem inúmeras consequências fisiológicas com
a dissipação de força motor de prótons, que permite o transporte ativo de inúmeros
compostos, em particular aminoácidos, para o meio intracelular. A célula mantém o
meio intracelular com pH ácido, a ativação do influxo de prótons e a consequente
acidificação intracelular, interferem negativamente na atividade metabólica. Em
resposta, a célula utiliza a H+-ATPase (bomba de prótons) para manter o pH
intracelular dentro de valores compatíveis com o metabolismo homeostático.A
bomba de íons é dependente de ATP, a H+ATPase é uma proteína de
membrana
que hidrolisa ATP em ADP que funciona transportando prótons através da
membrana contrabalanceando e mantendo a composição iônica
intracelular
(AMBESI et al , 2000; FERNANDES, 2008).
Estudo anterior demonstrado por (ARNEBORG et al, 1995) com a levedura
Pichia stipitis, na presença de 1% v/v de etanol no meio de cultura faz duplicar a
atividade da respectiva H+-ATPase da membrana plasmática e a presença de etanol
no meio, estimula a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática em S.
cerevisiae, atingindo o seu triplo da atividade basal,quando as concentrações de
etanol atingem no meio 6-8% v/v.
38
O etanol também afeta a atividade de água reduzindo a disponibilidade de
água. Em consequência disso, em todos os compartimentos celulares a
disponibilidade de água são reduzidos prejudicando os processos biológicos. Outros
processos afetados incluem atividades enzimáticas, enovelamento de proteínas e
estrutura da membrana. A resposta celular a redução de água são semelhantes
tanto para o alto teor de etanol com também temperaturas elevadas. Além disso ,a
composição da membrana é alterada fundamentalmente , com aumento percentuais
de ácidos graxos insaturados e alterações em teor de esteróis (MADEIRA et al,
2010).
5.2 A RESPOSTA A CONDIÇÃO DE ESTRESSE
Durante o estresse fermentativo, existe uma indução de um conjunto de
proteínas cuja síntese é fortemente aumentada, principalmente quando, os
organismos estão expostos a aumentos repentinos de temperatura ou a outros
parâmetros (MORANO et al, 1998). Pesquisas revelam que várias famílias de HSPs
(heat shock protein) são bem conservadas ao longo da evolução, exibindo um
elevado grau de conservação em todos os organismos, a partir de bactérias até
eucariotos superiores, elas desempenham um papel central no metabolismo celular
(CAGLIARI, 2009).
Padrões específicos de indução são observados para todas as respostas ao
estresse, incluindo, por exemplo, além do estresse térmico, etanólico, hiperosmótico,
estresse hiposmótico e limitação de nutrientes. Uma série de adaptações específicas
foi estudada extensivamente, e incluem a síntese de glicerol em resposta ao
estresse hiperosmótico, a síntese de hidratos de carbono, e armazenamento de
glicogênio em caso de privação ou a síntese de trealose em leveduras, em resposta
a escassez de nutrientes (SOUZA, 2009).
Estudos sugerem a existência de uma rede complexa de vias de transdução
de sinais e estas vias incluem, os receptores de sinais de estresse, associada ao
receptor de proteínas de ligação chamada de GTP (proteínas G), e módulos
intermediários que consiste principalmente de um grande número de quinases, que
são reguladas por pequenas moléculas chamada de segundo mensageiro, como
39
AMP cíclico (cAMP) adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
ou uma cascata de
atividade da proteína quinase (MAPK). Neste modelo, a quinase é uma via de
sinalização em que se fosforila uma proteína alvo específica, que pode incluir fatores
de transcrição, enzimas metabólicas e proteínas estruturais do citoesqueleto. A
fosforilação modula a atividade destas proteínas, seja para induzir ou suprimir suas
atividade (IZAWA et al , 2008).
As proteínas de choque térmico tem função de proteção à desnaturação das
proteínas de membrana como também recuperação das estruturas de membrana.
Pesquisas demonstram que a exposição de um organismo a um estresse específico
induz a uma formação de proteínas específicas apropriadas para aquele estresse
como também induz a formação de outras HSPs que fazem a proteção de outros
estresses, este modelo foi demonstrado em S. cerevisiae (BROSNAN et al, 2000).
Várias famílias de Hsps são induzidas em condições de estresse, como por
exemplo, substrato para o crescimento, mudança de uma fonte específica de
nutriente para uma fonte menos específica, mudanças de temperatura, pH, pressão
osmótica, e a presença de concentrações elevadas de etanol,substâncias tóxicas e
espécies reativas como peróxido de hidrogênio. Em condições favoráveis de
crescimento, maior será a velocidade de desenvolvimento, e menor será
concentração de proteínas Hsp dentro de uma célula, e a menor resistência à tensão
intrínseca (SWAN et al, 1998).
Famílias Hsp são agrupadas de acordo com a homologia da seqüência e são
denominadas de acordo com a média de peso molecular de seus membros. Em S.
cerevisiae as famílias Hsp incluem Hsp104p (membro da família Hsp100p), Hsp83p
(membro da família Hsp90p), Hsp70p, dos quais há pelo menos 10 membros em S.
cerevisiae, Hsp60p Hsp30p, Hsp26p e Hsp12p que também se expressam nesta
levedura. (MORANO et al, 1998).
Pesquisas foram aprimoradas para o estudo das Hsps durante a década de
1980. Inicialmente o modelo foi sugerido por Lewis & Pelham (1985) com a Hsp70p
onde se verificaram a interação com as proteínas desnaturadas, Desde então, vários
estudos têm demonstrado que a maior parte do estresse induzido, as Hsps estão
realmente envolvidos na proteção, solubilização e reparação e enovelamento de
proteínas desnaturadas e agregadas (MORANO et al, 1998) . Famílias de Hsps
parecem estar mantendo o estado de proteínas imatura ou recém-sintetizadas para
a incorporação em complexos de proteínas (JENSEN; JOHNSON, 1999).
40
Outras funções estão associadas a Hsps relacionando a manutenção de
proteínas em estado imaturo por membros das famílias Hsp70p, facilitar a sua
translocação através das membranas do retículo endoplasmático e mitocôndrias
(JENSEN; JOHNSON, 1999). Resgate de proteínas agregadas ou desnaturadas no
citoplasma, associado as atividades das famílias do complexo Hsp104p, Hsp70p e
Hsp40p (GLOVER; LINDQUIST, 1998); a reparação por Hsp104p e Hsp70p de
proteínas desnaturadas do retículo endoplasmático por calor excessivo (HANNINEN
et al, 1999). A aceleração da reativação de proteínas danificadas pelo calor por
Hsp90p (NOLLEN et al, 2002).
Com as alterações nos ácidos graxos que compõem a integridade da
membrana, pesquisas mostram a expressão das HSP 30p e HSP12 sendo que esta
desempenha papel específico durante o estresse etanólico. (SALES et al, 2000).
Enquanto a HSP30 regula a enzima H+ ATPase que consome grande quantidade de
ATP produzido pela célula, bombeando íons para fora do citoplasma equilibrando o
gradiente de concentração. Hsp30p demonstrou controlar e reduzir a atividade
ATPase. A indução das HSPs por etanol tem mecanismo de expressão bastante
semelhante a outros estresses (SOUZA, 2009).
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52
CAPITULO II
ULTRAESTRUTURA CELULAR E A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DAS
LEVEDURAS HANSENIASPORA SOB EFEITO DE ESTRESSE ETANÓLICO
RESUMO
As Hanseniaporas são leveduras de interesse enológico, pois atribuem flavour ao
produto final da fermentação do mosto de uvas. O objetivo do estudo foi avaliar o
estresse etanólico das Hanseniaspora em cepas(Ho e Hg)
analisando a
ultraestrutura e o perfil da expressão protéica em diferentes concentrações de etanol
. A ultraestrutura foi analisada através da Microscopia eletrônica de Varredura e a
expressão protéica foi avaliada em análise eletroforética pelo método SDS PAGE.
Na análise da Microscopia, as cepas em meio YM mostraram células jovens com
morfologia apiculadas com brotamento bilateral, pólos distais côncavos com
múltiplas cicatrizes em forma de anéis presentes na separação do broto durante o
brotamento. Acima de 6% de etanol as células tiveram alterações na integridade da
parede celular, plasmólise, perda da turgescência e ativação da autólise celular.
Nas análises de SDS-PAGE as expressões dos pesos moleculares foram
relacionadas como possíveis proteínas HSPs. Ho 41 e Hg 43 apresentaram banda
de peso molecular 10kDa nos estresses (1% , 2%, 3% ,6%).
Ho 41 apresentou
100kDa a 3% de estresse e Hg 43 apresentou 100kDa nos estresses 3% e
aumentou expressão em 6%. O etanol é um fator limitante para viabilidade celular
das Hansenisporas, além de acelerar a ativação do programa de morte celular. A
ausência de expressão de outras proteínas (HSPs) que auxiliam no mecanismo
adaptativo, faz com que esta levedura não tenha tolerância a concentrações
crescentes de etanol durante a fermentação do mosto de uvas.
Palavras-chave: etanol, Hansenisapora, ultraestrutura, HSP
53
ABSTRACT
The Hanseniaporas are yeast oenological interest because attribute flavor to the final
product of fermentation of grape must. The objective of the study was to evaluate the
ethanol stress of Hanseniaspora in strains (Ho and Hg) analyzing the ultrastructure
and the profile of protein expression in different concentrations of ethanol. The
ultrastructure was analyzed by electronic scanning microscopy and protein
expression was evaluated in electrophoretic analysis by SDS PAGE method. In the
analysis of microscopy, the strains in YM medium showed young cells with peaked
morphology with bilateral budding, concave distal poles with multiple scars in the
form of rings present in the bud separation during budding. Above 6% ethanol, the
cells were changes in the cell wall, plasmolysis, swelling, and loss of autolysis of cell
activation. On SDS-PAGE analysis of the expression of molecular weights were
related proteins HSPs as possible. Ho 41 and 43 mmHg had a molecular weight of
10kDa band in stresses (1%, 2%, 3%, 6%). Ho 41 100 kDa showed 3% Hg stress
and stress at 100 kDa showed 43% and increased expression 3 by 6%. Ethanol is a
limiting factor for cell viability of Hansenisporas and accelerate the activation of the
cell death program. The absence of expression of other proteins (HSPs) that assist in
the adaptive mechanism, makes this yeast has no tolerance to increasing
concentrations of ethanol during fermentation of the grape must.
Keywords: ethanol, Hansenisapora, ultrastructure, HSPs.
54
1 INTRODUÇÃO
A diversidade ambiental a que os organismos estão expostos desencadeiam
um sequenciamento de respostas biológicas complexas que envolvem mecanismos
gerais e específicos de adaptação. Estes mecanismos dependem de diversos
fatores que interagem entre si. No entanto, os organismos considerados modelos,
desempenham um papel crucial na compreensão desses mecanismos adaptativos,
decorrentes de variações rápidas e bruscas no meio ambiente, pois permitem a
manutenção de um estado de equilíbrio que garanta a sobrevivência e evolução
(ROPIO, 2010).
Durante a fermentação etanólica as células das leveduras estão expostas a
vários estresses ambientais tais como, elevadas concentrações de açúcar no meio,
aumento de temperatura, aumento da concentração de etanol e instabilidade do pH.
As macromoléculas celulares, incluindo as proteínas, ácidos nucléicos e membranas
estão seriamente danificadas em condições de estresse. Consequentemente,
comprometendo o seu crescimento, a viabilidade celular, e o próprio desempenho
fermentativo desta levedura. Para se proteger das condições desfavoráveis,
algumas espécies respondem rapidamente através da síntese de moléculas, que
irão reparar os danos celulares e a desnaturação de proteínas de membrana
causado pelo estresse, essas moléculas são chamadas de proteínas de choque
térmico (SHIMA et al 2009).
A tolerância ao estresse durante o processo fermentativo é alvo de estudos
de investigação sobre os mecanismos moleculares de resposta adaptativa (PURIA
et al 2009). As primeiras pesquisas sobre as respostas moleculares ao estresse
foram observadas em S. cerevisiae, em que a síntese de HSPs é verificada com o
aumento de temperatura de vinificação e o aumento da concentração de etanol entre
outros estresses (SIQUEIRA JUNIOR, 2013). E para garantir a sobrevivência
durante o estresse e proteger os componentes celulares essenciais, a S. cerevisiae
desenvolve mecanismos que permitem rápida retomada das atividades celulares
normais durante o período de recuperação. A célula da Saccharomyces sintetiza
proteínas de choque térmico (HSPs), mas também possui outros mecanismos
adaptativos como: aumento dos níveis de trealose, alterações bioquímicas,
55
enzimáticas na membrana plasmática e alterações morfológicas (ZHANG,
2009;TESNIERE et al, 2013)
As leveduras do gênero Hanseniaspora são alvos de pesquisas, pois são
identificadas nas fases iniciais da fermentação do mosto uvas. Essas leveduras se
tornaram um objeto de interesse crescente, devido a sua potencial contribuição nas
propriedades enológicas ao vinho. A adição dessas leveduras durante o processo
fermentativo no mosto, aumentam os atributos de aromas e sabor dos vinhos.
(MEDINA et al, 2013). No entanto, as espécies Hanseniaspora declinam e tem morte
celular mais rapidamente em uma concentração etanólica superior á 6% no meio.
Isto explica o efeito prejudicial do etanol sobre as proteínas de membrana e outros
componentes celulares, enfraquecendo as interações hidrofóbicas e a atividade
funcional
celular.
Fisiologicamente
o
etanol
causa
nas
leveduras
não
Saccharomyces um desequilíbrio entre a taxa de produção e o fluxo através da
membrana, o que acarretaria uma acumulação intracelular de etanol, o que
explicaria o maior efeito tóxico do etanol detectado durante a fermentação
(PIZARRO, 2008).
Segundo estudo realizado em S.cerevisiae durante o estresse etanólico foi
verificado a indução de uma série de respostas celulares considerando a depleção
de nutrientes no meio e aumento no percentual do etanol, contribuindo para queda
no crescimento e na formação de esporos aptos resistirem as variação ambiental
(RUIS,1995; CASALONE et al., 2005). A formação de esporos é um evento de
divisão celular anormal em que as células filhas são formadas no citoplasma da
célula mãe. Este processo envolve uma nova formação de duas estruturas celulares
diferentes: a membrana no citoplasma da célula que darão origem a esporos e a
membrana do plasma que forma uma grande parede de esporos que protege a
ultraestrutura celular das variações ambientais (PICCIRILLO, 2010;NEIMAN, 2011).
Além de esporos a S.cerevisiae tem demonstrado a formação de pseudohifas em
resposta de resistência a situação de estresse provocado pela toxicidade etanólica
associada à escassez de nutrientes. (GANCEDO, 2001; FUJITA, 2005).
56
Resposta molecular também foi observada em S.cerevisiae durante a
fermentação. Essas leveduras sintetizam vários marcadores moleculares e seus
cofatores (HSP 104, HSP 82, HSP 60, HSP 42, HSP30, HSP26) que são regulados
positivamente durante a fermentação. Essas chaperonas (HSPs), como também são
chamadas, funcionam ativando o resgate de proteínas de membrana desnaturadas,
restaurando a atividade celular, melhorando a tolerância da levedura S.cerevisiae, e
consequentemente aumentando a produtividade em etanol no meio, respondendo
rapidamente ao estresse fermentativo e homeostasia celular (KIM et al , 2013).
Proteínas de choque térmico (HSPs) são sintetizadas em resposta a uma
grande variedade de estresse. A família das HSPs é dinâmica, extremamente
heterogênea e são induzidas em respostas as variadas condições ambientais. Os
padrões específicos de indução das HSPs são observados para todas as respostas
dos organismos, incluindo a de estresses térmico, hiperosmótico, presença de
etanol, limitação de nutrientes e outros (BAUER et al, 2000).
Proteínas com pesos moleculares diferentes podem aumentar a sua
expressão no estresse de acordo com a linhagem estudada. A espécie S.cerevisiae
é considerada uma grande fermentadora e produtora de etanol, pois é conhecida
como a mais resistente à toxicidade etanólica. Ela participa da fermentação do
mosto juntamente com as leveduras Hanseniaspora e outros microrganismos nos
estágios inicias da fermentação, pois estas não toleram altas concentrações de
etanol ( 2007; ZHANG Q et al, 2009).
Não há muito conhecimento sobre a ultraestrutura e biologia molecular de
leveduras não Saccharomyces especialmente as do gênero Hanseniaspora, durante
o estresse. Dessa forma, foi relevante estudar o crescimento e sua morfologia
celular durante o estresse etanólico, já que este é o principal produto da
fermentação. E este gênero possui grande importância biotecnológica por ser
produtora de compostos voláteis, contribuindo com características singulares ao
mosto de uvas.
As leveduras S.cerevisiae podem servir de modelo na escolha de
marcadores HSP para seleção de espécies não Saccharomyces, avaliando as cepas
57
mais tolerantes ao etanol. Além disso, esses marcadores podem servir para criação
de espécies geneticamente modificadas, por exemplo, Hanseniasporas que
expressassem, estas proteínas poderiam resistir a concentrações bem mais altas de
etanol. No entanto, o estudo de marcadores moleculares de resistência ao estresse
diretamente em Hanseniasporas pode servir tanto para a bioprospecção de espécies
mais resistentes, como para contribuir na síntese de compostos voláteis e aromas,
atribuindo melhor qualidade sensorial ao vinho.
2 MATERIAIS E METÓDOS
O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular
Carmen Lemos (LBM) do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia em
parceria com o Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica do Instituto de
Física LAMUME - (UFBA).
2.1 MATERIAL
2.1.1 Amostra
Empregou-se
as
culturas
de
leveduras
do
gênero
Hanseniaspora
guillhiermondii (Hg43), Hansenisaspora Opuntiae (Ho41) isoladas de uvas Vitis
viniferas L., cultivadas na região do Vale do Submédio São Francisco, localizado
entre o estado de Pernambuco e Bahia. e como padrão Saccharomyces cerevisiae
da variedade bayanus (Scb) (Marca Maurivin).
3 MÉTODO
3.1 MEIO DE CULTURA
Para o cultivo das leveduras foi utilizado o meio contendo Agar Yeast Malt
(YM) (1% de glicose (Vetec); 2% de Agar bacteriológico (Acumedia); 0,5% de
peptona (Acumedia); 0,3% de extrato de malte (Acumedia) e 0,3% de extrato de
58
levedura (Acumedia), suplementadas com cloranfenicol (Himedia), na concentração
de 0,001% (100mg/L) (YARROW, 1998).
3.2 MEIO ETANÓLICO
Para a preparação dos inóculos em condições de indução ao estresse
etanólico foi adicionado ao meio YM o etanol - álcool etilico absoluto PA 99,5%
(Anidro) nas proporções 0%,1%,2% 3%, 6%, 9%,12%,(v/v). As leveduras foram
repicadas em triplicatas com auxílio da alça de Drigalski descartável em meio de
cultura adicionada ao etanol. Todas as placas após semeadura foram vedadas com
filmes plásticos e incubadas a 25ºC para avaliação de crescimento com o objetivo de
observar morfologia e crescimento das leveduras do gênero Hanseniaspora em
comparação com a levedura Saccharomyces cerevisiae da variedades bayanus.
(REIS, 2011).
3.3 MICROSCÓPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA - (MEV)
A Microscópica Eletrônica de Varredura (MEV) foi utilizada para fornecer
informações sobre à ultraestrutura da levedura com aumento de até 300.000 vezes.
A imagem eletrônica de varredura é gerada pela incidência de um feixe de elétrons,
em condições á vácuo. As imagens formadas foram realizadas no aparelho MEV
JEOL JSM-6610LV Scanning Electron Microscope, com filamento de tungstênio,
magnificação máxima de 300.000X pertencente ao Laboratório Multiusuário de
Microscopia Eletrônica do Instituto de Física da Universidade Federal da Bahia.
3.4 LISE CELULAR
A lise celular tem o objetivo de romper a parede celular da levedura. As
células foram removidas do meio de cultura sólido para um tubo de centrífuga com
tampa com auxilio de alça de platina. Foi pesado aproximadamente 1 g (peso úmido)
de células de leveduras crescidas em meio sob indução de estresse etanólico.
Adicionou-se 4 mL de tampão de lise. Em seguida ressuspendeu-se as células
usando um vórtex (Digilab) e estas, posteriormente, foram submetidas à sonicação
(Unique DS500). O tubo contendo a suspensão celular foi mantido em gelo e as
células foram sonicadas por 30s a 70Watts, seguidos de 1min de repouso em banho
de gelo. Este processo foi repetido 3 vezes. A suspensão de células lisadas em
59
seguida, foram centrifugadas durante 10 min a 10.000 rpm a 4ºC, para separar a
solução protéica do sedimento contendo o debris celular (FLEURI et al 2008).
3.5 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS – CURVA DE BSA
Foi realizada uma curva padrão usando-se diferentes concentrações de
albumina do soro bovino (BSA) em função da absorbância obtida a 595nm em
espectrofotômetro, utilizando o método de coloração de Bradford (1976). Este
método foi utilizado para a determinação do conteúdo de proteínas totais, que se
ligam ao corante de um modo proporcional à concentração (MACHINI; MARANA,
2013). Após a leitura das absorbâncias equivalentes as amostras de leveduras
(Ho41 e Hg43) no espectrofotômetro. A concentração das amostras foi determinada
(em mg/ ml) baseado na curva prévia de BSA. A conversão de Absorbância em
concentração de proteína foi obtida com a ajuda do software Graf Pad Prism 5
Project. As amostras dos tubos com o lisado protéico foram aliquotadas
armazenadas em freezer para posteriormente serem utilizadas nas análises de
eletroforéticas.
3.6 ELETROFORESE EM GEL
As análises dos perfis proteicos por eletroforese em gel de poliacrilamida do
tipo desnaturante (SDS-PAGE) foram desenvolvidas de acordo com o método
estabelecido por Laemmli (1970). SDS (sócio dodecil sulfato) é um detergente
aplicado com o objetivo de ação desnaturante sobre as proteínas se associando a
radicais apolares e rompendo interações hidrofóbicas. Esta técnica foi utilizada para
determinação das massas moleculares relativas das proteínas presentes em cada
amostra de levedura. As analises foram realizadas em uma cuba de eletroforese
(Mini-protean 3 cell Eletroforesis®, Biorad), a 75 volts em tampão de corrida (15g de
Tris Base; 72g de glicina; 50ml de SDS 10%, H2O q.s.p. 500ml com agua destilada)
e finalizada quando o azul de bromofenol atingiu a borda inferior do gel. A fonte
utilizada foi Gibco BRL Eletrophoresis Power Supply, modelo 250, da Life
Technologies.
A concentração de proteína aplicada foi padronizada (4ug) com o objetivo de
utilizar a mesma concentração protéica em todos os poços do gel. Dessa forma, a
60
variação na intensidade das bandas pôde ser interpretada como níveis diferentes de
expressão protéica diferentes. Com isso, quanto mais intensa a banda, maior o grau
de expressão naquelas condições. Foram aplicados 5 µl do marcador de peso
molecular BenchMark Protein Ladder. Os géis foram corados por nitrato de prata,
seguindo protocolo padronizado Mortz et al (2001). A coloração consiste
basicamente de imersões em diferentes soluções, seguindo as etapas de: fixação;
incubação, na qual o gel é sensibilizado para aumentar a subsequente formação de
imagens; coloração, quando ocorre a impregnação com o nitrato de prata; e a
revelação quando ocorre o desenvolvimento das imagens.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Em meio YM sem estresse etanólico as leveduras mostraram suas
ultraestruturas através da Microscopia eletrônica de Varredura (MEV), conforme
Figs. (1,2,3). As células com morfologia ovais e apiculadas, com brotamento bilateral
formam os ascósporos que é característica de identidade para esta levedura. A
parede celular exterior se mostrou espessa e distorcida evidenciada como célula
alongada. Segundo Deak (1996) as Hanseniasporas apresentam células ovais
jovens em forma de botão e as células apiculadas possuem parede celular alongada
e pólos distais côncavos, além de possuir múltiplas cicatrizes em forma de anéis
presentes na separação do broto na reprodução por brotamento conforme imagem
(Fig.4)
Figura 1 – Meio YM normal - Levedura Hanseniaspora opuntiae - 43 crescida em meio ym normal sob
condições normais- Imagem aumentada 1,100x
61
Figura 2 – Meio YM normal - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Ym normal sob
condições normais- Imagem aumentada 1,900x
Figura 3- Meio etanol 3% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 3% normal
sob condições normais- Imagem aumentada 2,500x
62
Figura 4 - Meio etanol 3% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio Etanol 3% normal
sob condições normais- Imagem aumentada 5,500x
63
As leveduras avaliadas Ho41 e Hg43 tiveram crescimento positivo em meio
etanólico
até
6%.
Saccharomyceas
Estudos
cerevisae,
similares
o
qual,
realizados
submeteu-se
por
a
Reis
levedura
(2011)
a
com
variadas
concentrações de etanol e observou a resistência e seu crescimento celular até a
concentração limitante de 15% conforme Fig 5.
Figura 5 - Meio etanol 12% - Levedura saccharomyceas cerevisae variedades bayanus -Scb crescida
em meio Etanol 12% normal sob condições normais- Imagem aumentada 4,500x
Outra característica foi observada na MEV, quando o feixe de elétrons focava nas
colônias das Hanseniasporas as células se agrupam em direção ao feixe de elétrons
diminuindo a sua viabilidade celular, isto ocorre devido a sua sensibilidade a
descarga elétrica, dificultando no foco das imagens da microscopia eletrônica (Figs
6,7).
Dados
similares
foram
obtidos
com
Hanseniaspora
guilliermondii
e
Saccharomyceas cerevisae relacionando os efeitos de diferentes correntes elétricas
com a viabilidade celular e observaram que as células das leveduras Hanseniaspora
são sensíveis a correntes elétricas em relação às Saccharomyceas. As cargas
elétricas alteram significativamente o potencial eletroquímico de membrana
provocando queda na atividade metabólica, diminuição da atividade enzimática,
64
perda da turgescência celular ocasionada pela autólise celular e perda da
organização da membrana plasmática nas Hanseniaspora. Comportamento diferente
foi observado em Saccharomyceas que mantiveram resistências as descargas
elétricas (RANALLI et al, 2002).Figura 6 - Meio etanol 1% - Levedura Hanseniaspora opuntiae 43 crescida em meio Etanol 1% normal sob condições normais- Imagem aumentada 1,600x
Figura 7 Meio etanol 1% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 1% sob
condições normais- Imagem aumentada 1,500x
65
Os testes realizados mostraram que as linhagens Ho41 e Hg43 não
cresceram em concentração acima de 6% de etanol diferentemente da Scb, que
suportou a concentração de etanol até 12%. Isso sugere que o etanol é um fator
limitante para viabilidade celular das leveduras Hansenisporas, além de acelerar a
ativação do programa de morte celular. Além disso, nas observações através de
microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível verificar as alterações ultra
estruturais induzidas pelo etanol e o comprometimento da integridade da parede
celular conforme, Figs ( 9, 10,11).
Figura 9 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio Etanol 6% normal
sob condições normais- Imagem aumentada 3,700x
66
Figura 10 - Meio etanol 6% - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio
Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 1,800x
Figura 11 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6%
normal sob condições normais- Imagem aumentada 6,000x
67
Esta análise também foi realizada em Saccharomyces cerevisae por Ceccato
(2000) e Klis (2002) que avaliaram a resposta celular a concentração de 15% de
etanol para esta espécie e verificaram a resistência desta a diferentes
concentrações de etanol. Em estresse ambiental a parede celular da S.cerevisae
ativa múltiplas reações que alteram a sua organização estrutural, elevando o nível
de quitina, aumentando sua resistência em resposta ao estresse, além de ativar uma
cascata de sinalização que induzem a síntese de proteínas de superfície que
protegem as proteínas de membrana.
Estudos anteriores mostram que a presença do etanol inibe a taxa de
crescimento e induz danos na membrana. No modelo Saccharomyces cerevisae foi
observado que o aumento da concentração de etanol no meio promove danos e
dimorfismo em resposta adaptativa a condições ambientais adversas. A depleção de
nutrientes e o aumento de etanol durante o processo fermentativo induzem a
modificações na estrutura celular, apresentando células de forma alongada
denominada de pseudohifas. A forma pseudohifa, a célula se apresenta filamentosa
conseguindo aumentar a relação volume/superfície gastando menos energia a
procura de nutrientes (GIMENO et al, 1992; DICKINSON, 1996). Nas cepas Ho41 e
Hg43 não foram evidenciadas o surgimento de pseudohifas, o que demonstra a
68
intolerância dessas espécies ao estresse etanólico e a incapacidade em responder
rapidamente as alterações ambientais.
Resultados similares também foram obtidos por KLIS (2002) com S.cerevisae
demonstrando que a presença de etanol influenciou no crescimento e alterações na
morfologia. O etanol induziu a filamentação por depleção de nitrogênio,
desenvolvendo pseudohifas.
Coney et al (2013) avaliou a formação de esporos em
Saccharomyces
cerevisae, elas foram testadas com éter e etanol adicionadas ao meio de cultura.
Foram identificadas a formação de esporos que conferem as camadas externas da
parede celular maior proteção e resistência as variações ambientais. As espécies
Ho41 e Hg 43 não foram identificadas a formação de esporos em meio etanólico até
6%.
Outro aspecto demonstrado nas pesquisas de Ceccato (2000) é que nas
leveduras em situação de estresse etanólico as células se alongam e se juntam
umas as outras formando cadeias ou aglomerados de células. Conforme Figs
(12,13,14) observa-se o alongamento das células das leveduras Hansenispora com
intenso agrupamento de células.
Figura 12 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6%
normal sob condições normais- Imagem aumentada 3,700x.
69
Figura 13 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6%
normal sob condições normais- Imagem aumentada 2,700x
Figura 14 - Meio etanol 6% Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6%
normal sob condições normais- Imagem aumentada 6,000x
70
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
Neste estudo foram avaliadas as cepas (Hg43) e (Ho41) a essas espécies
são atribuídas à incapacidade de sobreviver às concentrações crescentes de etanol
produzido na fermentação mantendo células viáveis no máximo de 6% tolerância. A
descoberta de marcadores protéicos conservados entre essas cepas é importante
para comparar com os marcadores identificados em Saccharomyces cerevisiae
submetidas ao mesmo estresse etanólico e que desempenha resistência a esta
levedura.
Pesquisas com Saccharomyces cerevisiae são realizadas para verificar a
presença de marcadores protéicos como forma de avaliar a resistência ao estresse
causado pelo etanol. Utilizando a metodologia de lise celular, dosagem de proteínas
(SDS_PAGE) avaliando as bandas de expressão dessas proteínas. No entanto,
estudos com não Saccharomyces são escassos e existe o interesse nessas
leveduras de que elas permaneçam viáveis até o final da fermentação. Para isso, é
preciso de informações das estratégias moleculares com relação à expressão
dessas proteínas de choque térmico (Hsps) durante o estresse etanólico (RAMOS et
al 2013).
Os marcadores de expressão descobertos para as cepas Ho41 e Hg43, cepas
específicas para vinho tiveram peso moleculares10 kDa apresentados em todos os
estresses(1%, 2%, 3%, 6%) conforme (Fig 1 e 2). Resultados similares obtidos por
(SIQUEIRA JUNIOR, 2013), que encontrou em S. cerevisiae fermento biológico da
cerveja – Safale (S-04) e estão relacionados ao estresse fermentativo etanólico.
Essa levedura teve crescimento até uma concentração de 15% de etanol v/v. Essa
Hsp10 também foi encontrada em S. cerevisiae em trabalhos realizados por Miura
(2006), que submeteu à levedura a alta pressão hidrostática verificando que esta
Hsp sugere está relacionada viabilidade celular.
Tanto para as espécies Ho 41 como a Hg 43 foi possível verificar a banda de
expressão para o peso molecular 100kDa, a 3% na levedura Ho41 e Hg 43 3% e 6%
de etanol, conforme (Fig 1 e 2). Sendo que em dados similares foram encontrados
71
por (SIQUEIRA JUNIOR, 2013), em S. cerevisiae fermento biológico da cachaça
(ScFC) submetidas a indução etanólica a 12%. O surgimento da expressão dessa
banda sugere a relação entre a H+ATPase como foi descrito por (MONTEIRO et al,
1994), tendo o etanol como um dos fatores ambientais de estresse fermentativo que
estimulam a atividade desta enzima in vivo. A H+-ATPase presente na membrana
plasmática de S. cerevisiae possui diversas funções celulares, entre as quais a
absorção de nutrientes (KOTYK, 1994), a regulação do pH intracelular. Estudos com
Hsp 100 realizados por (ZOLKIEWSKI, 2012) avaliam a funcionalidade desta Hsp
em reativar proteínas desagregadas e ativação enzimática da H+ ATPase.
Outros estudos foram realizados por (SIQUEIRA JUNIOR, 2013) com a
expressão de proteínas HSPs 50 e 30kDa aumentaram sua expressão e em todos
os processos fermentativos (pão, cachaça,cerveja e vinho). De acordo com o mesmo
autor, outros marcadores específicos para leveduras de vinho mais resistentes são
os de 15kDa, os de cerveja, 90kDa, o de cachaça, 20, 80 e 100kDa e os de pão 2025 e 70 kDa. A ausência de expressão de proteínas relacionadas a resistência
etanólica nas leveduras Hanseniaspora Ho41 e Hg43, possivelmente seria um dado
que explicaria a intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de
etanol. Apesar de a Hanseniaspora expressar uma proteína de 10 kDa, assim como,
a Saccharomyces, esta proteína está presente mesmo na ausência de estresse em
Ho41, o que impede que a usemos como marcador de resistência. Já na Hg43
aumenta sua expressão a parti de 6% de etanol. Segundo os resultados do gel da
(Fig 1) vemos que apenas uma proteína de 100kDA aumenta sua expressão com
concentrações crescentes de estresse etanólico, sendo que na H.guillermondii o
aumento na síntese dessa proteína se mantém até 6% de etanol (Fig 01), enquanto
na (Fig 02) H. opuntiae a banda se expressa somente a 3%.
72
Tabela 1 - PESO MOLECULAR DE PROTEÍNAS DE EXPRESSÃO
PESO
MOLECULAR(kDa)
Hanseniaspora guilliermondii(Hg 43)
1%
2%
3%
Hanseniaspora opuntiae (Ho 41)
6%
1%
2%
3%
6%
225
150
100
X
X
X
X
X
75
50
35
25
15
10
X
X
X
X
X
X
73
Figura 1 - Levedura Hanseniaspora guilliermondii Hg 43 - Estresse etanólico
6%
100KDa
10KDa
3%
2%
1%
M
74
100KDa
6%
3%
2%
1%
10KDa
Figura 2 - Hanseniaspora opuntiae Ho-41 - Estresse etanólico
M
75
CONCLUSÃO
A perda da viabilidade celular das leveduras Hansenisporas ocorre em
decorrência da intolerância dessa espécie as concentrações crescentes de etanol no
meio. Possivelmente, isto acontece devido a falta de adaptações na sua
ultraestrutura celular, que permitam a sua resistência durante a fermentação
etanólica. A ausência na formação de pseudohifas e esporulação é um sintoma de
falta de mecanismo adaptativo, como é visto em Saccharomyces, já que as
pseudohifas formadas expressam proteínas de resistência que tornam as novas
células mais adaptadas a um meio com altas concentrações de etanol e escassez
de nutrientes.
A levedura S. cerevisiae tem uma vantagem adaptativa em relação às
leveduras Hanseniaspora que somente tiveram crescimento até 6%, pois estas
continuam em crescimento positivo até 12% em meio etanólico. A possível
explicação seria a baixa expressão de proteínas relacionadas à resistência etanólica
nas leveduras Hanseniaspora Ho41 e Hg43, possivelmente seria um dado que
explicaria a intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de etanol. No
entanto, seriam relevantes mais pesquisas com essas leveduras, pois elas
compreendem um grupo diverso ecologicamente e bioquimicamente capazes de
alterar a dinâmica fermentativa atribuindo sabor e aroma ao vinho.
Desta forma, torna-se necessário confirmar a identidade desta proteína de
100KDa para poder usá-la como marcador molecular de cepas não- Saccharomyces
mais resistentes. Western blotting com anticorpos anti-HSP confirmaria se são
proteínas heat-shock. Caso contrário, um sequenciamento protéico poderia
identificar de que proteína se trata este marcador.
Como perspectiva futura o melhoramento genético de Hanseniaspora com
inserção do DNA de proteínas de resistência ao estresse determinadas
anteriormente em Saccharomyces com pesos moleculares 50kDa,30kDa,15kDa,
90kDa, 20kDa, 80kDa, 100kDa, 20kDa, 25kDa, 70kDa ( SIQUEIRA JUNIOR, 2013).
76
Isso permitiria a fermentação com leveduras do próprio mosto, porém melhoradas
geneticamente para resistir ao estresse etanólico e contribuindo com mais
compostos voláteis e singuralidade ao vinho.
77
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CONSIDERAÇÕES FINAIS.
A fermentação e a qualidade do vinho são diretamente dependentes dos
atributos metabólicos das leveduras que dominam de forma rápida e numérica na
fase inicial da fermentação do vinho. As leveduras não Saccharomyces influenciam
de forma relevante na fermentação, atribuindo compostos voláteis e identidade ao
vinho. Técnicas moleculares de seleção que identifiquem entre as espécies de
leveduras do vinho as mais aptas a tolerância etanólica e que essas leveduras
contribuíssem para aromas especiais ao vinho seria de grande importância
biotecnológica e comercial.
As leveduras Hanseniasporas guilliermondii e opuntiae são leveduras com
potencial biotecnológico para produção de aromas em fermentações cruzadas com
Saccharomyces. Contudo, a possível falta de expressão de proteínas de choque
térmico que auxiliam na adaptação ao estresse e de outros mecanismos metabólicos
faz com que as leveduras Hanseniasporas não tenham a mesma capacidade de
adaptação das Saccharomyces. A ausência na formação de estruturas que
respondam as variações ambientais são sintomas de falta de mecanismo adaptativo.
Em perspectivas futuras o melhoramento genético seria uma alternativa para
que as leveduras Hanseniasporas expressassem proteínas de choque que
protegessem a suas estruturas e elas pudessem resistir por mais tempo a toxicidade
etanólica.