ESTUDO FITOQUÍMICO DA ESPECIE VEGETAL Arrabidaea chica 2

ESTUDO FITOQUÍMICO DA ESPECIE VEGETAL Arrabidaea chica
Wannigleice de Sousa AMORIM (IC)1; Luziane da Cunha BORGES (IC) 1; Geyse do Carmo Diniz
SAMPAIO (PG) 2; Sonia das Graças Santa Rosa PAMPLONA (PG) 2; Milton Nascimento da SILVA (PQ)3
1
Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Química Industrial, (Bolsistas PIBIC/CNPq),
[email protected]
2
Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Pós-graduação em Química,
3
Universidade Federal do Pará/Faculdade de Química/Pesquisador-CNPq/UFPA, Orientador,
[email protected]
1- RESUMO Arrabidaea chica Verlot é uma planta trepadeira, com flores róseas ou violáceas, as
folhas submetidas à fermentação fornecem um corante vermelho-tijolo, sua composição química
mostra saponinas, quininos, taninos, flavonoides, alcaloides, etc, considerando às suas atividades
biológicas, como anti-inflamatória e de cicatrização de feridas (Teran, 1997). Considerando a
composição química da mesma, o projeto propôs realizar um estudo fitoquímico das folhas da
planta. A coleta foi realizada na Embrapa Amazônia Oriental, o material foi seco, triturado,
macerado com etanol em duas bateladas de 24 horas, concentrado em evaporador rotativo e
submetido à Cromatografia em Coluna de sílica gel por via úmida do extrato etanólico, as frações
foram coletadas e submetidas à análise em HPLC analítico. A fração escolhida foi a fração AcOEt
100%, devido ter menor complexidade nas substâncias, com isso, iniciou-se o desenvolvimento
do método para o isolamento das mesmas.
Palavras chaves: Arrabidaea chica, Bignoniaceae, HPLC.
2- INTRODUÇÃO
A Flora Amazônica é considerada a maior reserva de biodiversidade do planeta, com
poucas espécies de plantas estudadas de forma científica. Diante deste universo de
etnoconhecimento botânico, é possível a busca de novas drogas com o estudo de plantas
de uso popular consagrado para certa finalidade (Agra et al., 2008; Bertucci et al., 2008;
Marliére et al., 2008; Veiga-Junior, 2008; Jesus et al., 2009; Leitão et al., 2009; Santos et
al., 2009). A família Bignoniaceae reúne aproximadamente 78 gêneros e 832 espécies
geralmente tropicais espontâneas da América do Sul, incluindo árvores, lianas, arbustos
e raramente ervas. Em levantamento etnofarmacológico realizado na região Amazônica,
algumas espécies dessa família mostraram-se amplamente utilizadas com fins medicinais
entre elas estão a Arrabidaea chica (HKB) Verlot e Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry
(TAKEMURA et al 1995). Apresenta dois grandes centros de distribuição geográfica, o
1
675
Brasil e o continente Africano, observa-se que o Brasil é, provavelmente, a região onde a
família apresenta-se com o maior número de espécies, ocorrendo desde a Amazônia até
o Rio Grande do Sul, não possuindo um habitat único (PAULETTI et al., 2003).
Na espécie Arrabidaea chica, há identificado vários pigmentos como a bixina, genipina
e derivados da cajurina, que produzindo um corante vermelho-escuro servem para tingir
toda variedade de fibras artesanais, sendo supostamente eficazes contra dermatoses e
impinges (CORREA, 1984, TAYLOR 1998, MORS 2000) e são comumente utilizados
pelos indígenas da Amazônia na sua pintura corporal, para tingir seus enfeites, utensílios
e vestuários, bem como para tatuagem, na arte, magia e até como método profilático
contra picada de mosquitos e como protetor solar. Os estudos químicos demonstraram
presença de fitosteróis, flavonóides e pigmentos utilizados em cosméticos como:
carajurona, carajurina e 3-deoxiantocianidina (ESTRELA, 1995). As propriedades
tintoriais dessa planta são devido a dois pigmentos flavônicos: a carajurina, que é o
pigmento principal e a carajurona (GRENARD et al.,1987).
É uma planta trepadeira
com atributos ornamentais, é amplamente utilizada na medicina caseira, principalmente
na região Amazônica é usada como anti-inflamatória, antimicrobiana (TAYLOR, 1998),
além de um agente adstringente, sendo seu extrato usado na cosmética em forma de
sabonete cremoso produzindo um efeito anti-acne (TAKEMURA,1995) e atividade
antifúngica (BARBOSA & QUIGNARD,1998). A espécie Arrabidaea chica (Humb. &
Bonpl.) B. Verl., Bignoniaceae, é conhecida popularmente como cajuru, carajirú, crajirú,
cipó-pau, pariri, cipó-cruz (Cronquist, 1988; Grenand et al., 1987; Pauletti et al., 2003).
3- OBJETIVOS
3-1- Geral

Realizar o estudo fitoquímico da espécie Arrabidaea chica e avaliar o perfil
químico utilizando técnicas cromatográficas de Alta Eficiência.
3-2- Específicos
 Isolar e identificar as substâncias presentes nas folhas de Arrabidaea chica,
utilizando técnicas cromatográficas clássicas e de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência no modo preparativo;
 Avaliar a atividade biológica da espécie.
2
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4- MATERIAIS E MÉTODOS
 Nas separações cromatográficas em coluna, foi utilizada como adsorvente sílica
gel (60-200 µm) da SilicaFlash® G60.
 Balança analítica SHIMADZU, AY220.
 Percolador.
 Evaporador Rotativo Buchi.
 Solventes TEDIA: Hexano, Metanol, Acetato de etila, Acetonitrila todos ACS.
 Papel de filtro analítico.
 Técnica Cromatográfica: Cromatografia em camada delgada comparativa
(CCDC) em cromatoplacas medindo 5x5 cm.
 Revelador utilizado: Ácido Sulfúrico.
 Cromatógrafo Líquido Shimadzu LC-10 (analítico) e LC-6 (preparativo).
5- PREPARO DO EXTRATO ETANÓLICO
As folhas foram coletadas na Embrapa Amazônia Oriental. As mesmas foram colocadas
para secar em estufa de circulação de ar à 45º C por cinco dias, em seguida foram trituradas em
um liquidificador, totalizando 360 g de material botânico seco e triturado, logo após foi colocado
no percolador por 24 horas e submetido a duas extrações, por maceração, com etanol (2Lx2),
seguido de filtração e evaporação do solvente em evaporador rotativo. Obteve-se 36 g de extrato
etanólico bruto resultante das duas bateladas. Em seguida o extrato foi submetido a um
fracionamento em coluna cromatográfica de sílica gel, na coluna utilizou-se 180 g de sílica,
para uma altura de 11 cm, com diâmetro de 7,4 cm. A fase móvel foi constituída por
Hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt) e metanol (MeOH), empregados em modo
crescente de polaridade, iniciando com um sistema de Hex/AcOEt 10% (1), Hex/AcOEt
30% (2), Hex/AcOEt 50% (3), AcOEt 100% (4), AcOEt/ MeOH 20% (5), MEOH 100%
(6).
3
677
Folhas de A. chica
M= 360 g
Hex/AcOEt 10%
(1)
Hex/AcOEt 30%
(2)
Hex/AcOEt 50%
(3)
Rendimento:
1,6123g
Rendimento:
2,1878 g
Rendimento:
1,5644 g
AcOEt 100% (4)
AcOEt/MeOH 20%
(5)
MeOH 100% (6)
Rendimento:
1,644 g
Rendimento:
12,2324 g
Rendimento:
15,145 g
As frações 2, 3, 4, 5 e 6 foram analisadas por HPLC analítico e a fração escolhida
para dar prosseguimento ao trabalho foi a fração AcOEt 100% (4), devido ter menor
complexidade nas substâncias.
A fração AcOEt 100% com um rendimento de 1,6g, foi submetida a um
refracionamento por CCVU, usando Hexano, Acetato de Etila e Metanol como eluentes.
Deste processo obteve-se 83 frações, de Hex/AcOEt 10% à AcOEt/MeOH 20%, das quais
as frações 1 a 14 foram descartadas, as frações 15 a 23 continuam em frascos separados,
as frações 24-26; 27-34; 35-36; 37-41; 47-57; 58-65 e 66-73, foram reunidas e o restante
também continuam em frascos separados.
AcOEt 100% (4)
Rendimento: 1,644 g
Fração 27-34
Rendimento: 154 mg
S2
S1
A técnica de escolha para o pré-tratamento das frações foi a Extração por Fase Sólida
(SPE). O método utilizado consistiu em um cartucho C18 previamente condicionado com
4
678
1,0 mL de acetonitrila e 1,0 mL de água ultrapura, depois, a este foi adicionada uma
alíquota de 10 mg do extrato dissolvidos em uma solução de 800 µL de ACN sonicado
por um minuto e mais 200 µL de H2O sonicado também por um minuto (20:80), os
analitos de interesse eluiram com a solução, quanto aos interferentes, permaneceram
retidos na C18. Desta solução foram injetados 20 µL em um cromatógrafo líquido para
se dar início ao desenvolvimento do método de isolamento das substâncias por HPLC.
6- RESULTADOS E DISCUSSÃO
O isolamento das substâncias presente na fração 27-34 foi realizado em um
cromatógrafo líquido, utilizando como fase estacionária uma coluna semi-preparativa
Gemini C18, 5 µm, (250 x 10 mm) com fluxo de 4,7 mL/ min. Como fase móvel, utilizouse misturas dos solventes H2O/ACN (90:10 v/v), para as substancias S1 e S2 empregouse o mesmo método de isolamento, para a substancia que não obteve uma pureza
aceitável, a mesma se encontra em processo de purificação.
CROMATOGRAMA DA FRAÇÃO AcOEt 100%.
mAU
Ch1-319nm,4nm (1.00)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
min
Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 250 x 4.60 mm 5 μm 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN
variando de 5 a 100% em um tempo de 60 minutos, em modo linear e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, = 319
nm.
CROMATOGRAMAS DAS SUBSTANCIAS
ISOLADAS E SEUS RESPECTIVOS
1
ESPECTROS DE RMN DE H.
5
679
mAU
Ch1-215nm,4nm (1.00)
3000
5.304/1552501
2500
2000
S1
1500
4.234/75513
4.489/130927
1000
500
0
-500
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
min
Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 (250 x 4.60 mm), 5 μm, 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN
(90:10 v/v) em modo isocrático e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, = 215 nm.
Espectro de RMN de 1H da substancia isolada S1.
6
680
mAU
13.303/374756
Ch1-400nm,4nm (1.00)
400
350
300
S2
250
200
150
100
50
0
-50
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
min
Condição cromatográfica Coluna Gemini C18 (250 x 4.60 mm), 5 μm, 110A. Fase móvel composta por H2O/ACN
(90:10 v/v) em modo isocrático e vazão de 1 mL/min. Detecção de UV, = 400 nm.
Espectro de RMN de 1H da substância isolada S2.
7- CONCLUSÃO
Na investigação química das folhas de A. Chica foram isoladas duas substancias,
as mesmas foram isoladas via HPLC em escala semi-preparativa. A determinação
7
681
estrutural das substâncias ainda se encontra em processo de análise, e será feita com
base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1H, 13C, HETCOR, HMBC,
DEPT e COSY e por comparação com informações encontradas na literatura.
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
RIBEIRO, C. M. Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas utilizadas na medicina
popular da Amazônia. Dissertação de mestrado, 2008.
TAFFARELLO, D. Extrato de Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl) Verlot obtidos por
processos biotecnológicos: otimização da extração e avaliação farmacológica.
Dissertação de mestrado, 2008.
RIBEIRO, J. F. A. Investigação fitoquímica biomonitorada da tintura 70ºgl de
Arrabidaea chica Humb. & Bompl.Verlot. Dissertação de mestrado, 2011.
SOUZA, A. S. D.; PAGADIGORRIA, C. L. S.; ISHII-IWAMOTO, E.L.; BRACHT, A.;
CORTEZ, D. A. G.; AND YAMAMOTO, N. S. Effects of the Arrabidaea chica extract
on energy metabolism in the rat liver, Pharmaceutical Biology, 2009.
SCHIOZER, A. L.; CABRAL, E. C.; GODOY, L. A. F. D.; CHAVES, F, C. M.;
POPPI, R. J.; RIVEROS, J. M.; EBERLIN, M. N.; AND BARATA, L. E. S.
Electrospray Ionization Mass Spectrometry Fingerprinting of Extracts of the Leaves of
Arrabidaea chica, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 23, No. 3, 409-414, 2012.
BARBOSA, W. L. R.; PINTO, L. D. N.; QUIGNARD, E.; VIEIRA, J. M. D. S.; JR, J.
O. C. S.; ALBUQUERQUE, S. Arrabidaea chica (HBK) Verlot: phytochemical
approach, antifungal and trypanocidal activities, Brazilian Journal of Pharmacognosy,
2008.
PAULA, J. T.; PAVIANI, L. C.; FOGLIO, M. A.; SOUSA, I. M.O.; DUARTE, G. H.B.;
JORGE, M. P.; EBERLIN, M. N.; CABRAL, F. A. Extraction of anthocyanins and
luteolin from Arrabidaea chica by sequential extraction in fixed bed using supercritical
CO2, etanol and water as solventes, The Journal of Supercritical Fluids, 2014.
ALVES, M. S. M.; MENDES, P. C.; VIEIRA, J. G. D. P.; OZELA, E.F.; BARBOSA, W.
L. R.; JÚNIOR, J. O. C. S. Análise farmacognóstica das folhas de Arrabidaea chica
(Humb. & Bonpl.) B.Verlt, Bignoniaceae, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2008.
MAFIOLETI, L.; JUNIOR, I. F. D. S.; COLODEL, E. M.; FLACH, A.; MARTINS, D.
T. D. O. Evaluation of the toxicity and antimicrobial activity of hydroethanolic extract
of Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl, Journal of Ethnopharmacology, 2013.
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