relatório team minho5

Avaliação da poluição por TBT no Rio Minho
-
monitorização dos níveis de imposex em Nucella lapillus e Nassarius
reticulatus, e de intersex em Littorina littorea
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bioensaios em sedimento
Avaliação do potencial estrogénico de sedimentos do rio Minho
através do bioensaio com Potamopyrgus antipodarum.
Autores:
Filipe Miguel Grave Laranjeiro, Mestre em Toxicologia e Ecotoxicologia
Carlos Miguel Miguez Barroso, Professor Auxiliar Universidade de Aveiro
Ricardo Beiras García Sabell, Professor Catedrático Universidade de Vigo
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Indice Introdução ................................................................................................................ 4
Métodos .................................................................................................................... 5
Monitorização dos níveis de Imposex ................................................................... 5
Bioensaios laboratoriais ........................................................................................ 6
Resultados ............................................................................................................... 8
Monitorização dos niveis de imposexo ................................................................. 8
Bioensaios laboratoriais ........................................................................................ 9
Discussão ............................................................................................................... 11
Bibliografia .............................................................................................................. 13
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Introdução Os compostos de TBT estão presentes na "Lista de produtos químicos de acção
prioritária" da Convenção de Oslo e Paris e também estão listados como substância
prioritária na Directiva-Quadro Água. Além da monitorização química do TBT, a
avaliação de imposex é também um elemento obrigatório do Co-ordinated
Environmental Monitoring Programme da OSPAR (OSPAR, 2007). Esta entidade
adoptou orientações específicas para monitorizar os níveis de imposex em diferentes
espécies e definiu objetivos de qualidade ecológica (EcoQO) específicos para cada
espécie.
Definido por Smith (1971), o imposex é a sobreposição de caracteres masculinos
em fêmeas de gastrópodes. Foi descrita pela primeira vez por Blaber em fêmeas de
Nucella lapillus (Blaber 1970). Um ano mais tarde, Smith relatou o mesmo fenómeno
em fêmeas de Nassarius obsoleta e apelidou-o de imposex (Smith 1971). Em 1981,
Smith atribuiu o fenómeno a tintas anti-vegetativas. Foi então estabelecida uma
relação de causa-efeito e o TBT foi considerado o agente causador deste fenómeno
(Smith 1981a; Smith 1981b). Nas últimas décadas, o fenómeno de imposex foi
relatado em aproximadamente 200 espécies de gastrópodes (Shi et al. 2005), tendo
sido usado em diversos estudos de monitorização ambiental (como exemplo:(Oliveira
et al. 2009; Rodríguez et al. 2009; Sousa et al. 2009; Abidli et al. 2011;
Guðmundsdóttir et al. 2011; Castro et al. 2012).
Em sistemas estuarinos, o TBT tende a acumular-se nos sedimentos e apresenta
uma longa persistência neste compartimento; por exemplo, em sedimentos anóxicos
pode ser estável durante pelo menos 2 décadas (Dowson et al. 1993). Testes com
sedimentos colhidos de locais poluídos foram já efetuados com Nassarius reticulatus
para avaliar a indução de imposex (Duft et al. 2007). No entanto outras espécies de
gastrópodes demonstraram ser bons organismos para avaliação de substâncias
químicas com potencial disruptor endócrino no ambiente, como é o caso de
Potamopyrgus antipodarum (Duft et al. 2003a; Oehlmann et al. 2007; Mazurová et al.
2008). O efeito biológico a testar neste bioensaio é o número de embriões produzidos
como resposta à exposição a determinados compostos disruptores endócrinos. (Duft
et al. 2003ab). Um aumento na produção de embriões tem sido usado como uma
indicação da presença de compostos estrogénicos nos sedimentos, ao passo que uma
diminuição poderá indicar a presença de compostos androgénicos ou outros
compostos tóxicos (Duft et al. 2007).
4
Métodos Monitorização dos níveis de Imposex Para a monitorização de imposex foi feita uma visita extensiva a vários locais ao
longo do Rio Minho, assim como na zona costeira adjacente, tendo-se constatado uma
reduzida diversidade e abundância de gastrópodes. Os locais onde foi possível
observar animais em número significativo são apresentados na Figura 1. Assim sendo,
foram avaliados os níveis de imposex para Nassarius reticulatus e Nucella lapillus, e
de intersex para Littorina littorea, duas espécies propostas para monitorização pela
OSPAR.
Adultos de N. reticulatus foram colhidos em agosto de 2012 com uma rede ou à
mão. Os animais foram levados para o laboratório e mantidos em aquários com
arejamento constante. Antes da análise de imposex, os animais foram anestesiados
com uma solução de MgCl2 (7%) e as alturas da concha medidas com uma craveira
com uma resolução de 0,05 mm (medições arredondadas à décima de milímetro). As
conchas foram então abertas com o auxílio de um torno de mesa e os animais foram
dissecados à lupa, fazendo-se identificação do género e de outros parâmetros
necessários para análise de imposex. Os indivíduos parasitados foram descartados da
análise. A percentagem de fêmeas afetadas por imposex (% I), a média do
comprimento do pénis das fêmeas (FPL), a média do comprimento do pénis dos
machos (MPL), o comprimento relativo do pénis (RPLI – (o comprimento médio do
pénis das fêmeas/média do comprimento dos pénis dos machos) x 100) e o índice de
sequência do vaso deferente (VDSI) foram determinados para cada local de colheita.
O VDS foi classificado de acordo com a escala desenvolvida por Stroben et al. (1992).
Adultos de Nucella lapillus foram colhidos manualmente da zona intermareal
rochosa em janeiro de 2012, durante a maré baixa, e os animais foram processados
como descrito acima, embora neste caso os animais não tenham sido anestesiados. O
tamanho relativo do pénis [RPSI = comprimento médio do pénis feminino (FPL)
3
x
100/ comprimento médio do pénis masculino (MPL) 3], o índice sequência do vaso
deferente (VDSI) e a percentagem de fêmeas afetadas com imposex (% I) foram
determinados para cada estação. O VDS foi classificado de acordo com a escala
desenvolvida por Gibbs et al. (1987).
Adultos de Littorina littorea foram colhidos manualmente de um único local de
amostragem na zona intermareal rochosa em fevereiro de 2012, sendo a espécie
5
indicadora com a abundância mais baixa no Rio Minho. No laboratório os animais
foram processados como descrito anteriormente e com recurso a anestesia. Foi
determinada a percentagem de fêmeas afetadas por intersex (um fenómeno
relacionado com o imposex) e o índice de intersex (ISI), de acordo com Bauer et al.
(1995).
Figura 1 – Mapa com as estações de amostragem para a monitorização de imposex/intersex.
Bioensaios laboratoriais Os bioensaios laboratoriais efetuados com duas espécies de gastrópodes
(Nassarius reticulatus e Potamopyrgus antipodarum) consistiram numa exposição
destas a sedimentos colhidos no rio Minho e posterior observação dos efeitos
biológicos sob estudo. Estes sedimentos foram colhidos na campanha efetuada entre
22 e 23 de Maio de 2012 com as restantes equipas participantes no projeto e são
apresentados na Figura 2. Não foram testados todos os sedimentos devido à enorme
logística necessária, assim que foram selecionados pelo menos dois pontos
pertencentes a cada massa de água da zona de estudo.
A exposição com N. reticulatus pretendeu detetar níveis de TBT no sedimento
através do desenvolvimento de imposex durante a exposição. Um elevado número de
adultos de N. reticulatus foram colhidos numa estação de referência, usada
anteriormente em outros estudos, localizada em Toralla, Vigo. Foram trazidos para o
laboratório e foram anestesiados com uma solução de MgCl2 a 7% em água destilada.
O corpo do gastrópode foi puxado ligeiramente para fora da concha para a medição do
pénis. Selecionaram-se fêmeas selecionadas com imposex, mas com um pénis inferior
6
a 1 mm, sendo deixadas a recuperar da anestesia em água do mar durante uma
semana, enquanto os restantes organismos foram devolvidos ao seu meio natural, no
mesmo local.
Os organismos foram expostos aos sedimentos colhidos no rio Minho, havendo
um controlo positivo com sedimento colhido numa estação previamente estudada com
elevada contaminação por TBT e um controlo negativo com água do mar. Os animais
foram expostos em frascos de 1 litro durante 28 dias; 10 organismos foram colocados
em cada frasco havendo 3 réplicas por tratamento. O teste foi realizado com uma
camada de 2-3 cm de sedimentos total e o volume restante de água do mar até encher
o frasco. Antes do bioensaio começar, no momento de adição dos organismos, o
sedimento foi deixado assentar durante um dia. O bioensaio foi realizado a 18 ± 1 º C,
com arejamento constante, com renovação semanal de água mas sem fornecimento
de alimento.
No final da experiência, o VDS e o comprimento do pénis das fêmeas foram
avaliados com o auxílio de uma lupa de bancada. As análises estatísticas foram
realizadas com o software SPSS 17.0. As diferenças entre os tratamentos foram
avaliados através de um teste de análise de variâncias ANOVA, seguido pelo teste
post hoc de Dunnet.
O bioensaio com Potamopyrgus antipodarum teve como objetivo a deteção de
compostos disruptores endócrinos no sedimento através de efeitos ao nível da
produção de embriões. Adultos desta espécie foram capturados no Rio Minho e
levados para laboratório, sendo mantidos em aquários com água formulada de acordo
com Duft et al. (2003) para o cultivo desta espécie.
Após aclimatação em laboratório os organismos foram expostos aos sedimentos
colhidos no Rio Lima (Figura 2). No início do bioensaio o procedimento assemelha-se
ao acima descrito. O sedimento é colocado em frascos de 1 litro e a água formulada é
adicionada. Após assentamento do sedimento (um dia), 15 indivíduos de P.
antipodarum com tamanhos de concha entre 3,6 e 4,2 mm foram adicionados a cada
recipiente. Depois de 20 dias de exposição os animais foram medidos e removidos da
concha com o auxílio de um torno de mesa. O corpo do animal foi então observado à
lupa e o número de embriões produzidos, encontrados no saco embrionário, foram
contados. As análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS 17.0. As
diferenças entre os tratamentos foram avaliados através de um teste de análise de
variâncias ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Dunnet.
7
Figura 2 – Mapa com as estações de amostragens de sedimento para os bioensaios.
Resultados Monitorização dos níveis de imposex Os níveis de imposex nesta área de estudo são apresentados nas tabelas 1 e 2
para Nassarius reticulatus e Nucella lapillus, respetivamente. Para N. reticulatus, a
percentagem de fêmeas afetadas situou-se entre os 44 e os 72%. Os valores de VDSI
variaram entre 0,6 e 0,7, enquanto que o RPLI variou entre 0,1 e 0,9%.
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Tabela 1 - Níveis de imposex em Nassarius reticulatus na zona de desembocadura do Rio Minho: o
comprimento médio do pénis masculino em mm (MPL), o comprimento médio do pénis das fêmeas
em mm (FPLI), índice de comprimento relativo do pénis em % (RPLI), indice de sequência do vaso
deferente (VDSI), e percentagem de fêmeas afetadas por imposex (% I)
Estação Sexo N TM Imp. 2 TM Imp. 5 ♀ ♂ ♀ ♂ 32 19 34 23 Altura concha 24,4 23,9 24,7 22,8 MPL FPL RPLI VDSI %I -­‐ 10,04 -­‐ 12.31 0.01 -­‐ 0.11 -­‐ 0.13 -­‐ 0.89 -­‐ 0.72 -­‐ 0.56 -­‐ 72 -­‐ 44 -­‐ Para Nucella lapillus a percentagem de fêmeas afetadas variou entre 54 e 94, o
VDSI variou entre 0,6 e 1,6 enquanto que o RPSI oscilou entre 0.00 e 0.03, entre as
diferentes estações. O valor mais alto de imposex é encontrado dentro do estuário. O
segundo ponto com valores mais elevados é o TMImp.1, situado mais a norte,
enquanto o local com o nível mais baixo de imposex é o ponto localizado mais a sul
(TM Imp.5).
Tabela 2 - Níveis de imposex em Nucella lapillus na zona de desembocadura do Rio Minho: o
comprimento médio do pénis masculino em mm (MPL), o comprimento médio do pénis das fêmeas
(FPLI), índice do tamanho relativo do pénis (RPSI), indice de sequência do vaso deferente (VDSI), e
percentagem de fêmeas afetadas por imposex (% I)
Estação Sexo N TM Imp. 1 TM Imp. 2 TM Imp. 3 TM Imp. 4 TM Imp. 5 ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ 30 29 30 30 14 26 30 30 30 30 Altura concha 21.58 21.52 23.57 24.10 30.13 29.29 26.13 25.90 24.74 24.86 MPL FPL RPSI VDSI %I -­‐ 3.79 -­‐ 3.54 -­‐ 3.74 -­‐ 3.79 -­‐ 3.70 0.07 -­‐ 0.0 -­‐ 0.24 -­‐ 0.00 -­‐ 0.03 -­‐ 0.00 -­‐ 0.00 -­‐ 0.03 -­‐ 0.00 -­‐ 0.01 -­‐ 1.08 -­‐ 0.55 -­‐ 1.63 -­‐ 0.69 -­‐ 0.59 -­‐ 88 -­‐ 55 -­‐ 94 -­‐ 66 -­‐ 54 -­‐ Para Littorina littorea não houve registo de qualquer fêmea com intersex, num total de
20 fêmeas da amostra.
Bioensaios laboratoriais Os resultados dos bioensaios laboratoriais efetuados com Nassarius reticulatus
e Potamopyrgus antipodarum são apresentados na Figura 3 e na Figura 4,
9
respectivamente. No bioensaio com N. reticulatus não se observou nenhum aumento
estatisticamente significativo do comprimento do pénis nas exposições a sedimentos
do rio Minho quando comparado com o controlo. No entanto, houve um aumento
Comprimento médio do pénis (mm) significativo na exposição ao controlo positivo, validando neste sentido o bioensaio.
2,5 2 * 1,5 1 0,5 0 Estações Figura 3 – Crescimento do pénis em fêmeas de Nassarius reticulatus após exposição de 28
dias a sedimentos do rio Minho, ao controlo positivo (sedimentos colhidos no Porto de Vigo) e ao
controlo negativo (água do local de colheita dos animais). Diferenças estatisticamente
significativas relativamente ao controlo negativo (p<0.05) são sinalizadas por *.
Os resultados do bioensaio com Potamopyrgus antipodarum são apresentados
na Figura 4. Apesar de se poder observar um aumento geral na produção de
embriões, apenas as estações TM09, TM10 e TM16 apresentam diferenças
estatisticamente significativas.
10
20 Número de embriões 18 *
*
* 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Estações Figura 4 – Número médio de embriões produzidos por Potamopyrgus antipodarum expostos a
sedimentos do rio Minho durante 28 dias. Diferenças estatisticamente significativas relativamente
ao controlo (água de cultivo) (p<0.05) são sinalizadas por *.
Discussão Neste trabalho pretendeu-se avaliar os efeitos biológicos (imposex em Nucella
lapillus e Nassarius reticulatus, e intersex em Littorina littorea) provocados pela
poluição por tributilestanho (TBT) no Rio Minho e sua zona de influência, assim como
obter alguns indícios da presença de disruptores endócrinos nos sedimentos através
da realização de bioensaios com N. reticulatus e Potamopyrgus antipodarum.
Os valores de imposex encontrados nas espécies indicadoras demonstram um
baixo nivel de poluição por TBT. Na área de estudo o Ecological Quality Objective
(EcoQO) proposto pela OSPAR (VDSI<2.0) é atingido para N. lapillus, em que os
valores observados variaram entre 0,6 e 1,6. Embora este objetivo ainda não seja
atingido para N. reticulatus (VDSI<0,3), esta espécie apresenta valores de VDSI na
ordem dos 0,6-0,7, que são valores muito baixos. Por sua vez, não foi observada
qualquer fêmea de L. littorea afectada por intersex.
O local com os níveis mais elevados de imposex registado em Nucella lapillus
encontra-se ainda dentro do estuário, assim que historicamente a maior fonte de
poluição se encontrará aí. O facto da segunda estação com maior nível de imposex se
encontrar mais a norte pode ser explicado pela proximidade do porto de pesca de La
Guardia, o qual pode representar uma fonte adicional de poluição para estações
localizadas mais a norte na orla costeira adjacente ao estuário do Minho. A variação
espacial dos valores de imposex observados para Nassarius reticulatus corroboram o
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que foi dito anteriormente para N. lapillus. A inexistência de fêmeas de Littorina littorea
com intersex não é de forma nenhuma surpreendente na medida em que esta espécie
é, de entre todas, a menos sensível à poluição por TBT; de facto, para níveis baixos
de imposex em N. reticulatus e N. lapillus seria de esperar que a população de L.
littorea não estivesse afectada, como aconteceu.
Como o imposex é um fenómeno irreversível, os resultados obtidos expressam
a resposta dos animais a uma acumulação contínua de TBT ao longo da sua vida
(últimos 3-5 anos, tendo em conta a longevidade estimada para as espécies acima
referidas) e podem não refletir o estado de contaminação atual. Deste modo o
bioensaio de exposição a sedimentos pode dar-nos uma ideia dos níveis atuais de
TBT biodisponível no ambiente, o que reveste este bioensaio de grande importância
ecológica. Os resultados obtidos no bioensaio indicam que os níveis de TBT ao longo
do Rio Minho são insuficientes para provocar o crescimento do pénis em fêmeas de N.
reticulatus no período de exposição considerado (28 dias). Apesar do período de
exposição ser relativamente curto, a ausência de indução de imposex corrobora a
ideia de que os sedimentos não apresentam concentrações apreciáveis de TBT,
tratando-se, portanto, de um sistema com baixos níveis de poluição por este
composto. Este resultado contrasta com a indução significativa de imposex observada
para os sedimentos do porto de Vigo, local que se sabe apresentar níveis elevados de
poluição por TBT.
Os resultados obtidos no bioensaio de Potamopyrgus antipodarum, apesar de
serem um bom indicativo do potencial disruptor endócrino do sedimento, podem ser
afectados
por
diversos
outros
factores
intrínsecos
a
cada
sedimento,
independentemente da presença ou não de contaminantes, nomeadamente,
composição
quantitativa
e
qualitativa
em
matéria
orgânica,
composição
granulométrica, pH, etc. Por esta razão, a interpretação dos resultados obtidos deve
ser feita com o conhecimento das análises químicas dos sedimentos, devendo ser
encarada como uma ferramenta de avaliação ambiental complementar a outras
ferramentas utilizadas em monitorização ambiental. De qualquer forma, foi possível
observar que em três estações houve um aumento estatisticamente significativo na
produção de embriões. Estas estações apresentam um potencial estrogénico que teria
que ser confirmado pela presença de conhecidos compostos com potencial
estrogénico como é o caso do Nonylphenol ou Bisphenol A.
12
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