B99 - PET Engenharia Química - Universidade Federal de Uberlândia
Transcrição
B99 - PET Engenharia Química - Universidade Federal de Uberlândia
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA, pH E AGITAÇÃO NAS CARACTERÍSTICAS FLOCULANTES DE Saccharomyces cerevisiae 1 Marina D. B. Sousa, 1 Maria Silvia A. Cecílio, 2 Líbia D. Santos e 3 Eloízio J. Ribeiro 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFU, discente do curso de Engenharia Química Professor(a) da Faculdade de Engenharia de Alimentos da UFU/MG 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 2 1,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100 2 Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Uberlândia. Av Getúlio Vargas, 230, Centro, Patos de Minas- MG, CEP 38700-128 e-mail: [email protected] RESUMO - A volatilidade dos preços dos combustíveis a base de petróleo no mundo e a segurança do clima brasileiro impulsionam, desde 1970, a pesquisa por fontes de energia alternativas e o desenvolvimento de pesquisas em biocombustível para a substituição do petróleo. É neste contexto que, visando o aprimoramento da produção sustentável de etanol, o emprego da tecnologia de fermentação alcoólica com células floculantes surge como uma estratégia promissora para obter melhorias no desempenho e na redução de custos desta produção. O seguinte trabalho teve como intuito avaliar a influência da temperatura, do pH e da agitação na floculação e no rendimento da fermentação alcóolica utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae, de características floculantes, cepa C2/00 doada pelo CPQBA. As faixas de temperatura analisadas foram de 20, 25, 30, 32, 35 e 40°C, com relação ao pH foram avaliados os seguintes pontos: 2,5; 3,0 ; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 e 6,0 e por fim quanto a agitação os valores estudados foram: 50, 100 e 150 rpm. Ao final dos experimentos, verificou-se que os melhores resultados foram obtidos a 32°C, pH na faixa de 4,5 a 5,0 e 150 rpm de agitação. Palavras-Chave: leveduras floculantes, pH, temperatura INTRODUÇÃO O petróleo sempre teve grande destaque no setor energético nacional e mundial. Entretanto, visando diminuir os problemas ambientais e devido às perspectivas de esgotamento das fontes não renováveis de combustíveis fósseis, o biocombustível surgiu como uma opção mais viável para assegurar um futuro sustentável (Abarca, 2005). Nesse contexto, pesquisas e tecnologias capazes de melhorar a produção de etanol vêm aumentando por razões ecológicas e econômicas. O desafio é identificar os gargalos que limitam os processos de fermentação industriais e desenvolver processos que forneçam alta produção de etanol (Alfenore et al., 2004). Os processos de fermentação alcoólica conduzidos pelo uso de cepas selecionadas da levedura Saccharomyces cerevisiae, de características floculantes, vem se tornando uma promissora estratégia para obter melhorias no desempenho e na redução de custos do processo de produção de etanol. Essas leveduras possuem a capacidade de se agregarem espontaneamente e formarem flocos que se concentram no fundo do reator após a transformação dos açúcares presentes no caldo de cana em álcool. Dessa maneira, a retenção das células floculantes no reator possibilita sua reutilização, dispensando assim a centrifugação do vinho fermentado e garantindo uma economia em termos de aquisição e manutenção de centrífugas (Xu et al., 2005, Zhao et al., 2009). Porém, essa inovação ainda vem sendo estudada, uma vez que além do controle e regulação genética (espécie, linhagem e modificação genética), diversos fatores físicos (temperatura, pressão osmótica), químicos (pH, oxigenação, nutrientes minerais e orgânicos, inibidores) e microbiológicos (concentração da levedura e contaminação bacteriana), podem afetar a floculação de leveduras, o rendimento da fermentação e a eficiência da conversão de açúcar em etanol (Zhao et al., 2009, Lima et al., 2001). Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estudar o influência da temperatura, pH e agitação nas características floculantes da Saccharomyces cerevisiae e a resposta na fermentação alcoólica. MATERIAIS E MÉTODOS No experimento foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae, com características floculantes, cepa C2/00 doada pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), Campinas, SP. Além disso, utilizou-se um meio sintético estéril composto de KH2PO4 (5 g/L), MgSO4 .7H2O (1 g/L), [NH4]2SO4 (2 g/L) ,extrato de levedura (6 g/L) e sacarose (160 g/L). Para estudar a influência do pH, o procedimento experimental foi realizado com 150 mL de meio estéril, nos valores de pH definidos para cada experimento, com concentração de sacarose de 180 g/L. Cada erlenmeyer foi inoculado com 15 mL de suspensão celular, obtendo a concentração inicial de leveduras de 10% (v/v), o que correspondia a 108 células/mL. O pH do meio foi ajustado no início da fermentação com ácido clorídrico 2M ou hidróxido de sódio 1M e os valores estudados de pH foram:2,5; 3,0 ; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 e 6,0. O tempo de incubação foi de vinte e quatro horas em mesa rotatória a 100 rpm e temperatura 28°C. As temperaturas estudadas foram 20, 25, 30, 32, 35 e 40°C. As fermentações alcoólicas foram realizadas em erlenmeyers com meio de cultura em uma concentração inicial de sacarose de 160 g/L, em mesas rotatórias com agitação de 100 rpm, durante 10 horas. A redução da concentração de sacarose inicial para 160 g/L nos testes preliminares, foi baseada na quantidade alta de açúcar residual encontrada nos experimentos da influência do pH. Nos experimentos para estudar a influência da agitação nos flocos das leveduras com características floculantes, utilizou-se erlenmeyers e mesas rotativas nas seguintes agitações, a saber: 50, 100 e 150 rpm. As fermentações utilizaram meio sintético com concentração de sacarose de 160 g/L, pH 4,5, temperatura de 32°C e concentração celular de 10% (v/v) durante quinze horas. RESULTADOS E DISCUSSÕES O pH exerceu grande influência no comportamento das células de Saccharomyces cerevisiae C2/00, pois em valores na faixa de 4,5 à 6,0, as cepas se organizavam de forma mais uniforme, formando aglomerados cilíndricos perfeitos e o meio de cultivo se tornava transparente. Em valores entre pH 4,0 e 3,0 observava-se que as leveduras não se aglomeravam e se misturavam ao meio tornandoo viscoso e opaco. De acordo como Souza (et al., 2004), provavelmente, a modificação dos valores de pH altera a ionização dos ácidos aminados das lectinas, proteínas de origem não –imunológica, com a consequente mudança de sua conformação. No trabalho do Soares (2010), que estudou a indução da floculação de leveduras da fermentação alcoólica por bactérias Lactobacillus fermentum, é citado que uma redução brusca de pH promove a dispersão dos flocos, além de aumentar o tempo de sedimentação das células. Um comportamento interessante observado foi em meio de pH 3 o qual ocorreu uma desfloculação total e quando foi aumentando o pH, ao atingir 4,5, as leveduras se aglomeram e voltaram a formar flocos bem definidos, tornando o meio translúcido. Segundo Claro (et al., 2007), o pH pode exercer um efeito profundo na floculação das leveduras. Para várias cepas, a floculação ocorre num amplo intervalo de pH (2,5 – 9,0), embora para algumas cepas este intervalo seja muito mais estreito (2,5 – 5,5), porém para a maioria das cepas o pH ótimo para a floculação se situa entre 3,0 e 5,0. Os rendimentos e produtividades mais altos foram obtidos em pH 4 e 4,5, valores considerados ótimos na maioria das fermentações alcoólicas industriais, 93,94%. Em valores de pH abaixo de 4,0 observa um pequeno aumento na produção de glicerol, que é uma resposta ao estresse causado pelo baixo valor de pH, 3.18 g/L(ANDRIETTA et al., 2008) .Verifica-se para baixos valores de pH uma baixa conversão de sacarose, o que implica em uma alta quantidade de açúcar residual, 106 g/L. Com relação ao efeito da temperatura, os resultados experimentais obtidos em erlenmeyer revelaram que um aumento na temperatura implica numa redução do tamanho dos flocos da levedura, como ilustra a figura 1. Estes resultados estão de acordo com o trabalho de Stratford (1992) que afirmou que a incubação de leveduras na faixa de 35 a 37°C conduz a uma redução da floculação. Os autores (Taylor e Orton, 1975) afirmaram que ocorre uma provável desnaturação das lectinas da floculação a altas temperaturas, assim se as leveduras floculantes permanecessem por alguns minutos numa temperatura entre 50 e 60°C promoveria a completa dispersão dos flocos, mas de forma reversível. Além dos tamanhos dos flocos, a temperatura influenciou no rendimento e produtividade, conforme os resultados após 10 horas de fermentação, ilustrados pela tabela 1. Observa-se, pela tabela 1, que a temperatura na qual se obteve os melhores resultados de concentração de açúcar residual e de álcool foi a temperatura de 32°C. Nesta temperatura observou-se que os flocos foram uniformes e de menor tamanho. Em temperaturas mais baixas a fermentação não é favorecida, restando mais açúcar no final da fermentação e a agregação celular foi maior resultando em flocos grandes, na ordem de 10 mm de diâmetro em média. Os resultados desse estudo sobre a influência da temperatura indicou a faixa de temperatura de 30 a 35°C ser a mais indicada para o processo. Essa faixa é muito conhecida e utilizada nas fermentações alcoólicas com leveduras livres. Assim optou-se por utilizar a temperatura de 32°C para o trabalho subsequente. influenciava no tamanho dos flocos. De acordo com o autor (Zhao et al., 2009), é necessário um valor mínimo de agitação para ocorrer a floculação, pois a agitação mecânica permite aumentar a energia cinética das células o que supera a repulsão mútua entre elas. Sabendo que quanto maiores os flocos, menor é a superfície de contato das leveduras com o meio fermentativo, foram estudadas três condições de agitação em Shaker para observar a diferença no tamanho dos flocos e a influência desse tamanho no resultado da fermentação alcoólica (ANDRIETTA et al., 2008) Com os resultados apresentados pela figura e a tabela 1 pode-se constatar que ocorreu um aumento do rendimento alcoólico com a diminuição do tamanho dos flocos. Na agitação de 150 rpm os flocos ficaram mais uniformes, de tamanho reduzido com 1 mm de diâmetro em média e isso resultou no maior resultado obtido entre todos os testes realizados, na produção de 82,26 g/L de etanol e 96,11% de rendimento. Com uma menor agitação, 50 rpm, as células se agregaram formando flocos maiores de 10 mm de diâmetro em média e o rendimento da fermentação foi o de menor valor obtido igual a 82,35%. CONCLUSÃO Figura 1 – Representação da influência da temperatura do tamanho dos flocos da cepa Saccharomyces cerevisiae C2/00. Tabela 1 – Resultados da influência da temperatura empregando a cepa C2/00, para uma concentração inicial de 168,42 g/L de ART, a pH 4,5, em 10 h de fermentação Temperatura(°C) ART residual (g/L) Álcool (g/L) Rendimento (%) 20 38,73±1,9 44,5±1,9 67,15±3,8 25 23,42±0,9 53,44±2,7 72,12±4,1 30 8,21±0,5 71,05±3,2 86,79±4,2 32 5,32±0,2 76,23±3,9 91,46±4,8 35 0,69±0,03 77,26±3,8 90,14±4,4 40 2,53±0,11 66,11±3,3 77,99±3,9 Foi observado durante os testes preliminares utilizando a cepa Saccharomyces cerevisiae floculante C2/00 que a agitação O pH, a temperatura e a agitação influenciaram na formação dos flocos e no rendimento e produtividade da fermentação alcoólica. Valores de pH abaixo de 4,0, temperaturas acima de 35°C e agitação acima de 100 rpm provocaram uma dispersão dos flocos no meio. Valores de pH na faixa de 4,0 a 5,0 foram os mais adequados ao processo por conduzirem aos melhores resultados de rendimento e produtividade, além de manter a levedura floculada; REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABARCA, C. D. G.; 2005. Inovações tecnológicas na agroindústria da cana-de-açúcar no Brasil. COPPE/Universidade Federal do Rio de Janeiro, DEPRO/Universidade Federal de Ouro Preto. ALFENORE, S., CAMELEYRE, X., BENBADIS, L., BIDEAUX, C., URIBELERREA, J.L., GOMA, G., MOLINA-JOUVE, C., GUILLOUET, S.E.; 2004. Aeration strategy: a need for very high etha-nol performance, Journal of Applied Microbiology, 63, 537–542. ANDRIETTA, S. R.; STECKELBERG, C.; ANDRIETTA, M. G. S.; 2008. Study of flocculent yeast performance in tower reactors for bioethanol production in a continuous fermentation process with no cell recycling. Bioresource Technology, 99, 3002 – 3008. CLARO, F. B.; RIJSBRACK, K.; SOARES, E. V.; 2007. Flocculation onset in Saccharomyces cerevisiae: effect of ethanol, heat and osmotic stress, Journal of Applied Microbiology, 102, 693-700. LIMA, U. A.; BASSO, L. C.; AMORIM, H. V. In: LIMA, U. A. (Coord.); 2001. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos. 3 ed. São Paulo: Edgard Blücher, 1-60. SOARES EV.; 2010. Flocculation in Saccharomyces cerevisiae: a review, Journal of Applied Microbiology, 110, 1-18. SOUZA, M.A.C., MUTTON, M.J.R.; 2004. Floculação de leveduras por lactobacillus fermentum em processos industriais de fermentação alcoólica avaliada por técnica fotométrica, Ciência e Agrotecnologia, Lavras, 28, 893-898. STRATFORD, M.; 1992.Yeast flocculation – a new perspective. Advances Microbial Physiology, 33, 1-71. TAYLOR, N.W.; ORTON, W.L.; 1975. Calcium in flocculence of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Institute Brewing , 81, 53-57. XU, T.J.; ZHAO X.Q.; BAI, F.W.; 2005 Continuous ethanol production using self-flocculating yeast in a cascade of fermentors. Enzyme Microbiol Technology, 37, 634-640. ZHAO, X.Q., XUE, C, GE, X.M, YUAN, W.J., WANG, J.Y., BAI, F.W.; 2009. Impact of zinc supplementation on the improvement of ethanol tolerance and yield of self flocculating yeast in continuous ethanol fermentation. Journal of Biotechnology,139, 55–60. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a FAPEMIG, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro. Ao CPQBA pela doação da levedura.