avaliação da eficiência do ácido peracético na
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avaliação da eficiência do ácido peracético na
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS RENAN ANTONIO CERETTA CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008 1 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Elidio Angioletto Co-orientador: Marcos M. da Silva Paula CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008 2 3 AGRADECIMENTOS 4 Ao professor dr. Elidio Angioletto que, com paciência, tolerância, persistência e sabedoria, soube conduzir-me ao término do estudo. Muito obrigado Professor Elídio. Ao Professor dr. Marcos Marques Paula, cuja disponibilidade e disposição incomparáveis, co-orientou este trabalho com muita competência e afinco. Professor, você faz a diferença no ambiente acadêmico. Ao Everton Angioletto, bolsista que auxiliou primorosamente no desenvolvimento das pesquisas de laboratório, os meus agradecimentos especiais pela compreensão de minhas ansiedades. Ao colega MSc. Silvio Ávila Junior, que muito solidariamente desenvolveu estudos valiosos auxiliando-me na finalização de minhas pesquisas. Ao colega M.Sc. Claus Troger Pich pela disposição, companheirismo, solidariedade e imensa disposição em colaborar. Obrigado pelas tuas intervenções primorosas e ricas. À Universidade do Extremo Sul Catarinense – instituição em que atuo como docente, pelo seu crescimento e pelo investimento no conhecimento, promovendo o Curso de Pós-Graduação – nível de mestrado, e aos professores coordenadores e docentes do Curso de Mestrado. À FGM – pelo interesse e pelas idéias que possibilitaram o desenvolvimento deste estudo. Às prefeituras municipais de Criciúma e de Içara, por acreditarem na importância do aprimoramento profissional de seus trabalhadores e por cederem os períodos necessários ao desenvolvimento dos estudos. 5 À Vitória Bisognin Ceretta, minha filha – pela compreensão diante das ausências necessárias ao desenvolvimento dos estudos e por ser a força motivadora de meus empreendimentos. Aos meus pais Sílvio e Gema, por me apoiarem sempre em todos os empreendimentos de minha vida. mestrado. À Luciane Bisognin Ceretta, minha esposa, por me estimular a cursar o À Ana Paula Maciel, colega cirurgiã dentista e grande amiga, que tão prestimosamente cedeu seu consultório para que as pesquisas fossem desenvolvidas. À Patrícia Duarte Simões Pires, colega cirurgiã dentista e grande amiga, pelo auxílio com materiais, com estímulo e com o diálogo amigo. 6 “A razão cardeal de toda superioridade humana é, sem dúvida, a vontade. O poder nasce do querer. Sempre que um homem aplica a veemência e a perseverante energia de sua alma a um fim, ele vencerá os obstáculos e, se não atinge o alvo, fará pelo menos coisas admiráveis.” (JA) 7 RESUMO Avaliou-se a eficiência do ácido peracético, nas concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm, na esterilização microbiológica de materiais odontológicos. Determinou-se, para essas concentrações, se o ácido peracético causa corrosão na instrumentação odontológica, se induz a mutagenicidade, avaliada através do teste cometa e citotoxicidade celular. Verificou-se, ainda, a concentração inibitória mínima (CIM), a concentração bactericida mínima (CBM) através da difusão em Ágar utilizando o método dos poços. A taxa de corrosão, calculada a partir de ensaios potenciodinâmicos, foi de 10-6 cm/ano, indicando que o produto não danifica o instrumental. Também se avaliou a capacidade de esterilização do ácido peracético a 2500 ppm em materiais utilizados nos procedimentos clínicos, pelo período de tempo de exposição de 20 minutos. Os materiais foram coletados em dois consultórios odontológicos, sendo um público e outro privado. Os resultados deste estudo demonstraram a eficiência do ácido peracético na esterilização de equipamentos odontológicos, tornando-se mais uma alternativa para a prevenção das infecções nos consultórios. O teste COMETA indicou atividade genotóxica, para a concentração de 2500 ppm, inferior ao peróxido de hidrogênio. No entanto, o ácido peracético tem um curto tempo de vida não permanecendo sobre o instrumental. Apesar disso a atividade genotóxica indica a necessidade do usuário utilizar equipamentos de proteção, como luvas e jaleco. Palavras-chave: Ácido Peracético; Esterelização; Microorganismos; Odontologia; Sanitizante; Contaminação. 8 ABSTRACT The effectiveness of peracetic acid on the microbiological sterilization of dental materials was evaluated at concentrations of 800ppm, 1500ppm, and 2500ppm. At these concentrations, it was determined whether peracetic acid caused corrosion to dental instruments and induced cellular mutagenicity and cytotoxicidity. The minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration (MBC) and diffusion in Agar, using the well method, were also verified. The corrosion rate, calculated from potentiodynamic assays was 10-6 cm/year, indicating that the product does not damage equipment. The sterilization capacity of peracetic acid at 2500ppm for materials used in clinical procedures exposed for 20 minutes was also evaluated using materials collected at two dental clinics, one public and the other private. The results of this study demonstrated the effectiveness of peracetic acid for sterilizing dental equipment, providing another alternative for the prevention of infections in clinics. The COMET assay indicated genotoxic activity at 2500 ppm. Key words: Peracetic Acid; Sterilization; Cytotoxicidity; Genotoxic activity; Chemical agents. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Montagem do experimento do teste de corrosão ......................................39 Figura 2 - Descrição simplificada do teste cometa. ..................................................42 Figura 3 - Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3; (c) dano classe 4. ............................................................................................43 Figura 4 - Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão em Agar. ...49 Figura 5 - Staphylococcus aureus concentração 800ppm........................................49 Figura 6 - Staphylococcus aureus concentração 2500ppm......................................50 Figura 7 - Observa-se a realização do teste da concentração inibitória mínima da solução Peracet à 1500ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis . ...................51 Figura 8 - Perfis potenciodinâmicos de aço inox em ácido peracético. ...................56 Figura 9 - Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH 7,0), sendo *p<0,05 e **p<0,001...................................................................................................57 Figura 10 - Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH). ....................59 Figura 11 - índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800, 1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água) e controle positivo (próxido de hidrogênio).................................................................................60 Figura 12 - Representação gráfica do mínimo de células viáveis frente a diferentes concentrações............................................................................................................62 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do ácido peracético .........................................................................................................37 Tabela 2 - Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo. .........................38 Tabela 3 -Teste de difusão em Agar.........................................................................47 Tabela 4 - Resultados referentes a Concentração Inibitória Mínima . ......................51 Tabela 5 - Concentração do princípio ativo após diluição seriada. ...........................52 Tabela 6 - Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima.......53 Tabela 7 - Taxa de corrosão em cm.ano-1 em eletrodos de aço inox nas concentrações de Peracet de 800, 1500 e 2500 ppm/mL. ........................................55 Tabela 8 - Absorbância do número de células viáveis após exposição ao ácido peracético...................................................................................................................60 Tabela 9 - Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório público. ......................................................................................................................64 Tabela 10 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................66 Tabela 11 - Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização no consultório particular. ...........................................................................................67 Tabela 12 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................69 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA - Ácido Acético ANVISA - Agencia Nacional de Vigilância Sanitária ATCC - American Type Culture Collection CBM - Concentração Bactericida Mínima CEO - Centro de Especialidades Odontológicas CIM - Concentração Inibitória Mínima CRO - Conselho Regional de Odontologia DMSO - dimetil sulfóxido DNA - Ácido Desoxirribonucléico EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético EPI - Equipamentos de Proteção Individual HP - Peróxido de Hidrogênio MO - Microrganismos MTT - Sal de Tetrazolium PAA - Peróxido de Ácido Acético PBS - Cloreto de sódio / Cloreto de Potássio / Fosfato de Sódio Dibásico / Fosfato de Sódio Monobásico pH - Potencial Hidrogeniônico PPM - Partes por Milhão TBE - Tampão Tris / Borato / EDTA 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................13 2 OBJETIVOS............................................................................................................17 2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................17 2.2 Objetivos Específicos...........................................................................................17 3 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................18 3.1. A importância da Esterilização e os Métodos Utilizados.....................................18 3.2 Ácido Peracético...................................................................................................27 3.2.1 Características Físico-Químicas........................................................................27 3.2.2 Atividade Antimicrobiana...................................................................................29 3.2.3 Modo de Ação...................................................................................................30 3.2.4 Subprodutos......................................................................................................30 4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................33 4.1 Etapa Laboratorial................................................................................................33 4.1.1 Microrganismos Utilizados.................................................................................33 4.1.2 Disponibilização do Biocida...............................................................................35 4.1.3 Teste de Difusão em Agar.................................................................................34 4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura....................................................................35 4.1.5 Inoculação dos Microorganismos......................................................................35 4.1.6 Preparação da Solução Teste...........................................................................35 4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima..........................................................36 4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima......................................................37 4.1.9 Estudo de Eletroquímica...................................................................................37 4.1.9.1 Condição Experimental..................................................................................37 13 4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa.....................................................39 4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético........................................................42 4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT)..........42 4.2 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos...........................................43 4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública).......................................................44 4.2.2 Consultório Privado...........................................................................................45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................46 5.1 Teste de Difusão em Ágar....................................................................................46 5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima.............................................................49 5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima.........................................................51 5.4 Ensaios de Corrosão............................................................................................53 5.5 Teste de Genotoxicidade......................................................................................55 5.6 Freqüência de Dano ao DNA...............................................................................57 5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético.................................................................59 5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Oodontológicos.............................................61 5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração de 2500 ppm em Material Odontológico Contaminado...................................................61 6 CONCLUSÃO.........................................................................................................70 REFERÊNCIAS..........................................................................................................71 14 1 INTRODUÇÃO A definição de saúde para a Organização Mundial de Saúde (OMS), apresenta uma abrangência abstrata e muitas vezes inatingível, configurando-se uma utopia uma vez que a condicionam os fatores sociais, culturais e psicológicos, e não apenas a ausência de enfermidades. Tal conceito tem sido alvo de análises e críticas por muitos estudiosos. No entanto, representa um avanço em relação a um conceito anterior, que compreende a saúde, unicamente como a ausência de doenças. Isso porque, o que pode ser definido como um bem estar para uns poderá não ser para outros (Chaves, 1986). Dentre os fatores de bem estar ou de saúde estão àqueles relacionados à odontologia e, portanto, à saúde bucal. Concebemos que saúde e doença são determinadas por fatores sociais, econômicos e culturais e, também, influenciadas por serviços odontológicos, ou mesmo por medidas efetivas de controle e prevenção de doenças. Assim, é fundamental a implementação de políticas, tanto em nível individual quanto macroestruturais, e dentre elas estão àquelas relacionados ao controle de infecções, tanto nos serviços odontológicos da rede pública, quanto nos consultórios e clínicas particulares. Para Gonçalves, (2001), quatro normas são estabelecidas na rotina diária dentro de um consultório odontológico: 1. anti-sepsia das mãos; 2. limpeza, desinfecção e esterilização; 3. medidas de proteção do paciente e profissional. 4.manutenção e monitoramento. Dentre as tantas causas de doenças, estão aquelas que podem ser de natureza infecciosa (Hardie, 1996). A infecção é um fenômeno microbiano, caracterizado por uma resposta inflamatória frente à presença de microorganismos ou a invasão destes nos tecidos (Bone et al, 1992). 15 O objetivo prático da microbiologia é controlar os microrganismos, para utilizar ou estimular aqueles com atividades úteis e inibir ou destruir os que são nocivos. Os microrganismos são capazes de sobreviver em ambientes diversos, existindo, entretanto, limitações da capacidade de sobrevivência de determinados microrganismos em um meio ambiente desfavorável, as quais foram aproveitadas pelo homem como recurso para controle dos mesmos. O ambiente de trabalho odontológico é um local de alto risco de contaminação devido ao tipo de trabalho que é realizado e aos materiais utilizados nos diferentes procedimentos (Cellini et al, 2001). As principais razões para se desenvolver o controle de microrganismos nos consultórios odontológicos são: a. Prevenir a transmissão de doenças e infecções; b. Prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos; c. Prevenir a deterioração e dano de materiais causados por microrganismos. A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação, foi o fato do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção. O Processo de esterilização compreende a eliminação de todos os organismos viáveis, incluindo esporos. Este termo não pode ser usado com sentido relativo: um objeto ou substância estão ou não esterilizados; jamais poderão estar meio ou quase esterilizados. Entretanto, deve ser salientado que determinados instrumentos não podem ser esterilizados utilizando calor, que é um dos métodos mais indicados também em odontologia. Entre eles podemos citar as canetas de alta 16 rotação, cones de guta percha para obturação de canais radiculares, lençóis de borracha para isolamento absoluto, posicionadores intra-orais para tomadas radiográficas, dentre outros. Nesses casos, a esterilização química faz-se necessária. Essa esterilização vem provocando muitas dúvidas nos profissionais, pacientes e comunidade acadêmica, quanto à eficiência do processo, danos corrosivos causados no equipamento, e possíveis efeitos colaterais causados pela presença de resíduos nos equipamentos. No atendimento ao paciente, geralmente é o cirurgião-dentista e seu auxiliar que fazem todo o trabalho no consultório: atendem o paciente, limpam e esterilizam os instrumentos, desinfetam os equipamentos e as dependências do consultório, agendando consultas e outras atividades. É nesse ambiente que podem originar-se cadeias e rotas de contaminação de doenças infecciosas. Os profissionais da saúde estão expostos a uma grande variedade de microrganismos presentes na saliva e no sangue. Nas clínicas e consultórios odontológicos a maior concentração de microrganismos encontra-se na boca do paciente. Diante dessa realidade, as questões relativas ao controle de infecções e às normas de biossegurança passam a ter um novo enfoque. Procedimentos como pegar materiais das gavetas, antes considerados inofensivos, devem ser revistos e corrigidos (Russo e Russo, 2001). As infecções que podem ocorrer no consultório são semelhantes às infecções hospitalares, hoje tão estudadas, que representam sérios riscos aos pacientes em tratamento. O cirurgião-dentista deve obrigatoriamente controlar as infecções dentro do consultório odontológico com o maior rigor, para que não venha descobrir, mais tarde, que foi negligente, colocando em risco sua vida, de seus 17 pacientes, de seus auxiliares e de seus próprios familiares. Isso porque muitas doenças podem ser contraídas no consultório dentário. Neste contexto, torna-se necessário à realização de novas pesquisas que possam validar a utilização do ácido peracético como esterilizante/desinfetante químico de instrumentos odontológicos, laboratoriais e médico-hospitalares. Contudo, seu emprego como agente sanitizante exige que o mesmo seja eficiente na esterilização, não provoque danos celulares residuais e não cause corrosão nos diversos materiais metálicos com que possa entrar em contato. Assim, avaliar a eficiência da esterilização química em equipamentos odontológicos contaminados, através do àcido peracético se constitui no escopo principal do presente trabalho. 18 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Realizar estudo experimental sobre a eficiência do ácido peracético, na esterilização microbiológica de equipamentos odontológicos. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar em que concentração (800 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm) o ácido peracético é eficiente na esterilização de materiais odontológicos contaminados; Verificar se as concentrações do ácido peracético utilizados (800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm) podem causar ataque corrosivo nos equipamentos; Verificar se o ácido peracético é citotóxico e se seus resíduos que porventura permanecerem sobre os instrumentais odontológicos, podem induzir a mutagenicidade celular. 19 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1. A Importância da Esterilização e os Métodos Utilizados O controle das infecções nunca foi tão necessário quanto é hoje, não somente nos ambientes hospitalares, mas também em outros ambientes profissionais, como os consultórios odontológicos, clínicas médicas e veterinárias, cabeleireiros, atelier de tatuagem, laboratórios de indústrias alimentícias e farmacêuticas entre outros (Kuriki, 1997). O controle da infecção deve ser praticado onde e sempre que existir um potencial para exposição a vírus, bactérias, fungos ou outros microrganismos, não bastando somente utilizar o instrumental esterilizado, mas a conscientização dos profissionais pelo uso de técnicas assépticas e procedimentos que garantam tanto ao profissional, quanto ao paciente e ao ambiente um tratamento sem risco de contaminação. A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação foi o fato do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção. Assim, por exemplo, o exército de Alexandre o Grande, fervia a água para beber. Muitas outras civilizações antigas preservavam os gêneros alimentícios com sal, pela secagem e por aquecimento. Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), jovem cirurgião inglês, impressionado com os trabalhos de Pasteur, desenvolveu métodos para impedir o acesso de microrganismos aos ferimentos cirúrgicos, com a finalidade de evitar infecção microbiana (sepsia) nos tecidos após cirurgia. Realizando a esterilização escrupulosa dos instrumentos cirúrgicos, utilização de bandagens com anti-sépticos 20 (iodo) e conduzindo a cirurgia sob vaporização de desinfetante para impedir a infecção pelo ar, conseguiu reduzir grandemente a sepsia cirúrgica. Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), há mais de 100 anos, recomendava aos cirurgiões: “a contaminação deve obrigatoriamente ser vista com seus olhos mentais de maneira distinta do que podem fazer seus olhos corporais”. Para Cottone e colaboradores, (1991), o controle de infecção é uma filosofia de trabalho e não uma receita ou fórmula a ser seguida, sendo inserida dentro de um critério de racionalização onde é necessário verificar a eficácia dos equipamentos utilizados na esterilização, os agentes químicos escolhidos, o controle e eficácia da esterilização, a qualidade da água, o armazenamento do material esterilizado, o uso de EPI, o destino do lixo contaminado e a constante capacitação dos profissionais envolvidos no processo. A cada dia enfrenta-se uma realidade diferente, e a mudanças freqüentes nos protocolos de atendimento, juntamente com evolução dos produtos e equipamentos, obrigam os profissionais da área da saúde a atualizarem-se e transformar suas práticas diárias, restabelecendo normas de conduta e procedimentos que garantam um tratamento sem riscos de contaminação. Para Vieira, (2005), a descontaminação é o resultado dos processos de limpeza, desinfecção e esterilização usados em objetos, superfícies ou pacientes, utilizando métodos físicos e químicos. Conceituando esterilização, esta é a destruição ou remoção total de microorganismos e desinfecção é a destruição ou remoção de microorganismos indesejáveis não incluindo necessariamente os esporos. Desta forma, considerando as maneiras convencionais de assepsias existentes nos consultórios e clínicas odontológicas, a esterilização por calor úmido na autoclave e o calor seco em forno Pasteur (estufa) são as formas mais difundidas. Uma alternativa para esterilização por calor é a utilização de agentes 21 químicos (Tortora, Funke e Case 2000). A prática odontológica abrange uma variabilidade de procedimentos, desde simples profilaxias até cirurgias mais complexas, nas quais há contato com secreções da cavidade oral e com sangue; Somando-se a isso, equipamentos e instrumentais contaminados (Konkewicz, 1999). Esses procedimentos geralmente implicam em contato com secreções da cavidade oral, algumas vezes representados simplesmente pelo contato com saliva, outras vezes pelo contato com sangue, secreções orais, secreções respiratórias e aerossóis. Isso tudo acaba resultando em risco de transmissão de infecções, tanto de paciente para paciente, como dos profissionais para pacientes ou dos pacientes para os profissionais. É de fundamental importância que os procedimentos estabelecidos pelas normas de Biossegurança sejam rigorosamente seguidos e, que a limpeza e sanitização, tanto do local quanto dos equipamentos e superfícies de trabalho, devam atender às exigências legais (Veneranda, 2004). O Ministério da Saúde, no Manual de Controle de Infecção Hospitalar (Brasil, 1994), recomendou a classificação de Spaulding para objetos inanimados, conforme o risco potencial de transmissão de infecção que apresentam. Esta classificação tem sido utilizada rotineiramente também na Odontologia, já que no consultório odontológico o contato entre o instrumental e o paciente é constante. Na classificação de Spaulding, os materiais são considerados como artigos críticos, semi-críticos e não-críticos. Artigos críticos são todos aqueles que penetram nos tecidos subepiteliais, no sistema vascular e em outros órgãos isentos de microbiota própria, bem como todos àqueles que estejam conectados com eles. Instrumentos que tocam em pele e mucosa não íntegra também são considerados críticos. Estes artigos devem estar obrigatoriamente esterilizados ao 22 serem utilizados. Artigos semi-críticos são todos aqueles que entram em contato apenas com mucosa íntegra, capaz de impedir a invasão dos tecidos subepiteliais. Estes artigos também devem estar esterilizados. Para artigos semi-críticos se aceita desinfecção apenas para àqueles itens que não podem ser esterilizados por procedimentos físicos. Artigos não-críticos são todos aqueles que entram em contato com pele íntegra e ainda os que não entram em contato direto com o paciente. Estes artigos devem sofrer procedimentos de desinfecção (Guimarães Jr., 2001). Muitos microrganismos presentes na cavidade bucal podem sobreviver por longos períodos de tempo fora da mesma, representando um risco de contaminação tanto nos procedimentos realizados diretamente no paciente, como nos procedimentos realizados em laboratório, pela manipulação ou contato de objetos contaminados. A exposição ao sangue e a saliva de pacientes durante a realização de procedimentos odontológicos, leva a possibilidade de aquisição de doenças como herpes, gripe comum, tuberculose, pneumonia, hepatites B e C, AIDS entre outras. O vírus da AIDS é viável em plasma seco pelo período de 72 horas, enquanto o vírus da hepatite B pode sobreviver por uma semana sobre superfícies e o Mycobacterium tuberculosis pode representar risco de contaminação por semanas (Golegã et al, 2000). Como não é possível a percepção de todos os pacientes portadores de doenças infecciosas, deve-se considerar todo e qualquer paciente como potencialmente infectado durante a realização dos procedimentos odontológicos. Fungos, esporos, vírus, microrganismos bacterianos, causadores de doenças infecciosas, muitas vezes estão presentes em materiais para moldagem bem como em impressões e peças protéticas e, quando não são devidamente desinfetados passam a ser a principal via de transmissão de doenças. (Fonseca et al, 1998). Nos 23 laboratórios de prótese dentária e clínicas odontológicas, são manuseados materiais que foram contaminados pelo contato direto com tecidos orais de pacientes tornando-se potencialmente transmissores de doenças infecciosas. Guimarães (1992), constatou a sobrevivência de microrganismos em bancadas e superfícies contaminadas justificando a necessidade da adoção de medidas de biossegurança, ressaltando o uso de equipamentos de proteção individual, métodos de desinfecção e esterilização de materiais e instrumentais; fato este ratificado por Golegã e colaboradores (2000), que mencionam que o uso de IPI durante os procedimentos odontológicos reduz significativamente a transmissão de microrganismos conseqüentemente o risco de contaminação e transmissão de doenças. As práticas eficazes de controle de infecção devem incluir técnicas completas de lavagem das mãos com anti-sépticos adequados e outras barreiras apropriadas como o uso de luvas descartáveis, avental, máscara, proteção para os olhos inclusive dos pacientes, gorro, em qualquer consulta ao paciente que possa envolver exposição à saliva, muco ou sangue. A desinfecção dos instrumentos odontológicos deve iniciar com limpeza vigorosa, secagem e esterilização em calor úmido, seco, gás ou processo químico. O uso de sanitizantes deve fazer parte de um protocolo sanitário geral que inclui boa higiene do consultório, desinfecção de rotina do campo cirúrgico e as superfícies devem ser tratadas com desinfetantes apropriados (Tortamano, 1997). Isto é justificável, pois se sabe que 1 mL de saliva pode conter mais de 200 milhões de microrganismos de aproximadamente 250 espécies (Thylstrup; Fejerskov, 1995), sendo que a cavidade oral é considerada uma fonte primária de microrganismos potencialmente patogênicos (Cochran; Miller; Sheldrake,1989; 24 Medina; Merino e Gorodner, 2002). Juntamente com os procedimentos realizados nos consultórios odontológicos, existe um contato muito próximo entre paciente e profissional, podendo estabelecer desta forma uma relação de infecção cruzada, disseminando agentes patológicos podendo desencadear possíveis doenças entre indivíduos presentes no local e em outros meios quando os pacientes retornam as suas atividades de rotina (Pires, 2005). Recomendações para métodos de esterilização e desinfecção de instrumentos odontológicos vêm sendo descritos na literatura. Entretanto, existem muitas variáveis que podem ser encontradas quando da aplicação de tais métodos. Dessa forma faz-se necessário verificar a eficiência do processo de esterilização de maneira a levar o profissional de odontologia a escolher os métodos que melhor cumprem a tarefa sem colocar em risco a saúde dos pacientes, dos profissionais e a durabilidade dos equipamentos (Conselho Federal de Odontologia, 1999). Existe assim a necessidade de verificação de eficácia dos processos de esterilização efetuada nos consultórios dentários. Dentre as variáveis que influenciam a esterilização torna-se imprescindível verificar se as exigências de tempo, temperatura e concentração estão sendo cumpridas de forma a garantir que as bactérias e os esporos bacterianos sejam destruídos. Em alguns consultórios dentários desinfetantes indicados para desinfecção de ambientes hospitalares podem ser utilizados erroneamente na esterilização de equipamentos usados em tratamentos odontológicos. Em hospitais existem profissionais médicos, enfermeiros e bioquímicos que têm, dentre as funções desempenhadas, o controle de infecção. Eles estão encarregados de vigiar as políticas e materiais usados pelo pessoal operacional e pessoal das centrais de serviços. Nos consultórios dentários esse controle não 25 ocorre com a mesma eficácia e o profissional, às vezes, possui dúvidas na eficiência do controle que está utilizando. Outra dúvida que surge é se o processo de esterilização não estará danificando o equipamento que o mesmo vem utilizando. Outra preocupação comum é se esses produtos que esterilizam não prejudicam os pacientes (efeitos colaterais), causados por possíveis resíduos que permanecem no equipamento. Embora esterilização e desinfecção possam parecer procedimentos simples e diretos, são, entretanto complexos. Assim, torna-se relevante levar aos dentistas que atuam em clínicas públicas e privadas e não dispõem de pessoas para controle de infecção, uma avaliação criteriosa dos problemas de esterilização e desinfecção de instrumentos e dispositivos, para que possam optar pelos métodos mais seguros. Os Centros para Controle e Prevenção de Doenças recomendam a esterilização para todos os artigos críticos reutilizáveis, esses que penetram os tecidos macios ou os ossos e entram no sistema vascular. Também se inclui nesta recomendação os equipamentos manuais de alta velocidade e eletrodomésticos reutilizáveis, ainda que estes não penetrem tecidos. A ANVISA (2005), classifica os agentes antimicrobianos de acordo com o nível de descontaminação proporcionado pelos mesmos em: anti-sépticos, desinfetantes, sanitizantes e esterilizantes. Anti-séptico é um agente químico que inibe ou elimina o crescimento de microrganismos não sendo tóxico quando utilizado nos tecidos, para lavar as mãos ou em ferimentos. Os desinfetantes são agentes físicos ou químicos que destroem ou inativam irreversivelmente a maioria ou todos os microrganismos patogênicos, mas não inativam esporos ou vírus. Sanitizante é um agente químico que reduz, mas não elimina os 26 microrganismos de um material ou superfície inanimada. Os esterilizantes químicos devem eliminar todas as formas de vida microbiana, incluindo os esporos, sendo agentes utilizados para desinfecção em alto nível. Existem três diferentes níveis de desinfecção dependendo da efetividade microbiana esperada: De baixo nível, menos efetiva, reduzindo parcialmente os microrganismos e ineficaz contra Mycobacterium tuberculosis e esporos; de nível intermediário, eliminando o Mycobacterium tuberculosis e a maioria dos vírus, excluindo os esporos; e de alto nível capaz de eliminar fungos, bactérias e vírus, podendo ser esterilizante. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, (ANVISA), através da portaria Nº 15, de 23 de Agosto de 1988 define, classifica, regulamenta e estabelece os parâmetros de emprego dos sanitizantes com finalidade antimicrobiana: a. Desinfetantes - formulações que possuem na sua composição substâncias microbiocidas e apresentam efeito letal para microrganismos não esporulados (Staphylococcus aureus, Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Tricophyton mentagrophytes, Mycobacterium amegmatis e Myctobacterium bovis). b. Esterilizantes - formulações que possuem na sua composição substâncias microbicidas com efeito letal para microrganismos esporulados Bacillus subtilis (esporo) e Clostridium sporogenes (esporo). Para Guandalini e colaboradores (1997), um desinfetante químico ideal deve preencher certos requisitos como ter ação rápida, alta atividade biocida, ser efetivo na presença de matéria orgânica, biodegradável, fácil uso, ser econômico, não tóxico e não corrosivo, entre outros; porém, os produtos disponíveis no mercado não preenchem esses critérios. Pires (1998), aponta que os agentes químicos mais 27 utilizados para desinfecção são o glutaraldeído a 2% e o hipoclorito de sódio a 1%, que são produtos com alto poder germicida, porém a manipulação inadequada ou a hipersensibilidade do usuário podem causar intoxicação, dermatite de contato, despigmentação da pele e problemas respiratórios. Rutala e Weber (1999), abordaram sobre os esterilizantes químicos utilizados para desinfecção em alto nível com o objetivo de facilitar a escolha dos mesmos; Os autores concluíram que alguns desinfetantes podem até ser esterilizantes, dependendo do tempo de exposição, como o glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e o ácido peracético. Dentre os métodos químicos de descontaminação encontram-se os fenóis e os compostos fenólicos, as biguanidas, os halogênios, os álcoois, os metais pesados, os ácidos orgânicos, os aldeídos, os esterilizantes gasosos e ainda os peroxigênios, os quais em sua grande maioria contribuem para o controle de microrganismos nos serviços de saúde (Williams et al, 2001). Cabe destacar mais especificamente a classe dos peroxigênios, que são compostos de ação de largo espectro, possuindo como exemplo clássico o peróxido de hidrogênio, um antimicrobiano potencial. Além desse, utiliza-se outras formas, resultados de associações químicas, como o caso do ácido peracético. (Kitis, 2004). A portaria da ANVISA n° 122/DNT, de 29 de novembro de 1993 inclui na portaria n° 15 de 23/08/88, sub anexo 1 , alínea l, o princípio ativo do ácido peracético (peróxido orgânico, fórmula química bruta C2H4O3), para uso nas formulações de desinfetantes/esterilizantes. 28 3.2 Ácido Peracético 3.2.1 Características Físico-Químicas O ácido Peracético, também denominado ácido peroxiacético (PAA), é o peróxido de ácido acético (AA), e é considerado um forte agente oxidante e desinfetante. PAA está comercialmente disponível na forma de uma mistura de equilíbrio quaternário, que contém AA, peróxido de hidrogênio (HP), PAA, e água, como mostrado pela equação seguinte: CH3CO2H + H2O2 CH3CO3H + H2O Onde: CH3CO2H = ácido acético CH3CO3H = ácido peracético H2O2 = peróxido de hidrogênio. Embora o HP também seja um agente antimicrobiano contribuindo para a desinfecção, o PAA é um agente antimicrobiano mais potente que o HP, sendo rapidamente ativo a baixas concentrações contra um espectro grande de microorganismos. Constatou-se que o HP requer doses muito maiores que o PAA para o mesmo nível de desinfecção (Wagner et al, 2002). O PAA combina as características de oxigênio ativo de um peróxido dentro de uma molécula de ácido acético e pertence à classe de peróxidos orgânicos que são substâncias químicas artificiais. Peróxidos orgânicos podem conter os radicais de peróxido (ligação oxigênio-oxigênio), servindo como uma fonte de oxigênio. O radical de peróxido também promove instabilidade e combustão. 29 O PAA é um líquido claro e incolor sem capacidade de espumar. Tem um forte odor de ácido acético pungente (ácido acético é o componente principal de vinagre) e tem um pH ácido menor que dois. Para uma solução contendo 5% PAA, 20% a 24% HP, e 10% a 12% de AA, a massa específica é 1,10 (Solvay Interox , 2002a). Para uma solução de 12 % de PAA, o ponto de congelamento é de - 40.3 a 42.0ºC, e a massa específica é 1,11 (Solvay Interox, 2002b). PAA é solúvel em água em todas as proporções e em solventes orgânicos polares, sendo, entretanto, ligeiramente solúvel em solventes aromáticos (Solvay Interox, 2002a). Solução de PAA é produzida da reação de ácido acético ou anidrido acético com peróxido de hidrogênio na presença de ácido sulfúrico que age como um catalisador (Block, 1991). Além disso, um estabilizador ou um agente isolado é empregado durante sua produção. PAA é consideravelmente menos estável que o HP. Uma solução de 40% de PAA perde 1% a 2% de seus ingredientes ativos por mês, enquanto o HP (para uma solução de 30% a 90%) perde menos de 1% ao ano. Soluções diluídas de PAA são ainda mais instáveis: uma solução de 1% perde metade de sua força por hidrólise em 6 dias (Block, 1991). Porém, soluções de PAA comercialmente disponíveis (10% a 15%), como usado na indústria, são muito mais estáveis quando comparados à soluções com concentrações mais altas e mais baixas. Para manter a estabilidade, o PAA pode ser armazenado de forma comum, preferivelmente em local fresco e em recipientes originais. Não é afetado por vidro e pela maioria dos plásticos. Pode extrair componentes de algumas formulações de vinil usadas como aditivos, possibilitando o ataque a borrachas naturais e sintéticas (Dychdala, 1988). Alumínio puro e o aço inoxidável são 30 resistentes ao PAA; mas aço simples, ferro galvanizado, cobre metálico e o bronze são suscetíveis à reação e corrosão (Schroder, 1984; Fraser et al, 1984). Soluções de PAA que excedem 15% começam a exibir algum grau de explosividade, instabilidade e reatividade (Block, 1991). Dessa forma, muitas aplicações industriais usam soluções de PAA entre 10% e 15% (principalmente 12%). O uso de soluções concentradas de PAA em consultório odontológico representa risco para o usuário. Isto provavelmente ocorre devido à concentração reduzida de reagentes e adição de estabilizadores com propriedades para reduzir os riscos. Os riscos de saúde associados com PAA de 12% são semelhantes aos riscos de saúde a 50% de peróxido de hidrogênio. 3.2.2 Atividade Antimicrobiana As propriedades germicidas do PAA foram primeiramente reportadas por Freer e Novy (1902). Hutchings e Xezones (1949) demostraram que o PAA é o mais ativo de 23 germicidas testados contra esporos de Bacillus thermoacidurans. Greenspan e MacKellar (1951) descobriram ser este bactericida a 0,001%, fungicida a 0,003%, e esporicida a 0,3%. O PAA também era usado como um desinfetante na produção de animais livres de germes. (REYNIERS, 1946). Até mesmo na fase de vapor, o PAA demonstrou possuir a taxa de morte mais alta a uma concentração mais baixa quando comparado com uma bateria larga de outros desinfetantes disponíveis (Baldry, 1983). A eficiência de desinfecção utilizando o PAA para microorganismos pode ser classificada de maneira geral: Bactérias > vírus > Esporos bacterianos > cistos protozoários. (Liberti e Notarnicola, 1999; Rudd e Hopkinson, 1989). 31 3.2.3 Modo de Ação Embora poucos trabalhos foram desenvolvidos para pesquisar o modo de ação de PAA como um agente antimicrobiano, sugere-se que esse funcione como outros peróxidos e agentes oxidantes. (Block, 1991). Sua atividade de desinfetante está baseada na liberação de oxigênio ativo (Liberti e Notarnicola, 1999), é provável que sulfidrilas sensíveis e enxofre unem-se em proteínas ou enzimas. Foi sugerido que o PAA interfira na função seletiva da membrana citoplásmica lipoprotéica e ocorra ruptura das paredes das células (Baldry, 1988; Leaper, 1984). Assim, pode ser que é igualmente efetivo contra a membrana de lipoproteínas, facilitando sua ação contra células de microrganismos Gram-negativos (Leaper, 1984). Sua ação na quebra de uma proteína pode ajudar a explicar suas características como um esporicida e ovicida (Block, 1991). Além disso, PAA intracelular também pode oxidar enzimas essenciais; assim os caminhos bioquímicos vitais, ativam transporte por membranas, e níveis intracelulares solúveis são prejudicados (Fraser et al, 1984). Foi demonstrado que o PAA age nas bases da molécula de DNA (Tutumi et al, 1973). Uma vantagem importante do PAA é que pode inativar a catálise de uma enzima conhecida para desintoxicar os radicais livres de hidroxilas (Block, 1991). 3.1.4 Subprodutos Os produtos de decomposição de PAA são ácido acético, peróxido de hidrogênio, oxigênio, e água (Gehr et al, 2002; Wagner et al, 2002). Existem três 32 reações nas quais PAA é consumido em uma solução aquosa: decomposição espontânea, hidrólise e decomposição transição-metal-catalisada (Gehr et al, 2002). O pH varia de 5,5 a 8,2 e resulta principalmente em decomposição espontânea para ácido acético e oxigênio. Tem sido mostrado que PAA não produz subprodutos tóxicos ou mutagênicos depois de reação com material orgânico (Monarca et al, 2002). Ácidos carboxílicos são formados pela oxidação de matéria orgânica natural na água por PAA. Nenhuma desinfecção de subproduto contendo halogênio (DBPs) foi observada para água PAA tratada. Desinfetantes à base de cloro resultam na formação de subprodutos tóxicos e mutagênicos halogenados (clorados e/ou bromados) depois da reação de cloro com o material orgânico. Embora PAA na decomposição forme produtos inofensivos e, pouco ou nenhum subproduto que seja tóxico ou mutagênico, a possibilidade que possa formar DBPs não pode ser completamente ignorada (Crathorne et al, 1991). Foi demonstrado que PAA não pôde oxidar cloreto a ácido hipocloroso. Então, foi proposto que a transformação de fenol para clorofenol ocorra através da geração de radicais halógenos livres (de cloreto, se presente em quantidades altas como acontece na água do mar). A eletroquímica do PAA é suficiente para oxidar o brometo a ácido hipobromoso, subseqüentemente formando orgânicos bromados (Booth e Lester, 1995). Embora poucos estudos sugerem a formação de alguns DBPs (com alguma toxidade) a partir do PAA, a quantidade e espectro destes DBPs são muito menores que aqueles formados por cloro ou ozônio. Além disso, outros oxidantes, tais como cloro ou ozônio, também formam os radicais halógenos livres do cloreto de fundo ou íons de brometo. 33 O PAA, sendo produto final da reação do peróxido de hidrogênio com o ácido acético, é considerado a forma mais eficaz de esterilização utilizando uma baixa concentração ativa contra um amplo espectro de microrganismos. Foi observada ainda ausência de toxicidade ou resíduos persistentes, potencial mutagênico, pequena dependência do pH no espectro de atuação, exigência de tempo de contato curto e eficiência para efluentes (Pelkzar et al, 1998). Uma correta anti-sepsia pré-cirúrgica ou pré-tratamento é altamente satisfatório, caracterizando uma medida muita eficiente no controle da infecção cruzada no consultório odontológico. Na anti-sepsia podem ser utilizados: solução de clorexidina (de 0,12 a 0,2 %), compostos de iodo (povidona- Iodine, PVP-I, de 1 a 1,5 %) e água oxigenada a 10 volumes (Jorge, 2001). Nos biocidas químicos está a chave da preservação dos produtos tão diversos quanto alimentos e bebidas, cosméticos e formulações farmacêuticas. Os biocidas são ainda utilizados em larga escala de aplicações industriais, ambientais e centros hospitalares, sendo que muitos foram incorporados ao uso comum com um histórico longo de experimentação. Os estudos sistemáticos de mecanismos de ação auxiliam em novos projetos e desenvolvimentos futuros, propiciando conhecimento para ampliação de novos agentes que minimizam os mecanismos da resistência e os problemas toxicológicos (Denyer e Stewart, 1995). 34 4 MATERIAIS E MÉTODOS O desenvolvimento da pesquisa foi efetuado em duas etapas: a primeira etapa foi desenvolvida em laboratório buscando verificar qual das concentrações testadas o ácido peracético apresenta maior poder inibitório; qual o dano corrosivo causado pelo produto nos materiais odontológicos e a possível citotoxicidade e mutagenicidade provocada por uma ação residual. Esses resultados serviram como base para a realização da segunda etapa dos testes do ácido peracético nos consultórios odontológicos. 4.1 Etapa Laboratorial Foram utilizados nesta etapa os seguintes procedimentos e métodos: teste de difusão em ágar, teste de concentração inibitória mínima, teste de concentração bactericída mínima, estudo de eletroquímica, estudo de possível mutagenicidade causada pelo produto (Teste Cometa), estudo de possível citotoxicidade causada pelo produto (Citotoxicidade mitocondrial _ensaio com o sal de tetrazolium-MTT): 4.1.1 Microrganismos Utilizados Foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Mycobacterium smegatis ATCC 700044, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 e 35 Candida albicans sp ATCC 10231. Os mesmos foram adquiridos junto a fundação André Toselo. pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC). 4.1.2 Disponibilização do Biocida O biocida (àcido peracético) foi disponibilizado pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC). O mesmo foi fornecido na forma de pó gerador e pó neutralizador. 4.1.3 Teste de Difusão em Agar Para o teste de difusão em ágar modificado, as placas de Petri continham na sua parte interna dois discos de papel filtro, com o objetivo de absorver a umidade proveniente da atividade microbiológica tendo em vista a impossibilidade de virar a placa, quando utilizado o método dos poços. 4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura Em função do número de amostras, foram preparados os meios de cultura Ágar Plate Count para as bactérias e, para as leveduras, Ágar Sabouraud com o objetivo de crescimento dos microrganismos. 36 4.1.5 Inoculação dos Microorganismos A inoculação foi realizada utilizando a concentração equivalente à turvação 0,5 da escala Mac-Farland (Pelkzar et al, 1998), ajustou-se através das diluições seriadas, para uma concentração inicial de 106 colônias por mL, apanhouse um “swab” e mergulhou-se no tubo com as bactérias, impregnou-se bem o algodão, fazendo a haste girar nos dois sentidos. Retirou-se o excesso, pressionando o “swab“ levemente contra o frasco e então se inoculou por toda a placa cobrindo a superfície da mesma de maneira uniforme girando a placa 45 graus toda vez que chegou-se ao final da mesma. Repetiu-se o procedimento por três vezes. 4.1.6 Preparação da Solução Teste Na preparação do biocida ácido peracético utilizou-se um pó gerador e um pó neutralizador diluídos em água destilada, conforme descritos na Tabela 1, para se atingir as concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. Primeiramente mediu-se a água destilada, na qual foi adicionado o pó gerador e com um bastão de vidro agitou-se por cinco minutos, após essa diluição a solução apresentou-se de cor rosa; posteriormente se adicionou o pó neutralizador e novamente se agitou com o bastão de vidro até sua completa diluição, completando a reação formadora do ácido peracético, que tornou-se incolor. 37 Tabela 1: Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do ácido peracético Concentração da solução. Pó gerador em gramas. Pó neutralizador em gramas. 800 ppm 0,17g 0,095g 40 ml 1500 ppm 0,425g 0,2075g 50 ml 2500 ppm 0,52 O,3048 40 ml Fonte: Medidas fornecidas pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda de Joinvile, S/C. 4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima Para análise da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram utilizados 10 tubos contendo 10 mL de BHI (Pelkzar et al, 1998). No trabalho foi utilizado inicialmente 5,77 mL do princípio ativo. Para os tubos subseqüentes essa quantidade foi dividida por raiz de três (10 mL divididos por raiz de três), conforme pode ser observada na Tabela 2, a quantidade do princípio ativo utilizado para cada tubo. O tubo 10 não contém o princípio ativo e serve como um controle de crescimento. Os meios, após serem inoculados com os microrganismos, foram incubados a 35°C durante 24 horas. No final deste período os meios foram examinados visualmente para comprovar a presença de turvação. A turvação indica que houve crescimento dos microrganismos, e o primeiro tubo a não turvar indica a concentração inibitória mínima. 38 Tabela 2: Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo. Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Quantidade em (mL) 5,77 3,33 1,92 1,11 0,644 0,370 0,213 0,123 0,071 Branco 4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima A concentração bactericida mínima (CBM), em comparação com a CIM, é a menor concentração em µg/mL, que mata o microrganismo em estudo (Pelkzar et al, 1998). A solução (meio de crescimento + PAA) após 24h deve ser semeada em placas (uma placa correspondente a cada tubo). Após as placas devem permanecer por 24 horas em estufa a 35°C. Depois desse tempo deve ser observado o crescimento ou não das colônias, sendo que, caso ocorra crescimento, conta-se as colônias com um contador de colônias. A placa onde não crescem nenhuma colônia é a correspondente à concentração bactericida mínima. 4.1.9 Estudo de Eletroquímica 4.1.9.1 Condição Experimental Corpos de prova foram confeccionados a partir de aço inox de instrumentos odontológicos. Os mesmos foram cortados, embutidos em baquelite e polidos mecanicamente até grau metalográfico. Ensaios acelerados de corrosão eletroquímica empregando as técnicas de Ecorr vs. Tempo e Potenciodinâmico foram 39 conduzidos num Potenciostato&Galvanostato EGG&Par 283 em soluções recém preparadas. Estas técnicas permitem avaliar eventuais danos corrosivos causados pelo ácido peracético nas concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. As medidas foram efetuadas numa célula a três eletrodos típica, conforme ilustrado na Figura 1. O perfil potenciodinâmico de um eletrodo de área geométrica 0,198 cm2, foi registrado a uma velocidade de variação de potencial de 1,0 mV.s-1, iniciando num potencial Ei de -0,5V vs OC (open circuit) até um potencial final Ef de 1,6V. O programa usado para adquirir e tratar os dados foi o 352 Softcorr lll Corrosin Measurement software for windows versão 3.05 elaborado pela empresa EG & G Instruments Inc. Figura 1: Arranjo experimental para o teste de corrosão 40 4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa Entre os efeitos residuais que sanitizantes podem causar estão a genotoxicidade e conseqüentemente a mutagênese celular. Foram avaliados os possíveis danos ao DNA impostos pelo produto em sangue total, em função das concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm de ácido peracético. O estudo de genotoxicidade celular foi realizado através do teste Cometa, que é um teste com a finalidade de detectar possíveis danos ao DNA. O Teste Cometa ou SCGE (Single Cell Gel Assay), tem sido cada vez mais utilizado, pois permite a avaliação de danos causados no DNA. O reparo do mesmo e o potencial genotóxico de substâncias variadas pode ser avaliado pelo teste Cometa. (Guecheva, Henriques e Erdtmann, 2001). Pode-se realizar o teste em qualquer organismo vivo ou tipo celular, apresentando algumas vantagens quando comparado a outros testes para detecção de substâncias que promovem dano ao DNA. Porém, não é utilizado para detectar mutação, mas sim lesões genômicas que, após serem processadas podem resultar nesta. Este método pode ser realizado em tempo que varia de horas a dias, além de poder ser aplicado a qualquer célula de organismo vivo, tornando-o um excelente método para avaliações ambientais, de fármacos e produtos químicos (Silva et al, 2000). Também pode ser avaliado o número de células que tiveram ou não o seu DNA afetado e este valor, chamado de “freqüência de dano ao DNA”, é expresso como porcentagem de células que tiveram algum dano mensurável ao seu código genético. O teste Cometa em pH alcalino está representado na Figura 2. Para realização do teste foram coletados 5 mL de sangue de 06 doadores: Após a coleta, 41 o sangue foi colocado em ependorf com 40 µl de eparina. Posteriormente se preparou as soluções de ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e 2500 ppm; Para cada amostra foram colocados em outro ependorf 100 µl de sangue com 10 µl de solução de ácido peracético pelo período de 20 minutos. As células foram colhidas e dissolvidas em agarose low-melting point (0,75%) e então plaqueadas sobre uma lâmina de microscopia com pré-cobertura de agarose (1,5%). As lâminas foram feitas em duplicata para cada tratamento. As células foram lisadas com uma solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10% DMSO pH 10) por no mínimo duas horas. Após a lise celular, as lâminas foram colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal contendo uma solução tampão (300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 13,00-13,50 a 4°C) que permite o desenrolamento do DNA. Então, as laminas foram incubadas por 20 minutos nessa solução alcalina feito na hora do uso. Uma corrente elétrica de 300 mA e 25 V foi aplicada por 15 minutos a 4 °C. As lâminas foram então neutralizadas com 0.4 M Tris, pH 7.5. Após estarem secas, as lâminas foram fixadas por uma solução contendo ácido tricloroacético 15%, sulfato de zinco 5% e glicerol 5% e então coradas com solução de coloração contendo carbonato de sódio 5% mais nitrato de amônio 0,1%, nitrato de prata 0,1%, ácido tungstosilicico 0,25% e formaldeído 0,15%. A reação foi parada com acido acético 1% (Hartmann e Speit, 1997). 42 Figura 2: Descrição simplificada do teste cometa. Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada. Foram analisados, num total de 100 células para cada grupo teste, 50 por lâmina, em microscópio óptico NIKON®, com aumento de 400x, onde se observaram os núcleos contendo DNA intacto, que se apresentam redondos. Nas células lesadas observa-se migração de DNA para fora do núcleo, apresentando forma similar a um “cometa”, de onde se origina a nomenclatura do teste (Figura 3). As células são classificadas visualmente em cinco classes, de acordo com o tamanho da cauda, sem danos (classe 0), até danos máximos (classe 4). Assim, o índice de danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0; 100 células observadas completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 células observadas com dano máximo) (Erdtmann e Henriques, 2003). 43 Figura 3: Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3; (c) dano classe 4. Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada. 4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético 4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT) Em placa de 96 poços, foi adicionado 1 X 106 macrófagos, que foram expostos às três diferentes concentrações de Ácido peracético (800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm). Após a adição das células, a placa foi centrifugada por 10 min a 1.500 RPM. Retirou-se com cuidado de 90-95% do meio e desprezadas as células aderidas, sendo descartado o sobrenadante. Após este procedimento, foram adicionados 100 µl de meio RPMI em todos os poços, e 100 µl de Ácido peracético nas concentrações acima citadas. Adicionou-se 10 µl de MTT (10% do volume, isto é, 10 µl de MTT para cada 100 µl de meio em todos os poços) e misturou-se com muito cuidado. Incubouse por 3 horas em estufa a 37° (com CO2), esperando a precipitação das células que ficam caracterizadas pela opacidade do fundo do poço. Centrifugou-se por 10 min a 1.500 rpm, retirou-se o sobrenadante que foi desprezado. Posteriormente adicionou-se o mesmo volume de álcool isopropílico; a 44 seguir agitou-se vigorosamente com uma pipeta poço por poço para o MTT se dissolver no álcool; posteriormente centrifugou-se por 5 min a 2000 rpm, retirou-se o sobrenadante e transferiu-se para outra placa e procedeu-se a leitura. A leitura foi realizada a 540 nm em leitor de placa ELISA automático. 4.1 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos Foram avaliados materiais e equipamentos contaminados de dois consultórios odontológicos, sendo um público e o outro privado. As soluções de ácido peracético foram preparadas para formar 1000 mL de solução na concentração de 2500 ppm. Foram utilizados “saches” previamente pesado pela FGM e misturados a um litro de água, adicionando primeiramente o pó gerador e após o pó neutralizador. O preparo da solução foi conduzido por diferentes pessoas (dentistas e auxiliares), após breve explanação sobre as recomendações do fabricante para a utilização do produto. A preparação da solução ocorreu antes da primeira esterilização do dia e as coletas foram realizadas após o primeiro, terceiro e sexto atendimento, independentemente do procedimento clínico a ser realizado. A coleta foi realizada da seguinte forma: Utilizaram-se quatro tubos de ensaio, onde três continham 5 mL de solução salina e um 5 mL de BHI, devidamente esterilizados. Após o atendimento odontológico o material utilizado foi lavado de maneira convencional com água e sabão e seco em toalhas de tecido. Posteriormente com um swab estéril friccionou-se por trinta segundos o material. Após, este swab era imerso no meio (salina ou BHI) e vedado. Findo o sexto atendimento, os tubos foram levados ao laboratório, onde foram incubados na estufa 45 a 35 graus Celsius por 24 horas. Das amostras com solução salina foram retirados 100 microlitros e semeados em uma placa contendo plate count agar utilizando uma alça de Drigalski. Para comprovar a contaminação do material utilizado nos consultórios odontológicos, procedeu-se da seguinte forma. Os materiais foram totalmente submersos em uma solução de ácido peracético na concentração de 2500 ppm por vinte minutos. Decorrido este tempo, com uma pinça estéril o material foi removido da solução e secado com gase estéril. O procedimento de coleta e condução laboratorial das amostras foi semelhante aos descritos antes da esterilização. Após 24 hs foi feita a contagem nas placas. As datas das coletas estão na Tabela 1. Vale destacar que os instrumentais utilizados nos testes foram submetidos ao procedimento habitual de esterilização do consultório após a coleta prevista no experimento. 4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública) A unidade de saúde 24 hs Próspera está localizada no bairro Próspera onde se localiza o CEO ( Centro de Especialidades Odontológicas) que conta com o apoio de serviços odontológicos clínicos gerais com um consultório, dois cirurgiões dentistas e um assistente de consultório dentário, realizando atendimento clínico de três horas, no período matutino (08:00h às 11:00h) e vespertino (13:00h às 16:00h). Nesta unidade são realizados atendimentos clínicos de ordem geral (exames para diagnóstico, tartarectomias, restaurações, extrações, drenagem de abscessos e 46 atividades preventivas (profilaxias, aplicações tópicas de flúor e orientações quanto à higiene oral). 4.2.2 Consultório Privado O consultório odontológico que foi avaliado está localizado na rua Coronel Pedro Benedet, nº 225, sala 306, Ed. Galeria Becker, Criciúma-Centro; o referido consultório pertence à Cirurgiã Dentista Ana Paula Maciel que concordou com o experimento. Nesse consultório são realizados os procedimentos de rotina de um cirurgião dentista com destaque para os procedimentos cirúrgicos de endodontia (tratamento de canal), pois a mesma é especialista nesta área de atuação odontológica. O atendimento clínico é realizado no período das 14hs às 20hs de segunda a sexta-feira; atuam nesse consultório um cirurgião dentista e uma auxiliar de consultório dentário. 47 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos no desenvolvimento deste trabalho. 5.1 Teste de Difusão em Ágar Nos testes laboratoriais os resultados obtidos nos testes de difusão em ágar são apresentados na Tabela 3. Os resultados representam as médias aritméticas. Tabela 3: Teste de difusão em Agar TESTE DIFUSÃO EM ÀGAR Primeira Amostra Segunda Amostra Bactérias 800 S.a 22,5mm E.c 11 mm 14mm 14,5mm 12,5mm T.m 14,5mm 17mm 21mm S.c 8,5mm 14mm 20mm B.s 10mm P.a 6mm M.s 12,5mm C.a 22,5mm Amostra 800 1500 2500 800 1500 2500 25mm 25,5mm 30mm 20mm 20mm 22mm 13,5mm 18mm 11,5mm 14,5mm 22mm 12mm 17mm 17,5mm 13mm 15mm 18,5mm 12,5mm 15,5mm 21mm 11,5mm 14mm 19mm 14mm 21,5mm 9,5mm 13mm 24,5mm 8mm 13,5 17mm 10mm 14,5mm 6,5mm 11,5mm 14mm 7,5mm 11,5mm 15mm 20,5mm 13mm 15mm 19mm 19,5mm 22,5mm 30mm 23mm 22mm 23mm 1500 2 500 Terceira 25,5mm 32,5mm 16,5mm 24mm 25mm 23mm 14,5mm 14,5mm 48 Conforme pode ser visualizado na Tabela 3 e na Figura 4, os halos inibitórios mantiveram para todos os microrganismos, uma escala crescente de acordo com o aumento na concentração do agente antimicrobiano. Observa-se que para o microrganismo, Pseudomonas aeruginosa, mesmo na concentração de 2500 ppm, o halo de inibição médio foi menor entre todos os microrganismos testados. Já para o Staphylococcus aureus o teste apresentou o maior halo de inibição. Essa diferença possivelmente seja decorrente das diferenças fisiológicas dos microrganismos. O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva enquanto a Pseudomonas aeruginosa, é uma bactéria gram negativa que possui uma camada adicional de proteína em sua membrana celular, dificultando a ação do ácido peracético, tornando o microrganismo menos susceptível. Podemos observar que para todos os microrganismos testados o ácido peracético apresentou ação bactericida, sendo mais eficiente na concentração de 2500 ppm. A figura 4 apresenta os valores dos halos de inibição ao crescimento bacteriano frente a três concentrações diferentes do ácido peracético (Teste de difusão em ágar). 49 800ppm 1500ppm 2500ppm 30 Halo de inibição em mm 25 20 15 10 5 0 Sa Ec Tm Sc Bs Pa Ms Ca C o n c e n tra ç ã o à c id o p e ra c é tic o Figura 4: Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão em Agar. As figuras 5 e 6 exemplificam a diferença visual e significativa da inibição do crescimento existente entre duas concentrações do ácido peracético frente a mesma espécie de microrganismo (Staphylococcus aureus). Figura 5: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido peracéticonas concentrações 800ppm. 50 Figura 6: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido peracético nas concentrações 2500 ppm. Os dados analisados apresentam significância estatística entre as concentrações à nível de significância de 5%- ANOVA. 5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima Conforme pode ser visualizado na Figura 7, a Concentração Inibitória Mínima ocorre no tubo No 01, que se apresenta límpido. Nos demais tubos observam-se que ocorreu turvação indicando o crescimento dos microrganismos. 51 Figura 7: Teste da concentração inibitória mínima da solução Peracet à 1500 ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis . Na Tabela 4 apresentam-se os resultados referentes à concentração Inibitória mínima. Tabela 4: Respostas de crescimento dos microrganismos em diferentes concentrações de àcido peracético S.a (Gram +) E.c (Gram -) T.m (levedura) S.c (Gram -) B.s (Gram +) P.a (Gram -) M.s (levedura) C.a (levedura 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 800 1500 2500 10 -1 ^ 10 -2 ^ 10 -3 ^ 10 -4 ^ 10 -5 ^ 10 -6 ^ 10 -7 ^ 10 -8 ^ 10 -9 ^ 10 -10 N N N S S N N N N S N N N N N S N N N N N S S N N N N S S N N N N S S N N N N S S N N N N S S N S S N S S N S N N S S N S S N S S N N N N S S N S S N S S N S N N S S N S S N S S N N N N S S N S S N S S N S S N S S S S S S S S S S S N S S N S S N S S N S S N S S S S S S S S S S S N N S N S S N S S S S S N S S S S S S S S S S S N N S N S S N S S S S S N S S S S S S S S S S S N N S N S S S S S S S S N S S S S S S S S S S S N N S N S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S Legenda: N – Não turvou e não cresceu S – Turvou e cresceu ^ 52 As concentrações indicadas na Tabela 4 não correspondem às concentrações finais obtidas após a diluição. Estas são apresentadas na Tabela 5. Observa-se que para concentração inicial de 2500 ppm nenhuma espécie de bactéria sobreviveu, indicando que esta concentração nos garante o efeito bactericida. Conforme pode ser observado na Tabela 5 a concentração inicial que correspondia a 2500 ppm após a diluição corresponde a 897,5 ppm. Isso é um indicativo de que o PAA 800 ppm será eficiente como bactericida para todos os microrganismos testados. Salienta-se que a concentração inicial que era 800 ppm após a diluição passou para 287 ppm. Esta concentração mostrou-se ineficiente para três dos microrganismos que foram testados. Tabela 5: Concentração do princípio ativo após diluição seriada. Concentração Diluição Concentração VL (ml) Relação 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm -1 5,77 0,359 287 538,5 897,5 -2 3,33 0,249 200 373,5 622,5 -3 1,92 0,161 128,8 241,5 402,5 -4 1,11 0,099 79,2 148,5 247,5 -5 0,644 6,05 x 10 48,4 90,7 151,2 -6 0,370 3,567 x 10 28,5 53,5 89,17 -7 0,213 2,08 x 10 16,64 31,2 52,0 -8 0,123 1,215 x 10 -2 9,72 18,22 30,4 -9 0,071 7,049 x 10 -3 05,63 10,573 17,6 0 0 0 0 10 10 10 10 10 10 10 10 10 -10 10 Concentração branco -2 -2 -2 5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima Observando os resultados apresentados na Tabela 6 percebe-se que, para Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e a Salmonella choleraesuis ATCC 53 14028, nas concentrações de 800 ppm e 1500 ppm quando semeados os mesmos ainda desenvolveram colônias. Tabela 6: Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima 5,77µl 3,33µl 1,92µl 1,11µl 0,644µl 0,370µl 0,213µl 0,123µl 0,071µl Branco 800 A A C C C C C C C C S.a 1500 A A C C C C C C C C 2500 A A A A A A A A C C 800 A A A A C C C C C C 1500 A C C C C C C C C C 2500 A A A A A A C C C C 800 A A C C C C C C C C T.m 1500 A A A A A A C C C C 2500 A A A A A A A A A C 800 C C C C C C C C C C 1500 C C C C C C C C C C 2500 A A A A C C C C C C 800 A A A C C C C C C C 1500 A A A A C C C C C C 2500 A A A A C C C C C C 800 C C C C C C C C C C P.a 1500 C C C C C C C C C C 2500 A A A A C C C C C C 800 A A A A C C C C C C M.s 1500 A A A C C C C C C C 2500 A A A A A A A A C C 800 C C C C C C C C C C C.a 1500 A A A A A C C C C C 2500 A A A A A A A C C C E.c S.c B.s 54 Os resultados obtidos no teste da concentração bactericida mínimo, em concordância com os resultados obtidos no teste de concentração inibitória mínima, levam a concluir que as concentrações menores (800 e 1500 ppm) possibilitaram o crescimento de alguns dos microrganismos testados. Em função destes resultados a concentração de 2500 ppm tornou-se a mais indicada para os testes nos consultórios odontológicos. 5.4 Ensaios de Corrosão Um aspecto importante que deve ser levado em consideração na esterilização química é a degradação corrosiva dos equipamentos, decorrente do emprego de agentes físicos e/ou químicos. Diversos produtos, embora eficientes no aspecto microbiológico, apresentam forte ação corrosiva, inviabilizando seu emprego. O ácido peracético, um agente oxidante in-natura apresenta características corrosivas, como esperado. No sentido de minimizar este efeito foi adicionado um agente neutralizante. Antes de cada ensaio potenciodinâmico, registrou-se o potencial de circuito aberto (OC) durante 30 minutos, a fim de estabilizar a interface substrato // meio. As curvas de Ecorr vs. Tempo não são apresentadas. A Tabela 7 sumariza os principais resultados obtidos a partir dos perfis potenciodinâmicos de substratos de aço inox de instrumentos odontológicos, cobre e platina, registrada em diferentes concentrações de ácido peracético pode ser visualizada os principais resultados do ensaio potenciodinâmico. Verifica-se que a taxa de corrosão do aço inox, calculada a partir das inclinações de Tafel, cresce com o aumento da concentração de ácido peracético. Entretanto, os valores são muito baixos, isto é, 21,58 x 10-6 cm.ano-1, XX 55 e YY, para as concentrações de 800, 1500 e 2500 ppm, respectivamente. Estes valores representam taxas muito baixa, indicando que o produto pode ser usado com segurança, no que tange a resistência à corrosão. Tabela 7: Taxa de corrosão em cm.ano-1 em eletrodos de aço inox nas concentrações de Peracet de 800,1500 e 2500 ppm/mL. Concentração (ppm) Eletrodos Aço Inox Cobre Platina Parâmetro 800 1500 2500 ICORR (nA) 22,27 180,5 256,70 ECORR (mV) -99,70 -113,5 -196,70 TxCORR (cm/ano) 21,58 x 10 183,24 x 10 248,82 x 10 ICORR (µA) 88,4 52,15 46,95 ECORR (mV) -128,13 -18,22 -108,4 ICORR (µA) 10,98 12,16 15,42 ECORR (mV) -51,9 123,32 -195,7 -6 -6 -6 A Figura 8 corresponde à sobreposição dos perfis potenciodinâmicos para corpos de prova de aço inox em ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e 2500 ppm, registrados a uma velocidade de varredura de 1 mV.s-1. Observa-se que abaixo de Ecorr todos os perfis são similares, com diminuição gradual na densidade de corrente, a medida que o potencial varia da região catódica para anódica. Entretanto, o Ecorr torna-se mais negativo, a medida que a concentração do ácido peracético aumenta em ocorre uma taxa de corrosão muito baixa com os eletrodos em estudo (aço inox). Acima de Ecorr, não se verifica tendência a passivação, em toda a faixa de potencial investigada. Adicionalmente, as densidades de corrente são progressivamente superiores em função do aumento de concentração, o que está de acordo com as taxas de corrosão calculadas. 56 2 0 0 0 8 0 0 p p m 1 5 0 0 p p m 2 5 0 0 p p m 1 5 0 0 E (m V ) 1 0 0 0 5 0 0 0 -5 0 0 -1 0 0 0 -1 4 -1 2 -1 0 -8 -6 -4 -2 lo g ( I) ( lo g ( A ) ) Figura 8: Perfis potenciodinâmicos do aço inox em ácido peracético. O produto, portanto, pode ser utilizado com segurança para assepsia de instrumentos fabricados com material similar ao testado, sem ocasionar dano corrosivo considerável. 5.5 Teste de Genotoxicidade Na Figura 9 são apresentados os resultados de 06 amostras em duplicata do teste Cometa, onde estão representados os possíveis danos ao DNA em comparação aos controles positivo e negativos. Nessa figura observa-se a média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos. ìndice de dano ao DNA ìndice de dano ao DNA 57 120 120 ** 67,667 67,667 100 100 80 80 60 60 40 40 **** 78,667 78,667 85,167 85,167 50,000 50,000 32,667 32,667 20 20 0 0 Controle Controle 800ppm 800ppm 1500ppm 2500ppm 1500ppm 2500ppm Tratamento Tratamento H2O2 H2O2 Figura 9: Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH 7,0), sendo *p<0,05 e **p<0,001. Na concentração de 800 ppm o índice de dano foi de 50,00±16,50; na concentração de 1500ppm foi de 67,667±29,12; na concentração de 2500 ppm o índice de dano ao DNA foi de 78,667±25,74; e na incubação com Peróxido de Hidrogênio (H2O2) o índice observado foi de 85,167±15,38. É importante salientar que a incubação com H2O2, é realizado para verificar a funcionalidade do teste, onde se utiliza 150 µM de H2O2 para indução do dano ao DNA. A diferença estatística é notada na concentração de 1500 ppm com p<0,05 e na concentração de 2500 ppm com p<0, 01, tendo como referência para comparação o controle negativo contendo Tampão PBS pH 7,0. O índice de dano ao DNA varia de 0 (0, classificação de dano ao DNA) x 100 (Referente ao número de células observadas) a 400 (100 (quantidade de células observadas) x 4(Dano ao DNA). 58 5.6 Freqüência de Dano ao DNA A figura 10 representa a média da freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos. Na concentração de 800ppm foi observado uma freqüência de 37,167±13,14; na concentração de 1500ppm a freqüência observada foi de 44,167±11,65; na concentração de 2500ppm 51,667±11,98 foi a freqüência observada e 55,167±7,22; foi freqüência observada para o tratamento com 150 µM de H2O2. A diferença estatística é notada na concentração de 2500ppm com p<0, 05, tendo como referência para comparação o controle negativo contendo Tampão PBS pH 7,0. É importante salientar que a freqüência de dano ao DNA é observada pela soma de células danificadas no teste cometa. Esta descrição varia de 0 a 100, 0 é dado quando todas as células observadas não apresentam dano ao DNA e 100 é o número dado quando todas as células observadas pelo teste cometa são lesadas, independente se o índice de dano é classificado de 1, 2, 3 ou 4. % de dano ao DNA % de dano ao DNA 59 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 ** 37,167 37,167 44,167 44,167 51,667 51,667 55,167 55,167 2500ppm 2500ppm H2O2 H2O2 29,333 29,333 Controle Controle 800ppm 800ppm 1500ppm 1500ppm Tratamento Tratamento Figura 10: Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH). Observa-se na figura 11 que o ácido peracético em contato direto com as células pode causar danos no DNA; salientamos que como esterilizante químico não entra em contato direto como as células dos tecidos. Em concentração menor 800 ppm/mL o seu efeito é menor do que na concentração de 2500 ppm/mL. Salienta-se que possíveis resíduos que entrarem em contato com o tecido após o enxágüe do material estarão diluídos diminuindo consideravelmente seu efeito de dano ao DNA. Além disso, o produto sofre rápida degradação gerando H2O2 e ácido acético. Portanto, a possibilidade do produto entrar em contato com as células da cavidade bucal são muito baixas. ìndice de dano ao DNA ìndice de dano ao DNA 60 120 120 ** 67,667 67,667 100 100 80 80 60 60 40 40 **** 78,667 78,667 85,167 85,167 50,000 50,000 32,667 32,667 20 20 0 0 Controle Controle 800ppm 800ppm 1500ppm 2500ppm 1500ppm 2500ppm Tratamento Tratamento H2O2 H2O2 Figura 11: Índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800, 1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água) e controle positivo (próxido de hidrogênio). 5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético O teste de citotoxicidade foi realizado com intuito de aproximar os resultados às condições operacionais na esterilização de material odontológico utilizando o ácido peracético. A principal diferença quando comparado ao teste de genotoxicidade está no fato do material nuclear estar protegido pela membrana celular. Na Tabela 8 são apresentados o número de células viáveis após a exposição ao ácido peracético nas diferentes concentrações e contagem realizada em leitor de ELISA automático. A absorbância do controle positivo foi de 0,589. 61 Tabela 8: Absorbância do número de células viáveis após exposição ao ácido peracético. Concentração 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm Leitura 1 0,624 0,526 0,420 Leitura 2 0,497 0,469 0,403 Leitura 3 0,607 0,445 0,411 Leitura 4 0,444 0,400 0,340 Média 0,543 0,460 0,3935 Variança 0,00752 0,00275 0,00132 A análise estatística do teste T com nível de significância de 0,5% obtevese os valores t= -1,63734 e p= 0,15267. A conclusão é que a comparação entre as concentrações de 800 ppm e 1500 ppm não apresentam diferença significativa. O teste T entre as concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm apresenta t= 2,08364 e p= 0,08232. A conclusão é que para um nível de significância de 0,5% não apresenta diferença significativa. A análise ANOVA por uma via apresenta os valores de f= 5,80421 e p= 0,02404. A um nível de significância de 0,5% os resultados mostram diferença significativa. Para uma melhor visualização apresenta-se na figura 12 os dados obtidos. 62 C2500 C1500 C800 0,7 Absorbância de células viáveis 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 C oncentração de Ácido Peracético Figura 12: Representação gráfica da absorbância de células viáveis frente a diferentes concentrações. A comparação de redução celular na concentração de 800 ppm pra o controle positivo foi de 7,8%. Quando comparado à concentração de 1500 ppm a redução foi de 21,9%. A concentração de 2500 ppm apresentou uma redução de 33,28%. Dados da literatura apontam que uma redução de até 10% não é considerada citotóxico. Acima deste valor passa a ser significativo. 5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Odontológicos 5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração de 2500 ppm em Material Odontológico Contaminado Os testes de verificação da eficácia de esterilização do ácido peracético foram realizados na concentração de 2500 ppm, pois nesta concentração os resultados na etapa laboratorial mostraram-se mais eficientes. 63 Na Tabela 9 são transcritos o número de colônias de microrganismos das 72 amostras em solução salina antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm; a semeadura foi realizada em PCA. Observa-se ainda, que após o atendimento odontológico o material utilizado se apresenta contaminado e que a imersão deste material em solução de ácido peracético na concentração de 2500 ppm por 20 minutos promoveu sua completa esterilização em todas as coletas efetuadas, comprovando sua eficácia na esterilização desses materiais. Pode ser observado, ainda, que em uma coleta o material antes da esterilização não apresentou microrganismos, sendo desconhecido o fator que causou tal resultado. Possivelmente a lavagem prévia do material tenha sido efetuada de maneira eficiente, retirando o biofilme formado e demais sujidades, deixando o material com alto nível de limpeza. 64 Tabela 9: Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório público. Coleta 1 Nº Nº colônias colônias antes depois Amostra1 10 Amostra 2 Amostra 3 09/05/06 Coleta 2 Nº Nº colônias colônias antes depois 00 07 03 00 06 00 09/05/06 Coleta 3 Nº Nº colônias colônias antes depois 00 06 00 02 00 05 00 05 00 07 00 09/05/06 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 12/05/06 12/05/06 12/05/06 Amostra1 03 00 10 00 22 00 Amostra2 05 00 07 00 07 00 Amostra3 00 00 15 00 12 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 16/05/06 16/05/06 16/05/06 Amostra1 02 00 02 00 00 00 Amostra2 01 00 05 00 01 00 Amostra3 00 00 10 00 03 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 18/05/06 18/05/06 18/05/06 Amostra1 02 00 17 00 07 00 Amostra2 05 00 13 00 05 00 Amostra3 00 00 08 00 11 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 22/05/06 22/05/06 22/05/06 Amostra1 10 00 10 00 02 00 Amostra2 18 00 00 00 01 00 Amostra3 15 00 05 00 05 00 14 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 25/05/06 25/05/06 25/05/06 Amostra1 33 00 25 00 Continua => 65 Continuação Amostra2 17 00 10 00 12 00 Amostra3 11 00 15 00 07 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 31/05/06 31/05/06 31/05/06 Amostra1 23 00 09 00 14 00 Amostra2 40 00 00 00 21 00 Amostra3 18 00 12 00 06 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 02/06/06 02/06/06 02/06/06 Amostra1 00 00 03 00 12 00 Amostra2 00 00 15 00 17 00 Amostra3 00 00 09 00 07 00 Na Tabela 10 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm em material odontológico contaminado na unidade de saúde 24 hs PrósperaCriciúma S/C. 66 Tabela 10: Resultados do crescimento microbiano das amostras em BHI. Coleta 1 Turvou 09/05/06 Antes Não Coleta 2 turvou 09/05/06 x Depois Antes x Turvou Não Coleta 3 turvou 09/05/06 x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 12/05/06 12/05/06 12/05/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 16/05/06 16/05/06 16/05/06 Antes x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 18/05/06 18/05/06 18/05/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 22/05/06 22/05/06 22/05/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 25/05/06 25/05/06 25/05/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 31/05/06 31/05/06 31/05/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 02/06/06 02/06/06 02/06/06 Depois x Antes x Depois x Antes x x x x x x x x x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Depois Não turvou Depois Coleta 1 Antes Turvou x x x 67 Na Tabela 10 observa-se claramente que o material, antes da exposição ao ácido peracético na concentração de 2500 ppm, estava contaminado. Os dados contidos na tabela 10 ratificam os resultados apresentados na tabela 09 mostrando a eficácia da esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm nas amostras coletadas em BHI, onde se verifica a ausência total de crescimento bacteriano após a esterilização do material. Na Tabela 11 observa-se a ação bactericida do ácido peracético na concentração de 2500 ppm no consultório odontológico localizado na rua Coronel Pedro Bennedet 226/306 - Criciúma S/C. O tempo de exposição ao produto foi de 20 minutos. Os resultados da análise bactericida no consultório odontológico particular são semelhantes aos do consultório público comprovando a efetividade da esterilização do ácido peracético, obtendo-se um resultado absoluto de esterilização. Tabela 11: Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização no consultório particular. Coleta 1 Nº colônias antes Nº colônias depois Amostra 1 03 00 03 00 05 00 Amostra 2 02 00 01 00 03 00 Amostra 3 01 00 02 00 07 00 27/06/06 Coleta 2 27/06/06 Nº colônias antes Nº Coleta 3 Nº Nº colônias colônias colônias 27/06/06 depois antes depois Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 03/07/06 03/07/06 03/07/06 Amostra 1 07 00 03 00 04 00 Amostra 2 12 00 00 00 03 00 Amostra 3 05 00 05 00 03 00 12 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 05/07/06 05/07/06 05/07/06 Amostra 1 00 00 05 00 Continua => 68 Continuação Amostra 2 00 00 07 00 23 00 Amostra 3 00 00 00 00 17 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 10/07/06 10/07/06 10/07/06 Amostra 1 22 00 13 00 22 00 Amostra 2 14 00 16 00 17 00 Amostra 3 03 00 11 00 05 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 13/07/06 13/07/06 13/07/06 Amostra 1 00 00 09 00 17 00 Amostra 2 05 00 12 00 21 00 Amostra 3 02 00 17 00 15 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 20/07/06 20/07/06 20/07/06 Amostra 1 30 00 00 00 13 00 Amostra 2 22 00 00 00 22 00 Amostra 3 17 00 00 00 09 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 27/07/06 27/07/06 27/07/06 Amostra 1 07 00 32 00 19 00 Amostra 2 15 00 34 00 05 01 Amostra 3 31 00 45 00 08 00 Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 13/09/06 13/09/06 13/09/06 Amostra 1 44 00 21 00 08 00 Amostra 2 32 00 13 00 09 00 Amostra 3 23 00 17 00 06 00 No dia 27/07/06 houve o crescimento de uma colônia bacteriana após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500ppm, que pode ter 69 ocorrido por contaminação durante o experimento, portanto essa amostra foi desprezada. Na Tabela 12 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm em material odontológico contaminado localizado na Rua Coronel Pedro Bennedet 226/306. Tabela 12: Resultados das amostras recolhidas em BHI Coleta 1 Turvou 27/06/06 Antes Não Turvou x Depois Coleta 2 27/06/06 Antes x Turvou Não Turvou x Depois Coleta 3 27/06/06 Antes x Coleta 2 Coleta 3 03/07/06 03/07/06 03/07/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 05/07/06 05/07/06 05/07/06 Antes x Antes Depois x Depois x Antes x Coleta 2 Coleta 3 10/07/06 10/07/06 10/07/06 x Depois Antes x x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 13/07/06 13/07/06 13/07/06 x Depois Antes x Depois x Antes x Coleta 2 Coleta 2 20/07/06 20/07/06 20/07/06 x Antes x x x x x x Depois Coleta 2 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes x Depois Coleta 1 Antes Não Turvou x Depois Coleta 1 Antes Turvou x x Continua => 70 Continuação Depois x Coleta 1 x Coleta 2 27/07/06 27/07/06 Antes Depois x Depois Antes x Depois Coleta 3 27/07/06 x Depois Antes x Coleta 2 Coleta 3 13/09/06 13/09/06 13/09/06 x Depois Antes x Depois x Antes x x Depois Coleta 1 Antes x Depois x x x A Tabela 12 ratifica os resultados observados na tabela 11, demonstrando a eficiência na esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm em materiais odontológicos contaminados, após o atendimento clínico. Na coleta efetuada no dia 20/07/2006 não houve turvamento da segunda amostra (antes e após a esterilização). 71 6 CONCLUSÃO Durante os testes efetuados a esterilização foi efetiva em todas as amostras utilizando o ácido peracético na concentração de 2500 ppm/ml. A técnica de preparo da solução de PAA é simples e não surgiram dificuldades durante o manuseio; Um ponto negativo observado durante o preparo é o tempo de diluição de cinco minutos do pó gerador. Uma vantagem a ser apontada neste processo é a esterilização de materiais termo-sensíveis. O tempo de esterilização é inferior ao da estufa e de autoclave. Em 20 minutos observou-se ausência total de crescimento de microrganismos nos materiais odontológicos contaminados. As pessoas que usaram o ácido peracético 2500 ppm na esterilização do material observaram que o mesmo apresentava manchas escuras que são características de corrosão. O teste de citotoxicidade apresentou alterações significativas nas concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm. No entanto, os resíduos do PAA que podem permanecer sobre instrumentais esterilizados são o H2O2 e ácido acético, portanto, não representam risco. O resultado de citotoxididade e genotoxicidade indicam a necessidade do uso de EPI (equipamentos de proteção individual) por parte do usuário. Procedimento que inclusive já faz parte dos procedimentos habituais em consultórios odontológicos. 72 REFERÊNCIAS ALMEIDA WB. Grupo de Pesquisa em Imunologia e Genética Ambiental. Criciúma: Universidade do Extremo Sul Catarinense -UNESC. 2006. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Serviços de Saúde. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br. Acesso em 25 jun. 2005. BALDRY MGC. The bactericidal, fungicidal, and sporicidal properties of hydrogen peroxide and peracetic acid. J. Appl. Bacteriol, 54:417-423, 1983. BLOCK SS. Disinfection, sterilization, and preservation. 4 ed. 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