MARIANA TEREZA DE LIRA BENÍCIO Avaliação de vias de

Transcrição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
MARIANA TEREZA DE LIRA BENÍCIO
Avaliação de vias de sinalização em células-tronco da
leucemia mieloide aguda de novo
RIBEIRÃO PRETO
2015
MARIANA TEREZA DE LIRA BENÍCIO
Avaliação de vias de sinalização em células-tronco da
leucemia mieloide aguda de novo
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Doutora em
Ciências.
Área de concentração: Imunologia Básica e
Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Magalhães Rego
RIBEIRÃO PRETO
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação da publicação
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
Benício, Mariana Tereza de Lira.
Avaliação de vias de sinalização em células-tronco da leucemia
mieloide aguda de novo, 2015.
108p.: Il.; 30 cm
Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Imunologia
Básica e Aplicada.
Orientador: Eduardo Magalhães Rego
1. LMA. 2. Células-tronco leucêmicas. 3. Sinalização Celular.
4. Aldeído desidrogenase. 5. Metilação.
Benício, MTL.
Avaliação de vias de sinalização em células-tronco da leucemia mieloide aguda
de novo.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para a obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Aprovado em: ___/___/____
Banca Examinadora
Prof. Dr.________________________________ Instituição: ___________________
Julgamento: ____________________________ Assinatura: ___________________
Aos meus pais, Dóris e Odilon, pelo amor e apoio
incondicionais.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela oportunidade de concluir mais essa etapa na minha formação
profissional, por me amparar nos momentos difíceis e pelas maravilhosas bênçãos
que ele me proporcionou nesta caminhada.
À minha família, pelo amor, carinho e incentivo em todas as horas. Por
compreenderem minha ausência e por se fazerem presentes de todas as formas
possíveis durante esses sete longos anos de convivência à distância.
Ao professor Dr. Eduardo Magalhães Rego, pela confiança, paciência
e por todas as oportunidades que me proporcionou. Agradeço também pela
amizade, pelos ensinamentos, exemplos e por me auxiliar na definição do meu
futuro profissional.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela
concessão da bolsa de doutorado e pelo apoio financeiro para a realização desta
pesquisa.
Ao professor Dr. Roberto Passetto Falcão, por disponibilizar a estrutura
física de seu laboratório para realização dos experimentos desse trabalho.
Ao Dr. Gary Nolan, pela oportunidade de conviver e aprender com seu
grupo e por todo o suporte oferecido para realização dos experimentos de fosfo-flow.
Ao Dr. Daniel Diniz de Carvalho, pela oportunidade de realizar os
experimentos de ERRBS deste trabalho em seu laboratório.
À Aglair Bérgamo, pela paciência, boa-vontade e disponibilidade para me
auxiliar em todas as etapas dos experimentos de citometria, especialmente quando
o projeto ainda estava engatinhando. Você é, sem dúvida, a melhor pessoa com
quem eu poderia ter aprendido as primeiras noções sobre citometria de fluxo.
À Priscila Scheucher, Ana Silvia Lima, Adriana Dore e Denise
Palma por me ajudarem em tudo o que precisei para realização deste trabalho.
Aos amigos Bárbara Santana, Cleide Silva, Dalvinha, Sarah Bassi e
Felipe Furtado, pela sincera e valiosa amizade, solidariedade, força, ajuda
profissional e pela certeza de que estaremos juntos para a vida toda.
À minha família ribeirão-pretana: Fernanda Barbosa, Marlusa
Amarante, Procópio Filho, Maitê Gomes, Larissa Cândido, Diandra
Favoretto, Florencia Tellechea, Mariana Grassi e Célia. Obrigada pelo
apoio nas horas difíceis, encorajamento nas horas de fraqueza e pelos incontáveis
momentos de risada à toa, alegria, aventuras e amor. É maravilhoso poder
compartilhar minha vida com vocês!
Ao Tiago, meu príncipe, por todo amor, generosidade, paciência, incentivo e
pela ajuda fundamental na execução e análise dos experimentos de ERRBS.
Aos meus amigos Mirela Tamarozzi e Sandro Soares, pelo
companheirismo e amizade ao longo de todos esses anos e por me hospedarem
com tanto amor no quartinho do meu sobrinho Lucas.
À Flavia Donaires, Antonio Roberto, Leonardo Zanelatto,
Katarina Holanda, Fernanda Gutierrez, Ritinha, Ildercílio Lima,
Hudson Bezerra, Helder Freitas, Danuta Sastre, Lara Zapata e Vitor
Leão, pelos anos de convivência, pelos cafés, pelas conversas e por tudo que
aprendi com cada um de vocês.
Aos meus amigos-irmãos: Ana Paula Diniz, Tales Costa e Silva,
Juliana Galvão, Luciene Marques, Bianca Fiche, Natália Scatena e
Leonardo Dantas. Obrigada por estarem comigo em todos os momentos e por
todo amor, apoio, compreensão e incentivo.
À Dra. Lorena Figueiredo-Pontes e ao Dr. Guilherme Santos, por
me auxiliarem no delineamento de diversos experimentos neste projeto, pelo tempo
dedicado às discussões dos resultados e pelo apoio e encorajamento.
To my T.O. friends: Roxana Shen, Rajat Singhania, Frank, Aline
Arya, Helen Loo, David Roulouis, Illias Ettayebi, Naoya Takayama,
Mark Dowar, Nick Khuu, Julie and Monika, for being incredibly kind, lovely
and helpful, and for making my stay in Toronto so pleasant and memorable.
“A persistência é o caminho mais curto para o êxito.”
(Charles Chaplin)
RESUMO
Benício, M.T.L., Avaliação de vias de sinalização em células-tronco da leucemia
mieloide aguda de novo. 2015. 108p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Cerca de dois terços dos pacientes diagnosticados com leucemia mieloide aguda
(LMA) alcançam remissão hematológica completa com os esquemas terapêuticos
atualmente disponíveis, a qual é frequentemente seguida por recaída. Diversas
evidências corroboram a ideia de que a recaída na LMA se deve à sobrevivência de
uma rara população de células quiescentes, funcionalmente caracterizadas como
células iniciadoras de leucemia (LIC), as quais são resistentes à quimioterapia.
Portanto, admite-se que a LMA poderia ser erradicada por estratégias terapêuticas
que tenham como alvos as propriedades exclusivas das LIC. Vias de sinalização e
alterações epigenéticas aberrantes podem ser consideradas alvos em potencial para
intervenção terapêutica, com o objetivo de promover remissões mais duradoras. O
objetivo do presente estudo foi determinar se as subpopulações de células
CD34+CD38-ALDHhigh (enriquecidas em CTH) isoladas de amostras de medula
óssea de doadores saudáveis e de pacientes com LMA, e CD34+CD38-ALDHint
(enriquecidas em LIC) apresentam diferentes perfis de sinalização e de metilação do
DNA genômico. Utilizou-se uma combinação entre os marcadores de superfície
CD34 e CD38 e os níveis de atividade da enzima aldeído desidrogenase (Aldh) para
separar CTH e LIC em amostras de LMA ao diagnóstico e de doadores saudáveis.
Essas subpopulações celulares foram funcionalmente estudadas em ensaios de
xenotransplantes em camundongos NOD/SCID/gama (NSG) e seus perfis de
sinalização celular e de metilação genômica global foram caracterizados por
citometria de fluxo (fosfo-flow) e enhanced reduced representation bisulfite (ERRBS),
respectivamente. Nossos resultados demonstraram que as duas subpopulações
celulares apresentaram níveis basais de fosfoproteínas distintos, bem como
diferentes perfis de resposta ao fator estimulante de colônias de granulócitos (GCSF) e ao fator de crescimento de células-tronco (SCF). Elevados níveis basais de
fosfoproteínas Stat3, Stat5, Erk e Akt foram detectados nas LIC em comparação
com a subpopulação ALDHhigh. A ausência de resposta aos estímulos utilizados foi
mais frequente na subpopulação ALDHint. A comparação entre os perfis de
metilação genômica global revelou que os genes diferencialmente metilados nas LIC
em comparação com as CTH estão relacionados à regulação da sobrevivência
celular e mecanismos de resistência à terapia. Esses achados corroboram a nossa
hipótese de que essas subpopulações celulares são funcionalmente distintas e de
que as LIC e CTH respondem diferentemente aos estímulos presentes no nicho
medular.
ABSTRACT
Benício, M.T.L., Assessment of signaling pathways on de novo acute myeloid
leukemia stem-cells. 2015. 108p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Over two-thirds of patients diagnosed with acute myeloid leukemia (AML) reach
hematological complete remission with existing therapy strategies. However, a great
proportion of these apparently cured patients frequently relapse. Accumulating
evidence supports the idea that disease relapse is due to the survival of a small
population of dormant leukemia stem cells (LIC) that are resistant to chemotherapy.
Therefore, it could be hypothesized that leukemia could be eradicated by developing
treatments focused on the unique properties of this rare cell subset. Aberrant
signaling pathways and methylation patterns can be considered potential targets for
therapeutic intervention, aimed to provide long-lasting remissions. The aim of this
study was to assess whether CD34+CD38-ALDHhigh cells (ALDHhigh - enriched for
hematopoietic stem cells - HSC) isolated from normal donors’ and AML patients’
bone marrow, and CD34+CD38-ALDHint (ALDHint - enriched for LIC) show different
signaling profiles and methylation patterns. We took advantage of the combination
between the surface markers CD34 and CD38, and the activity levels of the enzyme
aldehyde dehydrogenase (Aldh) to reliably distinguish HSC from LIC in samples
obtained from AML patients at diagnosis and normal donors. After validating their
stemness potential by xenotransplantation assays, we characterized their profiles
regarding signaling pathways and genomic methylation by flow cytometry
(phosphoflow) and enhanced reduced representation bisulfite (ERRBS), respectively.
The comparison of the phosphoprotein levels between ALDHhigh and ALDHint cells
revealed discernable profiles at the basal level and in response to granulocyte
colony- stimulating factor (G-CSF) or stem cell factor (SCF). Increased basal
phosphorylation of Stat3, Stat5, Erk and Akt was detected on LIC in comparison to
the ALDHhigh cell subset. Lack of response to growth factors was more frequent on
ALDHint cells. The association between increased basal phosphorylation and lack of
activation following growth factors stimulation could reflect a mechanism of
maintenance for LIC. The comparison of the global genomic methylation profiles
between isolated cell subsets showed that differentially methylated cytosines in LIC,
in relation to HSC, occur in genes that play a role in the control of cell survival and
chemoresistance. Our data corroborated our hypothesis that ALDHhigh and ALDHint
are functionally different and show discernable signaling profiles in response to
stimuli present within the bone marrow niche.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –
Esquema de separação das subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e
CD34+CD38-ALDHint por citometria de fluxo e sua subsequente
utilização para xenotransplante e fosfo-flow. As gates estabelecidas
para separação celular foram baseadas na atividade da Aldh dentro
da população de células CD34+CD38-. ................................................. 34
Figura 2 –
Padrões de marcação com Aldeofluor de amostras de medula óssea
de doadores saudáveis e de pacientes com LMA ao diagnóstico. ........ 47
Figura 3 –
Representação da análise de enxertia das células CD45 humanas
por meio de citometria de fluxo. ............................................................ 49
Figura 4 –
Avaliação da enxertia por citometria de fluxo. ....................................... 50
Figura 5 –
Análise da correlação entre o número de células injetadas e o
percentual de células recuperadas em experimentos de
xenotransplante.. ................................................................................... 51
Figura 6 –
Análise dos marcadores de linhagens em células humanas CD45+
recuperadas da medula óssea de camundongos NSG transplantados
com amostra de medula óssea total de um paciente com leucemia
mieloide aguda. ..................................................................................... 52
Figura 7 –
Análise representativa da enxertia de células humanas CD34+CD38ALDHhigh ou CD34+CD38-ALDHint obtida por meio de ensaio de
diluição limitante. ................................................................................... 53
Figura 8 –
Padronização dos inibidores de vias de sinalização em linhagem
celular HL-60. ........................................................................................ 54
Figura 9 –
Histogramas representativos dos níveis de fosfo-Stat3 e fosfo-Stat5
após tratamento de células de medula óssea normal com inibidores
de Stats. ................................................................................................ 56
Figura 10 – Heatmaps representativos da fosforilação de Stat3 e Stat5 na
ausência de estímulo e em resposta a G-CSF ou IL-6 na
subpopulação CD34+CD38-ALDHhigh em amostras de medula óssea
de doadores saudáveis. ...................................................................... 57
Figura 11 – Heatmaps representativos da fosforilação de Erk1/2 e Akt na
ausência de estímulo e em resposta a SCF na subpopulação
CD34+CD38-ALDHhigh em amostras de medula óssea de doadores
saudáveis. ............................................................................................. 58
Figura 12 – Heatmaps representativos dos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 na
ausência de estímulo e em resposta ao estímulo com G-CSF nas
subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint isoladas
de doadores saudáveis e pacientes com LMA.. .................................... 61
Figura 13 – Painel representativo dos níveis de P-Erk1/2 e P-Akt na ausência de
estímulo e em resposta ao SCF nas subpopulações CD34+CD38ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint isoladas de doadores saudáveis e
pacientes com LMA.. ............................................................................. 64
Figura 14 – Heatmaps representativos da quantificação relativa dos níveis de PStat3 e P-Stat5 em resposta ao estímulo com G-CSF nas
de doadores saudáveis e pacientes com LMA. ..................................... 66
Figura 15 – Heatmap representativo da quantificação relativa dos níveis de PStat3 em resposta ao estímulo com IL-6 nas subpopulações
CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint isoladas de pacientes
com LMA. .............................................................................................. 68
Figura 16 – Heatmap representativo dos níveis de P-Erk1/2 e P-Akt em resposta
ao estímulo com SCF nas subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e
CD34+CD38-ALDHint isoladas de pacientes com LMA. ........................ 70
Figura 17 – Comparação entre os níveis de P-Stat3 e P-Stat5 entre as
de pacientes com LMA ao diagnóstico e na recaída. ............................ 72
Figura 18 – Comparação entre perfis de resposta ao G-CSF das subpopulações
CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint isoladas de pacientes
com LMA ao diagnóstico e na recaída. ................................................. 73
Figura 19 – Comparação entre os perfis de metilação de células CD34+CD38ALDHhigh isoladas de pacientes com LMA ou de doadores saudáveis .. 76
Figura 20 – Distribuição global de citosinas hipo- e hipermetiladas em células
CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de pacientes com LMA em comparação
com células CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de doadores saudáveis. ....... 77
Figura 21 – Regiões genômicas e sítios de localização das citosinas
diferencialmente metiladas na subpopulação CD34+CD38-ALDHhigh
isoladas de pacientes com LMA em comparação com células
CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de doadores saudáveis. ...................... 77
Figura 22 – Comparação entre os perfis de metilação de células CD34+CD38ALDHint e células CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de doadores
saudáveis.. ............................................................................................ 78
Figura 23 – Regiões genômicas e sítios de localização das citosinas
diferencialmente metiladas na subpopulação CD34+CD38-ALDHint
em comparação com células CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de
doadores saudáveis. ............................................................................. 79
CD34+CD38-ALDHint isoladas de pacientes com LMA em
comparação com células CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de
doadores saudáveis. ............................................................................. 79
Figura 25 – Comparação entre os perfis de metilação entre células CD34+CD38ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint isoladas de pacientes com LMA. ........ 81
CD34+CD38-ALDHint em comparação com células CD34+CD38ALDHhigh isoladas do mesmo paciente.. ................................................ 82
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Reagentes usados para digestão com MspI ......................................... 39
Tabela 2 – Reagentes utilizados para purificação do DNA ..................................... 40
Tabela 3 – Reagentes utilizados nas reações de reparo das extremidades dos
produtos da digestão por MspI .............................................................. 41
Tabela 4 – Reação de adenilação do DNA reparado .............................................. 41
Tabela 5 – Ligação dos adaptadores Illumina aos fragmentos ............................... 42
Tabela 6 – Reagentes utilizados para as reações de Q-PCR ................................. 43
Tabela 7 – Reagentes utilizados para construção das bibliotecas .......................... 44
Tabela 8 – Características dos pacientes cujas amostras foram incluídas neste
estudo ................................................................................................... 46
Tabela 9 – Resumo dos resultados dos experimentos de xenotransplante ............ 50
Tabela 10 – Percentual médio de células hCD45+ detectado nas amostras de
medula óssea dos animais submetidos ao xenotransplante nos quais
se considerou haver enxertia de células humanas. .............................. 51
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aldh
Enzima aldeído desidrogenase
Akt
Do inglês, v-akt murine thymoma viral oncogene homolog
ATO
Trióxido de arsênico
ATRA
Ácido all-trans retinoico
CBF
Do inglês, Core-binding factor
C-KIT
Do inglês, v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral
oncogene homolog
CTH
Célula-tronco hematopoiética
CTL
Célula-tronco leucêmica
DMC
Do inglês, differentially methylated cytosines
DRM
Doença residual mínima
Erk
Do inglês, extracellular-signal-regulated kinase
ERRBS
Do inglês, enhanced reduced representation bisulfite
sequencing
FLT3
Do inglês, Fms-like tyrosine kinase – 3
FLT3-ITD
Duplicações internas em tandem do gene Fms-like
tyrosine kinase – 3
G-CSF
fator estimulante de colônias de granulócitos
IL-6
Interleucina 6
JAK
Do inglês, Janus kinase 2
LDA
Do inglês, limiting dilution analysis
LLA
Leucemia linfoide aguda
LIC
Do inglês, leukemia initiating cell
LMA
Leucemia mieloide aguda
MAPK
Do inglês, mitogen-activated protein kinase
NOD/SCID
Do inglês, Non-obese
immunodeficiency
NPM1c+
Proteína nucleofosmina aberrantemente localizada no
citoplasma. Alternativamente, gene codificador para a
nucleofosmina mutado
NSG
Do inglês, NOD/SCID gamma
PCA
Análise de componentes principais
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PI3K
Do inglês, phosphoinositide-3-kinase
PML-RARA
Gene de fusão resultante do rearranjo entre os genes
promyelocytic leukemia e retinoic acid receptor, alpha
RAS
Do inglês, rat sarcoma viral oncogene homolog
RUNX1-RUNX1T1
Gene de fusão resultante do rearranjo entre os genes
runt-related transcription factor 1 e runt-related
transcription factor 1; translocated to, 1
SAM
Sequence Alignment/Map
Stat
Do inglês, signal transducer and activator of transcription
SCF
Do inglês, stem cell factor
diabetic/
severe
combined
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 18
1.1 Células-tronco leucêmicas da LMA ..................................................................... 19
1.2 A atividade da Aldeído-Desidrogenase na identificação de células-tronco
leucêmicas ................................................................................................................ 21
1.3 Panorama atual do tratamento de pacientes com LMA ....................................... 23
1.4 O estudo da sinalização celular em células individuais ....................................... 25
1.5 Estudo de vias de sinalização na LMA ................................................................ 26
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 30
2.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 31
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 31
3 MÉTODOS ..................................................................................................... 32
3.1 Separação das subpopulações celulares ALDHHIGH e ALDHINT a partir de
subpopulações CD34+CD38- de pacientes com LMA ............................................... 33
3.2 Xenotransplante em camundongos NOD.CG-PRKDCSCID IL2RGTM1WJL/SZJ
(NSG) das subpopulações celulares obtidas ............................................................ 35
3.3 Avaliação da enxertia das células humanas transplantadas ............................... 35
3.4 Avaliação das vias de sinalização celular por citometria de fluxo ....................... 36
3.4.1 Estímulo com citocinas/fatores de crescimento e análise das fosfoproteínas
intracelulares ............................................................................................................. 36
3.4.2 Tratamento com inibidores de fosfoproteínas .................................................. 37
3.5 Enhanced Reduced Representation Bisulfite (ERRBS) ...................................... 38
3.5.1 Extração do DNA .............................................................................................. 38
3.5.2 Quantificação do DNA ...................................................................................... 39
3.5.3 Digestão com MspI ........................................................................................... 39
3.5.4 Purificação do DNA após reações enzimáticas ................................................ 40
3.5.5 Reparo das extremidades e adenilação dos produtos da digestão por MspI ... 41
3.5.6 Conversão por bissulfito ................................................................................... 42
3.5.7 Seleção por tamanho dos fragmentos de DNA ligados aos adaptadores ........ 42
3.5.8 Validação do número de ciclos de PCR ideal para a construção das
bibliotecas por Q-PCR ............................................................................................... 43
3.5.9 Validação das bibliotecas ................................................................................. 44
4 RESULTADOS .............................................................................................. 45
4.1 Identificação de diferentes perfis de atividade da ALDH em doadores
saudáveis e pacientes com LMA ao diagnóstico ....................................................... 47
4.2 Xenotransplantes das subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38ALDHint em camundongos NSG ................................................................................ 48
4.2.1 Avaliação da enxertia nos camundongos ......................................................... 49
4.3 Avaliação das vias de sinalização por citometria de fluxo ................................... 53
4.3.1 Validação do método fosfo-flow ....................................................................... 54
4.3.2 Perfil de sinalização em amostras de medula óssea normal ............................ 57
4.3.3 Perfil de sinalização entre os pacientes com LMA ........................................... 59
4.3.3.1 Sinalização na ausência de estímulo externo ............................................... 59
4.3.3.2 Análise da resposta aos estímulos ................................................................ 65
4.3.3.2.1 G-CSF ........................................................................................................ 65
4.3.3.2.2 IL-6 ............................................................................................................. 67
4.3.3.2.3 SCF ............................................................................................................ 69
4.3.4 Comparação entre amostras coletadas ao diagnóstico e na recaída ............... 71
4.4 Análise de metilação global genômica ................................................................ 74
5 DISCUSSÃO.................................................................................................. 84
6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 94
1 INTRODUÇÃO
Introdução | 19
As Leucemias Mieloides Agudas (LMA) constituem um heterogêneo grupo de
doenças clonais que afetam progenitores hematopoiéticos, tornando-os incapazes
de se diferenciarem terminalmente e de responderem aos reguladores naturais de
proliferação e morte celular. Como consequência, essas células malignas se
acumulam na medula óssea e prejudicam a produção normal das células
sanguíneas, mas podem também se acumular em outros tecidos e órgãos, cujas
funções são frequentemente comprometidas (1,2).
Estudos epidemiológicos sugerem que fatores genéticos, ambientais e
ocupacionais estejam envolvidos na patogênese da LMA (3). Apesar dos
mecanismos envolvidos nesse processo não serem inteiramente conhecidos, sabese que decorre de alterações genéticas cumulativas que resultam em irregularidades
na expressão gênica, na função das proteínas e nas vias de transdução de sinal
subjacentes. Como consequência, esses eventos afetam a proliferação, sobrevida e
diferenciação das células hematopoiéticas (2,4,5).
Historicamente, dois modelos de leucemogênese foram propostos. De acordo
com o modelo estocástico, as células da leucemia não compõem um sistema
hierarquicamente organizado: todas as células apresentam o mesmo potencial
intrínseco de contribuir para a manutenção da neoplasia (6). O modelo da hierarquia,
por sua vez, propõe que a leucemia consiste em uma população heterogênea de
células, hierarquicamente organizadas, dentro da qual apenas um pequeno
percentual de LIC mantém a doença (7). Existe ainda um terceiro modelo,
recentemente proposto, segundo o qual células leucêmicas maduras podem
retroceder em seus programas de diferenciação celular e readquirir propriedades
características de células-tronco ou progenitoras (8–10).
1.1 Células-tronco leucêmicas da LMA
Evidências consistentes da existência de células-tronco leucêmicas (CTL) da
LMA foram demonstradas por Lapidot et al. (1994) e Bonnet e Dick (1997) ao
identificarem, entre células de pacientes com LMA, uma subpopulação muito rara de
células CD34+CD38-, capaz de propagar a leucemia após transplante em animais
NOD/SCID (Non-obese diabetic/Severe combined immunodeficiency disease),
Introdução | 20
reproduzindo a doença original do paciente. Em contraste, progenitores mais
comprometidos CD34+CD38+ não apresentaram o mesmo potencial (7,11).
Posteriormente, evidenciou-se que as CTL não são funcionalmente
homogêneas e, como as CTH normais, se organizam em classes hierarquicamente
arranjadas, cujos potenciais para induzir e manter leucemia em camundongos
imunodeficientes são variáveis. Algumas das subpopulações só foram capazes de
repovoar a medula após transplantes subsequentes em receptores consecutivos
(transplantes
seriados),
indicando
que
raramente
se
dividiam,
e
que
a
autorrenovação ocorria preferencialmente, em vez de divisão celular seguida por
diferenciação (12,13). Outros trabalhos corroboraram a heterogeneidade funcional
existente entre as CTL, como por exemplo, a observação de que a frequência de
células capazes de propagar leucemia em modelos animais se correlacionava com o
prognóstico clínico dos pacientes dos quais foram obtidas (14,15).
Por muito tempo, acreditou-se que as CTL fossem restritas à subpopulação
de fenótipo CD34+CD38-, devido às limitações inerentes aos modelos animais
utilizados para sua identificação e caracterização. Entretanto, estudos mais
recentes, utilizando animais mais imunocomprometidos do que os NOD/SCID para
xenotransplantes, sugeriram que os xenoenxertos prévios não demonstraram todas
as populações de CTL, e que as demais frações estabelecidas de acordo com os
marcadores CD34 e CD38 também continham células com grande potencial para
iniciar e propagar leucemia (16–19). Estes estudos constataram que havia uma
grande heterogeneidade nos marcadores imunofenotípicos característicos das CTL,
demonstrando que a confirmação dessas células requer validação por ensaios de
repopulação, baseados na capacidade funcional que essas células apresentam de
migrar e repovoar o microambiente medular em animais transplantados. Assim, duas
linhas de evidências são necessárias para estabelecer quais as populações
celulares que contém LIC: 1. O fracionamento das células leucêmicas em
populações que possam originar xenoenxertos ou não; e 2. Transplantes seriados
para comprovar seu potencial de autorrenovação (20). Com base em sua definição
funcional, as células-tronco leucêmicas serão chamadas neste trabalho de células
iniciadoras de leucemia (do inglês, LIC), de agora em diante.
Como as células-tronco hematopoiéticas normais, as LIC são quiescentes e
conservam as propriedades de autorrenovação e clonogenicidade (7,8,10,12,21).
Devido a essa capacidade de manutenção clonal em longo-prazo, acredita-se que o
Introdução | 21
prognóstico do paciente com LMA esteja mais intimamente relacionado às LIC do
que às demais células leucêmicas, e que a cura dependa de sua erradicação. Por
serem quiescentes, essas células não respondem a agentes citotóxicos que têm
como alvo o ciclo celular. Dessa forma, são resistentes à ação de vários
quimioterápicos e acredita-se que restabeleçam a doença e promovam as recaídas
tão frequentemente observadas na LMA. Além disso, as LIC podem também ser
alvos de mutações e alterações epigenéticas que adicionalmente promovam
resistência a drogas e resultem em recaída da doença (22).
As LIC e as CTH compartilham muitas características e coexistem na medula
óssea de pacientes com LMA. Para o desenvolvimento de terapias bem-sucedidas
direcionadas contra as LIC é essencial a identificação de diferenças entre estas
duas populações celulares residentes na medula óssea.
1.2 A atividade da Aldeído-Desidrogenase na identificação de células-tronco
leucêmicas
Em 1997, Bonnet e Dick demonstraram pela primeira vez que as células da
LMA estão organizadas obedecendo a uma hierarquia, semelhante ao que se
observa na hematopoiese normal (7). De acordo com esse modelo, admite-se que
as CTH ou progenitores hematopoiéticos sejam os alvos de modificações genéticas
que culminam com o desenvolvimento da LMA. Assim, compreender a biologia
dessas células e como elas se transformam em células leucêmicas são questões
fundamentais para identificar propriedades exclusivas das LIC, as quais podem ser
exploradas para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.
Múltiplos
trabalhos
demonstraram
que
as
LIC
estavam
tipicamente
enriquecidas na fração CD34+CD38- de progenitores hematopoiéticos, juntamente
com as CTH.
Nesse contexto, diversos grupos propuseram marcadores de
superfície que seriam preferencialmente expressos em LIC quando comparadas às
CTH. Um dos primeiros antígenos descritos como sendo preferencialmente
expressos em LIC da LMA foi a cadeia α de alta afinidade do receptor da IL-3,
também conhecido como CD123 (23–26). Após essa primeira descrição, várias
outras moléculas foram descritas como sendo mais expressas em LIC CD34+CD38-
Introdução | 22
da LMA, tais como: CD44 (27), CLL-1 (28), CD47 (29,30) e TIM3 (31). Entretanto, há
controvérsia sobre a especificidade dos marcadores propostos, principalmente
relacionada à sua detecção em medula óssea e cordão umbilical (32).
Métodos funcionais, em detrimento de métodos imunológicos, têm sido
propostos para discriminar LIC e CTH. Entre eles, a avaliação da atividade de
enzimas associadas com a proteção de células primitivas contra estímulos
genotóxicos tem se revelado uma estratégia promissora. Por exemplo, a atividade
da aldeído desidrogenase (Aldh) entre células primárias da LMA foi associada com
características de células-tronco e se correlacionou com o desfecho clínico (33,34).
Na última década, diversos trabalhos foram publicados sobre a Aldh em CTH e
progenitores hematopoiéticos, os quais exploraram seu papel na hematopoiese normal
e apontaram um possível papel no desenvolvimento e propagação da LMA (33–35).
Esta família compreende 19 membros, os quais compartilham sequências homólogas e
funções biológicas, muitas delas relacionadas ao metabolismo dos retinoides e à
atuação como chaperonas (36). Dentre todas as isoformas, a Aldh1a1 é a mais
expressa em CTH e progenitores imaturos murinos e humanos, quando comparados a
progenitores mais maduros e células terminalmente diferenciadas (37).
A Aldh é uma enzima citosólica envolvida na detoxificação de uma ampla
variedade de aldeídos intracelulares, convertendo-os em seus respectivos ácidos
carboxílicos (38). Uma de suas importantes funções consiste em catalisar a
conversão da vitamina A (retinol) em ácido retinoico (39), o qual é crucial para a
diferenciação das CTH (40,41). Além de atuar na detoxificação de aldeídos
intracelulares, a Aldh também exerce esse efeito sobre xenobióticos (42). Altos
níveis de expressão da Aldh foram detectados em CTH quando comparadas com
outras células hematopoiéticas (35,43), e o aumento de sua atividade confere
resistência a agentes alquilantes, como por exemplo, a ciclofosfamida, protegendo
as CTH dos seus efeitos citotóxicos (42).
A utilidade da Aldh como marcador de células-tronco foi primeiramente
reconhecida em CTH humanas por Storms et al. (1999), que desenvolveram um
substrato fluorescente para essa enzima, denominado BODIPY® aminoacetaldeído
(BAAA) (44), e seu método foi posteriormente aprimorado para o desenvolvimento de
um
kit
comercialmente
disponível,
denominado
ALDEFLUOR™
(STEMCELL
Technologies, Canadá). O BAAA é incorporado por células vivas por difusão passiva e
convertido pela Aldh no produto fluorescente e negativamente carregado BODIPY®
Introdução | 23
aminoacetato (BAA). O BAA se acumula no interior dessas células devido à sua carga
negativa e também à presença de um inibidor de bombas de efluxo (Verapamil) contido
no tampão utilizado no procedimento. A quantidade de produto fluorescente acumulado
correlaciona-se diretamente à atividade da Aldh nessas células, o que permite que
células com elevada atividade dessa enzima sejam identificadas pela intensa
fluorescência e isoladas por citometria de fluxo. Adicionalmente, o kit contém um
inibidor da Aldh, o dietilaminobenzaldeído (DEAB), que permite identificar células com
elevada atividade da Aldh. Esse método vem sendo progressivamente mais utilizado
no isolamento de células-tronco por citometria de fluxo e baseia-se em características
funcionais e não apenas imunofenotípicas (33–35,43).
Em 2012, Gerber et. al demonstraram que a combinação entre os marcadores
de superfície CD34 e CD38 e o reagente ALDEFLUOR™ (STEMCELL Technologies,
Canadá) permitiu a separação entre subpopulações de células-tronco normais e
leucêmicas em pacientes com LMA. Dentro da subpopulação CD34+CD38- nestes
pacientes, a atividade da Aldh permitiu a separação entre células leucêmicas
desprovidas de potencial hematopoiético (CD34+CD38-ALDHlow), LIC (CD34+CD38ALDHint) e CTH (CD34+CD38-ALDHhigh), as quais tiveram seu potencial de
autorrenovação e diferenciação hematopoiética funcionalmente validadas por meio
de xenotransplante em animais NSG. Além disso, a avaliação da doença residual
mínima (DRM) por meio da quantificação de células com fenótipo CD34+CD38ALDHint demonstrou uma forte correlação entre a persistência dessas células ao
final do tratamento e a subsequente recaída clínica (45). Posteriormente, outros
grupos também demonstraram que a combinação entre marcadores de superfície e
a atividade da Aldh possibilitou a separação entre CTH e LIC (46,47). Estes achados
reforçam a potencial aplicabilidade da avaliação da atividade da Aldh para
identificação de LIC da LMA.
1.3 Panorama atual do tratamento de pacientes com LMA
A diversidade existente entre as LMA pode ser evidenciada sob os pontos de
vista genético, citomorfológico, clínico e de resposta ao tratamento. Apesar disso, a
primeira linha do tratamento é igual para todos os pacientes e consiste em indução
Introdução | 24
de remissão utilizando-se Citarabina (Ara-C) combinada a um antracíclico, seguida
por consolidação com Ara-C. Nos últimos trinta anos, não houve mudanças
significativas na quimioterapia padrão, nem nos desfechos da grande maioria dos
pacientes, o que contrasta com os progressos obtidos no tratamento da leucemia
linfoide aguda (LLA) na infância (48).
Nos últimos anos, diversas alterações genéticas foram identificadas na LMA,
muitas das quais estão associadas à patogênese da doença (49–51). A
caracterização dessas alterações foi essencial para uma melhor compreensão da
biologia da LMA e possibilitou a identificação de alvos moleculares para o
desenvolvimento de agentes terapêuticos. Entretanto, poucos avanços têm sido
observados, como no caso da leucemia promielocítica aguda (LPA) associada à
t(15;17), em que o desfecho dos pacientes foi significativamente melhorado após a
inclusão de ácido all-trans retinoico (ATRA) e trióxido de arsênico (ATO) nos
esquemas terapêuticos (52,53).
Algumas das anormalidades genéticas mais frequentemente detectadas na
LMA foram associadas à evolução clínica e achados laboratoriais específicos, de tal
maneira que novas entidades nosológicas foram propostas com base nessas
anormalidades genéticas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) (54). Além
disso, os achados genéticos ao diagnóstico estão associados ao prognóstico e a
respostas à terapia e, juntamente com algumas características clínicas observadas
ao diagnóstico, constituem ferramentas determinantes para a escolha de
abordagens terapêuticas adaptadas ao risco (49,55–57).
Apesar da categorização dos pacientes em função dos achados genéticos ser
utilizada nos ensaios clínicos e na prática clínica, poucos protocolos utilizaram
estratégias terapêuticas adaptadas ao risco. De maneira geral, a sobrevida global
em cinco anos para os pacientes com LMA permanece baixa: aproximadamente de
40% nos países desenvolvidos (58–61) e de 20% no Brasil (62–64). Além disso,
apesar da remissão completa ser alcançada em cerca de 70% dos casos utilizandose os esquemas terapêuticos convencionais, ela é frequentemente seguida por
recaída (65,66).
A ausência de resposta duradoura sugere que, embora as drogas atualmente
utilizadas sejam geralmente capazes de eliminar os blastos leucêmicos, elas podem
não ser tão eficazes contra as populações de LIC. Vários autores demonstraram que
as LIC, em analogia às CTH, apresentam elevado potencial de autorrenovação e
Introdução | 25
reduzida taxa de divisão celular, características que permitem que resistam às
terapias convencionais, as quais atacam principalmente células que se dividem
rapidamente (67). De fato, há evidências experimentais de que quando comparadas
aos blastos leucêmicos e às CTH, as LIC são menos sensíveis à Ara-C e
antracíclicos, bem como à apoptose induzida por Fas (68).
Há diversos mecanismos por meio dos quais as LIC podem escapar dos
efeitos tóxicos dos quimioterápicos, muitos dos quais são compartilhados pelas
células-tronco do câncer, em geral. Entre eles, podemos citar: a expressão de
bombas de efluxo de drogas, o aumento da atividade da aldeído desidrogenase,
aumento da expressão de proteínas antiapoptóticas da família BCL-2, ativação
aberrante de vias de sinalização, entre outros (69). Uma vez que a quimioterapia é a
principal ferramenta no tratamento da LMA, compreender os mecanismos envolvidos
na quimiorresistência é fundamental para o desenvolvimento de abordagens
terapêuticas mais eficazes.
1.4 O estudo da sinalização celular em células individuais
A fosforilação de resíduos de tirosina, serina e treonina é fundamental para o
controle da atividade das proteínas envolvidas em vários eventos celulares. Com o
advento dos anticorpos fosfo-específicos, técnicas como Western blotting e
imunoprecipitação passaram a ser utilizadas para detecção de proteínas
fosforiladas. Entretanto, apesar das técnicas de marcação de proteínas serem
bastante informativas sobre as respostas celulares a estímulos em experimentos em
longo prazo, elas não revelam a cinética da ativação. Assim, eventos mais
dinâmicos, que ocorrem rapidamente após estimulação ou estresse, são dificilmente
apreciados nas análises por Western blotting e imunoprecipitação (70). Além disso,
esses métodos requerem quantidades relativamente grandes de amostra, são
demorados e laboriosos, não produzem resultados verdadeiramente quantitativos e
não permitem análises multiparamétricas.
Os avanços nas técnicas de marcação intracelular, citometria de fluxo, no
desenvolvimento de reagentes fluorescentes e produção de anticorpos expandiram o
número de antígenos intracelulares que podem ser analisados por citometria de
Introdução | 26
fluxo. Em 2003, Nolan et al. combinaram anticorpos fosfo-específicos à citometria de
fluxo para desenvolver uma tecnologia que possibilita a análise de fosfoproteínas.
Esse método inovador, que requer pequenas quantidades de amostra e é ideal para
análises rápidas, quantitativas e multiparamétricas, constitui uma importante
ferramenta para se estudar cascatas de sinalização regidas por quinases em
subpopulações celulares distintas e em células únicas (70,71).
O perfil da sinalização em células únicas, investigado por citometria de fluxo
multiparamétrica, vem sendo utilizado em estudos de proteômica sobre a expressão
de proteínas e sua atividade sob condições basais e moduladas (4,72). Utilizando
células viáveis, a análise de proteínas endógenas em importantes vias de
sinalização é feita antes e depois da exposição in vitro a agentes moduladores, tais
como fatores de crescimento, citocinas ou agentes terapêuticos de relevância
biológica. Essa abordagem viabiliza o estudo da fisiologia das vias de sinalização
em células individuais através da avaliação de propriedades que não são
perceptíveis em estado basal, como por exemplo: falha de algumas vias em se
tornarem ativadas, hipo- ou hipersensibilidade de vias a estímulos fisiológicos,
cinéticas de resposta alteradas e redefinição de vias canônicas (72–74). Assim, é
possível detectar uma heterogeneidade funcional que estaria obscurecida pela
homogeneidade
de
grupos
estabelecidos
por
critérios
citomorfológicos
e
moleculares.
Sabendo-se que as LIC constituem populações raras, a caracterização do
perfil de sinalização em células individuais seria particularmente útil para sua
caracterização funcional, uma vez que a citometria de fluxo apresenta resultados
quantitativos satisfatórios com números limitados de células, além de admitir
análises multiparamétricas (como a combinação entre os diferentes marcadores
celulares utilizados para identificar esta subpopulação e para detectar as proteínas
fosforiladas de interesse neste estudo).
1.5 Estudo de vias de sinalização na LMA
A progressão tumoral é um processo multifatorial que envolve mutações e
alterações epigenéticas, as quais afetam direta ou indiretamente proteínas
Introdução | 27
sinalizadoras e, em última instância, interferem na maneira como as células
interpretam os sinais do microambiente e respondem a eles. Esses mecanismos são
cruciais para que as células tumorais se tornem autossuficientes em sinais de
crescimento e insensíveis aos sinais inibitórios do crescimento (75). O perfil de
sinalização das células do câncer é, portanto, a soma de várias influências e o
reflexo da seleção frente à necessidade de escapar do sistema imune e de
desenvolver vantagens adaptativas no nicho medular.
Atualmente, admite-se que a sinalização celular é aberrante em virtualmente
todas as LMA, e é possível associar muitas dessas aberrações a uma ampla
variedade de alterações genéticas e epigenéticas (4,73,76–80). Quando aplicado a
vias relevantes para a patogenia da LMA, o mapeamento dessas redes de
sinalização apresenta potencial aplicabilidade diagnóstica, prognóstica e para
identificação de alvos para o desenvolvimento de drogas. A identificação das vias
mais comumente afetadas na LMA nos casos que apresentam evolução clínica
desfavorável pode ser útil para reconhecer quais os pacientes que não irão
responder à quimioterapia padrão e que, portanto, devem ser submetidos aos
esquemas terapêuticos indicados para pacientes de alto risco. Assim, uma
classificação das LMA baseada em estudos de sinalização celular pode fornecer
informações adicionais às advindas da classificação baseada em alterações
genéticas, para guiar a intervenção terapêutica (4,73,79,81,82).
Utilizando citometria de fluxo para estudar sinalização celular, Irish et al.
(2004) demonstraram que blastos leucêmicos derivados de diferentes subtipos de
LMA apresentaram ativação de diferentes vias de sinalização intracelulares em
resposta aos mesmos estímulos. Demonstraram ainda que populações distintas de
blastos derivados de um mesmo paciente também manifestaram perfis diferenciados
de sinalização celular, reproduzindo a diversidade da LMA em nível de redes de
transdução de sinais em resposta a estímulos que estão presentes no nicho
leucêmico. Além disso, os diferentes perfis identificados se correlacionaram com
achados genéticos e com o desfecho da doença, sugerindo que possam ser
informativos para escolha da terapia a ser utilizada (4). Desde então, diversos
grupos têm se empenhado em avaliar o valor prognóstico associado às vias de
sinalização comumente afetadas na LMA.
Kornblau et al. (2010) analisaram funcionalmente vias de sinalização
intracelulares em blastos derivados de pacientes com LMA, na tentativa de
Introdução | 28
predizerem a resposta à quimioterapia de indução de remissão. Seus resultados
mostraram uma associação entre as vias de sinalização intracelulares moduladas e
a resposta ao tratamento. Adicionalmente, as informações prognósticas obtidas por
essa metodologia foram diferentes das provenientes de outros fatores, tais como
idade e alterações citogenéticas e moleculares, sugerindo que tais informações
devam ser combinadas para aperfeiçoar a conduta dos médicos e aumentar as
chances de sucesso da abordagem terapêutica escolhida (79).
Outro aspecto importante a respeito da caracterização da sinalização
intracelular aberrante observada nas células leucêmicas é que algumas das
proteínas envolvidas nessas vias podem se tornar alvos para o desenvolvimento de
agentes quimioterápicos. O receptor tirosina quinase Flt3, por exemplo, está mutado
em cerca de 30% das LMA (83,84). Essas mutações estão associadas ao aumento
da proliferação celular e inibição da apoptose por meio da ativação constitutiva do
receptor e de seus alvos, como Stat5 (85). Esse receptor tornou-se um alvo para o
desenvolvimento de inibidores de tirosina quinase (86–88).
Há crescentes evidências de que as irregularidades observadas nas vias de
sinalização na LMA tenham origem nos compartimentos de células-tronco e/ou
progenitoras, uma vez que muitas das células que exibem sinalização aberrante
apresentam características fenotípicas destes compartimentos celulares (74,89).
Além disso, análises de expressão gênica demonstraram que alterações nos
mecanismos de sinalização podem ser detectados nas LIC em comparação com as
CTH. Apesar de cerca de 30% dos genes modulados serem compartilhados por
ambas as subpopulações celulares (os quais provavelmente justificam as
características comuns, tais como quiescência, autorrenovação e diferenciação em
múltiplas linhagens), diversas vias de sinalização são aberrantemente reguladas nas
LIC da LMA. Muitos desses genes são bem conhecidos por seu envolvimento no
desenvolvimento do câncer e na biologia das células-tronco, tais como: vias de
sinalização Notch, Wnt e MAPK, além de proteínas de adesão (90,91). Esses
resultados demonstram que compreender como essas vias são diferencialmente
reguladas em LIC e CTH poderia esclarecer mecanismos fundamentais que
governam a transformação leucêmica, além de apontar vias específicas que possam
ser alvos de agentes terapêuticos.
Entre as vias de sinalização ativas em células consideradas progenitoras da
LMA (6), estão a via STAT(92,93) e a via Ras/MAPK (94). Há evidências de que
Introdução | 29
Stat3 e Stat5 estejam constitutivamente ativadas na LMA, e de que os padrões de
ativação em resposta ao G-CSF podem estar associados ao desfecho clínico
(82,95,96). Além disso, a interação da via STAT com outras vias de sinalização
associadas a receptores de fatores de crescimento hematopoiéticos, entre as quais
a MAPK, pode desempenhar um papel na transformação oncogênica. A ativação da
via MAPK também foi demonstrada na LMA, e uma interação direta entre essas vias
foi sugerida (97–99).
Uma vez que muitas terapias dirigidas contra alvos moleculares consistem em
inibidores de proteínas envolvidas na transdução de sinal ou anticorpos monoclonais
contra receptores de fatores de crescimento, identificar vias de sinalização
aberrantes da LMA, com o objetivo de utilizar uma terapia específica, é um dos
principais objetivos dos estudos de genômica do câncer (25,30,100–103). Por
exemplo, moléculas sinalizadoras como Akt e Erk1/2 parecem estar promiscuamente
ativadas em muitos tipos de câncer, e são, portanto, consideradas bons alvos para
terapia (104). Na LMA, mutações clinicamente relevantes em proteínas sinalizadoras
estão frequentemente associadas com aumento da atividade de Stat5, como é o
caso das mutações nos genes KIT e FLT3 (85,101,105).
2 OBJETIVOS
Objetivos | 31
2.1 Objetivo geral
Determinar
se
as
subpopulações
de
células
CD34+CD38-ALDHhigh,
enriquecidas em CTH, e CD34+CD38-ALDHint, enriquecidas em LIC, apresentam
diferentes perfis de sinalização e de metilação do DNA gênomico.
2.2 Objetivos específicos
•
Avaliar o potencial de enxertia em longo-prazo das células humanas
CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint em camundongos
NOD.CG-PRKDCSCID IL2RGTM1WJL/SZJ (NSG);
•
Avaliar a expressão das formas fosforiladas das proteínas Stat-3 (P-Stat3),
Stat5 (P-Stat5), Erk (P-Erk) e Akt (P-Akt) nas vias canônicas
moduladas por G-CSF, IL-6 e SCF nas duas subpopulações
celulares acima;
•
Comparar a expressão das fosfoproteínas citadas nas células-tronco
hematopoiéticas isoladas de doadores saudáveis e de pacientes
com LMA, na presença ou não de G-CSF, IL-6 e SCF;
•
Determinar se a metilação global genômica se distribui em padrões
específicos
em
células CD34+CD38-ALDHhigh e
CD34+CD38-
ALDHint, isoladas de pacientes com LMA, e células CD34+CD38ALDHhigh, isoladas de indivíduos saudáveis.
3 MÉTODOS
Métodos | 33
3.1 Separação das subpopulações celulares ALDHHIGH e ALDHINT a partir de
subpopulações CD34+CD38- de pacientes com LMA
Sempre que possível, foi estudado material excedente de amostras frescas
enviadas para diagnóstico de LMA no referido centro, após sua confirmação.
Foram estudadas também amostras congeladas, pertencentes ao banco de
células de nosso laboratório. Nos casos de amostras criopreservadas, algumas
medidas foram tomadas para evitar a formação de grumos de células durante o
processo de descongelamento. As células foram descongeladas em tubos Falcon
de 50mL contendo 10mL de RPMI 1640 (Gibco, EUA) acrescido de 10% de soro
bovino fetal (Invitrogen, EUA), 50.000U de DNAse I e 500U de heparina, e
centrifugadas a 1500rpm por 5min à temperatura ambiente. Ao fim da
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e mais 50.000U de DNaseI foram
adicionadas diretamente ao pellet celular, e os tubos foram levados ao vortex,
alternando-se este procedimento com agitação manual por pelo menos 2min
para evitar a formação de grumos. Posteriormente, 10mL de meio + SBF foram
adicionados, seguindo-se nova centrifugação nas mesmas condições. Após o
descarte do sobrenadante, as células foram ressuspendidas no tampão do
ALDEFLUOR™ (STEMCELL Technologies, Canadá) e foi realizada a marcação
com este reagente, seguindo-se as recomendações do fabricante, e incubação
em banho-maria a 37°C por 40min. Após este período, foi realizada uma lavagem
com o próprio tampão para retirar o excesso de reagente, e foi realizada a
marcação com os anticorpos de superfície anti-CD34-PECy5 e anti-CD38eFluor650 em geladeira por 15min. Após nova lavagem em tampão do
ALDEFLUOR™
(STEMCELL
Technologies,
Canadá),
as
células
foram
ressuspendidas em 300µL do mesmo tampão e levadas para separação celular
no citômetro de fluxo JSAN (Bay Bioscience, Japão).
Para separação das subpopulações celulares de interesse, foram
selecionadas inicialmente as células viáveis, com base em uma gate definida pelo
perfil SSC x FSC sem anticorpos. Cumpre ressaltar que a conversão do substrato
da Aldh em seu composto fluorescente requer que as células estejam vivas, e
que a utilização do reagente ALDEFLUOR™(STEMCELL Technologies, Canadá)
não afeta significativamente a viabilidade celular, nem sua capacidade de
Métodos | 34
repopulação (35). Dentro dessa gate, foram selecionadas as células CD34+CD38-,
tendo como referência controles positivos para cada uma das proteínas de
superfície. Em seguida, a atividade da Aldh foi analisada dentro da subpopulação
CD34+CD38-.
Após a separação, as subpopulações celulares foram subdivididas para os
experimentos de xenotransplante em camundongos NSG e fosfo-flow (Figura 1).
Ainda, uma fração destas subpopulações foi congelada para a análise de metilação
genômica global, posteriormente.
+
-
high
+
-
Figura 1 – Esquema de separação das subpopulações CD34 CD38 ALDH
e CD34 CD38
int
ALDH por citometria de fluxo e sua subsequente utilização para xenotransplante e fosfo-flow.
As gates estabelecidas para separação celular foram baseadas na atividade da Aldh dentro da
+
população de células CD34 CD38 . Após separação, cada subpopulação foi subdividida em duas
frações: uma destinada ao xenotransplante e a outra aos estudos da sinalização celular (fosfo-flow).
Cada amostra de LMA foi transplantada em dois grupos de camundongos NSG. Os experimentos de
sinalização celular também foram realizados com as duas subpopulações paralelamente, nas
seguintes condições: um tubo sem estímulo, e tubos estimulados com G-CSF (20ng/100µL), IL-6
(50ng/100µL) ou SCF (100ng/100µL).
Métodos | 35
3.2 Xenotransplante em camundongos NOD.CG-PRKDCSCID IL2RGTM1WJL/SZJ
(NSG) das subpopulações celulares obtidas
Os experimentos com animais foram realizados após aprovação pelo Comitê
de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade de São Paulo (Processo
número: 018/2013-1). Após a separação celular no citômetro, as subpopulações
celulares foram recuperadas em PBS 2% SBF e imediatamente transplantadas em
fêmeas NSG de oito a doze semanas. Quantidades equivalentes das duas
subpopulações celulares foram transplantadas em dois grupos (ALDHhigh e ALDHint)
contendo dois ou três animais cada, dependendo do rendimento obtido após
separação no citômetro de fluxo. Após anestesia com isofluorano, os transplantes
foram realizados na tíbia direita dos camundongos, utilizando-se uma seringa de
insulina 0,5mL inserida diretamente no espaço medular da tíbia previamente
tricotomizada e submetida à antissepsia com álcool 70% (75). Após o transplante, os
camundongos foram colocados em mini-isoladores com água e ração autoclavadas
ad libitum. Estes mini-isoladores foram alocados em rack ventilada de pressão
positiva (Alesco®, Brasil), equipada com filtros HEPA (do inglês, High Efficient
Particle Air filter).
3.3 Avaliação da enxertia das células humanas transplantadas
A avaliação da enxertia foi realizada cerca de 10 semanas após o transplante.
Os animais foram sacrificados em câmara de CO2, e suas tíbias e fêmures foram
macerados, utilizando-se um cadinho e um pistilo, para que se obtivesse um maior
rendimento das células da medula óssea. Os baços também foram processados. As
células foram distribuídas em tubos de citometria, marcadas com anticorpos antiCD45-FITC humano e anti-CD45-PercP murino, ambos da BD Biosciences, e
incubadas por 15min protegidas da luz. Em seguida, adicionou-se 2mL de FACS
Lysing Solution (BD Biosciences, EUA) e os tubos foram incubados por 10min a 4°C.
As células foram então lavadas em 4mL de PBS NaN3 0,1% + 4% SBF, fixadas em
PBS NaN3 0,1% + 4% SBF formol 1% e mantidas protegidas da luz até o momento
Métodos | 36
da leitura no citômetro. O percentual de enxertia foi calculado como: percentual de
células humanas CD45+ dividido pela soma do percentual de células humanas
CD45+ com o percentual de células murinas CD45+ (hCD45+/(hCD45++mCD45+).
Considerou-se que houve enxertia quando o percentual de células positivas para o
CD45 humano foi ≥0,1%. A mesma marcação em um animal não-transplantado foi
realizada como controle negativo.
3.4 Avaliação das vias de sinalização celular por citometria de fluxo
A sinalização celular das vias JAK/STAT, MAPK e PI3K/AKT foi avaliada nas
subpopulações obtidas após separação no citômetro de fluxo. Devido ao número
limitado de células obtidas, optamos por analisar primordialmente a fosforilação de
Stat3 em resposta a G-CSF e IL-6, e de Stat5 em resposta a G-CSF, devido à
aplicabilidade clínica que esses resultados poderiam apresentar (82). Nos casos em
que um número maior de células foi obtido, os níveis de fosforilação de Erk e Akt em
resposta ao SCF também foram estudados. As citocinas e fatores de crescimento
foram produzidas pela Peprotech (Peprotech, EUA) e os anticorpos específicos para
proteínas fosforiladas foram adquiridos da BD Bioscience (BD Bioscience, EUA).
3.4.1
Estímulo
com
citocinas/fatores
de
crescimento
e
análise
das
fosfoproteínas intracelulares
As células destinadas aos experimentos de sinalização celular foram
separadas em meio StemSpan™(STEMCELL Technologies, Canadá) sem soro e
mantidas em incubadora a 37ºC e atmosfera de 5% CO2 por uma hora, antes de
serem estimuladas com as respectivas citocinas/fatores de crescimento (106).
A abordagem utilizada para avaliação do status de ativação da via JAK/STAT
foi o monitoramento da fosforilação 705 em Stat3 e da tirosina 694 em Stat5. Em
relação à via MAPK, monitorou-se a fosforilação da treonina 202 e da tirosina 204
em Erk1 e da treonina 184 e da tirosina 186 em Erk2. Para avaliar a modulação da
Métodos | 37
via PI3K, avaliou-se a fosforilação da serina 473 em Akt. As células foram ou não
estimuladas com: G-CSF (20ηg/100µL), IL-6 (50ηg/100µL) ou SCF (100ηg/100µL).
Em seguida, as células foram mantidas em estufa a 37ºC e atmosfera de 5% CO2
por 15min, quando foram imediatamente fixadas com formaldeído (na concentração
final de 1,6%) por 10min à temperatura ambiente. Após lavagem em PBS NaN3 0,1%
+ 4% SBF, as células foram permeabilizadas com 500µL de metanol e mantidas em
gelo na geladeira por 30min. Passado esse tempo, elas foram novamente lavadas
em PBS NaN3 0,1% + 4% SBF, centrifugadas a 300 x g por 5min, marcadas com os
anticorpos Alexa Fluor® 488 Mouse Anti-Stat3, Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Stat5,
Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-ERK1/2 ou PE Mouse anti-Akt (pS473) e incubadas
por meia hora protegidas da luz, à temperatura ambiente. Passado esse tempo,
procedeu-se com a lavagem em PBS NaN3 0,1% + 4% SBF, centrifugação a 300 x g
por 5min, descarte do sobrenadante e ressuspensão das células em PBS NaN3
0,1% + 4% SBF formol 1%. Elas foram mantidas em geladeira até o momento da
aquisição e análise no citômetro.
3.4.2 Tratamento com inibidores de fosfoproteínas
Tubos individuais contendo alíquotas com números equivalentes de células
para cada uma das amostras foram utilizados para estimulação ou tratamento com
os inibidores, em volumes de 100µL. Os controles adequados foram processados
simultaneamente. A inibição foi realizada com um coquetel contendo: Wortmannin
10mM (inibidor de PI3K), PD 98059 10mM (inibidor de MAPK/ERK), SB 202190
10mM (inibidor de p38 MAPK), BAY 11-7085 20mM (inibidor de IκBα), Ruxolitinib
10mM (inibidor de JAK1/2). Os tubos foram incubados a 37°C por 30min, quando
então foram adicionados os estímulos nos tubos correspondentes. Os passos
seguintes foram realizados de acordo com o protocolo convencional para fosfo-flow.
Métodos | 38
3.5 Enhanced Reduced Representation Bisulfite (ERRBS)
Nós utilizamos uma versão aprimorada do reduced representation bisulfite
sequencing (ERRBS), com cobertura genômica extendida, para comparar a
metilação genômica global entre as subpopulações celulares CD34+CD38-ALDHhigh e
CD34+CD38-ALDHint. Esta abordagem possibilita o enriquecimento de regiões do
genoma ricas em CG, o que reduz o total de sequenciamento necessário (e os
custos do procedimento), enquanto captura a maior parte dos promotores e outras
regiões genômicas relevantes localizadas fora das tradicionais ilhas CpG (Akalin et
al., 2012; Gu et al., 2011). Este método requer quantidades extremamente baixas de
DNA, uma condição necessária para as populações celulares altamente purificadas
que estudamos, sendo adequado para pelo menos 500 células. ERRBS foi realizado
de acordo com o protocolo descrito por Gu et al. (2011), com ligeiras modificações.
Os experimentos de ERRBS foram realizados no laboratório do professor Daniel
Diniz de Carvalho, na Universidade de Toronto, Toronto, Canadá.
Quinze amostras foram submetidas ao protocolo de ERRBS: cinco amostras
de doadores saudáveis, duas amostras de subpopulações ALDHhigh isoladas de
pacientes com LMA, pareadas com suas respectivas subpopulações ALDHint, e seis
amostras apenas de subpopulações ALDHint.
3.5.1 Extração do DNA
Após a separação celular descrita no item 3.1, o DNA dessas células foi
extraído utilizando-se o protocolo do laboratório do professor De Carvalho, destinado
a amostras com número limitado de células. Foi utilizado um tampão de lise
desenvolvido no respectivo laboratório, composto de: 1M Tris-HCl, 0,5M EDTA,
10%SDS, 5M NaCl, RNase (50ηg/μL), proteinase K (1μg/μL). O DNA foi mantido a
-20°C até ser enviado para o Canadá.
Métodos | 39
3.5.2 Quantificação do DNA
A quantificação de DNA foi realizada utilizando-se o kit Quant-iT™
PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen, EUA), o qual permite a detecção de no
mínimo 25ρg/mL de dsDNA (50pg dsDNA em um volume de 2mL) por meio de um
espectrofluorômetro padrão. Cinco microlitros de cada amostra foram adicionados a
microplacas de 96 poços, juntamente com 189µL de TE buffer 1x, 5µL de água e
1µL do reagente Picogreen®. Uma curva padrão de cinco pontos foi preparada,
variando entre 0 – 2.500ρg. Após 5min de incubação, as amostras foram excitadas a
480ηm e a intensidade de emissão de fluorescência foi medida a 520ηm por um
espectrofluorômetro. A intensidade de emissão de fluorescência foi representada
versus a concentração de DNA.
3.5.3 Digestão com MspI
As amostras de DNA foram digeridas com a endonuclease de restrição MspI
(C↓CGG). Esta enzima é insensível à metilação em CpG, de modo que todos os
fragmentos resultantes da digestão com MspI, grandes ou pequenos, contêm dois
CpG terminais.
As reações de digestão com MspI foram preparadas de acordo com a tabela
abaixo. Depois de misturar bem, as reações foram incubadas a 37°C por 16h.
Tabela 1 – Reagentes usados para digestão com MspI
Componente
Digestão
Volume
final/Concentração
Água
NEB buffer 2 (10x)
DNA genômico
−1
MspI (20 U µl )
Total
até 80µL
10 µL
10ηg
10µL
100µL
1x
−1
0.1 ηg µl
200U
Para parar as reações de digestão, 1µl de EDTA 0.5M foi adicionado a cada
tubo, e misturado bem com o auxílio de um vortex.
Métodos | 40
3.5.4 Purificação do DNA após reações enzimáticas
Após parar a digestão, adicionou-se tampão TE até completar o volume de
200µL. Os tubos foram homogeneizados em vortex por 30s e brevemente
centrifugados. Em uma capela de exaustão, o mesmo volume (200µL) de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1, vol/vol/vol) foi adicionado, e então os
tubos foram levados ao vortex por pelo menos 30s. As amostras foram centrifugadas
a 14,000g por 5min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi cuidadosamente
transferido para um novo tubo. Os reagentes descritos abaixo foram adicionados, os
tubos foram levados ao vortex para que seu conteúdo fosse bem homogeneizado e
as amostras foram mantidas a -20°C overnight.
Tabela 2 – Reagentes utilizados para purificação do DNA
Reagente
Glicogênio
Volume
0.5µL
NaCl 5M
10µL
Etanol (100%)
500µL
Após a incubação overnight, as amostras foram centrifugadas a 16000 x g por
30min a 4°C. O sobrenadante foi aspirado com o auxílio de uma pipeta de 1mL e
descartado. Em seguida, 500µl de etanol 70% (vol/vol) foram adicionados ao pellet,
seguindo-se uma centrifugação a 16000 x g por 10min a 4°C. O sobrenadante foi
aspirado e descartado e os tubos foram novamente centrifugados a 16000 x g por
2min à temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante utilizando uma
pipeta de 20µl, os tubos foram mantidos abertos por 5min para que os pellets
secassem. Em seguida, eles foram ressuspendidos em 15µL de tampão EB (Qiagen,
Alemanha).
Métodos | 41
3.5.5 Reparo das extremidades e adenilação dos produtos da digestão por
MspI
As reações de reparo das extremidades foram realizadas como descrito na
Tabela 3. Uma master mix foi preparada e alíquotas foram dispensadas em cada
tubo, seguindo-se agitação por vortex e rápida centrifugação.
Tabela 3 – Reagentes utilizados nas reações de reparo das extremidades dos produtos da digestão
por MspI
Solução de trabalho
DNA digeridoo por MspI
T4 DNA polimerase
Klenow DNA polimerase
T4 polinucleotídeo quinase
Premix de dNTPs (10mM each)
Tampão da T4 DNA ligase
Água
Total
3000U/mL
5000U/mL
10000U/mL
Volume
30µL
5µL
1µL
5µL
4µL
10µL
45µL
100µL
Final
15U
5U
50U
As reações foram incubadas a 20°C por 30min. O DNA foi então purificado
com o QIAquick PCR purification kit e eluído em 32µL de tampão EB (Qiagen,
Alemanha). A etapa de purificação foi seguida pela reação de ligação da cauda poliA, como descrito abaixo.
Tabela 4 – Reação de adenilação do DNA reparado
Solução de
trabalho
DNA reparado
Klenow fragment
T4 polinucleotídeo quinase
dATP
NEB buffer (10x)
Total
5000U/mL
10000U/mL
1mM
Volume
32µL
3µL
5µL
10µL
5µL
50µL
Final
15U
50U
0.2mM
As reações foram incubadas a 37°C por 30min. O DNA foi purificado com o
MiniElute PCR purification kit da (Qiagen, Alemanha) e eluído em 10µL de tampão
EB (Qiagen, Alemanha). A purificação foi seguida pela ligação aos adaptadores
Illumina, como descrito abaixo.
Métodos | 42
Tabela 5 – Ligação dos adaptadores Illumina aos fragmentos poliadenilados
DNA poliadenilado
Tampão da T4 ligase (10x)
Adaptadores metilados* (15µM)
-1
T4 DNA ligase (2000U µL )
Água
Total
Volume
2µL
3µL
1.6µL
1µL
5.4µL
20µL
Final
15U
1.2µM
2000 U
* Os adaptadores devem ser adicionados diretamente a cada tubo.
As reações de ligação com os adaptadores foram incubadas a 16°C por 24h
(passo crítico). Em seguida, o DNA foi purificado com o MiniElute PCR Purification
kit (Qiagen, Alemanha) e eluído em 24µL de tampão EB (Qiagen, Alemanha).
3.5.6 Conversão por bissulfito
A conversão por bissulfito foi realizada com o Imprint® DNA Modification kit
(Sigma, EUA), seguindo-se as recomendações do fabricante para pequenas
quantidades de DNA (>5ηg). Após a purificação dos produtos modificados, o DNA foi
eluído em 14µL de tampão EB (Qiagen, Alemanha).
3.5.7 Seleção por tamanho dos fragmentos de DNA ligados aos adaptadores
As amostras de DNA foram misturadas a corantes de alta densidade, para
evitar contaminação cruzada entre amostras que flutuassem para fora dos
respectivos poços, e aplicadas no gel, de modo que três poços vazios fossem
deixados entre duas amostras adjacentes. Um marcador de peso molecular de foi
aplicado nos poços externos. As corridas ocorreram em géis de agarose low-melting
3% a 5V x cm
–1
, até que o azul de bromofenol estivesse a 6–7cm de distância dos
poços onde as amostras foram aplicadas. Ao final da corrida, as canaletas contendo
os marcadores de peso molecular foram excisadas do gel e visualizadas em
transiluminador. As posições correspondentes a fragmentos de DNA com 160bp e
Métodos | 43
350bp (indicando a localização de fragmento de restrição entre 40bp e 220bp
ligados a adaptadores, respectivamente) foram marcadas fazendo-se buracos no gel
com o auxílio de uma fina ponteira de 20µL. Os fragmentos de gel contendo os
marcadores de peso molecular foram alinhados com a parte não corada, contendo
as amostras de DNA e, após a marcação das regiões de interesse (fragmentos de
DNA com 160bp e 350bp), os respectivos fragmentos foram excisados do gel,
utilizando-se uma gilete limpa para cada amostra.
Cada fragmento do gel foi
transferido para tubos cônicos de 15mL, e o DNA foi purificado com o MinElute gel
extraction kit (Qiagen, Alemanha), seguindo-se as instruções do fabricante. Duas
colunas foram utilizadas para cada fragmento de gel. O DNA foi eluído em 11µL de
tampão EB (Qiagen, Alemanha) pré-aquecido (65°C) por coluna.
3.5.8 Validação do número de ciclos de PCR ideal para a construção das
bibliotecas por Q-PCR
Um microlitro do DNA selecionado pelo tamanho no item anterior foi utilizado
para o teste de eficiência de ligação e para determinar o número de ciclos de PCR
ideal para a construção das bibliotecas por Q-PCR, como descrito a seguir. Para as
reações de PCR, as amostras foram desnaturadas a 98°C por 45s, e submetidas a
25 ciclos de desnaturação a 98°C por 15s, anelamento a 60°C por 30s e extensão a
72°C por 30s.
Tabela 6 – Reagentes utilizados para as reações de Q-PCR
Reagentes
2x KAPA HiFiSeq HS Uracil+
SYBR green (10x)
PCR primer mixture (2.5 µM)
DNA
Água
Total
Volume
5µL
1µL
1.2µL
1µL (2x diluído)
1.8µL
10µL
Ao final das reações, o cycle threshold (Ct) foi selecionado e o número ideal
de ciclos a serem utilizados na preparação final das bibliotecas de ERRBS foi
determinado para cada amostra. As reações de PCR foram realizadas como descrito
Métodos | 44
abaixo, nas seguintes condições: desnaturação a 98°C por 45s, seguida por
desnaturação a 98°C por 15s, anelamento a 60°C for 30s e extensão a 72°C por
30s, pelo número de ciclos previamente determinado por Q-PCR, seguindo-se uma
extensão final a 72°C por 1min.
Os produtos de PCR foram purificados com 90µL de AMPure XP magnetic
beads (Beckman Coulter, EUA). Após homogeneização por pipetagem 10 vezes, as
amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 15min, homogeneizando-se
novamente a cada 5min. Em seguida, os tubos foram inseridos em suportes
magnéticos DynaMag-2 (Life Technologies, EUA) por 10min, até que a solução
ficasse transparente.
A fase aquosa foi cuidadosamente descartada com uma
pipeta e 200µL de etanol 70% (vol/vol) foram adicionados a cada tubo, sem
perturbar as beads magnéticas acumuladas na região do tubo em contato com o
suporte magnético. Após incubação por 5min, o etanol foi descartado. Este passo
foi repetido mais uma vez e, após descartar o etanol, os tubos foram mantidos
abertos para secarem por 5min. Os tubos foram removidos dos suportes magnéticos
e 40µL de tampão EB (Qiagen, Alemanha) foram adicionados às beads acumuladas
na parede do tubo, para serem lavadas. Os tubos foram novamente posicionados no
suporte magnético para separar as beads da solução, e a solução contendo o DNA
foi transferida para um novo tubo limpo, sem perturbar as beads.
Tabela 7 – Reagentes utilizados para construção das bibliotecas
Reagentes
2x KAPA HiFiSeq HS Uracil+
PCR primer mixture (2.5 µM)
DNA
Total
Volume
25µL
6µL
19µL
50µL
3.5.9 Validação das bibliotecas
Após o passo de amplificação, os produtos de PCR purificados foram
aplicados em chips Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Alemanha) para
quantificar as bibliotecas de ERRBS, e para avaliar se a distribuição dos tamanhos
dos fragmentos da biblioteca se apresentava como esperado.
4 RESULTADOS
Resultados | 46
Foram estudadas amostras de 22 pacientes com LMA, coletadas ao
diagnóstico e/ou na recaída: 21 amostras foram coletadas ao diagnóstico e quatro,
na recaída. Suas características estão resumidas na Tabela 8. As amostras não
foram consecutivas e, portanto, a distribuição das alterações genéticas identificadas
não foi representativa da população. Para validação do potencial de autorrenovação
e diferenciação das duas subpopulações de células de interesse, foram realizados
14 xenotransplantes, dos quais 13 com amostras coletadas ao diagnóstico e um com
amostra de recaída (P12 – Tabela 8). Para os estudos de fosfo-flow, 16 amostras
foram analisadas, mas duas delas foram posteriormente excluídas devido a
variações nos protocolos utilizados (P4 e P20 – Tabela 8). Oito amostras foram
analisadas pelos dois procedimentos. Uma amostra rendeu material suficiente
apenas para realização de ERRBS (P14 – Tabela 8) e uma amostra foi destinada ao
ensaio de diluição limitante in vivo (LDA, do inglês Limiting-dilution Analysis), para
estimar a frequência de células-tronco contidas em cada subpopulação.
Tabela 8 – Características dos pacientes cujas amostras foram incluídas neste estudo
Paciente
P1
P2
¥
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
¤
P12
P13
P14
P15
¥
P16
¥
P17
P18
P19
P20
P21
P22
Idade
(anos)
62
51
72
54
0.6
70
1.6
20
7
72
77
33
20
74
48
6
40
6
74
64
21
26
Células
+
CD34 (%)
<1
10
<1
56
<1
80
32
27
25
<1
1
43
6
6
93
34
<1
92
87
92
94
89
Células
Transplantadas
3
2,5 x 10
4
2x10
NR
4
2x10
NR
3
2x10
NR
3
4
10 ou10
3
5 x 10
3
6,2 x 10
NR
6
7
5 x 10 ou 10
4
1x10
NR
3
3,5 x 10
NR
NR
3
2,5x10
NR
3
5x10
3
2x10
3
3x10
Estímulos
G-CSF, IL-6
G-CSF, IL-6, SCF
NR
G-CSF, IL-6
G-CSF, IL-6
G-CSF, IL-6, SCF
G-CSF, IL-6, SCF
NR
G-CSF, IL-6, SCF
G-CSF, IL-6
G-CSF, IL-6
G-CSF, SCF
G-CSF, IL-6, SCF
NR
NR
G-CSF
G-CSF
G-CSF
G-CSF
G-CSF, IL-6, SCF
NR
NR
Perfil
Genético
t(8;21)
t(8;21)
t(8;21)
t(8;21)
inv(16)
inv(16)
inv(16)
inv(16)
FLT3-ITD
FLT3-ITD
FLT3-ITD
FLT3-ITD
46; XY
46; XY
46; XY
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
GB, glóbulos brancos; * contagem de leucócitos ao diagnóstico; ¥ paciente analisado ao
diagnóstico e na recaída; ¤ paciente analisado só na recaída; NR, não realizado; ND, não
determinado.
Resultados | 47
4.1 Identificação de diferentes perfis de atividade da ALDH em doadores
saudáveis e pacientes com LMA ao diagnóstico
Figura 2 – Padrões de marcação com Aldefluor de amostras de medula óssea de doadores
saudáveis e de pacientes com leucemia mieloide aguda ao diagnóstico. A avaliação da atividade
da Aldh identifica duas subpopulações em medulas ósseas normais (à esquerda) e três em medulas
ósseas de pacientes com LMA (à direita).
No compartimento celular CD34+CD38-, foram identificadas apenas duas
subpopulações de acordo com a atividade da Aldh (ALDHlow e ALDHhigh) na medula
óssea normal (Figura 2 à esquerda); já em indivíduos com LMA (Figura 2 à direita),
uma terceira subpopulação foi identificada, a qual apresentou atividade intermediária
da Aldh (ALDHint). Em cada procedimento de separação celular, isolamos as
subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint, as quais acredita-se
que estejam enriquecidas em CTH e LIC, respectivamente, como descrito por
Gerber et al. (2012) (45). Esses autores demonstraram que níveis intermediários de
atividade da Aldh caracterizaram uma subpopulação celular CD34+CD38- que podia
ser detectada no diagnóstico e cuja identificação durante a remissão completa se
correlacionou com subsequente recaída clínica. Adicionalmente, as células
CD34+CD38-ALDHint geraram enxertia leucêmica após transplante em camundongos
NSG (detectada por FISH).
Para descrever os resultados deste trabalho de agora em diante, estas
subpopulações celulares serão chamadas de ALDHhigh (CD34+CD38-ALDHhigh) e
ALDHint (CD34+CD38-ALDHint). As células ALDHhigh foram raras nas amostras
colhidas no momento do diagnóstico, sendo a percentagem média de 0,54%
(intervalo: 0,02 – 3,11%) do total de células CD34+CD38-. Gerber et al. (2012)
descreveram um percentual médio de 0,12% (intervalo: 0,005%-0,5%) para esta
Resultados | 48
subpopulação. Em duas das nossas amostras, caracterizadas por portar cariótipos
normais, foram detectados percentuais elevados de células ALDHhigh (17,6% e 74%
das células CD34+CD38-), e foram excluídas do cálculo do percentual médio desta
subpopulação. Um dos pacientes era portador da mutação FLT3-ITD e ambos
apresentaram doença refratária primária e morreram menos de um ano após o
diagnóstico. Gerber et al. (2012) também observaram células predominantemente
ALDHhigh na subpopulação CD34+CD38- de um paciente com cariótipo normal e
mutação FLT3-ITD, que também apresentou refratariedade primária e teve
sobrevida curta. Em relação às células ALDHint, o percentual médio detectado em
nosso estudo foi 82,68% (7,9 – 98,7%).
4.2 Xenotransplantes das subpopulações CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38ALDHint em camundongos NSG
Após o isolamento no citômetro de fluxo, quantidades equivalentes de células
das subpopulações ALDHhigh e ALDHint de cada paciente foram transplantadas em
camundongos NSG. O número de células transplantadas variou entre experimentos em
função do número de células ALDHhigh, as quais, exceto em uma amostra, foram
sempre menos frequentes, corroborando os dados da literatura (GERBER et. al, 2012).
Cerca de 10 semanas após o transplante, avaliou-se e comparou-se a
enxertia das subpopulações transplantadas entre os grupos de animais. Os animais
foram sacrificados e as células da medula óssea das tíbias e fêmures, bem como do
baço, foram processadas e marcadas com os anticorpos para avaliação da
percentagem de células humanas e murinas (quimerismo) e determinação da
linhagem celular enxertada.
Para nos certificarmos da eficácia do modelo de transplante utilizado, uma
vez que percentuais sempre muito baixos de células humanas CD45+ eram
recuperadas dos animais, foi feito um xenotransplante de medula óssea total de uma
recaída de LMA, na qual havia sido detectada a mutação FLT3-ITD, tanto no
diagnóstico, quanto na recaída (P12 – Tabela 8). Dois grupos de três animais foram
transplantados: um com 5x106 células e outro com 107 células. Seguindo-se o
protocolo convencional, os animais foram sacrificados 10 semanas após o
Resultados | 49
transplante e as células da medula óssea e do baço foram marcadas com dois
coquetéis de anticorpos: um contendo CD45 humano e murino (conjugados a FITC e
PerCP, respectivamente) e outro contendo CD45-FITC, CD11b-PE, CD3-PerCP e
CD19-APC, todos humanos. Um animal não transplantado foi utilizado como
controle
do
experimento.
Todos
os
animais
transplantados
apresentaram
esplenomegalia facilmente detectável. A enxertia de células humanas CD45+ variou
de 50 a 72%. Estas células também foram detectadas nos baços dos animais,
embora em menor número (1 – 4,5%) (Figura 3). Não houve diferença na enxertia
entre os grupos transplantados com 5 x106 ou 107 células. Todas as células
humanas detectadas nos camundongos eram CD11b+, CD3- e CD19-.
+
Figura 3 – Representação da análise de enxertia das células humanas CD45 por meio de
citometria de fluxo. Cinco ou dez milhões de células de uma amostra de recaída de LMA foram
transplantadas em camundongos NSG. Os gráficos tipo dot plot ilustram as marcações com
anticorpos anti-CD45 FITC humano e anti-CD45 PerCP murino das células de medula óssea e baço,
cerca de dez semanas após o transplante. Um animal não transplantado foi analisado como controle.
4.2.1 Avaliação da enxertia nos camundongos
Os resultados dos transplantes são apresentados na Tabela 9. Detectou-se
enxertia em 8/12 (66,6%) das amostras transplantadas (Figura 3). Em três delas,
houve enxertia de apenas uma subpopulação: duas apenas ALDHhigh e uma apenas
ALDHint. Não foi observada vantagem na enxertia da subpopulação celular
Resultados | 50
enriquecida em LIC (12/31 enxertos nos animais transplantados com células
ALDHhigh versus 12/32 enxertos nos animais transplantados com células ALDHint).
Tabela 9 – Resumo dos resultados dos experimentos de xenotransplante
Paciente
Número de
células
transplantadas
P1
2,5 x 10
P2
2 x 10
4
2 x 10
4
2 x 10
3
5 x 10
3
P4
P6
P9
P10
6,2 x 10
3
high
int
Perfil Genético
Enxertia
ALDH
(enxertos/
transplantes)
RUNX1/RUNX1T1, NPM1c+
sim
3/3
2/3
RUNX1/RUNX1T1, NPM1c+
sim
3/3
1/3
RUNX1/RUNX1T1
não
0/3
0/3
CBFB/MYH11
não
0/1
0/2
ALDH
(enxertos/
transplantes)
FLT3-ITD
sim
2/3
2/2
3
FLT3-ITD
sim
1/2
0/3
4
P13
10
46, XY
sim
1/2
3/3
P15
3,6 x 10
3
46, XY
sim
0/2
1/2
P18
2,5 x 10
3
ND
sim
1/2
0/2
P20
5 x 10
3
ND
sim
1/2
3/4
2 x 10
3
ND
não
0/2
0/3
3 x 10
3
ND
não
0/2
0/2
P21
P22
ND, não detectado.
Figura 4 – Avaliação por citometria de fluxo da enxertia das subpopulações celulares
+
high
+
int
CD34 CD38 ALDH
e CD34 CD38 ALDH isoladas de pacientes com leucemia mieloide
aguda. Os animais transplantados foram sacrificados entre 10 e 12 semanas após os transplantes.
As células da medula óssea e/ou baço foram marcadas com anticorpos anti-CD45 humano (hCD45FITC) e murino (mCD45-PerCP). Um animal não transplantado foi analisado simultaneamente como
controle negativo. Para estabelecer a gate correspondente às células humanas, as mesmas
marcações foram realizadas em animais transplantados com medula óssea total de LMA e cujo
quimerismo foi superior a 60%.
Para avaliação dos xenotransplantes, consideramos que houve enxertia das
células transplantadas quando foi detectado percentual igual ou maior a 0,1% de
células positivas para hCD45-FITC na amostra (106–108). Considerando-se os
Resultados | 51
casos em que houve enxertia de células humanas na medula óssea murina, os
percentuais observados para as subpopulações ALDHint e ALDHhigh variaram entre
0,11 - 0,52% e 0,1 - 2,67%, respectivamente (Tabela 10).
Tabela 10 – Percentual médio de células hCD45+ detectado nas amostras de medula óssea dos
animais submetidos ao xenotransplante nos quais se considerou haver enxertia de células humanas
Número de células
transplantadas
33
10 5x10
CD34+CD38-ALDH
int
CD34+CD38-ALDH
0.22
0.18
3
4
0.3
0.32
4
4
0.26
0.76
5x10 - 1x10
1x10 - 2x10
high
O potencial de enxertia em longo-prazo não foi diferente entre as duas
subpopulações. Para ambas as subpopulações, o menor número de células capaz
de gerar enxertia das subpopulações ALDHhigh e ALDHint foi de 2,5x103 células
(Figura 4), e houve correlação entre o número de células transplantadas e o
percentual de células humanas recuperadas (R2=0.84, P=0.001). Para realizar esta
análise, para cada ponto correspondente ao número de células da LMA
transplantadas nos animais (ALDHhigh e ALDHint), foram considerados os maiores
percentuais de células humanas recuperados da medula óssea dos animais cerca
de dez semanas após o transplante. Os animais foram transplantados com 2x103 a
2x104 células de uma ou outra subpopulação celular, e os percentuais de células
humanas CD45+ recuperadas variaram entre 0,06 – 2,6% (Figura 5).
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
1
2
3
% Células recuperadas
Figura 5 – Análise da correlação entre o número de células injetadas e o percentual de células
recuperadas em experimentos de xenotransplante. Foram incluídos na análise os maiores
percentuais recuperados em cada dose transplantada, considerando-se as subpopulações celulares
high
int
3
4
ALDH
e ALDH . O número de células injetadas variou entre 2x10 e 2x10 , e o percentual de
2
células recuperadas variou entre 0,06 e 2,6%. R =0,84; P=0,001.
Resultados | 52
Nós não obtivemos sucesso em caracterizar a hematopoiese originada pelas
subpopulações transplantadas, a fim de validá-las como sendo normais ou
leucêmicas. Há indícios de que isso possa ter decorrido do baixo percentual de
células humanas recuperadas após os transplantes, o que dificulta a análise da
coexpressão de marcadores de linhagem nas células humanas CD45+. Esta
hipótese é reforçada pelos resultados do experimento de xenotransplante realizado
com medula óssea total de um paciente com LMA, no qual foi possível demonstrar
claramente que as células enxertadas eram mieloides (Figura 6).
Figura 6 – Análise dos marcadores de linhagens em células humanas CD45+ recuperadas da
medula óssea de camundongos NSG transplantados com amostra de medula óssea total de
um paciente com leucemia mieloide aguda. As células foram marcadas com os anticorpos
específicos para antígenos humanos: anti-CD45-FITC, anti-CD11b-PE, anti-CD3-PerCP e anti-CD19APC. Inicialmente, foi selecionada uma gate nas células hCD45+ e, dentro dela, foi analisada a
expressão dos marcadores de células mieloides, células T e células B, respectivamente. A ilustração
mostra e enxertia de células mieloides (CD45+CD11b+, CD3- e CD19-).
O baixo rendimento celular após a separação por citometria de fluxo também
impossibilitou a realização dos ensaios de LDA in vivo, destinados à determinação
da frequência de células-tronco em cada sobpopulação celular. Assim, optamos por
utilizar algumas amostras exclusivamente para os experimentos de LDA, na tentativa
de obter número de células adequado para realização dos transplantes. Em apenas
um caso foi possível fazer este ensaio, realizado por meio do xenotransplante em
dois grupos contendo dois animais, cada: um grupo recebeu a injeção de 103 células
de cada subpopulação de interesse, enquanto o outro recebeu 104 células.
Resultados | 53
+
-
high
Figura 7 – Análise representativa da enxertia de células humanas CD34 CD38 ALDH
ou
+
int
3
CD34 CD38 ALDH obtida por meio de ensaio de diluição limitante. Doses equivalentes a 10 ou
4
+
high
+
int
ou CD34 CD38 ALDH foram injetadas em dois grupos de animais,
10 células CD34 CD38 ALDH
contendo dois animais por dose. Os animais foram sacrificados 10 semanas após o transplante e as
células da medula óssea e baço foram marcadas com anti-CD45 FITC humano e anti-CD45 PerCP
murino para análise de quimerismo por citometria de fluxo. Considerou-se haver enxertia nos animais
+
nos quais os percentuais de células humanas CD45 detectadas foram maiores ou iguais a 0,1%.
Apesar de não ter sido possível realizar o LDA, a tentativa representada na
Figura 7 demonstra que a diferença de dez vezes entre o número de células
injetadas e recuperadas é conservada entre os grupos transplantados com células
ALDHhigh: no animal transplantado com 103 células, 0,01% de células humanas
CD45+ foram recuperadas da medula óssea, enquanto no animal transplantado com
104 células, 0,1% foi o total de células humanas detectadas na medula óssea. Por
outro
lado, não foram
detectadas
células
humanas
CD45+ nos animais
transplantados com células ALDHint, sugerindo que a frequência de células-tronco
neste grupo seja menor do que no grupo de células ALDHhigh. Este resultado deve
ser interpretado com cautela, uma vez que se refere a apenas um experimento.
4.3 Avaliação das vias de sinalização por citometria de fluxo
Nós avaliamos a expressão de fosfoproteínas das vias canônicas moduladas por
G-CSF e IL-6, dois fatores que regulam a mielopoiese normal (96), além do SCF, que
desempenha importante papel na autorrenovação e manutenção das CTH (109). Há
Resultados | 54
escassos relatos na literatura sobre estudos de fosfo-flow realizados em subpopulações
celulares raras (74,106,110). Neste trabalho, nós buscamos padrões de ativação que se
correlacionassem com propriedades da doença (grupo genético, sensibilidade ao
tratamento, entre outras), estabelecidos com base em dois tipos de referenciais: um
para avaliação do estado basal e outro para avaliação da resposta ao estímulo utilizado.
4.3.1 Validação do método fosfo-flow
Inicialmente, para garantir que o método utilizado poderia ser seguramente
empregado para detecção de fosfoproteínas nas diferentes condições analisadas,
foram realizados testes com inibidores das vias de sinalização de interesse, em
linhagens celulares e amostras de medula óssea normal. A linhagem celular da LMA
HL-60 foi utilizada para padronização do experimento.
As seguintes condições foram avaliadas: 1. sem estímulo (SE), 2. tratamento
com o coquetel de inibidores na ausência de estímulo (CQT SE), 3. tratamento com
o coquetel de inibidores, seguido por estímulo com G-CSF (CQT G-CSF), 4.
tratamento apenas com Ruxolitinib (inibidor específico da fosforilação de Stat3),
seguido por estímulo com G-CSF (Rux G-CSF) e 5. estímulo com G-CSF (Figura 8).
Figura 8 – Padronização dos inibidores de vias de sinalização em linhagem celular HL-60.
Células HL-60 foram ou não tratadas com um coquetel de inibidores (CQT) ou ruxolitinib (RUX) e
estimuladas ou não (SE) com G-CSF. A figura ilustra a fosforilação de Stat3 (e não de Stat5) por GCSF, o que não foi observado na ausência de G-CSF e na presença de inibidores. A diferença entre
os níveis de P-Stat3 na presença e na ausência de resposta ao estímulo foi de cerca de duas vezes.
Resultados | 55
No caso da linhagem celular HL-60, o tratamento com o coquetel de
inibidores de sinalização celular resultou em ausência completa de ativação
quando comparado com o tratamento com o estímulo, demonstrando que as
condições experimentais utilizadas por nós para estudo de sinalização celular
estavam satisfatoriamente estabelecidas e controladas.
Além disso, o
Ruxolitinib sozinho apresentou a mesma capacidade de inibir fosforilação de
Stat3 que o coquetel de inibidores, demonstrando que, no caso dessa linhagem
celular, este inibidor pode ter sido o responsável pelo resultado observado com
tratamento com o coquetel de inibidores no que se refere à diminuição dos
níveis de P-Stat3.
Nos experimentos realizados com amostras de doadores saudáveis (D1 e
D2), as células do D1 não apresentaram aumento expressivo dos níveis de PStat3 nas diferentes condições experimentais analisadas, enquanto as células do
D2 mostraram ativação em resposta a G-CSF e, mais expressivamente, a IL-6
(Figura 9). Já em relação à P-Stat5, os níveis constitutivos desta fosfoproteína se
mostraram bastante elevados em ambos os doadores, os quais foram ainda
maiores em resposta ao estímulo com G-CSF. Apesar da variabilidade na
resposta de ativação celular entre as diferentes condições experimentais
analisadas, o tratamento com o coquetel de inibidores resultou em níveis de
fosfo-Stats inferiores aos detectados após o tratamento com G-CSF e/ou IL-6.
Além disso, os níveis dessas fosfoproteínas na presença dos inibidores (CQT SE)
foram equivalentes entre os dois doadores estudados. Consideramos que esta
condição reflete os níveis de fosfoproteínas em um estado que pode ser admitido
como basal da via JAK/STAT.
Resultados | 56
D1
D2
CQT SE
9.56
12.41
D1
D2
CQT SE
48.7
46.14
CQT EST
11.65
17.47
CQT EST
51.4
67.32
DMSO SE
12.41
15.12
DMSO SE
51.4
59.89
MEIO SE
13.46
11.76
MEIO SE
44.91
41.79
G-CSF
12.52
22.67
G-CSF
58.82
66.12
IL-6
12.98
32.78
Figura 9 – Histogramas representativos dos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 após tratamento de
células de medula óssea normal com inibidores de Stats. Amostras de medula óssea de dois
doadores saudáveis foram ou não tratadas com um coquetel de inibidores de vias de sinalização
celular e estimuladas ou não com G-CSF ou IL-6. Histogramas representativos dos níveis de P-Stat3
(à esquerda) e P-Stat5 (à direita) nas diferentes condições experimentais analisadas. Abaixo dos
histogramas estão os valores das medianas dos canais de fluorescência para a respectiva
fosfoproteina. CQT SE, tratamento com coquetel e sem estimulação; CQT EST, tratamento com
coquetel e posterior estimulação; DMSO SE, tubo contendo a mesma concentração de DMSO
utilizada na diluição dos inibidores; MEIO SE, tubo contendo apenas meio e não estimulado; G-CSF,
tubo estimulado com G-CSF (20ηg/100µL); IL-6, tubo estimulado com IL-6 (50ηg/100µL).
Para caracterizar os níveis de fosfoproteínas nas diferentes condições e
compará-los entre os indivíduos, foram construídos heatmaps representativos de
cada experimento, o que facilita a visualização das variações nos níveis de
fosfoproteínas detectadas em cada condição analisada de maneira global, além de
possibilitar a distinção entre estados de ativação discretamente diferentes. Cada
quadrado no grid corresponde a um arquivo de citometria de fluxo multidimensional
contendo pelo menos 2000 eventos celulares. As escalas de cor dos heatmaps
variaram entre o azul escuro (valor mínimo) e o amarelo claro (valor máximo),
passando pelo preto (zero).
Resultados | 57
4.3.2 Perfil de sinalização em amostras de medula óssea normal
Inicialmente, nós objetivamos caracterizar o perfil de sinalização em amostras de
medula óssea de doadores saudáveis (D1 a D6), na tentativa de obter um referencial
para identificar respostas aberrantes em amostras de LMA, posteriormente.
Como mostrado na Figura 10, os níveis constitutivos de P-Stat3 foram
semelhantes entre os doadores saudáveis, contrariando resultados reportados por
Redell et al. (2013) referentes a experimentos realizados com medula óssea total,
onde foi observada grande variabilidade nos níveis desta fosfoproteína entre
doadores saudáveis (82). Observou-se aumento nos níveis de fosforilação de Stat3
em resposta aos estímulos utilizados nas células do D2, que apresentou um
aumento
de
aproximadamente
2
vezes
em
resposta
a
G-CSF
e
de
aproximadamente 3 vezes em resposta à IL-6 (Figura 10).
P-Stat3
P-Stat5
SE
G-CSF
IL-6
D1
D2
D3
13.34
11.76
12.98
12.19
22.67
9.78
12.63
32.49
11.04
D1
D2
D3
43.71
41.79
42.17
SE
G-CSF
58.29
66.12
38.89
D4
12.3
11.6
X
D4
24.36
25.48
Figura 10 – Heatmaps representativos da fosforilação de Stat3 e Stat5 na ausência de estímulo
+
high
e em resposta a G-CSF ou IL-6 na subpopulação CD34 CD38 ALDH
em amostras de medula
óssea de doadores saudáveis.
As células foram ou não (SE) estimuladas com G-CSF
(20ηg/100µL) ou IL-6 (50ηg/100µL). Cada quadrado na figura representa o nível da fosfoproteína em
resposta a uma condição, para cada um dos indivíduos. O campo riscado em vermelho significa que
não houve dados para análise. As tabelas mostram os valores medianos dos canais de fluorescência
para P-Stat3 ou P-Stat5, cuja intensidade variou de acordo com a escala representada.
Resultados | 58
Os níveis constitutivos de P-Stat5 foram semelhantes entre as amostras
normais analisadas, exceto no caso do D4, que apresentou valor equivalente a 57%
da média das outras amostras de doadores saudáveis. Após o estímulo com G-CSF,
os perfis de sinalização variaram entre ausência de resposta (D3 e D4) e ativação da
via com aumento de 1,6 vezes na expressão do P-Stat5. Dentre os respondedores,
D1 apresentou aumento nos níveis de P-Stat5 correspondente a 1,3 vezes e o D2,
1,6 vezes (Figura 10).
P-Erk 1/2
SE
P-Akt
SCF
SE
SCF
D1
29.16
42.94
D3
D5
29.43
14.07
31.34
15.26
D3
D5
24.8
5.52
9.06
4.66
D6
11.34
11.04
D6
3.62
6.61
Figura 11 – Heatmaps representativos da fosforilação de Erk1/2 e Akt na ausência de estímulo
+
high
e em resposta a SCF na subpopulação CD34 CD38 ALDH
em amostras de medula óssea de
doadores saudáveis. As células foram ou não (SE) estimuladas com SCF (100ηg/100µL). Cada
quadrado na figura representa o nível da fosfoproteína em resposta a uma condição, para cada um
dos indivíduos. As tabelas contêm os valores medianos das intensidades de fluorescência para cada
condição, cuja intensidade variou de acordo com a escala representada.
Na ausência de estímulo, os níveis de P-Erk e de P-Akt foram variáveis entre
os doadores saudáveis analisados. Após estímulo com SCF, a amostra do D1
apresentou um aumento de 1,47 vezes nos níveis de P-Erk1/2 em relação ao estado
basal, enquanto os níveis dessa fosfoproteína nos demais doadores se mantiveram
inalterados (D6) ou aumentaram discretamente (D3 e D5). O estímulo com SCF
Resultados | 59
resultou em diminuição dos níveis de P-Akt nas amostras dos D3 e D5, e em
aumento de 1,82 vezes na do D6 (Figura 11).
Estes resultados revelam que as CTH isoladas de indivíduos saudáveis são
capazes de responder aos estímulos como o G-CSG, IL-6 e SCF. A resposta ao GCSF pode ser avaliada pelo aumento nos níveis de P-Stat3 e/ou P-Stat5. Por sua
vez, o estímulo com SCF pode levar à ativação de Erk1/2 ou de Akt.
4.3.3 Perfil de sinalização entre os pacientes com LMA
Após a caracterização dos perfis de resposta aos estímulos analisados em
doadores saudáveis, os perfis dos pacientes com LMA foram analisados. Foram
construídos painéis de respostas a citocinas/fatores de crescimento para avaliar a
ocorrência de transdução de sinal alterada entre as células de pacientes com LMA.
Amostras de 14 pacientes tiveram seus perfis de sinalização caracterizados em
resposta a G-CSF, nove à IL-6 e cinco ao SCF.
4.3.3.1 Sinalização na ausência de estímulo externo
Para caracterizar a sinalização celular na ausência de estímulo externo,
determinada pelos níveis constitutivos das fosfoproteínas de interesse, os pacientes
com LMA foram classificados em função dos valores de MFI referentes aos
doadores saudáveis: valores maiores do que o maior valor apresentado entre os
doadores saudáveis indicaram ativação basal aberrante.
Os níveis constitutivos de P-Stat3 e P-Stat5 variaram expressivamente entre
as amostras de pacientes com LMA, em ambas as subpopulações (Figura 12). As
reais implicações dessa variabilidade sobre mecanismos de resistência associados
às células leucêmicas permanecem elusivas, uma vez que um fenômeno
semelhante é observado também em indivíduos saudáveis (82).
Os níveis constitutivos de P-Stat3 na subpopulação celular ALDHhigh dos
pacientes classificados como LMA-CBF (pacientes P1 – P6) foram superiores aos
Resultados | 60
dos demais (P=0.02). Dois pacientes (P1 e P18) apresentaram níveis constitutivos
de P-Stat3 superiores ao maior valor apresentado entre os doadores saudáveis após
estímulo com G-CSF. Nenhum paciente apresentou nível constitutivo de P-Stat5
maior do que a referência de normalidade adotada. Três pacientes (P7, P16 e P19)
apresentaram níveis de ambas as fosfoproteínas inferiores ao menor valor
apresentado pelos doadores saudáveis. Diferente do que foi observado para PStat3, níveis constitutivos de P-Stat5 inferiores ao valor basal normal foram bastante
frequentes na subpopulação celular ALDHhigh, detectados em 11/14 (78,5%)
pacientes.
Resultados | 61
A)
B)
high
ALDH
int
ALDH P-Stat3
P-Stat3
SE
high
ALDH
G-CSF
int
P-Stat5
SE
G-CSF
SE
G-CSF
D1
12.41
22.67
D1
46.14
66.12
D2
9.47
12.19
D2
47.83
58.29
D3
12.98
9.78
D3
42.17
38.89
D4
12.3
11.6
25.48
D4
24.36
17.62
17
ALDH P-Stat5
SE
G-CSF
P1
22.68
26.18
P1
P1
47.83
47.4
P1
34.91
38.03
P2
15.82
16.4
P2
14.86
14.07
P2
8.9
9.56
P2
7.37
8.58
P3
13.16
13.64
P3
13.22
14.46
P3
12.52
12.52
P3
16.25
15.4
P5
16.4
16.85
P5
18.6
16.85
P5
17
11.04
P5
9.39
10.37
P6
16.7
15.68
P6
29.3
47.4
P6
46.56
42.55
P6
76.7
91.81
P7
7.77
7.77
P7
15.4
16.25
P7
9.56
10.37
P7
18.94
18.77
P9
12.63
21.1
P9
17.47
12.63
P9
21.67
37.86
P9
27.88
25.95
P10
9.65
9.65
P10
12.92
11.76
P10
15.82
17.78
P10
16.62
14.07
P11
9.82
8.98
P11
8.06
7.7
P11
3.59
3.4
P11
10.27
6.21
42.17
P13
10.75
18.77
P13
12.3
22.88
P13
17.15
39.24
P13
26.9
P16
7.37
7.17
P16
5.42
5.47
P16
21.1
20.72
P16
18.27
17.94
P17
11.97
10.55
P17
8.74
9.14
P17
27.63
20.54
P17
21.87
28.39
P18
36.85
20.72
P18
44.51
42.17
P18
3.23
37.18
P18
50.71
48.7
P19
5.73
6.67
P19
2.84
3.34
P19
19.63
18.35
P19
13.82
13.95
Figura 12 – Heatmaps representativos dos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 na ausência de estímulo
+
high
+
e em resposta ao estímulo com G-CSF nas subpopulações CD34 CD38 ALDH
e CD34 CD38
int
ALDH isoladas de doadores saudáveis e pacientes com leucemia mieloide aguda. As
subpopulações celulares foram estimuladas ou não (SE) com G-CSF (20ηg/100µL). Cada linha nas
figuras representa um paciente e cada quadrado representa a resposta de um sítio de fosforilação a
uma condição específica, cujas intensidades medianas de fluorescência variaram de acordo com as
escalas representadas. Nas tabelas, as respostas ao estímulo estão representadas como dados
brutos. A) dados referentes à P-Stat3 e B) P-Stat5. Níveis basais aumentados estão destacados em
vermelho, enquanto os diminuídos estão destacados em verde.
Resultados | 62
Considerando-se a subpopulação celular ALDHint, pacientes com LMA-CBF
apresentaram níveis constitutivos de P-Stat3 maiores do que os dos demais
pacientes (P=0.03). Dois dos três pacientes portadores de mutações FLT3-ITD e um
paciente cujo perfil genético não pôde ser determinado (P18) também apresentaram
níveis constitutivos aberrantemente elevados desta fosfoproteína. O estímulo com
G-CSF induziu aumento significativo da fosforilação de Stat3 em apenas um dos
nove pacientes (P6) que apresentaram elevada ativação basal, sugerindo que a
ausência de resposta se deva ao fato das células já terem alcançado o potencial
máximo de ativação desta via. Três pacientes (P11, P16 e P17) apresentaram níveis
reduzidos de P-Stat3, os quais não aumentaram após estímulo com G-CSF,
sugerindo inibição constitutiva da via e ausência de resposta ao G-CSF.
Dois pacientes apresentaram níveis constitutivos de P-Stat5 aberrantemente
elevados (P6 e P18). Um deles, o paciente P6, apresentou níveis basais superiores
ao maior valor detectado após estímulo com G-CSF entre os doadores saudáveis, e
observou-se aumento da fosforilação de Stat-5 após estímulo com G-CSF. Vale
ressaltar que apenas a subpopulação celular enriquecida em LIC deste paciente foi
capaz de responder ao estímulo com G-CSF, apesar dos níveis basais
aberrantemente elevados de ambas as fosfoproteínas.
Oito pacientes (57%) apresentaram níveis reduzidos de P-Stat5 em relação
aos doadores saudáveis. Com base na demonstração de que a expressão da
proteína Flt3 mutante aumenta a fosforilação de Stat5 em linhagens celulares
(111,112), nós investigamos os níveis desta fosfoproteína nesse grupo de pacientes.
Dois dos três pacientes com FLT3-ITD (P10 e P11) apresentaram níveis basais
diminuídos de P-Stat5, enquanto o terceiro se manteve dentro da normalidade (P9).
Observou-se maior fosforilação basal na subpopulação ALDHint em comparação com
a ALDHhigh em dois pacientes que apresentaram essa mutação (P9 e P11). Além
disso, o estímulo com G-CSF foi capaz de induzir aumento da fosforilação de Stat5
nas células ALDHhigh, enquanto induziu diminuição dos níveis de P-Stat5 nas células
ALDHint. Apesar do pequeno número de amostras FLT3-ITD incluídas na análise,
nossos resultados sugerem que não haja aumento da fosforilação basal de Stat5
nas células-tronco da LMA FLT3-ITD+, nem aumento dos níveis dessa fosfoproteína
em reposta ao G-CSF. Além disso, nós observamos elevados níveis constitutivos de
P-Stat3 em células ALDHint de pacientes FLT3-ITD+, os quais não foram
aumentados pelo tratamento com G-CSF. Esses resultados revelam uma
Resultados | 63
combinação entre níveis basais elevados de fosfoproteínas e ausência de resposta
aos estímulos na subpopulação enriquecida em ALDHint quando comparada à
subpopulação ALDHhigh. Este mecanismo pode estar associado à quiescência
característica das células-tronco e viabilizar a manutenção das células leucêmicas.
Não foi observada diferença significativa nos níveis constitutivos de P-Stat3
(14.09±2.12 na subpopulação ALDHhigh vs. 15.8±2.8 na subpopulação ALDHint,
Média±SEM, P=0.6) e P-Stat5 (19.44±3.6 na subpopulação ALDHhigh vs. 15.8±2.8 na
subpopulação ALDHint, P=0.4) entre as duas subpopulações celulares estudadas. A
ativação basal de Stat3 possibilitou a distinção entre as subpopulações celulares
isoladas de 5/14 (36%) pacientes, cujas diferenças nas MFI foram arbitrariamente
definidas como sendo maiores do que 3. Em relação a Stat5, isto ocorreu em 10/14
(71,4%) pacientes.
Foi possível diferenciar as duas subpopulações celulares com base no estado
de ativação basal de Erk1/2 em quatro das cinco amostras analisadas (P6, P7, P9 e
P13). Os níveis constitutivos de P-Erk1/2 foram variáveis entre as duas
subpopulações celulares e os valores mais altos foram detectados na subpopulação
ALDHint.
Três dos cinco pacientes analisados apresentaram níveis constitutivos
aberrantes de P-Erk na subpopulação ALDHint (P6, P9 e P13), o que não foi
observado na subpopulação ALDHhigh em nenhum paciente (Figura 13). Estudos
anteriores demonstraram a ativação constitutiva de Erk em amostras primárias de
LMA (113–115). Por outro lado, o aumento da ativação de Erk após estímulo com
SCF foi mais frequente na subpopulação ALDHhigh (3/5 pacientes vs. 1/5 na
subpopulação ALDHint).
Observou-se uma grande variação entre os níveis constitutivos de P-Akt
detectados entre os doadores saudáveis. Os níveis basais dessa fosfoproteína
possibilitaram a distinção entre CTH e LIC apenas no P6 e no P7 (Figura 13). A
ativação basal de Akt acima dos níveis da normalidade foi observada apenas nas
células ALDHint do paciente P6, e nesta subpopulação também foi detectada uma
ativação constitutiva aberrante de Stat3, Stat5 e Erk1/2.
Resultados | 64
A)
B)
high
ALDH
int
P-Erk
SE
high
ALDH P-Erk
SCF
SE
ALDH
SCF
int
P-Akt
SE
ALDH P-Akt
SCF
D1
29.16
42.94
D3
29.43
31.34
D3
24.8
9.06
D5
14.07
15.26
D5
5.52
4.66
D6
11.34
11.04
D6
3.62
6.61
P2
10.27
9.4
P2
P6
30.23
34.6
P7
8.06
15.82
P9
25.37
P13
24.58
SE
SCF
9.56
10.65
P2
13.95
13.46
P2
12.08
P6
72.9
65.53
P6
18.6
14.72
P6
26.66
28.9
P7
22.07
24.8
P7
7.04
6.95
P7
10.09
13.1
32.2
P9
32.49
31.06
P9
9.06
11.55
P9
9.47
9.87
26.6
P13
31.62
38.54
P13
7.1
6.67
P13
8.82
8.66
13.22
Figura 13 – Painel representativo dos níveis de P-Erk1/2 e P-Akt na ausência de estímulo e em
+
high
+
int
resposta ao SCF nas subpopulações CD34 CD38 ALDH
e CD34 CD38 ALDH isoladas de
doadores saudáveis e pacientes com leucemia mieloide aguda. As subpopulações celulares
foram estimuladas ou não (SE) com SCF (100ηg/100µL). Cada linha nas figuras representa um
paciente e cada quadrado representa a resposta de um sítio de fosforilação a uma condição
específica, cujas intensidades medianas de fluorescência variaram de acordo com as escalas
representadas. Nas tabelas, as respostas ao estímulo estão representadas como dados brutos. A)
dados referentes à P-Erk1/2 e B) P-Akt. Niveis basais aumentados estão destacados em vermelho,
enquanto os diminuídos estão destacados em verde.
Resultados | 65
4.3.3.2 Análise da resposta aos estímulos
Assim como os estados basais, a resposta à ativação induzida pelos
estímulos também foi variável entre os pacientes com LMA. Estabelecemos que
valores de Log2Ratio entre os estados “estimulado” versus “sem estímulo”
[log2(MFIEstimulado/MFISE)] maiores do que 0,32 e menores do que -0,43 (equivalentes
a fold-changes iguais a 1,25 e 0,75, respectivamente) seriam considerados aumento
ou diminuição detectável da fosforilação, respectivamente.
4.3.3.2.1 G-CSF
Catorze pacientes tiveram seu perfil de sinalização em resposta ao G-CSF
caracterizado, por meio da quantificação dos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 em
condições basais e após o estímulo (Figura 14). Não houve diferença significativa
nos níveis de P-Stats detectados após estímulo com G-CSF entre as subpopulações
estudadas (P-Stat3: 14.3±1.6 na subpopulação ALDHhigh vs. 17.22±3.41 na
subpopulação ALDHint, P=0.4; P-Stat5: 23.47±3.8 na subpopulação ALDHhigh vs.
27.17±6.06 na subpopulação ALDHint, P=0.6). Células ALDHhigh e ALDHint
apresentaram respostas visivelmente diferentes ao G-CSF detectada pelos níveis de
P-Stat3 em 5/14 (35,7%) pacientes, e de P-Stat5 em 7/14 (50%) pacientes (Figura
14).
Resultados | 66
A)
B)
ALDHhigh P-Stat3
Log2Ratio
D1
0.87
D2
0.36
D3
-0.41
D4
-0.08
0.21
P1
0.05
P2
0.05
P3
0.04
P5
-0.09
P6
0
P7
0.74
P9
0
P10
-0.13
P11
0.8
P13
-0.04
P16
-0.18
P17
-0.83
P18
0.22
P19
ALDHint P-Stat3
Log2Ratio
P1
P2
P3
P5
P6
P7
P9
P10
P11
P13
P16
P17
P18
P19
-0.05
-0.08
0.13
-0.14
0.69
0.08
-0.47
-0.14
-0.07
0.9
0.01
0.06
-0.08
0.23
ALDHhigh P-Stat5
Log2Ratio
D1
0.52
D2
0.29
D3
-0.12
D4
0.06
-0.01
P1
0.1
P2
0
P3
-0.62
P5
-0.13
P6
0.12
P7
0.8
P9
0.17
P10
-0.08
P11
1.19
P13
-0.03
P16
-0.43
P17
3.52
P18
-0.1
P19
ALDHint P-Stat5
Log2Ratio
P1
P2
P3
P5
P6
P7
P9
P10
P11
P13
P16
P17
P18
P19
0.12
0.22
-0.08
0.14
0.26
-0.01
-0.1
-0.24
-0.73
0.65
-0.03
0.38
-0.06
0.01
Figura 14 – Heatmaps representativos da quantificação relativa dos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 em
+
high
+
int
e CD34 CD38 ALDH isoladas
resposta ao estímulo com G-CSF nas subpopulações CD34 CD38 ALDH
de doadores saudáveis e pacientes com leucemia mieloide aguda. As subpopulações celulares foram
estimuladas ou não (SE) com G-CSF (20ηg/100µL). Cada linha nas figuras representa um paciente e cada
quadrado representa a resposta de um sítio de fosforilação a uma condição específica, cujas intensidades
medianas de fluorescência variaram de acordo com as escalas representadas. Nas tabelas, as respostas ao
G-CSF
SE)
/MFI . A) níveis relativos de P-Stat3 e
estímulo em cada nó de sinalização foram calculadas como log2(MFI
B) P-Stat5.
Resultados | 67
Na subpopulação enriquecida em CTH, dois pacientes tiveram aumento
significativo nos níveis de P-Stat3 e P-Stat5 em resposta a G-CSF (P9 e P13),
apesar de ambos terem apresentado níveis basais baixos de P-Stat5 nesta
subpopulação. O P18 também respondeu ao estímulo com G-CSF, porém com
ativação apenas de Stat5 (Figura 14). Já na subpopulação enriquecida em LIC, um
paciente apresentou ativação aumentada de Stat3 e Stat5 (P13), e um paciente
apenas de Stat3 (P6).
Entre os casos de cinética de resposta desregulada, foram observados dois
casos na subpopulação celular ALDHhigh (P-Stat3 no P18 e P-Stat5 no P5) e dois na
subpopulação celular ALDHint (P-Stat3 no P9 e P-Stat5 no P11). Os pacientes que
responderam ao estímulo com G-CSF com diminuição dos níveis de P-Stat3
apresentaram expressão constitutiva alterada desta fosfoproteína (P9 e P18, Figura
14).
Nos casos não mencionados anteriormente, considerou-se que não houve
resposta ao estímulo. Entre os pacientes classificados como LMA-CBF, apenas a
subpopulação ALDHint do P6 respondeu ao estímulo com G-CSF com aumento dos
níveis de P-Stat3. É importante destacar que todos os pacientes deste grupo
apresentaram níveis constitutivos elevados desta fosfoproteína em ambas as
subpopulações (exceto o P7), o que pode ter influenciado a falta de indução de
resposta pelo estímulo com este fator de crescimento.
4.3.3.2.2 IL-6
Nove pacientes tiveram seu perfil de sinalização em resposta à IL-6
caracterizado, por meio da quantificação dos níveis de P-Stat3 em condições basais
e após o estímulo (Figura 15). O G-CSF foi mais eficiente do que a IL-6 em induzir
fosforilação de Stat3 após estimulação, visto que ambas as subpopulações celulares
foram predominantemente irresponsivas ao estímulo com IL-6. Adicionalmente,
diferente do que foi observado em relação ao G-CSF, não foi possível discriminar
CTH e LIC isoladas de pacientes com LMA por meio do perfil de resposta à IL-6.
Resultados | 68
ALDHhigh P-Stat3
Log2Ratio
P1
-0,47
P2
-0,07
0,13
P5
-0,51
P6
-0,1
P7
-0,27
P9
0,06
P10
0,16
P11
0,1
P13
ALDHint P-Stat3
Log2Ratio
P1
-0,26
P2
-0,4
0,11
P5
0,13
P6
-0,07
P7
-0,49
P9
-0,26
P10
-0,14
P11
-0,12
P13
Figura 15 – Heatmap representativo da quantificação relativa dos níveis de P-Stat3 em
+
high
+
int
e CD34 CD38 ALDH
resposta ao estímulo com IL-6 nas subpopulações CD34 CD38 ALDH
isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda. As subpopulações celulares foram ou não
(SE) estimuladas com IL-6 (50ηg/100µL). Cada linha nas figuras representa um paciente e cada
quadrado representa a resposta de um sítio de fosforilação a uma condição específica, cujas
intensidades medianas de fluorescência variaram de acordo com as escalas representadas. Nas
ILtabelas, as respostas ao estímulo em cada nó de sinalização foram calculadas como log2(MFI
SE)
6
/MFI .
Resultados | 69
4.3.3.2.3 SCF
Como mencionado anteriormente, devido ao número limitado de células
obtidas após a separação, foi possível analisar o perfil de ativação em resposta ao
SCF em apenas cinco pacientes com LMA. Apesar do número relativamente
pequeno de pacientes incluídos nesta análise, foi possível diferenciar as duas
subpopulações celulares pelo perfil de resposta ao estímulo com SCF em todas
elas, tanto pelos níveis de P-Erk1/2 quanto de P-Akt (Figura 16).
Após o estímulo com SCF, houve maior aumento dos níveis de P-Erk na
subpopulação celular ALDHhigh do que na subpopulação ALDHint. Por outro lado, a
subpopulação celular ALDHint apresentou níveis mais elevados de P-Akt após
estímulo do que as células ALDHhigh, sugerindo que estas células sejam mais
sensíveis à ativação de mecanismos de sobrevida do que a subpopulação
enriquecida em CTH normais.
Resultados | 70
A)
ALDHhigh P-Erk1/2
Log2Ratio
D1
D2
D3
D4
-0,13
P2
0,19
P6
0,97
P7
0,34
P9
0,12
P13
B)
ALDHint P-Erk1/2
Log2Ratio
D1
D2
D3
D4
0,16
P2
-0,16
P6
0,17
P7
-0,06
P9
0,29
P13
ALDHhigh P-Akt
Log2Ratio
D1
D2
D3
D4
-0,05
P2
-0,34
P6
-0,02
P7
0,35
P9
-0,09
P13
ALDHint P-Akt
Log2Ratio
D1
D2
D3
D4
0,13
P2
0,12
P6
0,38
P7
0,06
P9
-0,03
P13
Figura 16 – Heatmap representativo dos níveis de P-Erk1/2 e P-Akt em resposta ao estímulo
+
high
+
int
com SCF nas subpopulações CD34 CD38 ALDH
e CD34 CD38 ALDH isoladas de pacientes
com leucemia mieloide aguda. As subpopulações celulares foram estimuladas com SCF
(100ηg/100µL). Uma alíquota sem estímulo (SE) foi analisada para efeitos comparativos. Cada linha
nas figuras representa um paciente e cada quadrado representa a resposta de um sítio de
fosforilação a uma condição específica, cujas intensidades medianas de fluorescência variaram de
acordo com as escalas representadas. Nas tabelas, as respostas ao estímulo em cada nó de
G-CSF
SE)
sinalização foram calculadas como log2(MFI
/MFI . A) níveis relativos de P-Erk1/2 e B) P-Akt.
Resultados | 71
O número de amostras incluídas nesta análise dificultou a avaliação da
existência de correlação entre marcadores genéticos e perfis de resposta ao SCF.
Entretanto, dois dos três pacientes com LMA-CBF estudados (P2 e P7)
apresentaram o mesmo perfil de responsividade ao SCF nas células ALDHint, com
níveis equivalentes de P-Erk após estímulo com SCF, enquanto o terceiro (P6)
apresentou níveis reduzidos de P-Erk em relação ao basal (Figura 16). Além disso,
apesar da ativação basal similar, as LIC dos pacientes com LMA-CBF (P2, P6 e P7)
apresentaram maiores níveis de P-Akt após estímulo com SCF do que as
respectivas CTH, sugerindo maior sensibilidade à ativação.
Apesar de não ter sido possível discriminar as CTH e LIC pela sinalização basal
no caso dos pacientes não classificados como LMA-CBF, eles apresentaram perfis de
sinalização distintos em resposta ao estímulo com SCF, reforçando a importância de
avaliar essas duas condições para caracterização do perfil de sinalização.
4.3.4 Comparação entre amostras coletadas ao diagnóstico e na recaída
Dos 14 pacientes cujos perfis de sinalização celular em resposta a G-CSF,
IL-6 e/ou SCF foram caracterizados, apenas nove tinham dados de seguimento
clínico disponíveis. Entre estes nove pacientes, seis alcançaram remissão, dos
quais: um permaneceu em remissão, dois foram a óbito em remissão e três
recaíram. Células ALDHhigh e ALDHint dos pacientes que recaíram também tiveram
seu perfil de sinalização celular caracterizado na recaída. Houve células suficientes
para avaliar apenas a resposta ao estímulo com G-CSF.
Apesar do número pequeno de amostras incluídas nesta análise, demonstrouse que os perfis de resposta ao G-CSF das duas subpopulações estudadas foram
diferentes, assim como os perfis de sinalização observados ao diagnóstico e na
recaída. Na subpopulação ALDHhigh, detectou-se níveis basais mais elevados de PStat3 e P-Stat5 ao diagnóstico do que na recaída (Figura 17). Por outro lado, a
subpopulação enriquecida em LIC (ALDHint) apresentou perfis mais heterogêneos. O
P3 apresentou menores níveis basais de P-Stat3 e P-Stat5 na recaída do que ao
diagnóstico, e o contrário foi observado nas amostras do P16. O P17, por sua vez,
apresentou maiores níveis basais de P-Stat3 e menores níveis basais P-Stat5 na
recaída do que ao diagnóstico.
Resultados | 72
high
ALDH
int
P-Stat3
SE
G-CSF
P3 D
11.55
12.13
P3 R
3.85
P16 D
high
ALDH P-Stat3
SE
G-CSF
P3 D
13.1
14.46
3.34
P3 R
6.73
7.37
7.1
P16 D
P16 R
5.94
10.94
P17 D
12.08
P17 R
12.52
ALDH
int
P-Stat5
SE
G-CSF
P3 D
12.08
11.92
4.83
P3 R
7.7
5.52
5.62
P16 D
P16 R
8.9
7.23
10.6
P17 D
8.66
14.27
P17 R
13.04
ALDH P-Stat5
SE
G-CSF
P3 D
16.25
15.4
7.3
P3 R
13.58
10.09
21.1
20.72
P16 D
18.27
18.11
P16 R
15.54
20.35
P16 R
26.42
22.67
9.22
P17 D
27.88
20.54
P17 D
21.48
29.16
12.13
P17 R
9.31
11.65
P17 R
17.62
6.29
Figura 17 – Comparação entre os níveis de P-Stat3 e P-Stat5 entre as subpopulações
+
high
+
int
e CD34 CD38 ALDH isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda
CD34 CD38 ALDH
ao diagnóstico e na recaída. As subpopulações celulares foram estimuladas ou não (SE) com GCSF (20ηg/100µL). Cada linha nas figuras representa um paciente e cada quadrado representa a
resposta de um sítio de fosforilação a uma condição específica, cujas intensidades medianas de
fluorescência variaram de acordo com as escalas representadas. Nas tabelas, as respostas ao
estímulo foram expressas como dados brutos.
Após estímulo com G-CSF, observou-se aumento nos níveis de P-Stat3 e PStat5 na subpopulação ALDHhigh isolada dos pacientes P16 e P17 apenas na
recaída, sugerindo maior capacidade de ativação em relação ao diagnóstico (Figura
18). Em contraste, as subpopulações ALDHint de todos os pacientes foram menos
sensíveis ao estímulo com G-CSF na recaída do que no diagnóstico, com diminuição
dos níveis tanto de P-Stat3 quanto de P-Stat5. Este resultado sugere mudanças na
Resultados | 73
sinalização da subpopulação enriquecida em LIC durante o curso da doença, as
quais refletem alterações na sensibilidade e/ou responsividade a fatores de
crescimento presentes no nicho medular entre o momento do diagnóstico e a
recaída.
high
ALDH
P-Stat3
Log2Ratio
int
high
ALDH
P-Stat5
Log2Ratio
int
P3 D
0.07
ALDH P-Stat3
Log2Ratio
P3 D
0.14
P3 D
-0.02
ALDH P-Stat5
Log2Ratio
P3 D
-0.08
P3 R
-0.21
P3 R
-0.48
P3 R
-0.08
P3 R
-0.43
P16 D
-0.05
P16 D
0.03
P16 D
-0.03
P16 D
-0.01
P16 R
0.88
P16 R
-0.3
P16 R
0.39
P16 R
-0.22
P17 D
-0.19
P17 D
0.09
P17 D
-0.44
P17 D
0.44
P17 R
0.19
P17 R
-0.1
P17 R
0.32
P17 R
-1.49
+
-
Figura 18 – Comparação entre perfis de resposta ao G-CSF das subpopulações CD34 CD38
high
+
int
ALDH
e CD34 CD38 ALDH isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda ao
diagnóstico e na recaída. As subpopulações celulares foram estimuladas ou não (SE) com G-CSF
(20ηg/100µL). Cada linha nas figuras representa um paciente e cada quadrado representa a resposta
de um sítio de fosforilação a uma condição específica, cujas intensidades medianas de fluorescência
variaram de acordo com as escalas representadas. Nas tabelas, as respostas ao estímulo foram
G-CSF
SE)
calculadas como log2(MFI
/MFI .
Resultados | 74
4.4 Análise de metilação global genômica
Apesar da grande variedade de alterações genéticas e epigenéticas
observadas na LMA, sabe-se que muitas delas culminam com a desregulação de
vias de sinalização em comum. Se as CTH e as LIC têm uma origem comum, seria
razoável considerar que as diferenças observadas nos padrões de sinalização
podem ser devidas a mecanismos epigenéticos. Para avaliar esta hipótese, nós
comparamos os padrões de metilação global genômica entre estas subpopulações
celulares, e entre elas e a subpopulação de CTH residuais nos pacientes com LMA.
Inicialmente, todos os arquivos SAM (Sequence Alignment/Map) referentes às
subpopulações ALDHint e ALDHhigh isoladas de doadores saudáveis foram lidos. O
primeiro grupo foi especificado como “tratamento=1” e o segundo como
“tratamento=0”. Em seguida, apenas as CpG com cobertura mínima igual a 10 foram
mantidas. Após esse passo, todas as amostras foram reunidas, com diferentes
critérios. Nessa etapa, o objetivo era apenas obter as CpG que estivessem
presentes em todas as amostras, sem levar os valores beta em consideração.
Entretanto, se o critério para seleção fosse obter CpG presentes em todas as
amostras, apenas 29 CpG seriam obtidas, de modo que um novo critério foi adotado
para obtenção de CpG presentes em pelo menos três amostras em cada grupo.
Com efeito, este novo critério manteve o requisito de selecionar CpG presentes em
todas as amostras de doadores saudáveis, enquanto ainda exigiu que as CpG
selecionadas estivessem presentes em apenas três das amostras ALDHint de
pacientes leucêmicos. Esta abordagem resultou em 9.819 CpG, o que ainda não foi
um valor alto o suficiente. Então, os requisitos foram diminuídos para a obtenção de
CpG presentes em pelo menos duas amostras em cada grupo, o que resultou em
199.360 CpG.
Em seguida, foi aplicado um filtro, estipulando que, para qualquer CpG
selecionada, a diferença nos valores beta dentro de um grupo (no caso o ALDHint)
não poderiam exceder 0,25, ou seja, o máximo valor beta menos o mínimo valor
beta deveria ser menor do que 0,25. Isto foi feito para reduzir interferências entre
os dados. Das 199.360 CpG inicialmente obtidas, restaram 134.373
“filtradas”.
CpG
Resultados | 75
O próximo passo foi proceder com o MethylKit, calculateDiffMeth, que
comparou
automaticamente
as
amostras
com
o
“tratamento=1”
com
o
“tratamento=0”. Esta análise gerou um “objeto” cujas três primeiras colunas foram o
arquivo BED para determinação das CpG diferencialmente metiladas (DMC, do
inglês: differentially methylated cytosines). Em seguida, aplicou-se o “get.methylDiff”
neste mesmo objeto, com delta beta mínimo = abs(0.25) & q-value < 0.01 para obter
Hiper e Hipo DMC como arquivos BED.
Uma vez obtidos os arquivos BED para Hiper e Hipo DMC, cada um deles foi
sobreposto à versão “hg19” de referência para o genoma humano, para identificação
de características de promotores, éxons, íntrons, regiões intergênicas, CGI (do
inglês, CpG islands), shelf (2 – 4kb de distância de uma ilha CpG), shore (até 2kb de
distância de uma ilha CpG) e opensea (ilhas CpG isoladas no genoma).
Este
método gerou o número “observado” de sobreposições. Para calcular o
correspondente número “esperado” de sobreposições, os arquivos BED de Hipo e
Hiper DMC foram misturados e confrontados contra o background 1.000 vezes, e
interceptados com as características do “hg19”. Os valores de P para
enriquecimento/depleção foram computados pela função R pnorm.
Toda essa análise foi repetida para a comparação entre as subpopulações
ALDH
high
isoladas de pacientes com LMA e doadores saudáveis. Neste caso, se
reuníssemos todas as amostras, teríamos 1.816 CpG, o que corresponderia a um
valor muito baixo. Então, novamente, este critério foi modificado para a obtenção
de CpG presentes em pelo menos duas amostras em cada grupo (o que ainda
selecionaria todas as amostras ALDHhigh isoladas de pacientes com LMA, pois só
havia duas delas). Após esta seleção, foram obtidas 21.220 CpG (com pelo
menos uma amostra em cada grupo, seriam obtidas 704.195 CpG,
o que
corresponderia a um valor muito alto). Após filtrar essas 21.220 CpG, foram
obtidas 15.002 CpG.
A primeira comparação foi realizada entre os perfis de metilação genômica de
células ALDHhigh isoladas de indivíduos saudáveis com a mesma população isolada
de pacientes com LMA, para avaliar o grau de similaridade entre elas. A Figura 19
mostra o agrupamento hierárquico e a análise de componentes principais (PCA, do
inglês Principal Componente Analysis) das células ALDHhigh isoladas de doadores
saudáveis e de pacientes com LMA, e revelou a existência de similaridade entre os
perfis de metilação apresentados por elas. Adicionalmente, a distribuição global de
Resultados | 76
citosinas metiladas foi bastante semelhante entre essas duas subpopulações
celulares. Observou-se que relativamente poucos genes estavam diferencialmente
metilados entre estas duas subpopulações - 142 loci hipermetilados e 192 loci
hipometilados, e que o número de CpG diferencialmente metiladas entre elas
também foi pequeno – três hipometiladas e cinco hipermetiladas (Figura 20). A
hipometilação ocorreu predominantemente em íntrons, e foi detectada em ilhas CpG
e shores. Já a hipermetilação foi observada em regiões intergênicas, e localizada em
ilhas CpG e shores (Figura 21).
Apesar do pequeno número de amostras ALDHhigh da LMA incluídas neste
estudo, estes resultados sugerem a existência de grande similaridade entre os
metilomas de células ALDHhigh isoladas de indivíduos saudáveis e de pacientes com
LMA.
+
-
high
Figura 19 – Comparação entre os perfis de metilação de células CD34 CD38 ALDH
isoladas
de pacientes com leucemia mieloide aguda ou de doadores saudáveis.
O DNA das
subpopulações celulares foi extraído e submetido ao ERRBS. O sequenciamento foi realizado na
plataforma Illumina HiSeq2500 e os dados foram processados utilizando o Bismark, um método
baseado em Bowtie para alinhamento e análise após conversão por bissulfito. O agrupamento
+
high
hierárquico supervisionado (à esquerda) e a PCA (à direita) de células CD34 CD38 ALDH isoladas
de pacientes com LMA ou de doadores saudáveis, baseado no perfil de metilação, revelou a maior
similaridade existente entre amostras do mesmo subtipo celular (CTH residuais isoladas de pacientes
com LMA destacadas em azul e CTH isoladas de doadores saudáveis destacadas em vermelho),
com 192 loci hipometilados e 142 loci hipermetilados nas células da LMA em relação às normais.
Resultados | 77
+
-
Figura 20 – Distribuição global de citosinas hipo- e hipermetiladas em células CD34 CD38
high
ALDH
isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda em comparação com células
+
high
CD34 CD38 ALDH
isoladas de doadores saudáveis. Volcano plot do -log10 (P-valor) versus valor
delta beta, representando as diferenças na metilação entre as subpopulações analisadas. As linhas
pontilhadas indicam os limiares de significância (Delta Beta=0.25). Na análise das citosinas
diferencialmente metiladas, foram detectadas 3 casos de hipo- e 5 de hipermetilação.
Figura 21 – Regiões genômicas e sítios de localização das citosinas diferencialmente
high
metiladas na subpopulação CD34+CD38-ALDH
isoladas de pacientes com leucemia mieloide
high
aguda em comparação com células CD34+CD38-ALDH
isoladas de doadores saudáveis.
Características gênicas e das CGIs das citosinas diferencialmente metiladas estão representadas. As
barras em vermelho representam os resultados significativos, com a condição de que o P-valor
(números ao lado das barras) seja <0.05.
Resultados | 78
Em seguida, nós comparamos os perfis de metilação genômica entre células
int
ALDH
isoladas de pacientes com LMA e células ALDHhigh isoladas de doadores
saudáveis. Os perfis de metilação das LIC apresentaram-se bastante variáveis
quando comparados aos das CTH de doadores saudáveis (Figura 22). Pela análise
de PCA, os perfis de metilação do DNA não foram capazes de distinguir entre
amostras normais e amostras de LMA. Embora a maioria das amostras leucêmicas
tenha formado um grupo homogêneo, algumas delas compartilham mais
similaridades com amostras normais do que com amostras de LMA (Figura 22). Este
resultado pode refletir a heterogeneidade entre os perfis de metilação genômica na
LMA, mais precisamente em LIC.
+
-
int
Figura 22 – Comparação entre os perfis de metilação de células CD34 CD38 ALDH e células
+
high
CD34 CD38 ALDH
isoladas de doadores saudáveis. O DNA das subpopulações celulares foi
extraído e submetido ao ERRBS. O sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina HiSeq2500 e
os dados foram processados utilizando o Bismark, um método baseado em Bowtie para alinhamento
e análise após conversão por bissulfito. A PCA revelou que apesar de haver maior semelhança entre
células pertencentes à mesma subpopulação celular, não houve uma clara separação entre CTH
(indicadas em vermelho) e LIC (indicadas em azul).
No total, 1.583 loci apresentaram-se hipometilados e 787 loci estavam
hipermetilados nas LIC, quando comparadas às CTH isoladas de doadores
saudáveis. Esta hipometilação foi predominantemente observada em regiões
intergênicas, íntrons e promotores, e foi identificada em ilhas CpG (CGI) e shores.
Por outro lado, a hipermetilação foi predominantemente observada em regiões
intergênicas e éxons, e também ocorreu principalmente em CGIs e shores (Figura
18).
Resultados | 79
Figura 23 – Regiões genômicas e sítios de localização das citosinas diferencialmente
int
metiladas na subpopulação CD34+CD38-ALDH em comparação com células CD34+CD38high
ALDH
isoladas de doadores saudáveis. Características gênicas e das CGIs das citosinas
diferencialmente metiladas estão representadas. As barras em vermelho representam os resultados
significativos, com a condição de que o P-valor (números ao lado das barras) seja <0.05.
Ao contrário do que foi observado na comparação entre células ALDHhigh
isoladas de indivíduos saudáveis e leucêmicos (Figura 15), o perfil de metilação global
revelou numerosas diferenças na distribuição de DMC entre CTH e LIC (Figura 19).
Figura 24 – Distribuição global de citosinas hipo- e hipermetiladas em células CD34+CD38int
ALDH isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda em comparação com células
high
CD34+CD38-ALDH
isoladas de doadores saudáveis. Volcano plot do -log10 (P-valor) versus
valor delta beta, representando as diferenças na metilação entre as subpopulações analisadas. As
linhas pontilhadas indicam os limiares de significância (Delta Beta=0.25). Na análise das citosinas
diferencialmente metiladas, foram detectadas 150 hipo- e 299 hipermetiladas.
Resultados | 80
Em relação aos genes que codificam proteínas envolvidas nas vias de
sinalização celular relevantes para este trabalho, observou-se diferenças nos
padrões de metilação entre CTH isoladas de doadores saudáveis e LIC. As LIC
apresentaram hipometilação no gene STAT3, bem como em genes envolvidos nas
vias p38/MAPK e JNK/ MAPK, tais como: MAP2K4, MAP3K10, MAP3K5, MAP4K4.
Uma vez que maiores níveis basais de Stat3 e de Erk1/2 fosforiladas foram
detectados nas LIC, é possível que exista uma correlação entre estes achados de
regulação gênica e os níveis de fosfoproteínas detectados por citometria de fluxo.
Em relação às vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento
embrionário, as LIC apresentaram predominantemente hipometilação em genes que
codificam proteínas envolvidas nas vias Notch, Wnt e Sonic Hedgehog, tais como:
NOTCH, ADAM17, WNT10A, FZD4, SHH e GlI2. Este fenômeno sugere potencial
hiperativação dessas vias, as quais medeiam eventos relacionados à manutenção
das propriedades das células-tronco, o que conferiria vantagens às LIC quando
comparadas às CTH.
Detectou-se hipometilação na região promotora do gene ABCA1 em LIC, o
qual codifica uma proteína do tipo ATP-binding cassette, envolvida no mecanismo de
resistência a múltiplas drogas (MDR). Este resultado soma-se às evidências de
mecanismos de resistência nas LIC quando comparadas às CTH. Adicionalmente,
uma variedade de genes geralmente regulados positivamente durante os estágios
mais
tardios
da
diferenciação
de
células-tronco
embrionárias
estavam
hipermetilados em LIC, assim como genes envolvidos na sinalização por cálcio, tais
como o CACNA1A. Uma vez que há crescentes evidências de que a sinalização de
cálcio intracelular desempenhe importantes papéis no crescimento e proliferação
celular, a inativação de um gene que codifica um canal de cálcio pode estar
relacionada ao desenvolvimento e/ou progressão do câncer (116).
Em seguida, nós avaliamos as diferenças entre células ALDHhigh e ALDHint,
ambas isoladas de indivíduos com LMA. Devido ao número limitado de células e à
qualidade do DNA extraído, só foi possível fazer esta comparação entre duas
amostras pareadas, as quais haviam sido isoladas do P2 e do P13.
As
subpopulações isoladas do P13 apresentaram apenas 3.948 CpG em comum,
enquanto 154.483 CpG foi o número observado para o P2.
Os perfis de metilação discriminaram dois grupos: um que correspondeu à
subpopulação
enriquecida
em
CTH
residuais
e
outro
correspondente
à
Resultados | 81
subpopulação enriquecida em LIC (Figura 25). Apesar do número pequeno de
amostras analisadas, estes dados reforçam a hipótese de que as subpopulações
celulares ALDHhigh e ALDHint apresentam distintos padrões de metilação genômica
global, além das diferenças previamente observadas quanto à atividade da Aldh e
perfil de sinalização celular.
+
-
high
Figura 25 – Comparação entre os perfis de metilação entre células CD34 CD38 ALDH
e
+
int
CD34 CD38 ALDH isoladas de pacientes com leucemia mieloide aguda.
O DNA das
subpopulações celulares foi extraído e submetido ao ERRBS. O sequenciamento foi realizado na
plataforma Illumina HiSeq2500 e os dados foram processados utilizando o Bismark, um método
baseado em Bowtie para alinhamento e análise após conversão por bissulfito. O agrupamento
hierárquico supervisionado (à esquerda) e a PCA (à direita), baseados no perfil de metilação,
revelaram maior similaridade entre amostras da mesma subpopulação celular (CTH residuais
destacadas em azul e LIC destacadas em vermelho).
Na análise do P2, 6.842 loci estavam hipometilados e 787 loci estavam
hipermetilados na subpopulação ALDHint quando comparada à ALDHhigh. Já para o
P13, foram detectados 190 loci hipometilados e 220 loci hipermetilados na mesma
comparação. Diferenças nos metilomas destas duas subpopulações foram ainda
mais evidentes do que as observadas na comparação entre células ALDHint e células
ALDHhigh isoladas de indivíduos saudáveis, reforçando observações prévias de que
estão enriquecidas em tipos celulares funcionalmente diferentes.
Resultados | 82
Figura 26 – Distribuição global de citosinas hipo- e hipermetiladas em células CD34+CD38int
high
ALDH em comparação com células CD34+CD38-ALDH
isoladas dos mesmos pacientes.
Volcano plot do -log10 (P-valor) versus valor delta beta, representando as diferenças na metilação
entre as subpopulações analisadas. As linhas pontilhadas indicam os limiares de significância (Delta
Beta=0.25). No caso do paciente P2, foram detectadas 18406 e 9045 DMC significativamente hipo- e
hipermetiladas, respectivamente. Para o paciente P13, os valores foram 365 e 342, respectivamente.
Entre os genes hipometilados nas células ALDHint quando comparadas às
ALDHhigh, estão envolvidos na sinalização de cálcio intracelular, bem como no
transporte transmembrana de íons e pequenas moléculas. Além disso, foi marcante
a presença de DMC hipometiladas nas regiões promotoras de genes relacionados à
oncogênese, tais como os envolvidos em processos como: inibição da apoptose
(BCL2), remodelamento da matriz extracelular e formação de colágeno (COL2A1,
COL9A2/3), receptores do tipo tirosina-quinase (ERRB2, ABL1), controle do ciclo
celular (E2F, CDKN2A, EP300, EP400), resistência a múltiplas drogas (ABCB10,
ABCC8, ABCD3, ABCD4), entre outros. Adicionalmente, genes que codificam
proteínas das vias MAPK (MAPK 3/8/11/12/13) e VEGF (PIK3R1, PP3CA, PPP3CC,
NFATC2/4) também estavam hipometilados na subpopulação celular CD34+CD38ALDHint. Entre os genes hipermetilados nas células CD34+CD38-ALDHint, também
estão os que codificam transportadores do tipo ATP-binding cassette (ABCD2/3),
além de genes envolvidos na formação de colágeno e da matriz extracelular
(LAMA3/5, COL8A2, COL9A2, FGF4/19), fatores pró-apoptóticos (BAD, BID),
caderinas (CDH1) e proteínas envolvidas na sinalização do ácido retinoico e
Resultados | 83
resistência a drogas (ALDH1A3). Estes achados sugerem que as células ALDHint
apresentam um maior potencial oncogênico quando comparadas às células
ALDHhigh, ambas isoladas de amostras de LMA. Além disso, sugerem uma base
molecular para as diferenças funcionais observadas entre estas subpopulações, e
reforçam observações prévias de que a subpopulação CD34+CD38-ALDHint está
enriquecida em LIC.
Em relação às vias de sinalização de interesse deste trabalho, observou-se
hipometilação em genes que codificam proteínas MAPK, o que pode ter correlação
com os resultados observados em nível proteico, detectados por citometria de fluxo,
uma vez que células ALDHint apresentaram maiores níveis basais de Erk1/2
fosforiladas. Por outro lado, não foram observadas diferenças no perfil de metilação
de genes envolvidos na via JAK/STAT, apesar da demonstração de diferenças na
sinalização entre as duas subpopulações celulares, principalmente devidas aos
níveis de P-Stat5 (basais e após estimulação). Portanto, é improvável que as
diferenças observadas nos perfis de sinalização da via JAK/STAT possam ser
atribuídas a diferenças na metilação genômica.
5 DISCUSSÃO
Discussão | 85
Nós demonstramos que a atividade da Aldh pode ser utilizada para identificar
subpopulações enriquecidas de células-tronco dentro da heterogênea fração de
células CD34+CD38- em amostras LMA ao diagnóstico. O potencial de célula-tronco
desta subpopulação foi validado por meio da realização de ensaios de
xenotransplante em modelo murino e avaliação da enxertia em longo prazo.
O percentual de enxertia nos nossos experimentos está de acordo com o
descrito pela literatura (50-70%) (117–119). Em relação ao percentual de células
humanas recuperadas da medula óssea murina, a literatura descreve uma grande
variabilidade. Para xenotransplantes realizados com amostras de medula óssea total
em modelos mais imunossuprimidos como o NSG, por exemplo, percentuais que
variaram entre 10 e 80% foram descritos (107,119,120). Por outro lado, percentuais
mais baixos foram detectados à medida que subpopulações purificadas foram
transplantadas (106,107), como foi observado no presente trabalho: 0,11 - 0,52% de
quimerismo para a subpopulação ALDHint e 0,1 - 2,67% para a subpopulação
ALDHhigh.
Utilizando o mesmo método para enriquecimento de células-tronco
normais e leucêmicas, Gerber et al. (2012) descreveram resultados semelhantes aos
nossos (45).
Observou-se grande variabilidade nos resultados obtidos entre os animais
pertencentes ao mesmo grupo, tanto qualitativa (haver ou não enxertia) quanto
quantitativa (percentual de células enxertadas). Isso pode refletir a heterogeneidade
no potencial de enxertia de diferentes subclones transplantados, assim como a
frequência
de
células-tronco
normais
ou
leucêmicas
contidas
em
cada
subpopulação. Este potencial pode se correlacionar com as alterações genéticas da
LMA. Sanchez et al. (2009) demonstraram que a presença de mutações no gene
FLT3 na LMA se correlacionou com maior capacidade de enxertia em camundongos
NSG (119). No presente trabalho, não foram analisadas amostras representativas de
cada grupo genético em número suficiente para avaliar esta hipótese.
Houve
enxertia nas três amostras portadoras de mutações FLT3-ITD, duas delas
transplantadas ao diagnóstico e uma na recaída (Tabela 3). Na amostra da recaída,
foi realizado transplante de medula óssea total. Considerando-se as duas restantes,
em uma delas (P9) detectou-se enxertia de ambas as subpopulações celulares
transplantadas (ALDHhigh e ALDHint), enquanto na outra (P10), apenas da
subpopulação ALDHhigh. Entre os quatro xenotransplantes realizados com amostras
de pacientes classificados com LMA-CBF (P1 e P2), observou-se enxertia em dois
Discussão | 86
deles, com detecção de ambas as subpopulações celulares transplantadas. Além de
portarem rearranjos do tipo CBF, estes pacientes cujas amostras enxertaram eram
portadores de mutações no gene NPM1.
Outro fator que pode ter limitado o sucesso dos nossos xenotransplantes é o
ambiente no qual os animais são mantidos. Sabe-se que o isolamento de
camundongos NSG em condições SPF (do inglês, Specified Pathogens-Free) é
fundamental para manutenção de suas propriedades originais, que justificam o
grande sucesso da enxertia observado nessa linhagem de animais. No biotério onde
eles são manipulados e mantidos, nossa infraestrutura e condição econômica não
nos permitem reproduzir as condições de manipulação e manutenção adotadas por
centros de referência em pesquisa em células-tronco da LMA, tais como: isolamento
das colônias de camundongos NSG em salas exclusivas; manipulação por um único
profissional, o qual é impedido de circular em salas contendo animais de outras
linhagens no mesmo dia; substituição das matrizes e reconstituição das colônias a
cada seis meses; rastreamento genético regular para garantir a integridade do
background genético original, entre outras.
Ainda, demonstramos que foi possível caracterizar funcionalmente as células
iniciadoras de leucemia no que se refere a sua resposta a estímulos como G-CSF e
SCF, e que este critério também pode ser utilizado para diferenciar as LIC das CTH
normais. Trata-se, portanto, da primeira descrição de sinalização celular aberrante
na subpopulação ALDHint, a qual apresentou várias características funcionais de
células-tronco leucêmicas.
Padrões aberrantes nas vias de sinalização celular em resposta a fatores de
crescimento e citocinas são cruciais para as vantagens na sobrevivência e
proliferação que as células do câncer apresentam sobre as células normais.
Portanto, a caracterização desses perfis de sinalização aberrantes pode revelar
mecanismos pelos quais essas células interpretam os sinais do microambiente para
evadirem dos mecanismos de manutenção da homeostase.
Estudos realizados com linhagens celulares e amostras primárias de LMA
diferem bastante no que se refere à existência de correlação direta entre mutações e
ativação de proteínas envolvidas na sinalização celular (77,111,121). Assim, podese propor que não é o nível absoluto das proteínas da sinalização (ou seu status de
fosforilação basal) o mais informativo sobre os processos de sinalização que
ocorrem no câncer, mas a resposta a estímulos do microambiente. Adicionalmente,
Discussão | 87
demonstrou-se que padrões aberrantes de sinalização podem ser identificados tanto
na ausência quanto na presença de citocinas/fatores de crescimento (110,122). Por
essa razão, analisamos a sinalização constitutiva e os padrões de resposta aos
estímulos utilizados entre amostras de LMA.
Na comparação entre os níveis de fosfoproteínas detectados entre as
amostras de LMA na ausência de estímulo e na presença de G-CSF ou SCF, nossos
resultados demonstraram que as subpopulações de células ALDHhigh e ALDHint
puderam ser distinguidas pelos níveis basais de fosfoproteínas detectados e/ou por
seu perfil de resposta aos fatores de crescimento utilizados como estímulos. Esses
achados corroboram a nossa hipótese de que as duas subpopulações celulares são
funcionalmente distintas e de que as LIC e CTH respondem diferentemente aos
estímulos presentes no nicho medular. Assim, a busca por componentes dessas vias
responsáveis pela diferença da resposta pode identificar alvos para intervenção
terapêutica.
Entre as aberrações na sinalização celular detectadas na subpopulação
ALDHint, elevados níveis basais de fosforilação das proteínas Stat3 e Erk foram
observados em comparação com a subpopulação ALDHhigh. Adicionalmente, a
ausência de resposta aos estímulos utilizados foi mais frequente na subpopulação
ALDHint. Essa combinação entre níveis basais elevados de fosfoproteínas e
ausência de resposta aos estímulos pode representar um mecanismo de
manutenção das células leucêmicas, que poderia levar à recaída da LMA (4).
A ativação constitutiva de Stat3 pode desempenhar um papel na
transformação maligna por meio da ativação de mecanismos antiapoptóticos, o que
foi descrito em diversos cânceres. Foi demonstrado que a inibição da via Stat3
induziu apoptose em linhagens celulares de câncer de mama (123). Adicionalmente,
em células de mieloma múltiplo nas quais a ativação de Stat3 foi induzida pelo
tratamento com IL-6, detectou-se o aumento das proteínas Bcl-xL e Mcl-1 (dois
membros da família Bcl-2 de proteínas antiapoptóticas) (124). Em tumores de
cabeça e pescoço, a ativação constitutiva de Stat3, associada ao aumento da
sinalização via receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR), induziu
mecanismos antiapoptóticos mediados por Bcl-x (125). Entre os alvos regulados
pelas vias STAT, c-myc, ciclina D1 e Bcl-x parecem contribuir para a oncogênese
por meio da indução de proliferação celular e sobrevida através do controle da
progressão do ciclo celular e/ou inibição da apoptose. Adicionalmente, demonstrou-
Discussão | 88
se que a interação direta entre as vias STAT e MAPK pode estar envolvida na
transformação oncogênica (126).
As vias PI3K/Akt e Ras/MAPK estão envolvidas na regulação da morte celular
de diversas formas (127,128). Uma vez fosforilada, Akt promove a fosforilação de
Bad e FoxO, que são sequestradas no citoplasma, bloqueando a indução da
expressão gênica de ligantes de morte celular (TRAIL e Fas-L) e de proteínas próapoptóticas da família Bcl-2 (Bim, Bad). P-Akt promove também a ativação de NFκB, que por sua vez regula múltiplos fatores de sobrevida, inclusive proteínas
antiapoptóticas (129). A forma ativada de Erk, por sua vez, fosforila Bim (um
regulador pró-apoptótico) e IκBα (inibidor de NF-κB), marcando-os para degradação
(130). Em condições homeostáticas, o balanço entre reguladores anti- e próapoptóticos garante que as células entrem em apoptose quando cessam os sinais
para sobrevida, fornecidos por fatores de crescimento e pelo microambiente.
Entretanto, a hiperativação da sinalização das vias PI3K/Akt e Ras/MAPK perturba o
equilíbrio em favor de sinais antiapoptóticos, contribuindo para sobrevida e
expansão das células tumorais (131). Como descrito acima para P-Stat3, no
presente estudo detectou-se uma associação entre níveis basais aumentados de PErk e menor sensibilidade à ativação pelo estímulo com SCF na subpopulação
enriquecida em células leucêmicas (ALDHint). Considerando-se que essa via medeia
sinais primariamente mitogênicos e antiapoptóticos (131), a ativação constitutiva de
Erk e Akt detectada somente na subpopulação ALDHint pode estar associada a
mecanismos que promovem a manutenção dessa população de células leucêmicas.
Não foi observado um perfil característico de resposta de sinalização que se
correlacionasse com alterações genéticas específicas. Não foi detectado aumento
na fosforilação basal de Stat5 em pacientes portadores da mutação FLT3-ITD. Em
estudos realizados com populações de blastos da LMA, Pallis et al. (2003) e Irish et
al. (2004) não observaram diferenças na fosforilação basal de Stat5 entre portadores
ou não de mutações FLT3-ITD (4,77). Entretanto, Irish et al. (2004) descreveram
maiores níveis de P-Stat5 após estímulo com G-CSF entre pacientes FLT3-ITD+.
Apesar do pequeno número de amostras FLT3-ITD incluídas na presente análise,
nossos resultados também não sugerem que haja aumento da fosforilação basal de
Stat5 nas células-tronco da LMA, nem aumento dos níveis dessa fosfoproteína em
resposta ao G-CSF, contrariando os resultados reportados por Irish et al. (2004) (4).
Além disso, nós observamos elevados níveis constitutivos de P-Stat3 em células
Discussão | 89
ALDHint de pacientes FLT3-ITD+, os quais não aumentaram com o tratamento com
G-CSF. Nossa interpretação destes achados é que o perfil apresentado pelas LIC da
LMA FLT3-ITD+ possa estar associado à quiescência característica das célulastronco, o que tornaria as células leucêmicas não-respondedoras mais resistentes à
quimioterapia.
Apesar da variabilidade nos níveis basais de P-Stat3 e P-Stat5 detectados
nas células ALDHint quando as amostras coletadas ao diagnóstico foram
comparadas às da recaída, foram observados perfis semelhantes em resposta ao GCSF. Após estímulo com G-CSF, foram detectados menores níveis tanto de P-Stat3
quanto de P-Stat5 na subpopulação ALDHint isolada das amostras da recaída em
relação à mesma população isolada ao diagnóstico. Este resultado sugere que
durante o curso da doença (e do tratamento), a subpopulação celular enriquecida
em LIC passou por mudanças na sinalização desta via, as quais podem tê-la tornado
menos sensível à ativação. Essa mudança na sensibilidade ao estímulo com G-CSF
pode representar um mecanismo de resistência das LIC.
Gibbs et al. (2013) demonstraram que em CTH normais, a resposta ao G-CSF
com fosforilação de Stat3 apresenta relevância biológica, promovendo entrada no
ciclo celular e aumento da proliferação em um subgrupo de células CTH. Após o
fracionamento deste compartimento com base na expressão do CD114 (receptor do
G-CSF), os autores demonstraram no compartimento CD114neg/lo enriquecimento de
CTH long-term, as quais estavam quase completamente ausentes no compartimento
CD114pos (106). Corroborando a aplicabilidade clínica deste achado, Redell et al.
(2013) demonstraram que os padrões de ativação de Stat3 por G-CSF e IL-6
apresentaram uma associação com a sobrevida dos pacientes, de modo que os
pacientes cujos blastos foram mais sensíveis ao estímulo com G-CSF apresentaram
maior sobrevida global e maior sobrevida livre de eventos (82). O mecanismo
proposto por ambos os trabalhos baseia-se na ideia de que as células mais
sensíveis ao G-CSF, que promove proliferação celular, seriam mais vulneráveis à
ação de quimioterápicos que têm como alvo células em divisão. Irish et al. (2006)
demonstraram que pacientes em cujos blastos foram detectados altos níveis de
Stat5 e Stat3 fosforiladas tanto na presença como na ausência de G-CSF
apresentaram evoluções clínicas diversas, enquanto aqueles cujos níveis de ambas
as fosfoproteínas foram elevados apenas após estímulo com G-CSF apresentaram
evolução clínica desfavorável (104).
Discussão | 90
Além da caracterização da sinalização celular, os perfis de metilação global
genômica também foram comparados entre as subpopulações ALDHint e ALDHhigh
isoladas de pacientes com LMA, além da ALDHhigh isolada de doadores saudáveis.
Nossos dados sugerem que o perfil de metilação possibilita a distinção entre
subpopulações celulares enriquecidas em células-tronco normais e leucêmicas, de
acordo com os critérios adotados nesse estudo.
Na comparação entre células ALDHhigh isoladas de pacientes com LMA e de
doadores saudáveis, observou-se que relativamente poucos genes estavam
diferencialmente metilados. As análises de PCA e o agrupamento hierárquico
reforçaram as similaridades existentes entre estas subpopulações. Por outro lado,
na comparação entre células ALDHint isoladas de pacientes com LMA e células
ALDHhigh isoladas de doadores saudáveis, não se observou uma clara distinção
entre amostras normais e leucêmicas com base nos perfis de metilação. Embora a
maioria das amostras leucêmicas tenha formado um grupo distinto das amostras
normais, duas amostras leucêmicas (P2 e P13) apresentaram perfis de metilação
relativamente semelhantes ao apresentado pelas células de doadores saudáveis.
Além disso, os genes diferencialmente metilados nas LIC em comparação com as
CTH estão relacionados a processos biológicos que conferem vantagens na
sobrevida e mecanismos de resistência à terapia. Na subpopulação celular ALDHint,
detectou-se hipometilação nas regiões promotoras de genes relacionados à inibição
da apoptose (BCL2), remodelamento da matriz extracelular e formação de colágeno
(COL2A1, COL9A2/3), receptores do tipo tirosina-quinase (ERRB2, ABL1), controle
do ciclo celular (E2F, CDKN2A, EP300, EP400), resistência a múltiplas drogas
(ABCB10, ABCC8, ABCD3, ABCD4), proteínas das vias MAPK (MAPK 3/8/11/12/13)
e do VEGF (PIK3R1, PP3CA, PPP3CC, NFATC2/4). Entre os genes hipermetilados
nas células ALDHint em comparação com as CTH normais, estão genes que
codificam transportadores do tipo ATP-binding cassette (ABCD2/3), além de genes
envolvidos na formação de colágeno e da matriz extracelular (LAMA3/5, COL8A2,
COL9A2, FGF4/19), fatores pró-apoptóticos (BAD, BID), E-caderina (CDH1) e
proteínas envolvidas na sinalização do ácido retinoico e resistência a drogas
(ALDH1A3). As diferenças entre os metilomas das subpopulações estudadas
indicam que as células ALDHint apresentam alterações epigenéticas associadas ao
desenvolvimento e manutenção de neoplasias. Estas alterações sugerem uma base
Discussão | 91
molecular para as diferenças funcionais observadas entre células ALDHhigh e
ALDHint.
Os resultados de regulação da expressão gênica estão alinhados com os de
sinalização celular, como evidenciado pela detecção de maiores níveis basais das
formas fosforiladas de Stat3 e de Erk1/2 nas LIC, quando comparadas às CTH, e de
hipometilação no gene STAT3 e em genes da via MAPK. Entretanto, os diversos
mecanismos regulatórios compreendidos entre a informação contida no DNA e a
expressão de proteínas não permitem inferir que haja uma correlação direta entre os
resultados obtidos por ERRBS e fosfo-flow. Uma maior compreensão a respeito da
interação entre mecanismos epigenéticos e sinalização celular se faz necessária.
Dada à natureza reversível das modificações epigenéticas, nossos dados reforçam a
potencial relevância do perfil de metilação das células-tronco leucêmicas para
finalidades terapêuticas.
Nossos resultados sugerem a potencial aplicabilidade do método fosfo-flow
para detecção de DRM na LMA, sobretudo nos casos em que não há marcador
genético específico para ser rastreado ou expressão aberrante de antígenos
detectável por imunofenotipagem. Além disso, a demonstração da ocorrência de
sinalização celular aberrante nas LIC identifica alvos em potencial para intervenção
terapêutica.
6 CONCLUSÕES
Conclusões | 93
• As subpopulações celulares CD34+CD38-ALDHhigh e CD34+CD38-ALDHint
podem ser diferenciadas pelo perfil de sinalização celular na ausência de
estímulo externo e em resposta ao estímulo com G-CSF e SCF;
• A subpopulação celular CD34+CD38-ALDHint, enriquecida em LIC, apresenta
perfil de sinalização celular distinto do apresentado por células-tronco de
medula óssea normal;
• Os metilomas das células CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de pacientes com
LMA conservam similaridades nos padrões de metilação com células
CD34+CD38-ALDHhigh isoladas de doadores saudáveis.
• Não se observou uma clara distinção entre células CD34+CD38-ALDHhigh
isoladas de doadores saudáveis e células CD34+CD38-ALDHint, isoladas de
pacientes com LMA, com base nos perfis de metilação global genômica.
Entretanto, a subpopulação CD34+CD38-ALDHint apresentou DMC em genes
que desempenham um papel no desenvolvimento e manutenção do câncer,
bem como na resistência à quimioterapia.
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