Histotecnologia Óssea

HISTOTECNOLOGIA ÓSSEA
John R. Kammerman, Edna B. Prophet & Carlton F. Barnes
Para a rotina da histotecnologia óssea é necessário remover os sais de cálcio sem que se altere,
severamente, os detalhes celulares. O emblocamento em parafina é recomendado para os espécimens
de todos os tamanhos, incluindo as preparações de montagem inteira de corte de ossos longos.
FIXAÇÃO
Fixe todos os espécimens tissulares em formalina a 10%, neutra, tamponada, por até cinco dias.
É recomendável que os ossos longos, grandes, sejam envoltos em musselina ou em várias camadas de
gaze para assegurar o contato entre o fixador e o espécime inteiro, e prevenir que fragmentos de tecido
flutuem livremente.
Após a fixação preliminar, os grandes espécimens podem ser cortados do tamanho apropriado
ao dos cassetes padrões. Os ossos longos, da perna e do braço, são convencionalmente cortados ou
seccionados utilizando-se uma serra manual.
Uma fixação adicional em formalina de concentração dobrada (20%) é recomendada,
especialmente para os espécimens a serem montados com superfície de corte inteira, após serem
serrados.
SOLUÇÃO DE FORMALINA A 20%, NEUTRA, TAMPONADA
Formaldeído (37% - 40%) ............................................. 20 mililitros.
Água destilada ............................................................. 80 mililitros.
Fosfato de sódio, monobásico (NaH2PO4)✝..................... 4,0 gramas.
Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4)✝........................... 6,5 gramas.
✝
BIOSSEGURANÇA: Danosos à saúde se inalados, engolidos, ou em contato com a pele e as mucosas, podendo,
inclusive, causar irritação e sensibilização.
Os espécimens, provenientes de biopsia ou de curetagem, são fixados por 1 a 2 horas em
formalina a 20%. Os espécimens cirúrgicos de rotina, que normalmente cabem no cassete plástico,
devem ser fixados por 24 a 48 horas, e os maiores espécimens, a serem montados para corte inteiro,
tais como os ossos longos, devem ser fixados por 72 horas ou mais.
Todos os espécimens fixados, provenientes de biopsia ou de curetagem, são lavados em água
corrente, com fluxo lento, por no mínimo 30 minutos. Os espécimens maiores são lavados por não
mais que 1 hora. Evite lavar rapidamente em água corrente. Para evitar perder as amostras pequeninas
decante cuidadosamente o fixador.
DESCALCIFICAÇÃO
SOLUÇÃO ESTOQUE DE ÁCIDO CLORÍDRICO A 8%
Ácido clorídrico, concentrado (HCl)✝............................ 80 mililitros.
Água destilada ............................................................ 920 mililitros.
SOLUÇÃO ESTOQUE DE ÁCIDO FÓRMICO A 8%
Ácido fórmico (HCOOH)✝......................................... 80 mililitros.
Água destilada ........................................................... 920 mililitros.
SOLUÇÃO DE TRABALHO DE ÁCIDO FÓRMICO-ÁCIDO CLORÍDRICO
Combine partes iguais das soluções de ácido clorídrico a 8% e de ácido fórmico a 8%.
✝ BIOSSEGURANÇA:
O ácido clorídrico e o ácido fórmico são substâncias corrosivas e tóxicas. Não respire os
vapores e evite o contato com a pele, mucosas, olhos e com a roupa. Em caso de acidente
lave a superficie com abundante água corrente.
Procedimento
1. Os espécimens devem ser descalcificados em solução de trabalho de ácido clorídrico-ácido
fórmico, numa quantidade de 20 vezes o volume do espécime.
2. Troque a solução descalcificadora diariamente, até que a descalcificação tenha se completado.
3. Lave os espécimens completamente por até 1 hora.
Os espécimens não devem ser amontoados juntos, de modo que se consiga uma completa e rápida
descalcificação. A descalcificação excessiva danificará permanentemente o espécime. Os
procedimentos a seguir auxiliam determinar corretamente, o ponto final da descalcificação.
Ponto final da descalcificação
O ponto final da descalcificação pode ser checado pelo exame do espécime ao raio X ou por
testes químicos ou físicos. O exame ao raio X é o mais preciso. Se não for possível radiografar o
espécime, o seguinte teste químico, para detectar os resíduos de sais de cálcio, é recomendado, em
lugar do teste físico, o qual é menos acurado e pode potencialmente danificar o espécime.
Teste químico
As soluções seguintes são necessárias para testar quimicamente os resíduos de cálcio.
HIDRÓXIDO DE AMÔNIO A 5% (ESTOQUE)
Hidróxido de amônio (NH4OH)✝, 28% ........................... 5 mililitros.
Água destilada .............................................................. 95 mililitros.
OXALATO DE AMÔNIO A 5% (ESTOQUE)
Oxalato de amônio (COONH4)✝......................................... 5 gramas.
Água destilada ............................................................... 95 mililitros.
SOLUÇÃO DE TRABALHO DE HIDRÓXIDO DE AMÔNIO / OXALATO DE AMÔNIO
Misture partes iguais das soluções de hidróxido de amônio a 5% e de oxalato de amônio a 5%.
✝ BIOSSEGURANÇA:
Tóxicos e, ou corrosivos. Evite inalar, deglutir ou o contato com a pele, mucosas, ou
quaisquer partes do corpo.
Procedimento
1. Insira uma pipeta na solução descalcificante contendo o espécimen.
2. Retire, aproximadamente, 5 ml da solução descalcificante de ácido clorídrico / ácido fórmico
do fundo do frasco, onde se encontra o espécime e coloque em um tubo de ensaio.
3. Adicione aproximadamente 10 ml da solução de trabalho de hidróxido de amônio / oxalato de
amônio, misture bem e deixe em repouso por uma noite.
4. A descalcificação está completa, quando nenhum precipitado é observado em dois testes
químicos, feitos em dois dias consecutivos. Repita este teste a cada dois ou três dias.
Testes físicos
Os testes físicos incluem dobrar o espécime ou inserir um alfinete ou uma lâmina de bisturi
diretamente no mesmo. A desvantagem de inserir alfinete ou uma lâmina de bisturi é a criação de
artefatos de corte ou de orifício. Dobrar suavemente o espécime é mais seguro e menos danoso, porém
não permitirá, de modo conclusivo, saber se todos os sais de cálcio foram removidos. Após checar a
rigidez, lave completamente o espécime em água corrente, antes do processamento.
REFERÊNCIA:
PROPHET, E. B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B. & SOBIN, L.H., eds.- Armed Forces Institute of
Pathology. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C., American Registry of Pathology,
1994.
DESCALCIFICAÇÃO COM ÁCIDO ETILENODIAMINOTETRAACÉTICO (EDTA)
FIXAÇÃO: Formalina a 10%, neutra, temponada.
SOLUÇÃO
SOLUÇÃO DE EDTA (VERSENATO)
EDTA ........................................................................10 gramas
Água destilada (pH 5,5 a 6,5) ................................ 100 mililitros
PROCEDIMENTO
1. Coloque o tecido ósseo, previamente fixado em formalina a 10%, neutra, tamponada, na solução de
EDTA e deixe até que a descalcificação esteja completa. Leia as observações abaixo.
2. Coloque em solução de etanol a 70%. Lavagem não é necessária.
3. Desidrate, clarifique e faça a infiltração e o emblocamento em parafina, ou outro processamento que
desejar.
OBSERVAÇÕES
a. A maioria dos espécimens ósseos, com 3 milímetros de espessura, descalcifica em 2 a 4 dias. (Deixe
os fragmentos suspensos por fio, quando imersos na solução de EDTA).
b. Os espécimens podem ficar na solução de EDTA por até 14 dias sem que se notem efeitos na
qualidade da coloração das células. Isto é especialmente verdadeiro se a solução estiver com pH entre
5,5 e 6,5.
c. A solução de EDTA deve ser usada para a descalcificação de materiais ósseos densos. Neste caso
pode ser necessário longo tempo de modo que a solução de EDTA deve ser trocada no intervalo de 3 4 dias. A vantagem do EDTA é a preservação da afinidade tintorial das células.
REFERÊNCIA:
Birge, E.A. & Imhoff, C.E. – Versenate as a decalcifying agent for bone. Amer. J. Clin. Path. 22: 192193, 1952.
In: Luna, L.G. – Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of
Pathology. New York, McGraw-Hill, 1968, pp. 9-10.