Apresentação neurotransmissores 1 2016

Prof. Martin Metzger
Sala 240, ICB 1
Tel. 30918044
[email protected]
Neurotransmissores e seus receptores: Introdução
1. Definição e classificação dos neurotransmissores
2. Métodos para demonstrar e quantificar neurotransmissores
Definição dos neurotransmissores:
Os neurotransmissores são substâncias químicas produzidas pelos
neurônios e são usadas para transmitir informação entre eles. Estes são
libertados por um neurônio pré-sináptico para a fenda sináptica, no
espaço extra-celular e causam uma alteração na membrana póssináptica. Esta célula receptora, pode ser um neurônio com receptores
especificas para os neutransmissores, sofrendo uma alteração de
potencial, porém, também pode ser uma célula muscular ou uma célula
glandular. Define-se por neurotransmissão a conversão de um evento
elétrico num evento químico e posteriormente noutro evento elétrico.
Sinapses:
A sinapse é um local por onde a informação é transmitida de uma
célula a outra. A informação pode ser transmitida por mecanismo
elétrico (sinapses elétricas) ou químico (sinapses químicas).
Historia
1873
Camilo Golgi (Itália): Técnica
Golgi para impregnar neurônios.
de
1890
William James
(Estados Unidos):
Introduziu o termo plasticidade
1893
Eugenio Tanzi (Itália): Hipertrofia de
elementos neurais consequente de
aprendizagem.
1894
Ramón y Cajal (Espanha): Doutrina
neural,
dinamismo,
plasticidade,
exercícios
neurais:
Mudanças
atividade-dependentes de conexões
neurais.
1897
Charles
Scott
Sherrington
Britânia: Sinapse como
a
entre dois neurônios.
1948
Jerzy Konorski (Polônia):
de novas sinapses
(Grãjunção
Formação
Sinapse elétrica
Sinapse química
Sinapse elétrica:
Sinapses Químicas:
Nas sinapses químicas, a informação é transmitida, através
da fenda sináptica, por meio de neurotransmissor, uma
substância que é liberada pela terminação pré-sináptica e
que se fixar a receptores na terminação pós-sinaptica.
A seguinte seqüência de etapas ocorre nas sinapses químicas.
Um potencial de ação, na célula pré-sináptica faz com que
canais de Ca2+ se abram. Ocorre influxo de Ca2+ para a
terminação pré-sináptica, provocando a liberação do
neurotransmissor por excocitose. O neurotransmissor se
difunde pela fenda sínaptica, fixa-se a receptores na
membrana pós-sínaptica, produzindo variação do potencial
de membrana na célula pós-sináptica.
Neurotransmissores:
A transmissão da informação, nas sinapses químicas; envolve
a liberação de um neurotransmissor pela célula pré-sináptica,
difusão através da fenda sináptica e fixação do neurotransmissor a receptores específicos na membrana pós-sináptica para
produzir variação do potencial de membrana.
Os seguintes critérios são usados para designar, formalmente,
uma substância como neurotransmissor:
1. A substância deve ser sintetizada na célula pré-sináptica
2. A substância deve ser liberada pela célula pré-sináptica,
quando estimulada
3. Se a substância for aplicada exogenamente à membrana
pós-sináptica, na concentração fisiológica apropriada,
a resposta da célula pós-sináptica deve ser semelhante
à resposta in vivo
4. Existe um mecanismo especifico para remover a substância
do sitio da ação (a fenda sináptica)
Otto Loewi (1873-1961)
Ganhador do prêmio Nobel em 1936 junto com Henry Dale para suas
descobertas sobre a neurotransmissão química em particular a acetilcolina.
1921: Otto Loewi, em Viena:
Terminais nervosos simpáticos ou
parassimpáticos podem conter
substâncias químicas que poder ser
liberadas pela estimulação e que
por sua vez, poderiam também
transmitir impulsos nervosos para
seus respectivos órgãos efetores
Reciclagem do glutamato pelas células gliais:
Classificação dos neurotransmissores:
Aminas Biogênicas:
Dopamina
Adrenalina
Noradrenalina
Serotonina
Histamina
Acetilcholina (Ach)
Agentes gasosas:
Óxido Nítrico
Monóxido de carbono
Aminoácidos:
Glutamato +
Aspartato
Ácido y-aminobutírico (GABA) –
Glicina
Neuropeptídeos:
Substância P
Vasopressina
Peptídeo Inibidor Vasoactivo VIP
Endorfinas
Dinorfina
Ocitocina
Neurotensina
Métodos para demonstrar e quantificar neurotransmissores
e seus receptores em tecidos e “in vivo”.
1. Imunohistoquímica
2. Hibridização “in situ”
3. Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC)
4. Microdiálise “in vivo”
5. Imunoeletrônica
6. Auto-radiografia de receptores
7. Imunoblotting
8. Ensaios genéticos
Definition of immunohistochemistry:
Immunohistochemistry can be considered as the
demonstration of antigens in tissue sections by the use of
specific antigen-antibody interactions which culminate in the
attachment of a marker to the antigen.
Antigen: Serotonin
Primary antibody:
Rabbit anti-serotonin
Secondary antibody:
Biotinylated anti-rabbit
Tertiary antibody:
Avidin-biotin peroxidase
Complex
Chromogen:
Diaminobenzidine (DAB)
Marcação de dopamina pela técnica de imunoperoxidase
na substância negra:
Marcação de tirosina hidroxilase (TH) pela técnica de
imunoperoxidase no córtex pré-frontal:
Síntese das catecolaminas:
Marcação de noradrenalina pela técnica de Falck-Hillarp
(tratamento com formol).
Marcação de noradrenalina pela técnica de imunoperoxidase:
Marcação de noradrenalina pela técnica de imunoperoxidase:
Marcação dupla de imunofluorescência:
Estudos de co-localização:
Estudos de co-localização:
Um ou dois neurotransmissores principais ?
The DR is a highly heterogeneous structure with distinct
subregions differentially involved in stress paradigms and
affective disorders (Lowry et al. 2008; Hale & Lowry (2011).
Material & Métodos:
Técnicas de rastreamento neural
Incorporação do traçador pelos terminais axônicos e
transporte retrógrado para os corpos celulares:
Incorporação do traçador pelos corpos celulares e
transporte anterógrado para os axônios:
Métodos combinados:
Imunohistoquímica/rastreamento retrógrado:
Métodos combinados:
Imunohistoquímica/rastreamento anterógrado:
Imunohistoquímica:
Vantagens: Especificidade (dependendo do anticorpo primário)
Facilidade da combinação com outras técnicas
Facilidade de marcações múltiplas
Desvantagem:
Difícil de quantificar
In situ hybridization:
In situ hybridization, as the name suggests, is a method of
localizing and detecting specific mRNA sequences in
morphologically preserved tissues sections or cell
preparations by hybridizing the complimentary strand of a
nucleotide probe to the sequence of interest.
Normal hybridization requires the isolation of DNA or RNA,
separating it on a gel, blotting it onto nitrocellulose and
probing it with a complimentary sequence.
Probe types:
DNA (double strand)
DNA (single strand)
RNA
Oligunucleotide
Probe labeling:
Radioactive (32P, 35S, 3H)
Biotin
Digoxigenin
Fluorescence
Hibridização “in situ”
Vantagem: Especificidade
Hibridização “in situ” para o receptor kappa
mRNA versus protein localization
Hybridizations with 35S-radiolabeled GAD67 probe combined
with immunhistochemical detection of CTb
From: Sego et al. (2014)
Hybridizations with 35S-radiolabeled VGLUT2 probe
combined with immunhistochemical detection of CTb
Explorando o Sistema Serotonérgico
On-Line
http://mouse.brain-map.org/brain/Tph2/71378535/thumbnails.html?ispopup=1
Hibridização “in situ”
Desvantagem: Resolução celular
From: Metzger et al., 2006)
Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC)
“In vivo” brain microdialysis:
Microdialysis is a technique to monitor the chemistry of the
extracellular space in living tissue. The technique has been extensively
used in the neurosciences to monitor neurotransmitter release.
The basic principle is to mimic the function of a capillary blood vessel by
perfusing a thin dialysis tube implanted into the tissue with a physiological
liquid. The perfusate is analysed chemically and reflects the composition of
the extracellular fluid with time due to the diffusion of substances back and
forth over the membrane. Microdialysis is thus a technique whereby
substances may be both recovered from and supplied to a tissue.
“In vivo” brain microdialysis:
What is Voltammetry?
• As an applied potential is
changed over time a
current is measured
• Reduces ions in the
electrode
• Commonly uses three
electrodes
– Working Electrode (WE)
– Auxiliary Electrode (AE)
– Reference Electrode (RE)
Fast-scan cyclic voltammetry (FSCV):
Analytical Methods
• Chromatography
– Large amounts of materials used
– Not very sensitive
• Voltammetry
– Extremely sensitive
– Few components used
– Wide range of concentrations
Imunoeletrônica:
From: Metzger et al. (2002)
Cryo-immunogold EM labeling of marker proteins in uninfected and prion-infected
hippocampus.
Godsave S F et al. J. Neurosci. 2008;28:12489-12499
©2008 by Society for Neuroscience
Localização extra-sináptica de receptores de dopamina D1:
Junção neuromuscular:
A sinapse entre o axônio do motoneurônio e a fibra muscular
é chamada junção neuromuscular. Um potencial de ação nesse
axônio produz um potencial de ação em todas as fibras musculares que inerva.
Neurotransmissão volumétrica – Volume transmission
From: Zoli et al., 1999
Receptores de Neurotransmissores:
Receptor nicotínico de Acetilcolina:
Exemplo de um receptor ionotrópico
Ações de neurotransmissores em receptores acoplados a proteínas G:
Auto-radiografia
de receptores:
Uso de radioligantes
(antagonistas radioativas
como [3H]SCH23390
para o receptor de dopamina
do tipo D1.
Vantagem: Dar uma boa
impressão da distribuição
geral. Quantificação simples
Desvantagem: Nenhuma
resolução celular
Among all AMPA-type glutamate receptor subunits, the GluR2/3
subunit shows the most robust expression in the mPFC .
Serotonin 5-HT2A imunohistochemistry:
The dopamine receptor family:
AMPA receptors mediate the majority of the fast excitatory synaptic
transmission. Kainate receptors contribute to the postsynaptic responses at
excitatory synapses and can also modulate presynaptic neurotransmitter
release at some synapses, whereas NMDA receptors are crucial for the
induction of specific forms of synaptic plasticity and play important roles in
several neuropsychiatric disorders .
Table from: Kew & Kemp (2005)
AMPA-type receptors:
AMPA receptors are tetrameric heteromeric complexes of four homologous
subunits GluR1 to GluR4, which combine in different stoichiometries to form
distinct receptor subtypes. Each subunit has a large N-terminal extracellular
domain, three transmembrane domains and a C-terminal intracellular
domain. Most AMPA receptors contain the GluR2 subunit, which confers the
properties of Ca2+ impermeability and linear-rectification, characteristic of
the majority of AMPA receptors.
Scheme from: Song & Huganir (2002)
Métodos de imunoblotting:
Vantagem:
Fácil e exato de quantificar
Absolutamente critico: Disseção do material
Neurônios dopaminérgicos na substância negra:
GENETIC APPROACHES:
Green fluorescent protein (GFP)
Camundongos Cre que expressam uma proteína fluorescente
(tdTomato) em populações neuronais distintas:
Estudos de co-localização em camundongos geneticamente modificados
ChR2-mCherry expression in raphe obscurus neurons and their axonal projections.
DePuy S D et al. J. Neurosci. 2011;31:1981-1990
©2011 by Society for Neuroscience
Positron emission tomography (PET) = use of raditracers
with short lived positronemmiting isotopes.