Pericárdio Bovino Tratado com Ácido Glutâmico

Transcrição

Maria Christiane Valeria Braga Braile-Sternieri
Pericárdio Bovino Tratado com
Ácido Glutâmico para Confecção de
Próteses Valvulares Cardíacas:
Estudos In Vitro e In Vivo
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto para
obtenção do título de Doutor no
Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde, Eixo Temático Medicina
Interna.
Orientador: Prof. Dr. Moacir F. de Godoy
São José do Rio Preto
2013
Ficha Catalográfica
Braile-Sternieri, Maria Christiane Valeria Braga
Pericárdio bovino tratado com ácido glutâmico para confecção
de próteses valvulares cardíacas: estudos in vitro e in vivo / Maria
Christiane Valeria Braga Braile-Sternieri
São José do Rio Preto, 2013
90p.
Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de São José do Rio
Preto - FAMERP
Eixo Temático: Medicina Interna
Orientador: Prof. Dr. Moacir Fernandes de Godoy
1. Prótese de valva cardíaca; 2. Pericárdio bovino; 3. Ácido
glutâmico; 4. Estudo experimental.
Maria Christiane Valéria Braga Braile-Sternieri
Pericárdio Bovino Tratado com Ácido Glutâmico para
Confecção de Próteses Valvulares Cardíacas:
Estudos In Vitro e In Vivo
BANCA EXAMINADORA
TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR
Presidente e Orientador: Prof.Dr.Moacir Fernandes de Godoy
2º Examinador: ____________________________________
3º Examinador: ____________________________________
4º Examinador: ____________________________________
5º Examinador: ____________________________________
Suplentes: ______________________________________
______________________________________
São José do Rio Preto, ______/___________/_______.
SUMÁRIO
Dedicatória ................................................................................................ i
Agradecimentos ...................................................................................... ii
Epígrafe .................................................................................................. vi
Lista de Figuras ..................................................................................... vii
Lista de Tabelas ..................................................................................... xi
Lista de Abreviaturas e Símbolos .......................................................... xiii
Resumo ................................................................................................. xv
Abstract ................................................................................................ xvii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................. 1
1.1. Calcificação ................................................................................ 5
1.2. Objetivo.................................................................................... 10
2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................. 11
2.1. Tratamentos Químicos para Reticulação do Pericárdio
Bovino ...................................................................................... 12
2.1.1. Tratamento Controle (PB GA) ...................................... 13
2.1.2. Tratamento Anticalcificante (PB GA+Glu) ................... 16
2.2. Testes Físicos ........................................................................... 18
2.2.1. Teste de Resistência Mecânica........................................ 18
2.2.2. Análise Térmica.............................................................. 20
2.3. Avaliação Estrutural e Ultraestrutural ....................................... 21
2.3.1. Microscopia de Luz ........................................................ 21
2.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................. 22
2.4. Estudos in Vivo ......................................................................... 23
2.4.1. Teste de implante ............................................................ 24
2.5. Determinação do Índice de Calcificação ................................... 26
2.5.1. Calcinação dos Cadinhos Vazios .................................... 27
2.5.2. Secagem dos Explantes ................................................... 27
2.5.3. Calcinação dos Explantes ............................................... 28
2.5.4. Determinação do Índice de Calcificação dos
Explantes ........................................................................ 28
2.6. Análise Fractal ......................................................................... 29
2.7. Prótese Valvular de Pericárdio Bovino ..................................... 31
2.7.1. Confecção ....................................................................... 32
2.7.2. Caracterização ................................................................ 32
2.7.2.1. Teste de Durabilidade Acelerada ...................... 32
2.8. Análise Estatística .................................................................... 34
3. RESULTADOS ................................................................................ 35
3.1. Testes Físicos ........................................................................... 36
3.1.1. Teste de Resistência Mecânica e Análise Térmica .......... 36
3.2. Avaliação Estrutural e Ultraestrutural ....................................... 37
3.2.1. Microscopia de Luz ........................................................ 37
3.2.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ................. 39
3.3. Implantes em Subcutâneo de Ratos .......................................... 40
3.3.1. Avaliação da Biocompatibilidade do Implante ................ 40
3.3.2. Análise de Cálcio dos Explantes ..................................... 48
3.3.3. Determinação Quantitativa da Calcificação .................... 51
3.3.4. Análise da Dimensão Fractal .......................................... 53
3.3.5. Durabilidade Acelerada .................................................. 56
4. DISCUSSÃO ................................................................................... 58
5. CONCLUSÕES................................................................................ 72
6. REFERÊNCIAS ............................................................................... 74
7. APÊNDICES .................................................................................... 85
8. ANEXOS ......................................................................................... 89
i
DEDICATÓRIA
Aos meus filhos Sofia e Giovanni... minhas obras-primas e fontes
inesgotáveis do meu entusiasmo.
Ao meu melhor amigo, meu marido, Waltinho... pela nossa infinita
cumplicidade e sintonia sempre !!!
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e pela graça de poder realizar esse estudo.
Ao querido Prof. Dr. Moacyr Fernandes de Godoy, com seu jeito
manso e sagaz, olhar misterioso... sempre pronto a me aconselhar,
corrigir, ensinar e, sobretudo, valorizar os meus avanços.
Ao Prof. Dr. Gilberto Goissis, que me ensinou tudo sobre esse
assunto, com muita paciência e carinho... “Quantas vezes não pegou em
minhas mãos e me ensinou a escrever!”
Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, por sua orientação segura e
competente nos estudos morfológicos; suas críticas e sugestões foram
decisivas para o andamento e concretização deste trabalho.
Aos meus pais Domingo Braile e Maria Cecilia Braga Braile... o que
falar desse casal de estudiosos e por que não dizer, casal de cientistas?
Por uma vida inteira mostraram-me tantos caminhos e, além disso, que
era possível percorrer por vários deles, mas sempre de cabeça erguida e
alma aberta... nunca deixando a simplicidade e a essência de sermos
pessoas comuns por onde passássemos .... Muito obrigada, muito
obrigada mesmo por tudo o que sou e o que sempre fizeram e fazem por
mim e por todos nós!
À minha irmã Patricia... Com certeza a inspiradora do meu primeiro
sorriso... Sempre ao meu lado, minha protetora no escuro da noite e
destemida nas viagens de avião... Transformou-se na minha gigante
advogada de todas as horas... Primeira amiga da vida e para a vida
toda!!! Nem tenho o que falar...
Aos meus sobrinhos Rafael - o Grande, Luiza - La Bela, por me
deixarem ser um pouquinho dona de vocês também! Mais sobrinhos...
Fernanda, Fábio, Isa e Caio... que sempre alegram as nossas vidas...
dão sentido e continuidade a nossa família.
iii
Aos meus sogros Walter (in memorium), Carminha, meus cunhados
Gisele, Luis Antonio , Wagner e Jucimara... que delícia tê-los como
companheiros de minha jornada. Comigo para o que der e vier...
Parceiros incondicionais...
À base fundamental de tudo...
Lino Braile e Maria Neviani Braile,
Dario Pereira Braga e Cecilia Ferreira Braga...
Inesquecíveis...
Ao Prof. Dr. Renato Braz Araújo, companheiro incansável de
estudos, por sua compreensão, amizade e alívio em todos os momentos.
À Profª. Drª. Ana Paula Marques de Lima, Gerente de Pesquisas da
Braile Biomédica, que sentou comigo e me fez quieta nos mais
inusitados momentos... esteve junto de mim para que chegássemos até
aqui!
À Profª. Drª. Rosa Sayoko Kawasaki Oyama, por sua imensa
dedicação e rigor científico, ajudou-me a trilhar o intrigante caminho da
pesquisa... sempre com um sorriso no rosto, muito obrigada!!!
Às minhas queridas Midori Cristina Okubo, Glaucia Grazielli Basso
e Paula Inácio Rodrigues Ayres, sempre comprometidas com o meu
estudo.... Quanto fizeram com tabelas, estatísticas, fotos, formatações,
revisão ortográfica e outras inúmeras revisões... Trabalho primoroso e
amigo!!!
Ao Vladimir Donizete Aparecido Ramires, Gerente de
Desenvolvimento Biológico da Braile Biomédica, por toda ajuda na
realização das técnicas de preservação do pericárdio.
Ao Marcos Vinicius Pinto e Silva, Vinicius Ladeia, Aparecida de
Fátima Giglioti e Solange Dourado. A amizade demonstrada por cada
um de vocês e a colaboração técnica prestada no dia-a-dia do
laboratório foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.
iv
Aos meus assistentes Drª Eliana Migliorini Mustafá, Dr. Victor
Rodrigues, Dr. Fuad Kassis Filho, Dr. Felipe Toledo, Dr. Edson
Barboza Rezende, Drª Heloisa Ramazzini Braga, Dra. Daniela
Zerezuela, e toda minha equipe do Instituto Domingo Braile, que
cuidaram de nosso Serviço e dos pacientes com profissionalismo,
dedicação e sobretudo amor quando precisei me ausentar para que meu
sonho se concretizasse... Caríssima Cibele Olegario Vianna de Queiroz...
não poderia deixar de citá-la...você é fundamental para nós... trabalhadora,
incansável na organização de nosso Centro de Pesquisa.
Muito obrigada às minhas funcionárias do Instituto Domingo Braile, nas
pessoas de Maria Beserra de Souza Pereira e Ocely Aparecida
Trevizan, “as mais antigas”, quero agradecer a todas por todo cuidado,
atenção e preocupação para comigo e meu trabalho. Querido Weverson
Martins, sinta-se incluído... por todo comprometimento.
Aos meus Residentes e Estagiários do Instituto Domingo Braile que, no
dia-a-dia, ajudam-me a percorrer os meandros da Medicina e os enigmas
de cada diagnóstico, instigando-me sempre a conhecer mais... junto de
vocês !! A vida é mais alegre com vocês!!!! Com gratidão ...
Ao Prof. Dr. José Victor Maniglia, Diretor Adjunto de Pós-Graduação da
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), por seus
constantes esforços em promover o nosso curso.
Aos funcionários da Pós-Graduação da FAMERP, em especial a José
Antonio Silistino e Fabiana Cristina Godoy, pela dedicação e atenção,
pelo tratamento carinhoso e respeito dispensados aos alunos.
Aos pacientes e familiares que confiam suas vidas e a de seus entes
queridos a mim e a minha equipe... Que possamos sempre fazer jus a essa
confiança.
À minha terapeuta Aglair Pires, por seu magnífico conhecimento da alma
humana e pelo seu destemor em me convencer que eu podia!!
v
Às queridas Jocelena Cardoso Ferrarini e Nilzeli Xavier, minhas
companheiras do lar... Saibam que sem a vossa ajuda fraternal e dedicação,
pra lá de excepcional, seria absolutamente impossível a realização de toda
a minha vida profissional.
Aos meus Amigos, pois me ensinam a cada dia o verdadeiro sentido do
companheirismo. “Não existe patrimônio que mereça maior cuidado do
que nossos afetos”. (Aglair Grein)
vi
“Entre o plantio e a colheita,
há o tempo de espera.”
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino
do grupo controle (PB GA) ............................................... 15
Figura 2:
Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino
(PB) do grupo anticalcificante com ácido
glutâmico (Glu) PB GA+Glu ............................................ 17
Figura 3:
Equipamento Q-Test para teste de resistência
mecânica do pericardio bovino ......................................... 19
Figura 4:
Equipamento Braile Biomédica ® para teste de
encolhimento do pericárdio bovino ................................... 21
Figura 5:
(a) Exemplo de contorno irregular ajustado pelo
método de Box-Counting;
(b) Gráfico log-log para obtenção da dimensão
fractal ............................................................................... 31
Figura 6:
Equipamento de teste de fadiga de válvulas
biológicas ......................................................................... 33
Figura 7:
Fotomicrografias dos pericárdios bovinos (PB)
submetidos aos tratamentos controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-C) e
anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1%
(PB GA+Glu) (D-F), corados pela
Hematoxilina-Eosina (HE) (A e D), Orceína (B
e E) e Tricrômio de Masson (C e F). As setas
pretas indicam as fibras elásticas coradas pela
Orceína e as setas amarelas a ondulação das
fibras colágenas intensamente coradas pelo
Tricrômio de Masson ........................................................ 38
viii
Figura 8:
Fotomicrografias de microscopia eletrônica de
varredura dos pericárdios bovinos (PB)
submetidos aos tratamentos controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-B) e
(PB GA+Glu) (C-D). A = Aumento .................................. 39
Figura 9:
Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB),
submetidos a tratamento controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e tratamento
(PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de
ratos após 14, 28, 60 dias do implante,
mostrando diferentes graus de deposição de
colágeno. Deposição discreta (D), moderada
(M) e importante (I). Coloração: Tricrômio de
Masson. A = Aumento ...................................................... 42
Figura 10: Gráfico do escore total de agressão tecidual do
subcutâneo pós-implante de PB GA e PB
GA+Glu ............................................................................ 45
Figura 11: Fotomicrografias dos tipos celulares presentes
nos pericárdios bovinos (PB), submetidos ao
tratamento controle com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) e tratamento anticalcificante
com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu),
explantados de subcutâneo de ratos, após 14,
28, 60 dias do implante e corado pela
Hematoxilina-Eosina ........................................................ 46
Figura 12: Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB)
do grupo controle submetidos ao tratamento
com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-D) e
PB com tratamento anticalcificante com ácido
glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (E-H),
explantados de subcutâneo de rato e corados
pelo método de Von Kossa. Setas indicam
calcificação moderada. Aumento: 40X ............................. 50
ix
Figura 13: Gráfico Box-Plot: Resultados dos índices de
calcificação de pericárdios bovinos (PB) do
grupo controle tratado com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento
(PB GA+Glu), implantados em subcutâneo de
ratos, por períodos de 14, 28 e 60 dias (n= 5
PB/período de implante) ................................................... 52
Figura 14: Gráfico Box-Plot: Resultados da dimensão
fractal de pericárdios bovinos (PB) do grupo
controle tratado com glutaraldeído (GA) 0,5%
(PB GA) e PB submetidos ao tratamento
(PB GA+Glu) no pré-implante e após 14, 28 e
60 dias de implante, em subcutâneo de ratos
(n= 5 PB/período de implante) .......................................... 53
Figura 15: Fotomicrografias e respectivas binarizações de
pericárdios bovinos (PB) do grupo controle
tratado com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA)
e PB submetidos ao tratamento anticalcificante
com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu),
pré-implante e após 14, 28 e 60 dias de
implante ............................................................................ 55
Figura 16: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB)
do grupo controle antes (A e B) e após (C e D)
o teste de durabilidade ...................................................... 56
Figura 17: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB)
do grupo com tratamento anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) 1% (PB Ga+Glu) antes
(A e B) e após (C e D) o teste de durabilidade
acelerada. Nota-se a presença de peeling (setas) ............... 57
x
Figura 18: Esquema
representativo
do
tratamento
empregado no presente estudo. A: colágeno do
pericárdio bovino na presença do GA. B. Tipos
de ligações do GA com o colágeno; B1: Base
de Shiff, reação de reticulação em que os dois
aldeídos ligam-se ao colágeno; B2: apenas um
grupamento aldeídico liga-se ao colágeno; B3:
as moléculas de GA ligam-se formando uma
cadeia polimérica. C: em meio ácido (H +) ou
alcalino (OH-) as cadeias polimérica abrem-se,
formando aldeídos livres que se ligarão ao
ácido glutâmico. D: neutralização dos aldeídos
livres pelo ácido glutâmico (adaptado de
Carnevalli, 200380)............................................................ 62
Figura 19: Esquema representativo do tratamento químico
com glutaraldeído (GA) para reticulação das
fibras de colágeno do pericárdio bovino,
seguido de tratamento com peróxido de
hidrogênio (H2O2) formando o ácido
carboxílico com consequente diminuição da
toxicidade pelo glutaraldeído polimérico .......................... 67
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Protocolo de implante de PB com tratamentos
anticalcificante PB GA+Glu e controle PB GA,
em subcutâneo de ratos..................................................... 24
Tabela 2:
Propriedades mecânicas e térmicas de
pericárdio bovino (PB) submetidos ao
tratamento controle com glutaraldeído (PB GA)
0,5% (GA) e PB submetidos ao tratamento
anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) (PB
GA+Glu) .......................................................................... 36
Tabela 3:
Resultado das análises histopatológicas de
pericárdios bovinos submetidos a tratamento
convencional com glutaraldeído (GA) 0,5%
(PB GA) e tratamento anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu),
explantados de subcutâneo de ratos, quanto à
deposição de colágeno (n=5 animais / período
de implante) ..................................................................... 41
Tabela 4:
Resultados das análises histopatológicas de
pericárdio bovino (PB) submetido aos
tratamentos controle com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) e anticalcificante com ácido
glutâmico
(Glu)
1%
(PB
GA+Glu),
explantados de subcutâneo de ratos, quanto aos
tipos celulares (n=5 animais / período de
implante) .......................................................................... 44
Tabela: 5
Análise estatística comparativa dos tipos
celulares presentes na reação inflamatória
decorrente do implante de pericárdios bovinos
(PB) submetidos ao tratamento controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB
submetido ao tratamento anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), em
subcutâneo de ratos, após 14, 28, 60 dias (n=5
PB / período de implante) ................................................. 47
xii
Tabela 6:
Resultado das análises histopatológicas de
pericárdios bovinos (PB) do grupo controle
submetidos ao tratamento com glutaraldeído
(GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao
tratamento
anticalcificante
com
ácido
glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), após
implante em região subcutânea de ratos por 14,
28 e 60 dias, corados pelo método de Von
Kossa ............................................................................... 49
Tabela 7:
Valores médios ± desvio-padrão (DP) de
calcificação (µg de Ca++/mg de tecido seco), de
acordo com o tempo de implante de pericárdios
bovinos (PB) submetidos ao tratamento
controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB
GA) e ao tratamento anticalcificante com ácido
glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), em
subcutâneo de ratos (n=5 PB / período de
implante) .......................................................................... 51
Tabela 8:
Comparação dos índices de calcificação de PB
e/ou cúspide de válvula porcina, fixados com
GA e submetidos ou não a tratamentos
anticalcificantes, após implante em subcutâneo
de ratos ............................................................................. 65
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
A
AAMI
ANSI
ASTM
bpm
CEL GIG
CEUA
d
D
DF ou d
DP
et al.
FAMERP
GA
Glu
HE
I
ICP OES
ISO
L
M
MACROF
MEV
n
NEOV
NI
NS
OECD
P
PB
PLASM
PMN
ppm
RMS
S1
S2
S3
SIF
Aumento
Association for the Advancement of Medical Instrumentation
American National Standards Institute
American Society for Testing and Materials
Batimentos por minuto
Células gigantes
Comissão de Ética no Uso de Animais
Coeficiente angular
Discreta
Dimensão fractal
Desvio padrão
et alii (e outros)
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
Glutaraldeído
Ácido glutâmico
Hematoxilina-Eosina
Importante
Espectrometria de emissão ótica com plasma induzido
International Organization for Standardization
Lado
Moderada
Macrófagos
Microscopia eletrônica de varredura
Número
Neovascularização
Não informado
Diferença estatística não-significante
Organization for Economic Co-operation and Development
Probabilidade
Pericárdio bovino
Plasmócitos
Polimorfonucleares
Partículas por milhão
Root mean square
Solução 1
Solução 2
Solução 3
Serviço de Inspeção Federal
xiv
Tº
Ts
USA
x
Temperatura
Temperatura de encolhimento
United States of America
Vezes
%
>
≥
<
≤
®
ºC
Ca
cm
cm2
g
h
H2O2
keV
kg
kgf/mm2
l
µg
µm
mg
mg/kg
mg/l
MgSO4
min
ml
mm
mmHg
mol/l
N
NaCl
NaOH
pH
Porcentagem
Maior
Maior ou igual
Menor
Menor ou igual
Marca registrada
Graus Celsius / centígrado
Cálcio
Centímetro
Centímetro quadrado
Grama
Horas
Peróxido de hidrogênio
Quilo eletrovolts
Quilograma
Quilograma força por milímetro quadrado
Litro
Micrograma
Micra
Miligrama
Miligrama por quilograma
Miligrama por litro
Sulfato de magnésio
Minuto
Mililitro
Milímetro
Milímetro de mercúrio
Mol por litro (concentração molar)
Normal
Cloreto de sódio
Hidróxido de sódio
Potencial hidrogeniônico
xv
RESUMO
Introdução: Estudos têm mostrado que as doenças das valvas cardíacas
acometem indivíduos de todas as faixas etárias. Quando pacientes com
estas doenças apresentam piora em manifestações clínicas, como dilatação
das câmaras cardíacas, arritmias e insuficiência cardíaca, o tratamento é
cirúrgico, visando o reparo por meio de plastia ou troca por próteses
valvulares mecânicas ou biológicas. Apesar da vantagem das biopróteses
serem atrombogênicas, não estão livres de falhas primárias, sendo a
calcificação a principal delas. O presente estudo avaliou as propriedades do
pericárdio bovino in vitro e in vivo após tratamento anticalcificante com
glutaraldeído e ácido glutâmico para confecção de biopróteses cardíacas.
Materiais e Métodos: Foram utilizados 180 pericárdios bovinos, divididos
em dois grupos: o Controle (PB GA) tratado convencionalmente com
glutaraldeído 5% (n=90) e o com Tratamento Anticalcificante (PB
GA+Glu), tratado convencionalmente com glutaraldeído seguido de
tratamento com ácido glutâmico 1% (n=90). Após tratamento químico os
pericárdios de ambos os grupos foram submetidos ao teste de resistência
mecânica, análise térmica, avaliação estrutural e ultraestrutural. Em
seguida foram implantados em subcutâneo de ratos e explantados após 14,
28 e 60 dias para determinação da biocompatibilidade e do índice de
calcificação. Para auxiliar na avaliação comparativa do aspecto histológico
de uma forma mais objetiva, foi utilizado o cálculo da dimensão fractal.
Ao final foram confeccionadas válvulas cardíacas de PB para realização do
teste de durabilidade acelerada. Resultados: Amostras de pericárdio
bovino do grupo PB GA+Glu foram biocompatíveis ao organismo animal.
A análise de calcificação dos explantes de pericárdios bovinos, dos grupos
PB GA e PB GA+Glu, realizada pelo método de Von Kossa, revelou
discreta calcificação em todos os pericárdios, em todos os períodos (14,28
e 60 dias) tanto no grupo PB GA quanto no grupo PB GA+GLU. No
entanto a espectrofotometria de absorção atômica mostrou aumento
discreto gradual da concentração de cálcio nos pericárdios bovinos do
grupo PB GA aos 14, 28 e 60 dias, enquanto que nos pericárdios bovinos
submetidos ao tratamento anticalcificante permaneceu mais estável e em
níveis mais baixos. Na análise da dimensão fractal, o pré-implante foi
significantemente maior no grupo PB GA (P<0,0001). Após o implante a
xvi
situação inverteu-se, com a dimensão fractal sendo significantemente
maior no grupo PB GA+Glu aos 14, 28 e 60 dias (P= 0,0495; P=0,0034 e
P=0,0002, respectivamente). As válvulas confeccionadas com PB de
ambos os grupos, submetidas ao teste de durabilidade acelerada,
apresentaram integridade estrutural aos 200 milhões de ciclos de
batimentos. Conclusões: Pericárdio bovino reticulado pelo glutaraldeído e
tratado com ácido glutâmico apresentou características biomecânicas,
térmicas e morfológicas apropriadas para a confecção de válvulas
cardíacas. Os experimentos em implante subcutâneo de ratos mostraram
que os grupos químicos de glutaraldeído reativo livre, após reação com o
ácido glutâmico, causaram redução significante da calcificação tecidual.
xvii
ABSTRACT
Introduction: Studies have shown that the heart valve diseases affect
individuals of all age groups. When patients with these diseases have
worsening of clinical manifestations such as cardiac chamber dilatation,
arrhythmias and heart failure, treatment is surgical repair order by repair or
replacement by mechanical or biological valve prosthesis. Despite the
advantage of being non-thrombogenics, bioprostheses are not free from
primary failure and calcification is the main one. The present study
evaluated the properties of bovine pericardium in vitro and in vivo after
anticalcification treatment with glutaraldehyde and glutamic acid for
manufacturing cardiac bioprostheses. Materials and Methods: A total of
180 bovine pericardium were divided in two groups: Control (BP GA)
treated conventionally with 5% glutaraldehyde (n=90) and with
anticalcification treatment (BP GA+Glu), treated with glutaraldehyde
followed by treatment with 1% glutamic acid (n=90). After chemical
treatment the pericardium of both groups were submitted to mechanical
strength, thermal analysis, structural and ultrastructural tests. Then were
subcutaneously implanted in rats and explanted after 14, 28 and 60 days to
determine the biocompatibility and calcification index. The fractal
dimension was calculated to evaluate the histological appearance in both
groups. Finally, some bioprostheses were manufactured for achieving
accelerated durability test. Results: Samples of bovine pericardium group
BP GA+Glu were biocompatible to animal organism. The analysis of
calcification of bovine pericardium explants from groups BP GA and BP
GA+Glu held by the Von Kossa method, revealed mild calcification at all
the pericardium, in all periods (14, 28 and 60 days) in both groups.
However the atomic absorption spectrophotometry showed gradual slight
increase in calcium concentration in bovine pericardium group BP GA at
14, 28 and 60 days, whereas in bovine pericardium subjected to
anticalcification treatment remained more stable and at lower levels. In the
analysis of the fractal dimension, the pre-implantation was significantly
higher in group BP GA (P<0.0001). After implantation, the situation was
reversed, with the fractal dimension is significantly higher in BP GA+Glu
at 14, 28 and 60 days (P=0.0495, P=0.0034 and P=0.0002, respectively).
The valves prepared with BP of both groups were submitted to the
accelerated durability test, showed structural integrity of the 200 million
cycles of beats. Conclusions: Crosslinked bovine pericardium treated with
glutaraldehyde and glutamic acid showed biomechanical, thermal and
morphological properties appropriated for manufacturing heart valves.
Experiments in rat subcutaneous implant showed that the group BP
GA+Glu had a significant reduction in tissue calcification.
1. INTRODUÇÃO
Introdução - 2
Estudos médicos sobre doenças das valvas cardíacas têm mostrado
que elas acometem indivíduos de todas as faixas etárias em todo mundo e
são um problema de saúde pública, tanto em países desenvolvidos como
naqueles em desenvolvimento.1,2
De acordo com o estudo realizado por Nkomo et al. (2006),1 a
prevalência dessas doenças nos Estados Unidos, em 2000, foi estimada em
4,2 a 5,6 milhões de adultos. Sua forma moderada acomete 2,5% da
população geral, porém, com o avanço da idade, esta prevalência sofre um
aumento considerável, atingindo 8,5% dos indivíduos com 65-74 anos e
13,2% dos indivíduos com idade superior a 75 anos. No Brasil não há
dados estatísticos do número de indivíduos portadores dessa doença,
porém, de acordo com os dados do Ministério da Saúde, em 2011, foram
realizadas 27.284 cirurgias cardíacas de trocas valvares.3
As valvas cardíacas são estruturas com características próprias e sua
vida útil depende da sua posição intracardíaca, quantidade, qualidade e
arquitetura de sua matriz extracelular, principalmente do colágeno, elastina
e glicosaminoglicanas4. Além disso, apresentam capacidade de adaptação e
autorreparação diante de diferentes tipos de estresse.5
A arquitetura da matriz extracelular e o fenótipo das células
intersticiais
valvares
são
dinâmicos,
mantendo-se
em
constante
transformação durante toda a vida, inclusive em situações patológicas.6
Introdução - 3
Apesar disso, fatores genéticos, mecânicos, inflamatórios e imunogênicos
podem alterar a morfologia dessas valvas, tornando-as não funcionantes e
interrompendo a homeostase valvar.7
Dentre
as
principais
enfermidades
das
valvas
cardíacas,
considerando sua posição intracardíaca, destacam-se:
 Valva
aórtica
bivalvulada:
cardiopatia
congênita
de
maior
prevalência, podendo evoluir para estenose e/ou regurgitação,
endocardite infecciosa, dilatação da aorta e até mesmo dissecção
aórtica.8,9
 Estenose valvar aórtica calcificada: ocorre devido à calcificação das
cúspides valvares, tanto em valvas normais como em valvas aórticas
bicúspides
congênitas.10,11
Em
valvas
normais
manifesta-se
preferencialmente em indivíduos na oitava década de vida.12
 Degeneração mixomatosa da valva mitral: ocorre quando os folhetos
tornam-se aumentados, engrossados e redundantes, propiciando
complicações como insuficiência valvar, endocardite infecciosa,
tromboembolismo e fibrilação atrial.5
 Doença valvar reumática: corresponde a uma das sequelas da febre
reumática. Representa problema grave de saúde em países de baixa
renda e condição sanitária precária.5
Introdução - 4
É consenso que, quando pacientes com doença valvar cardíaca
apresentam piora em manifestações clínicas como dilatação das câmaras
cardíacas, arritmias e insuficiência cardíaca, o tratamento é cirúrgico,
visando reparo da(s) valva(s) por meio de plastia ou pela troca por próteses.
Atualmente existem dois tipos de prótese valvular cardíaca:
mecânicas e biológicas. Próteses mecânicas são compostas por materiais
não biológicos como polímeros, metal e carbono pirolítico, enquanto as
biológicas são confeccionadas, pelo menos em parte, com tecidos
biológicos como pericárdio bovino (PB), valvas porcinas, valvas
homólogas ou, mais recentemente, pericárdio de outros animais. 13-22
Próteses
mecânicas
têm
elevada
durabilidade,
entretanto,
apresentam desvantagens como tromboembolismo sistêmico e/ou trombose
da prótese. Além disso, obrigam ao uso contínuo de anticoagulantes,
favorecendo sangramento ou, na falha da anticoagulação, trombose. Os
medicamentos anticoagulantes são instáveis quanto aos seus efeitos, sendo
que a maioria dos pacientes encontra-se fora da faixa terapêutica segura.23
Biopróteses não são trombogênicas e permitem fluxo central
semelhante ao das valvas nativas. Apesar desta vantagem, podem ocorrer
calcificação e ruptura da sua estrutura e, com isso, falhas primárias.24
Introdução - 5
1.1. Calcificação
A calcificação é uma das principais causas de falha em próteses
valvulares cardíacas, tanto de PB como porcinas,25,26 caracterizada pela
formação de sais insolúveis de fosfato de cálcio nos folhetos valvares.27
No estudo particular da calcificação, verificou-se ser ela de origem
multifatorial,28,29 incluindo desde fatores relacionados à estrutura física e
química dos implantes até o metabolismo do hospedeiro e fatores
mecânicos. A calcificação pode ocorrer precocemente em próteses tratadas
com glutaraldeído (GA), principalmente naquelas submetidas a um elevado
grau de estresse mecânico e em indivíduos jovens.24
O GA é o agente mais utilizado na fixação química do PB. Esse
fixador atua na reticulação do colágeno, dando estabilidade ao material,
tornando-o mais durável, além de diminuir sua antigenicidade e garantir a
esterilidade.30 Este processo com o GA também é conhecido como método
de curtição do PB ou processo de reticulação. 15,31,32
Materiais fixados com GA não são inertes, mesmo após o término
de todo o processo químico. O tecido biológico continua liberando
moléculas de GA monomérico a partir do GA polimérico presente.
Portanto, biopróteses têm toxicidade tanto local como sistêmica para o
hospedeiro.13,28,33-35 O PB tratado com GA apresenta aldeídos livres que,
Introdução - 6
juntamente com os fosfolípides e a antigenicidade residual do tecido das
biopróteses, são importantes nos mecanismos de calcificação.24,36-38
As estratégias de prevenção da calcificação são baseadas em:
1. Terapias no paciente, como:
- terapia sistêmica com agentes anticalcificantes;
- terapia local com dispositivos implantáveis de liberação prolongada de
drogas;
2. Tratamento no PB antes da confecção da bioprótese, como:
- adição de agentes de natureza química que promovam alterações
estruturais do tecido;24
- modificações de biomateriais, como remoção de componente com
potencial para calcificação.39,40
Considerando as estratégias relacionadas ao tratamento do PB,
diversos métodos têm sido propostos para redução da calcificação, tais
como:
1. Remoção de fosfolípides;41-43
2. Inativação de aldeídos livres;44-51
3. Redução de antigenicidade e toxicidade de biopróteses tratadas com
GA;36,45,52,53
4. Descelularização.39,40,54-56
Introdução - 7
Para este estudo sobre calcificação do PB, foram escolhidos a
estratégia 2 e o método 3, o que resultou na adição de ácido glutâmico
(Glu) ao processo de curtição feito com GA.
A inativação de aldeídos livres pode ser realizada por meio da
adição de agentes químicos como lisina, glutamina, arginina, ácido αamino-oléico, octanediol, etanol, diamina, Glu, entre outros.48,52,57-63
O Glu, um aminoácido não essencial, foi escolhido porque vem
sendo utilizado após reticulação convencional do PB com GA, resultando
na redução da citotoxicidade localizada e sistêmica, permitindo a
proliferação das células endoteliais na superfície do PB e, ao mesmo
tempo, reduzindo significativamente índices de calcificação em estudos in
vivo.51,64,65
Entretanto, os resultados para diminuir a calcificação de materiais
fixados com GA, seguido de tratamento com aminoácidos como Glu, são
controversos, pois vão desde a redução significativa da calcificação 51,64,65
até índices maiores de calcificação.48 Esses dados têm suscitado dúvidas
quanto à eficácia do tratamento com Glu para redução simultânea de
toxicidade e dos índices de calcificação. Uma avaliação mais detalhada
desses procedimentos sugere que tais discrepâncias podem ser atribuídas a
diferenças nas condições experimentais.
Introdução - 8
Quando o PB é fixado com GA e, em seguida, submetido a
tratamento com Glu em pH 3,0, baixos índices de calcificação são
obtidos.65 Por outro lado, o mesmo tratamento em pH 6,0 mostra índices de
calcificação elevados.48
Na literatura, estudos in vitro de biopróteses valvulares cardíacas de
PB tratadas com Glu, após reticulação convencional com GA, são
escassos.51,66 Braile et al. (2011),66 comparando resultados de desempenho
hidrodinâmico e durabilidade acelerada entre próteses valvulares de PB
submetidas a tratamento com Glu após fixação com GA, constataram que
parâmetros como gradiente pressórico, área efetiva, fração de regurgitação
(desempenho) e durabilidade apresentaram resultados similares, sugerindo
que alterações morfológicas produzidas pelo Glu não influenciaram no
desempenho da prótese valvular.
Também resultados de pesquisas experimentais in vivo sobre
calcificação de PB, submetido a tratamento químico com Glu utilizando
implantes subcutâneos em ratos, são controversos. Alguns autores
verificaram que essa estratégia reduziu significativamente a taxa de
calcificação.50,64,65,67 Por outro lado, Jorge-Herrero et al. (1996)48
constataram que não houve diminuição significativa na quantidade de
cálcio acumulado no PB.
Introdução - 9
Considerando que trabalhos pré-clínicos sobre tratamento do PB
com GA+Glu em pH alcalino e ácido, utilizado na confecção de próteses
valvulares cardíacas, não foram encontrados na literatura, justifica-se o
estudo in vitro e in vivo de PB e biopróteses tratadas com Glu. Com este
estudo pretende-se avaliar:
1. Se o tratamento anticalcificante propiciará a despolimerização das
ligações de GA e, ao mesmo tempo, inativação de aldeídos livres
presentes na matriz extracelular do PB fixado com GA.
2. Se o tratamento anticalcificante propiciará melhor preservação da
estrutura
desse
tecido
biológico,
podendo
minimizar
alguns
mecanismos de calcificação de biopróteses sem efeitos deletérios.
3. Se o PB que receberá o tratamento anticalcificante será adequado para
confecção de biopróteses cardíacas valvulares, levando à redução do
índice da calcificação e ao aumento da vida útil da válvula cardíaca no
paciente.
Introdução - 10
1.2. Objetivo
O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro e in vivo o PB
processado com GA e tratado com Glu, considerando-se:

caracterização mecânica, térmica e morfológica do pericárdio bovino
tratado com GA+Glu para confecção de bioprótese valvular cardíaca;

avaliação do índice de calcificação de implantes de PB tratado com
GA+Glu em subcutâneo de rato;

avaliação da durabilidade acelerada de biopróteses valvulares cardíacas
com a utilização deste PB tratado com GA+Glu.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos - 12
Foram utilizados 180 PB (n=180), obtidos de animais machos com
até 60 meses de idade, recolhidos em frigoríficos de classe internacional,
inspecionados pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF).
A preparação do PB compreendeu uma série de etapas que
envolveram a coleta do PB, a limpeza, o curtimento em GA e a
conservação em formaldeído.
2.1. Tratamentos Químicos para Reticulação do Pericárdio Bovino
Os PB foram tratados quimicamente de duas formas:
 tratamento convencional do PB com GA 0,5%, denominado tratamento
controle PB GA, realizado em 90 PB (n=90);
 tratamento experimental do PB com GA 0,5% e Glu 1%, denominado
tratamento anticalcificante PB GA+Glu, realizado em 90 PB (n=90).
O tratamento químico com GA 0,5% promove a reticulação das
fibras de colágeno do PB, mantendo o alinhamento ou paralelismo dos
feixes colágenos, de modo que não sofram estiramento ou alteração da sua
ondulação natural. Dessa forma, os pericárdios terão a devida elasticidade
mecânica, necessária para a correta funcionalidade da bioprótese.
2.1.1. Tratamento Controle (PB GA)
O tratamento químico de reticulação com GA 0,5%, no grupo
controle PB GA, foi realizado de acordo com o estudo de Braile (1990).15
O processo compreende quatro etapas, cada uma com um tempo específico
de tratamento, totalizando 18 dias.
No frigorífico, os PB ricos em fibras colágenas e livres de gordura
foram visualmente selecionados e transportados até o laboratório, em
galões plásticos contendo solução de cloreto de sódio (NaCl) 0,9% e
sulfato de magnésio (MgSO4) 8 mOsmóis, tamponado em pH 7,4, com
tampão fosfato 0,13M/l, no qual é transportado para o laboratório a
temperatura de 6±4ºC, permanecendo no máximo por quatro horas. Essa
solução é chamada de solução de limpeza.
No laboratório os PB foram colocados em nova solução de limpeza,
sendo anteriormente retirados a gordura e restos de tecidos (debris). A
seguir, foram montados em um suporte e submetidos ao tratamento de
reticulação (curtimento) em solução de fixação de GA 0,5%.
Depois de curtido, os PB foram lavados em solução de NaCl 0,9% e
mantidos por três dias em solução conservadora de formaldeído a 4%.
Após este período os PB foram submetidos a um tratamento com uma
solução oxidante de peróxido de hidrogênio (H2O2), por um período de 4 a
6 horas. Este procedimento tem como objetivo retirar dos PB as substâncias
antigênicas, as impurezas e restos celulares, além de aumentar a resistência
do tecido.
Uma vez completada esta etapa, os pericárdios foram novamente
lavados em solução de NaCl 0,9% e colocados em solução conservadora de
formaldeído a 4%. Após esta fase, foram submetidos a testes de controle de
qualidade, sendo apenas liberados aqueles que atenderem aos critérios
previamente estabelecidos, com base em mínimos exigíveis. A Figura 1
apresenta o fluxograma com as etapas do processo de reticulação do PB
GA.
Figura 1: Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino do grupo
controle (PB GA).
A espessura dos pericárdios liberados para a confecção das
biopróteses foi rigorosamente medida (0,18 mm a 0,50 mm), de modo a
adequar esse valor em razão direta com o diâmetro do anel da válvula a ser
montada.
Desde a coleta dos pericárdios até a sua liberação para confecção
das válvulas, o índice de rejeição atinge 90%.
2.1.2. Tratamento Anticalcificante (PB GA+Glu)
O tratamento químico de reticulação com GA 0,5% no grupo
anticalcificante PB GA+Glu foi idêntico ao do grupo controle PB GA até a
4ª curtição com GA (Figuras 1). A partir desta etapa, os PB foram
submetidos a um tratamento de choque de pH com uma solução de
hidróxido de sódio (NaOH) 0,1N por 24 horas, e então tratados com ácido
acético 0,01N em pH 7,4 para neutralização do pH. Em seguida, receberam
tratamento com a solução anticalcificante de Glu a 1% em pH 3,5 por 24
horas. Na sequência, os PB foram lavados em solução NaCl 0,9% para
eliminação do excesso de Glu, neutralizados em solução de NaOH 0,01N
em pH 7,4 e mantidos por 3 dias em solução conservadora de formaldeído.
A partir desta etapa os procedimentos foram idênticos aos realizados nos
PB do grupo controle PB GA, envolvendo as etapas com a solução
antioxidante, conservação em solução de formaldeído e confecção das
válvulas (Figura 2).
Figura 2: Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino (PB) do grupo
anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) PB GA+Glu.
2.2. Testes Físicos
Todos os PB dos grupos controle (n=90) e anticalcificante (n=90)
foram submetidos aos testes físicos de resistência mecânica e análise
térmica.
2.2.1 Teste de Resistência Mecânica
O teste de resistência mecânica fornece os valores de tensão de
ruptura (kgf/mm2), elongação (%) e tenacidade (%), obtidos a partir de uma
carga aplicada sobre uma amostra de PB (corpo de prova). À medida que é
aplicada uma carga sobre o corpo de prova, esta é automaticamente
correlacionada com a elongação provocada no material, acabando por gerar
um diagrama de carga-elongação. A partir desse diagrama foram
calculados os valores para tensão, ruptura, elongação e índice de
tenacidade. A elongação é a deformação sofrida pelo corpo de prova do
PB, até que ocorra a ruptura. A tenacidade é a medida da energia necessária
para romper o tecido.
Os parâmetros de resistência mecânica foram avaliados como
requerido pela Norma - ISO 5840:2005 - Cardiovascular Implants Cardiac Valve Prostheses68 e os ensaios realizados conforme a norma
ASTM D638 (Standard Test Method for Tensile Properties of Plastics).69
O teste foi realizado em todas as amostras de PB quimicamente
tratadas com solução anticalcificante e naquelas com tratamento controle,
no equipamento Q-Test (MTS Systems Corporation – número de série:
M206170/102398 – Figura 3).
Figura 3: Equipamento Q-Test para teste de resistência mecânica do
pericardio bovino.
Para confecção das válvulas foram selecionados os PB que
atingiram os parâmetros de aceitação: Tração ≥ 1,50 kgf / mm2; Elongação
≥ 17,0%; Tenacidade ≥ 11,0%.
2.2.2 Análise Térmica
O Teste de Encolhimento representa a temperatura na qual o PB
encolhe 1/5 do seu comprimento original, possibilitando uma avaliação
indireta do grau de reticulação do colágeno com o GA, indicando se o
tecido foi efetivamente fixado.
O equipamento de análise térmica para realização do teste de
encolhimento do PB, desenvolvido pela Braile Biomédica ®, consiste em
um sistema de aquecimento de água controlado eletronicamente, cuja
temperatura varia durante todo o teste, na razão de 1ºC/min, até atingir o
valor desejado (Figura 4).
O corpo de prova (2,0 cm x 0,8 cm) foi fixado nas garras e o
equipamento acionado para aquecer o banho-maria (1ºC/min). No
momento em que a amostra apresentou um encolhimento de 20% de seu
tamanho, o sensor foi tracionado acionando o alarme. Com o alarme
acionado, o termômetro digital fixou-se em um valor que corresponde ao
valor da temperatura de encolhimento. A temperatura mínima considerada
para garantir a fixação adequada das fibras de colágeno pelo GA foi de
83°C.
Figura 4: Equipamento Braile Biomédica® para teste de encolhimento do
pericárdio bovino.
2.3. Avaliação Estrutural e Ultraestrutural
2.3.1. Microscopia de Luz
Após os tratamentos, as amostras de PB de ambos os grupos foram
fixadas em formaldeído 10%, lavadas em água, desidratadas em etanol,
clarificadas em xilol e então incluídas em paraplast. Cortes histológicos
com 5 µm de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo
semiautomático. Para cada fragmento foram analisados cerca de cinco
cortes histológicos. Após a desparafinização e hidratação, os cortes foram
submetidos à coloração por hematoxilina-eosina (HE), tricrômio de Masson
e Orceína. As fotomicrografias coloridas foram obtidas no fotomicroscópio
Zeiss Jeneval.
2.3.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Amostras (1,0 cm2) de PB GA e GA+Glu, após serem
quimicamente tratadas e adicionadas em tampão fosfato 0,13M em pH
7,4, foram lavadas com água destilada (3 vezes por 30 min) para remoção
do tampão fosfato. Em seguida foram congeladas a -90°C e liofilizadas
em um equipamento Liofilizador Liobras Mod. L101 (LIOTOP). A
liofilização é um processo que remove a água ou outros solventes de uma
solução ou um produto por sublimação, em condições de baixa
temperatura e pressão.
As amostras de PB liofilizadas foram recobertas com ouro em
Metalizador Balsers modelo SDC 050. As fotomicrografias para os
materiais estudados foram obtidas em um equipamento ZEISS DSM 960,
operando com feixe de elétrons entre 10 e 20 keV, no Centro de
Caracterização e Desenvolvimento de Materiais da Universidade Federal
de São Carlos.
2.4. Estudos in Vivo
A metodologia utilizada para o implante de PB em subcutâneo de
ratos seguiu os procedimentos descritos na norma ISO 10993-6 (2000)70 e
Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Repeat-Dose Toxicity
Studies (2000),71 após aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais
– CEUA da TECAM (Parecer Nº 8255/2011-1.0) (Anexo 1).
Foi utilizado um total de 30 ratos (n=30) machos da linhagem
Wistar (Rattus novergicus), divididos em dois grupos: Grupo controle PB
GA com 15 animais (n=15) e Grupo anticalcificante PB GA+Glu com 15
animais (n=15). Cada grupo foi subdividido em três subgrupos com 5
animais cada (n=5), de acordo com o tempo de implante de 14, 28 e 60
dias, conforme apresentado na Tabela 1.
Tabela 1: Protocolo de implante de PB com tratamentos anticalcificante PB
GA+Glu e controle PB GA, em subcutâneo de ratos.
Período do implante (dias)
PB GA+Glu (n)
PB GA (n)
14
5
5
28
5
5
60
5
5
PB = pericárdio bovino; GA = glutaraldeído; Glu = ácido glutâmico; n = número
2.4.1. Teste de Implante
Os animais foram aclimatados às condições de laboratório por cinco
dias antes do início do teste e foram examinados durante esse período;
animais com quaisquer sinais de anormalidade não foram utilizados no
estudo. Nesse período foram acondicionados em caixas de polipropileno
convencionais (41,0 x 34,0 x 16,0 cm) contendo, no máximo, cinco animais
por caixa e alimentados com ração e água filtrada à vontade. As caixas com
os animais foram identificadas com números, número de animais, sexo,
data de nascimento, número do protocolo e as datas do teste. Os animais
foram pesados e identificados com canetas coloridas de forma a permitir a
avaliação individual.
Cada animal recebeu dois implantes de PB em subcutâneo, sendo
um controle (PB GA) e um tratado (PB GA+Glu), com 1 cm2 cada.
O PB conservado em formaldeído 10% foi lavado por submersão
em solução de NaCl 0,9% (soro fisiológico) por 15 minutos por cinco
vezes. Cada fragmento implantado foi pesado em balança analítica, modelo
AB 204/S (Mettler Toledo), antes da realização do implante.
Os animais foram anestesiados com a associação de cetamina 10%
(60 mg/kg), xilazina 2% (5 mg/kg) e diazepan 0,5% (5 mg/kg) pela via
intraperitoneal. Foram realizadas tricotomia e antissepsia da região do
gradil costal (região dorso lateral) de ambos os lados de cada animal. A
distribuição dos locais de implante foi:
A. Região dorso lateral anterior esquerda: PB tratamento anticalcificante
PB GA+Glu;
B. Região dorso lateral posterior esquerda: PB tratamento controle PB
GA.
Foi realizada incisão em cada ponto descrito anteriormente e, após
o posicionamento do implante, suturada com fio inabsorvível (nylon 2-0)
em padrão de ponto simples separado. Cada animal foi mantido isolado em
caixas convencionais para a espécie durante os sete primeiros dias de
observação, com troca diária de bandagem semioclusiva, para garantir a
cicatrização completa da ferida cirúrgica.
Todos os animais foram pesados no início do período de exposição
e semanalmente, para acompanhamento de ganho de peso. Os animais
foram individualmente observados por um período de 14, 28 e 60 dias,
cinco dias por semana, para avaliação de sinais clínicos de toxicidade e sete
dias por semana para a presença de animais mortos e moribundos. Uma vez
por semana, no momento da pesagem dos animais, foi realizada nova
tricotomia e remarcação das áreas do implante.
Após 14, 28 e 60 dias, os animais foram eutanasiados com uso de
dióxido de carbono e realizada necropsia. Durante a necropsia foram
colhidos os locais de pele contendo o implante dos dois pontos
implantados, nos três grupos experimentais.
A região de implante nos grupos experimentais foi retirada com um
mínimo de 2 mm de área adjacente. Cada explante foi novamente pesado e
uma parte de cada um (aproximadamente 50%) foi utilizada para dosagem
do cálcio. O material remanescente foi fixado em formol 10% e processado
conforme item 2.3.1. Foram realizadas as colorações de HE, Von Kossa e
Tricrômio de Masson para observação de inflamação, calcificação e
fibrose, respectivamente, por histomorfometria.
2.5. Determinação do Índice de Calcificação
A determinação do índice de calcificação dos PB explantados foi
realizada por Espectroscopia de Emissão Ótica com Plasma Induzido. Para
isto, as amostras de PB foram submetidas à calcinação, um processo em
que a matéria orgânica é submetida a temperaturas superiores a 400°C, por
períodos de tempo pré-estabelecidos, obtendo-se, ao final, um resíduo de
mineralização formado por sais presentes na amostra e carbonatos
derivados da decomposição da matéria orgânica em temperatura elevada.
As etapas envolvidas no processo de determinação do índice de
calcificação estão descritas abaixo.
2.5.1. Calcinação dos Cadinhos Vazios
Cadinhos limpos foram numerados e calcinados em mufla a 900°C
por um período de quatro horas. Após resfriamento foram pesados e
novamente colocados na mufla para mais uma sessão de calcinação. Como
não houve variação de peso de uma pesagem para outra, o protocolo foi
mantido em apenas um tempo de calcinação de quatro horas para o restante
dos cadinhos.
2.5.2. Secagem dos Explantes
Os explantes foram colocados nos cadinhos calcinados e
transferidos para estufa a 90°C por quatro horas. Após este período os
cadinhos foram resfriados por oito horas e pesados. O procedimento foi
repetido e não houve variação de peso de uma pesagem para outra, portanto
o protocolo foi mantido em apenas uma secagem.
2.5.3. Calcinação dos Explantes
Os cadinhos contendo as amostras secas foram colocados em uma
mufla a 900°C por quatro horas. Após este período, os cadinhos foram
removidos, deixados resfriar e pesados. O procedimento foi repetido até
que o peso tornasse constante e o resíduo de calcinação foi determinado
pela diferença entre o peso do cadinho com o resíduo e o cadinho vazio.
2.5.4. Determinação do Índice de Calcificação dos Explantes
Os resíduos de calcinação foram dissolvidos em 2 ml de solução de
ácido nítrico 1,0M e transferidos para frascos identificados, fechados
hermeticamente, encaminhados para o Centro de Caracterização e
Desenvolvimento de Materiais da Universidade Federal de São Carlos, para
serem analisados por Espectrometria de Emissão Ótica com Plasma
Induzido (ICP OES), em equipamento da Varian modelo Vista AX (IT AQ206 rev013). Para o elemento cálcio, o limite de detecção instrumental
encontrado foi de 0,018 (mg/l) ppm. O volume utilizado por amostra no
equipamento foi de 1 ml.
2.6. Análise Fractal
Para auxiliar na avaliação comparativa do aspecto histológico de
uma forma mais objetiva, foi utilizado o cálculo da dimensão fractal.
A dimensão fractal é a dimensão que caracteriza uma estrutura
fractal, ou seja, uma estrutura não-homogênea, não-simétrica. Os padrões
irregulares como, por exemplo, a forma de uma nuvem, de uma montanha,
etc., necessita da existência de uma forma diferente de geometria, que
atenda à descrição desses padrões fragmentados existentes na natureza.
Para isso, o matemático francês Benoit Mandelbrot criou o termo fractal,
originário do latim fractus, cujo significado é quebrado, fragmentado, para
descrever alguns tipos de fenômenos espaciais e temporais.72
As medidas da dimensão fractal foram realizadas utilizando o
software ImageJ (Image Processing and Analysis in Java), versão 1.45k.
Foram analisadas imagens de microscopia de luz dos PB do grupo controle
PB GA e grupo anticalcificante PB GA+Glu, antes e depois do implante
subcutâneo (14, 28 e 60 dias de implante).
As curvas para determinação da dimensão fractal foram geradas
pelo método de Box-Couting, um dos métodos mais conhecidos e
utilizados para estimar a dimensão fractal de uma forma ou imagem, pela
sua simplicidade de implementação. Esse método consiste em cobrir a
imagem ou objeto a ser analisado com quadrados de lados L e contar o
número de quadrados N(L) necessários para cobrir toda a forma.73,74
Quando este procedimento é aplicado em uma linha reta, espera-se
um comportamento N(L) proporcional a 1/L; para uma superfície (plano), a
relação passa a ser N(L) proporcional a 1/L2 enquanto que uma forma
espacial (volume) apresenta relação descrita por N(L) proporcional a 1/L3.
Para formas mais complexas (Figura 5a), ela toma a forma de uma relação
do tipo
, uma lei de potência, com d sendo a dimensão.73,74
Desenvolvendo esta relação com a ajuda de logaritmos, chega-se à
seguinte equação:
onde d é a dimensão fractal calculada pelo método de Box-Couting.
Verifica-se que:
é a equação de uma reta com coeficiente angular d.
d é determinada mediante construção de um gráfico log-log (Figura
5b):
versus
Figura 5. (a) Exemplo de contorno irregular ajustado pelo método de
Box-Counting.75
(b) Gráfico log-log para obtenção da dimensão fractal.
As imagens foram binarizadas, com tons de cinza variando entre 0
(preto) e 255 (branco). O contorno fractal (outline) foi feito para as regiões
escuras da imagem, cobertas com caixas quadradas de dimensões de 2 a 64
pixels.
2.7. Prótese Valvular de Pericárdio Bovino
Os
PB
submetidos
aos
tratamentos
controle
PB
GA
e
anticalcificante PB GA+Glu e aprovados nos testes in vitro e in vivo foram
utilizados para confecção de biopróteses valvulares cardíacas para
avaliação da durabilidade.
2.7.1. Confecção
As próteses foram confeccionadas com PB submetidos ao
tratamento controle PB GA e anticalcificante PB GA+Glu (itens 2.1.1 e
2.1.2), conforme procedimento operacional da empresa Braile Biomédica ®,
para confecção de prótese valvular de PB.15
2.7.2. Caracterização
Para avaliação da durabilidade das próteses foram realizados testes
de
fadiga
(durabilidade
acelerada),
de
acordo
com
a
norma
ANSI/AAMI/ISO 5840:2005 – Cardiovascular Implants – Cardiac Valve
Prostheses.68 Foram avaliadas cinco biopróteses (n=5), confeccionadas
com PB submetidos ao tratamento controle PB GA e cinco biopróteses
confeccionadas com PB submetidos ao tratamento anticalcificante PB
GA+Glu. Foram selecionadas três biopróteses valvulares de 23 mm e duas
de 27 mm de diâmetros, para ambos os grupos.
2.7.2.1. Teste de Durabilidade Acelerada
As próteses valvulares biológicas de PB, confeccionadas com PB
dos grupos controle PB GA e anticalcificante PB GA+Glu, foram
submetidas ao teste de durabilidade acelerada em equipamento ViVitro
Labs, modelo HiCycle System (Figura 6). O teste foi realizado em solução
aquosa de álcool benzílico 2% com pH 6,5 a 37ºC, que produz um
ambiente com uma densidade de 1g/ml e pressão de fechamento de 200 a
300 mmHg.
Apesar da variabilidade dos resultados, considera-se adequado o
modelo de prótese biológica quando se consegue atingir 200x10 6 ciclos em
uma velocidade de 1400 bpm.
Figura 6: Equipamento de teste de fadiga de válvulas biológicas.
2.8. Análise Estatística
Foi feita análise descritiva dos dados obtendo-se a média, o desviopadrão e a mediana. As variáveis quantitativas contínuas com distribuição
gaussiana foram analisadas com auxílio de Análise de Variância com
comparação pós-teste de Tukey-Kramer para análise intergrupos ou com o
teste t de Student não-pareado para comparação entre dois grupos. Quando
as variáveis não apresentavam distribuição gaussiana utilizou-se o Teste de
Kruskal-Wallis para comparações múltiplas, com pós-teste de Dwass-Steel
ou o teste de Mann-Whitney para comparação entre dois grupos.
Os resultados foram ilustrados com Gráficos Box-Plot. Admitiu-se
erro alfa de 5%, sendo considerados significantes valores de P≤ 0,05.
3. RESULTADOS
Resultados - 36
3.1. Testes Físicos
3.1.1. Teste de Resistência Mecânica e Análise Térmica
Os resultados dos testes físicos, realizados em 90 PB submetidos ao
tratamento controle PB GA e em 90 PB submetidos ao tratamento
anticalcificante PB GA+Glu, obtidos a partir do teste de resistência
mecânica e análise térmica, foram expressos pelos valores de tensão de
ruptura, elongação e tenacidade, apresentados na Tabela 2. Nota-se
diferença significante apenas para temperatura de encolhimento (TS) entre
os grupos (P<0,0001), sendo o valor médio do grupo controle (GA) maior
que o do estudo (GA+Glu).
Tabela 2: Propriedades mecânicas e térmicas de pericárdios bovinos (PB)
submetidos ao tratamento controle com glutaraldeído (PB GA)
0,5% (GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) (PB GA + Glu).
Parâmetros
PB GA
PB GA+Glu
P
TS (°C)
90,2  1,2
86,2  0,8
< 0,0001*
Tração (kgf/mm2)
2,3  0,4
2,4  0,7
0,9187
Elongação (%)
23,9  5,1
21,9  2,8
0,4126
Tenacidade (%)
28,0  7,1
26,3  9,6
0,7396
P = Probabilidade; Ts = Temperatura de encolhimento; * diferença significante entre
os grupos. Valores de aceitação: TS ≥ 83,0ºC; Tração ≥ 1,50 (kgf/mm2); Elongação
≥17,0%; Tenacidade ≥11,5%.
Resultados - 37
Os valores correspondem à média de seis determinações
independentes.
3.2. Avaliação Estrutural e Ultraestrutural
3.2.1. Microscopia de Luz
Os resultados histológicos dos PB submetidos ao tratamento
controle PB GA e ao tratamento anticalcificante PB GA+Glu não
apresentaram diferenças entre os dois grupos quanto à preservação da
morfologia do tecido (Figura 7).
A coloração com HE mostrou a integridade tecidual, com
preservação das fibras de colágeno e elásticas e das raras células,
principalmente nervosas e da arquitetura do PB (Figuras 7A e 7D).
A coloração pela Orceína mostrou a preservação das fibras elásticas
tanto no aspecto tintorial como em relação à integridade fibrilar (arranjo
molecular) (Figuras 7B e 7E).
A preservação do colágeno, quanto ao padrão de birrefringência e
ordem molecular, foi evidenciada pela coloração Tricômio de Masson
(Figuras 7C e 7F).
Resultados - 38
Aumento: 40X.
Figura 7: Fotomicrografias dos pericárdios bovinos (PB) submetidos aos
tratamentos controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-C)
e anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (DF), corados pela Hematoxilina-Eosina (HE) (A e D), Orceína (B e
E) e Tricrômio de Masson (C e F). As setas pretas indicam as fibras
elásticas coradas pela Orceína e as setas amarelas a ondulação das
fibras colágenas intensamente coradas pelo Tricrômio de Masson.
Resultados - 39
3.2.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A MEV mostrou que não há diferença quanto à preservação do
padrão das fibras no grupo PB GA+Glu quando comparado ao PB GA
(Figura 8).
Figura 8: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura dos
pericárdios bovinos (PB) submetidos aos tratamentos controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-B) e anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (C-D). A = Aumento.
Resultados - 40
3.3. Implantes em Subcutâneo de Ratos
Todos os animais submetidos ao implante subcutâneo de PB
apresentaram ganho de peso dentro da variação fisiológica esperada para a
espécie.
Durante todo o período de teste não foram observados sinais
clínicos nos animais dos grupos experimentais avaliados aos 14, 28 e 60
dias após o implante.
3.3.1. Avaliação da Biocompatibilidade do Implante
Após 14, 28 e 60 dias de implante foi realizada avaliação
macroscópica nos 15 animais do grupo controle PB GA e nos 15 animais
do grupo anticalcificante PB GA+Glu, não sendo observadas alterações
relacionadas ao implante.
Quanto aos aspectos microscópicos de deposição de colágeno, nos
PB do grupo controle PB GA, corados pelo método de Tricrômio de
Masson, apresentou, após 14 dias de implante, deposição moderada de
colágeno em dois animais e discreta em três. Aos 28 dias observou-se
deposição discreta em dois animais implantados e moderada em três. Aos
60 dias, houve deposição moderada de colágeno em um animal e discreta
em quatro deles (Tabela 3 e Figura 9).
Resultados - 41
No PB do grupo anticalcificante PB GA+Glu, houve deposição
discreta de colágeno em três animais, após 14 dias, moderada em um e
importante em outro. Aos 28 dias, observou-se deposição discreta de
colágeno em dois animais e moderada nos outros três animais. No grupo
observado por 60 dias, houve discreta deposição de colágeno em todos os
animais (Tabela 3 e Figura 9).
Tabela 3: Resultado das análises histopatológicas de pericárdios bovinos
submetidos a tratamento convencional com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) e tratamento anticalcificante com ácido glutâmico
(Glu) 1% (PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos,
quanto à deposição de colágeno (n=5 animais / período de
implante).
Grupos
14 dias
28 dias
60 dias
Animais
PB GA
PB GA+Glu
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
1
2
2
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
2
1
2
3
1
1
2
2
1
2
1
1
0
1
1
1
(0) ausência de tecido de implantação;
(1) deposição de colágeno discreta, até 25% do corte do tecido na lâmina foi corado;
(2) deposição de colágeno moderada, de 26 a 50% do corte do tecido na lâmina foi
corado;
(3) deposição de colágeno importante, mais de 51% do corte do tecido na lâmina foi
corado.
Resultados - 42
Figura 9: Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB), submetidos a
tratamento controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e
tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB
GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos após 14, 28, 60
dias do implante, mostrando diferentes graus de deposição de
colágeno. Deposição discreta (D), moderada (M) e importante
(I). Coloração: Tricrômio de Masson. A = Aumento.
Resultados - 43
A coloração pelo método de HE revelou baixos graus de fibrose nos
dois grupos avaliados, com um discreto aumento nos PB controle PB GA
quando comparados com os PB do grupo anticalcificante PB GA+Glu. Este
aumento no grau de fibrose em ambos os grupos foi evidenciado aos 14 e
60 dias.
O escore de necrose foi ligeiramente maior aos 14 dias nos
explantes de PB controle PB GA e discretamente evidenciado aos 28 dias
nos explantes de PB com tratamento anticalcificante PB GA+Glu.
Observou-se maior grau de formação de cápsula nos explantes de
28 dias quando comparados aos de 14 e 60 dias, em ambos os grupos
estudados.
O grau de neovascularização nos explantes aos 14 e 60 dias foi
ligeiramente maior para o PB controle PB GA, quando comparado ao PB
com tratamento anticalcificante PB GA+Glu e maior para o PB GA+Glu
aos 28 dias.
Quanto às células polimorfonucleares, células gigantes, linfócitos e
plasmócitos, os menores escores foram observados no explante de PB com
tratamento anticalcificante PB GA+Glu aos 60 dias (Tabela 4, Figura 10 e
11).
Resultados - 44
Tabela 4: Resultados das análises histopatológicas de pericárdio bovino (PB)
submetido aos tratamentos controle com glutaraldeído (GA) 0,5%
(PB GA) e anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB
GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos, quanto aos tipos
celulares (n=5 animais / período de implante).
Tipos
Celulares
1
Animais
(14 dias)
2 3 4
5
Tratamento
1
Animais
(28 dias)
2 3 4 5
1
Animais
(60 dias)
2 3 4 5
NECR
GA
GA+Glu
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PMN
GA
GA+Glu
0
1
2
2
4
1
1
2
1
0
1
3
1
2
1
3
0
1
1
0
0
0
1
0
0
0
4
1
0
0
LINF
GA
GA+Glu
2
2
3
2
2
3
4
1
3
1
2
3
1
4
2
4
1
4
3
4
1
1
3
1
2
2
2
2
2
1
PLASM
GA
GA+Glu
1
1
1
1
2
0
1
1
1
1
0
3
0
3
2
3
0
3
1
2
0
0
2
0
0
0
2
1
2
0
MACROF
GA
GA+Glu
0
1
1
1
1
0
2
1
0
1
0
1
1
1
1
2
0
1
1
3
1
0
3
0
1
0
3
1
1
0
CEL GIG
GA
GA+Glu
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
0
1
0
1
0
3
0
1
1
2
0
0
3
0
0
0
2
0
0
0
NEOV
GA
GA+Glu
1
0
3
1
2
2
2
2
3
2
1
2
2
4
4
2
2
4
2
2
1
1
3
0
3
2
2
2
0
1
FIBRO
GA
GA+Glu
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
1
0
1
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
FORM
CAPS
GA
GA+Glu
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
NEC = Necrose
PMN = Polimorfonucleares
LINF = Linfócitos
PLASM = Plasmócitos
MACROF = Macrófagos
CEL GIG = Células Gigantes
NEOV = Neovascularização
FIBRO = Fibrose
FORM CAPS = Formação Capsular
Escore (0): Ausência de achados significativos;
Escore (1): Achados mínimos;
Escore (2): Achados leves;
Escore (3): Achados moderados;
Escore (4): Achados máximos.
Resultados - 45
Para avaliação da biocompatibilidade do PB explantado, foi criado
um escore total de agressão tecidual com base na soma de todos os achados
(Figura 10).
Escore PB GA
Escore PB GA+Glu
Figura 10: Gráfico do escore total de agressão tecidual do subcutâneo pósimplante de PB GA e PB GA+Glu.
Resultados - 46
Figura 11: Fotomicrografias dos tipos celulares presentes nos pericárdios
bovinos (PB), submetidos ao tratamento controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e tratamento
anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu),
explantados de subcutâneo de ratos, após 14, 28, 60 dias do
implante e corado pela Hematoxilina-Eosina.
A = Aumento; PMN = polimorfonucleares; PLASM = plasmócitos;
MACROF = macrófagos; NEOV = neovascularização;
CEL GIG = células gigantes.
Resultados - 47
A análise estatística, comparando os diferentes tipos celulares
presentes após 14, 28 e 60 dias de implante, mostrou aumento significativo
de linfócitos, plasmócitos e células gigantes aos 28 dias no grupo PB
GA+Glu. Aos 60 dias houve aumento significativo da necrose e dos
macrófagos também no grupo PB GA+Glu (Tabela 5).
Tabela 5: Análise estatística comparativa dos tipos celulares presentes na
reação inflamatória decorrente do implante de pericárdios
bovinos (PB) submetidos ao tratamento controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetido ao
GA+Glu), em subcutâneo de ratos, após 14, 28, 60 dias (n=5 PB
/ período de implante).
PB GA x PB GA+Glu
14 dias
28 dias
60 dias
Necrose
Polimorfonucleares
Linfócitos
Plasmócitos
Macrófagos
Células gigantes
Neovascularização
Fibrose
Formação capsular
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS= diferença estatística não-significante (P ≥ 0,05).
NS
NS
0,0159
0,0159
NS
0,0317
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
0,0317
NS
NS
NS
NS
Resultados - 48
3.3.2. Análise de Cálcio dos Explantes
A análise de calcificação dos explantes dos PB dos grupos controle
PB GA (n=5 PB/período de implante) e anticalcificante PB GA+Glu (n=5
PB/período de implante) foi realizada após coloração pelo método de Von
Kossa. Os resultados obtidos revelaram discreta calcificação na maioria dos
PB submetidos ao tratamento controle PB GA aos 14, 28 e 60 dias. Porém,
em um PB implantado por 14 dias, um por 28 dias e dois por 60 dias
apresentaram calcificação moderada (Tabela 6 e Figura 12).
Os resultados obtidos nos cinco PB (n=5), submetidos ao
tratamento anticalcificante PB GA+Glu, revelaram discreta calcificação em
todos os tempos de implante (14, 28 e 60 dias). Os dados obtidos estão
apresentados na Tabela 6 e Figura 12.
Resultados - 49
Tabela 6: Resultado das análises histopatológicas de pericárdios bovinos
(PB) do grupo controle submetidos ao tratamento com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao
GA+Glu), após implante em região subcutânea de ratos por 14,
28 e 60 dias, corados pelo método de Von Kossa.
Grupos
14 dias
28 dias
60 dias
Animais
PB GA
PB GA+Glu
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
Macho 1
Macho 2
Macho 3
Macho 4
Macho 5
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
(1) calcificação discreta, até 25% do corte do tecido na lâmina foi corado;
(2) calcificação moderada, de 26 a 50% do corte do tecido na lâmina foi corado;
(3) calcificação importante, mais de 51% do corte do tecido na lâmina foi corado.
Resultados - 50
Figura 12: Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB) do grupo
controle submetidos ao tratamento com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) (A-D) e PB com tratamento anticalcificante
com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (E-H),
explantados de subcutâneo de rato e corados pelo método de
Von Kossa. Setas indicam calcificação moderada. Aumento:
40X.
Resultados - 51
3.3.3. Determinação da Quantitativa da Calcificação
Os dados da análise utilizada para determinar qualitativa e
quantitativamente
os
valores
de
calcificação,
pelo
método
de
espectrofotometria de absorção atômica, estão apresentados na Tabela 7.
Notou-se um aumento discreto gradual da concentração de cálcio nos PB
do grupo controle PB GA aos 14, 28 e 60 dias (n=5 PB/período de
implante), enquanto que nos PB submetidos ao tratamento anticalcificante
PB GA+Glu (n=5 PB/período de implante), a concentração de cálcio
permaneceu mais estável e em níveis mais baixos quando comparada ao
grupo PB GA.
Tabela 7: Valores médios ± desvio-padrão (DP) de calcificação (µg de
Ca++/mg de tecido seco), de acordo com o tempo de implante de
pericárdios bovinos (PB) submetidos ao tratamento controle com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e ao tratamento
anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu),
em subcutâneo de ratos (n=5 PB / período de implante).
Período do implante
(dias)
PB GA
PB GA+Glu
Média ± DP
Média ± DP
14
3,6 ± 0,7
4,0 ± 0,4
28
5,7 ± 1,6
4,3 ± 1,1
60
5,67 ± 1,3
3,1 ± 0,15
Resultados - 52
A Figura 13 mostra graficamente os resultados do índice de
calcificação pelo modelo Box-Plot. Nota-se que, aos 14 dias, os índices de
calcificação dos grupos controle PB GA (n=5 PB/período de implante) e
anticalcificante PB GA+Glu (n=5 PB/período de implante) não diferiram
estatisticamente (P=0,0678). Aos 28 e 60 dias, houve um aumento
progressivo da calcificação no grupo PB GA, com manutenção de valores
no grupo PB GA+Glu, sendo que aos 60 dias atingiu uma diferença
significante (P=0,0456).
Figura 13: Gráfico Box-Plot: Resultados dos índices de calcificação de
pericárdios bovinos (PB) do grupo controle tratado com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao
GA+Glu), implantados em subcutâneo de ratos, por períodos de
14, 28 e 60 dias (n= 5 PB/período de implante).
Resultados - 53
3.3.4. Análise da Dimensão Fractal
A Figura 14 mostra graficamente os resultados da dimensão fractal
pelo modelo Box-Plot. Nota-se que, no pré-implante, a dimensão fractal foi
significantemente maior no grupo controle PB GA (n=5 PB/período de
implante) (P<0,0001). Após o implante a situação inverteu-se, com a
dimensão fractal sendo significantemente maior no grupo anticalcificante
PB GA+Glu (n=5 PB/período de implante) aos 14, 28 e 60 dias (P= 0,0495;
P=0,0034; P=0,0002, respectivamente).
Figura 14: Gráfico Box-Plot: Resultados da dimensão fractal de pericárdios
bovinos (PB) do grupo controle tratado com glutaraldeído (GA)
0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante
com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) no pré-implante e
após 14, 28 e 60 dias de implante, em subcutâneo de ratos (n= 5
PB/período de implante).
Resultados - 54
As fotomicrografias representativas e suas respectivas binarizações,
dos dois grupos (PB GA e PB GA+Glu) nos períodos pré, 14, 28 e 60 dias
de implante estão apresentadas na Figura 15.
Resultados - 55
Figura 15:
Fotomicrografias e respectivas
binarizações de pericárdios
bovinos (PB) do grupo
controle tratado com
glutaraldeído (GA) 0,5% (PB
GA) e PB submetidos ao
tratamento anticalcificante com
ácido glutâmico (Glu) 1%
(PB GA+Glu), pré-implante e
após 14, 28 e 60 dias de
implante.
A-H: coloração pela
Hematoxilina-Eosina. I-P:
Imagem em outline para
cálculo da dimensão fractal.
Aumento: 40X.
DF= Dimensão Fractal
Resultados - 56
3.3.5. Durabilidade Acelerada
As válvulas confeccionadas a partir de PB do grupo controle PB
GA (n=5) (Figura 16) e do grupo com tratamento anticalcificante PB
GA+Glu (n=5) (Figura 17), submetidas ao teste de durabilidade acelerada,
resistiram aos 200 milhões de ciclos de batimentos apresentando
integridade estrutural. Observou-se apenas uma leve esfoliação do
pericárdio no grupo anticalcificante PB GA+Glu (Figura 17).
Figura 16: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB) do grupo controle
antes (A e B) e após (C e D) o teste de durabilidade acelerada.
Resultados - 57
Figura 17: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB) do grupo com
Ga+Glu) antes (A e B) e após (C e D) o teste de durabilidade
acelerada. Nota-se a presença de peeling (setas).
4. DISCUSSÃO
Discussão - 59
O PB processado pelo GA é um biomaterial clássico para a
confecção de válvulas cardíacas. As propriedades físicas, químicas,
estruturais e ultraestruturais apropriadas que este tratamento confere ao
tecido são amplamente divulgadas pela literatura especializada. Apesar de
alguns efeitos indesejáveis, ainda é o processo padrão para a confecção das
biopróteses cardiovasculares.13,24,25,50,51,53,76-80
Os
resultados
deste
estudo
indicaram
que
o
tratamento
anticalcificante com PB GA+Glu, quando comparado ao tratamento
controle PB GA, não alterou as propriedades físicas e de resistência
mecânica do PB.
O PB submetido ao tratamento anticalcificante PB GA+Glu
apresentou propriedades mecânicas, determinadas pelos testes físicos e
análise térmica (temperatura de encolhimento), dentro dos limites mínimos
de aceitação, a saber: Tração ≥ 1,50 (kgf/mm2), Elongação ≥ 17,0%;
Tenacidade ≥ 11,5%, TS ≥ 83,0ºC.
As propriedades mecânicas adequadas do tecido biológico
quimicamente tratado são muito importantes para o bom desempenho
hemodinâmico e para a durabilidade das próteses. Quando se introduz um
novo reagente químico, os primeiros parâmetros que precisam ser avaliados
são as propriedades físicas e térmicas. Estas garantem a adequada
preservação do tecido, principalmente das fibras colágenas, e isto implicará
Discussão - 60
no desempenho da bioprótese, bem como na sua durabilidade 15. No
presente estudo, os valores de ruptura, elongação e tenacidade atenderam as
especificações pré-estabelecidas por Braile (1990),15 utilizadas para a
fabricação de válvulas cardíacas. Os valores obtidos nos grupos PB GA e
PB GA+Glu para propriedades físicas não apresentaram diferenças
significantes. Já a temperatura de encolhimento foi significantemente
menor no grupo PB GA+Glu, o que pode ser resultante do rompimento das
ligações cruzadas poliméricas de GA, provocado pelo tratamento com Glu
e ainda presentes em GA. A temperatura de encolhimento é útil para
controle do processo, pois é uma forma de assegurar que o tecido foi
reticulado, ou seja, quanto maior seu valor, mais reticulada é a matriz
colagênica. Apesar desta diferença estatística, os parâmetros mostraram-se
dentro dos limites aceitáveis e não foram observadas alterações para as
propriedades mecânicas necessárias para a fabricação das válvulas.57
Vale ressaltar que os valores obtidos em cada um dos testes de
resistência foram muito acima dos limites de aceitação. Por exemplo, a
Tenacidade tem valor de aceitação ≥11,5; no presente estudo o valor obtido
no grupo PB GA+Glu foi de 26,3±9,6. Estes resultados apontam para uma
segurança quanto à estabilidade e preservação do tecido.
A avaliação comparativa entre a estrutura e ultraestrutura dos PB do
grupo controle PB GA e do grupo anticalcificante PB GA+Glu foi realizada
Discussão - 61
para constatar se o acréscimo do Glu não interferiu nas propriedades
físicas, químicas e morfológicas do tecido.
As colorações pela HE, Orceína e Tricrômio de Masson
evidenciaram alto grau de preservação dos núcleos e citoplasma, grande
quantidade de fibras elásticas e fibras colágenas com ondulações
características, respectivamente. Estes achados, quando comparados aos
obtidos com o PB do grupo controle PB GA, com eficácia clínica
comprovada,15 mostraram que o Glu não comprometeu a preservação
morfológica do tecido processado pelo GA, o que explicaria as
similaridades das propriedades físicas apresentadas na Tabela 2. Estes
resultados eram esperados, uma vez que a interação química do Glu é feita
somente através da ligação deste com os grupamentos livres de aldeído,
que não se uniram à matriz colagênica. Os grupamentos aldeídicos do GA,
que estão comprometidos com as ligações cruzadas na matriz colagênica,
não são reativos ao Glu. Para um melhor entendimento, a Figura 18 mostra
resumidamente as reações químicas que envolveram todas as fases do
tratamento anticalcificante empregado neste estudo.
Discussão - 62
Figura 18: Esquema representativo do tratamento empregado no presente
estudo. A: colágeno do pericárdio bovino na presença do GA.
B. Tipos de ligações do GA com o colágeno; B1: Base de Shiff,
reação de reticulação em que os dois aldeídos ligam-se ao
colágeno; B2: apenas um grupamento aldeídico liga-se ao
colágeno; B3: as moléculas de GA ligam-se formando uma
cadeia polimérica. C: em meio ácido (H+) ou alcalino (OH-) as
cadeias poliméricas abrem-se, formando aldeídos livres que se
ligarão ao ácido glutâmico. D: neutralização dos aldeídos livres
pelo ácido glutâmico (adaptado de Carnevalli, 2003). 81
A biocompatibilidade dos materiais neste estudo foi avaliada sob
dois aspectos: resposta inflamatória e calcificação. A reação inflamatória
desencadeada pelo hospedeiro, em resposta ao implante de PB, foi aquela
Discussão - 63
esperada
nos
implantes
em
subcutâneo.50,60,65,67
A
presença
de
polimorfonucleares, plasmócitos, fibroblastos, macrófagos e células
gigantes do hospedeiro é uma resposta inflamatória típica ao corpo
estranho. A evolução do processo inflamatório aos 14, 28 e 60 dias foi
atribuída às diferenças do processamento químico, entretanto, ao final dos
60 dias, a resolução do processo inflamatório foi semelhante nos dois
grupos. A resposta inflamatória do PB GA+Glu não foi diferente daquela
do material processado apenas pelo GA e já de eficácia comprovada para
aplicação na fabricação de biopróteses cardíacas. Considerando que
biocompatibilidade é a capacidade que um material possui de promover
uma resposta biológica apropriada em uma dada aplicação, os resultados
em relação à resposta inflamatória mostraram que o PB, do grupo
anticalcificante PB GA+Glu, atende à demanda para fabricação de
implantes cardiovasculares.
A análise quantitativa da calcificação revelou que o grupo controle
PB GA apresentou progressivamente maiores índices aos 28 dias (5,7±1,6
µg/mg) e 60 dias (5,6±1,3 µg/mg) em relação ao grupo anticalcificante PB
GA+Glu, 28 dias (4,3±1,1 µg/mg) e 60 dias (3,1±0,15 µg/mg). No entanto,
para ambos os grupos, os valores foram muito inferiores àqueles
apresentados pela literatura, conforme descritos a seguir e resumidos na
Tabela 8.
Discussão - 64
Grabenwoger et al. (1996)67 avaliaram, em subcutâneo de rato, a
calcificação em PB processado com GA e Glu e encontraram valores de
89,6±14 µg Ca++/mg tecido seco e para o grupo tratado apenas com GA,
165,4±20 µg Ca++/mg tecido seco. Semelhantemente, Chang et al. (2011),82
em estudo experimental, encontraram altos índices de calcificação em PB
processado apenas com o GA, 277,85±17,51 µg Ca++/mg tecido úmido. No
entanto, no grupo em que se acrescentou o Glu, os valores caíram
abruptamente para 7,95±1,21 µg Ca++/mg tecido úmido. Este estudo reflete
a maioria dos achados da literatura, em subcutâneo de rato, que mostrou
altos índices de calcificação para PB processado apenas com o GA e
redução drástica após tratamento anticalcificante com Glu. Grimm et al.
(1992)50 obtiveram redução de calcificação de 169±1,24 para 13,3±1,24 µg
Ca++/mg no tecido seco, quando trataram o pericárdio com Glu.
Contrariando a literatura, no presente estudo, os índices de
calcificação foram reduzidos também no grupo controle PB GA nos
diferentes períodos do implante, 14, 28 e 60 dias (Tabela 8).
Discussão - 65
Tabela 8: Comparação dos índices de calcificação de PB e/ou cúspide de
válvula porcina, fixados com GA e submetidos ou não a tratamentos
anticalcificantes, após implante em subcutâneo de ratos.
Calcificação µg Ca++/mg
Tempo
Tecido Seco
de
Tratamento
Material
Implante Anticalcificante
PB
PB GA
(dias)
GA+GLU
Referência
PB
60
Glu 1%
5,67±1,3
3,1±0,15
Presente estudo
Porcina
60
Glu 0,8%
50,8±8,7
34,2±16,2
Soncini da Rosa
et al., 200260
PB
90
Glu 0,2%
65,9±24,6
38,3±13,7
Collatusso
et al., 201284
PB
60
Glu (NI)
100,0± 38,3 130,4±22,4
Jorge-Herrero
et al., 199648
PB
63
Glu (sol.
saturada)
165,4±20
89,6±14,0
Grabenwöger
et al., 199667
PB
63
Glu 0,8%
169±24
13,3±2
Grimm
et al., 199250
Porcina
90
Glu 1%
199,3±53,4
103,0±76,4
Liao
et al., 199249
PB
84
Glu (NI)
277,8±17,5
7,95±21
Chang
et al., 201181
PB
112
___
199,0
___
Schoen
et al., 198679
GA: Glutaraldeído; Glu: Ácido Glutâmico; NI: não informado; PB: Pericárdio Bovino
Discussão - 66
Houve diferença estatística entre os grupos apenas aos 60 dias pósimplante, em que o grupo controle PB GA mostrou aumento significante da
calcificação (5,67±1,3 µg/mg) em relação ao grupo anticalcificante PB
GA+Glu (3,1±0,15 µg/mg). O fator que deve ter influenciado para
obtenção dos baixíssimos índices de calcificação encontrados no grupo
controle PB GA desse estudo foi o tratamento antioxidante com peróxido
de hidrogênio (H2O2), empregado nas etapas finais do preparo do material,
de acordo com o processo Braile Biomédica® de fabricação de biopróteses
(Figura 19). É provável que a H2O2 também atue na inativação dos aldeídos
livres de GA, conforme se observa na reação química. Esse achado é o que
podemos chamar de “edge effect”, como já citado por outro autor que, ao
tratar seu biomaterial com glicerol, obteve menor acúmulo de cálcio.83
Discussão - 67
Figura 19: Esquema representativo do tratamento químico com
glutaraldeído (GA) para reticulação das fibras de colágeno do
pericárdio bovino, seguido de tratamento com peróxido de
hidrogênio (H2O2) formando o ácido carboxílico com
consequente diminuição da toxicidade pelo glutaraldeído
polimérico.
Soncini da Rosa et al. (2002)60 realizaram um estudo comparativo
da eficácia do Glu na prevenção da calcificação das cúspides e parede
aórtica porcina, após implante em subcutâneo de rato, aos 15, 30 e 60 dias.
Os resultados obtidos mostraram baixos índices de calcificação tanto no
grupo controle com GA (12,44±2,26 µg/mg; 13,44±3,34 µg/mg;
50,85±8,71 µg/mg, aos 15, 30 e 60 dias, respectivamente) como no grupo
tratado com GA+Glu (12,17±0,66 µg/mg; 15,31±2,82 µg/mg; 34,24±16,28
Discussão - 68
µg/mg, aos 15, 30 e 60 dias, respectivamente). Os autores concluíram que o
Glu a 0,8% não foi, diferentemente do PB, capaz de inibir a calcificação
das cúspides valvares porcinas, pois os valores do teor de cálcio não
diferiram dos encontrados no grupo controle. Na Tabela 8 encontra-se um
resumo dos valores acima descritos.
No presente estudo, a concentração de Glu utilizada foi de 1%, bem
próximo dos 0,8% de Soncini da Rosa et al. (2002).60 Entretanto, as
concentrações de cálcio foram muito inferiores, provavelmente devido à
aplicação de choques de pH durante o tratamento anticalcificante.
Inicialmente foi realizado um tratamento com NaOH em pH 12,0, em
seguida a neutralização com solução de ácido acético atingindo pH 7,4,
tratamento com Glu pH 3,5 e, finalmente, nova neutralização com NaOH
até atingir pH 7,4. Quando o PB foi submetido ao pH ácido, a matriz
colagênica alterou sua conformação, pela alteração das ligações
eletrostáticas, ao mesmo tempo em que se desfizeram as ligações
poliméricas de GA, possibilitando sua saída do tecido.51
A retomada da estrutura fibrilar do colágeno é devido à sua
memória térmica, pois quando colocado em pH neutro e a 37ºC, sua
estrutura volta à conformação inicial, mas com menor quantidade de GA
poliméricos.85
Além disso, o pH ácido 3,5 provocou a despolimerização dos
Discussão - 69
polímeros de GA, que fazem parte das ligações cruzadas presentes na
matriz colagênica, resultando na liberação do GA na forma de produtos
solúveis, ainda na etapa de processamento, diminuindo os efeitos da sua
toxicidade localizada e sistêmica, resultante da liberação de GA livre das
ligações poliméricas pós-implante. E mais, grupos aldeídicos, resultantes
da ligação do GA somente por uma de suas extremidades, também são
neutralizados, pois o Glu reage com estas extremidades, formando ligações
químicas estáveis o suficiente para resistir aos processos hidrolíticos,
quando expostas às condições fisiológicas.50
Após esses processos químicos, infere-se que o PB tenha alcançado
alto grau de biocompatibilidade pela retirada de GA poliméricos e
inativação de aldeídos livres e que, ao ser utilizado para confecção de
próteses valvares cardíacas, apresente índices menores de calcificação.
Houve clara diferença qualitativa no componente inflamatório do
grupo PB GA+Glu aos 28 dias, o qual apresentou maior pontuação no
escore total de agressão tecidual. A dimensão fractal foi significantemente
maior nesse grupo aos 28 dias (P = 0,0034) mas, curiosamente, embora
qualitativamente a Figura 10 indique menor escore total no grupo PB
GA+Glu, do ponto de vista de dimensão fractal esta continuou sendo
significantemente maior, possivelmente sugerindo que a avaliação objetiva
com o uso da dimensão fractal possa ser um melhor marcador da agressão
Discussão - 70
tecidual subjacente (P = 0,0495 aos 14 dias e P = 0,0002 aos 60 dias).
Estudos desenhados especificamente com essa finalidade deverão ser
realizados visando comparar a avaliação subjetiva do patologista contra a
avaliação objetiva da dimensão fractal em termos fisiopatológicos e
prognósticos.
Várias teorias são compartilhadas por muitos grupos que se
dedicam ao estudo da calcificação valvar, porém, o real mecanismo e a
explicação para o mesmo não se sabe ao certo. Provavelmente o tratamento
anticalcificante eficaz é uma somatória de fatores como fonte do tecido,
tipo de soluções, concentrações, pH, dentre outros.86 Assim, cada uma das
etapas do processo de tratamento dos tecidos biológicos poderá determinar
graus diferentes de calcificação.
Além dos estudos sobre a inativação desses componentes
indesejáveis formados a partir do uso do GA, existem pesquisadores que
atuam em outras frentes de estudos, visando a retirada de fosfolipídios das
membranas celulares, uso de substâncias como detergentes para
fosfolipídios, entre tantas outras técnicas que vão atuar também nos
potenciais locais de acúmulo de cálcio.24,35,41,43,63,87
É importante salientar a necessidade absoluta de que as
características físicas do pericárdio reticulado sejam preservadas, pois, caso
o tecido seja “destruído” pelo tratamento, a durabilidade da bioprótese será
Discussão - 71
menor. O tratamento adequado desde a coleta, a fixação em pressão zero, a
concentração, temperatura e tempos de exposição ao GA para conservação
da ondulação do colágeno e das fibras elásticas, praticamente elimina a
possibilidade de ruptura da prótese.
A atuação completa do GA deve ser garantida em toda a espessura
do tecido, demonstrada pela TS e pelos testes físicos de tração, assim como
pela
durabilidade
acelerada,
recomendada
pela
ANSI/AAMI/ISO
5840:2005 – Cardiovascular Implants – Cardiac Valve Prostheses.68
O tecido da válvula implantada vai se rompendo ao longo dos anos,
em consequência do estresse sofrido. No caso da mitral, são 75
toneladas/70
batimentos
por
minuto/24
horas,
durante
a
sístole
ventricular.88 Com o rompimento do tecido valvar, há uma invasão por
polimorfonucleares produzindo fibrose que termina em calcificação.
O hospedeiro também tem papel fundamental na calcificação.
Crianças, jovens e adultos até 37 anos têm maior tendência à calcificação
pelo metabolismo do cálcio. O mesmo ocorre em pacientes com
insuficiência renal e com mulheres grávidas.
O meio orgânico é agressivo, as biopróteses logicamente terão uma
durabilidade de acordo com o nível desta agressão, como ocorre com as
válvulas nativas.
5. CONCLUSÕES
Conclusões - 73
1. O pericárdio bovino reticulado pelo GA e tratado com Glu apresentou
características biomecânicas, térmicas e morfológicas apropriadas para
a confecção de válvulas cardíacas.
2. Os experimentos em implante subcutâneo de ratos mostraram que os
grupos químicos de GA reativo livre após reação com o Glu causaram
redução significante da calcificação tecidual.
3. As biopróteses valvulares cardíacas confeccionadas com PB tratado
com GA+Glu apresentaram durabilidade “in vitro” dentro dos padrões
normativos.
4. Estudos a longo prazo serão necessários para avaliar o possível efeito
da maior reação inflamatória ocorrida no grupo PB GA+Glu, conforme
demonstrado pela dimensão fractal dos tecidos.
6. REFERÊNCIAS
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APÊNDICES
Apêndices - 86
SOLUÇÃO DE LIMPEZA
Para limpeza do pericárdio é utilizada a solução de NaCl com
MgSO4, tamponada, pH 7,4 com tampão fosfato 0,13 mol/l.
1. Solução de Cloreto de Sódio 0,9% com Sulfato de
Magnésio
NaCl ................................ 9 g
MgSO4 7 H2O ................... 2,13 g
H2O purificada q.s.p. ........ 1000 ml
2. Solução de Fosfato de Sódio Dibásico Anidro 0,13 mol/l
Na2HPO4. ......................... 18,45 g
SOLUÇÃO DE FIXAÇÃO
1. Solução de GA a 25% Purificada
Solução GA 25% ............. 1000 ml
Carvão ativado ................. 100 g
Agitação mecânica por 1 hora. Filtrar.
A esta, mais tarde, será acrescida as soluções abaixo:
2. Solução de Fosfato de Sódio Dibásico Anidro 0,13mol/l
Na2HPO4 .......................... 18,45 g
Apêndices - 87
3. Solução de Fosfato de Potássio 0,13 mol/l
KH2PO4 ............................ 17,70 g
4. Solução Tampão de Fosfato
Na2HPO4 0,13M ............... 700 ml
KH2PO4 0,13M ................. 200 ml
SOLUÇÃO CONSERVANTE
A bioprótese é conservada em solução de formaldeído a 4%,
tamponada a pH 5,4 com acetato de sódio 0,2 mol/l na seguinte
formulação:
1. Solução de Formaldeído a 4%
Formol a 37% .................. 108 ml
2. Solução de Acetato de Sódio a 0,2 mol/l
CH3COONa ...................... 16,4 g
Apêndices - 88
TRATAMENTO ANTICALCIFICANTE
1. Solução de Ácido Glutâmico 1%
C5H9NO4........................... 10 g
NaCl 0,9% q.s.p. .............. 1000 ml
2. Solução de NaOH 0,1 N
NaOH ............................... 4 g
3. Solução de NaOH 0,01 N
NaOH ............................... 0,4 g
4. Solução de Ácido Acético 0,01 N
CH3COOH ........................ 0,57 ml
NaCl 0,9% q.s.p. .............. 1000 ml
ANEXOS
Anexos - 90
ANEXO 1

Pericárdio Bovino Tratado com Ácido Glutâmico

Transcrição

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