polimorfismos nos genes fas e fasl em indivíduos - PPGBAIP

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
POLIMORFISMOS NOS GENES FAS E FASL EM INDIVÍDUOS
INFECTADOS PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T
HUMANAS (HTLV)
ETHIENNE LOBATO DOS SANTOS
Belém-Pará
2013
1
POLIMORFISMOS NOS GENES FAS E FASL EM INDIVÍDUOS
INFECTADOS PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T
HUMANAS (HTLV)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do
Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade
Federal do Pará, como requisito para a obtenção do
grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário
Vallinoto.
Belém-Pará
2013
2
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFPA
___________________________________________________________________
Santos, Ethienne Lobato dos, 1981Polimorfismos nos genes FAS e FASL em indivíduos
infectados pelo vírus linfotrópico de células T humanas
( HTLV) / Ethienne Lobato dos Santos. - 1981.
Orientador: Antonio Carlos Rosário Vallinoto.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências
Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, Belém, 1981.
1. HTLV (Vírus). 2. Polimorfismo (Genética).
3 . Infecção por HTLV. 4. Genes. I. Título.
CDD 22. ed. 616.9188
____________________________________________________________________
3
POLIMORFISMOS DOS GENES FAS E FASL EM INDIVÍDUOS
INFECTADOS PELO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS
(HTLV)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Pará, como
requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Alexandre Rodrigues de Lemos
Prof. Dr. Leonardo dos Santos Sena
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado
Prof. Dr. Ricardo Ishak
Prof. Dra. Vânia Nakauth Azevedo
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA (Suplente)
Belém, 04 de abril de 2013.
4
EPÍGRAFE
Eu pedi forças... e Deus me deu dificuldades para fazer-me forte.
Eu pedi sabedoria... e Deus me deu problemas para resolver.
Eu pedi prosperidade... e Deus me deu cérebro e músculos para
trabalhar.
Eu pedi coragem... e Deus me deu perigos para superar.
Eu pedi amor... e Deus me deu pessoas com dificuldades para
ajudar.
Eu pedi dádivas... e Deus me deu oportunidades.
Eu não recebi nada do que pedi, mas eu recebi tudo que precisava.
Autor desconhecido
5
DEDICATÓRIA
À DEUS, fonte de inspiração. Por estar sempre presente em minha vida, por me amparar nos
momentos difíceis, por me dar força interior para superar as dificuldades, por mostrar o
caminho nas horas incertas, por me suprir em todas as minhas necessidades e iluminar meus
caminhos. É ao Senhor, meu MESTRE e MENTOR, a quem dedico mais esta conquista.
Aos meus pais, Ziloci Santos e Esmênia Santos, que sempre estiveram ao meu lado, nos
momentos bons - prontos para compartilhar comigo as minhas conquistas e as alegrias da vida
– e naqueles difíceis – em que o colo de vocês foi e continuará sendo meu eterno amparo.
Pelos nossos diálogos, pelo carinho, pela dedicação, pelos gestos, pela repreensão, quando foi
necessário, pela segurança das suas palavras, pela confiança, pela educação, pelo amor, etc.
Enfim, por terem me ensinado que vale a pena acreditar e lutar pelos meus sonhos, que
também se tornaram seus. A caminhada até aqui foi longa e cheia de obstáculos, os quais
consegui contornar graças a esses meus dois grandes guias, que com suas valiosas
experiências adquiridas em vida, sabiamente me ensinaram a trilhar rumo às grandes
conquistas.
Aos meus irmãos, Lianne Santos e Ziloci Júnior, pelo amor, respeito, companheirismo,
pelos fortes laços de amizades entre nós, além da reciprocidade fraternal admirável e
interminável. Por acreditarem sempre na minha capacidade, motivando-me a superar limites,
torcendo e vibrando comigo em todas as minhas conquistas, que também são suas. Enfim, por
representarem união para mim, nos momentos importantes.
Às minhas sobrinhas, Alicia e Julia, provas da presença constante de DEUS, anjos que
vieram para iluminar e alegrar ainda mais as nossas vidas, amo vocês.
Ao meu grande amor, Lincoln Loureiro, por não medir esforços para encurtar a distância
entre nós, por se fazer presente em todos os momentos da minha vida, por ser meu amigo,
companheiro de todas as horas, compreensivo, por conseguir dizer as mais belas palavras nos
momentos difíceis, preencher minha vida e realizar-me com seu amor.
Aos meus avós Mãe Vivi, Pai Sabá, Pai Zilo (in memorian) e Mãe Cizica, por todo apoio,
confiança e dedicação.
6
À toda minha família, imensa, graças a DEUS, que, com certeza serviu de incentivo para
mais esta realização.
7
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto, pela confiança em mim depositada, desde o
primeiro momento, dispondo-se a orientar-me e me dando a oportunidade de realizar este
trabalho. Pela atenção, pela paciência, por suas preciosas críticas e sugestões que, com
certeza, enalteceram esta pesquisa.
A todos os professores do Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará, o Prof. Dr. Luis Fernando Almeida Machado, o Prof. Dr.
Ricardo Ishak, a Profa. Dra. Vânia Nakauth Azevedo, Profa. Dra. Rosimar Neris Martins e a
Profa. Dra. Marluísa Ishak, que se fizeram presentes durante toda a realização do meu
trabalho, incentivando-me e mostrando-me que sou capaz de vencer e superar todas as minhas
dificuldades, colaborando para a construção do mesmo, sempre que precisei. Obrigada pelos
ensinamentos e pela confiança que em mim vocês depositaram.
Aos meus amigos do Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará, especialmente Jacqueline, Lucimar Di Paula, Felipe, Rogério,
Samara, Caroline, Renata, pessoas que aprendi a admirar, amigos para todas as horas, pelo
apoio incondicional durante o desenvolver do trabalho, pela amizade, uma das minhas
maiores conquistas durante esses seis anos, e pelo companheirismo. E todos os outros
companheiros de trabalho: Bárbara, Larissa, Izete, Tuane, Ednelza, Maria Helena, Sandra,
Alice, Érica, sempre dispostos a ajudar uns aos outros, não sendo diferentes comigo. O meu
muito obrigada pelas suas amizades que, com certeza, serão para a vida inteira.
Aos pacientes atendidos no ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical (NMT), que fizeram
parte das amostras testadas.
Ao Dr. Cezar Augusto Muniz Caldas e à Dra. Rita Catarina Medeiros, do Núcleo de Medicina
Tropical (NMT), pelas amostras a mim enviadas para realização deste estudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte
financeiro disponibilizado através da concessão de bolsa de Doutorado durante todo o
desenvolvimento deste trabalho.
8
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... 10
RESUMO .......................................................................................................................... 12
ABSTRACT .....................................................................................................................
13
1.
INTRODUÇÃO .............................................................................................
14
1.1
A FAMÍLIA RETROVIRIDAE .......................................................................
14
1.1.1
Vírus linfotrópicos de células T humanas (HTLV) ....................................
15
1.2
BIOLOGIA DO HTLV ...................................................................................
16
1.2.1
Características morfológicas do HTLV ....................................................... 16
1.2.2
Organização genômica do HTLV ................................................................. 17
1.2.3
Ciclo de Replicação do HTLV ......................................................................
1.2.4
Modos de transmissão do HTLV .................................................................. 21
1.3
EPIDEMIOLOGIA DO HTLV ......................................................................
23
1.4
PATOLOGIAS ASSOCIADAS AO HTLV ..................................................
27
1.4.1
Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (LLcTA) ................................
27
1.4.2
Paraparesia
Espástica
Tropical/Mielopatia
Associada
ao
18
HTLV-1
(PET/MAH) ...................................................................................................................... 29
1.4.3
Manifestações Reumáticas Associadas ao HTLV-1 .................................... 30
1.5
RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO PELO HTLV-1 ...................................
1.6
APOPTOSE ..................................................................................................... 32
1.7
O RECEPTOR APOPTÓTICO FAS E SEU LIGANTE FASL ....................
1.7.1
Polimorfismos Genéticos de Fas ................................................................... 36
1.7.2
Polimorfismos Genéticos de FasL ................................................................
36
1.8
OBJETIVOS ...................................................................................................
38
1.8.1
Objetivo Geral ...............................................................................................
38
1.8.2
Objetivos Específicos ..................................................................................... 38
2.
MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................
39
2.1
COLETA E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ..............................
39
2.1.1
Indivíduos soropositivos para o HTLV .....................................................
39
2.1.2
Indivíduos soronegativos para o HTLV .....................................................
39
2.1.3
Aspectos éticos ...............................................................................................
40
2.2
QUANTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS T CD4+ e CD8+ ................................
40
30
34
9
2.3
CARGA PROVIRAL ....................................................................................
40
2.4
ANÁLISE MOLECULAR ..............................................................................
41
2.4.1
Extração do DNA ..........................................................................................
41
2.4.2
PCR em tempo real .......................................................................................
42
2.4.3
Investigação molecular das formas alélicas dos genes FAS e FASL ........
43
2.4.3.1
Polimorfismo FAS-670A>G (rs1800682) .......................................................
43
2.4.3.2
Polimorfismo FAS-1377G>A (rs2234767) .....................................................
43
2.4.3.3
Polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G (rs5030772) .....................................
44
2.4.3.4
Polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T .............................................................
44
2.4.3.5
Polimorfismo FASLG-844C>T (rs763110) ..................................................... 45
2.4.3.6
Eletroforese ...................................................................................................... 46
2.5
MÉTODOS ESTATÍSTICOS .........................................................................
49
3.
RESULTADOS …………………………………………………………….
50
4.
DISCUSSÃO ..................................................................................................
68
5.
CONCLUSÕES .............................................................................................
71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................
72
ANEXO ............................................................................................................................
95
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da estrutura morfológica do HTLV ...................... 16
Figura 2 - Esquema ilustrando a estrutura genômica do HTLV ........................................ 17
Figura 3 - Síntese do DNA viral pela transcriptase reversa (TR) ...................................... 20
Figura 4 - Ciclo Replicativo dos Retrovírus ...................................................................... 21
Figura 5 - Representação esquemática das diferentes alterações morfológicas nos processos
de morte celular necrose e apoptose ................................................................................... 33
Figura 6 - Representação esquemática da estrutura protéica monomérica do receptor FAS
............................................................................................................................................. 35
Figura 7 - Representação esquemática da subunidade estrutural da proteína trimérica FASL
............................................................................................................................................
35
Figura 8 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima MvaI, a partir do fragmento
amplificado de 322 pb da região promotora do gene FAS ................................................
46
Figura 9 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima BstUI,, a partir do fragmento
amplificado de 122 pb da região promotora do gene FAS ................................................
47
Figura 10 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima FokI, a partir do fragmento
amplificado de 239 pb do segundo íntron do gene FASL .................................................
47
Figura 11 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima HincII, a partir do fragmento
amplificado de 185 pb do terceiro íntron do gene FASL ..................................................
48
Figura 12 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima DraIII, a partir do fragmento
amplificado de 85 pb na posição -844 da região promotora do gene FASL .....................
48
Figura 13: Comparação dos níveis de linfócitos T CD4+ e T CD8+ entre os indivíduos
infectados pelo HTLV (sintomáticos e assintomáticos) e grupo controle, portadores de
diferentes genótipos para o polimorfismo FAS-670A>G .................................................
58
diferentes genótipos para o polimorfismo FAS-1377G>A ...............................................
59
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G ...............................
61
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T ..................................
62
11
Figura 17 - Comparação dos níveis de linfócitos T CD4+ e T CD8+ entre os indivíduos
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLG-844C>T .............................................. 64
12
RESUMO
O presente estudo teve como objetivo de descrever os polimorfismos nos
genes FAS e FASL em indivíduos portadores da infecção pelo Vírus linfotrópico de células T
humanas (HTLV) e sua possível associação com a ocorrência de infecção sintomática em um
grupo de 321 indivíduos, subdivididos em 86 indivíduos soropositivos para o HTLV, com 39
sintomáticos e 47 assintomáticos, e 235 controles soronegativos. A identificação dos alelos A
e G do polimorfismo FAS-670A>G foi realizada por meio da técnica de PCR, utilizando
sequências de iniciadores específicos e posterior digestão enzimática (RFLP) com a enzima
MvaI. A identificação do polimorfismo FAS-1377G>A foi feita utilizando-se o método de
PCR-RFLP com a enzima BstUI. A identificação dos alelos A e G do polimorfismo
FASLGINV2nt-124A>G, bem como T e delT do polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T foi
realizada através da técnica de ACRS, seguido de RFLP com as endonucleases de restrição
FokI e HincII, respectivamente. A identificação do polimorfismo FASLG-844C>T foi feita
utilizando-se o método de PCR-RFLP com a enzima DraIII. As análises das distribuições das
genotípicas dos genes FAS e FASL nas populações estudadas sugerem uma possível
associação do polimorfismo FAS-670A>G com a suscetibilidade ao HTLV. A análise
combinatória dos genótipos revelou que a presença do alelo variante A na posição -1377FAS,
seja em homo ou em heterozigose, pode ser um fator predisponente à infecção pelo HTLV. A
análise combinatória dos genótipos revelou que a presença do alelo mutante G do
polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G, em homo ou heterozigose, foi mais frequente entre
os controles, sugerindo uma proteção à infecção pelo HTLV aos portadores desse alelo. A
análise de regressão logística múltipla revelou um risco aumentado de progressão para
infecção sintomática pelo HTLV associada aos polimorfismos FAS-670A>G e FASLG844C>T. Os portadores do alelo C do polimorfismo FASLG-844C>T apresentaram médias de
linfócitos TCD8+ mais elevados, sugerindo uma melhor resposta imunológica. Não foi
observada existência de associação entre os polimorfismos nos genes FAS e FASL com os
níveis de carga proviral. Assim, faz-se necessário estudos posteriores, que visem investigar,
por exemplo, a influência dos níveis de expressão dos genes FAS e FASL em indivíduos
portadores da infecção pelo Vírus linfotrópicos de células T humanas (HTLV).
13
ABSTRACT
This study aimed to describe the polymorphisms in FAS and FASL in
patients with the human T-cell lymphotropic virus (HTLV) and its possible association with
the occurrence of symptomatic infection in a group of 321 individuals, divided in 86 HTLV
seropositive individuals, with 39 symptomatic and 47 asymptomatic, and 235 seronegative
controls. The A and G alleles identification of the FAS-670A>G polymorphism was
performed through a PCR followed by restriction endonucleases analyses (RFLP), with the
enzyme MvaI. The identification of the polymorphism FAS-1377G>A was performed using
the PCR-RFLP method with enzyme BstUI. The identification of A and G alleles of
FASLGINV2nt-124A>G
polymorphism, T and delT of the FASLIVS3nt169T>∆T
polymorphism was performed using ACRS assay, followed by RFLP with the restriction
endonucleases FokI and HincII, respectively. The identification of the polymorphism FASLG844C>T was performed using the PCR-RFLP method with the enzyme DraIII. Analyses of
genotypic distributions of FAS and FASL genes in the populations studied suggest a possible
association of the polymorphism FAS-670A>G with susceptibility to HTLV. Combinatorial
analysis of genotypes showed that the presence of the variant A allele at position -1377FAS,
whether homo or heterozygous, may be a predisposing factor to HTLV. Combinatorial
analysis of genotypes showed that the presence of the mutant allele G of the polymorphism
FASLGINV2nt-124A>G, in homo or heterozygosity was more frequent among controls,
suggesting a protection to HTLV carriers of this allele. A multiple logistic regression analysis
revealed an increased risk of progression to symptomatic infection with HTLV
polymorphisms associated with FAS-670A>G and FASLG-844C>T. The C allele
polymorphism FASLG-844C>T showed average higher CD8+ T lymphocytes, suggesting a
better immune response. There was no association between polymorphisms in genes FAS and
FASL with the levels of proviral load. Thus, it is necessary to further studies aimed at
investigating, for example, the influence levels of gene expression FAS and FASL in
individuals carrying the infection of human T-cell lymphotropic virus (HTLV).
14
1.
INTRODUÇÃO
1.1
A FAMÍLIA RETROVIRIDAE
Nenhum grupo de agentes infecciosos tem recebido mais atenção da
comunidade científica nos últimos anos do que os retrovírus (Coffin, 1996). Os vírus da
família Retroviridae ganharam notoriedade com a descrição do Vírus da imunodeficiência
humana (HIV), porém o grupo já é bastante conhecido desde o início do século passado com
os estudos de Rous (1911) apud Ishak et al.(2003).
A família Retroviridae compreende uma extensa família de vírus que
infectam primariamente vertebrados, particularmente aves e mamíferos, embora já tenham
sido encontrados infectando outros animais como insetos e moluscos, determinando-lhes, uma
variedade de doenças, incluindo malignidades de diversos tipos, desordens neurológicas,
hematológicas e imunodeficiências (Andrada-Serpa et al., 1994; Coffin, 1996).
Os retrovírus possuem em seu genoma duas fitas simples de RNA, idênticas,
com polaridade positiva que, por ação da enzima DNA-polimerase RNA-dependente
(transcriptase reversa), têm seu RNA genômico transcrito na forma de um DNA de fita dupla
(Coffin, 1996; Gallo, 2005). Esses vírus são tradicionalmente classificados em três
subfamílias: Oncovirinae, Lentivirinae e Spumavirinae, baseando-se primariamente na
patogenicidade mais do que nas relações genômicas (Andrada-Serpa et al., 1994; Coffin,
1996). O Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) tem definido, recentemente, a
partir das relações de seqüências nucleotídicas e estrutura genômica, a existência de sete
gêneros distintos dentro dessa família: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus,
Deltaretrovirus, Epsolonretrovirus e Lentivirus, sendo esses divididos em subgêneros e
espécies (Coffin, 1996; ICTV, 2012).
Os vírus de importância médica para o homem são os Vírus linfotrópico de
células T humanas (HTLV-1 e HTLV-2), pertencentes ao gênero Deltaretrovirus, os quais
têm associação com raras doenças linfoproliferativas e o Vírus da imunodeficiência humana 1
e 2 (HIV-1 e HIV-2), responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (Aids),
classificados no gênero Lentivirus (Hall et al., 1992; White & Fenner, 1994; ICTV, 2005).
15
1.1.1
Vírus linfotrópicos de células T humanas (HTLV)
O HTLV-1 e o HTLV-2 possuem propriedades biológicas semelhantes,
apresentando tropismo por linfócitos T e uma associação com raras doenças
linfoproliferativas (Rosenblatt et al., 1988; Poiesz et al., 1980; 1981; Yoshida et al., 1982;
Hall et al., 1996).
A infecção pelo HTLV-1 é endêmica no Japão, Caribe, sul da América,
África Sub-saariana e Melanésia (Blattner et al., 1982; 1983; Hinuma et al., 1982; Saxinger et
al., 1984; Gotuzzo et al., 2000), onde está associada ao linfoma e leucemia de células T do
adulto (LLcTA), uma neoplasia de linfócitos T CD4+ maduros e também
à chamada
Paraparesia Espástica Tropical ou Mielopatia Associada ao HTLV-I (PET/MAH),
caracterizada por distúrbios neurológicos crônicos (Gessain et al., 1985; Ferreira Jr et al.,
1997).
A infecção pelo HTLV-2 é prevalente entre usuários de drogas intravenosas
(UDIV) das áreas urbanas dos Estados Unidos e da Europa, sudeste da Ásia e entre diversas
populações nativas da América central, do norte e sul, assim como em tribos pigméias da
África Central, demonstrando-se menos patogênico que o HTLV-1. Embora não haja
indicadores nítidos associando o HTLV-2 a manifestações clínicas bem definidas, existem
evidências que sugerem a sua associação a um quadro clínico semelhante à PET/MAH
(Goubau et al., 1993; Soriano et al., 1995; Ishak et al., 1998, 2003; Egan et al., 1999;
Fujiyoshi et al., 1999; Colin et al., 2003).
Dois novos outros tipos de HTLV, o HTLV-3 e o HTLV-4, foram isolados
de populações da República dos Camarões, vivendo próximos a florestas. Através de análises
filogenéticas, o HTLV-3, isolado de um indivíduo com padrão indeterminado de Western
blotting (Wb), demonstrou uma forte relação com o Vírus linfotrópico de células T de símios
3 (STLV-3) (Calattini et al., 2005; Wolfe et al., 2005). Já o HTLV-4 é um membro de
linhagem filogenética distinta de todos os tipos de HTLV e STLV conhecidos, sendo
identificado de um indivíduo com padrão de Wb característico para HTLV-2 (Wolfe et al.,
2005).
16
1.2
BIOLOGIA DO HTLV
1.2.1
Características morfológicas do HTLV
O HTLV é um retrovírus tipo C, com forma esférica e tamanho médio de 100
a 120 nm de diâmetro. Possuem seu genoma diplóide de RNA circundado por um capsídeo
composto pelas proteínas estruturais p19, p24 e p15, formando assim o nucleocapsídeo ou
core viral eletrodenso, caracterizado por ser central, onde encontram-se enzimas que
desempenham papel importante na replicação viral, tais como a protease, a integrase e a
transcriptase reversa, que também assume a função de RNAse H (Ribonuclease H).
Externamente, encontra-se o envelope viral composto pela matriz lipídica da membrana
plasmática da célula hospedeira adicionada das glicoproteínas virais gp21 e gp46 (AndradaSerpa, 1994; Coffin, 1996; Rayne et al., 2001; Ishak et al., 2003; Figura 1).
Figura 1: Representação esquemática da estrutura morfológica do HTLV (Casseb & Penalva
de Oliveira, www.htlv.com.br).
Proteínas do MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade
17
1.2.2
Organização genômica do HTLV
O HTLV-1 e o HTLV-2 apresentam estrutura genômica similar e parte da
sequência nucleotídica com 70% de homologia. Possuem em seu genoma, na forma de DNA
proviral (genoma viral integrado ao genoma celular), aproximadamente, 9.000 pares de bases
(pb), três genes estruturais (gag, pol e env), uma região chamada pro sobreposta aos genes
gag e pol e dois principais genes reguladores, tax e rex, situados em uma região denominada
de pX, localizada entre as regiões env e 3’LTR, exclusiva do HTLV. Recentemente, foi
descrito o gene viral HTLV-1 b-ZIP fator (HBZ) sendo o único na região pX cujo o promotor
encontra-se na região 3´LTR (Mesnard et al, 2008). Flanqueando esses genes, tem-se as duas
longas terminações repetidas (Long Terminal Repeats – LTR), sem função codificadora
(Shimotohno et al., 1985; Manns et al., 1999; Jeang et al., 2004; Feuer & Green, 2005; Figura
2).
5’
3’
Pol
Gag
pX
LTR
U3-R-U5
p19
p24
p15
Pro
protease
Transcriptase
Env
RNAse
gp21
Integrase
gp46
Tax
LTR
U3-R-U5
Rex
HBZ
Figura 2: Esquema ilustrando a estrutura genômica do HTLV (adaptado de Boxus e Willems,
2009).
p19, p24 e p15 - proteínas estruturais; protease - enzima proteolítica; transcriptase, RNAse e
integrase - enzimas envolvidas na replicação viral; gp21 e gp46 - glicoproteínas virais de
superfície; Tax e Rex - proteínas envolvidas na regulação da transcrição viral; HBZ – proteína
envolvida na transativação mediato pelo Tax.
As regiões LTR possuem 763 pb e contêm sítios de ligação para a RNA
polimerase e sequências que regulam a transcrição viral. A estrutura U3-R-U5, nas
extremidades 5’e 3’, presentes nessas regiões, é normalmente utilizada pelo provírus como
sinais de início e término da transcrição, respectivamente (Shimotohno et al., 1985; Hall et
al., 1994).
O gene gag codifica uma poliproteína (p53) que será subsequentemente
clivada em três outras proteínas com função estrutural: a proteína da matriz (p19), a do
capsídeo (p24) e a do nucleocapsídeo (p15). O gene pol codifica as enzimas transcriptase
18
reversa, RNAse H e integrase, estando todas envolvidas na síntese e integração do provírus ao
genoma do hospedeiro (Hall et al.,1994; Karpas, 2004). A região pro codifica a enzima
protease, responsável pela clivagem dos produtos dos genes gag e pol (Shimotohno et al.,
1985).
O gene env codifica uma proteína precursora que vai sofrer clivagem
proteolítica e, subsequentemente, glicolisação, produzindo duas glicoproteínas de superfície, a
gp46 e a gp21. A gp46 tem a função de reconhecimento e ligação ao receptor celular,
facilitando assim a penetração do vírus na célula. A gp21 é uma proteína transmembrana,
ancorada no envelope viral, desempenhando importante papel na fusão do envelope viral com
a membrana (Hall et al.,1994; Karpas, 2004). A região pX contém os genes que codificam
para as proteínas virais Tax, Rex, HTLV-I bZIP fator (HBZ), p12, p13, p30 e p21 que estão
relacionadas com a patogênese viral (Matsuoka & Jeang, 2007; Mesnard et al, 2008).
A proteína Tax é capaz de induzir a proliferação celular e interfere nas vias
moleculares da célula infectada atuando na sobrevida, induzindo danos genéticos e
interferindo no seu metabolismo (Edwards et al, 2008; Matsuoka & Jeang, 2007).
O gene viral HTLV-I bZIP fator (HBZ), recentemente descrito (Mesnard et
al, 2008), transcreve-se em sentido negativo e é o único da região pX no qual promotor
encontra-se na região 3’LTR do provirus (Mesnard et al, 2008). Funciona sob duas diferentes
formas moleculares: como RNAm e como proteína. O RNAm promove a proliferação das
células infectadas, enquanto a proteína suprime a transativação mediada por Tax através do 5’
LTR (Satou et al, 2006).
A proteína Rex atua na regulação pós-transcricional, promovendo o splicing
do RNA mensageiro viral (RNAm) e o transporte do mesmo do núcleo para o citoplasma,
além de promover a expressão das proteínas de gag, pol e env (Ciminale et al., 1992;
Bangham, 2000). Pode ainda regular a sua própria expressão, assim como a de Tax. A
regulação negativa de Tax e Rex levaria a uma diminuição da expressão de todos os genes
virais e pode restabelecer a latência, assim tem sido postulado que Rex pode estar envolvida
em um estado de latência e produção do vírus (White & Fenner, 1994).
1.2.3
Ciclo de Replicação do HTLV
O ciclo de replicação do HTLV é comum ao de outros retrovírus e inclui os
seguintes aspectos: reconhecimento do receptor e penetração do vírus na célula hospedeira,
transcrição reversa, integração, transcrição e montagem de novos vírus (Tillmann et al.,
1994).
19
Inicialmente, há uma interação entre as glicoproteínas sintetizadas pelo gene
env: a gp46, com função de reconhecimento e ligação ao receptor GLUT-1 da superfície das
células-alvo, e a gp21, a qual funciona como uma âncora, penetrando na membrana da célula,
facilitando a fusão entre o envelope viral e a membrana celular, com a consequente
penetração do genoma viral no citoplasma da célula hospedeira (Jinno et al., 1999; Manel et
al., 2003; Karpas, 2004).
Uma vez liberado no citoplasma celular, o nucleocapsídeo viral possui em
sua estrutura toda maquinaria necessária à síntese do DNA viral (Andrada-Serpa, 1994). O
HTLV possui uma molécula particular de RNA transportador (RNAt), que é utilizada como
iniciador da transcrição, associada com à região 5’LTR (White & Fenner, 1994).
Primeiramente é transcrita a região correspondente aos fragmentos R e U5, localizados entre o
sítio de ligação do iniciador e a extremidade 5’ do genoma. Posteriormente, a transcriptase
reversa salta para a extremidade 3’ para dar continuidade à formação do DNA fita única de
orientação negativa (Andrada-Serpa, 1994; Coffin, 1996). Concomitantemente, o RNA viral
que serviu de molde é degradado pela enzima RNAse H, que faz parte da molécula de
transcriptase reversa (White & Fenner, 1994).
Os oligonucleotídeos resultantes desta hidrólise servem como primer para a
síntese de DNA de fita simples de polaridade positiva, utilizando para isso, o DNA recémformado como molde. O DNA de fita dupla resultante, contém as seqüências terminais
chamadas terminações longas repetidas (LTR), sendo cada uma composta das regiões U3, R e
U5 (White & Fenner, 1994) (Figura 3). Esse DNA de fita dupla recém-formado migra para o
núcleo onde, por ação da integrase, vai se integrar ao genoma do hospedeiro na forma de um
provírus (Cullen, 1992). A notável estabilidade genética sugere que o vírus replica por
mitoses celulares (Mortreux et al., 2003).
20
Figura 3: Síntese do DNA viral pela transcriptase reversa (TR) (adaptado de Andrada-Serpa,
1994).
Uma vez integrado no DNA celular, o provírus inicia a transcrição do RNA
utilizando todo o mecanismo bioquímico da célula hospedeira, sendo transcrito pela RNA
polimerase II celular (White & Fenner, 1994; Coffin, 1996). Duas classes de produtos
transcritos são gerados, um RNA genômico sem evento de processamento tipo splicing
(unspliced), para a incorporação do vírus maduro, e dois RNA transcritos com eventos de
processamento tipo splicing (RNA subgenômico), usados para gerar poliproteínas virais
(Urnovitz & Murphy, 1996).
21
Ao final da síntese do RNA e das proteínas virais, dá-se, simultaneamente, a
montagem e o brotamento de novos vírus. O envelope viral é adquirido durante a montagem
das partículas virais, a partir de protuberâncias visualizadas na parte externa da membrana
celular, as quais se estendem até formarem esferas com a mesma composição lipídica da
membrana da célula hospedeira, além de glicoproteínas virais. Assim, essas partículas virais
imaturas obtêm seus envelopes durante o brotamento na superfície celular (Coffin, 1996;
Buchschacher, 2002) (Figura 4).
Figura
4:
Ciclo
Replicativo
dos
Retrovírus
(http://www.bio.davidson.edu/people/vecase/SeniorColloquium/04/Genetic%20Testing/genet
herapybiology.htm)
1.2.4
Modos de transmissão do HTLV
O HTLV-1 e o HTLV-2 compartilham as mesmas vias de transmissão que o
HIV-1, tais como: o contato sexual, a transfusão sanguínea e de hemoderivados, o uso de
agulhas e/ou seringas contaminadas e a transmissão da mãe para o filho pela via
transplacentária e, principalmente, através da amamentação (Dixon et al., 1989; Ferreira et
al.,1997; Morimoto et al., 2005; Nobre et al., 2005), mas, diferentemente do HIV-1, a
transmissão inter-humana depende da veiculação de linfócitos infectados.
22
A transmissão sexual do HTLV é bidirecional (Kajiyama et al., 1986),
entretanto a transmissão de homens para mulheres é mais eficiente, o que pode explicar a
maior soropositividade em mulheres (Carneiro-Proietti et al., 2002). Por exemplo, relata-se
que, após 10 anos de contato sexual com parceiro infectado, a mulher tem uma probabilidade
de cerca de 60% de estar infectada, em oposição ao homem, cuja probabilidade é de somente
0,4% (Murphy et al., 1989; Ferreira et al.,1997). A soronegatividade de cônjuges de pessoas
soropositivas, sugerem que essa forma de transmissão é relativamente ineficiente (Dixon et
al., 1989). Entretanto, estudos desenvolvidos por Ishak et al. (1995), em povos ameríndios da
região amazônica brasileira, demonstraram uma constante e contínua transmissão do HTLV-2
entre homens e mulheres, mas sem diferenças significantes, sugerindo que a transmissão
sexual pode ser igualmente eficiente entre os gêneros.
A transfusão sanguínea e de hemoderivados é a mais eficiente via de
transmissão do HTLV, com uma taxa de soroconversão de aproximadamente 50% (Okochi et
al., 1984; Kamihira et al., 1987). A eficiência da transmissão do HTLV-2 via transfusão varia
de 20% (Estados Unidos) a 60% (Japão/Estados Unidos) (Ishak et al., 2003). Testes
sorológicos para infecção por HTLV têm se tornado obrigatórios em alguns países (Japão,
Estados Unidos, Canadá, países europeus) desde 1986 e, no Brasil, desde 1993, através da
Portaria 1376 do Ministério da Saúde (Ferreira et al.,1997; Colin et al., 2003; Santos et al.,
2003; Proietti et al., 2005). Essa importante intervenção da saúde pública na exclusão de
indivíduos soropositivos candidatos a doadores de sangue, tem resultado em menor infecção
em pacientes transfundidos, assim como tem contribuído para a redução do número de novas
infecções da população global (Proietti et al., 2005).
O HTLV é transmitido entre UDIV, presumivelmente através do
compartilhamento de seringas contaminadas com linfócitos infectados (Catalan-Soares et al.,
2001). Em virtude desse comportamento inseguro, a propagação da infecção por esse
retrovírus entre os UDIV é correntemente alarmante, com uma alta prevalência de
soropositividade (Weiss, 1987; Dixon et al., 1989). Estudos realizados nos Estados Unidos e
na Itália apontam prevalências para o HTLV-1/2 nessa população que variam de 8 a 28% e de
4 a 7,3%, respectivamente, com predomínio do tipo 2 sobre o tipo 1. Entretanto, o HTLV-1 é
prevalente entre UDIV no Brasil e em Nova Iorque (Weiss, 1987; Zela et al., 1990; Proietti,
2005).
A transmissão de mãe para filho ocorre, principalmente, pela amamentação
por meio da ingestão de leite contendo linfócitos infectados. A eficiência dessa importante via
23
de transmissão depende do tempo da amamentação, com a soroconversão na infância variando
de 1 a 3 anos de idade (Nyambi et al., 1996; Ferreira et al.,1997; Kusuhara et al., 1997).
A transmissão materno-infantil é apontada como principal modo de
transmissão em áreas endêmicas no Japão, e estudos desenvolvidos nesse país demonstraram
taxas de transmissão pelo aleitamento materno variando de 15 a 25% (Nyambi et al., 1996;
Catalan-Soares et al., 2001). De 78 crianças amamentadas com mamadeiras, cerca de 13%
estavam infectadas, sugerindo ser esta a taxa de infecção transplacentária. Vários autores,
utilizando a reação em cadeia da polimerase, têm encontrado linfócitos infectados em
amostras de sangue do cordão umbilical (Hirata et al., 1992; Catalan-Soares et al., 2001).
Em diversas populações indígenas, a transmissão de mãe para filho tem sido
reportada como uma importante via de transmissão e manutenção da endemicidade do HTLV2 (Ishak et al., 2003). Ishak et al. (1995) demonstraram, pela primeira vez, a importância da
transmissão vertical desse retrovírus entre ameríndios da região amazônica brasileira, onde foi
encontrada uma taxa de soropositividade acima de 20% em crianças com idade inferior a nove
anos. Além do mais, em relação à tribo Kararaô, foi possível demonstrar a similaridade
genética do vírus transmitido de mãe para filho (Ishak et al., 2001).
O caminho para a prevenção da transmissão de mãe para filho seria a
amamentação de crianças, filhas de mães soropositivas, com mamadeiras, ou ainda pela
redução do tempo de amamentação (Vrienlink & Reesink, 2004). Contudo, crianças
alimentadas com mamadeiras têm também apresentado infecção com HTLV-1 com uma
freqüência de 4 a 14% e, apesar de ainda não estar bem esclarecido qual o mecanismo de
transmissão desse vírus para essas crianças, é provável que aí tenha ocorrido uma transmissão
via intra-uterina ou perinatal (Bittencourt, 1998; Manns et al., 1999).
Ainda não se sabe se os modos de transmissão do HTLV-3 e do HTLV-4 são
semelhantes aos de outros tipos de HTLV. Portanto, é fundamental o desenvolvimento de
pesquisas acerca das possíveis doenças por eles causadas, assim como da possibilidade de
transmissividade entre humanos (Calattini et al., 2005; Wolfe et al., 2005).
1.3
EPIDEMIOLOGIA DO HTLV
O HTLV-1 é endêmico na África, na Europa, no Sudeste da Ásia, no Japão,
no Caribe, nas Américas do Norte e do Sul (Switzer et al., 1995; Hall et al., 1996; Taylor,
1996), enquanto que a infecção pelo HTLV-2 é prevalente em diversas comunidades
indígenas das Américas, assim como em tribos pigméias da África Central, entre UDIV e
doadores de sangue nas Américas do Norte e do Sul, e na Europa (Duenas – Barrajas et al.,
24
1993; Goubau et al, 1993; Hjelle et al., 1993; Lee et al., 1993; Levine et al., 1993; Ishak et
al., 1995).
A África representa um reservatório endêmico do HTLV. Há predominância
do HTLV-1 no continente africano, mas o HTLV-2, também, foi encontrado entre pigmeus,
em Camarões (Mauclére et al., 1997). Vandame et al. (1998), encontraram o novo subtipo
HTLV-2d em pigmeus de Efe Bambuti, Congo, com as sequências mais divergentes entre os
HTLV-2 até então conhecidos, sendo esta nova linhagem denominada de Pygmy HTLV-2
Efe-2. Em amostras de 960 indivíduos vivendo em vilas rurais próximas a áreas de florestas,
no sudeste da República de Camarões, que tinham contato com sangue e fluidos de primatas
não humanos (PNH), seja através da alimentação ou comercialização desses animais 9,7%
confirmaram a infecção pelo HTLV no Wb. Nestas, a prevalência para o HTLV-1 foi de
1,1%, para o HTLV-2 de 0,5%, para o HTLV de 1,4% e 6,7% obtiveram um padrão de Wb
indeterminado. Verificou-se ainda a ocorrência de um novo vírus do gênero Deltaretrovirus, o
HTLV-4, distinto de todos os HTLV e PTLV conhecidos, proveniente de um homem de 48
anos, com padrão Wb característico para HTLV-2 (Wolfe et al., 2005).
Forbi e Odetunde (2007), estudando a prevalência da infecção de HTLV em
mulheres grávidas e trabalhadoras do sexo, na Nigéria, encontraram uma prevalência de
16,7% (20 de 120 amostras) em mulheres grávidas e, de 22,9% (38 de 166 amostras) em
trabalhadoras do sexo.
Visando determinar a prevalência dos tipos e subtipos de HTLV em
gestantes no Gabão, Etenna et al. (2008) realizaram um levantamento epidemiológico nas
cinco principais cidades do país. Em 907 amostras, a prevalência de HTLV-1 foi de 2,1%, das
quais, um pertencia ao subtipo 1a (Cosmopolita) e, a outras, pertenciam ao subtipo 1b (África
Central), sendo encontrado apenas um caso de infecção pelo HTLV-2, pertencendo ao subtipo
2b. A soroprevalência para HTLV-1 aumentou com a idade e diferiu entre as regiões, com
maior prevalência (5%) na região sudeste.
A infecção pelo HTLV parece ser rara na Europa e, quando ocorre, é restrita
a grupos específicos, como imigrantes de áreas endêmicas ou pessoas com comportamento de
risco para retroviroses (Kurtz et al., 2000).
O Japão foi a primeira região a ser identificada como endêmica para o
HTLV, com taxas de prevalência que variam de 0 a 37%, sendo as áreas localizadas no
sudoeste do país (Shikoku, Kyushu e Okinawa), as que apresentam maiores índices (Goto et
al., 1997). Em Israel, a prevalência da infecção por HTLV-1 em doadores de sangue é de
1/100.000 pessoas (Stienlauf et al., 2009).
25
A infecção pelo HTLV mostra-se endêmica em um grande número de
populações indígenas americanas. Na América do Norte, o HTLV está presente entre as tribos
Navajo e Pueblo do Novo México e entre os índios Seminole na Flórida (Hjelle et al., 1990,
1993; Levine et al., 1993). Em uma coorte de 2561 UDIV, em King Country, Washington,
Zunt et al. (2006), relataram a infecção pelo HTLV-2 em 190 indivíduos (7,4%).
Na América do Sul, distintas populações da Colômbia, da Argentina e do
Brasil têm sido encontradas infectadas com o vírus. Dois subtipos moleculares, o HTLV-2a e
o HTLV-2b foram identificados em ameríndios e UDIV, com maior prevalência do subtipo 2b
entre os grupos populacionais indígenas (Dube et al., 1993; Lee et al., 1993; Eiraku et al.,
1996; Switzer et al., 1996).
Um estudo realizado na cidade de Arequipa, no Peru, pesquisou a presença
de anticorpos para HTLV-1/2 em 2.732 doadores de sangue, dos quais 35 (1,2%) foram
sororreativos para HTLV, por ELISA, sendo 25 HTLV-1 positivos, confirmados por Wb
(Quispe et al., 2009).
No Brasil, a infecção pelo HTLV-1 é considerada endêmica, porém com
baixo índice de prevalência na população geral, quando comparado com os índices do Japão
(Silva et al., 2002). A infecção pelo HTLV-1 e pelo HTLV-2 encontra-se presente em todas
as regiões brasileiras, mas as prevalências variam de um estado para o outro, sendo mais
elevadas na Bahia, em Pernambuco e no Pará (Carneiro-Proietti et al., 2002).
A prevalência da infecção pelo HTLV-1 em remanescentes de comunidades
quilombolas no Brasil Central, foi estimada em 0,5% (9/1.837) por Nascimento et al. (2009).
Dal Fabro et al. (2008), estimaram a prevalência da infecção pelo HTLV1/2
em gestantes no Estado de Mato Grosso do Sul, e, das 116.689 gestantes analisadas, 153
estavam infectadas pelo HTLV-1/2 (0,13%), dentre as quais, 133 (86,9%) eram HTLV-1
positivas e, 20 (11,1%) HTLV-2. Dentre as 2.965 puérperas, com idade média de 23,9 anos,
atendidas em três maternidades públicas de Cuiabá, encontrou-se uma prevalência de HTLV1/2 da ordem de 0,2% (Ydy et al., 2009).
O primeiro estudo soroepidemiológico demonstrando a infecção pelo HTLV2 entre indígenas do sul do Brasil, foi reportado por Menna-Barreto et al. (2005), que
encontrou entre os índios Guarani uma taxa de soropositividade para anticorpos anti-HTLV-2
de 5,76% (3 de 52 indivíduos analisados).
Em um estudo de caso-controle desenvolvido por Mota et al. (2006) para
estimar a prevalência da infecção por HTLV em doadores de sangue, em Salvador, observouse, entre os 504 participantes, uma prevalência de 0,48%. Entre mulheres usuárias de crack,
26
encontrou-se uma baixa prevalência de 4,0%, de um total de 125 amostras analisadas, na
mesma cidade (Nunes et al., 2007).
Os primeiros casos comprovados de associação de PET/MAH ao HTLV-1
foram descritos em Fortaleza (Castro-Costa et al., 1991). Ishak et al. (2002), analisando
pacientes com paraparesia progressiva de origem obscura, atendidos em uma clínica
universitária em Belém-Pará, encontraram os primeiros casos comprovados de uma provável
associação entre o HTLV-1 e PET/MAH nessa cidade.
A primeira detecção, em Belém, da infecção pelo HTLV-2c entre doadores
de sangue foi descrita por Ishak et al. (1998) por meio da análise das amostras soropositivas
para o HTLV-2, as quais foram submetidas à PCR para as regiões genômicas pX e env. Santos
et al. (2009), analisando 79 amostras de indivíduos soropositivos para o HTLV na cidade de
Belém, Pará, observaram que, destas, 71% eram HTLV-1, classificadas como pertencentes ao
subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental e, 29% eram HTLV-2, dentre as quais, a
maioria identificadas como HTLV-2c, sendo, ainda, obeservado pela primeira vez na
Amazônia Brasileira, uma amostra de HTLV-2b.
Vallinoto et al. (2004) encontraram uma prevalência de infecção pelo
HTLV-1 de 2,38% entre imigrantes japoneses residentes na cidade de Tomé–Açú, no Estado
do Pará. Análises filogenéticas das três amostras revelaram que as mesmas pertenciam ao
grupo Cosmopolita, sendo duas do subgrupo Japonês e uma do subgrupo Transcontinental. A
presença do subgrupo Transcontinental também foi evidenciada em dois habitantes de
comunidades remanescentes de quilombos localizados na Ilha de Marajó (Vallinoto et al.,
2006).
Análises feitas em 25 comunidades indígenas da região amazônica brasileira
por Ishak et al. (1995), detectaram a presença do HTLV-2 na maioria delas, com uma taxa de
soroprevalência acima de 30% na tribo Kayapó, identificando, ainda, por meio da análise da
RFLP e das seqüências nucleotídicas da região env, a infecção pelo subtipo HTLV-2a entre os
Kayapós.
Amostras de sangue de índios nativos na aldeia Kararao (Kayapó) foram
analisadas, por métodos sorológicos e moleculares por Ishak et al. (2001) para caracterizar a
infecção e analisar a transmissão do HTLV-2. Observou-se uma reatividade específica em 3
de 26 indivíduos, dos quais duas amostras eram de uma mãe e de seu filho. A análise pela
RFLP das regiões pX e env, confirmou a infecção por esse vírus, evidenciando ainda, por
análise filogenética e da seqüência de nucleotídeos, a ocorrência do subtipo HTLV-2c.
27
A ocorrência de co-infecção HIV-1/HTLV é freqüente, provavelmente em
conseqüência desses retrovírus compartilharem os mesmos modos de transmissão. Na cidade
de Belém, Pará, Vallinoto et al. (1998) mostraram, pela primeira vez, a infecção pelo HTLV
em pacientes HIV-1 positivos, e observaram uma maior prevalência de HTLV-2 (4,7%) em
relação ao HTLV-1 (2,7%). Esses resultados foram confirmados por Laurentino et al. (2005),
que identificaram em pacientes HIV-1 positivos, na área urbana da cidade de Belém, Pará,
uma taxa de infecção pelo HTLV-2 maior (3,4%) do que pelo HTLV-1, que foi de (1,7%).
1.4
PATOLOGIAS ASSOCIADAS AO HTLV
O HTLV-1 está etiologicamente associado a dois tipos diferentes de doenças.
Cerca de 1 a 5% das pessoas infectadas desenvolvem um tipo agressivo de tumor de células T
– Leucemia/Linfoma das Células T do Adulto (LLcTA) – ou uma doença crônica inflamatória
neurodegenerativa, denominada de Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia Associada ao
HTLV-1 (PET/MAH). Contudo, mais de 90% dos infectados permanecem assintomáticos por
um longo período da vida (Bangham, 2000).
Outras síndromes auto-imunes, dentre as quais artrite reumatóide e síndrome
de Sjögren são descritas em pacientes infectados pelo HTLV-1. Nestes pacientes, estas
condições clínicas parecem ser o resultado da interação entre o vírus como fator do ambiente
e susceptibilidade do hospedeiro, levando ao funcionamento aberrante de mecanismos imunomoduladores, proliferação celular e inflamação (Cruz et al., 2005). Embora não haja
indicadores nítidos associando o HTLV-2 a manifestações clínicas bem definidas, existem
evidências que sugerem a sua associação a um quadro clínico semelhante àquele da
PET/MAH (Hjelle et al., 1992; Black et al., 1996; Murphy et al., 1997).
1.4.1
Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (LLcTA)
A Leucemia/Linfoma das Células T do Adulto é uma neoplasia dos linfócitos
T, relacionada à infecção pelo HTLV-1. É geralmente fatal e não responde à quimioterapia
(Bittencourt e Farré, 2008). Foi primeiramente descrita no Japão por Uchiyama et al. (1977)
e, a partir de então, passou a ser relatada em outras partes do mundo. A LLcTA ocorre
geralmente na idade adulta, pelo menos 20 a 30 anos após a infecção, sendo que homens e
mulheres são igualmente afetados. Indivíduos infectados na infância têm maior risco de
desenvolver LLcTA e alguns pacientes manifestam a fase pré-LLcTA, geralmente
assintomática (Farias et al., 1997; Galvão-Castro et al., 1997; Catalan-Soares et al., 2001).
28
O papel etiológico da HTLV-1 na LLcTA foi confirmado com a
demonstração da integração monoclonal do DNA proviral ao genoma das células neoplásicas
(Shimoyama et al., 1991; Levine et al., 1994; Yamaguchi, 1994; Gonçalves et al., 2003). Dos
15 a 25 milhões de indivíduos infectados no mundo todo, aproximadamente 3% a 5%
desenvolvem LLcTA , porém os cofatores responsáveis permanecem desconhecidos
(Takatsuki et al., 1985; Shimoyama et al., 1986).
Os principais sintomas e sinais da LLcTA são desconforto abdominal,
diarréia, cólica, ascite, tosse e episódios de infecções repetidas. Os sinais clínicos mais
encontrados ao exame físico são linfadenopatia, hepatomegalia, esplenomegalia e lesões de
pele. A hipercalcemia é complicação freqüente e aparece em 28% dos pacientes na ocasião do
diagnóstico e em 50% na evolução clínica, acompanhada de lesões osteolíticas, agravando
assim o quadro clínico inicial da doença (Kiyokawa et al., 1987; Takatsuki et al., 1992).
As formas clínicas da LLcTA caracterizam-se em quatro subtipos: agudo,
linfoma, crônico e smoldering (latente) (Bittencourt e Farré, 2008). Além destes subtipos,
reconhece-se um estágio clínico limítrofe entre indivíduos assintomáticos e com LLcTA, que
é denominado como fase pré-LLcTA, que caracteriza-se pela monoclonalidade da inserção
proviral do HTLV-1 no linfócito T CD4+ (Shimoyama et al.,1991; Tachibana et al., 1992).
Outra forma clinica, a tumoral primária de pele, com características
diferentes, foi sugerida recentemente. As formas aguda, linfomatosa e tumoral primária de
pele são as de pior prognóstico (Bittencourt e Farré, 2008).
O LLcTA dos tipos aguda e linfoma são as formas clínicas mais agressivas e
o paciente apresenta-se com debilidade do estado geral, sinais de síndrome tumoral,
caracterizada por linfoadenomegalia, presença de lesões de pele, lesões ósseas, lesões
viscerais múltiplas ou infiltração pulmonar (Ministério da Saúde, 2004). O tempo de
sobrevida para os subtipos agressivos varia de semanas a mais de um ano. Complicações
pulmonares, incluindo pneumonia por Pneumocytis carinii, hipercalcemia, herpes zoster
disseminado, meningite criptococócica e infecção por citomegalovírus, são as causas mais
freqüentes de morte (Takatsuki et al., 1992).
29
1.4.2
Paraparesia
Espástica
Tropical/Mielopatia
Associada
ao
HTLV-1
(PET/MAH)
A Paraparesia Espástica Tropical ou Mielopatia Associada ao HTLV-1 é uma
doença desmielinizante crônica progressiva que afeta a medula espinhal e a substância branca
do cérebro, determinando o aparecimento de uma síndrome clínica grave em decorrência das
limitações motoras que acometem os membros inferiores, somadas à disfunção autonômica
associada. O quadro clínico inicia-se e evolui de modo insidioso, sendo muitas vezes
impossível estabelecer quando surgiram os primeiros sintomas (Bhigiee et al.,1991; Ribas &
Melo, 2002).
Os principais sinais e sintomas de apresentação da mielopatia são distúrbios
da marcha, a fraqueza e o enrijecimento dos membros inferiores. As primeiras manifestações
da doença ocorrem na quarta década de vida e observa-se relação mulher/homem de 2:1
(Ribas & Melo, 2002). O período de incubação varia de paciente para paciente e observou-se
ser menor nos casos em que o vírus foi adquirido pela via transfusional (Bucher et al., 1990;
Buisson et al., 1990).
Mundialmente, a associação entre HTLV-1 e PET/MAH tem sido
demonstrada no sudoeste do Japão, no oeste da Índia, na África, na Europa e nas Américas do
Norte e do Sul (Mongtomery, 1993; Switzer et al., 1995; Hall et al., 1996; Mueller et al.,
1996). A transmissão do HTLV-1 através da transfusão sanguínea parece estar relacionada a
um maior risco de desenvolvimento de PET/MAH (Macedo et al., 2004).
No Brasil, vários estudos demonstraram ser a PET/MAH endêmica no país,
com casos relatados nas regiões Nordeste, Sudeste e Sul (Castro-Costa et al., 1994; Haussen
et al., 1995; Menna-Barreto et al., 1995; Coral et al., 1998; Oliveira et al., 1998). Grzesiuk e
Martins (1999), relataram os dois primeiros casos de PET/MAH na cidade de Cuiabá, capital
de Mato Grosso.
Objetivando determinar, por meio da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (ANA) em células epidermóides humanas (HEp-2), a prevalência de autoanticorpos contra antígenos celulares em pacientes infectados pelos HTLV-1 e HTLV-2 na
cidade de Belém, Pará, Bichara (2009), observou que, em 23 indivíduos infectados pelo
HTLV-1 (76,7%), 36,7% mostrava doença compatível com PET/MAH, e a presença de ANA
não revelando diferença significativa entre sintomáticos e assintomáticos.
30
1.4.3
Manifestações Reumáticas Associadas ao HTLV-1
Doenças reumáticas auto-imunes são síndromes clínicas em que o dano
tissular acontece a partir de uma resposta do sistema imunológico a auto-antígenos (Davidson
e Diamond, 2001). Genericamente, tais doenças podem ser entendidas como o resultado da
interação entre predisposição genética e fatores ambientais (Krause et al., 1996; Davidson e
Diamond, 2001).
O HTLV-1 vem sendo implicado a uma série de doenças de outras condições
inflamatórias, como artrite reumatóide e síndrome de Sjögren (Cruz et al.,2005).
Um primeiro estudo desenvolvido por Taniguchi et al. (1988), relatou a
associação entre HTLV-1 e artrite, em uma mulher de 79 anos com LLcTA. A partir de então,
novos estudos demonstraram a existência dessa associação em outros pacientes infectados
com HTLV-1 (Sato et al., 1991; Eguchi et al., 1996; Motokawa et al., 1996; Nishioka et al.,
1996; McCallun et al., 1997).
No único estudo realizado no Brasil sobre a prevalência de infecção pelo
HTLV-1 em pacientes com doenças reumáticas, Lonzetti et al. (1999) observaram sorologia
positiva para HTLV-1/2 em 5/69 pacientes com artrite reumatóide (7,0%), enquanto a
positividade observada no grupo controle de doadores de sangue foi de 1,3%.
A síndrome de Sjögren é uma doença auto-imune, caracterizada pela
infiltração por linfócitos T das glândulas salivares e lacrimais, causando a destruição de sua
estrutura ductal e secura de mucosas oral e conjuntival. Eventualmente podem ocorrer outros
sintomas inflamatórios sistêmicos como pneumonite, vasculite e comprometimento do
sistema nervoso central (Moutsopoulos et al., 1980).
A associação entre HTLV-1 e a síndrome de Sjögren foi descrita por Vernant
et al. (1988), a partir de cinco pacientes das Índias Ocidentais com PET/MAH e alveolite
linfocítica, que preenchiam critérios diagnósticos para a exocrinopatia. Outros estudos
demonstraram uma alta prevalência de anticorpos contra HTLV-1 em pacientes com essa
síndrome (Vernan et al., 1988; Eguchi et al., 1992; Mariette et al., 1995; Vogetseder, 1995).
1.5
RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO PELO HTLV-1
A resposta imune ao HTLV-1 difere da resposta observada para outras
infecções crônicas causadas por vírus. Os mecanismos naturais de controles baseados na
produção de interferons (IFN) do tipo 1 (α e β) e na lise mediada pelo complemento não são
suficientes para controlar a infecção pelo HTLV-1 (Santos, 2005).
31
Na interação vírus-hospedeiro dois aspectos são atualmente reconhecidos
como importantes para o desenvolvimento da TSP/HAM: a primeira é a eficiência da resposta
imune celular e o segundo é a taxa de expressão espontânea do antígeno viral, ambos
justificados pelas numerosas alterações imunológicas, mediadas principalmente pela
expressão de Tax, observadas tanto no sangue periférico quanto no líquor dos pacientes com
TSP/HAM (Santos et al., 2009).
A propagação do vírus no indivíduo infectado ocorre principalmente através
de duas vias: 1) por sinapses virológicas, onde acontece à transferência do material viral de
uma célula infectada para a célula não infectada que se encontra em contato, sem a produção
de partículas virais e 2) proliferação clonal dos linfócitos infectados, onde produtos dos genes
virais estimulam a divisão da célula hospedeira (Bangham et al., 2003). Estas duas vias visam
aumentar o número de células infectadas.
O HTLV-1 tem sido descrito como capaz de infectar, tanto in vitro como in
vivo, um grande número de tipos celulares. Todavia os linfócitos T CD4+, e numa menor
extensão os linfócitos T CD8+, são considerados como os principais alvos do HTLV-1
(Richardson et al., 1990; Nagai et al., 2001). Embora seja latente na maioria das células T, e
desta forma indetectável pelo sistema imune do hospedeiro, a infecção produtiva pelo HTLV
induz a ativação de linfócitos os quais respondem através de mecanismos múltiplos da
resposta imune celular e humoral (Jones et al., 2008).
As citocinas têm um papel central na regulação da resposta imune contra o
HTLV-1 (Mendez et al., 1997) e a principal estratégia de defesa montada pelo sistema
imunológico do hospedeiro, visando controlar a replicação do HTLV e a proliferação de
células infectadas, é mediada pelos linfócitos T CD8+ (Bangham, 2000; Bangham & Osame,
2005).
A infecção pelo HTLV-1 induz ativação e intensa proliferação celular dos
linfócitos T infectados. Esse fenômeno relaciona-se principalmente com a função do gene Tax
do vírus que tem a propriedade de transativar os genes da interleucina-2 (IL-2), e do receptor
da IL-2. Essa proliferação anômala de células T pode levar ao aparecimento da LLcTA. A
proliferação indiscriminada de células pode provocar também a expansão de células T autoreativas e secreção acentuada de citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral
(TNF-α). Essas anormalidades podem associar-se com lesão tecidual cutânea e neurológica
(Barmak et al., 2003). Assim, vários estudos têm identificado a proteína regulatória Tax,
como o principal alvo da resposta imune contra o HTLV, por ser o antígeno reconhecido com
melhor eficiência pelos linfócitos T citotóxicos (Jacobson et al., 1990; Kannagi et al., 1992;
32
Parker et al., 1992; Goon et al., 2004) e o gene HBZ, recentemente descrito, que produz dois
transcritos, sendo que um deles é fruto de splicing alternativo (HBZ-SI ou sHBZ), detectado
mais frequentemente nas células infectadas de pacientes com ATL e TSP/HAM e tem um
papel mais importante na proliferação celular (Murata et al., 2006).
Existem, ainda, evidências de que as células Natural Killer (NK)
desempenham mecanismos efetores importantes no controle da infecção pelo HTLV-1 e na
prevenção do processo inflamatório PET/MAH (Fujihara et al., 1991; Yu et al., 1991).
O HTLV-1 infecta, principalmente, as células T CD4+, que são os
reguladores centrais da resposta imune adquirida, desregulando o sistema imune do
hospedeiro (Satou & Matsuoka, 2010). Para estabelecer a infecção persistente, o HTLV-1
desregula as células T CD4, algumas vezes levando à LLcTA (Takatsuki, 2005) ou à doenças
crônicas inflamatórias como PET/MAH, uveítes, artrites e alveolites (Mochizuki et al., 1992;
Nishioka et al., 1996; Osame et al., 1986; Sugimoto et al., 1987).
A resposta imune humoral contra o HTLV é comumente observada, sendo as
proteínas virais codificadas por genes estruturais e reguladores os principais alvos de
anticorpos específicos ao vírus, os quais são ferramentas fundamentais para o diagnóstico
sorológico da infecção pelo HTLV (Ministério da Saúde, 2004).
1.6
APOPTOSE
Apesar de diversos componentes apoptóticos terem sido, explicitamente,
descritos muitos anos antes, o termo “apoptose” foi utilizado pela primeira vez por Kerr,
Wyllie e Currie em 1972, para designar uma forma distinta de morte celular que ocorre de
maneira fisiológica (Kerr et al., 1972).
A apoptose é um tipo de morte celular programada que ocorre durante várias
situações fisiológicas e patológicas, constituindo um mecanismo de remoção de células
lesadas e, de renovação celular e tecidual (Anazeti e Melo, 2007). Caracteriza-se por diversas
alterações morfológicas e bioquímicas das células e é de crucial importância para o
desenvolvimento embrionário, maturação do sistema imune, defesa contra infecções virais e
eliminação de tumores (Wyllie et al., 1980; Hale et al., 1996; Green, 2003).
É um processo de morte ativa das células íntegras e pode ser comparada
metaforicamente a um “suicídio celular”, sem que haja o comprometimento das células
vizinhas. As células que iniciam esse processo apresentam várias alterações típicas, tais como,
a condensação da cromatina, degradação internucleossômica do DNA, destruição do
citosqueleto, alterações na assimetria de fosfolipídeos de membrana plasmática com
33
exposição da fosfatidilserina, diminuição do volume citoplasmático, entre outras. As células
que iniciam esse processo diminuem seu volume citoplasmático, mantendo suas organelas
intactas. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana celular forma
vesículas, denominadas corpúsculos apoptóticos, os quais contêm fragmentos do núcleo e
algumas organelas. Estes corpúsculos ou corpos apoptóticos são rapidamente reconhecidos e
englobados por fagócitos e/ou células adjacentes, e degradados pelos lisossomos (Morgan,
2002; Elmore, 2007).
Diferentemente da apoptose, a necrose é um tipo de morte celular passiva, na
qual há o aumento do volume citoplasmático da célula e a perda da integridade da membrana
plasmática. Consequentemente, ocorre a liberação dos constituintes intracelulares para o meio
extracelular, o que estimula a resposta inflamatória e amplia a lesão tecidual (Trump et al.,
1997) (Figura 5).
Figura 5: Representação esquemática das diferentes alterações morfológicas nos processos de
morte
celular
necrose
e
apoptose
(http://2.bp.blogspot.com/_klKFmeWGnUQ/TG7RnhKP4kI/AAAAAAAAAGU/16s5ayWE6
Lw/s400/droppedImage_4.jpg).
34
A desregulação dos mecanismos de apoptose tem implicações na patogênese
de várias doenças humanas. Algumas dessas são causadas por defeitos em genes de apoptose.
A identificação de mutações nesses genes pode contribuir para o melhor entendimento dos
mecanismos fisiológicos dos quais as moléculas envolvidas participam. A partir do
conhecimento da natureza molecular dos defeitos apoptóticos, pode-se desenvolver
marcadores para diagnóstico de doenças e novas formas de tratamento (Köhler, 2005).
1.7
O RECEPTOR APOPTÓTICO FAS E SEU LIGANTE FASL
A purificação e clonagem do gene APO-1, levou à conclusão que este e FAS
eram idênticos, tratando-se de um único gene e, consequentemente, da mesma proteína (Oehm
et al., 1992).
Suda et al (1993) e Suda & Nagata (1994) identificaram uma molécula que
desencadeia o processo de apoptose ao se ligar ao receptor de membrana celular FAS,
codificado pelo gene FAS, sendo denominada ligante de FAS (FASL).
O receptor FAS conhecido, também, como APO-1 ou CD95, é uma proteína
transmembrânica do tipo I, composta por 335 aminoácidos e peso molecular 35kDa,
pertencente à superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) que, ao interagir com seu
ligante FASL (uma proteína da membrana do tipo II, constituída por 281 aminoácidos e
pertencente à superfamília do TNF), desencadeia a apoptose (morte celular programada),
constituindo-se portanto nos principais genes controladores da morte celular no sistema imune
(Takahashi et al., 1994; Müaller et al., 2001). Trata-se de uma proteína expressa na superfície
de diversos tipos celulares, como linfócitos, fibroblastos, células epiteliais e algumas células
endoteliais, sendo responsável por desencadear o processo de morte celular nestas células
(Leithauser et al., 1993).
Assim como todos os membros da família que a compõe, a proteína FAZ
possui um domínio extracelular contendo três repetições ricas em cisteína, um domínio
transmembrana e um domínio intracelular citoplasmático, onde se encontra o domínio de
morte (Figura 6). O domínio amino-terminal extracelular é o mais similar entre os membros
desta família, com 24 a 30% da sequência de aminoácidos conservada, mas particularmente
na região rica em cisteína (Smith et al., 1994). Por outro lado, o domínio citoplasmático
intracelular apresenta pequena homologia entre os membros, com exceção de alguns casos, a
exemplo de FAS e TNFR1 (Hill & Lunec, 1996).
35
Figura 6: Representação esquemática da estrutura protéica monomérica do receptor FAS.
CRD: Domínio rico em cisteína; TM: domínio transmembrana (Adaptado de Feig et al.,
2007).
O ligante de FAS, também conhecido como FASL, CD95L, CD178, é uma
proteína transmembrana tipo II, de 40 kDa, pertencente à superfamília de proteínas TNF
(Suda et al., 1993; Takahashi et al., 1994; Nagata & Golstein, 1995). É uma proteína
trimérica, composta por uma região N terminal, encontrada no citoplasma, e uma região C
terminal que se entende para o espaço extracelular (Figura 7). A região extracelular de
aproximadamente 15 aminoácidos é bastante conservada (20-25%) entre os membros da
mesma família, enquanto que o comprimento e a sequência do segmento citoplasmático
diferem significativamente (Nagata, 1997).
Figura 7: Representação esquemática da subunidade estrutural da proteína trimérica FASL
(Adaptado de Sun et al., 2006).
Embora seja latente na maioria das células T, e desta forma indetectável pelo
sistema imune do hospedeiro, a infecção produtiva pelo HTLV induz a ativação de linfócitos,
os quais respondem através de mecanismos múltiplos da resposta imune celular e humoral.
Vários estudos têm sido realizados no sentido de compreender o papel do sistema
imunológico no processo de cronicidade diferenciada da infecção pelo HTLV. Esses estudos
36
buscam correlacionar fatores ligados aos mecanismos imunopatológicos/imunoprotetores com
o desenvolvimento ou manutenção das diferentes formas clínicas da infecção (Kubota et al.,
2000). Até o presente momento, são poucas as informações acerca das características
imunogenéticas do paciente portador do HTLV que possam justificar a natureza desses fatores
e os mecanismos pelos quais cerca de apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem
PET/MAH ou LLcTA, havendo portanto a necessidade de novos estudos que visem
investigar, por exemplo, a influência dos polimorfismos nos genes FAS e FASL em indivíduos
portadores da infecção pelo Vírus linfotrópicos de células T humanas (HTLV).
1.7.1
Polimorfismos Genéticos de FAS
Atualmente, considera-se que, FAS e seu ligante FASL, desempenham
importante papel no desenvolvimento de doenças autoimunes e, estudos recentes têm sido
desenvolvidos focalizando a apoptose mediada por essas proteínas, como a causa de diversas
desordens autoimunes tais como a artrite reumatóide. Assim, diversos polimorfismos nos
genes FAS e FASL têm sido descritos e associados a diversas patologias (Huang et al., 1997;
Huang & Manolios, 2000; Bolstad et al., 2000; Pinti et al., 2002; Nasi et al., 2005; Crew et
al., 2007).
O gene humano FAS está localizado no cromossomo10 na posição 10q24.1, é
composto por nove éxons e oito íntrons e codifica uma proteína com 334 aminoácidos (Huang
et al., 1997). Dois polimorfismos têm sido identificados na região promotora de FAS: um na
posição -1377, em que há a substituição do nucleotídeo G por A (FAS-1377G>A, rs2234767)
e, outro, na posição -670, com substituição da base nucleotídica A por G (FAS-670A>G,
rs1800682) (Huang et al., 1997).
As variações nas sequências da região promotora de FAS podem influenciar
na expressão desse gene, desregulando a sinalização da morte celular programada (apoptose),
contribuindo, assim, para um possível processo de carcinogênese (Sibley et al., 2003).
1.7.2
Polimorfismos Genéticos de FASL
O gene FASL, está localizado na posição 1q23, mede, aproximadamente, 8
kb, e é formado por uma região promotora, quatro éxons e três íntrons e, codifica 281
aminoácidos (Takahashi et al., 1994). Três polimorfismos têm sido descritos nesse gene: um
na posição -844 da região promotora, com substituição de citosina (C) por timina (T)
(FASLG-844C>T, rs763110) (Wu et al., 2003); outro, na posição -124, no segundo íntron,
resultando na substituição de A por G (FASLGINV2nt-124A>G, rs5030772) (Bolstad et al.,
37
2000) e; um terceiro, que consiste na deleção de T na posição 169 do terceiro íntron
(FASLIVS3nt169T>∆T) (Nasi et al., 2005).
38
1.8
OBJETIVOS
1.8.1
Objetivo Geral: O presente estudo visa avaliar a associação dos polimorfismos
nos genes FAS e FASL com a infecção pelo Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV)
e sua possível relação com a ocorrência de infecção sintomática.
1.8.2
Objetivos Específicos
i)
Determinar as frequências dos polimorfismos FAS-670A>G, FAS-1377G>A,
FASLGINV2nt-124A>G, FASLIVS3nt169T>∆T, FASLG-844C>T em indivíduos portadores
do HTLV, assim como naqueles soronegativos para a infecção;
ii)
Investigar a existência de associação entre os polimorfismos nos genes FAS e
FASL com os níveis de linfócitos T CD4+ e T CD8+ nos indivíduos portadores da infecção
pelo HTLV, e comparar com os valores obtidos em um grupo controle de indivíduos
soronegativos;
iii)
FASL com os níveis de carga proviral nos pacientes portadores da infecção pelo HTLV;
iv)
FASL e a ocorrência de infecção sintomática pelo HTLV.
39
2.
MATERIAL E MÉTODOS
2.1
COLETA E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
2.1.1
Indivíduos soropositivos para o HTLV
Este grupo foi composto por indivíduos de ambos os sexos, com idade acima
de 18 anos, provenientes do Ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical da Universidade
Federal do Pará (NMT - UFPA) que apresentaram sorologia positiva para a infecção pelo
HTLV. As amostras de sangue foram obtidas no período de agosto de 2009 a agosto de 2011
em um sistema de colheita a vácuo, em tubos de 5 mL contendo EDTA como anticoagulante,
para a obtenção de plasma e massa celular e, posteriormente, enviadas ao Laboratório de
Virologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Pará para a
realização de testes de contagem de linfócitos T CD4+, T CD8+ e de carga proviral bem como
para a caracterização dos polimorfismos genéticos. Depois de processadas, alíquotas de
plasma e de leucócitos, foram armazenadas à -20ºC até o momento do uso.
O estudo foi do tipo transversal, tendo como critérios de inclusão, a seleção
de indivíduos com idade igual ou superior a 18 anos, que apresentaram sorologia e PCR
positivas para o HTLV, assintomáticos e sintomáticos para manifestações clínicas
reumatológicas
(artrite,
tenossinovite,
Artrite
Reumatóide,
Síndrome
de
Sjögren,
Fibromialgia, Miopatias Inflamatórias) em acompanhamento no ambulatório do NMT-UFPA.
Foram excluídos da pesquisa indivíduos que não preencheram os requisitos estipulados acima
e aqueles co-infectados pelos vírus da hepatite B, hepatite C e HIV-1.
2.1.2
Indivíduos soronegativos para o HTLV
No presente estudo, foram utilizados como grupo controle, para efeito de
comparação, amostras de sangue de indivíduos soronegativos para a infecção, previamente
coletadas e armazenadas a -20oC no Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Pará.
Essas amostras foram coletadas em um sistema de colheita a vácuo em tubos
de 5 mL contendo EDTA como anticoagulante, e encaminhadas ao Laboratório de Virologia
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, onde foram processadas
para a separação do plasma e da massa celular, sendo em seguida, estocadas a -20ºC para
posterior confirmação da infecção por meio de análise molecular e avaliadas quanto aos níveis
de linfócitos T CD4+ e TCD8+, além da caracterização do polimorfismo genético.
40
Foram incluídos na pesquisa amostras de indivíduos maiores de 18 anos de
idade, soronegativos para o HTLV. Foram excluídos da pesquisa indivíduos que apresentaram
resultado positivo ou inconclusivo na sorologia para HTLV.
2.1.3
Aspectos éticos
Após a explicação sobre os objetivos do projeto, os indivíduos que
concordaram em participar do estudo, assinaram um Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) (ANEXO 1), sendo posteriormente aplicado, aos mesmos, um
questionário clínico-epidemiológico (ANEXO 2) entregues no momento da coleta.
O presente trabalho faz parte do projeto “Manifestações reumatológicas em
pacientes infectados com o Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV) na região
amazônica”, coordenado pelo médico reumatologista, doutor Cezar Augusto Muniz Caldas
(pesquisador responsável) do Núcleo de Medicina Tropical (NMT), submetido e aprovado
pelo Comitê de Ética em pesquisa com seres humanos (Parecer de aprovação datada em 09 de
setembro de 2009 – Protocolo n.028/2009 – CEP-NMT) (ANEXO 3), em parceria com o
Laboratório de Virologia da Universidade federal do Pará, seguindo as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (Resolução 196 do Conselho
Nacional de Saúde).
2.2
QUANTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS T CD4+ e CD8+
As amostras de sangue dos pacientes soropositivos para o HTLV foram
processadas dentro de 4 horas após a coleta e a contagem de linfócitos T foi determinada por
Citometria de Fluxo (FacsCount, Becton & Dickinson, USA) usando o kit de
imunomonitoramento da FacsCountTM Reagents de acordo com o protocolo padrão
recomendado pelo fabricante (Becton Dickinson, USA).
2.3
CARGA PROVIRAL
Para a realização da quantificação da carga proviral absoluta foi feita,
inicialmente, uma quantificação relativa, baseada em uma proporção que derivou da relação
quantitativa entre alvo e o controle endógeno, como descrito por Tamegão-Lopes et al.
(2006).
41
2.4
ANÁLISE MOLECULAR
2.4.1
Extração do DNA
A Extração de DNA total a partir de leucócitos do sangue periférico foi
realizada no Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará, usando-se o kit GE Healthcare.
Na etapa de lise das células sanguíneas, adicionou-se 20µL de proteinase K
em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL. Acrescentou-se até 300µL de sangue (total ou
frações celulares) e adicionou-se 400µL de Lysis buffer type 10 no tubo. Submetendo-se a
mistura ao vortex por 15 segundos. O tubo foi incubado à temperatura ambiente por 10
minutos, “vortexando”, intermitentemente, para ajudar na lise (ao final, a cor da reação poderá
mudar de vermelho para um castanho escuro). Posteriormente, centrifugou-se brevemente
para trazer a amostra para o fundo do tubo.
Na etapa de número 2 (Genomic DNA binding), montou-se uma mini coluna
no tubo de coleta fornecido. Usando-se as colunas individuais para cada amostra.
Posteriormente, colocou-se o lisado completo no centro da coluna, usando uma pipeta.
Tampou-se a coluna e centrifugou-a por 1 minuto a 14000rpm (11000 × g). Após a
centrifugação, foi removido o tubo de coleta contendo o material coletado, cuidadosamente,
sem tocar na base da coluna, descartando o material coletado e recolocando a coluna de volta
para dentro do tubo de coleta.
Seguiu-se, então para a etapa de lavagem, na qual adicionou-se 500 µL de
Lysis buffer type 10 na coluna, centrifugando-a por 1 minuto a 14000 rpm (11000 × g). Essa
etapa assegura a lise celular completa e desnatura qualquer proteína residual. Posteriormente,
descartou-se o material coletado. Adicionou-se 500 µL de Lysis buffer type 6 na coluna,
centrifuguando-a por 3 minutos a 14000 rpm (11000 × g), novamente descartando o tubo de
coleta (Collection tube) e o material coletado.
Finalmente, na etapa de eluição, transferiu-se a coluna de purificação para
um tubo de microcentrífuga, livre de DNase (fornecida pelo usuário) e adicionou-se 200µL de
Ellution buffer type 5, pré-aquecido a 70°C, diretamente no centro da coluna. Em seguida, a
coluna foi submetida à incubação por 1 minuto à temperatura ambiente (não mais que 1
minuto, pois pode comprometer a qualidade do DNA), com posterior centrifugação por 1
minuto a 14000rpm (11000 × g) para recuperar o DNA genômico.
A amostra de DNA genômico obtida foi estocada à -20°C para posterior
manipulação.
42
2.4.2
PCR em tempo real
No presente trabalho, a tipagem das amostras de HTLV positivas foi feita
através da PCR em tempo real, utilizando-se o sistema TaqMan (Applied Biosystems, Foster
City, CA) de três sequências alvo: o gene da albumina, como controle endógeno e as regiões
não homólogas do gene pol do HTLV-1 e do HTLV-2, como descrito por Tamegão-Lopes et
al. (2006). As sequências de primers e sondas utilizadas na técnica de PCR em tempo real
estão descritas nos quadro 1 e 2.
Quadro 1 – Sequências nucleotidicas de primers utilizados na reação de PCR.
PRIMER
SEQUÊNCIAS 5’ – 3’
HTLV-1 F
GAACGCTCTAATGGCATTCTTAAAACC
HTLV-1 R
GTGGTTGATTGTCCATAGGGCTAT
HTLV-2 F
CAACCCCACCAGCTCAGG
HTLV-2 R
GGGAAGGTTAGGACAGTCTAGTAGATA
Albumina F
GCTCAACTCCCTATTGCTATCACA
Albumina R
GGGCATGACAGGTTTTGCAATATTA
Quadro 2 – Sequências nucleotidicas de sondas utilizadas na reação de PCR.
SONDAS
SEQUÊNCIAS 5’ – 3’
HTLV-1
FAM-ACAAACCCGACCTACCC-NFQ
HTLV-2
FAM-TCGAGAGAACCAATGGTATAAT-NFQ
Albumina
FAM-TTGTGGGCTGTAATCAT-NFQ
As reações da PCR foram preparadas utilizando o conjunto de reagentes
TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), contendo
nucleotídeos, tampão, UNG, AmpliTaq®, referência passiva (ROX), de acordo com
instruções do fabricante. O protocolo de reação utilizou 15µL de Master Mix, 10,5µL de água,
1,5µL de Assay -by-Design (conjunto de primer e sonda), 3µL de DNA, sendo o volume final
de 30μL. Foi utilizada a plataforma Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA),
43
com o seguinte protocolo de ciclagem: um ciclo de 50°C durante 2 minutos; um ciclo de 95°C
durante 10 minutos; 50 ciclos de 90°C durante 50 segundos e 60°C durante 1 minuto.
2.4.3
Investigação molecular das formas alélicas dos genes FAS e FASL
2.4.3.1
Polimorfismo FAS-670A>G (rs1800682)
Os alelos A e G na posição -670 do gene FAS foram identificados através da
reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR) seguida de digestão enzimática com a
endonuclease de restrição MvaI, uma vez que a troca de A para G cria um sírio de restrição
nesta posição reconhecido pela enzima (Huang et al., 1999).
A PCR foi realizada em um volume de 50L contendo 100 ng de DNA
extraído, 200 mM de cada dNTP, 200 nmol de cada iniciador, KCl2 50 mM, MgCl2 1,5 mM,
Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1 U de Taq DNA polimerase. O par de iniciadores envolvidos nesta
reação foi (-670FasDir) 5’-CTACCTAA GAGCTATCTACCGTTC-3’ e (-670FasRev) 5’GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3’. Na reação de amplificação, após a desnaturação inicial
a 94ºC por 6 minutos, foram efetuados 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 62ºC e 1
minuto a 72ºC. Os ciclos foram seguidos por extensão final de 10 minutos a 72ºC. O produto
amplificado (233 pb) foi submetido à incubação com endonuclease de restrição MvaI, a qual
cliva o alelo G em 189 e 44 pb, já o alelo A permanece com 233 pb e, foi realizada,
misturando-se 10,0 µL do produto amplificado, 16,9 µL de H2O, 3,0 µL de tampão E
(Promega, Madison WI, USA) e 0,1 µL da enzima de restrição MvaI, com posterior incubação
à 37ºC por 4 horas.
2.4.3.2
Polimorfismo FAS-1377G>A (rs2234767)
A identificação do polimorfismo FAS-1377G>A foi feita utilizando-se o
método de PCR-RFLP, previamente descrito por Zhang et al., 2004. O par de iniciadores
envolvidos nesta reação foram 5’-TGTGTGCACAAGGCTGGCGC-3’ (-1377FasF) e 5’TGCATCTGTCACTGCACTTACCACCA – 3’ (-1377FasR), resultando em um produto
amplificado de 122 pb, o qual foi submetido à RFLP com a enzima BstUI, resultando em dois
fragmentos com tamanhos de 104 e 18 pb (Zhang et al., 2006).
A PCR foi realizada em um volume de 50 L contendo 100 ng de DNA
extraído, 200 mM de cada dNTP, 200 nmol de cada iniciador, KCl2 50 mM, MgCl2 1,5 mM,
Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1 U de Taq DNA polimerase. Na reação de amplificação, após a
desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos, foram efetuados 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC,
44
45 segundos a 62ºC e 45 segundos a 72ºC. Os ciclos foram seguidos por extensão final de 7
minutos a 72ºC. O produto amplificado (122 pb) foi submetido à incubação com
endonuclease de restrição BstUI, a qual foi realizada, misturando-se 10,0 µL do produto
amplificado, 16,0 µL de H2O, 2,0 µL de tampão E (Promega, Madison WI, USA) e 1,0 µL da
enzima de restrição BstUI, com posterior incubação à 60ºC por 2 horas.
2.4.3.3
Polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G (rs5030772)
A identificação do polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G foi efetuada por
meio do método de ACRS (amplification-created restriction site – sítio de restrição criado
por amplificação). Este método é baseado na técnica de PCR, e através dele é possível avaliar
polimorfismos por meio de um iniciador desenhado com a alteração de uma base, de modo
que crie um sítio de restrição artificial no alelo selvagem ou mutante (Eiken et al., 1991).
A reação de amplificação de 239 pb do gene FASL foi realizada em um
volume de 50 L contendo 100 ng de DNA extraído, 200 mM de cada dNTP, 5 pmol de cada
iniciador, KCl2 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1 U de Taq DNA
polimerase. O par de iniciadores envolvidos nesta reação foram (-124Dir) 5’GCAGTTCAGACCTACATGATTAGGAT-3’
e
(-124Rev)
5’-CCAATTCTCACC
TGTACCTTC-3’, o qual contém uma alteração (negrito e sublinhado) que cria um sítio de
restrição para a enzima FokI na presença do alelo G. O produto amplificado foi então
submetido à incubação com endonuclease de restrição FokI, a qual cliva o alelo G em 210 e
29 pb, sendo que o alelo A não é digerido e permanece com 239 pb (Nasi et al., 2005).
Na reação de amplificação, após a desnaturação inicial a 94ºC por 6 minutos,
foram efetuados 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 62ºC e 1 minuto a 72ºC. Os
ciclos foram seguidos por extensão final de 10 minutos a 72ºC. O produto amplificado (122
pb) foi submetido à incubação com endonuclease de restrição FokI que, foi realizada,
(Promega, Madison WI, USA) e 0,1 µL da enzima de restrição FokI, com posterior incubação
à 37ºC por 3 horas.
2.4.3.4
Polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T
Assim como para a identificação do polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T, a
determinação da deleção de T na posição 169 do terceiro íntron do gene FasL foi efetuada por
meio de ACRS.
45
A reação de PCR foi realizada em um volume de 50 L contendo 100 ng de
DNA extraído, 200 Mm de cada dNTP, 5 pmol de cada iniciador, KCl2 50 mM, MgCl2 1,5
mM, Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1 U de Taq DNA polimerase. O par de iniciadores envolvidos
nesta reação foi (169Dir) 5’-AGGAAAGG ACTTCAAAGCCTA-3’ e (169Rev) 5’TTGATGCATCACAGAATTTCGTC -3’. O iniciador 169Rev contém uma alteração (negrito
e sublinhado) responsável pela criação de um sítio de restrição para a enzima HincII na
presença de T na posição 169. O produto amplificado foi submetido então à incubação com a
endonuclease de restrição HincII, a qual cliva o alelo T em 162 e 23 pb, e no caso da deleção
de T (alelo delT), não há digestão e o fragmento permanece em 185 pb (Nasi et al., 2005).
Na reação de amplificação, após a desnaturação inicial a 94ºC por 6 minutos,
foram efetuados 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC e 30 segundos a 72ºC.
Os ciclos foram seguidos por extensão final de 10 minutos a 72ºC. O produto amplificado
(185 pb) foi submetido à incubação com endonuclease de restrição HincII que, foi realizada,
(Promega, Madison WI, USA) e 0,1 µL da enzima de restrição HincII, com posterior
incubação à 37ºC por 2 horas.
2.4.3.5
Polimorfismo FASLG-844C>T (rs763110)
A identificação do polimorfismo FASLG-844C>T foi feita utilizando-se o
método de PCR-RFLP, previamente descrito por Zhang et al., 2004. O par de iniciadores
envolvidos nesta reação foi 5’-CAATGAAAATGAACACATTG- 3’ (forward) e 5’CCCACTTTAGAAATTAGATC-3’ (reverso), o qual contém uma alteração (negrito e
sublinhado) que cria um sítio de restrição para a enzima DraIII na presença do alelo T,
resultando em um produto amplificado de 85pb. Este produto amplificado foi então
submetido à RFLP com a enzima DraIII, clivando o alelo T em dois fragmentos de 66 e 19 pb
(Zhang et al., 2006).
A reação de PCR foi realizada em um volume de 50 L contendo 100 ng de
DNA extraído, 200 Mm de cada dNTP, 5 pmol de cada iniciador, KCl2 50 mM, MgCl2 1,5
mM, Tris-HCl pH 8,3 10 mM e 1 U de Taq DNA polimerase. Na reação de amplificação,
após a desnaturação inicial a 94ºC por 6 minutos, foram efetuados 35 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 1 minuto a 45ºC e 1 minuto a 72ºC. Os ciclos foram seguidos por extensão final de 7
minutos a 72ºC. O produto amplificado (85 pb) foi submetido à incubação com endonuclease
de restrição DraIII que, foi realizada, misturando-se 10,0 µL do produto amplificado, 16,0 µL
46
de H2O, 2,0 µL de tampão E (Promega, Madison WI, USA) e 1,0µL da enzima de restrição
DraIII, com posterior incubação à 37ºC por 2 horas.
2.4.3.6
Eletroforese
Os produtos da amplificação foram visualizados após eletroforese (100 V/45
minutos) em gel de agarose de 3% a 4%, em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase
1,6 M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), contendo 6 μL
de Syber-Safe (Invitrogen, Oregon, USA), mediante a utilização de transiluminador com fonte
de luz ultravioleta (Figuras 8, 9, 10, 11e 12).
Figura 8 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima MvaI, a partir do fragmento
amplificado de 322 pb da região promotora do gene FAS.
47
Figura 9 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima BstUI,, a partir do fragmento
amplificado de 122 pb da região promotora do gene FAS.
Figura 10 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima FokI, a partir do fragmento
amplificado de 239 pb do segundo íntron do gene FASL.
48
Figura 11 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima HincII, a partir do fragmento
amplificado de 185 pb do terceiro íntron do gene FASL.
Figura 12 - Perfil eletroforético de RFLP, com a enzima DraIII, a partir do fragmento
amplificado de 85 pb na posição -844 da região promotora do gene FASL.
49
2.5
MÉTODOS ESTATÍSTICOS
As análises comparativas das frequências alélicas e genotípicas, entre os
pacientes infectados pelo HTLV foram efetuadas por meio do teste de qui-quadrado (χ2) e
teste G, enquanto que a análise comparativa dos valores dos níveis de linfócitos T CD4+ e
TCD8+ e da carga proviral entre os indivíduos portadores dos diferentes genótipos foi
realizada por meio do teste T de student. A análise intragrupos (sintomáticos x sintomáticos e
assintomáticos x assintomáticos) da associação entre os polimorfismos FAS-670A>G, FAS1377G>A, FASLIVS3nt169T>∆T e FASLG-844C>T e a carga proviral foi feita por meio do
teste Mann-Whitney. A relação dos polimorfismos com a chance de evolução clínica da
infecção pelo HTLV foi analisada através do teste de regressão logística simples. Todos os
testes foram executados utilizando o software BioEstat 5.0, adotando-se o nível de
significância estatística de 5% (p < 0,05) (Ayres et al., 2008).
50
3.
3.1
RESULTADOS
FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS
Foram analisadas amostras de um grupo populacional composto por 321
indivíduos, subdivididos em 86 indivíduos soropositivos para o HTLV, com 39 sintomáticos e
47 assintomáticos, e 235 controles soronegativos, para a investigação dos polimorfismos na
região promotora do gene FAS e no segundo e terceiro íntron do gene FASL.
Nos grupos populacionais analisados, observou-se a existência de todas as
variantes alélicas para quatro (FAS-670A>G, FAS-1377G>A, FASLIVS3nt169T>∆T, FASLG-844C>T) dos cinco polimorfismos analisados. Tanto o grupo de indivíduos infectados
pelo HTLV, quanto o grupo controle soronegativo estão em Equilíbrio de Hardy-Weinberg
em relação às frequências genotípicas dos polimorfismos FAS-1377G>A (p= 0,4662; p=
0,0978, respectivamente), FASLGINV2nt-124A>G (p= 0,7375; p= 0,7434, respectivamente),
FASLIVS3nt169T>∆T (p= 0,3796; p= 0,2838, respectivamente) e FASLG-844C>T (p=
0,2715; p= 0,3474, respectivamente). Em relação às frequências genotípicas do polimorfismo
de FAS-670A>G, somente o grupo controle soronegativo está em Equilíbrio de HardyWeinberg (p= 0,9076). Entre os grupos de indivíduos sintomáticos e assintomáticos,
verificou-se que os assintomáticos estão em Equilíbrio de Hardy-Weinberg em relação às
frequências genotípicas dos cinco polimorfismos FAS-670A>G (p= 0,4946), FAS-1377G>A
(p= 0,7087), FASLGINV2nt-124A>G (p= 0,8815), FASLIVS3nt169T>∆T (p= 0,4726) e
FASLG-844C>T (p= 0,0574), já nos sintomáticos, verificou-se que estão em Equilíbrio de
Hardy-Weinberg em relação às frequências genotípicas apenas de quatro polimorfismos FAS1377G>A (p= 0,1820), FASLGINV2nt-124A>G (p= 0,7357), FASLIVS3nt169T>∆T
(p=0,6070) e - FASLG-844C>T (p= 0,8171).
Quando analisado o polimorfismo FAS-670A>G, a análise comparativa das
frequências genotípicas demonstrou a maior prevalência do genótipo homozigoto GG entre o
grupo de infectados (44,2%), quando comparado com o grupo controle (28,9%), bem como a
maior prevalência do genótipo AG entre os soronegativos (49,4%) em relação aos
soropositivos (29,1%); já o genótipo selvagem AA, apresentou prevalência de 26,7% entre os
indivíduos infectados pelo HTLV e de 21,7% entre os indivíduos do grupo controle. A
análise das frequências alélicas demonstrou a presença dos alelos A e G com uma frequência
de 41% e 59% nos indivíduos infectados pelo HTLV e de 46% e 54% no grupo controle,
respectivamente.
As
diferenças
observadas
apresentaram
valores
estatisticamente
significativos, na analise comparativa das frequências genotípicas (p= 0,0040), porém, em
51
relação à análise comparativa das frequências alélicas, não houve significância estatística (p=
0,5590). Entre os sintomáticos, a prevalência do genótipo GG foi maior (48,7%) quando
comparado aos assintomáticos (40,4%), assim como a maior prevalência do genótipo
selvagem AA entre os sintomáticos (38,5%) em relação aos assintomáticos (17%), já o
genótipo AG, apresentou prevalência maior entre os assintomáticos (42,6%) do que no grupo
de sintomáticos (12,8%). Em se tratando das frequências alélicas, verificou-se a presença dos
alelos A e G com uma frequência de 45% e 55% nos indivíduos sintomáticos e de 38% e 62%
nos indivíduos assintomáticos, respectivamente. As diferenças observadas apresentaram
valores estatisticamente significativos, na analise comparativa das frequências genotípicas (p=
0,0053) e, em relação à análise comparativa das frequências alélicas, não houve significância
estatística (p= 0,4242) (Tabela 1).
52
Tabela 1 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos de FAS e
FASL entre os grupos analisados.
Perfil genético
Populações
HTLV
N (%)
Controle
N (%)
FAS-670A>G
AA
AG
GG
23 (26,7)
25 (29,1)
38 (44,2)
51 (21,7)
11(49,4)
68 (28,9)
*A
*G
0,4128*
0,5872*
0,4638
0,5362
FAS-1377G>A
GG
58 (67,4)
185 (78,7)
GA
24 (27,9)
44 (18,7)
AA
4 (4,7)
6 (2,6)
*G
*A
0,8140
0,1860
0,8809
0,1191
FASLGINV2nt-124A>G
GG
AG
AA
80(93,0)
6 (7,0)
0
198(84,3)
35 (14,9)
2 (1)
*G
*A
0,9651
0,0349
0,9170
0,0830
FASLIVS3nt169T>∆T
TT
T∆T
∆T∆T
68 (79,1)
16 (18,6)
2 (2,3)
177(75,3)
56 (23,8)
2 (0,9)
*T
*∆T
0,8837
0,1163
0,8723
0,1277
FASLG-844C>T
CC
CT
TT
26 (30,2)
47 (54,7)
13 (15,1)
99 (42,1)
112(47,7)
24 (10,2)
G/x2
p
0,0040
0,5590
0,1283
0,2631
0,1059
0,2527
0,4217
0,9759
0,1211
*C
0,5756
0,6596
0,2816
*T
0,4244
0,3404
* A população não está em equilíbrio de Hardy-Weinberg
Pacientes
Sintomáticos
N (%)
Assintomáticos
N (%)
15 (38,5)
5 (12,8)
19 (48,7)
8 (17,0)
20 (42,6)
19 (40,4)
0,4487*
0,5513*
0,3830
0,6170
26 (66,7)
32 (68,1)
10 (25,6)
14 (29,8)
3 (7,7)
1 (2,1)
0,7949
0,2051
0,8298
0,1702
35 (89,7)
4 (10,3)
0
45 (95,7)
2 (4,3)
0
0,9487
0,0513
0,9787
0,0213
30 (76,9)
8 (20,5)
1 (2,6)
38 (80,9)
8 (17,0)
1 (2,1)
0,8718
0,1282
0,8936
0,1064
17 (43,6)
17 (43,6)
5 (12,8)
9 (19,1)
30 (63,8)
8 (17,0)
0,6538
0,3462
0,5106
0,4894
G/x2
p
0,0053
0,4242
0,4768
0,6520
1,0000
0,4467
0,9170
0,7954
0,0484
0,0562
53
Em relação ao polimorfismo FAS-1377G>A, a análise comparativa das
frequências genotípicas demonstrou maior prevalência do genótipo GG no grupo controle
(78,7%) em relação à população paciente de infectados pelo HTLV (67,4%), seguidos do
genótipo GA, com frequências de 18,7% e 27,9% e do genótipo AA, menos prevalente, com
frequências de 2,6% e 4,7% em soronegativos e soropositivos, respectivamente, não
revelando diferenças estatísticas significativas (p= 0,1283). O alelo selvagem G foi
encontrado com maior frequência, tanto no grupo de indivíduos infectados (81%) quanto no
grupo controle (89%), enquanto que o alelo A apresentou frequências de 19% e 12% entre os
portadores de HTLV e o grupo controle, respectivamente, sem diferença significativa (p:
0,2631). A análise comparativa das frequências genotípicas feita entre sintomáticos e
assintomáticos demonstrou maior prevalência do genótipo GG tanto em sintomáticos (66,7%)
quanto em assintomáticos (68,1%), o genótipo GA com frequências de 25,6% e 29,8% e o
genótipo AA com frequências de 7,7% e 2,1% entre sintomáticos e assintomáticos,
respectivamente (Tabela 1).
A análise comparativa das frequências genotípicas do polimorfismo 124FASL apresentou o genótipo GG com frequências de 93% e 84,3%, AG com frequências
de 7% e 14,9% e o genótipo AA, menos prevalente, com 0% e 1% entre pacientes infectados
pelo HTLV e grupo controle, respectivamente; não havendo significância estatística
significativa (p= 0,1059). Entre esses dois grupos observou-se, ainda, que para frequências
dos alelos G (97% e 92%) e A (3% e 8%), respectivamente, não havia significância estatística
(p= 0,2527). Em se tratando de portadores sintomáticos e assintomáticos, constatou-se uma
ocorrência do genótipo GG com frequências de 89,7% e de 95,7%, do genótipo AG com
frequências de 10,3% e 4,3%, não tenho sido observada a ocorrência do genótipo AA em
ambos os grupos. Essa distribuição genotípica não revelou diferença estatística significativa
(p= 1,0000). Quanto à frequência alélica, verificou-se a prevalência do alelo G com 95% e
98% e do alelo A com 5% e 2% entre sintomáticos e assintomáticos, respectivamente, não
havendo diferença estatística significativa (p= 0,4467) (Tabela 1).
Considerando o polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T, observamos os
genótipos TT, T∆T e ∆T∆T com frequências de 79,1%, 18,6% e 2,3% no grupo populacional
de indivíduos infectados pelo HTLV e de 75,3%, 23,8% e 0,9% no grupo controle,
respectivamente. Entretanto não foi observada diferença estatisticamente significante (p=
0,4217), bem como na análise das frequências alélicas (p= 0,9759) onde o alelo selvagem T
apresentou frequências de 88% e 87% entre infectados pelo HTLV e controles,
respectivamente (Tabela 1). Entre sintomáticos e assintomáticos verificou-se os genótipos TT,
54
T∆T e ∆T∆T com frequências de 76,9%, 20,5% e 2,6% e 80,9%, 17% e 2,1%,
respectivamente, sem diferença estatística significante (p= 0,9170), já em relação ao alelo
selvagem T, observamos frequências de 87% e 89% entre sintomáticos e assintomáticos,
respectivamente, sem significância estatística (p= 0,7954) (Tabela 1).
O polimorfismo na posição -844 da região promotora do gene FASL,
denominado FASLG-844C>T, demonstrou frequências dos genótipos CC, CT e TT de 30,2%,
54,7% e 15,1% e de 42,1%, 47,7% e 10,2% entre soropositivos para o HTLV e soronegativos,
respectivamente, sem diferença estatisticamente significativa (p= 0,1211), assim como na
análise das frequências alélicas (p= 0,2816), a qual apresentou os alelos C e T com
frequências de 58% e 42% e de 66% e 34% entre soropositivos e grupo controle,
respectivamente. Em se tratando de sintomáticos e assintomáticos, observou-se os genótipos
CC, CT e TT com frequências de 43,6%, 43,6% e 12,8% e 19,1%, 63,8% e 17%,
respectivamente, com diferença estatisticamente significante (p= 0,0484). Em relação às
frequências alélicas em ambos os grupos, sintomáticos e assintomáticos, observamos os alelos
C e T com frequências de 65% e 35% e de 51% e 49%, respectivamente, sem diferença
estatisticamente significante (p= 0,0562) (Tabela1).
3.2
ANÁLISE DE REGRESSÃO LOGÍSTICA MÚLTIPLA
Realizou-se regressão logística simples para investigar a chance de infecção
pelo HTLV e da evolução clínica em relação à ocorrência dos cinco polimorfismos genéticos
analisados, FAS-670A>G, FAS-1377G>A, FASLGINV2nt-124A>G, FASLIVS3nt169T>∆T e
FASLG-844C>T. Os resultados evidenciaram significância estatística na distribuição dos
genótipos para os polimorfismos FAS-1377G>A e FASLGINV2nt-124A>G (Tabela 2).
55
Tabela 2 – Análise de regressão logística simples para investigar a chance de evolução da
infecção pelo HTLV em relação à ocorrência dos cinco polimorfismos genéticos entre os
grupos analisados.
Perfil genético
Populações
HTLV
N(%)
Controle
N(%)
OR
95% IC
p
23 (27)
63 (73)
51 (22)
184 (78)
0,6686
0.37 – 1.27
0,2281
58 (67)
28 (33)
185 (79)
50 (21)
1,9191
1.07 – 3.45
0,0291
80 (93)
6 (7)
198 (84)
35 (16)
0,3349
0.13 – 0.84
0,0202
68 (79)
18 (21)
177 (75)
58 (25)
0,8722
0.46 – 1.64
0,6711
26 (30)
60 (70)
99 (42)
136 (58)
1,8111
1.03 – 3.18
0,0386
FAS-670A>G
AA
AG + GG
FAS-1377G>A
GG
GA + AA
FASLGINV2nt-124A>G
AA
AG + GG
FASLIVS3nt169T>∆T
TT
T∆T + ∆T∆T
FASLG-844C>T
CC
CT + TT
Verificou-se, também, a chance de desenvolvimento de sintomas entre os
indivíduos infectados por esse vírus em relação à ocorrência dos cinco polimorfismos
genéticos analisados. Distinto do observado na análise entre infectados e controles, a presente
análise demonstrou elevada significância estatística na comparação das frequências para os
polimorfismos FAS-670A>G e FASLG-844C>T (Tabela 3).
56
Tabela 3 – Análise de regressão logística simples para investigar a chance de
desenvolvimento de sintomas entre indivíduos infectados por esse vírus em relação à
ocorrência dos cinco polimorfismos analisados.
Perfil genético
Populações
Sintomáticos
N (%)
Assintomáticos
N (%)
OR
95% IC
p
15 (38)
24 (62)
8 (17)
39 (83)
8,2584
2.18 – 31.27
0,0019
26 (67)
13 (33)
32 (68)
15 (32)
0,3204
0.09 – 1.08
0,0668
35 (90)
4 (10)
45 (96)
2 (4)
0,1749
0.02 – 1.37
0,0969
30 (77)
9 (23)
38 (81)
9 (19)
1,3310
0.35 – 5.06
0,6747
17 (44)
22 (56)
9 (19)
38 (81)
8,5211
2.30 – 31.52
0,0013
FAS-670A>G
AA
AG + GG
FAS-1377G>A
GG
GA + AA
FASLGINV2nt-124A>G
AA
AG + GG
FASLIVS3nt169T>∆T
TT
T∆T + ∆T∆T
FASLG-844C>T
CC
CT + TT
3.3
POLIMORFISMOS GENÉTICOS E QUANTIFICAÇÃO DOS LINFÓCITOS T
CD4+ E T CD8+
Foram realizadas contagens de linfócitos T CD4+ e T CD8+ em 75 amostras
de indivíduos infectados pelo HTLV e, para efeito de comparação, em 183 amostras de
indivíduos do grupo controle. Na população de indivíduos infectados pelo HTLV, a análise do
número de linfócitos T CD4+ variou de 364 a 3.024 células/μL, com média de 1.198,7
células/μL, em relação ao número de linfócitos T CD8+, os valores variaram de 173 a 1.673
células/μL, com média de 623,7 células/μL. Dentre os indivíduos soronegativos, a análise do
número de linfócitos T CD4+ variou de 411 a >2000 células/μL, com média de 1.028,7,
enquanto que, a quantificação de linfócitos T CD8+ variou de 162 a 1.563 células/μL, com
média de 619,5 células/μL. A análise do número de linfócitos T CD4+ em sintomáticos variou
de 364 a 3.024 células/μL, com média de 1.253,5 células/μL e, em relação ao número de
linfócitos T CD8+, variou de 303 a 1.673 células/μL, com média de 643,4 células/μL. Nos
57
assintomáticos, os valores de linfócitos T CD4+ variaram de 581 a 1.680 células/μL, com
média de 1.143,9 células/μL, já em relação ao número de linfócitos T CD8+, a variação foi de
173 a 1.049 células/μL, com média de 603,9 células/μL.
Os níveis de linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ foram comparados entre
os portadores dos diferentes genótipos para os cinco polimorfismos analisados dentre todos os
grupos populacionais analisados. Em relação ao polimorfismo FAS-670A>G, o número de
linfócitos T CD4+ entre os indivíduos infectados pelo HTLV e grupo controle portadores do
genótipo AA, variou de 473 a 1963 células/μL (média = 1.248,82 células/μL) e de 494 a 1783
células/μL, respectivamente (média = 1.055,11 células/μL), com diferença estatisticamente
significante (p= 0,0449), já entre os portadores do alelo G, seja em homo ou em heterozigose,
a variação foi de 364 a 2.288 células/μL (média = 1.176,64 células/μL) e de 411 a 1.765
células/μL (média = 1.019,19 células/μL), respectivamente, sendo esta diferença
estatisticamente significante (p= 0,0166). Os níveis de linfócitos T CD8+ para o genótipo AA
variaram de 303 a 817 células/μL (média = 516,06 células/μL) e de 305 a 1.174 células/μL
(média = 616,74 células/μL) entre indivíduos HTLV positivos e grupo controle,
respectivamente, com o valor de p próximo ao definido para a significância estatística (p=
0,0519), bem como para os portadores do alelo G, seja em homo ou em heterozigose, cuja
variação foi de 173 a 1.167 células/μL (média = 620,93 células/μL) e de 162 a 1.368
células/μL (média = 613,19 células/μL) (p= 0,8287).
Entre sintomáticos e assintomáticos, as variações dos níveis de linfócitos T
CD4+ para o genótipo AA variaram de 473 a 1963 células/μL (média = 1.252,62 células/μL) e
de 1177 a 1450 células/μL (média = 1.325,67 células/μL), respectivamente, e não havendo
diferença estatisticamente significante (p= 0,7718), bem como para os genótipos AG e GG
(p= 0,6318), cujas variações foram de 364 a 2288 células/μL (média = 1.180,25 células/μL) e
de 581 a 1680 células/μL (média = 1.133,06 células/μL), respectivamente. A quantificação
dos níveis de linfócitos T CD8+ entre ambos os grupos variaram de 303 a 817 células/μL
(média = 506,39 células/μL) e de 359 a 665 células/μL (média = 547,5 células/μL) para o
genótipo AA, respectivamente, com diferença estatisticamente significante (p<0,0001) e, para
os portadores do alelo G, seja em homo ou heterozigose, as variações foram de 315 a 1167
células/μL (média = 636,3 células/μL) e de 173 a 1049 células/μL (média = 610,53
células/μL), respectivamente, também com diferença estatisticamente significante (p<0,0001)
(Figura 13).
58
diferentes genótipos para o polimorfismo FAS-670A>G.
Em relação ao polimorfismo FAS-1377G>A, os níveis de linfócitos T CD4+
entre soropositivos e soronegativos variaram de 473 a 2.288 células/μL (média = 1.195,7
células/μL) e de 411 a 1.783 células/μL (média = 1.040,18 células/μL) para o genótipo GG,
respectivamente, com uma diferença estatisticamente significante (p= 0,0034) e, para a
combinação dos genótipos GA+AA, as variações foram de 364 a 1.883 células/μL (média =
1.131,8 células/μL) e de 470 a 1.524 células/μL (média = 982,58 células/μL),
respectivamente, sem significância estatística (p= 0,0633). Quanto à quantificação de
linfócitos T CD8+, as variações entre indivíduos HTLV positivos e grupo controle foram de
173 a 1.123 células/μL (média = 579,64 células/μL) e de 266 a 1.256 células/μL (média =
614,01 células/μL) para o genótipo GG, respectivamente, sem significância estatisticamente
significante (p= 0,3370) e, para os genótipos combinados GA+AA, as variações foram de 315
a 913 células/μL (média = 609,44 células/μL) e de 162 a 1.368 células/μL (média = 613,64
células/μL), também sem diferença estatisticamente significante (p= 0,9350).
59
A quantificação dos níveis de linfócitos T CD4+ entre sintomáticos e
assintomáticos demonstrou para o genótipo GG variações de 473 a 2.288 células/μL (média =
1.287,83 células/μL) e de 581 a 1.659 células/μL (média = 1.110,65 células/μL),
respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,0856) e, para os genótipos
GA e AA, variações de 364 a 1.883 células/μL (média = 1.054 células/μL) e de 722 a 1.680
células/μL (média = 1.216,08 células/μL), sem significância estatística (p= 0,3832). Em
relação aos níveis de linfócitos T CD8+, verificou-se, para o genótipo GG, variações de 303 a
852 células/μL (média = 541,52 células/μL) e 173 a 1.049 células/μL (média = 592,46
células/μL) em ambos os grupos, respectivamente, sem diferença estatística significante (p=
0,3387), assim como, para os genótipos GA e AA (p= 0,9187), cujas variações foram de 315 a
1.167 células/μL (média = 636,67 células/μL) e de 384 a 793 células/μL (média = 628,67
células/μL), respectivamente (Figura 14).
diferentes genótipos para o polimorfismo FAS-1377G>A.
60
Para o polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G, a quantificação dos níveis de
linfócitos T CD4+ entre indivíduos positivos para o HTLV e o grupo controle, demonstrou
variações de 364 a 1.883 células/μL (média = 1.154,35 células/μL) e de 411 a 1.783
células/μL (média = 1.027,07 células/μL)
para o genótipo AA, respectivamente, com
diferença estatisticamente significante (p= 0,0085) e variações de 731 a 1.963 células/μL
(média = 1.216 células/μL) e de 470 a 1.540 células/μL (média = 990,27 células/μL) para os
genótipos AG+GG, respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,1079).
Em relação aos níveis de linfócitos T CD8+, para o genótipo AA verificou-se
variações de 173 a 1.167 células/μL (média = 600,9 células/μL) e de 162 a 1.368 células/μL
(média = 620,2 células/μL), respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p=
0,5081) e, para os genótipos AG e GG, as variações foram de 317 a 872 células/μL (média =
550,83 células/μL) e de 269 a 1.174 (média = 581,7 células/μL), respectivamente, sem
significância estatística (p= 0,7727).
Os níveis de linfócitos T CD4+ entre sintomáticos e assintomáticos para o
polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G apresentaram variações de 364 a 3.024 células/μL
(média = 1.237,88 células/μL) e de 580 a 1.680 células/μL (média = 1.158,89 células/μL)
para o genótipo AA, respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,4431)
e, para o genótipo AG, as variações foram de 825 a 1.963 células/μL (média = 1.386,5
células/μL) e de 731 a 1.019 células/μL (média = 875 células/μL), respectivamente, sem
significância estatística (p= 0,4431). Para os níveis de linfócitos T CD8+, o genótipo AA
apresentou variações de 303 a 1.673 células/μL (média = 657 células/μL) e de 173 a 1.049
células/μL (média = 604,33 células/μL), respectivamente, sem diferença estatisticamente
significante (p= 0,2307), bem como para o genótipo AG (p= 0,7910) no qual variaram de 317
a 847 células/μL (média = 528,25 células/μL) e de 320 a 872 células/μL (média = 596
células/μL), respectivamente (Figura 15).
61
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G.
A comparação dos níveis de linfócitos T CD4+ entre infectados pelo HTLV e
grupo
controle
portadores
de
diferentes
genótipos
para
o
polimorfismo
FASLIVS3nt169T>∆T, demonstrou variações para o genótipo TT de 473 a 2.288 células/μL
(média = 1.190,63 células/μL) e de 411 a 1.765 células/μL (média = 1.039,02 células/μL),
respectivamente, com diferença estatisticamente significante (p= 0,0054), enquanto que, para
os genótipos T∆T e ∆T∆T, com variações de 364 a 1.883 células/μL (média = 1.109,47
células/μL) e de 428 a 1783 células/μL (média = 982,4 células/μL), não houve significância
estatística (p= 0,2162). Quanto aos níveis de linfócitos T CD8+, as variações entre ambos os
grupos foram de 173 a 1.167 células/μL (média = 587,25 células/μL) e de 162 a 1.368
células/μL (média = 623,44 células/μL) para o genótipo TT, respectivamente, sem diferença
estatisticamente significante (p= 0,2583) e, para os genótipos T∆T e ∆T∆T, variações de 297
a 1.123 células/μL (média = 637,93 células/μL) e de 266 a 1.158 células/μL (média = 579,65
células/μL), também sem diferença estatisticamente significante (p= 0,3912).
62
A análise dos níveis de linfócitos T CD4+ entre sintomáticos e assintomáticos
para o polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T revelou variações de 473 a 2.288 células/μL
(média = 1.202,32 células/μL) e de 581 a 1.680 células/μL (média = 1.180,41 células/μL),
respectivamente, para o genótipo TT, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,8211)
e, para os genótipos T∆T e ∆T∆T variações de 364 a 1.883 T∆T e ∆T∆T células/μL (média =
1.216,11 células/μL) e de 696 a 1.084 células/μL (média = 949,5 células/μL),
respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,1075). Para os níveis de
linfócitos T CD8+, essas variações para o genótipo TT foram de 303 a 1.167 células/μL
(média = 574,96 células/μL) e de 173 a 900 células/μL (média = 620,85 células/μL),
respectivamente, sem significância estatística (p= 0,6369), bem como para os genótipos T∆T
e ∆T∆T (p= 0,5958), cujas variações foram de 442 a 706 células/μL (média = 570,86
células/μL) e de 297 a 1.049 células/μL (média = 635,33 células/μL), respectivamente
(Figuras 16).
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T.
63
Os níveis de linfócitos T CD4+ entre indivíduos HTLV positivos e grupo
controle para o polimorfismo FASLG-844C>T apresentaram variações estatisticamente
significantes tanto para o genótipo CC (p= 0,0421), cujas variações foram de 364 a 1.883
células/μL (média = 1.174,38 células/μL) e de 411 a 1.783 células/μL (média = 1.020,76
células/μL), respectivamente, quanto para os portadores do alelo T, seja em homo ou em
heterozigose (p= 0,0214), as quais foram de 473 a 1.963 células/μL (média = 1.152,14
células/μL) e de 470 a 1.765 células/μL (média = 1.031,21 células/μL), respectivamente. Para
os níveis de linfócitos T CD8+, as variações foram de 333 a 852 células/μL (média = 605,08
células/μL) e de 266 a 1.368 células/μL (média = 657,52 células/μL) para o genótipo CC,
respectivamente, sem diferença estatisticamente significante (p= 0,1544), bem como para os
portadores do alelo T, seja em homo ou em heterozigose (p= 0,7217), cujos níveis variaram
de 173 a 1.167 células/μL (média = 592,88 células/μL) e de 162 a 1.256 células/μL (média =
578,87 células/μL), respectivamente.
Nos sintomáticos e assintomáticos, portadores dos diferentes genótipos do
polimorfismo FASLG-844C>T, os níveis de linfócitos T CD4+, variaram de 364 a 2.288
células/μL (média = 1.294,53 células/μL) e de 581 a 1.587 células/μL (média = 1.058,25
células/μL) para o genótipo CC, respectivamente, sem diferença estatisticamente significante
(p= 0,2031), assim como, para genótipos combinados CT+TT (p= 0,7073), cujas variações
foram de 473 a 1.963 células/μL (média = 1.130,15 células/μL) e de 692 a 1.680 células/μL
(média = 1.166,8 células/μL), respectivamente. Os níveis de linfócitos T CD8+ mostraram
variações de 333 a 852 células/μL (média = 574,94 células/μL) e de 606 a 777 células/μL
(média = 698,29 células/μL) para o genótipo CC, respectivamente, com diferença
estatisticamente significante (p= 0,0036), já para os portadores do alelo T, seja em homo ou
em heterozigose, a diferença não foi estatisticamente significante (p= 0,9319), variando de
303 a 1.167 células/μL (média = 600,95 células/μL) e de 173 a 1.049 células/μL (média =
587,5 células/μL) (Figura 17).
64
diferentes genótipos para o polimorfismo FASLG-844C>T.
A relação de linfócitos T CD4+ / CD8+ foi comparada entre a população paciente e
grupo controle portadores de diferentes genótipos para os cinco polimorfismos analisados,
sem diferenças estatisticamente significante (Tabela 4).
65
Tabela 4 – Comparação da relação de linfócitos T CD4+ / CD8+ entre a população paciente e
grupo controle portadores de diferentes genótipos para os cinco polimorfismos analisados.
Perfil genético
Populações
CD4+/CD8+
HTLV
N (%)
Controle
N (%)
HTLV
Média
Controle
Média
p
18 (24)
58 (76)
38 (21)
146 (79)
2,58
1,93
7,30
5,16
0,3974
0,1706
51 (67)
25 (33)
140 (76)
44 (24)
2,23
1,80
6,76
1,93
0,5552
0,5552
70 (92)
6 (8)
154 (84)
30 (16)
2,04
2,66
6,33
1,87
0,1003
0,3480
61 (80)
15 (20)
144 (78)
40 (22)
2,18
1,72
5,21
7,02
0,2039
0,3178
25 (33)
51 (67)
81 (44)
103 (56)
1,92
2,17
1,69
8,68
0,2081
0,0946
FAS-670A>G
AA
AG + GG
FAS-1377G>A
GG
GA + AA
FASLGINV2nt-124A>G
AA
AG + GG
FASLIVS3nt169T>∆T
TT
T∆T + ∆T∆T
FASLG-844C>T
CC
CT + TT
A relação de linfócitos T CD4+ / CD8+ foi comparada entre sintomáticos e
assintomáticos, portadores de diferentes genótipos para os cinco polimorfismos analisados,
com diferença estatisticamente significante somente para o genótipo CC do polimorfismo
FASLG-844C>T (p= 0,0218) (Tabela 5).
66
Tabela 5 – Comparação da relação de linfócitos T CD4+ / CD8+ entre sintomáticos e
assintomáticos portadores de diferentes genótipos para os cinco polimorfismos analisados.
Perfil genético
Populações
CD4+/CD8+
Sintomáticos
N (%)
Assintomáticos
N (%)
Sintomáticos
Média
Assintomáticos
Média
p
14 (37)
24 (63)
4 (11)
34 (89)
2,65
1,89
2,35
1,96
0,6838
0,7294
25 (66)
13 (34)
26 (68)
12 (32)
2,45
1,63
2,01
1,99
0,1334
0,1581
34 (89)
4 (11)
36 (95)
2 (5)
2,06
3,12
2,02
1,73
0,8584
0,4412
29 (76)
9 (24)
32 (84)
6 (16)
2,27
1,83
2,09
1,56
0,4585
0,5273
17 (45)
21 (55)
8 (21)
30 (79)
2,18
2,16
2,38
2,17
0,0218
0,9638
FAS-670A>G
AA
AG + GG
FAS-1377G>A
GG
GA + AA
FASLGINV2nt-124A>G
AA
AG + GG
FASLIVS3nt169T>∆T
TT
T∆T + ∆T∆T
FASLG-844C>T
CC
CT + TT
A análise comparativa de carga proviral plasmática foi realizada entre os
portadores dos diferentes genótipos para quatro dos cinco polimorfismos estudados, visto que,
para polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G o número amostral para a ocorrência do alelo
polimórfico G não foi significativo. O polimorfismo FAS-670A>G evidenciou diferença
significante para o genótipo AA (p= 0,0084), o que também foi observado na análise dos
polimorfismos FAS-1377G>A (p= 0,0239) para o genótipo GG e para o polimorfismo
FASLIVS3nt169T>∆T com referência ao genótipo TT (p= 0,0318). Entretanto, na análise do
polimorfismo FASLG-844C>T, evidenciou-se diferença significativa (p= 0,0226) de carga
67
proviral entre os portadores do alelo polimórfico T, em homo ou heterozigose, entre estes
indivíduos.
Posteriormente, foi feita a análise da carga proviral e os polimorfismos FAS670A>G,
FAS-1377G>A,
FASLIVS3nt169T>∆T
e
FASLG-844C>T,
intragrupos
(sintomáticos x sintomáticos e assintomáticos x assintomáticos) (Tabela 6).
Tabela 6 – Comparação dos níveis de carga proviral entre os indivíduos soropositivos para a
infecção pelo HTLV-1 portadores de diferentes genótipos para os polimorfismos analisados.
* Mann-Whitney
Perfil genético
Populações
Carga proviral (cópias/mL)
Sintomáticos
N
Assintomáticos
N
Sintomáticos
Média
Assintomáticos
Média
p
13
17
4
30
1402,75
676,39
0,0280*
156,54
293,98
0,6305*
0,0084
0,3278
21
9
24
10
995,.87
980,13
0,1971*
281,08
269,96
0,9699*
0,0239
0,3370
23
7
28
6
954,87
110,34
0,5399*
327,45
46,148
0,2783*
0,0318
0,2672
14
16
8
26
891,83
1078,05
0,2798*
441,41
227,47
0,5561*
0,5080
0,0226
FAS-670A>G
AA
AG + GG
p*
FAS-1377G>A
GG
GA + AA
p*
FASLIVS3nt169T>∆T )
TT
T∆T + ∆T∆T
p*
FASLG-844C>T
CC
CT + TT
p*
68
4.
DISCUSSÃO
No presente estudo, observou-se uma maior prevalência do genótipo GG
entre indivíduos infectados pelo HTLV, assim como, entre portadores sintomáticos,
corroborando com estudos desenvolvidos por Vallinoto et al. (2011), com pacientes HTLV
positivos residentes na cidade de Belém, Pará, sugerindo uma possível associação deste
polimorfismo com a suscetibilidade ao HTLV e à progressão para infecção sintomática. A
frequência do alelo variante G foi maior em todos os grupos analisados, corroborando com
estudos realizados por Huang et al. (1999), que relataram frequências dos alelos A e G de
49% e 51%, respectivamente, em três grupos populacionais (pacientes com artrite reumatóide,
lúpus eritematoso sistêmico e indivíduos saudáveis) de australianos de origem caucasóide.
Uma pesquisa desenvolvida no Brasil relatou frequências de 52%, 41% e 36% para o alelo A
em pacientes portadores do HTLV-1 positivos com Leucemia/Linfoma de células T do Adulto
(LLcTA), assintomáticos e em controles soronegativos, respectivamente (Farre et al., 2008).
Frequências similares são observadas em americanos, portugueses e chineses (Sun et al.,
2004; Zhang et al., 2006; Crew et al., 2007; Lima et al., 2008).
Trabalhos desenvolvidos por Mehta et al. (2008) tem demonstrado maior
risco de desenvolver leucemia mielóide aguda (LMA) em pacientes adultos portadores do
alelo variante na posição -1377 da região promotora de FAS. Observamos uma maior
frequência do genótipo GG em todos os grupos analisados, porém sem significância
estatística, a semelhança do descrito por Qureshi (2010), em pacientes com câncer. Por outro
lado, a análise combinatória dos genótipos revelou uma maior frequência significativa dos
genótipos GA+AA entre os portadores da infecção quando comparado aos controles,
sugerindo que a presença da variante A em homo ou heterozigose, pode ser um fator
predisponente à infecção, sendo ainda observado menor nível de LTCD4+ nos portadores
desses genótipos.
Um estudo desenvolvido por Santana et al. (2010) com indivíduos
infectados pelo HTLV-1, verificou uma maior frequência do genótipo -1377AA entre a
população de pacientes, não sendo encontrado o mesmo genótipo em nenhuma amostra do
grupo controle. Sibley et al. (2003) mostraram um aumento significativo de casos de leucemia
mielóide aguda do adulto (LMA) associada aos portadores do alelo polimórfico A na posição
-1377FAS, seja em homo ou em heterozigose.
Ainda são poucos os estudos relacionados às frequências genotípicas dos
polimorfismos do gene FASL (Bolstad et al., 2000). Estudo desenvolvido em 2006 com
americanos portadores de câncer, relatou frequências dos alelos A e G de 86% e 14%,
69
respectivamente; e nos indivíduos saudáveis foram observados frequências de 85% e 15%,
respectivamente (Zhang et al., 2006). No presente estudo, para o polimorfismo
FASLGINV2nt-124A>G foram encontradas frequências dos alelos A e G de 3% e 97% e de
8% e 92% entre HTLV positivos e controle, respectivamente, e de 5% e 95% e de 2% e 98%
entre sintomáticos e assintomáticos, respectivamente, sem diferenças estatisticamente
significantes. Contudo, a análise combinatória dos genótipos revelou que a presença do alelo
mutante G, em homo ou heterozigose, estava mais frequente entre os controles, sugerindo
uma proteção à infecção aos portadores desse alelo.
Pinti et al. (2002) encontraram frequências semelhantes às do presente
estudo para os alelos T e delT do polimorfismo FASLIVS3nt169T>∆T em centenários (87% e
13%, respectivamente) e em jovens italianos (82% e 18%, respectivamente).
Em nossos achados, o genótipo CT do polimorfismo FASLG-844C>T foi o
mais frequente em todos os grupos analisados, assim como em outros estudos realizados nos
Estados Unidos e na Coréia (Crew et al., 2007; Ter-Minassian et al., 2008; Park et al., 2009;
Qureshi et al., 2010). Por outro lado, no Brasil, estudo desenvolvido por Santana et al.
(2010), revelou maior prevalência do genótipo mutante TT na população paciente infectada
pelo HTLV (sintomáticos e assintomáticos) e no grupo controle, divergindo dos resultados
aqui encontrados.
O gene FAS é silenciado em muitos tipos de tumores, o que resulta na
incapacidade de responder a sinais pro-apoptóticos (Sibley et al., 2003). Além disso,
polimorfismos na região promotora de FAS (FAS-670A>G e FAS-1377G>A) e FASL
(FASLG-844C>T) alteram a atividade transcricional destes genes (Sun et al., 2004). A
substituição de A para G na posição -670 da região promotora do gene FAS altera o sítio de
ligação do fator de transcrição nuclear STAT-1, possivelmente influenciando na função ou
expressão do gene FAS (Shuai, 1994; Huang et al., 1997; Sibley et al., 2003).
Nossos achados sugerem esta possível influência, uma vez que, foi
observado um risco aumentado no desenvolvimento de sintomas em portadores da infecção
pelo HTLV, associado aos polimorfismos FAS-670A>G (odds ratio, 8,26; intervalo de
confiança 95%, 2,18 – 31,27) e FASLG-844C>T (odds ratio, 8,5; intervalo de confiança 95%,
2,30 – 31,52). O genótipo AA foi mais prevalente entre os portadores sintomáticos da
infecção associados a maior nível de carga proviral, o oposto sendo observado para a presença
dos genótipos AG+GG, os quais apresentaram-se mais frequentes entre os portadores
assintomáticos. Zhang et al. (2006) observaram um risco aumentado de desenvolvimento do
câncer de faringe quando comparados com controles saudáveis, para os genótipos -1377FAS
70
(GG + AG) e -670FAS (GG+AG). Todavia, estudos desenvolvidos por Crew et al. (2007)
não encontraram a associação entre o risco de desenvolver câncer de mama em mulheres e os
polimorfismos FAS-1377G>A, FAS-670A>G e FASLG-844C>T.
Zhang et al. (2007) ao avaliarem os efeitos dos polimorfismos de FAS1377G>A, FAS-670A>G e FASLG-844C>T sobre o risco de desenvolvimento de câncer de
mama, observaram que indivíduos com genótipo -844FASLCC tinham maior infiltrado de
linfócito no tecido tumoral do que aqueles que possuíam genótipos -844FASLTT, indicando
que os polimorfismos nos genes FAS e FASL podem estar associados com o aumento da
apoptose no tumor e com o risco de desenvolvimento de câncer de mama. Em nossos achados,
os portadores do alelo C do polimorfismo -844FASL apresentaram médias de linfócitos T
CD8+ mais elevados, sugerindo uma melhor resposta imunológica, visto que, a ativação dos
linfócitos T citotóxicos (LTC) pelos antígenos do HTLV-1, principalmente Tax, associado
com a secreção de citocinas antivirais como IFN-γ e TNF-α são etapas importantes para
diminuição da carga proviral do HTLV-1 (Santos et al., 2005), enquanto que, os portadores
do alelo T, apresentaram médias de linfócitos T CD8+ mais baixos, associados a uma maior
carga proviral.
Baseado nos resultados obtidos sugere-se que, os polimorfismos FAS670A>G, FAS-1377G>A e FASLG-844C>T, podem exercer influência na resposta de
linfócitos TCD4+ e linfócitos TCD8+ no curso da infecção pelo HTLV, uma vez que, a
principal estratégia de defesa montada pelo sistema imunológico do hospedeiro, visando o
controle da replicação do vírus é mediada por estas células. Desta forma, faz-se necessário
estudos posteriores, que visem investigar, por exemplo, a influência dos níveis de expressão
dos genes FAS e FASL em indivíduos portadores da infecção pelo Vírus linfotrópicos de
células T humanas (HTLV).
71
5.
CONCLUSÕES
(i)
As análises das distribuições das genotípicas dos genes FAS e FASL nas
populações estudadas sugerem uma possível associação do polimorfismo FAS-670A>G com a
suscetibilidade ao HTLV;
(ii) A análise combinatória dos genótipos revelou que a presença do alelo variante
A na posição -1377FAS, seja em homo ou em heterozigose, pode ser um fator predisponente à
infecção pelo HTLV;
(iii) A análise combinatória dos genótipos revelou que a presença do alelo mutante
G do polimorfismo FASLGINV2nt-124A>G, em homo ou heterozigose, foi mais frequente
entre os controles, sugerindo uma proteção à infecção pelo HTLV aos portadores desse alelo;
(iv) A análise de regressão logística múltipla revelou um risco aumentado de
progressão para infecção sintomática pelo HTLV associada aos polimorfismos FAS-670A>G
e FASLG-844C>T;
(v) Os portadores do alelo C do polimorfismo FASLG-844C>T apresentaram
médias de linfócitos TCD8+ mais elevados, sugerindo uma melhor resposta imunológica;
(vi) Foi observada existência de associação entre os polimorfismos nos genes
FAS e FASL com os níveis de carga proviral.
72
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95
ANEXO 01
96
ANEXO 02
97
98
99
100
ANEXO 03

polimorfismos nos genes fas e fasl em indivíduos - PPGBAIP

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Julho de 2009 - Fundação Amazonas Sustentável

Sumário

manifestações dermatológicas em indivíduos infectados pelo htlv